ES2270852T3 - Regulacion de la expresion de genes en celulas eucariotas. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido de origen no natural que comprende un promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un promotor 35S/T7 quimérico unido de manera operativa a una secuencia que codifica un polipéptido que se une específicamente a un elemento de respuesta a homoserina lactona acilada (AHL).
Description
Regulación de la expresión de genes en células
eucariotas.
Esta invención se refiere a procedimientos y
composiciones para la regulación de la expresión de genes en células
eucariotas, en particular mediante el uso de promotores que se
pueden inducir o reprimir químicamente.
Una amplia variedad de especies bacterianas
producen derivados de homoserina lactona acilada (AHL) que funcionan
en la comunicación célula-célula. Este sistema de
señalización se usa, por ejemplo, para controlar la densidad de la
población celular en un proceso denominado percepción de quórum
(quorum sensing). Cada célula en una población produce un bajo nivel
basal de la AHL difundible mediante la actividad de una AHL sintasa,
normalmente un miembro de la familia LuxI de proteínas. La
concentración de AHL aumenta con la densidad de población bacteriana
hasta que la concentración de AHL es suficiente para provocar la
expresión de diversos genes dependientes de AHL mediante una
proteína receptora de AHL, normalmente un miembro de la familia LuxR
de reguladores de transcripción. En al menos algunas especies, el
gen de la AHL sintasa se puede inducir mediante AHL, conduciendo a
la auto-inducción de la síntesis de AHL. Se han
descrito sistemas de percepción de quórum en Vibrio fischeri
(genes de bioluminiscencia lux), Pseudomonas
aeruginosa (genes de virulencia), Agrobacterium
tumefaciens (transferencia conjugativa), Serratia
liquefaciens (movilidad tipo swarming), y Erwinia
caratovora (producción de antibióticos), por ejemplo. Para
revisiones, véase, por ejemplo: Fuqua y Greenberg, Curr.
Opinion Microbiol. 1:183-189, 1998; y Fuqua y
col., Ann. Rev. Microbiol. 50:727-751,
1996).
De acuerdo con estudios publicados del sistema
de percepción de quórum LuxR-LuxI de Vibrio
fischeri, no se observó unión específica al sitio de unión de
LuxR (o "caja de lux") en las secuencias de promotor del
lux ni con LuxR en solitario ni con ARN polimerasa bacteriana
en solitario, sino que requería la presencia de tanto LuxR como de
ARN polimerasa. Por consiguiente, se ha pensado que es posible la
expresión génica inducible bajo el control de LuxR sólo cuando está
también presente la ARN polimerasa bacteriana, en concreto, en
células bacterianas, limitando la utilidad de los sistemas de
percepción de quórum en células eucariotas.
El documento
US-A-5.196.318 describe el uso de
elementos de respuesta a AHL para la expresión de genes heterólogos
en bacterias usando una homoserina lactona acilada como inductor.
Sin embargo, no describe este uso para la expresión en células
eucariotas. El documento WO 00/09704 describe el uso de elementos de
respuesta a AHL para la expresión de un polinucleótido en
eucariotas.
Se han descrito un número de sistemas para
regular genes eucariotas incluyendo diversos elementos promotores
que se pueden inducir químicamente. Sin embargo, sigue existiendo la
necesidad de un sistema promotor inducible que se pueda usar en una
variedad de organismos eucariotas, que esté estrictamente regulado y
fuertemente inducido, y que responda a un inductor químico que
presente una baja citotoxicidad.
Los inventores han descubierto que se pueden
usar sistemas de percepción de quórum bacterianos en el control de
la expresión de genes eucariotas, ya sea en el núcleo o en
orgánulos, tales como cloroplastos, de una célula eucariota. De esta
forma, la presente invención proporciona
(1) un polinucleótido de origen no natural que
comprende un promotor que es funcional en una célula eucariota que
comprende un promotor 35S/T7 quimérico unido de forma operativa a
una secuencia que codifica un polipéptido que se une de forma
específica a un elemento de respuesta a una homoserina lactona
acilada (AHL);
(2) un organismo que comprende el polinucleótido
de la reivindicación 1 seleccionado entre el grupo constituido por
una levadura, un mamífero no humano, y una planta.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporcionan polinucleótidos de origen no natural que incorporan
elementos de un sistema de percepción de quórum bacteriano y que son
útiles para el control o modulación de la expresión génica en una
célula eucariota. Se proporciona un polinucleótido que comprende un
promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un
elemento cis (por ejemplo, una caja de lux o secuencia
similar) que media en la sensibilidad del promotor respecto a una
N-acilhomoserina lactona (AHL). Dichos elementos cis
se denominan en el presente documento como elementos de respuesta a
AHL. Al unir una AHL o un análogo de AHL, el receptor de AHL se une
al elemento de respuesta a AHL, modulando la transcripción del gen
de interés unido de forma operativa. En la práctica de la invención
se puede usar cualquier elemento de respuesta a AHL, gen de AHL
sintasa, o gen de receptor de AHL conocido. El gen del receptor de
AHL codifica un receptor de AHL nativo, porciones de un receptor de
AHL nativo que se unen a un elemento de respuesta a AHL
correspondiente, o una proteína de fusión que comprende un receptor
de AHL nativo (o una porción del mismo que se une a un elemento
eucariota.
\newpage
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporciona un polinucleótido que comprende: una primera secuencia
que comprende un primer promotor que es funcional en una célula
eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL, y una
segunda secuencia que comprende un segundo promotor que comprende un
promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en la célula eucariota y
está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un
receptor de AHL. Cuando se expresa en la célula, el receptor de AHL
se une al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del
primer promotor. Otra realización de la invención es un
polinucleótido que comprende: una primera secuencia que comprende
un promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende
un elemento de respuesta a AHL; una segunda secuencia que comprende
un segundo promotor que es funcional en la célula que comprende un
elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a una secuencia
que codifica una AHL sintasa que, cuando se expresa en la célula
eucariota, sintetiza una AHL; y una tercera secuencia que comprende
un tercer promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es
funcional en la célula eucariota, y está unido de forma operativa a
una secuencia que codifica un receptor de AHL. La unión de la AHL
mediante el receptor de AHL provoca la unión del receptor de AHL al
elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer
promotor. En una célula eucariota que proporciona otras enzimas
requeridas para la biosíntesis de AHL, el tratamiento de la célula
con AHL exógena inicia la síntesis auto-inducida de
la AHL y en consecuencia la expresión continuada del gen
de interés.
de interés.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporcionan células eucariotas aisladas que comprenden: una
primera secuencia que comprende un segundo promotor que comprende un
promotor 35S/T7 quimérico, que es funcional en la célula eucariota
que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de forma
operativa a un gen de interés; y una segunda secuencia que comprende
un promotor que es funcional en la célula eucariota y que está unido
de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL.
Uno o ambos promotores puede ser no constitutivo, tal como un
promotor específico de célula, de tejido, o de órgano, o de etapa de
desarrollo, o un promotor inducible, por ejemplo.
Otro aspecto de la invención se refiere a la
expresión organular (incluyendo expresión de plasto o mitocondrial).
De acuerdo con una realización, se proporciona una célula eucariota
aislada que comprende: un orgánulo que comprende una primera
secuencia que comprende un promotor que es funcional en el orgánulo,
comprendiendo el promotor un elemento de respuesta a AHL que está
unido de forma operativa a un gen de interés; y un núcleo que
comprende una segunda secuencia que comprende un segundo promotor
que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en el
núcleo, y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica
un polipéptido que comprende (i) un péptido de transporte hacia el
orgánulo (o de dirección o tránsito) y (ii) un receptor de AHL. El
receptor de AHL producido por la expresión de la segunda secuencia y
la captación del polipéptido por el orgánulo se une al elemento de
respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor al
unir una AHL. De acuerdo con una realización alternativa, el
receptor de AHL se expresa en el orgánulo en lugar de ser recogido
por el orgánulo. En esta realización, la célula comprende un
orgánulo, que a su vez comprende una primera secuencia que comprende
un promotor que es funcional en el orgánulo que comprende un
elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a un gen de
interés; y una segunda secuencia que comprende un promotor que
comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en el orgánulo
y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un
polipéptido que comprende un receptor de AHL que se une al elemento
de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor
al
unir una AHL.
unir una AHL.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporcionan procedimientos para la modulación de la expresión de un
polinucleótido que comprende un primer promotor que es funcional en
una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL,
comprendiendo dichos procedimientos la expresión en la célula
eucariota de un receptor de AHL usando el polinucleótido de (1), y
la aplicación a la célula de una composición que comprende una AHL
que está unida por el receptor de AHL, provocando la modulación de
la transcripción del polinucleótido por parte del receptor de AHL,
con la condición de que dicho procedimiento se aplique ex vivo si la
célula eucariota es una célula humana o una célula animal.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporcionan procedimientos para la identificación de AHL que están
unidas por un receptor de AHL. Dichos procedimientos emplean células
eucariotas aisladas que comprenden una primera secuencia que
comprende (i) un primer promotor que es funcional en la célula
eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de
forma operativa a una secuencia que codifica un marcador de
selección o de información (gen chivato), y (ii) un segundo promotor
que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en la
célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia que
codifica un receptor de AHL, en el que la unión de una AHL por el
receptor de AHL provoca la expresión del marcador. El procedimiento
implica la aplicación a la célula de una composición que comprende
la AHL y la detección de la expresión del marcador. Dichas células
(u organismos tales como levaduras o plantas que comprenden dichas
células) pueden usarse para seleccionar análogos de AHL que sean
útiles para controlar la expresión de genes. Por ejemplo, una planta
que comprende dicha construcción se puede usar para ensayar análogos
de AHL útiles agronómicamente que se apliquen a la planta, por
ejemplo, mediante aplicación foliar o mediante aplicación al suelo o
a una semilla.
La Figura 1 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53006.
La Figura 2 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53007.
La Figura 3 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53008.
La Figura 4 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53009.
La Figura 5 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53010.
La Figura 6 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53031.
La Figura 7 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53035.
La Figura 8 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53036.
La Figura 9 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53002.
La Figura 10 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53003.
La Figura 11 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53004.
La Figura 12 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53005.
La Figura 13 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53015.
La Figura 14 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53020.
La Figura 15 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53021.
La Figura 16 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53028.
La Figura 17 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53029.
La Figura 18 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53030.
La Figura 19 proporciona un esquema para la
preparación de la construcción que proporciona la expresión de la
secuencia de codificación de GUS a partir del promotor luxI y
regulada por el activador transcripcional LuxR expresado bajo el
control del promotor luxR nativo.
La Figura 20 proporciona un esquema para la
preparación de la construcción que proporciona la expresión de la
secuencia de codificación de GUS a partir del promotor luxI y
regulada por el activador transcripcional LuxR expresado bajo el
control de las secuencias promotor/guía Prrn/G10L.
La Figura 21 proporciona un esquema para la
preparación de la construcción que proporciona la expresión de la
secuencia de codificación de GUS a partir del promotor T7 viral. La
ARN polimerasa T7 que controla la expresión a partir del promotor T7
se expresa a partir del promotor luxI y está regulada por el
activador transcripcional LuxR expresado bajo el control de las
secuencias promotor/guía Prrn/G10L.
La Figura 22 proporciona un esquema para la
preparación de la construcción que proporciona la expresión de la
secuencia de codificación de GUS a partir del promotor esaR y
regulada por el represor transcripcional EsaR expresado bajo el
control de las secuencias promotor/guía Prrn/G10L.
La Figura 23 proporciona un esquema para la
preparación de la construcción que proporciona la expresión de la
secuencia de codificación de la
\alpha-glucuronidasa (GUS) a partir de promotor T7
viral. La ARN polimerasa T7 que controla la expresión a partir del
promotor T7 se expresa a partir del promotor esaR y está regulada
por el represor transcripcional EsaR expresado bajo el control de
las secuencias promotor/guía Prrn/G10L.
La Figura 24 proporciona una representación
esquemática de la construcción de expresión pMON53055.
La Figura 25 proporciona los resultados de
resultados de tinción histoquímica para la actividad de GUS de
plantas Arabidopsis transgénicas inducidas (tratadas con HSL)
y no inducidas que contienen los genes reportero
TraA8(3x)-GUS y activador
35S-VP16-TraR (pMON53077).
La Figura 26 proporciona la actividad
\beta-galactosidasa en extractos celulares de dos
líneas independientes (cepa YPH499, cl. 5 y cl. 6) que contienen el
gen reportero de \beta-galactosidasa dirigido por
un promotor mínimo con tres copias del elemento TraA8.
La Figura 27 proporciona la estructura genérica
de los análogos de AHL, así como también las diversas sustituciones
de los análogos.
\newpage
La Figura 28 proporciona la actividad
\beta-galactosidasa en protoplastos de zanahoria
inducidos y no inducidos que contienen las construcciones del gen
reportero TraA8(4X)-GUS y del gen activador
35S-VP16-TraR. La inducción de la
actividad \beta-galactosidasa se llevó a cabo
usando los análogos de AHL.
La Figura 29 proporciona una representación
gráfica de los datos presentados en la Tabla 9.
Se pueden usar sistemas de percepción de quórum
para controlar la expresión génica en cualquier célula eucariota,
incluyendo, pero sin limitación, células de levadura, de hongo, de
planta, de insecto, de anfibio, de ave, y de mamífero. En el
presente documento se describen composiciones y procedimientos
ejemplares para la expresión de genes localizados en genomas
nucleares y organulares.
De acuerdo con una realización de la presente
invención, un gen de interés que comprende una secuencia de
codificación de proteína se une de forma operativa a un promotor que
comprende un elemento sensible a AHL. Al unir un compuesto de AHL o
un análogo de AHL, un receptor de AHL se une a (o en algunas
realizaciones, se disocia de) el elemento de respuesta a AHL,
modulando (activando, reprimiendo, o alterando de cualquier otra
forma) la transcripción del gen de interés. Este sistema se puede
entender mejor haciendo referencia a la percepción de quórum de
Vibrio fischeri, el ejemplo mejor caracterizado de los muchos
sistemas de percepción de quórum procariotas, cualquiera de los
cuales se puede usar en la práctica de la presente invención.
V. fischeri, una bacteria marina, produce
un autoinductor difundible,
N-3-(oxohexanoil)homoserina lactona
(denominado con el nombre trivial VAI-1), una AHL
que se acumula en el entorno circundante durante el crecimiento y
que se difunde fácilmente a través de la membrana celular
bacteriana. VAI-1 se sintetiza por LuxI. LuxR es
tanto un receptor para VAI-1 como un regulador
transcripcional dependiente de VAI-1 que une el ADN
inmediatamente cadena arriba del promotor lux.
En la Tabla 1 se muestran ejemplos de especies
bacterianas que presentan sistemas de percepción de quórum con genes
de tipo luxI ("AHL sintasa") y/o genes de tipo
luxR ("receptor de AHL") (Fuqua y col., Annu. Rev.
Microbiol. 50:727-751, 1996). En la
práctica de la presente invención se puede usar cualquier sistema de
percepción de
quórum.
quórum.
\vskip1.000000\baselineskip
Un número de bacterias con proteínas homólogas a
LuxR y LuxI producen también autoinductores AHL similares o
idénticos a VAI-1 de V. fischeri (Tabla 1).
Todos estos compuestos señal presentan restos homoserina lactona
idénticos pero pueden diferir en la longitud y estructura de sus
grupos acilo. LuxI y enzimas correspondientes de otras especies
catalizan la unión de S-adenosilmetionina (SAM) y
una cadena acilo grasa derivada de conjugados
acilo-proteína portadora de grupos acilo (ACP). Los
sustratos para la biosíntesis de AHL por LuxR están disponibles
tanto en células procariotas como en células eucariotas; la
expresión de LuxI en una célula eucariota es suficiente para
producir
VAI-1.
VAI-1.
En la práctica de la presente invención se
pueden usar también análogos de autoinductores AHL naturales
("análogos de AHL"). Varios estudios de análogos de AHL han
encontrado un número de análogos de AHL que presentan actividad
significativa en sistemas de percepción de quórum, incluyendo:
análogos de
N-(3-oxohexanoil)-L-homoserina
lactona ensayados en sistemas LuxR (Eberhard y col., Arch.
Microbiol. 146:35-40, 1986; Greenberg y
col., J. Bacteriol. 178:2897-2901,
1996) y EsaR (Bycroft y col., J. Antibiot.
46:441-454, 1993); análogos de
N-(oxooctanoil)-L-homoserina lactona
ensayados en el sistema TraR (Winans y col., J. Bacteriol.
180:5398-5405, 1998); y análogos de
N-(oxododecanoil)-L-homoserina
lactona (PAI), ensayados en el sistema LasB (Iglewski y col., J.
Bacteriol. 178:5995-6000, 1996). En
general, el alargamiento o acortamiento del grupo lateral acilo en
uno o dos carbonos es el cambio mejor tolerado, tolerándose mejor
las cadenas más largas que las cadenas más cortas. El mantenimiento
del sustituyente 3-oxo se requiere generalmente para
una buena actividad, y el sustituyente 1-oxo
potencia la actividad. El sustituyente 1-oxo es
suficiente para la unión pero no para la inducción. La reducción de
la saturación de la cadena acilo se puede tolerar en cierta
medida.
Las proteínas de tipo LuxR están compuestas de
dos módulos, un dominio amino-terminal (restos
20-156 de LuxR) con una región de unión a AHL
(restos 79-120 de LuxR) y un dominio de regulación
de la transcripción carboxi-terminal (restos
160-250 de LuxR), que incluye un motivo de unión a
ADN hélice-giro-hélice (restos
190-210 de LuxR). El tercio carboxi terminal de
estas proteínas es homólogo a los dominios de unión a ADN de la
superfamilia LuxR de reguladores transcripcionales. Se ha propuesto
un mecanismo general de activación para esta superfamilia de
proteínas mediante el cual un dominio amino terminal actúa
negativamente para prevenir una interacción entre el dominio carboxi
terminal y sitios de unión a ADN diana. Esta inhibición puede
aliviarse mediante la actuación de un ligando que es un autoinductor
en el caso de proteínas de tipo LuxR o un grupo fosforilo en el caso
de reguladores de dos componentes. Las eliminaciones de hasta 40
aminoácidos del extremo carboxi terminal de LuxR dan como resultado
proteínas que siguen siendo competentes para la unión a ADN
regulador de lux pero no activan la expresión del operón lux. Por lo
tanto se requiere la región entre los aminoácidos 211 y 250 de LuxR
para la activación transcripcional posterior a la unión a ADN.
LuxR se une como un homomultímero al sitio de
unión de LuxR, que tiene simetría díada, y una región requerida para
la multimerización de restos entre los aminoácidos 116 y 161 de la
porción amino terminal de la proteína.
El sitio de unión de LuxR, o caja lux
(5'-ACCTGTAGGATCGTACAGGT-3'), es una
repetición invertida de 20 nucleótidos centrada 44 nucleótidos
cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción del operón de
luminiscencia (Devine y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
86:5688-5692, 1989; Gray y col., J.
Bacteriol. 176:3076-3080, 1994). De
manera similar, se encuentran cajas tra de 18 pares de bases
cadena arriba de al menos tres promotores regulados por TraR y se
requieren para la activación transcripcional por TraR (Fuqua y
Winans, J. Bacteriol. 178:435-440,
1996). Secuencias similares encontradas en promotores regulados por
LasR se superponen invariablemente sobre los supuestos elementos -35
de promotores de tipo \sigma^{70} en un nucleótido. Las cajas
lux y las son suficientemente similares de forma que
LuxR puede activar la transcripción a partir del promotor
lasB en presencia de VAI-1, y a la inversa,
LasR puede activar la transcripción del operón de luminiscencia en
presencia de PAI-1 (Gray y col., J.
Bacteriol. 176:3076-3080, 1994). Se han
comparado varias secuencias de tipo caja lux (denominadas también en
el presente documento como "elementos de respuesta a AHL")
(Tabla 2). La secuencia de tipo caja lux de consenso es
5'-RNSTGYAXGATNXTRCASRT-3'. Pueden
producirse elementos de respuesta a AHL sintéticos variando uno o
más nucleótidos de una secuencia de tipo caja lux nativa. Tal y como
se discute en los ejemplos más adelante en el presente documento,
cuando TraR se expresa en células de la zanahoria, un promotor que
incluye la caja traA muestra un nivel más alto de lo esperado
de actividad basal. Esta actividad basal puede reducirse
significativamente sin eliminar la sensibilidad a AHL reemplazando
la caja traA por una variante de la caja en la cual están alteradas
un número pequeño de pares de bases de la caja traA. Pueden
producirse promotores sensibles a AHL sintéticos reemplazando un
elemento de respuesta a AHL procedente de un promotor por un
elemento de respuesta a AHL procedente de otro promotor, o añadiendo
un elemento de respuesta a AHL nativo o sintético a un promotor que
carece de un elemento de respuesta a AHL funcional, tal como un
promotor mínimo. Además, pueden estar presentes dos o más elementos
de respuesta a AHL en un único promotor para hacer al promotor
sensible a más de una AHL. Un promotor que comprende uno o más
elementos de respuesta a AHL se denomina en el presente documento
"promotor sensible a AHL".
