ES2270852T3 - Regulacion de la expresion de genes en celulas eucariotas. - Google Patents

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Abstract

Un polinucleótido de origen no natural que comprende un promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un promotor 35S/T7 quimérico unido de manera operativa a una secuencia que codifica un polipéptido que se une específicamente a un elemento de respuesta a homoserina lactona acilada (AHL).

Description

Regulación de la expresión de genes en células eucariotas.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a procedimientos y composiciones para la regulación de la expresión de genes en células eucariotas, en particular mediante el uso de promotores que se pueden inducir o reprimir químicamente.
Antecedentes de la invención
Una amplia variedad de especies bacterianas producen derivados de homoserina lactona acilada (AHL) que funcionan en la comunicación célula-célula. Este sistema de señalización se usa, por ejemplo, para controlar la densidad de la población celular en un proceso denominado percepción de quórum (quorum sensing). Cada célula en una población produce un bajo nivel basal de la AHL difundible mediante la actividad de una AHL sintasa, normalmente un miembro de la familia LuxI de proteínas. La concentración de AHL aumenta con la densidad de población bacteriana hasta que la concentración de AHL es suficiente para provocar la expresión de diversos genes dependientes de AHL mediante una proteína receptora de AHL, normalmente un miembro de la familia LuxR de reguladores de transcripción. En al menos algunas especies, el gen de la AHL sintasa se puede inducir mediante AHL, conduciendo a la auto-inducción de la síntesis de AHL. Se han descrito sistemas de percepción de quórum en Vibrio fischeri (genes de bioluminiscencia lux), Pseudomonas aeruginosa (genes de virulencia), Agrobacterium tumefaciens (transferencia conjugativa), Serratia liquefaciens (movilidad tipo swarming), y Erwinia caratovora (producción de antibióticos), por ejemplo. Para revisiones, véase, por ejemplo: Fuqua y Greenberg, Curr. Opinion Microbiol. 1:183-189, 1998; y Fuqua y col., Ann. Rev. Microbiol. 50:727-751, 1996).
De acuerdo con estudios publicados del sistema de percepción de quórum LuxR-LuxI de Vibrio fischeri, no se observó unión específica al sitio de unión de LuxR (o "caja de lux") en las secuencias de promotor del lux ni con LuxR en solitario ni con ARN polimerasa bacteriana en solitario, sino que requería la presencia de tanto LuxR como de ARN polimerasa. Por consiguiente, se ha pensado que es posible la expresión génica inducible bajo el control de LuxR sólo cuando está también presente la ARN polimerasa bacteriana, en concreto, en células bacterianas, limitando la utilidad de los sistemas de percepción de quórum en células eucariotas.
El documento US-A-5.196.318 describe el uso de elementos de respuesta a AHL para la expresión de genes heterólogos en bacterias usando una homoserina lactona acilada como inductor. Sin embargo, no describe este uso para la expresión en células eucariotas. El documento WO 00/09704 describe el uso de elementos de respuesta a AHL para la expresión de un polinucleótido en eucariotas.
Se han descrito un número de sistemas para regular genes eucariotas incluyendo diversos elementos promotores que se pueden inducir químicamente. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de un sistema promotor inducible que se pueda usar en una variedad de organismos eucariotas, que esté estrictamente regulado y fuertemente inducido, y que responda a un inductor químico que presente una baja citotoxicidad.
Sumario de la invención
Los inventores han descubierto que se pueden usar sistemas de percepción de quórum bacterianos en el control de la expresión de genes eucariotas, ya sea en el núcleo o en orgánulos, tales como cloroplastos, de una célula eucariota. De esta forma, la presente invención proporciona
(1) un polinucleótido de origen no natural que comprende un promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un promotor 35S/T7 quimérico unido de forma operativa a una secuencia que codifica un polipéptido que se une de forma específica a un elemento de respuesta a una homoserina lactona acilada (AHL);
(2) un organismo que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 seleccionado entre el grupo constituido por una levadura, un mamífero no humano, y una planta.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporcionan polinucleótidos de origen no natural que incorporan elementos de un sistema de percepción de quórum bacteriano y que son útiles para el control o modulación de la expresión génica en una célula eucariota. Se proporciona un polinucleótido que comprende un promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento cis (por ejemplo, una caja de lux o secuencia similar) que media en la sensibilidad del promotor respecto a una N-acilhomoserina lactona (AHL). Dichos elementos cis se denominan en el presente documento como elementos de respuesta a AHL. Al unir una AHL o un análogo de AHL, el receptor de AHL se une al elemento de respuesta a AHL, modulando la transcripción del gen de interés unido de forma operativa. En la práctica de la invención se puede usar cualquier elemento de respuesta a AHL, gen de AHL sintasa, o gen de receptor de AHL conocido. El gen del receptor de AHL codifica un receptor de AHL nativo, porciones de un receptor de AHL nativo que se unen a un elemento de respuesta a AHL correspondiente, o una proteína de fusión que comprende un receptor de AHL nativo (o una porción del mismo que se une a un elemento eucariota.