Otros promotores regulados por TraR y LasR
carecen de estos sitios. Por ejemplo, el gen lasI no presenta una
caja las reconocible cadena arriba de su promotor (Passador y
col., Science 260:1127-1130, 1993) y
sin embargo es fuertemente inducible por LasR. De manera similar, el
gen traM de A. tumefaciens parece presentar dos medios sitios
cadena arriba de su promotor en lugar de una caja tra
ortodoxa (Fuqua y col., J. Bacteriol.
177:1367-1373, 1995; Hwang y col., J.
Bacteriol. 177:449-458, 1995) y es
suavemente inducible por TraR. La proteína TraR activa también la
expresión del gen traR en un promotor que aparentemente no
presenta similitud con ningún motivo caja tra. En el caso de los
promotores TraR que presentan una fuerte similitud con los motivos
caja tra de consenso están activados hasta un alto nivel de
expresión por
3-oxooctanoil-homoserina lactona
(AAI), y los motivos más degenerados están asociados con niveles más
bajos de inducción.
Los promotores de percepción de quórum pueden
ser alterados para hacerlos sensibles a un autoinductor de tipo AHL
diferente mediante "intercambio de operador", es decir,
reemplazando secuencia(s) de tipo caja lux del promotor por
una secuencia de tipo caja lux procedente de un promotor diferente.
Por ejemplo, una secuencia de caja lux en un promotor puede ser
reemplazada por una secuencia de caja tra o las. La
sensibilidad a AHL puede modificarse también mediante "intercambio
de dominio", es decir, reemplazando una región de unión a AHL de
una proteína de tipo LuxR por la región de unión a AHL de otra
proteína de tipo LuxR de manera que la especificidad de unión a ADN
de la proteína quimérica resultante permanezca invariable. Por
ejemplo, el reemplazo de la región de unión a VAI-1
de LuxR por la región de unión a AAI-1 de TraR
provocaría la unión de la proteína quimérica resultante a la
secuencia de caja lux y la modulación de la actividad
transcripcional en respuesta a la unión del autoinductor
VAI-1. Además, el dominio de activación de una
proteína de tipo LuxR puede reemplazarse por otro dominio de
activación que sea un activador bien conocido de la expresión génica
en una célula huésped dada, tal como GAL4, VP16, u otros dominios
activadores bien conocidos.
Se han buscado nuevos miembros de la familia
LuxR-LuxI mediante la selección de bacterias para la
liberación de autoinductores usando una cepa de Escherichia
coli que contenía un regulón lux clonado pero que carecía de
luxI (y por lo tanto no sintetizaba VAI-1).
Se han llevado a cabo experimentos similares con regulador TraR de
Agrobacterium tumefaciens para seleccionar bacterias del
suelo patogénicas a plantas. Estos estudios han demostrado que LuxR
y TraR son activados por un subgrupo de autoinductores conocidos. Se
ha demostrado también que las proteínas de tipo LuxR tales como LuxR
y LasR de Pseudomonas aeruginosa activan la expresión génica
de lux después de la unión de derivados de los autoinductores
afines con alteraciones en la longitud de la cadena acilo o en los
grupos carbonilo, por ejemplo (Eberhard y col., Arch.
Microbiol. 146:35-40, 1986; Kuo y col.,
J. Bacteriol. 176:7558-7565, 1994; Kuo
y col., J. Bacteriol., 178:971-976,
1996; Pearson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
91:197-201, 1994; Fuqua y Winans, J.
Bacteriol. 176:2796-2806, 1994).
Se reseña que EsaR, ExpR y YenR son represores
de sus genes diana en lugar de activadores, y sus autoinductores
respectivos aumentan la expresión de los genes reprimidos.
Los sistemas de percepción de quórum
encontrarían muchos usos en la modulación de la expresión génica en
eucariotas. Los sistemas de percepción de quórum se pueden usar para
la activación o represión transcripcional. Esto se puede entender
mejor por analogía al uso del "sistema Tet" para modular la
transcripción de gen eucariota en base a la unión específica del
receptor de tetraciclina (TetR) a sitios de operador. Se han
desarrollado sistemas tanto "Tet-off" como
"Tet-on" (Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU., 89:5547-51, 1992). En un
principio, la represión fuerte del promotor de polimerasa II (pol
II) se consiguió colocando varios sitios de operador TetR
adyacentes a la caja TATA, el sitio de unión para un factor de
transcripción general ubicuo, TBP (proteína de unión a la caja
TATA). En ausencia de inductor (tetraciclina o un análogo de
tetraciclina), TetR se une a los sitios de operador, impidiendo
estéricamente el reconocimiento de la caja TATA por parte de TBP.
Esto previene la unión del complejo TFIID (del cual TBP es una parte
central) al promotor y ensamblaje del complejo de iniciación de la
transcripción sobre el promotor, reprimiendo de esta manera el
inicio de la transcripción. Después de la aplicación de
tetraciclina, TetR se disocia del promotor, aliviando la represión
transcripcional. Este enfoque se ha demostrado que funciona también
en plantas (Gatz, y col., Plant. J.,
2:397-404, 1992; Gatz y Quail, Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU., 85:1394-7, 1988) y se
ha aplicado también para regular promotores de polIII (Ulmasov y
col., Plant Mol. Biol., 35:417-424,
1997).
Se ha descrito una estrategia para aumentar el
intervalo dinámico de regulación génica mediante el sistema Tet
(Rossi y col., Nat. Genet.,
20:389-393, 1998). Esta estrategia aprovecha
la existencia de (1) mutantes inversos de TetR (rTetR) que se unen
al ADN sólo en presencia del ligando (un fenotipo opuesto a TetR de
tipo silvestre), y (2) isoformas de TetR que pueden formar
homodímeros (represor Tet presenta un dominio de dimerización y es
activo solamente como dímero), pero no pueden formar heterodímeros.
Fusionando la proteína del fenotipo inverso de clase B (rTetR_{B})
al dominio de activación de VP16 (para formar rtTA_{B}), y el
represor de tipo silvestre de clase G (TetR_{G}) a un dominio de
represión potente (denominado KRAB del gen kox1 humano)
creando tTR_{G}, se crearon dos tipos de factores de transcripción
eucariotas que responden al mismo ligando químico pero que ejercen
efectos opuestos sobre la transcripción. En ausencia del ligando,
solamente tTR_{G} se une cadena arriba del promotor mínimo
regulado que contiene sitios tetO y reprime de forma activa los ya
de por sí bajos niveles de transcripción basal a partir de este
promotor. En presencia del ligando, (doxiciclina, un análogo de
tetraciclina), tTR_{G} se disocia del ADN, pero rtTA_{B}
adquiere la capacidad de unirse al ADN y activa la transcripción. Al
mismo tiempo, como las proteínas TetR de clase B y de clase G no se
heterodimerizan, no se pueden formar heterodímeros no productivos
que contengan dominios tanto de activación como de represión. La
ventaja de este sistema respecto a un sistema Tet-On
convencional es una expresión de fondo menor a partir del promotor
en ausencia de inductor. Una estrategia similar se puede emplear con
el sistema de percepción de quórum descrito en el presente
documento.
Un sistema de percepción de quórum simple
estaría constituido por dos genes: (1) un gen de interés bajo el
control de un promotor sensible a AHL, es decir, un promotor que
incluye un elemento de respuesta a AHL (tal como una caja lux), y
(2) un gen que codifica un polipéptido de unión al ADN que se une
específicamente al elemento de respuesta a AHL, presentando ambos
genes promotores que son funcionales en una célula eucariota. El
polipéptido de unión a ADN incluye preferiblemente motivos de unión
a AHL (para controlar la unión del elemento de respuesta a AHL
mediante aplicación de una AHL) y un dominio de unión a ADN
hélice-giro-hélice derivado de un
receptor de AHL nativo. El polipéptido de unión a ADN
preferiblemente incluye también una región de multimerización
derivada de un receptor de AHL nativo. El polipéptido de unión a ADN
incluye también una región de activación transcripcional de un
receptor de AHL nativo (que no es funcional en eucariotas pero puede
ser funcional en cloroplastos) o un dominio de activación o de
represión transcripcional eucariota heterólogo que es bien conocido
en la técnica, excepto cuando el polipéptido de unión al ADN se usa
para la represión transcripcional pasiva por impedimento estérico,
en cuyo caso un dominio de activación o represión transcripcional es
opcional. La aplicación de una AHL y la unión de la AHL mediante el
motivo de unión a AHL del polipéptido de unión a ADN provoca la
unión específica del polipéptido de unión a ADN al elemento de
respuesta a AHL. El dominio de activación (o represión)
transcripcional del polipéptido de unión a ADN modula entonces la
transcripción del promotor sensible a AHL hasta que los niveles de
la AHL en la célula caigan por debajo de los niveles requeridos para
afectar a la expresión génica.
En el caso de represión transcripcional
"pasiva", la unión de AHL por el polipéptido de unión a ADN
provoca su unión a uno o más elemento(s) de respuesta a AHL
situados cerca de la caja TATA e interfiere estéricamente con el
inicio de la transcripción por polII. Los fragmentos de unión a ADN
del receptor de AHL, o polipéptidos de fusión recombinante que
incluyen tal dominio de unión a ADN y secuencias polipeptídicas
heterólogas, pueden usarse en lugar del polipéptido receptor de AHL
de longitud completa para tal sistema de represión
"pasivo".
El sistema de percepción de quórum puede usarse
también para la represión "activa" de la transcripción. Por
ejemplo, EsaR funciona como un represor (disociándose del ADN en
presencia de su ligando,
3-oxohexanoil-homoserina lactona,
C6-AHL); LuxR y algunos otros miembros de su familia
(por ejemplo, TraR) adquieren la capacidad de unirse a ADN solamente
en presencia del ligando. De esta forma, puede producirse un sistema
de dos factores regulado por C6-AHL que es análogo
al sistema Tet usando represión "activa" descrita
anteriormente. EsaR se fusiona a un dominio de represión y LuxR a un
dominio de activación; ambos responden a la misma AHL pero no se
pueden heterodimerizar. La única diferencia entre el sistema de dos
factores Tet descrito y un sistema de dos factores basado en
LuxR/EsaR es que, a diferencia de diferentes isoformas de TetR, EsaR
y LuxR reconocen elementos cis ligeramente diferentes. Este problema
se soluciona colocando ambos sitios de unión LuxR y EsaR cadena
arriba del promotor mínimo regulado o cambiando la especificidad de
unión a ADN de una de estas proteínas por mutagénesis o por
intercambio de dominios de unión a ADN.
Los sistemas de percepción de quórum pueden
emplearse también para proporcionar un "interruptor"
transcripcional que permanece activo indefinidamente una vez
activado mediante aplicación de AHL exógena. Entre los ejemplos de
tales interruptores se incluye el siguiente sistema de tres genes:
(1) un gen de interés bajo el control de un promotor sensible a AHL
(por ejemplo, un promotor que incluye una caja lux tal como el
promotor del luxI); (2) un gen de AHL sintasa (por ejemplo,
el gen luxI) bajo el control de un promotor que es sensible a
la misma AHL; y (3) un gen de receptor de AHL (por ejemplo, el gen
luxR) bajo el control de un promotor específico de tejido o
constitutivo, por ejemplo. Una única aplicación de AHL a una célula
transformada con los tres genes (que podría estar incluida en una
única construcción de ADN) induciría a la AHL sintasa a sintetizar
AHL, lo cual, a su vez, induciría la expresión continuada del gen de
interés. Sustratos para la producción de AHL en células de plantas,
incluyendo S-adenosilmetionina, y o bien derivados
acilo-proteína portadora de grupos acilo
(acil-ACP) o de coenzima A, están disponibles en
plastos de células de plantas. La producción de moléculas señal de
tipo AHL en plastos de células de plantas se ha demostrado
dirigiendo el producto génico de la AHL sintasa yenI desde
Yersinia entercolitica a los cloroplastos de plantas de
tabaco transgénicas (Fray, y col., (1999), Nature Biotech.,
17:1017-1020).
Células, tejidos, u organismos que contienen
construcciones en las que se usa un sistema de percepción de quórum
para controlar la expresión de un gen reportero unido de forma
operativa bien conocido, incluyendo un marcador de información (gen
chivato) tal como proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa
(luc), \beta-galactosidasa, o
\beta-glucuronidasa, o un marcador de selección
tal como un gen de resistencia al antibiótico, son útiles para
cribar análogos de AHL que sean eficaces en la modulación de la
expresión del gen reportero unido. Dichos análogos de AHL podrían
cribarse adicionalmente mediante procedimientos bien conocidos para
obtener análogos de AHL que sean no tóxicos, muestren buena
captación por parte de la célula huésped, y presenten otras
características deseables, tales como análogos de AHL útiles
agronómicamente, por ejemplo.
La resistencia a la infección por un patógeno
bacteriano puede lograrse mediante la expresión en una planta de un
gen de la AHL sintasa que produce una AHL que afecta al sistema de
percepción de quórum del patógeno. Un número de especies de
bacterias que emplean sistemas de percepción de quórum provocan
enfermedad en la planta, por ejemplo Pseudomonas stewartii
(marchitez bacteriana de Stewart y tizón de la hoja), Erwinia
carotovora (pudriciones blandas), Agrobacterium
tumefaciens (agallas en la zona de la corona), y Ralstonia
solanacearum (marchitez vascular). La expresión en una planta de
una AHL sintasa que produce una AHL usada como un inductor mediante
un patógeno bacteriano causaría la activación de genes regulados que
de lo contrario sólo se activarían cuando la densidad de población
de la bacteria fuera alta. Los genes activados son ineficaces y las
bacterias consumen energía en un proceso no productivo que limita
finalmente su crecimiento. Como un ejemplo,
N-octanoil-L-homoserina
lactona, una C8-AHL está producida por SolI de
Ralstonia solanacearum y es un buen agonista para el receptor
TraR, pero también para el receptor LuxR, que normalmente responde a
una AHL C6-sustituida. Otras especies que
normalmente responden a la C6-AHL, tales como E.
carotovora (ExpR) y P. stewartii (EsaR), por ejemplo,
pueden también antagonizarse por la C8 AHL. De esta forma, la
expresión transgénica del gen SolI en una planta conferiría
resistencia a varios patógenos bacterianos.
La expresión de un gen de la AHL sintasa en una
planta se puede usar también para hacer que las bacterias
beneficiosas produzcan antibióticos que inhiban las bacterias
patogénicas. Por ejemplo, Pseudomonas aureofaciens cepa
30-84, que se aisló de las raíces del trigo que eran
resistentes a la enfermedad take-all (pudrición de
la corona y raíz de cereales), produce un grupo de antibióticos de
fenazina. La producción de antibiótico mediante esta cepa está
regulada por una C6-AHL. La producción de la
C6-AHL en células de plantas mediante la expresión
de la AHL sintasa apropiada induce la producción de antibióticos en
P. aureofaciens e inhibe el crecimiento de hongos
patogénicos en las proximidades de la planta. (Bacterias asociadas a
plantas que emplean sistemas de percepción de quórum se revisan en
Annu. Rev. Phytopathol. 36:207-225,
1998).
Las siguientes definiciones y procedimientos se
proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a
aquellos expertos habituales en la técnica en la práctica de la
presente invención. A menos que se indique de otra forma, los
términos han de ser entendidos de acuerdo con el uso convencional
por parte de los expertos habituales en la técnica relevante. Se
pueden encontrar también definiciones de términos comunes en
biología molecular en Rieger y col., Glossary of Genetics:
Classical and Molecular, 5ª edición,
Springer-Verlag: Nueva York, 1991; y Lewin,
Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1994. Se usa la
nomenclatura para las bases de ADN tal y como se muestra en 37 CFR
\NAK1,822. Se usa para los restos de aminoácidos la nomenclatura
convencional de una y tres letras.
"(Secuencia de) ácido nucleico" o
"(secuencia de) polinucleótido" se refiere a ARN o ADN de
cadena única o de doble cadena, en concreto, un polímero de bases
ribonucleótido o desoxirribonucleótido, respectivamente, cuya
secuencia se proporciona en este documento desde el extremo 5'
(cadena arriba) hasta el extremo 3' (cadena abajo). Se incluyen las
secuencias tanto con sentido como sin sentido.
"Promotor" se refiere a una secuencia de
ácido nucleico localizada cadena arriba o 5' respecto a un codón de
partida traduccional de un marco abierto de lectura (o región que
codifica proteína) de un gen y que está implicada en el
reconocimiento y unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas
(factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la
transcripción. Un "promotor de mamífero" es un promotor nativo
o no nativo que es funcional en células de mamífero, un "promotor
de planta" es funcional en células de planta, y así
sucesivamente. Los promotores constitutivos son funcionales en la
mayoría o en todos los tejidos de un organismo a lo largo del
desarrollo. Los promotores "inducibles" expresan selectivamente
una secuencia de ADN unida de forma operativa como respuesta a la
presencia de un inductor químico endógeno o exógeno.
"Modulación" de la expresión se refiere a
cualquier cambio en la expresión, incluyendo pero sin limitación, el
aumento de la expresión (por ejemplo, inducción), reducción de la
expresión (por ejemplo, represión), o cambio en la especificidad o
momento de la expresión (por ejemplo, desde constitutiva hasta
específica de tejido), o inducibilidad de la expresión, por
ejemplo.
Promotores para la ARN polimerasa II, como
aquellos de otros eucariotas superiores, están comprendidos por
varios elementos distinguibles. Uno de estos elementos es la caja
TATA o caja Goldberg-Hogness, que se requiere para
una correcta expresión de genes eucariotas in vitro y para un inicio
preciso y eficaz de la transcripción in vivo. La caja TATA se sitúa
típicamente aproximadamente a de -25 a -35, es decir, a de 25 a 35
pares de bases (pb) cadena arriba (5') del sitio de inicio de la
transcripción, o sitio del cap, que se define como la posición +1
(Breathnach y Chambon, Ann. Rev. Biochem.
50:349-383, 1981; Messing y col., En:
Genetic Engineering of Plants, Kosuge y col., eds., páginas
211-227, 1983). Otro elemento común, la caja CCAAT,
está localizada entre -70 y -100 pb. En plantas, la caja CCAAT puede
presentar una secuencia de consenso diferente que la secuencia
funcionalmente análoga de promotores de mamífero (el análogo en
plantas se ha denominado la "caja AGGA" para diferenciarlo de
su homólogo en animales; Messing y col., En: Genetic Engineering
of Plants, Kosuge y col., eds., páginas 211-227,
1983). Además, prácticamente todos los promotores incluyen
potenciadores o secuencias de activación cadena arriba adicionales
(Benoist y Chambon, Nature
290:304-310, 1981; Gruss y col., Proc.
Nat. Acad. Sci. EE.UU. 78:943-947, 1981;
y Khoury y Gruss, Cell 27:313-314,
1983) que se extienden desde alrededor de -100 pb hasta -1.000 pb o
más cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción.
Cuando se fusionan a secuencias de ADN
heterólogas, dichos promotores hacen de forma típica que la
secuencia fusionada tenga un patrón de expresión que es similar al
de la secuencia génica con la que el promotor está asociado
normalmente. Se pueden añadir fragmentos de promotor que incluyen
secuencias reguladoras (por ejemplo, fusionados al extremo 5' de, o
insertados en, otro promotor activo que tiene sus propias secuencias
reguladoras parciales o completas (Fluhr y col., Science
232:1106-1112, 1986; Ellis y col., EMBO
J. 6:11-16, 1987; Strittmatter y Chua,
Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU.
84:8986-8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol.
Gen. Genet. 214:16-23, 1988; Comai y
col., Plant Mol. Biol. 15:373-381,
1991)). Alternativamente, se han añadido secuencias reguladoras
heterólogas a la región cadena arriba 5' de un promotor truncado
inactivo, por ejemplo, un promotor que incluye solamente el núcleo
TATA y, a veces, los elementos CCAAT (Fluhr y col., Science
232:1106-1112, 1986; Strittmatter y Chua,
Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU.
84:8986-8990, 1987; Aryan y col., Mol.
Gen. Genet. 225:65-71, 1991).
Los promotores típicamente están comprendidos
por múltiples "elementos reguladores transcripcionales que actúan
en cis" distinguibles, o simplemente "elementos cis", cada
uno de los cuales parece conferir un aspecto diferente del control
global de la expresión génica (Strittmatter y Chua, Proc. Nat.
Acad. Sci. EE.UU. 84:8986-8990, 1987;
Ellis y col., EMBO J. 6:11-16, 1987;
Benfey y col., EMBO J. 9:1677-1684,
1990). Dichos elementos cis unen factores proteicos que actúan en
trans que regulan la transcripción. Algunos elementos cis unen más
de un factor, y los factores de transcripción que actúan en trans
pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un elemento
cis (Johnson y McKnight, Ann. Rev. Biochem.
58:799-839, 1989). Por ejemplo en: Martin,
Curr. Opinions Biotech. 7:130-138,
1996; Murai, En: Methods in Plant Biochemistry and Molecular
Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, páginas
397-422; y Methods in Plant Molecular
Biology, Maliga y col., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995,
páginas 233-300 se discuten factores de
transcripción de plantas, elementos cis correspondientes, y el
análisis de sus interacciones.
Los promotores se pueden manipular para producir
promotores sintéticos o quiméricos que combinan elementos cis de dos
o más promotores, por ejemplo, añadiendo una secuencia reguladora
heteróloga a un promotor activo con sus propias secuencias
reguladoras parciales o completas (Ellis y col., EMBO J.
6:11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc.
Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84:8986-8990,
1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet.
214:16-23, 1988; Comai y col., Plant Mol.
Biol. 15:373-381, 1991). Se han
desarrollado también promotores quiméricos añadiendo una secuencia
reguladora heteróloga a la región cadena arriba 5' de un promotor
truncado inactivo (también denominado promotor "mínimo"), es
decir, un promotor que incluye solamente el núcleo TATA y,
opcionalmente, elementos CCAAT (Fluhr y col., Science
232:1106-1112, 1986; Strittmatter y Chua,
Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU.
84:8986-8990, 1987; Aryan y col., Mol.
Gen. Genet. 225:65-71, 1991). Se pueden
obtener elementos cis mediante síntesis química o mediante clonación
a partir de promotores que incluyen dichos elementos, y pueden
sintetizarse con secuencias de flanqueo adicionales que contienen
sitios de enzima de restricción útiles para facilitar la posterior
manipulación.
Un promotor "mínimo" o "basal" es
capaz de reclutar y unir el complejo ARN polimerasa II y sus
proteínas accesorias para permitir el inicio y la elongación
transcripcionales. Sin embargo, un promotor mínimo carece de
secuencias cis que recluten y unan factores de transcripción que
modulan (por ejemplo, potencian, reprimen, confieren especificidad
de tejido, confieren capacidad de inducción o capacidad de
represión) la transcripción.
"Nativo". El término "nativo/a"
se usa indistintamente con los términos "tipo silvestre" o
"de origen natural".
"Heteróloga". Una secuencia
"heteróloga" se origina a partir de una fuente o especie
foránea o, si procede de la misma fuente, está modificada respecto a
su forma original.
"Aislada". Una secuencia de ácido
nucleico "aislada" está sustancialmente separada o retirada por
purificación de otras secuencias de ácido nucleico con las que el
ácido nucleico está normalmente asociado en la célula del organismo
en la cual el ácido nucleico aparece de forma natural, en concreto,
otro ADN cromosómico o extracromosómico. El término abarca ácidos
nucleicos que están bioquímicamente purificados de forma que se
retiren sustancialmente ácidos nucleicos contaminantes y otros
componentes celulares. El término abarca también ácidos nucleicos
recombinantes y ácidos nucleicos sintetizados químicamente.
Identidad Sustancial de Secuencia de
Nucleótidos. La presente invención abarca secuencias de
polinucleótidos que son sustancialmente idénticas a una secuencia de
polinucleótidos nativa, que comprenden preferiblemente solamente
sustituciones de aminoácidos conservativas respecto a una secuencia
nativa, y manteniendo de forma más preferible una similitud
funcional. Cuando se hace referencia a un gen de la AHL sintasa o
gen del receptor de AHL particular, por ejemplo, están incluidas
dichas secuencias sustancialmente similares.
Un primer ácido nucleico muestra "identidad
sustancial" respecto a una secuencia de ácido nucleico de
referencia si, cuando están alineadas de forma óptima (con
inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas de un total del
20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la
ventana de comparación) con el otro ácido nucleico (o su cadena
complementaria), existe al menos aproximadamente un 75% de identidad
de secuencia de nucleótidos, preferiblemente al menos
aproximadamente un 80% de identidad, de forma más preferible al
menos aproximadamente un 85% de identidad, y de la forma más
preferible al menos aproximadamente un 90% de identidad a lo largo
de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de
nucleótidos, preferiblemente al menos 50 posiciones de nucleótidos,
de forma más preferible al menos 100 posiciones de nucleótidos, y de
la forma más preferible a lo largo de la longitud entera del primer
ácido nucleico. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear
una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante el
algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl.
Math. 2:482, 1981; mediante el algoritmo de alineamiento
para homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.
48:443, 1970; mediante el procedimiento de búsqueda de
similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
85:2444, 1988; preferiblemente mediante implementaciones
computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en
el paquete de software Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). El ácido nucleico de
referencia puede ser una molécula de longitud completa o una porción
de una molécula más larga.
Alternativamente, dos ácidos nucleicos son
sustancialmente similares si uno se hibrida con el otro en
condiciones de hibridación rigurosas, tal y como se define más
adelante en el presente documento.
Utilización preferencial de determinados
codones: Con el fin de optimizar la traducción de un gen
procariota (tal como un gen nativo que codifica una AHL sintasa o un
receptor de AHL) en una célula huésped eucariota, uno o más codones
del gen pueden ser alterados para reflejar la utilización
preferencial de determinados codones de la célula huésped eucariota,
es decir, los codones que están estadísticamente representados de
forma más elevada en los genes de esa célula que en el gen
procariota.
"Unido/a de forma operativa". Una
primera secuencia de ácido nucleico está "unida de forma
operativa" con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando las
secuencias están dispuestas de tal manera que la primera secuencia
de ácido nucleico afecta a la función de la segunda secuencia de
ácido nucleico. De forma preferible, las dos secuencias son parte de
una única molécula de ácido nucleico contigua y de forma más
preferible son adyacentes. Por ejemplo, un promotor está unido de
forma operativa a un gen si el promotor lleva a cabo o media la
transcripción del gen en una célula.
"Recombinante". Un ácido nucleico
"recombinante" se construye mediante una combinación artificial
de dos segmentos de secuencia que de lo contrario estarían
separados, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la
manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas
de ingeniería genética.
Se conocen bien técnicas para la manipulación de
ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, segunda edición, vol. 1-3,
ed. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1989 (en lo sucesivo en el presente documento,
"Sambrook y col., 1989"); Current Protocols in Molecular
Biology, ed. Ausubel y col., Greene Publishing and
Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con
actualizaciones periódicas) (en lo sucesivo en el presente
documento, "Ausubel y col., 1992"). Los procedimientos para la
síntesis química de ácidos nucleicos se discuten, por ejemplo, en
Beaucage y Carruthers, Tetra. Letts.
22:1859-1862, 1981, y Matteucci y col., J.
Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981. La síntesis química de
ácidos nucleicos se puede llevar a cabo, por ejemplo, en
sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comerciales.
Preparación de ácidos nucleicos recombinantes
o sintetizados químicamente: Vectores, Transformación, Células
huésped. Se pueden incorporar ácidos nucleicos naturales o
sintéticos de acuerdo con la presente invención en construcciones de
ácido nucleico recombinante, típicamente construcciones de ADN,
capaces de introducción y replicación en una célula huésped. Dicha
construcción es preferiblemente un vector que incluye un sistema de
replicación (secuencia de replicación autónoma [ARS] u origen de
replicación [ori]) y secuencias que hacen posible la transcripción y
traducción de una secuencia que codifica polipéptido en una célula
huésped dada.
Para la práctica de la presente invención, se
discuten composiciones y procedimientos convencionales para preparar
y usar vectores y células huésped y ejemplos de combinaciones
funcionales de células huésped y vectores, entre otros, en Sambrook
y col., 1989, o Ausubel y col., 1992. Se seleccionan secuencias de
promotor y otras secuencias de vector necesarias de manera que sean
funcionales en una célula huésped particular.
Se han descrito un número de vectores adecuados
para la transfección estable de células de plantas o para el
establecimiento de plantas transgénicas en, por ejemplo, Pouwels y
col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, sup. 1987;
Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology,
Academic Press, 1989; y Gelvin y col., Plant Molecular Biology
Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, vectores
de expresión eucariotas incluyen, por ejemplo, uno o más genes
clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras
5' y 3' y un marcador de selección. Secuencias de control
reguladoras incluyen, pero sin limitación, un promotor (incluyendo
un sitio de inicio de la transcripción), un sitio de unión al
ribosoma, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de
terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación.
Secuencias reguladoras a partir de la región 3'-no
traducida de genes de plantas incluyen, por ejemplo, regiones
3'-de terminación para aumentar la estabilidad ARNm
del ARNm, tales como la región de terminación PI-II
de patata o las regiones 3'-de terminación de la
octopina o nopalina sintasa (Thornburg y col., Proc. Natl. Acad.
Sci EE.UU. 84:744, 1987; An y col., Plant Cell
1:115 (1989)). Se puede usar cualquier gen marcador de
selección bien conocido, incluyendo, por ejemplo, genes que
codifican genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo,
resistencia a higromicina, kanamicina, bleomicina, G418,
estreptomicina o espectinomicina); y genes de resistencia a
herbicidas (por ejemplo, fosfinotricina acetiltransferasa). Dichas
secuencias reguladoras 5' y 3', secuencias de terminación de la
transcripción, señales de poliadenilación, marcadores de selección,
etc. para uso en otras células eucariotas, por ejemplo, en células
de levadura, de mamífero u otros tipos de células, son bien
conocidas en la técnica.
Entre los ejemplos de promotores de plantas
constitutivos útiles para la expresión génica en plantas se incluyen
el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que
confiere una expresión de alto nivel y constitutiva en la mayoría de
los tejidos de las plantas (véase, por ejemplo, Odel y col.,
Nature 313:810, 1985), incluyendo monocot (véase, por
ejemplo, Dekeyser y col., Plant Cell 2:591, 1990;
Terada y Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220:389, 1990);
el promotor de la nopalina sintasa (An y col., Plant Physiol.
88:547, 1988) y el promotor de la octopina sintasa (Fromm y
col., Plant Cell 1:977, 1989).
Puede ser también ventajoso utilizar un sistema
de percepción de quórum de acuerdo con la presente invención para
regular la expresión de transgenes en orgánulos, incluyendo plastos
tales como cloroplastos y mitocondrias. Por ejemplo, un gen que
codifica un polipéptido que comprende (1) una secuencia de dirección
al orgánulo (por ejemplo, cloroplasto) fusionada en fase con (2) un
polipéptido receptor de AHL (por ejemplo, LuxR) se expresa a partir
de un casete de expresión en el genoma nuclear de la célula de la
planta. El receptor de AHL es dirigido al orgánulo mediante la
secuencia de dirección y se activa por medio del inductor AHL para
modular la actividad de un promotor sensible a AHL en el genoma del
orgánulo. Alternativamente, un gen que codifica el receptor de AHL
puede expresarse en el interior del orgánulo, por ejemplo, mediante
la incorporación en el genoma organular, bajo el control de un
promotor que es funcional en el orgánulo para modular la expresión
de un promotor sensible a AHL en el orgánulo. Como una opción en
cualquier caso, la AHL sintasa (por ejemplo, LuxI) podría expresarse
o bien en el núcleo o en el orgánulo.
Pueden prepararse las construcciones de
expresión para dirigir la expresión del regulador transcripcional a
partir del núcleo de la célula de la planta, y dirigir la expresión
de la secuencia de ADN de interés expresada a partir del promotor
regulable en el plasto de la célula de la planta. Dichas
construcciones pueden requerir el uso de un péptido de tránsito al
cloroplasto (CTP), tal como el CTP de la subunidad pequeña
ribulosa-bisfosfato carboxilasa (ssuCTP), para
dirigir la proteína activadora/represora al plasto de la célula de
la planta. En la patente de EE.UU. nº 5.576.198, por ejemplo, se
describen procedimientos para la transcripción regulada de
secuencias de ADN en el plasto usando secuencias de control
expresadas a partir del núcleo.
Además, se pueden preparar construcciones de
expresión para dirigir la expresión de tanto el regulador
transcripcional como de la secuencia de ADN de interés a partir del
plasto de la célula de la planta.
Hibridación de ácido nucleico; "Condiciones
Rigurosas"; "Específica". Los cebadores y las sondas de
ácido nucleico de la presente invención se hibridan en condiciones
rigurosas a una secuencia de ADN diana. El término "condiciones
rigurosas" se define como condiciones bajo las cuales una sonda o
cebador se híbrida específicamente con una(s)
secuencia(s) diana y no con secuencias que no son diana, tal
y como se puede determinar empíricamente. El término "condiciones
rigurosas" se define funcionalmente con respecto a la hibridación
de una sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico diana (es decir,
a una secuencia de ácido nucleico particular de interés) mediante el
procedimiento de hibridación específica discutido en Sambrook y
col., 1989, en 9.52-9.55. Véase también, Sambrook y
col., 1989, en 9.47-9.52, 9.56-9.58;
Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12:203:213, 1984; y Wetmur
y Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370,
1968. De forma preferible, la hibridación usando cebadores o sondas
de ARN o ADN se lleva a cabo a 65ºC en 6x SSC, SDS al 0,5%, 5x
solución de Denhardt, 100 \mug/ml de ADN no específico (por
ejemplo, ADN de esperma de salmón sonicado) con lavado a 0,5x SSC,
SDS al 0,5% a 65ºC. Se pueden usar temperaturas de hibridación y/o
lavado inferiores para identificar secuencias relacionadas que
presentan un menor grado de similitud de secuencia si se conserva la
especificidad de unión de la sonda o cebador a la(s)
secuencia(s) diana.
Con respecto a la amplificación de una secuencia
de ácido nucleico diana (por ejemplo, mediante PCR) usando una
pareja de cebadores de amplificación particular, "condiciones
rigurosas" son condiciones que permiten que la pareja de
cebadores se hibride solamente a la secuencia de ácido nucleico
diana a la que se uniría un cebador que presentara la secuencia de
tipo silvestre correspondiente (o su complementaria) y produzca de
forma preferible un producto de amplificación único.
Fragmentos, Sondas, y Cebadores. Un
fragmento de un ácido nucleico es una porción del ácido nucleico que
es menor que su longitud completa y que comprende al menos una
longitud mínima capaz de hibridarse específicamente con un ácido
nucleico nativo en condiciones de hibridación rigurosas. La longitud
de dicho fragmento es preferiblemente de al menos 15 nucleótidos,
más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos, y de la forma más
preferible de al menos 30 nucleótidos de una secuencia de ácido
nucleico nativo.
Se pueden preparar cebadores y sondas de ácido
nucleico en base a una secuencia génica nativa. Una "sonda" es
un ácido nucleico aislado al que está unido una etiqueta detectable
o molécula informadora convencional, por ejemplo, un isótopo
radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima.
"Cebadores" son ácidos nucleicos aislados que son apareados a
una cadena de ADN diana complementaria mediante hibridación de ácido
nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN
diana, después se extiende a lo largo de la cadena de ADN diana
mediante una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Se pueden
usar parejas de cebadores para la amplificación de una secuencia de
ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácido
nucleico convencionales.
Las sondas y los cebadores tienen generalmente
una longitud de 15 nucleótidos o más, de forma preferible de 20
nucleótidos o más, de forma más preferible de 25 nucleótidos, y de
la forma más preferible de 30 nucleótidos o más. Dichas sondas y
cebadores se hibridan específicamente a una secuencia de ARN o ADN
diana bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad. De forma
preferible, las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente
invención presentan una similitud de secuencia completa con una
secuencia diana, aunque se pueden diseñar mediante procedimientos
convencionales sondas que difieren de una secuencia diana que
mantengan la capacidad de hibridarse con la secuencia diana.
Los procedimientos para preparar y usar sondas y
cebadores se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989;
Ausubel y col., 1992; e Innis y col., PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Las
parejas de cebadores para PCR se pueden derivar de una secuencia
conocida, por ejemplo, usando programas de ordenador pretendidos
para ese fin tales como Primer (Versión 0.5, © 1991, Whitehead
Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Amplificación de ácido nucleico. Tal y
como se usa en el presente documento, "ADN amplificado" se
refiere al producto de amplificación de ácido nucleico de una
secuencia de ácido nucleico diana. La amplificación de ácido
nucleico se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los diversos
procedimientos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la
técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En
la técnica se conocen una variedad de procedimientos de
amplificación y se describen, entre otros, en las patentes de EE.UU.
n^{os} 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide To
Methods and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San
Diego, 1990.
Variantes de Secuencia de Nucleótidos de
Ácidos Nucleicos Nativos. Usando el nucleótido y la secuencia de
los promotores descritos en el presente documento, los expertos en
la técnica pueden crear moléculas de ADN que presenten variaciones
minoritarias en su secuencia de nucleótidos.
Moléculas de ADN "variantes" son moléculas
de ADN que contienen cambios en los cuales uno o más nucleótidos de
una secuencia de ADN nativo están eliminados, añadidos, y/o
sustituidos, preferiblemente manteniendo sustancialmente al mismo
tiempo la función promotora, o, en el caso de un fragmento de
promotor, de afectar la transcripción de un promotor mínimo al que
está unido de forma operativa. Se pueden producir moléculas de ADN
variantes, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis de ADN
convencionales o sintetizando químicamente la molécula de ADN
variante o una porción de la misma.
Se pueden eliminar uno o más pares de bases a
partir del extremo 5' o 3' de una secuencia de promotor para
producir un promotor "truncado". Se pueden insertar, eliminar,
o sustituir internamente a una secuencia de promotor uno o más pares
de bases. Se pueden construir promotores en los cuales fragmentos o
elementos del promotor están unidos de forma operativa, por ejemplo,
colocando dicho fragmento cadena arriba de un promotor mínimo. Se
pueden combinar sustituciones, eliminaciones, inserciones o
cualquier combinación de las mismas para producir una construcción
final.
Una célula, tejido, órgano u organismo en el
cual se ha introducido un ácido nucleico foráneo, tal como un vector
recombinante, se considera "transformado", "transfectado",
o "transgénico". Una célula u organismo "transgénico" o
"transformado" incluye también la progenie de la célula u
organismo. En el caso de las plantas, una célula "transgénica"
o "transformada" incluye también la progenie producida a partir
de un programa de cultivo que emplea dicha planta "transgénica"
como un precursor en un cruzamiento y que muestra un fenotipo
alterado que resulta de la presencia y expresión de una construcción
de ácido nucleico recombinante.
Se puede usar cualquier variedad de planta en la
práctica de la presente invención incluyendo, pero sin limitación,
plantas de cultivo monocotiledóneas y dicotiledóneas tales como
maíz, soja, trigo, arroz, cebada, Brassica (por ejemplo,
semilla de aceite de colza), algodón, lino, girasol, cártamo, sorgo,
tabaco, lechuga, zanahoria, brécol y coliflor, sandía, tomate, melón
y calabaza.
Construcciones de ácido nucleico tal y como se
han descrito anteriormente, particularmente vectores de expresión
que incluyen un gen de interés que se expresa bajo el control de un
promotor sensible a AHL, son útiles en una amplia variedad de
contextos.
En plantas transgénicas, por ejemplo, dichas
construcciones se pueden usar para preparar plantas estériles
masculinas o femeninas, usando un promotor sensible a AHL para
modular la expresión de un gen que afecta a la función reproductora,
por ejemplo matando un tejido reproductor masculino o femenino,
haciendo un tejido reproductor masculino o femenino sensible al daño
por parte de un compuesto químico exógeno tal como un herbicida o
antibiótico, o interfiriendo con la función o desarrollo normal de
un tejido reproductor masculino o femenino, por ejemplo. Dichas
plantas estériles masculinas o femeninas son útiles para el cultivo
híbrido. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n^{os}
5.356.799, 5.478.369, 5.633.441, 5.689.041, 5.723.763, 5.728.558,
5.728.926, 5.741.684, 5.750.867, 5.767.374; patentes europeas EP
329.308, 412.911; y documento WO 90/08828.
En plantas transgénicas que se transforman con
vectores que incluyen no solamente un gen que codifica el receptor
de AHL sino también tanto un gen de interés como un gen que codifica
la AHL sintasa transcritos bajo el control de un promotor sensible a
AHL correspondiente, la aplicación una vez de una AHL adecuada
provoca la expresión del gen de interés de una manera continuada
como resultado de la síntesis continuada de la AHL en la planta por
autoinducción. Por lo tanto, la AHL puede aplicarse en forma de un
revestimiento de semilla, o por medio de un pulverizador u otra
forma de aplicación en un momento apropiado para estimular la
expresión del gen sensible a AHL. La expresión del gen de interés
puede estar restringida a un tejido u órgano deseado, por ejemplo,
mediante el uso de un promotor específico de tejido o de órgano para
conducir la expresión del gen que codifica el receptor de AHL.
La presente invención puede usar formulaciones
que incluyen una cantidad de una o más AHL que sea eficaz para
modular la expresión de un gen en una célula, por ejemplo, una
célula de planta, que ha sido puesta bajo el control de un promotor
sensible a AHL.
\newpage
Dichas composiciones (preferiblemente
composiciones acuosas), cuando se aplican a las plantas, se aplican
al follaje, al suelo, o a la superficie del agua (por ejemplo, en un
campo de arroz). Dichas composiciones pueden aplicarse también en
forma de un tratamiento de semilla, por ejemplo, empapando semillas
en una formulación líquida que contiene el compuesto de acuerdo con
la invención o revistiendo semillas con el compuesto.
Dichas composiciones pueden incluir uno o más de
los compuestos anteriores y, opcionalmente, otros ingredientes
activos e inactivos. Por ejemplo, los compuestos anteriores pueden
usarse en combinación con otros ingredientes activos o inactivos,
tales como reguladores del crecimiento de las plantas, herbicidas,
fungicidas, insecticidas, nematicidas, y bactericidas, por
ejemplo.