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De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido que comprende: una primera secuencia que comprende un primer promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL, y una segunda secuencia que comprende un segundo promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en la célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL. Cuando se expresa en la célula, el receptor de AHL se une al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor. Otra realización de la invención es un polinucleótido que comprende: una primera secuencia que comprende un promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL; una segunda secuencia que comprende un segundo promotor que es funcional en la célula que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a una secuencia que codifica una AHL sintasa que, cuando se expresa en la célula eucariota, sintetiza una AHL; y una tercera secuencia que comprende un tercer promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en la célula eucariota, y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL. La unión de la AHL mediante el receptor de AHL provoca la unión del receptor de AHL al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor. En una célula eucariota que proporciona otras enzimas requeridas para la biosíntesis de AHL, el tratamiento de la célula con AHL exógena inicia la síntesis auto-inducida de la AHL y en consecuencia la expresión continuada del gen
de interés.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporcionan células eucariotas aisladas que comprenden: una primera secuencia que comprende un segundo promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, que es funcional en la célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a un gen de interés; y una segunda secuencia que comprende un promotor que es funcional en la célula eucariota y que está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL. Uno o ambos promotores puede ser no constitutivo, tal como un promotor específico de célula, de tejido, o de órgano, o de etapa de desarrollo, o un promotor inducible, por ejemplo.
Otro aspecto de la invención se refiere a la expresión organular (incluyendo expresión de plasto o mitocondrial). De acuerdo con una realización, se proporciona una célula eucariota aislada que comprende: un orgánulo que comprende una primera secuencia que comprende un promotor que es funcional en el orgánulo, comprendiendo el promotor un elemento de respuesta a AHL que está unido de forma operativa a un gen de interés; y un núcleo que comprende una segunda secuencia que comprende un segundo promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en el núcleo, y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un polipéptido que comprende (i) un péptido de transporte hacia el orgánulo (o de dirección o tránsito) y (ii) un receptor de AHL. El receptor de AHL producido por la expresión de la segunda secuencia y la captación del polipéptido por el orgánulo se une al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor al unir una AHL. De acuerdo con una realización alternativa, el receptor de AHL se expresa en el orgánulo en lugar de ser recogido por el orgánulo. En esta realización, la célula comprende un orgánulo, que a su vez comprende una primera secuencia que comprende un promotor que es funcional en el orgánulo que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a un gen de interés; y una segunda secuencia que comprende un promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en el orgánulo y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un receptor de AHL que se une al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor al
unir una AHL.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan procedimientos para la modulación de la expresión de un polinucleótido que comprende un primer promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL, comprendiendo dichos procedimientos la expresión en la célula eucariota de un receptor de AHL usando el polinucleótido de (1), y la aplicación a la célula de una composición que comprende una AHL que está unida por el receptor de AHL, provocando la modulación de la transcripción del polinucleótido por parte del receptor de AHL, con la condición de que dicho procedimiento se aplique ex vivo si la célula eucariota es una célula humana o una célula animal.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan procedimientos para la identificación de AHL que están unidas por un receptor de AHL. Dichos procedimientos emplean células eucariotas aisladas que comprenden una primera secuencia que comprende (i) un primer promotor que es funcional en la célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a una secuencia que codifica un marcador de selección o de información (gen chivato), y (ii) un segundo promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en la célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL, en el que la unión de una AHL por el receptor de AHL provoca la expresión del marcador. El procedimiento implica la aplicación a la célula de una composición que comprende la AHL y la detección de la expresión del marcador. Dichas células (u organismos tales como levaduras o plantas que comprenden dichas células) pueden usarse para seleccionar análogos de AHL que sean útiles para controlar la expresión de genes. Por ejemplo, una planta que comprende dicha construcción se puede usar para ensayar análogos de AHL útiles agronómicamente que se apliquen a la planta, por ejemplo, mediante aplicación foliar o mediante aplicación al suelo o a una semilla.
Descripción de las figuras
La Figura 1 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53006.
La Figura 2 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53007.
La Figura 3 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53008.
La Figura 4 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53009.
La Figura 5 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53010.
La Figura 6 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53031.
La Figura 7 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53035.
La Figura 8 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53036.
La Figura 9 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53002.
La Figura 10 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53003.
La Figura 11 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53004.
La Figura 12 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53005.
La Figura 13 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53015.
La Figura 14 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53020.
La Figura 15 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53021.
La Figura 16 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53028.
La Figura 17 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53029.
La Figura 18 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53030.
La Figura 19 proporciona un esquema para la preparación de la construcción que proporciona la expresión de la secuencia de codificación de GUS a partir del promotor luxI y regulada por el activador transcripcional LuxR expresado bajo el control del promotor luxR nativo.