Un compuesto se puede aplicar al medio de
crecimiento o a las plantas que se van a tratar bien como tal o como
un componente de una formulación que también incluye un vehículo
agronómicamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes
activos, incluyendo otros compuestos citados anteriormente. Por
"vehículo agronómicamente aceptable" se entiende cualquier
sustancia líquida o sólida que se pueda usar para disolver,
dispersar, o difundir un compuesto en la composición sin alterar la
eficacia del compuesto y que por sí misma no presente efectos
perjudiciales significativos para el suelo, equipo, cultivos, o
entorno agronómico. Dichas composiciones incluyen formulaciones o
soluciones líquidas o sólidas, incluyendo polvos humectables,
concentrados emulsionables, polvos, gránulos, granzas, aerosoles,
concentrados de emulsión fluida, suspensiones, y soluciones, que
pueden prepararse de acuerdo con cualquier procedimiento
convencional. Una composición puede diluirse con un vehículo sólido
o líquido agronómicamente adecuado. Dichas composiciones pueden
incluir también uno o más adyuvantes agronómicamente aceptables
tales como agentes tensioactivos aniónicos, catiónicos, o no iónicos
(agentes humectantes, agentes de extensión, agentes de dispersión,
agentes de suspensión, y agentes emulsionantes), agentes de
acondicionamiento, agentes de adherencia y adhesivos. Se
pueden encontrar ejemplos de adyuvantes útiles en "Detergents and Emulsifier's Annual" (John W. McCutcheon, Inc.).
pueden encontrar ejemplos de adyuvantes útiles en "Detergents and Emulsifier's Annual" (John W. McCutcheon, Inc.).
Las composiciones preferidas incluyen líquidos y
polvos humectables, que contienen preferiblemente como un agente de
acondicionamiento uno o más agentes tensioactivos en cantidades
suficientes para hacer al/a los ingredien-
te(s) activo(s) fácilmente dispersables en agua o en aceite. La incorporación de un agente tensioactivo en el compuesto puede potenciar su eficacia. Entre los agentes de humectación adecuados se incluyen pero sin limitación alquil benceno y alquil naftaleno sulfonatos, alcoholes grasos sulfonados, aminas o amidas de ácido, ésteres de ácido de cadena larga de isotionato sódico, ésteres de sulfosuccinato sódico, ésteres de ácidos grasos sulfatados o sulfonados, sulfonatos de petróleo, aceites vegetales sulfonados, glicoles acetilénicos diterciarios, derivados de polioxietileno o alquilfenilos (particularmente isooctilfenol y nonilfenol) y derivados de polioxietileno de los ésteres de ácidos grasos nono-superiores de anhídridos de hexitol (por ejemplo, sorbitano). Entre los tensioactivos se incluyen pero sin limitación dihexil éster del ácido sulfonsuccínico de sodio, monolaurato de sorbitano POE 20, y octilfenoxi polietoxi etanol. Polvos humectables o gránulos dispersables son composiciones dispersables en agua que contienen uno o más ingredientes activos, un extensor sólido inerte, y uno o más agentes de humectación y dispersión. Los extensores sólidos inertes son normalmente de origen mineral tales como las arcillas naturales, tierra de diatomeas, sales y minerales sintéticos, derivados de sílice y similares. Entre los ejemplos de tales extensores se incluyen caolinitas, arcilla atapulgita, sales y silicato de magnesio sintético.
te(s) activo(s) fácilmente dispersables en agua o en aceite. La incorporación de un agente tensioactivo en el compuesto puede potenciar su eficacia. Entre los agentes de humectación adecuados se incluyen pero sin limitación alquil benceno y alquil naftaleno sulfonatos, alcoholes grasos sulfonados, aminas o amidas de ácido, ésteres de ácido de cadena larga de isotionato sódico, ésteres de sulfosuccinato sódico, ésteres de ácidos grasos sulfatados o sulfonados, sulfonatos de petróleo, aceites vegetales sulfonados, glicoles acetilénicos diterciarios, derivados de polioxietileno o alquilfenilos (particularmente isooctilfenol y nonilfenol) y derivados de polioxietileno de los ésteres de ácidos grasos nono-superiores de anhídridos de hexitol (por ejemplo, sorbitano). Entre los tensioactivos se incluyen pero sin limitación dihexil éster del ácido sulfonsuccínico de sodio, monolaurato de sorbitano POE 20, y octilfenoxi polietoxi etanol. Polvos humectables o gránulos dispersables son composiciones dispersables en agua que contienen uno o más ingredientes activos, un extensor sólido inerte, y uno o más agentes de humectación y dispersión. Los extensores sólidos inertes son normalmente de origen mineral tales como las arcillas naturales, tierra de diatomeas, sales y minerales sintéticos, derivados de sílice y similares. Entre los ejemplos de tales extensores se incluyen caolinitas, arcilla atapulgita, sales y silicato de magnesio sintético.
Los compuestos anteriores pueden disolverse en
cualquier disolvente adecuado, incluyendo pero sin limitación, uno o
una mezcla de los siguientes: agua, alcoholes, cetonas,
hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos halogenados,
dimetilformamida, dioxano, y dimetilsulfóxido. La concentración del
ingrediente activo en la solución resultante puede determinarse
empíricamente.
Con el fin de producir concentrados
emulsionables, los compuestos se disuelven en un disolvente orgánico
tal como benceno, tolueno, xileno, naftaleno metilado, aceite de
maíz, terpentina, o-diclorobenceno, isoforona,
ciclohexano, u oleato de metilo, o mezclas de los mismos, junto con
un agente emulsionante convencional que permite la dispersión en
agua, por ejemplo, derivados óxido de etileno de alquilfenoles o
alcoholes de cadena larga, mercaptanos, ácidos carboxílicos, aminas
reactivas, y alcoholes polihídricos parcialmente esterificados.
Pueden usarse como emulsionantes sulfatos o sulfonatos solubles en
disolvente, tales como las sales de metales alcalinotérreos o sales
de amina de alquilbencenosulfonatos y los sulfatos sódicos de
alcoholes grasos, que presentan propiedades tensioactivas ya sea en
solitario o junto con un producto de reacción de tipo óxido de
etileno. Los concentrados de emulsión fluida se formulan de forma
similar e incluyen, además de los componentes de los concentrados
emulsionables anteriores, agua y un agente estabilizante tal como un
derivado de celulosa soluble en agua o una sal soluble en agua de un
ácido poliacrílico. La concentración del ingrediente activo en
dichos concentrados emulsionables es generalmente del 10% al 60% en
peso y en concentrados de emulsión que fluye libremente es
generalmente del 10% al 75% en peso.
Polvos humectables adecuados para la
pulverización son mezclas de un compuesto anterior, un sólido
finamente dividido (tal como una arcilla, un carbonato o silicato
orgánico, o un gel de sílice), y un agente humectante, agente de
adherencia, y/o agente de dispersión. La concentración de/de los
ingrediente(s) activo(s) en dichos polvos está
generalmente entre aproximadamente el 20% y el 98% en peso y está
preferiblemente entre un 40% y un 75% en peso. Un agente de
dispersión está presente opcionalmente en una concentración de entre
el 0,5% y el 3% en peso de la composición. Un agente humectante
puede constituir entre el 0,1% y el 5% en peso de la
composición.
Polvos son mezclas de uno o más de los
compuestos anteriores con sólidos orgánicos o inorgánicos inertes
finamente divididos tales como harinas botánicas, almidón,
diatomita, sílices, silicatos, carbonatos, y arcillas. Un
procedimiento para preparar un polvo es diluir un polvo humectable
con un vehículo finamente dividido. Un concentrado de polvo que
contiene entre aproximadamente un 20% y un 80% de/de los
ingrediente(s) activo(s) se puede diluir hasta una
concentración final entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un
10% en peso del polvo.
Las formulaciones particuladas (por ejemplo,
granulares) se preparan impregnando el/los ingrediente(s)
activo(s) en un material sólido, tal como tierra Fuller
granular, vermiculita, mazorcas de maíz trituradas, harina de maíz,
cáscaras de semilla (incluyendo salvado u otras cáscaras de grano),
u otros materiales. Una solución de uno o más de los compuestos
anteriores en un disolvente orgánico volátil se pulveriza o se
mezcla con el sólido granular y el disolvente se retira por
evaporación. El material granular puede tener cualquier tamaño
adecuado, preferiblemente entre 1,18 mm y 0,25 mm (malla de 16 a
60). El ingrediente activo representa generalmente del 2% al 15% en
peso de la formulación. De forma alternativa, la formulación se
puede incorporar en formulaciones particuladas de liberación
controlada mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, por
encapsulación mediante polimerización interfacial y coacervación;
disolviendo el ingrediente activo en una solución junto con un
polímero seguido de evaporación del disolvente; mezclando el
ingrediente activo con una cera o polímero (mezclando ingredientes
secos seguido de fusión de la mezcla, o mezclando el ingrediente
activo con un polímero o cera fundida, seguido de la solidificación
de la mezcla), produciendo después partículas de la mezcla mediante
prilado, trituración, extrusión o pulverización por congelación. El
ingrediente activo representa generalmente entre el 5% y el 50% de
dicha formulación de liberación controlada.
Se pueden formular sales de los compuestos
anteriores y aplicarse como soluciones acuosas a una concentración
de entre el 0,05% y el 50% en peso y preferiblemente entre el 0,1% y
el 10% en peso y aplicarse a los cultivos en esta forma. Dichas
soluciones se pueden preparar como concentrados que se diluyen con
un disolvente acuoso u otro disolvente apropiado hasta la
concentración deseada para su uso. Dichas soluciones incluyen
opcionalmente un agente tensioactivo y/o uno o más materiales
auxiliares para aumentar la actividad del ingrediente activo, tales
como glicerina, metiletilcelulosa, hidroxietil celulosa,
polioxietilensorbitan monooleato, polipropilenglicol, ácido
poliacrílico, polietilen sodio malato, u óxido de polietileno.
Dichos materiales auxiliares están presentes generalmente a una
concentración del 0,1% al 5% en peso, preferiblemente entre el 0,5%
y el 2% en peso de la solución. Dichas composiciones pueden incluir
también opcionalmente un tensioactivo agronómicamente aceptable.
Los compuestos y formulaciones de la invención
pueden aplicarse mediante un procedimiento convencional, incluyendo
pero sin limitación, pulverizaciones hidráulicas, pulverizaciones
aéreas, o polvos. Para aplicaciones de bajo volumen se usa
normalmente una solución del compuesto. La formulación, el volumen,
la concentración, la tasa de aplicación, el momento de la aplicación
(incluyendo la etapa del desarrollo de la planta), y el
procedimiento de aplicación apropiados dependerán de una serie de
factores tales como el tipo de planta, el tipo de suelo, la
fertilidad y factores medioambientales.
Tal y como se usa en el presente documento, el
término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una AHL
o análogo de AHL (o mezcla que incluye dos o más AHL o análogos de
AHL) en una composición que es suficiente para modular la expresión
de un gen bajo el control de un promotor sensible a AHL,
preferiblemente una inducción o reducción de la expresión que es de
al menos dos veces, preferiblemente cinco veces, y de forma más
preferible al menos de diez veces en comparación con la actividad
basal en ausencia de la AHL.
El procedimiento de la presente invención es
útil para la modulación de la expresión génica en una amplia
variedad de animales o células o tejidos animales, incluyendo hongos
(por ejemplo, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae),
nematodos, insectos, anfibios, aves, y mamíferos, por ejemplo. Se
puede usar cualquier formulación convencional para administrar una
AHL a dicha célula, tejido u organismo.
El inductor para el control del sistema lux en
Vibrio fisheri,
N-(3-oxohexanoil)-L-homoserina
lactona (OHHL, denominado también VAI-1) se
sintetiza u obtiene a partir de una fuente comercial. Los
procedimientos para la producción del inductor OHHL están descritos
por Eberhard y col., Biochemistry
20:2444-2449, 1981. Otros inductores AHL
pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales.
Se preparan una serie de construcciones
efectoras y reporteras para dirigir la expresión de LuxR y proteínas
relacionadas y de la caja lux-GUS respectivamente.
Las construcciones efectoras contienen el regulador transcripcional,
y las construcciones reporteras contienen el promotor regulable que
alberga las secuencias de la caja lux.
Las construcciones reporteras que emplean el gen
reportero iudA (Jefferson y col., Proc. Natl. Acad.
Sci., 83:8447-8451, 1986) asociado de
forma operativa con la caja luxR se preparan tal y como se describe
más adelante. Se clonan en múltiples copias oligonucleótidos de
cadena doble que codifican LuxR o sitios de unión homólogos en una
construcción promotor 35S mínimo-reportero GUS. Las
secuencias de los oligonucleótidos son tal y como se muestra a
continuación:
caja | EsaR | 5'-AACTTAACCTGCACTATAGTACAGGTAACA-3' | |
caja | LuxI | 5'-AACTTAACCTGTAGGATCGTACAGGTAACA-3' | |
caja | LasB | 5'-AACTTAACCTGCCAGTTCTGGCAGGTAACA-3' | |
caja | TraR | 5'-AACTTAACGTGCAGATCTGCACATAACA-3' |
En la Figura 4 se muestra un ejemplo de la
construcción reportera, pMON53009, para EsaR. Se clonan cuatro
copias del oligonucleótido caja EsaR cadena arriba del promotor 35S
de CaMV mínimo (-46 truncado). Al promotor 35S mínimo le sigue el
potenciador de la traducción W procedente de la proteína de la
cápsida de TMV, gen \alpha-glucuronidasa
iudA de E. coli (GUS), y la región
3'-no traducida del gen nopalina sintasa (3'NOS),
que proporciona un terminador de la transcripción y una señal de
poliadenilación. Las construcciones para otros miembros de la
familia LuxR son idénticas con la excepción del número de copias y
la secuencia del oligonucleótido que codifica el supuesto sitio de
unión. Las construcciones se describen tal y como se muestra a
continuación, mostrando como subrayados la secuencia del elemento
cis, o el sitio de unión del regulador transcripcional.
La construcción pMON53006 contiene tres copias
de la caja luxR
(5'-AACTTAACCTGTAGGATCGTACAGGTA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 1).
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 1).
La construcción pMON53007 contiene siete copias
de la caja luxR
(5'-AACTTAACCTGTAGGATCGTACAGGT
AACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 2).
AACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 2).
La construcción pMON53008 contiene dos copias de
la caja luxR
(5'-AACTTAACCTGTAGGATCGTACAGGTA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 3).
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 3).
La construcción pMON53009 contiene cuatro copias
de la caja esaR
(5'-AACTTAACCTGCACTATAGTACAGG
TAACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 4).
TAACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 4).
La construcción pMON53010 contiene tres copias
de la caja esaR
(5'-AACTTAACCTGCACTATAGTACAGGTA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 5).
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 5).
La construcción pMON53031 contiene tres copias
de la caja traI1
(5'-AACTTAACGTGCAGATCTGCACATAA
CA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 6).
CA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 6).
La construcción pMON53032 contiene seis copias
de la caja traI1
(5'-AACTTAACGTGCAGATCTGCACATA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (similar a la Figura 6, teniendo solamente 6 copias de la secuencia de la caja traI1).
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (similar a la Figura 6, teniendo solamente 6 copias de la secuencia de la caja traI1).
La construcción pMON53035 contiene tres copias
de la caja lasB
(5'-AACTTAACCTGCCAGTTCTGGCAGGTA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 7).
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 7).
La construcción pMON53036 contiene cuatro copias
de la caja lasB
(5'-AACTTAACCTGCCAGTTCTGGCAGG
TAACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 8).
TAACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 8).
Se preparan una serie de construcciones
efectoras empleando diversos reguladores bacterianos. Se han aislado
los marcos abiertos de lectura de LuxR, EsaR, LasR, RhIR y TraR a
partir del ADN cromosómico bacteriano usando PCR. Los cebadores para
la amplificación de los reguladores son tal y como se muestra a
continuación: LuxR
(LuxR-N 5'-TGAAAAAGATAAATGCCGACGACACATACAGAA y LuxR-Cla 5'-AGCTTTATCGATGTACTTAAT
TTTTAAAGTATGG de Vibrio), EsaR (EsaR-Nde 5'-GGAGCCCATATGTTTTCTTTTTTCCTTGAAAAT y EsaR-Cla 5'-ACGTACGATCGATCCGCCCGTCGCAGTCACTAC), LasR (LasR-Nde 5'-GTAGCCATATGGCCTTGGTTGACGGTTTTC y LasR-Cla 5'-CATCGATCTGAGAGGCAAGATCAGAGAGTA), RhlR (RhlR-Nde 5'-CTTACTCATATGAGGAATGACGGAGGCTTT y RhlR-C CTGCGCTTCAGATGAGGCCCAGCGCCGCGG) y TraR
(TraR25' 5'-CATATGCAGCACTGGCTGG y TraR13' 5'-GTCGACCTCAGATGAGTTTCCG de la cepa A348 de Agrobacterium). Los fragmentos de la PCR que contienen marcos abiertos de lectura se clonan en una construcción de expresión. La construcción del vector contiene un promotor 35S modificado (doble potenciador) seguido del potenciador de la traducción de la proteína de la cápsida de TMV (W-guía), epitope de HA (hemoinfluenza) (MGYPYDVPDYAH) y la región 3'-no traducida del gen de la nopalina sintasa (3'NOS), que proporciona un terminador de la transcripción y una señal de poliadenilación. La región de 17 pares de bases del promotor 35S (de -17 a -1), que está inmediatamente cadena arriba del inicio de la transcripción (posición +1), se reemplaza por la secuencia del promotor del bacteriófago T7. El promotor 35S/T7 quimérico resultante tiene la ventaja frente al promotor 35S original de que permite el uso de la misma construcción tanto en ensayos in vivo en plantas (usando elementos promotores 35S) como en las reacciones de transcripción in vitro (usando el promotor T7 y la ARN polimerasa T7). El transcrito resultante se puede usar para programar una reacción de traducción in vitro convencional y sintetizar proteínas en un sistema libre de células. Como el promotor del T7 está cadena abajo de la caja TATA del promotor 35S, el reemplazo del tramo corto de la secuencia del promotor 35S nativo por la secuencia del fago no compromete la actividad del promotor 35S en células de plantas.
(LuxR-N 5'-TGAAAAAGATAAATGCCGACGACACATACAGAA y LuxR-Cla 5'-AGCTTTATCGATGTACTTAAT
TTTTAAAGTATGG de Vibrio), EsaR (EsaR-Nde 5'-GGAGCCCATATGTTTTCTTTTTTCCTTGAAAAT y EsaR-Cla 5'-ACGTACGATCGATCCGCCCGTCGCAGTCACTAC), LasR (LasR-Nde 5'-GTAGCCATATGGCCTTGGTTGACGGTTTTC y LasR-Cla 5'-CATCGATCTGAGAGGCAAGATCAGAGAGTA), RhlR (RhlR-Nde 5'-CTTACTCATATGAGGAATGACGGAGGCTTT y RhlR-C CTGCGCTTCAGATGAGGCCCAGCGCCGCGG) y TraR
(TraR25' 5'-CATATGCAGCACTGGCTGG y TraR13' 5'-GTCGACCTCAGATGAGTTTCCG de la cepa A348 de Agrobacterium). Los fragmentos de la PCR que contienen marcos abiertos de lectura se clonan en una construcción de expresión. La construcción del vector contiene un promotor 35S modificado (doble potenciador) seguido del potenciador de la traducción de la proteína de la cápsida de TMV (W-guía), epitope de HA (hemoinfluenza) (MGYPYDVPDYAH) y la región 3'-no traducida del gen de la nopalina sintasa (3'NOS), que proporciona un terminador de la transcripción y una señal de poliadenilación. La región de 17 pares de bases del promotor 35S (de -17 a -1), que está inmediatamente cadena arriba del inicio de la transcripción (posición +1), se reemplaza por la secuencia del promotor del bacteriófago T7. El promotor 35S/T7 quimérico resultante tiene la ventaja frente al promotor 35S original de que permite el uso de la misma construcción tanto en ensayos in vivo en plantas (usando elementos promotores 35S) como en las reacciones de transcripción in vitro (usando el promotor T7 y la ARN polimerasa T7). El transcrito resultante se puede usar para programar una reacción de traducción in vitro convencional y sintetizar proteínas en un sistema libre de células. Como el promotor del T7 está cadena abajo de la caja TATA del promotor 35S, el reemplazo del tramo corto de la secuencia del promotor 35S nativo por la secuencia del fago no compromete la actividad del promotor 35S en células de plantas.
Los ejemplos de la construcción de expresión de
doble propósito, pMON53004 y pMON53005, se muestran en las Figuras
11 y 12, respectivamente, para EsaR. El diseño de las construcciones
35S de CaMV-T7 para otros miembros de la familia
LuxR es el mismo excepto por la región de codificación de la
proteína EsaR.
Con el fin de conseguir la activación de la
transcripción en el núcleo, se incorpora un potente dominio de
activación en un grupo de construcciones. La fuente del dominio de
activación procede del gen VP16 del Herpes simplex
(aminoácidos 413-490 de la proteína VP16). Este
dominio de activación se ha demostrado que funciona de manera muy
eficaz en plantas (Ma y col., Nature
334:631-633, 1988).
Por consiguiente, todas las construcciones
efectoras contienen el promotor 35S de CaMV modificado (potenciador
duplicado, e35S con los nucleótidos -17 a -1 reemplazados por el
promotor del fago T7. El promotor va seguido del potenciador de la
traducción del virus del mosaico del tabaco (TMV) derivado de la
proteína de la cápsida de TMV (también conocida como fragmento
\Omega) seguido del sitio NcoI para la clonación. Si está
indicado, esto va seguido de una secuencia sintética que codifica el
epitope de la hemaglutinina (HA) de la gripe (MGYPYDVPDYAH)
fusionado en fase con o bien el dominio de activación de VP16 o el
marco abierto de lectura de la proteína receptora de AHL (también
denominada en el presente documento proteína o elemento regulador de
la transcripción). La terminación transcripcional y poliadenilación
viene proporcionado por la región 3' de la nopalina sintasa
(3'NOS).
La construcción pMON53002 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de LuxR bajo el control
transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS
(Figura 9).
La construcción pMON53003 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de
VP16-LuxR bajo el control transcripcional de un
promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 10).
La construcción pMON53004 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de EsaR bajo el control
transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS
(Figura 11).
La construcción pMON53005 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de
VP16-EsaR bajo el control transcripcional de un
promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 12).
La construcción pMON53015 contiene la fusión
señal de localización nuclear de SV40-marco abierto
de lectura (ORF) de VP16-EsaR bajo el control
transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS
(Figura 13).
La construcción pMON53020 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de RhlR bajo el control
transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS
(Figura 14).
La construcción pMON53021 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de
VP16-RhlR bajo el control transcripcional de un
promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 15).
La construcción pMON53028 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de
VP16-TraS bajo el control transcripcional de un
promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 16).
La construcción pMON53029 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de TraR bajo el control
transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS
(Figura 17).
La construcción pMON53030 contiene la etiqueta
epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la
fusión del marco abierto de lectura (ORF) de
VP16-TraR bajo el control transcripcional de un
promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS, creando de esta manera
la construcción de expresión
35S-HA-VP16-TraR-nos3'
(Figura 18).
Se prepararon una serie de construcciones de
casete de doble expresión que contenían los casetes tanto del
regulador como del reportero para la transformación de plantas.
La construcción pMON53071 contiene el regulador
EsaR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen
iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con
cuatro copias de los elementos cis de esaR en el casete del
reportero.
La construcción pMON53072 contiene el regulador
EsaR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado
con cuatro copias de los elementos cis de esaR en el casete del
reportero.
La construcción pMON53073 contiene el regulador
TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con
tres copias de los elementos cis de traI (véase la tabla 2 anterior)
en el casete del reportero.
La construcción pMON53074 contiene el regulador
TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado
con tres copias de los elementos cis de traI (véase la tabla 2
anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53075 contiene el regulador
TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con
tres copias de los elementos cis de traAI (véase la tabla 2
anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53076 contiene el regulador
TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado
con tres copias de los elementos cis de traAI (véase la tabla 2
anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53077 contiene el regulador
TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con
tres copias de los elementos cis de traA2 (véase la tabla 2
anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53078 contiene el regulador
TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado
con tres copias de los elementos cis de traA2 (véase la tabla 2
anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53079 contiene el regulador
TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con
tres copias de los elementos cis de traA8 (véase la tabla 2
anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53080 contiene el regulador
TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del
promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero
de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado
con tres copias de los elementos cis de traA8 (véase la tabla 2
anterior) en el casete del reportero.
Las construcciones de expresión se usan en
experimentos de transformación para obtener plantas transgénicas.
Las plantas Arabidopsis thaliana transgénicas pueden
obtenerse mediante transformación mediada por Agrobacterium
tal y como describen Valverkens y col., (Proc. Nat. Acad.
Sci. (1988) 85:5536-5540), o tal y como
describen Bent y col., ((1994), Science
265:1856-1860), o Bechtold y col. ((1993),
C. R. Acad. Sci., Life Sciences
316:1194-1199). Otras especies de plantas
pueden transformarse de forma similar usando técnicas
relacionadas.
Se preparan una serie de construcciones para
permitir la transcripción regulada de secuencias de ácido nucleico
de interés en el plasto de la célula de la planta. De manera similar
a las construcciones de expresión nuclear descritas en el ejemplo
2A, se preparan construcciones reporteras y efectoras; sin embargo,
las construcciones en los plastos emplean elementos reguladores para
la expresión en un plasto de una célula de una planta.
La secuencia Prrn/G10L se construye mediante la
hibridación de dos secuencias de oligonucleótidos, T7guía1 y T7guía2
para crear el sitio de unión al ribosoma del plasto G10L.
T7guía1: | 5'-AATTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC-3' | |
T7guía2: | 5'-CATGGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAC-3' |
La secuencia G10L se liga al extremo 3' de la
secuencia del promotor Prrn en forma de un fragmento EcoRI/NcoI para
crear la secuencia Prrn/G10L.
Se preparan una serie de construcciones que
contienen diversas secuencias Shine-Dalgarno (SD) y
de caja cadena abajo (DB). Se emplea PCR usando diversas
combinaciones de cebadores para amplificar fragmentos que contienen
las secuencias de SD y DB. Se llevan a cabo reacciones usando
cebadores oligonucleótidos y plásmido pCGN5063 en pBluescript+
(Stratagene) que contiene el gen GUS bajo el control del promotor T7
y la región guía del gen 10 del bacteriófago T7 (similar a pCGN4055
descrito en la patente de EE.UU. 5.576.198). El promotor T7 y la
región guía del gen 10 del bacteriófago T7 están presentes como un
fragmento HindIII/NcoI. Las parejas de cebadores para cada
construcción se diseñaron para introducir HindIII y NcoI en los
extremos respectivos. Los fragmentos de PCR resultantes se
purifican, se digieren con HindIII/NcoI, y se ligan al esqueleto del
vector pCGN5063 digerido por HindIII/NcoI. El cebador directo que
porta el sitio HindIII está diseñado para cebar en la región del
promotor T7 y es común para todas las construcciones (G10L5'
5'-ACGTAAGCTTCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3').
El cebador inverso que contiene el sitio NcoI introduce las variantes de las secuencias Shine-Dalgarno y de la caja cadena abajo para las diversas construcciones y se enumera en la Tabla 3. Las variantes de la caja cadena abajo (DB) incluyen (a) gen 10 DB de tipo silvestre (wt DB) que presenta 7 bases complementarias al ARNr 16S (7/15) plastidial, (b) DB mutante con 15 bases complementarias al ARNr 16S (m1DB, 15/15) plastidial, (c) DB mutante con 11 bases complementarias al ARNr 16S (m2DB, 11/15) plastidial y (d) DB mutante con 0 bases (m3DB, 0/15) que potencialmente puede emparejarse con los 15 pares de bases anti-secuencia DB en el ARNr 16S del tabaco. Las variantes de la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) incluyen SD de tipo silvestre (wt SD) AAGGAG y SD mutante (mSD) UUCCUC.
El cebador inverso que contiene el sitio NcoI introduce las variantes de las secuencias Shine-Dalgarno y de la caja cadena abajo para las diversas construcciones y se enumera en la Tabla 3. Las variantes de la caja cadena abajo (DB) incluyen (a) gen 10 DB de tipo silvestre (wt DB) que presenta 7 bases complementarias al ARNr 16S (7/15) plastidial, (b) DB mutante con 15 bases complementarias al ARNr 16S (m1DB, 15/15) plastidial, (c) DB mutante con 11 bases complementarias al ARNr 16S (m2DB, 11/15) plastidial y (d) DB mutante con 0 bases (m3DB, 0/15) que potencialmente puede emparejarse con los 15 pares de bases anti-secuencia DB en el ARNr 16S del tabaco. Las variantes de la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) incluyen SD de tipo silvestre (wt SD) AAGGAG y SD mutante (mSD) UUCCUC.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Genes quiméricos que codifican las proteínas
reguladoras se insertan preferiblemente en el vector de expresión
para dirigir su transcripción a partir del promotor Prrn. Así, en el
genoma del plasto, los genes quiméricos que codifican las proteínas
reguladoras se transcriben a partir del promotor Prrn/RBS, o del
promotor Prrn/G10L en el plasto de la planta.
Se preparan una serie de construcciones para
dirigir la expresión del gen GUS a partir de un promotor que
contiene secuencias de la caja lux (construcciones reporteras) así
como construcciones para la expresión de la proteína reguladora a
partir de las secuencias del promotor Prrn/RBS y Prrn/G10L.
La región que codifica luxR y las secuencias
cadena arriba se amplifican usando reacciones en cadena por la
polimerasa (PCR) y se clonan en 5' de la secuencia de codificación
de GUS. Se usa una reacción PCR de tres etapas para amplificar el
promotor luxI/promotor luxR/secuencia de codificación de luxR para
retirar el sitio Nco I de la secuencia de codificación de luxR. Se
añade una secuencia terminadora de T7 orientada de forma opuesta en
5' de la secuencia de codificación de luxR para prevenir la lectura
a través de la transcripción y la activación espúrea de la expresión
del gen GUS. Además, se añade un sitio SalI/NotI al
extremo 5' del terminador y se añade un sitio NcoI en el codón de
partida del promotor LuxI junto con un sitio EcoRI para fines
de clonación. Este fragmento se clona en pBluescript II y se
secuencia para confirmar que la secuencia amplificada es correcta.
El promotor de luxI/promotor de luxR/secuencia de codificación de
luxR/fragmento terminador de T7 se subclona en pCGN6104 en forma de
un fragmento SalI/NcoI. Este vector crea el sistema de
expresión inducible para la expresión regulada de GUS por parte del
inductor a partir del promotor luxI (Figura 19). El fragmento
NotI de este plásmido se clona en el vector de homología con
el plasto del tabaco pCGN6043 para proporcionar la expresión de la
secuencia de GUS bajo el control del promotor luxI y de la proteína
luxR. La construcción resultante contiene secuencias para la
integración en la región rbcL mediante recombinación homóloga (Svab
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
90:913-917, 1993).
Se construye una segunda construcción de
transformación para la expresión del gen GUS a partir del plasto de
la planta. Esta construcción contiene la secuencia de codificación
de GUS unida de forma operativa al promotor luxI, tal y como se ha
descrito anteriormente, y la secuencia de codificación de luxR bajo
el control del promotor/sitio de unión a ribosoma Prrn/G10L. Esta
construcción también contiene secuencia para proporcionar la
integración del casete de expresión en el genoma del cloroplasto en
la región rbcL (Svab y col. (1993), referencia citada
anteriormente). La inclusión del promotor/RBS Prrn:G10L en esta
construcción de expresión proporciona la expresión de alto nivel de
la forma inactiva de la proteína luxR en plastos de células de
plantas (Figura 20).
Se prepara un tercer casete de expresión para
ensayar la capacidad del sistema para controlar la ARN polimerasa T7
y los genes diana cadena abajo procedentes todos del interior del
plasto. En este casete, la secuencia de codificación de luxR está
dirigida por la secuencia Prrn/G10L (descrita anteriormente), que
controla la expresión de la ARN polimerasa T7 bajo el control de la
secuencia LuxI. El gen GUS está a su vez controlado por el promotor
T7. El casete Prrn/G10L:luxR/LuxI:ARN polimerasa T7/T7/GUS (Figura
21) se clona en el casete de homología con T7:GUS/rbcL,
pCGN6116.
Se preparan dos construcciones de expresión para
ensayar el sistema de represión esaR para expresar las secuencias de
ADN de interés del plasto de la planta.
La región de codificación de esaR se amplifica
mediante PCR y se liga a la secuencia terminadora de la polimerasa
T7 y al Prrn:G10L. La secuencia del promotor esaR se clona en una
orientación de expresión divergente de Prrn:G10L/secuencia de
codificación de esaR/terminador de T7. Un fragmento que contiene la
secuencia de codificación de GUS con el psbA 3' y el terminador de
polimerasa T7 se clonan para ser transcritos a partir de la
secuencia del promotor esaR. El fragmento resultante que contiene
dos casetes expresados de manera divergente,
Prrn:G10L/esaR/terminador T7 y esaR/GUS/psbA 3'/terminador T7
(Figura 22), se clonan en un vector para permitir la integración de
los casetes de expresión así como también contiene secuencias para
la selección de plantas transplastómicas usando espectinomicina
(psbA 3'/aad A).
Se prepara un vector de expresión en planta para
expresar la ARN polimerasa T7 a partir del promotor esaR. La
secuencia de codificación de la ARN polimerasa T7 se clona para ser
expresada a partir del promotor esaR tal y como se ha descrito
anteriormente para la expresión de la secuencia de codificación de
GUS. Se clona un fragmento que contiene casetes de transcripción
divergentes, Prrn:G10L/esaR/rps 16 3'/terminador T7 (cadena
complementaria) y PesaR/ARN polimerasa T7/psbA 3'/terminador T7, en
forma de un fragmento NotI en un vector que contiene
elementos para la integración de las secuencias de expresión en el
genoma del plasto. El vector también contiene una secuencia de
codificación de GUS expresada a partir de un promotor de polimerasa
T7, y secuencias para la expresión del gen marcador aadA. Esta
construcción (Figura 23) permite la expresión controlada por
inductor de la ARN poli-
merasa T7 regulando adicionalmente la expresión de la secuencia de codificación de GUS a partir del promotor T7.
merasa T7 regulando adicionalmente la expresión de la secuencia de codificación de GUS a partir del promotor T7.
Las construcciones nucleares descritas en el
ejemplo 2A anterior se transforman en la cepa S10200 de E.
coli. Colonias transformadas positivas, que son resistentes a
ampicilina, crecen en medios de cultivo que o bien carecen del
inductor AHL o contienen AHL. Las colonias cultivadas se seleccionan
para la producción de GUS ensayando la actividad enzimática GUS de
preparaciones de lisado celular para confirmar la expresión
controlada por inductor. Los ensayos de la actividad GUS se llevan a
cabo tal y como han descrito Jefferson y col. (EMBO J.
6:3901-3907, 1987).
Se aislaron y purificaron plásmidos para
transfección usando el kit de aislamiento de ADN del plásmido
Megaprep (Qiagen). Se prepararon protoplastos de zanahoria para
transfecciones a partir de un cultivo de suspensión de células de
zanahoria y se transfectaron con ADN purificado tal y como se ha
descrito en Ulmasov y col., Plant Cell
7:1611-1623, 1995. En resumen, se incubaron
10 \mug del plásmido reportero y 5 \mug del plásmido efector con
10^{6} protoplastos durante cinco minutos a temperatura ambiente
en presencia de una solución de
polietilenglicol-calcio. Después de diluir
aproximadamente diez veces con el medio de cultivo, los
protoplastos se incubaron en la oscuridad durante 36 horas o bien en
presencia o bien en ausencia del inductor
3-oxohexanoil-homoserina lactona
(OHHL, mezcla racémica de los isómeros L y D, adquirido en Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO). Después de la incubación, se
recogieron los protoplastos mediante una centrifugación a baja
velocidad, se lisaron y se midió el nivel de actividad GUS usando el
ensayo GUS fluorométrico (Jefferson y col., EMBO J.
6:3901-3907, 1987). Cada combinación ADN/AHL
se realizó por triplicado y se ajustaron los promedios de las
actividades GUS restando el valor de fondo del control de
transfección "sin ADN".
En Svab y col. (1990, referencia citada
anteriormente) y Svab y col. (1993, referencia citada anteriormente)
se reseña la transformación estable de genomas de plastos del tabaco
mediante bombardeo de partículas. Los procedimientos que se
describen en esas referencias se pueden emplear para obtener plantas
transformadas con las construcciones de expresión de plastos
descritas en el presente documento. Dichos procedimientos implican
generalmente el bombardeo con ADN de un explanto huésped diana,
preferiblemente un explanto preparado a partir de un tejido rico en
plastos metabólicamente activos, tales como tejidos de planta verde
incluyendo hojas o cotiledones.
Las semillas del tabaco (N. tabacum v.
Xanthi N/C) se esterilizan superficialmente en una solución de
clorox al 50% (hipoclorito sódico al 2,5%) durante 20 minutos y se
aclaran cuatro veces con H_{2}O estéril. Estas semillas se
siembran asépticamente en placas sobre un medio de 0,2x sales MS y
se deja que germinen. Los semilleros se desarrollan sobre medio de
agar solidificado con la solución salina MS con 30 g/l de sacarosa
(Murashige y col., Physiol. Plant
15:493-497, 1962).
Microproyectiles de wolframio (1,0 \muM) o de
oro (0,6 \muM) se recubren con ADN de plásmido de acuerdo con
Maliga (Methods in Plant Molecular Biology - A Laboratory
Manual, Eds. Maliga y col., Cold Spring Harbor Press, 1993) y se
usan para bombardear hojas maduras, colocadas en posición abaxial
boca arriba sobre medio RMOP; sales MS, 1 mg/l de BAP, 0,1 mg/l de
NAA, 30 g/l de sacarosa y phytagar al 0,7% (Svab y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:8526-8530,
1990) usando el sistema de He PDS 1000 de Bio-Rad
(Sanford y col., Technique 3:3-16).
Los plásmidos pZS223 y pZS224 se usan como el ADN de plásmido de
recubrimiento.
El tejido bombardeado se cultiva posteriormente
durante aproximadamente 2 días en un medio que promueve la división
celular, después de lo cual el tejido de la planta se transfiere a
un medio selectivo que contiene una cantidad inhibidora del agente
selectivo particular. Los explantos transformados forman brotes
verdes en aproximadamente 3-8 semanas. Las hojas de
esos brotes se subcutivan posteriormente en el mismo medio selectivo
para asegurar la producción y selección de brotes homoplásmicos.
Cuando la construcción caja esaR
(4X)-reportero GUS, pMON53009, se transfectó en
protoplastos de zanahoria junto con 35S-CAT
(construcción efectora "neutra" para compensar la cantidad
total de ADN en la reacción), la actividad GUS parecía ser
aproximadamente 3-4 veces superior que la del
promotor mínimo. Esto es probablemente resultado de una débil
activación por medio de la unión de factores de transcripción
endógenos a elementos caja esaR multimerizados con baja
afinidad. Es habitual observar un valor de fondo superior con
multímeros de elementos cis, ya que la multimerización a menudo
promueve la unión sinérgica de factores de transcripción. También es
posible que el valor de fondo esté provocado por elementos cis de
planta crípticos insertados en la caja esaR o la región
espaciadora de 10 pares de bases, que separa una caja esaR de
otra. Cuando se usó en el experimento de transfección la
construcción que codifica la fusión VP16-EsaR
(pMON53005), el nivel de expresión del gen reportero fue
significativamente superior (aproximadamente 40-50
veces) que el nivel de expresión de la construcción del promotor
mínimo. Esta potente activación mediante la construcción
VP16-EsaR disminuyó hasta 3,3 veces por la adición
del inductor,
(3-oxohexanoil-L-homoserina
lactona) de una manera dependiente de la dosis.
Este resultado indica que la proteína de fusión
VP16-EsaR probablemente se une a los elementos cis
de manera autónoma, en ausencia de ARN polimerasa bacteriana, y que
esta unión puede invertirse mediante su ligando, AHL. Este resultado
es también consistente con la hipótesis de que, a diferencia de
algunos otros miembros de la familia LuxR, EsaR funciona como un
represor, y no como un activador en células bacterianas. Este modo
de acción fue propuesto por otros en base a los datos obtenidos a
partir de experimentos genéticos (von Bodman y Farrand, J.
Bacteriol., 177:5000-5008, 1995; von
Bodman y col., Proc. Natl. Acad. EE.UU.
95:7687-7692, 1998). El hecho de que la
transcripción dependiente de EsaR pueda estar regulada en células de
plantas mediante concentraciones bajas de su ligando natural sugiere
que este compuesto AHL es capaz de penetrar membranas de células de
plantas y es suficientemente estable como para conseguir su efecto
durante el periodo de tiempo experimental de 36 horas.
La activación por parte de la construcción
VP16-EsaR estaba específicamente restringida a la
construcción del reportero que contiene la caja esaR. Cuando
se usó en combinación con otros reporteros, GAL4(4X) (cuatro
copias del sitio GAL4) cadena arriba del promotor 35S mínimo, o
siete copias de la caja luxI, no se observó activación, indicando
que el dominio de unión al ADN de esaR no reconoce los sitios
no relacionados (GAL4) ni incluso los sitios estrechamente
relacionados (luxI) con afinidad suficiente para proporcionar una
activación detectable.
La expresión del gen iudA a partir de la
caja TraI1 (pMON53031) usando el regulador TraR (pMON53030)
se determina también tal y como se describe para las construcciones
EsaR anteriormente. Los resultados se muestran más adelante en la
Tabla 4.
Diez \mug del plásmido reportero (pMON53031),
y la cantidad indicada del plásmido efector 35S por reacción se usó
para la transfección por triplicado. Después de la transfección, los
protoplastos se incubaron en la oscuridad durante 36 horas o bien en
ausencia o bien en presencia de la
3-oxooctanoil-L-homoserina
lactona (OOHL). Las columnas "inductor --" e "inductor +"
son promedios de las actividades GUS.
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Los resultados de los ensayos en células de
plantas anteriores demuestran que se puede obtener al menos una
inducción de GUS de 5,2 veces usando construcciones de activación o
de represión usando los procedimientos de la presente invención.
Además, las construcciones de reportero mostraron un valor de fondo
hasta 40 veces más alto en comparación con el promotor mínimo, lo
que sugiere que el valor de fondo era debido al reconocimiento y la
unión por parte de factores endógenos a los elementos de la caja
tra. Finalmente, la inducción no parecía tener lugar en
ausencia del inductor.
Se analizaron plantas de plasto transformado
seleccionadas para la expresión del gen marcador aadA para
determinar si se ha transformado el contenido total de plasto de la
planta (transformantes homoplásmicos). De manera típica, después de
dos rondas de formación de brotes y selección con espectinomicina,
aproximadamente el 50% de las plántulas transgénicas que se
analizaron son homoplásmicas según se determinó mediante el análisis
de transferencia Southern del ADN del plasto. Se seleccionaron
plántulas homoplásmicas para un cultivo adicional.
Se usó análisis de transferencia Southern para
confirmar la integración de los casetes de expresión quiméricos en
el genoma del plasto. La preparación, electroforesis, y
transferencia del ADN a filtros se realizó tal y como se ha descrito
en Svab y col., 1993, (referencia citada anteriormente). El ADN
total celular de la planta se preparó tal y como han descrito
Dellaporta y col., Plant Mol. Biol. Rep.
1:19-21, 1983.
Para medir la transcripción dependiente de AHL
del gen GUS, muestras de ARN celular total procedentes del tejido de
la hoja, tratadas o sin tratar con AHL, se sometieron a análisis
Northern con una sonda específica para GUS. Se preparó el ARN total
de la planta tal y como han descrito Hughes y col. en Plant Mol.
Biol. Rep. 6:253-257, 1988, o
mediante el uso del reactivo TRIzol (BRL Life Technologies,
Gaithersburg, MD) siguiendo el protocolo de los fabricantes. Una
única banda de ARNm abundante del tamaño esperado (2,1 kb) estaba
presente solamente en las muestras de ARN extraídas del tejido de la
hoja tratada con AHL. Esto indica que la transcripción del transgen
de GUS depende de la aplicación de AHL.
Para demostrar que los transcritos T7 GUS se
traducen en los plastos transgénicos, se midió en diversos tejidos
la actividad específica B-glucuronidasa. Los ensayos
GUS se llevaron a cabo tal y como han descrito Jefferson y col. en
EMBO J. 6:3901-3907, 1987.
Se analizó la inducción de la actividad GUS en
plantas Arabidopsis transgénicas que contenían los genes
reportero TraA8(3X)-GUS y activador
35S-VP16-TraR (pMON53077). Ocho
plantas mostraron actividad GUS en presencia de
C8-HSL. Tres de esas ocho mostraron fuerte
activación con niveles muy bajos de actividad de fondo. Sin embargo,
fue difícil determinar con precisión el nº de veces de inducción
debido a la extremadamente baja actividad no inducida, pero una
estimación preliminar sugiere que se trata de una inducción de no
menos de 75 a 150 veces. Los ensayos GUS se llevaron a cabo tal y
como han descrito Jefferson y col. (referencia citada
anteriormente).
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Además, se visualizaron hojas desprendidas
incubadas durante 24 horas en medio MS con o sin HSL 100 \muM para
la inducción de la actividad GUS después de tinción. Hojas
caulinares tratadas con el inductor durante 24 horas exhibieron
actividad inducida uniforme tal y como se reveló mediante tinción
histoquímica para la actividad de GUS. Los resultados de la tinción
histoquímica se proporcionan en la Figura 25.
Con el fin de aumentar los niveles de
inducibilidad del sistema TraR en células de zanahoria fue necesario
disminuir los niveles de la actividad de fondo del gen reportero
caja tra-GUS.
Este gen, que contiene tres copias de la caja
traI1 cadena arriba del promotor 35S mínimo, demostró una actividad
bastante alta, una actividad 10 a 50 veces mayor que la del promotor
35S mínimo, incluso sin el efector VP16-TraR. Esta
actividad de fondo es aparentemente resultado de la activación por
un factor de transcripción endógeno que se une a una(s)
secuencia(s) críptica(s) en la caja tra y
activa la transcripción independientemente de TraR. Como no se han
reseñado hasta la fecha TraR u homólogos de los mismos en las
plantas, no es probable que la especificidad de unión a ADN del
factor endógeno sea idéntica a la de TraR.
Partiendo de la hipótesis de que no todo
nucleótido en la caja tra es críticamente importante para la
unión, los inventores intentaron cambiar la secuencia de la caja
tra de manera que siguiera siendo reconocida por TraR, pero
no por el factor endógeno de plantas. Se diseñaron diez
oligonucleótidos de cadena doble que contenían una o dos
alteraciones de bases de la caja traA, un sitio de unión traR
perfectamente palindrómico de origen natural, tal y como se muestra
en la Tabla 2 (traA1 a traA9 y
traA-1). En las variantes de tipo
traA, traA1 a 9, se dispusieron simétricamente dos
cambios de pares de bases tal y como se muestra en la Tabla 2
(indicando las bases cambiadas con letras minúsculas).
Las cajas tra de tipo silvestre y
variantes se clonaron en múltiples copias cadena arriba del promotor
35S mínimo. Los plásmidos resultantes son tal y como se muestra a
continuación (véase la Tabla 2 anterior para la secuencia de las
cajas tra usadas).
- pMON53041:
- caja traA1 (3X)-46GUS, cl. 35
- pMON53042:
- caja traA2 (3X)-46GUS, cl. 43
- pMON53043:
- caja traA3 (3X)-46GUS, cl. 4
- pMON53044:
- caja traA4 (3X)-46GUS, cl. 23
- pMON53045:
- caja traA5 (3X)-46GUS, cl. 2
- pMON53046:
- caja traA6 (3X)-46GUS, cl. 21
- pMON53047:
- caja traA7 (3X)-46GUS, cl. 15
- pMON53048:
- caja traA8 (3X)-46GUS, cl. 4
- pMON53049:
- caja traA9 (3X)-46GUS, cl. 8
- pMON53050:
- caja traA (3X)-46GUS, cl. 17
- pMON53051:
- caja traA-1 (3X)-46GUS, cl. 14
Cada una de las construcciones contenía tres
copias de un oligonucleótido doble mutante con mutaciones simétricas
en ambas mitades del palindroma (marcadas en minúscula en la Tabla
2). Estas construcciones se ensayaron para evaluar la actividad GUS
de fondo y la sensibilidad a TraR en protoplastos de zanahoria. Los
resultados de dos experimentos de transfección independientes
(Tablas 5 y 6) indican que tres construcciones, pMON53041 (traA1),
pMON53042 (traA2) y pMON53048 (traA8) han retenido la capacidad de
activarse por la fusión VP16-TraR, mientras que
otras pierden su sensibilidad a TraR. Al mismo tiempo, la actividad
de fondo de estas construcciones se redujo significativamente, dando
como resultado niveles superiores de inducibilidad (inducción de
hasta 17 veces con la construcción traA1, línea 4 en
la Tabla 6).
Aunque la segunda transfección no fue tan eficaz
como la primera transfección, sus resultados apoyan la conclusión de
que las mutaciones en las posiciones 1, 2 y 8 en la caja tra
canónica (contando desde el primer nucleótido) pueden ser toleradas
por TraR y producen niveles de inducibilidad superiores después de
la estimulación con C8-AHL.
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Las muestras "inductor +" contenían
C8-AHL 12,5 \muM. Se usó 35S-CAT
en transfeciones "construcción de reportero en solitario" para
compensar el ADN del efector TraR.
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Las muestras "inductor +" contenían
C8-AHL 12,5 \muM. Se usó 35S-CAT
en transfeciones "construcción de reportero en solitario" para
compensar el ADN del efector.
Los inventores han ensayado también
construcciones que contienen cuatro copias de la caja
traA8 (pMON53055, TraA8 (4X)-46GUS,
cl. 16), y consiguieron una inducción de 25,7 veces (Tabla 7).
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La Tabla 7 contiene también datos que indican
que TraM y TraS se pueden usar para regular a la baja la activación
mediada por TraR en células de plantas, de una manera que es similar
a lo que ocurre en el huésped natural. Esto puede ser útil si es
deseable prevenir la inducibilidad por AHL en ciertos órganos,
tejidos o tipos de células. Por ejemplo, mediante la expresión de
TraM (que trabaja de una manera muy eficaz, comparar líneas 8 y 10
de la Tabla 7) bajo el control del promotor específico de tejido
apropiado, el sistema completo se puede mantener inactivo en
presencia del ligando.
Se ensayó la funcionalidad de las construcciones
sensibles a AHL en levadura (Saccharomyces cerevisiae). Con
el fin de producir construcciones de reportero en levadura, se
clonaron tres copias de un elemento sensible a AHL, las cajas
tra y esa, en pLacZi (un componente del "Sistema del
Mono-híbrido de MATCHMAKER" nº de catálogo
K1603-1, Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto,
CA), un vector reportero y de integración de levadura, cadena arriba
del promotor mínimo del gen del
iso-1-citocromo C de levadura
(P_{CYC1}), sirviendo lacZ como el gen reportero. pLacZi es
un vector integrativo que se puede integrar de manera estable en el
genoma de la levadura después de la linealización. Se produjeron
construcciones de plásmido efector mediante la clonación de TraR y
EsaR en pGAL415 a partir de un promotor GAL1 inducible por la
presencia de galactosa. Cuando se transforman en las células de
levaduras, dichos pares activador/reportero son útiles para llevar a
cabo cribados genéticos para nuevos alelos de receptores de AHL con
características cambiadas o mejoradas, para seleccionar moléculas
variantes de AHL que sean activas como inductores, para mutaciones
de la caja tra, etc. Las construcciones en levadura sensibles
a AHL son generalmente útiles para regular la expresión de
polipéptidos foráneos en células de levaduras.
La cepa de S. cerevisiae 204142, un
auxótrofo no patogénico de uracilo, leucina y triptófano (MATa
ura3-52 leu2-delta1
trp1-delta63 [RF45527]) se transformó mediante el
procedimiento de Acetato de Litio con
pLacZi-traA8(6X) para crear una cepa
reportera con traA8(6X) LacZi::ura3 (204142A). 204142A se
transformó posteriormente con o bien pGAL415 que portaba un marcador
de leucina para crear una cepa control (204142B) o con pGAL415TraR
que portaba un marcador de leucina para crear una cepa de ensayo
(204142C). Se midió la actividad beta-galactosidasa
usando el sistema de ensayo quimioluminiscente
Galacto-Star (Tropix, Inc., Bedford, MA) siguiendo
el protocolo de los fabricantes, y resumido en el presente
documento.
Todas las cepas de levadura se cultivaron sobre
placas de medio sólido (medio SD; 6,7 mg/ml de nitrógeno de levadura
y 40 mg/ml de glucosa más agar), suplementado con los aminoácidos
apropiados, triptófano (0,4 mg/ml) y leucina (0,6 mg/ml) para
204142A, y suplementado con triptófano (0,4 mg/ml) para 204142B y
204142C. Las células se dejaron crecer durante toda la noche a 30ºC
y se usaron para inocular medio líquido de crecimiento SR (6,7 mg/ml
de nitrógeno de levadura y 40 mg/ml de glucosa) suplementado con los
aminoácidos apropiados. Los cultivos inoculados se pusieron a 30ºC
con agitación a 300 rpm en un matraz o tubo con una relación
aproximada líquido/aire de 0,1. Las células se dejaron crecer hasta
una absorbancia de A_{600} entre 0,2 y 0,5.
Las células de levadura se distribuyeron en
asignadores de 450 \mul en pocillos de 2 ml de placas de 96
pocillos profundos. Se distribuyó una solución de Glucosa al 20%
(represor) o Galactosa al 20% (inductor) mediante asignadores de 50
\mul a cada pocillo para producir una concentración final del 2%.
Se añadió homoserina lactona (hsl) a diversas concentraciones a
partir de una solución madre con una concentración 100 mM en DMSO al
100%. Se suplementaron muestras control sin hsl con volúmenes
iguales de DMSO al 100%.
Las placas se pusieron a 30ºC sobre un agitador
de placas de titulación fijado a una velocidad 8 durante 5 horas
antes de retirar 100 \mul de cada pocillo para la medición de la
A_{600}. Los restantes 400 \mul de células se lisaron añadiendo
200 \mul de 3 X solución de lisis (3X solución madre: Fosfato de
Potasio 50 mM (pH 7,8), Triton X-100 al 0,1%, 1
mg/ml de CTAB, 1 mg/ml de Desoxicolato de Sodio, DTT 1 mM) y se
pusieron a 4ºC durante toda una noche sobre un agitador de placas de
titulación fijado a velocidad 8.
El día siguiente, las placas se llevaron a
temperatura ambiente y se pipetearon alícuotas de 75 \mul de
células en placas de microensayo de 96 pocillos negras que contenían
75 \mul de 2X solución de sustrato (Tropix, Inc., Bedford, MA), y
se calentó hasta temperatura ambiente. Las células lisadas y la
solución de sustrato se incubaron a temperatura ambiente durante 45
minutos antes de que se midiera la emisión de luz usando un contador
multitécnica Víctor®.
La proteína restante (525 \mul) se recogió en
el sobrenadante después de la centrifugación (centrífuga de placas
4K15 Sigma®, 6.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC). Se midió la
concentración de proteína usando un Equipo de Ensayo de Proteína
Pierce BCA-200 mezclando 25 \mul de sobrenadante
con 200 \mul del reactivo operativo BCA en una placa de
microensayo transparente de 96 pocillos. La mezcla se incubó a 37ºC
durante 30 minutos antes de que se midiera la A_{562}. Un blanco
que contenía 1X solución de lisis se restó de las lecturas de las
muestras y se determinó la concentración de proteína usando una
curva patrón a partir de muestras de BSA medidas en el mismo
ensayo.
Se midió la emisión de luz como cuentas por
segundo (CPS). Se promedió una fila de lecturas blanco de CPS
obtenidas a partir de una mezcla constituida por 1 X solución de
lisis y 1 X solución de sustrato y se restó de cada lectura de CPS
de ensayo. Se dividió las CPS entre la proteína total calculada a
partir del ensayo BCA para dar la actividad
\beta-galactosidasa (CPS/mg de proteína). Para
obtener el aumento en nº de veces entre las muestras, éstas se
dividieron entre el nivel basal de actividad
\beta-galactosidasa observado en la cepa control
(204142B) bajo condiciones represivas.
Los resultados de inducibilidad del gen
reportero se muestran en la Figura 26. Se observó una fuerte
inducción en presencia de C8-HSL cuando se dejaron
crecer células de levadura sobre galactosa, mientras que en ausencia
del inductor, o TraR (células cultivadas sobre glucosa), la
actividad estaba por debajo de los límites de detección
(indistinguible de cepas que carecían de TraR y/o de gen reportero
lacZ conjuntamente). Se ensayaron extractos celulares de dos líneas
independientes (cepa YPH499, cl. 5 y 6) que contenían el gen
reportero \beta-galactosidasa conducido por un
promotor mínimo con 3 copias del elemento TraA8 para evaluar la
actividad \beta-gal usando un ensayo
quimioluminiscente y demostraron una fuerte inducción después de 5
horas de cultivo sobre galactosa en presencia de
C8-HSL 50 \muM. En ausencia de AHL o TraR (5 horas
de cultivo sobre glucosa), la actividad detectada en los extractos
era tan baja como en la cepa YPH499 que carecía del gen reportero
LacZ.
Se prepararon
\beta-cetoésteres mediante un procedimiento
reseñado previamente (Wierenga, y col. (1979) J. Org. Chem.
44(2):310-311).
Procedimiento General para la Preparación de
2-Azidobutirolactonas: Las
2-bromobutirolactonas se prepararon de acuerdo con
un procedimiento previamente reseñado y se usaron sin purificación
adicional (2). 2-Bromobutirolactona bruta
(20-50 mmoles) se disolvió en CH_{2}Cl_{2}
(20-40 ml). Se añadieron un catalizador de
transferencia de fase (Aliquat®336, 10-20 gotas) y
una solución de azida sódica (4,8 equivalentes) disuelta en agua
(30-60 ml) a la solución de CH_{2}Cl_{2}. La
bifase se agitó enérgicamente durante 16-28 horas,
después se añadió agua (50-75 ml) y la fase orgánica
se separó. La fase acuosa se lavó con CH_{2}Cl_{2} (3 x 40 ml).
Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron
y se concentraron proporcionando un líquido amarillo. Se observaron
los cuatro diastereoisómeros. Los productos brutos se purificaron y
los isómeros cis se separaron de los isómeros trans
mediante cromatografía sobre gel de sílice.
2(S)-Azido-2-metilbutirolactona
y
2(R)-Azido-2-metilbutirolactona:
La reacción de azidación se llevó a cabo con
2-bromo-2-metilbutirolactona
(31,2 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 7:93)
proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (2,1 g,
47%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,32 (m, 2H), 2,25
(m, 2H), 1,62 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta
175,0, 65,1, 61,1, 35,3, 19,7.
\newpage
2-Azido-3-metilbutirolactonas:
3-Metilbutirolactona, requerida para la preparación
de la correspondiente bromolactona, se preparó tal y como se ha
reseñado previamente (3,4), con la excepción de que se usó metanol
en lugar de etanol en la reacción de hidrogenación (Nota: el
producto bruto contenía una cantidad significativa del éster
metílico del producto de anillo abierto que surge a partir de la
adición de metanol a la lactona. Este producto secundario, sin
embargo, se convirtió cuantitativamente en el producto deseado
durante la destilación). La reacción de azidación se llevó a cabo
con
2-bromo-3-metilbutirolactona
(19,6 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 15:85)
proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (1,52 g,
55%, cis:trans (aislado) = 1:1,5). Isómeros
cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,36 (dd,
J = 9,1, 6,2 Hz, 1H), 4,28 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,02 (dd, J = 9,1,
4,3 Hz, 1H), 2,75 (m, 1H), 1,12 (d, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN
(100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,9, 72,3, 60,4, 34,4, 12,2.
Isómero trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3})
\delta 4,47 (dd, J = 9,1, 7,8 Hz, 1H), 3,85 (d, J = 9,4 Hz, 1H),
3,84 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 2,46 (m, 1H), 1,24 (d, J = 6,7 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 173,2, 71,2, 63,3, 37,3,
14,6.
2-Azido-4-metilbutirolactonas:
La reacción de azidación se llevó a cabo con
2-bromo-4-metilbutirolactona
(Aldrich, 23,7 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexa-
no, 15:85) proporcionando los productos cis en forma de un sólido cristalino de color blanco y los productos trans en forma de un líquido incoloro (2,8 g, 83%, cis:trans (aislado) = 1,8:1). Isómeros cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,56 (m, 1H), 4,36 (dd, J = 11,0, 8,6 Hz, 1H), 2,69 (ddd, J = 13,0, 8,5, 5,3 Hz, 1H), 1,76 (dt, J = 12,9, 10,5 Hz, 1H), 1,47 (d, J = 6,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 173,1, 74,3, 58,1, 36,5, 20,7. Isómeros trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,76 (m, 1H), 4,33 (dd, J = 8,1, 5,6 Hz, 1H), 2,27 (ddd, J = 13,4, 7,0, 6,1 Hz, 1H), 2,13 (ddd, J = 13,7, 8,1, 5,8 Hz, 1H), 1,42 (d, J = 6,4 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,9, 75,5, 57,4, 35,6,
20,9.
no, 15:85) proporcionando los productos cis en forma de un sólido cristalino de color blanco y los productos trans en forma de un líquido incoloro (2,8 g, 83%, cis:trans (aislado) = 1,8:1). Isómeros cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,56 (m, 1H), 4,36 (dd, J = 11,0, 8,6 Hz, 1H), 2,69 (ddd, J = 13,0, 8,5, 5,3 Hz, 1H), 1,76 (dt, J = 12,9, 10,5 Hz, 1H), 1,47 (d, J = 6,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 173,1, 74,3, 58,1, 36,5, 20,7. Isómeros trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,76 (m, 1H), 4,33 (dd, J = 8,1, 5,6 Hz, 1H), 2,27 (ddd, J = 13,4, 7,0, 6,1 Hz, 1H), 2,13 (ddd, J = 13,7, 8,1, 5,8 Hz, 1H), 1,42 (d, J = 6,4 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,9, 75,5, 57,4, 35,6,
20,9.
2-Azido-4-etilbutirolactonas:
La reacción de azidación se llevó a cabo con
2-bromo-4-etilbutirolactona
(43,0 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 10:90)
proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (3,2 g,
47%, cis:trans (aislado) = 2,8:1). Isómeros
cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,37 (m,
1H), 4,35 (dd, J = 11,1, 8,7 Hz, 1H), 2,64 (ddd, J = 12,9, 8,7, 5,5
Hz, 1H), 1,74 (m, 3H), 1,02 (t, J = 7,5 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100
MHz, CDCl_{3}) \delta 173,1, 79,1, 57,8, 34,4, 28,2, 9,1.
Isómeros trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3})
\delta 4,55 (m, 1H), 4,30 (dd, J = 8,1, 6,2 Hz, 1H), 2,23 (ddd, J
= 13,7, 7,3, 6,4 Hz, 1H), 2,17 (ddd, J = 14,0, 8,2, 5,6 Hz, 1H),
1,85-1,58 (m, 2H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,9, 80,4, 57,2, 33,5,
28,2, 9,3.
2-Azido-4-butilbutirolactonas:
La reacción de azidación se llevó a cabo con
2-bromo-4-butilbutirolactona
(31,6 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 10:90)
proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (2,9 g,
50%, cis:trans (aislado) = 3,1:1). Isómeros
cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,42 (m,
1H), 4,36 (dd, J = 11,0, 8,6 Hz, 1H), 2,66 (ddd, J = 13,4, 8,1, 4,7
Hz, 1H), 1,82-1,72 (m, 1H), 1,77 (dt, J = 13,2, 10,6
Hz, 1H), 1,65 (m, 1H), 1,49-1,30 (m, 4H), 0,92 (t, J
= 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 173,1,
77,9, 57,8, 34,83, 34,80, 26,9, 22,2, 13,7. Isómeros
trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,60
(m, 1H), 4,29 (dd, J = 8,1, 5,9 Hz, 1H), 2,23 (ddd, J = 13,4, 7,1,
6,1 Hz, 1H), 2,15 (ddd, J = 13,8, 8,0, 5,8 Hz, 1H),
1,77-1,55 (m, 2H), 1,48-1,30 (m,
4H), 0,92 (t, J = 7,1 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3})
\delta 172,9, 79,2, 57,2, 35,0, 34,1, 27,2, 22,2, 13,7.
2-Azido-4-fenilbutirolactonas:
La reacción de azidación se llevó a cabo con
2-bromo-4-fenilbutirolactona
(21,7 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 15:85)
proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (2,4 g,
54%, cis:trans (aislado) = 3,7:1). Isómeros
cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta
7,42-7,32 (m, 5H), 5,39 (dd, J = 10,6, 5,5 Hz, 1H),
4,49 (dd, J = 11,3, 8,6 Hz, 1H), 2,94 (ddd, J = 13,2, 8,3, 5,3 Hz,
1H), 2,12 (dt, J = 12,9, 11,0 Hz, 1H); ^{13}C RMN (100 MHz,
CDCl_{3}) \delta 172,8, 137,3, 129,1, 128,9, 125,7, 78,3, 58,1,
37,3. Isómeros trans : ^{1}H RMN (400 MHz,
CDCl_{3}) \delta 7,43-7,26 (m, 5H), 5,64 (t, J =
6,6 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 7,7, 6,0 Hz, 1H), 2,55 (ddd, J = 13,4,
7,0, 6,3 Hz, 1H), 2,48 (ddd, J = 13,6, 7,7, 6,0 Hz, 1H); ^{13}C
RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,7, 138,0, 128,9, 128,8,
125,0, 79,2, 57,0, 36,8.
Procedimiento General para la Preparación de
Clorhidratos de Homoserina Lactonas: (Nota: Las
2-Azido-4-fenilbutirolactonas
no se redujeron usando este procedimiento). La
2-azidobutirolactona correspondiente
(2-20 mmoles) disuelta en metanol
(2-10 ml/mmol, típicamente 5 ml/mmol), HCl
concentrado (10-30 gotas), y Pd al 10%/C (seco,
3-10% en moles, típicamente 5% en moles) se agitaron
en atmósfera de H_{2} durante 24 horas o hasta que el análisis por
TLC indicó que no quedaba azida de partida. La reacción se filtró a
través de celita y se concentró a vacío retirando el metanol. Los
productos brutos se disolvieron en HCl 4N (generalmente 1 ml/mmol),
después se congelaron y se liofilizaron proporcionando los productos
en forma de sólidos de color blanco o blanquecino.
Clorhidratos de
2-Metil-(S)-homoserina lactona y
2-metil-(R)-homoserina lactona:
La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-2-metilhomoserina
lactona (6,1 mmoles, isómeros cis) proporcionando los
productos en forma de un sólido hidroscópico de color blanquecino
(1,21 g, 131%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,56 (td,
J = 9,5, 1,9 Hz, 1H), 4,46 (td, J = 9,9, 6,4 Hz, 1H), 2,64 (dt, J =
12,9, 9,8 Hz, 1H), 2,52 (ddd, J = 13,0, 6,5, 1,7 Hz, 1H), 1,64 (s,
3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 176,2, 66,8, 56,8,
34,4, 20,8.
Clorhidratos de
3(R)-Metil-(S)-homoserina
lactona y
3(S)-metil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-3-metilhomoserina
lactona (3,3 mmoles, isómeros cis) proporcionando los
productos en forma de un sólido hidroscópico de color ámbar (500 mg,
101%). La estereoquímica se asignó en base al trabajo previo (5).
^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,53 (m, 2H), 4,18 (d, J
= 9,1 Hz, 1H), 3,01 (m, 1H), 1,16 (d, J = 7,3 Hz, 3H); ^{13}C RMN
(100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,5, 74,2, 53,3, 33,9, 13,0.
Clorhidratos de
3(S)-Metil-(S)-homoserina
lactona y
3(R)-metil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-3-metilhomoserina
lactona (2,2 mmoles, isómeros trans) proporcionando los
productos en forma de un sólido de color blanquecino (290 mg, 87%).
La estereoquímica se asignó en base al trabajo previo (5). ^{1}H
RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,56 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 4,03
(d, J = 11,5 Hz, 1H), 3,96 (t, J = 9,7 Hz, 1H), 2,74 (m, 1H), 1,31
(d, J = 6,5 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta
173,8, 72,9, 55,8, 37,1, 14,0.
Clorhidratos de
4(S)-Metil-(R)-homoserina
lactona y
4(R)-metil-(S)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-4-metilhomoserina
lactona (10,4 mmoles, isómeros cis) proporcionando los
productos en forma de un sólido de color blanquecino (1,6 g, 102%).
^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,85 (m, 1H), 4,54 (dd, J
= 12,0, 8,7 Hz, 1H), 2,94 (ddd, J = 12,8, 8,4, 4,8 Hz, 1H), 2,07 (c,
J = 11,8 Hz, 1H), 1,50 (d, J = 6,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz,
CD_{3}OD) \delta 174,1, 77,3, 50,2, 34,6, 19,7.
Clorhidratos de
4(S)-Metil-(S)-homoserina
lactona y
4(R)-metil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-4-metilhomoserina
lactona (6,2 mmoles, isómeros trans) proporcionando los
productos en forma de un sólido de color blanquecino (910 mg, 98%).
^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,87 (m a, 1H), 4,42 (t
a, J = 9,4 Hz, 1H), 2,40 (m a, 2H), 1,28 (d a, J = 4,8 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 174,3, 77,5, 48,2,
32,1,
20,1.
20,1.
Clorhidratos de
4(S)-Etil-(R)-homoserina
lactona y
4(R)-etil-(S)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-4-etilhomoserina
lactona (7,9 mmoles, isómeros cis) proporcionando los
productos en forma de un sólido de color blanco (1,3 g, 97%).
^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,55 (m, 1H), 4,43 (dd, J
= 12,1, 8,9 Hz, 1H), 2,82 (ddd, J = 12,4, 8,6, 5,1 Hz, 1H), 1,96
(td, J = 12,2, 10,5 Hz, 1H), 1,79 (m, 2H), 1,04 (t, J = 7,5 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,4, 81,3, 50,8, 34,1,
28,9, 9,5.
Clorhidratos de
4(S)-Etil-(S)-homoserina
lactona y
4(R)-etil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-4-etilhomoserina
lactona (4,9 mmoles, isómeros trans) proporcionando los
productos en forma de un sólido hidroscópico de color blanquecino
(760 mg, 94%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,69 (m,
1H), 4,43 (t, J = 9,8 Hz, 1H), 2,52 (m, 2H), 1,75 (m, 2H), 1,02 (t,
J = 7,4 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,6,
81,8, 49,0, 31,8, 29,1, 9,9.
Clorhidratos de
4(S)-Butil-(R)-homoserina
lactona y
4(R)-butil-(S)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-4-butilhomoserina
lactona (12,0 mmoles, isómeros cis) proporcionando los
productos en forma de un sólido de color blanco (2,1 g, 91%).
^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,61 (m, 1H), 4,42 (dd, J
= 12,1, 8,6 Hz, 1H), 2,82 (ddd, J = 12,3, 8,7, 5,1 Hz, 1H), 1,96
(td, J = 12,1, 10,7 Hz, 1H), 1,85-1,66 (m, 2H),
1,54-1,29 (m, 4H), 0,95 (t, J = 7,1 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,4, 80,2, 50,8, 35,7,
34,6, 28,3, 23,4, 14,2.
Clorhidratos de
4(S)-Butil-(S)-homoserina
lactona y
4(R)-butil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo usando
2-azido-4-butilhomoserina
lactona (3,9 mmoles, isómeros trans) proporcionando los
productos en forma de un sólido hidroscópico de color blanquecino
(690 mg, 92%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,74 (m,
1H), 4,42 (t, J = 9,8 Hz, 1H), 2,49 (m, 2H),
1,86-1,63 (m, 2H), 1,54-1,28 (m,
4H), 0,95 (t, J = 6,9 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD)
\delta 173,6, 80,6, 53,6, 35,8, 32,2, 28,6, 23,3, 14,2.
Clorhidratos de
4(S)-Fenil-(R)-homoserina
lactona y
4(R)-fenil-(S)-homoserina
lactona: Los compuestos sustituidos con fenilo se redujeron
mediante el procedimiento descrito por Bloch y colaboradores (6). La
reacción se llevó a cabo usando
2-azido-4-fenilhomoserina
lactona (8,8 mmoles, isómeros cis, adición/agitación durante
0,75 horas, calentamiento durante 2 horas) proporcionando los
productos en forma de un sólido de color blanco (2,3 g, 117%). Los
productos también contenían las impurezas PPh_{3} y
P(O)Ph_{3} según se determinó mediante
espectroscopía de RMN. La integración de los productos y las
impurezas indicó que la mezcla era del 65,9% en peso de los
productos (1,6 g, 85% de rendimiento de producto) y se usaron sin
purificación adicional. ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta
7,66-7,39 (m, 5H), 5,62 (dd, J = 10,8, 5,4 Hz, 1H),
4,62 (dd, J = 12,1, 8,6 Hz, 1H), 3,11 (ddd, J = 12,5, 8,5, 5,2 Hz,
1H), 2,33 (td, J = 12,2, 11,0 Hz, 1H); ^{13}C RMN (100 MHz,
CD_{3}OD) \delta 173,2, 138,8, 130,0, 129,9, 127,3, 80,7, 51,2,
37,1.
Clorhidratos de
4(S)-Fenil-(S)-homoserina
lactona y
4(R)-fenil-(R)-homoserina
lactona: Los compuestos sustituidos con fenilo se redujeron
mediante el procedimiento descrito por Bloch y colaboradores (6). La
reducción se llevó a cabo usando
2-azido-4-fenilhomoserina
lactona (2,4 mmoles, isómeros trans, adición/agitación
durante 3,5 horas, calentamiento durante 3 horas) proporcionando los
productos en forma de un sólido de color blanco (680 mg, 135%). Bajo
estas condiciones, se observó racemización en la posición 2
proporcionando una mezcla 2:1 de los isómeros trans:cis. Los
productos también contenían las impurezas PPh_{3} y
P(O)Ph_{3} según se determinó mediante
espectroscopía de RMN. La integración de los productos y las
impurezas indicó que la mezcla era del 73,2% en peso de los
productos (498 mg, 99% de rendimiento de producto) y se usaron sin
purificación adicional. ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta
7,66-7,39 (m, 5H), 5,87 (dd, J = 8,5, 2,6 Hz, 1H),
4,42 (t, J = 9,7 Hz, 1H), 2,88 (ddd, J = 13,3, 10,2, 8,5 Hz, 1H),
2,80 (ddd, J = 13,0, 9,6, 3,2 Hz, 1H); ^{13}C RMN (100 MHz,
CD_{3}OD) \delta 173,5, 139,8, 130,1, 129,8, 126,3, 80,2, 51,2,
34,8.
\newpage
Procedimiento General para la preparación de
N-Acilhomoserina lactonas: Una mezcla del éster
etílico (1-5 mmoles) e hidróxido sódico al 5% (1,7
equivalentes) se agitó a 35ºC durante 1-1,5 horas y
después se añadió a diclorometano (75-100 ml). La
mezcla se enfrió en un baño de hielo, se agitó enérgicamente,
después se añadió gota a gota ácido clorhídrico concentrado (1,8
equivalentes) (Nota: un exceso significativo de ácido o de calor da
como resultado la descarboxilación de los productos ácido
b-cetocarboxílico). La fase de diclorometano se separó, se
secó (MgSO_{4}), y se concentró al vacío a temperatura ambiente.
El residuo sólido de color blanco se recogió en THF anhidro
(10-15 ml) y se añadió a una suspensión agitada de
bromhidrato o clorhidrato de homoserina lactona (0,8 equivalentes),
hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio
(0,9 equivalentes), y diisopropil etilamina (1,8 equivalentes) en
THF anhidro (15 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 18-24 horas. La solución resultante
se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo y de nuevo se
concentró proporcionando un aceite de color ámbar. El producto bruto
se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice
proporcionando un sólido de color blanco. En la mayoría de los
casos, se requirieron dos separaciones cromatográficas para obtener
el material puro.
N-(\beta-Cetooctanoil)-2-metil-(S)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-2-metil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (3,3 mmoles) y clorhidrato
de 3-metilhomoserina lactona (2,6 mmoles). La
purificación se llevó a cabo mediante cromatografía sobre gel de
sílice radial en dos ejecuciones secuenciales (AcOEt:hexano, 1:1
después AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 25:75) proporcionando el producto en
forma de un sólido de color blanco (37 mg, 6%). ^{1}H RMN (400
MHz, CDCl_{3}) \delta 7,70 (s a, 1H), 4,50 (td, J = 9,4, 2,4 Hz,
1H), 4,25 (td, J = 9,3, 7,4 Hz, 1H), 3,45 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 3,22
(d, J = 17,7 Hz, 1H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,28 (ddd, J =
12,8, 7,3, 2,6 Hz, 1H), 1,60-1,50 (m, 2H), 1,53 (s,
3H), 1,36-1,21 (m, 4H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,8, 177,1, 165,6,
65,2, 55,6, 48,2, 43,7, 34,2, 31,0, 22,9, 22,5, 22,3, 13,8; EMAR
Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}: 256,1549. Encontrado:
256,1562.
N-(\beta-Cetooctanoil)-3(S)-metil-(R)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-3(R)-metil-(S)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (2,6 mmoles) y clorhidrato
de 3-metilhomoserina lactona (1,9 mmoles, isómeros
cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía
en columna sobre gel de sílice seguido de cromatografía sobre gel de
sílice radial (AcOEt:hexano, 1:1; después AcOEt:CH_{2}Cl_{2},
1:3) proporcionando el producto en forma de un sólido de color
blanco (100 mg, 22%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta
7,73 (d a, J = 5,1 Hz, 1H), 4,77 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 4,43 (dd, J =
9,1, 5,1 Hz, 1H), 4,11 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,50 (s, 2H), 2,98 (m,
1H), 2,54 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,64-1,56 (m, 2H),
1,36-1,24 (m, 4H), 1,01 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 0,89
(t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta
206,1, 174,6, 166,5, 72,6, 53,1, 48,3, 43,8, 33,8, 31,1, 28,1, 23,0,
22,3, 13,8, 12,8; EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}:
256,1549. Encontrado: 256,1550.
N-(\beta-Cetooctanoil)-3(S)-metil-(S)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-3(R)-metil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (2,4 mmoles) y clorhidrato
de 3-metilhomoserina lactona (1,8 mmoles, isómeros
trans). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice seguido de
cromatografía sobre gel de sílice radial (AcOEt:hexano, 1:1)
proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco
(260 mg, 43%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,57 (d
a, J = 7,8 Hz, 1H), 4,45 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 4,38 (dd, J = 11,6,
8,1 Hz, 1H), 3,85 (dd, J = 10,7, 9,1 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H), 2,61 (m,
1H), 2,54 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,63-1,56 (m, 2H),
1,35-1,23 (m, 4H), 1,21 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,89
(t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta
206,6, 174,6, 166,6, 71,4, 55,2, 48,3, 43,7, 37,8, 31,1, 28,1, 23,0,
22,3, 14,7, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}:
256,1549. Encontrado: 256,1551.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-metil-(S)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-metil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (0,95 mmoles) y clorhidrato
de 4-metilhomoserina lactona (0,40 mmoles, isómeros
cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía
sobre gel de sílice radial dos veces (usando en primer lugar
AcOEt:hexano, 3:2; después usando iPrOH:CH_{2}Cl_{2}, 1:20)
proporcionando el producto en forma de un líquido incoloro
transparente (67 mg, 71%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3})
\delta 7,55 (d a, J = 5,4 Hz, 1H), 4,62 (ddd, J = 12,2, 8,4, 6,8
Hz, 1H), 4,49 (m, 1H), 3,39 (s, 2H), 2,78 (ddd, J = 12,6, 8,1, 4,8
Hz, 1H), 2,45 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,74 (td, J = 12,1, 10,9 Hz, 1H),
1,52 (m, 2H), 1,40 (d, J = 6,2 Hz, 3H), 1,30-1,15
(m, 4H), 0,82 (t, J = 6,7 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz,
CDCl_{3}) \delta 206,5, 174,4, 166,3, 74,6, 50,7, 48,2, 43,8,
37,8, 31,1, 23,0, 22,3, 20,6, 13,8; EMAR Calculado para M+H
C_{13}H_{22}NO_{4}: 256,1549. Encontrado: 256,1539.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-metil-(R)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-metil-(S)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (0,58 mmoles) y clorhidrato
de 4-metilhomoserina lactona (0,43 mmoles, isómeros
trans). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía sobre gel de sílice radial dos veces (usando en primer
lugar AcOEt:CH_{2}Cl_{2}:hexano, 6:1:3; después usando
iPrOH:AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:1:20) proporcionando el producto en
forma de un sólido de color blanco (31 mg, 27%). ^{1}H RMN (400
MHz, CDCl_{3}) \delta 7,60 (d a, J = 5,6 Hz, 1H), 4,77 (m, 1H),
4,59 (td, J = 9,7, 6,7 Hz, 1H), 3,39 (s, 2H), 2,45 (t, J = 7,4 Hz,
2H), 2,39-2,22 (m, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,36 (d, J =
6,5 Hz, 3H), 1,30-1,15 (m, 4H), 0,82 (t, J = 7,1 Hz,
3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,7, 174,5,
166,2, 74,8, 48,3, 48,0, 43,9, 35,4, 31,1, 23,0, 22,4, 21,3, 13,8;
EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}: 256,1549.
Encontrado: 256,1556.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-etil-(S)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-etil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (3,2 mmoles) y clorhidrato
de 4-etilhomoserina lactona (2,4 mmoles, isómeros
cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía
en columna sobre gel de sílice seguido de cromatografía sobre gel de
sílice radial (AcOEt:hexano, 1:1; después AcOEt:CH_{2}Cl_{2},
10:90) proporcionando el producto en forma de un sólido de color
blanco (310 mg, 48%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta
7,62 (d a, J = 6,2 Hz, 1H), 4,69 (ddd, J = 12,1, 8,3, 6,7 Hz, 1H),
4,38 (m, 1H), 3,47 (s, 2H), 2,80 (ddd, J = 12,4, 8,3, 5,0 Hz, 1H),
2,53 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,88-1,55 (m, 6H),
1,36-1,22 (m, 4H), 1,01 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 0,89
(t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta
206,4, 174,5, 166,3, 79,4, 50,4, 48,3, 43,7, 35,6, 31,1, 28,1, 23,0,
22,3, 13,8, 9,1; EMAR Calculado para M+H C_{14}H_{24}NO_{4}:
270,1705. Encontrado: 270,1692.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-etil-(R)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-etil-(S)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (2,4 mmoles) y clorhidrato
de 4-etilhomoserina lactona (1,8 mmoles, isómeros
trans). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 1:1)
proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco
(300 mg, 62%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,70 (d a,
J = 6,4 Hz, 1H), 4,60 (m, 2H), 3,46 (s, 2H), 2,53 (t, J = 7,4 Hz,
2H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,35-2,27
(m, 1H), 1,80-1,55 (m, 6H),
1,36-1,22 (m, 4H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,89
(t, J = 6,9 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta
206,5, 174,8, 166,3, 79,9, 48,4, 48,2, 43,7, 33,4, 31,1, 28,4, 23,0,
22,3, 13,8, 9,5; EMAR Calculado para M+H C_{14}H_{24}NO_{4}:
270,1705. Encontrado: 270,1700.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-butil-(S)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-butil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (1,0 mmoles) y clorhidrato
de 4-butilhomoserina lactona (1,2 mmoles, isómeros
cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía
sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}:hexano, 3:2:5)
proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco
(204 mg, 68%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,59 (d a,
J = 5,6 Hz, 1H), 4,66 (ddd, J = 12,1, 8,2, 6,6 Hz, 1H), 4,42 (m,
1H), 3,46 (s, 2H), 2,83 (ddd, J = 12,6, 8,2, 4,7 Hz, 1H), 2,52 (t, J
= 7,4 Hz, 2H), 1,86-1,74 (m, 3H),
1,72-1,54 (m, 2H), 1,50-1,20 (m,
8H), 0,92 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H); ^{13}C
RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,5, 174,4, 166,2, 78,3, 50,4,
48,1, 43,9, 36,3, 34,8, 31,1, 27,1, 23,0, 22,3, 13,9, 13,8; EMAR
Calculado para M+H C_{16}H_{28}NO_{4}: 298,2018. Encontrado:
298,2016.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-butil-(R)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-butil-(S)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (2,3 mmoles) y clorhidrato
de 4-butilhomoserina lactona (1,1 mmoles, isómeros
trans). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía sobre gel de sílice radial
(AcOEt:CH_{2}Cl_{2}:hexano, 3:2:5) dos veces proporcionando el
producto en forma de un sólido de color blanco (210 mg, 64%).
^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,64 (d a, J = 6,2 Hz,
1H), 4,63 (m, 2H), 3,46 (s, 2H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,46
(ddd, J = 12,8, 9,7, 2,8 Hz, 1H), 2,29 (ddd, J = 13,0, 10,1, 8,5 Hz,
1H), 1,78-1,66 (m, 1H), 1,66-1,54
(m, 3H), 1,48-1,22 (m, 8H), 0,91 (t, J = 7,1 Hz,
3H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3})
\delta 206,7, 174,6, 166,1, 78,6, 48,4, 47,9, 43,9, 35,1, 34,0,
31,1, 27,4, 23,0, 22,35, 22,29, 13,9, 13,8; EMAR Calculado para M+H
C_{16}H_{28}NO_{4}: 298,2018. Encontrado: 298,2024.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-fenil-(S)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-fenil-(R)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (1,3 mmoles) y clorhidrato
de 4-fenilhomoserina lactona (1,2 mmoles, isómeros
cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía
sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:9) dos veces
proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco
(273 mg, 71%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,77 (d a,
J = 6,2 Hz, 1H), 7,40-7,35 (m, 5H), 5,41 (dd, J =
11,0, 5,4 Hz, 1H), 4,80 (ddd, J = 12,1, 8,2, 6,9 Hz, 1H), 3,48 (s,
2H), 3,07 (ddd, J = 12,6, 8,3, 5,4 Hz, 1H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz,
2H), 2,24 (c, J = 11,9 Hz, 1H), 1,62-1,55 (m, 2H),
1,36-1,21 (m, 4H), 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,5, 174,0, 166,3,
137,8, 128,9, 128,8, 125,9, 78,8, 50,8, 48,1, 43,8, 38,2, 31,1,
23,0, 22,3, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{18}H_{24}NO_{4}:
318,1705. Encontrado: 318,1707.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-fenil-(R)-homoserina
lactona y
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-fenil-(S)-homoserina
lactona: La reacción se llevó a cabo con
3-oxooctanoato de etilo (1,0 mmoles) y clorhidrato
de 4-fenilhomoserina lactona (1,1 mmoles,
trans:cis = 2:1). La purificación y separación de los
isómeros trans se llevó a cabo mediante cromatografía sobre
gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:9) tres veces
proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco
(144 mg, 41%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,77 (d
a, J = 6,7 Hz, 1H), 7,41-7,28 (m, 5H), 5,75 (dd, J =
8,3, 2,7 Hz, 1H), 4,58 (td, J = 9,6, 6,8 Hz, 1H), 3,47 (s, 2H), 2,77
(ddd, J = 12,7, 9,3, 3,2 Hz, 1H), 2,68 (ddd, J = 12,9, 10,1, 8,5 Hz,
1H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,63-1,55 (m, 2H),
1,36-1,22 (m, 4H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,7, 174,6, 166,2,
139,0, 128,9, 128,4, 124,9, 78,4, 48,2, 48,0, 43,9, 36,4, 31,1,
23,0, 22,3, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{18}H_{24}NO_{4}:
318,1705. Encontrado: 318,1695.
N-(\alpha-Metil-\beta-cetooctanoil)-(S)-homoserina:
La reacción se llevó a cabo con
2-metil-3-oxooctanoato
de etilo (0,57 mmoles) y bromhidrato de
(S)-homoserina lactona (0,85 mmoles). La
purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre
gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:4; después
iPrOH:CH_{2}Cl_{2}, 1:20) proporcionando el producto en forma de
un sólido de color blanco (69 mg, 47%). ^{1}H RMN (400 MHz,
CDCl_{3}) \delta 6,95 (s a, 1H), 4,57-4,44 (m,
2H), 4,30-4,22 (m, 1H), 3,50-3,42
(m, 1H), 2,81-2,70 (m, 1H),
2,58-2,52 (m, 2H), 2,25-2,10 (m,
1H), 1,60-1,52 (m, 2H), 1,45-1,38
(m, 3H), 1,25-1,19 (m, 4H), 0,87 (t, J = 7,2 Hz,
3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 210,56, 210,52,
175,73, 175,72, 171,42, 171,39, 66,91, 66,86, 54,59, 54,55, 50,26,
50,19, 42,79, 42,54, 32,2, 30,9, 24,0, 23,4, 16,33, 16,25, 14,9;
EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{21}NO_{4}: 256,1549.
Encontrado: 256,1560.
N-(\alpha,\alpha-Dimetil-\beta-cetooctanoil)-(S)-homoserina:
Después de la hidrólisis del éster la reacción se llevó a cabo con
ácido
2,2-dimetil-3-oxooctanoico
(0,46 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina
lactona (0,85 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice radial
(AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:4; después CH_{2}Cl_{2}:AcOEt:hexano,
1:1:3) proporcionando el producto en forma de un sólido de color
blanco (51 mg, 41%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,45
(s a, 1H), 4,53-4,43 (m, 2H),
4,32-4,23 (m, 1H), 2,81-2,72 (m,
1H), 2,52 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,21-2,09 (m, 1H),
1,60-1,51 (m, 2H), 1,41 (d, J = 2,4 Hz, 6H),
1,30-1,19 (m, 4H), 0,87 (t, J = 7,2 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 211,1, 174,9, 173,2,
66,0, 55,7, 49,5, 38,3, 31,4, 29,9, 23,5, 22,7, 22,6, 14,0; EMAR
Calculado para M+H C_{14}H_{23}NO_{4}: 270,1705. Encontrado:
270,1700.
N-(\alpha-Etil-\beta-cetooctanoil)-(S)-homoserina:
Después de la hidrólisis del éster la reacción se llevó a cabo con
ácido
2-etil-3-oxooctanoico
(0,81 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina
lactona (0,77 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice radial
(AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:4; después AcOEt:hexano, 1:1)
proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco
(155 mg, 74%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,97 (d a,
J = 35,5 Hz, 1H), 4,58-4,50 (m, 1H),
4,50-4,42 (m, 1H), 4,30-4,21 (m,
1H), 3,37 (c, J = 8,0 Hz, 1H), 2,81-2,68 (m, 1H),
2,58-2,50 (m, 2H), 2,23-2,10 (m,
1H), 1,98-1,80 (m, 2H), 1,62-1,52
(m, 4H), 1,36-1,20 (m, 4H), 0,96 (c, J = 5,6 Hz,
3H), 0,87 (t, J = 7,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3})
\delta 209,90, 209,83, 174,7, 169,6, 169,5, 66,0, 65,9, 61,3,
61,2, 49,3, 49,2, 43,2, 42,9, 31,3, 30,05, 30,01, 24,96, 24,94,
23,0, 22,5, 14,0, 11,93, 11,90; EMAR Calculado para M+H
C_{14}H_{23}NO_{4}: 270,1705. Encontrado: 270,1692.
N-(\alpha-Butil-\beta-cetooctanoil)-(S)-homoserina:
Después de la hidrólisis del éster la reacción se llevó a cabo con
ácido
2-butil-3-oxooctanoico
(0,23 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina
lactona (0,36 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice radial (AcOEt:hexano,
1:1; después AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:4) proporcionando el producto
en forma de un sólido de color blanco (36 mg, 52%). ^{1}H RMN (400
MHz, CDCl_{3}) \delta 6,89 (d a, J = 35,5 Hz, 1H),
4,56-4,41 (m, 2H), 4,33-4,21 (m,
1H), 3,42 (c, J = 7,4 Hz, 1H), 2,80-2,70 (m, 1H),
2,56-2,48 (m, 2H), 2,22-2,08 (m,
1H), 1,96-1,72 (m, 2H), 1,63-1,50
(m, 2H), 1,38-1,20 (m, 8H),
0,93-0,84 (m, 6H); ^{13}C RMN (100 MHz,
CDCl_{3}) \delta 207,2, 207,1, 174,8, 169,69, 169,62, 66,0,
65,9, 60,82, 60,80, 49,4, 49,3, 31,6, 30,85, 30,83, 29,9, 29,8,
29,6, 29,14, 29,13, 27,38, 27,36, 22,6, 14,1; EMAR Calculado para
M+H C_{16}H_{27}NO_{4}: 298,2018. Encontrado: 298,2020.
N-(\alpha-Hexil-\beta-cetobutanoil)-(S)-homoserina:
Después de la hidrólisis del éster la reacción se llevó a cabo con
ácido
2-hexil-3-oxobutanoico
(0,83 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina
lactona (0,65 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice radial (AcOEt:hexano,
1:1; después AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:3) proporcionando el producto
en forma de un sólido de color blanco (147 mg, 84%). ^{1}H RMN
(400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,87 (d a, J = 21,3 Hz, 1H),
4,58-4,43 (m, 2H), 4,30-4,22 (m,
1H), 3,40 (c, J = 8,0 Hz, 1H), 2,80-2,70 (m, 1H),
2,25 (d, J = 2,4 Hz, 3H), 2,23-2,12 (m, 1H),
1,91-1,78 (m, 2H), 1,35-1,20 (m,
6H), 0,92-0,82 (m, 3H), 0,85 (t, J = 6,8 Hz, 3H);
^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 209,8, 174,7, 169,7,
169,6, 66,0, 65,9, 65,32, 65,30, 65,2, 60,0, 49,3, 49,2, 43,2, 42,9,
31,35, 31,33, 31,27, 31,24, 30,0, 29,6, 29,5, 23,1, 22,5, 14,0,
13,9.
La estructura genérica de la molécula de AHL y
las sustituciones realizadas a la estructura se proporcionan en la
Figura 27.
Se preparan protoplastos de zanahoria tal y como
se ha descrito en el ejemplo 4A anterior.
Se transfectaron protoplastos de zanahoria con
la construcción del reportero TraA8 (4X)- GUS con el gen activador
35S-VP16-TraR y se ensayó en ellos
la inducción de GUS mediante la aplicación de AHL de tipo silvestre
y los diversos análogos de AHL descritos en el Ejemplo 8.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La actividad
\beta-galactosidasa en protoplastos de zanahoria
inducidos y no inducidos que contienen las construcciones del gen
reportero TraA8(4X)-GUS y del gen activador
35S-VP16-TraR inducida usando
diversos análogos de AHL mostrados en las Tablas 8 y 9 se
proporciona en forma gráfica en las Figuras 28 y 29.
<110> Calgene LLC
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Control de la Expresión génica en
células eucariotas
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<130> 15376/00/WO
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/148,441
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
01-07-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/177,578
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-01-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/195,690
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
07-04-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 57
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipacctgtagga tcgtacaggt
\hfill20
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<210> 2
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprnstgyagat ntrcasrt
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctgtagga tcgtacaggt
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatggatca ttttgcaggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctgccagt tctggcaggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctgcacta tagtacaggc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgtaaga gttaccagtt
\hfill20
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<210> 8
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipccctgtcaat cctgacagtt
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipccctaccaga tctggcaggt
\hfill20
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<210> 10
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipacgtgcagat ctgcacat
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Oligonucléotido Sintético
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipaagtgcagat ttgcacat
\hfill18
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<210> 12
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipatgtgcagat ctgcacat
\hfill18
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<210> 13
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipgtgtgcagat ctgcacac
\hfill18
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<210> 14
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipaggtgcagat ctgcacct
\hfill18
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<210> 15
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipatttgcagat ctgcaaat
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 31
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 28
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill28
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacttaacct gccagttctg gcaggtaaca
\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacttaacct gccagttctg gcaggtaaca
\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\hfill34
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\hfill33
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<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Olígonucleótido Sintético
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<400> 39
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\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtagccatat ggccttggtt gacggttttc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttactcata tgaggaatga cggaggcttt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 43
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<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcgcttca gatgaggccc agcgccgcgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 44
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\hskip-.1em\dddseqskipcatatgcagc actggctgg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 45
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacctca gatgagtttc cg
\hfill22
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<210> 46
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> epítope de hemaglutinina de la
gripe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
His}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 47
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\hskip-.1em\dddseqskipaattgtagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacc
\hfill44
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<210> 48
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 48
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\hskip-.1em\dddseqskipcatgggtata tctccttctt aaagttaaac aaaattattt ctac
\hfill44
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<210> 49
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 49
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\hskip-.1em\dddseqskipacgtaagctt cgaaattaat acgactcact ataggg
\hfill36
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<210> 50
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<211> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 50
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\hskip-.1em\dddseqskipaaggag
\hfill6
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<210> 51
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<211> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 51
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\hskip-.1em\dddseqskipuuccuc
\hfill6
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<210> 52
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\newpage
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<400> 52
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<210> 53
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<211> 76
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 53
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<210> 54
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 54
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<210> 55
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleátído Sintético
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<400> 55
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<210> 56
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> O1iqonucleátido Sintético
\newpage
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<400> 56
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<210> 57
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Un polinucleótido de origen no natural que
comprende un promotor que es funcional en una célula eucariota que
comprende un promotor 35S/T7 quimérico unido de manera operativa a
una secuencia que codifica un polipéptido que se une específicamente
a un elemento de respuesta a homoserina lactona acilada (AHL).
2. El polinucleótido de la reivindicación 1 en
el que dicho promotor está unido de manera operativa a una secuencia
que codifica un polipéptido de unión al ADN que se une
específicamente a un elemento de respuesta a AHL.
3. El polinucleótido de la reivindicación 2 en
el que el polipéptido de unión a ADN comprende un motivo de unión a
AHL y un dominio de unión a un elemento de respuesta a AHL.
4. El polinucleótido de la reivindicación 3 en
el que el polipéptido de unión al ADN comprende además un miembro
del grupo constituido por un dominio de activación transcripcional
eucariota y un dominio de represión transcripcional eucariota.
5. El polipéptido de la reivindicación 3 en el
que la unión de una AHL mediante el motivo de unión a AHL provoca la
unión específica del polipéptido de unión al ADN a un elemento de
respuesta a AHL.
6. El polinucleótido de la reivindicación 3 en
el que el polipéptido de unión al ADN se une a un elemento de
respuesta a AHL a menos que una AHL esté unida mediante el motivo de
unión a AHL.
7. El polinucleótido de la reivindicación 1 en
el que dicho promotor está unido de manera operativa a una secuencia
que codifica un receptor de AHL.
8. El polinucleótido de la reivindicación 1 que
comprende adicionalmente un promotor que es funcional en una célula
eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL.
9. El polinucleótido de la reivindicación 1 que
comprende adicionalmente un promotor que es funcional en una célula
eucariota unido de manera operativa a una secuencia que codifica una
AHL sintasa.
10. El polinucleótido de la reivindicación 9 en
el que dicho promotor que es funcional en una célula eucariota unido
de manera operativa a la secuencia que codifica una AHL sintasa
comprende un elemento de respuesta a
AHL.
AHL.
11. El polinucleótido de la reivindicación 1 que
comprende:
una primera secuencia que comprende un primer
promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un
elemento de respuesta a AHL, y
una segunda secuencia que comprende un segundo
promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en
la célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia
que codifica un receptor de AHL, en el que el receptor de AHL se une
al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer
promotor.
12. El polinucleótido de la reivindicación 1 que
comprende:
una primera secuencia que comprende un primer
promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un
elemento de respuesta a AHL,
una segunda secuencia que comprende un segundo
promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un
elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a una secuencia
que codifica una AHL sintasa que, cuando se expresa en la célula
eucariota, sintetiza una AHL, y
una tercera secuencia que comprende un tercer
promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en
la célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia
que codifica un receptor de AHL, en el que la unión de la AHL
mediante el receptor de AHL provoca la unión del receptor de AHL al
elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer
promotor.
13. Un organismo que comprende el polinucleótido
de la reivindicación 1 seleccionado entre el grupo constituido por
una levadura, un mamífero no humano, y una planta.
14. Una célula eucariota aislada que comprende
una primera secuencia que comprende un primer promotor que es
funcional en la célula eucariota que comprende un elemento de
respuesta a homoserina lactona acilada (AHL) unido de forma
operativa a un gen de interés;
y una segunda secuencia que comprende un segundo
promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en
la célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia
que codifica un receptor de AHL, en el que la unión de una AHL
mediante el receptor de AHL provoca la unión del receptor de AHL al
elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer
promotor.
15. La célula eucariota de la reivindicación 14
en la que al menos uno de entre el primer o el segundo promotor es
un promotor no constitutivo.
16. La célula eucariota de la reivindicación 14
en la que el gen de interés es un marcador de selección o de
información (gen chivato).
17. Una célula eucariota aislada que
comprende:
un núcleo;
un orgánulo;
una primera secuencia que comprende un promotor
que es funcional en el orgánulo que comprende un elemento de
respuesta a homoserina lactona acilada (AHL) unido de forma
operativa a un gen de interés; y
una segunda secuencia que comprende un segundo
promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en
el núcleo y está unido de forma operativa a una secuencia que
codifica un polipéptido que comprende (i) un péptido de transporte
hacia el orgánulo y (ii) un receptor de AHL, en el que el receptor
de AHL se une al elemento de respuesta a AHL y modula la
transcripción del primer promotor tras la unión de una AHL.
18. La célula eucariota de la reivindicación 17
en la que el orgánulo es un plasto y el péptido de transporte hacia
el orgánulo es un péptido de transporte hacia el plasto.
19. La célula eucariota de la reivindicación 18
en la que el plasto es un cloroplasto y el péptido de transporte
hacia el plasto es un péptido de transporte hacia el
cloroplasto.
20. Una célula eucariota aislada que comprende
un orgánulo, comprendiendo el orgánulo:
una primera secuencia que comprende un promotor
que es funcional en el orgánulo que comprende un elemento de
respuesta a homoserina lactona acilada (AHL) unido de forma
operativa a un gen de interés; y
una segunda secuencia que comprende un promotor
que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en el
orgánulo y está unido de forma operativa a una secuencia que
codifica un polipéptido que comprende un receptor de AHL, en el que
el receptor de AHL se une al elemento de respuesta a AHL y modula la
transcripción del primer promotor tras la unión de una AHL.
21. La célula eucariota de la reivindicación 20
en la que el orgánulo es un plasto.
22. La célula eucariota de la reivindicación 21
en la que el plasto es un cloroplasto.
23. Un procedimiento de modulación de la
expresión de un polinucleótido que comprende un primer promotor que
es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de
respuesta a homoserina lactona acilada (AHL), comprendiendo el
procedimiento
la expresión en la célula eucariota de un
receptor de AHL usando el polinucleótido de la reivindicación 1,
y
la aplicación a la célula de una composición que
comprende una AHL que está unida por el receptor de AHL, provocando
la modulación de la transcripción del polinucleótido por parte del
receptor de AHL,
con la condición de que dicho procedimiento se
aplique ex vivo si la célula eucariota es una célula humana o una
célula animal.
24. El procedimiento de la reivindicación 23 en
el que la etapa de aplicación a una célula comprende aplicar la
composición a un organismo que comprende la célula, con la condición
de que el organismo no sea humano ni
animal.
animal.
25. El procedimiento de la reivindicación 24 en
el que la célula es una célula de planta y la etapa de aplicación a
una célula comprende la aplicación de la composición a una semilla o
una planta que comprende la célula o al
suelo.
suelo.
26. Un procedimiento de identificación de una
homoserina lactona acilada (AHL) que está unida por un receptor de
AHL, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) proporcionar una célula eucariota aislada
que comprende (i) un primer promotor que es funcional en la célula
eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de
forma operativa a una secuencia que codifica un marcador de
selección o de información (gen chivato), y (ii) un segundo promotor
que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en una
célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia que
codifica un receptor de AHL, en el que la unión de una AHL por el
receptor de AHL provoca la expresión del marcador;
(b) aplicar a la célula una composición que
comprende la AHL, y
(c) detectar la expresión del marcador.
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