La Figura 20 proporciona un esquema para la preparación de la construcción que proporciona la expresión de la secuencia de codificación de GUS a partir del promotor luxI y regulada por el activador transcripcional LuxR expresado bajo el control de las secuencias promotor/guía Prrn/G10L.
La Figura 21 proporciona un esquema para la preparación de la construcción que proporciona la expresión de la secuencia de codificación de GUS a partir del promotor T7 viral. La ARN polimerasa T7 que controla la expresión a partir del promotor T7 se expresa a partir del promotor luxI y está regulada por el activador transcripcional LuxR expresado bajo el control de las secuencias promotor/guía Prrn/G10L.
La Figura 22 proporciona un esquema para la preparación de la construcción que proporciona la expresión de la secuencia de codificación de GUS a partir del promotor esaR y regulada por el represor transcripcional EsaR expresado bajo el control de las secuencias promotor/guía Prrn/G10L.
La Figura 23 proporciona un esquema para la preparación de la construcción que proporciona la expresión de la secuencia de codificación de la \alpha-glucuronidasa (GUS) a partir de promotor T7 viral. La ARN polimerasa T7 que controla la expresión a partir del promotor T7 se expresa a partir del promotor esaR y está regulada por el represor transcripcional EsaR expresado bajo el control de las secuencias promotor/guía Prrn/G10L.
La Figura 24 proporciona una representación esquemática de la construcción de expresión pMON53055.
La Figura 25 proporciona los resultados de resultados de tinción histoquímica para la actividad de GUS de plantas Arabidopsis transgénicas inducidas (tratadas con HSL) y no inducidas que contienen los genes reportero TraA8(3x)-GUS y activador 35S-VP16-TraR (pMON53077).
La Figura 26 proporciona la actividad \beta-galactosidasa en extractos celulares de dos líneas independientes (cepa YPH499, cl. 5 y cl. 6) que contienen el gen reportero de \beta-galactosidasa dirigido por un promotor mínimo con tres copias del elemento TraA8.
La Figura 27 proporciona la estructura genérica de los análogos de AHL, así como también las diversas sustituciones de los análogos.
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La Figura 28 proporciona la actividad \beta-galactosidasa en protoplastos de zanahoria inducidos y no inducidos que contienen las construcciones del gen reportero TraA8(4X)-GUS y del gen activador 35S-VP16-TraR. La inducción de la actividad \beta-galactosidasa se llevó a cabo usando los análogos de AHL.
La Figura 29 proporciona una representación gráfica de los datos presentados en la Tabla 9.
Descripción detallada de la invención
Se pueden usar sistemas de percepción de quórum para controlar la expresión génica en cualquier célula eucariota, incluyendo, pero sin limitación, células de levadura, de hongo, de planta, de insecto, de anfibio, de ave, y de mamífero. En el presente documento se describen composiciones y procedimientos ejemplares para la expresión de genes localizados en genomas nucleares y organulares.
De acuerdo con una realización de la presente invención, un gen de interés que comprende una secuencia de codificación de proteína se une de forma operativa a un promotor que comprende un elemento sensible a AHL. Al unir un compuesto de AHL o un análogo de AHL, un receptor de AHL se une a (o en algunas realizaciones, se disocia de) el elemento de respuesta a AHL, modulando (activando, reprimiendo, o alterando de cualquier otra forma) la transcripción del gen de interés. Este sistema se puede entender mejor haciendo referencia a la percepción de quórum de Vibrio fischeri, el ejemplo mejor caracterizado de los muchos sistemas de percepción de quórum procariotas, cualquiera de los cuales se puede usar en la práctica de la presente invención.
V. fischeri, una bacteria marina, produce un autoinductor difundible, N-3-(oxohexanoil)homoserina lactona (denominado con el nombre trivial VAI-1), una AHL que se acumula en el entorno circundante durante el crecimiento y que se difunde fácilmente a través de la membrana celular bacteriana. VAI-1 se sintetiza por LuxI. LuxR es tanto un receptor para VAI-1 como un regulador transcripcional dependiente de VAI-1 que une el ADN inmediatamente cadena arriba del promotor lux.
En la Tabla 1 se muestran ejemplos de especies bacterianas que presentan sistemas de percepción de quórum con genes de tipo luxI ("AHL sintasa") y/o genes de tipo luxR ("receptor de AHL") (Fuqua y col., Annu. Rev. Microbiol. 50:727-751, 1996). En la práctica de la presente invención se puede usar cualquier sistema de percepción de
quórum.
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TABLA 1 Sistemas Regulatorios basados en AHL
1
2
3
4
Un número de bacterias con proteínas homólogas a LuxR y LuxI producen también autoinductores AHL similares o idénticos a VAI-1 de V. fischeri (Tabla 1). Todos estos compuestos señal presentan restos homoserina lactona idénticos pero pueden diferir en la longitud y estructura de sus grupos acilo. LuxI y enzimas correspondientes de otras especies catalizan la unión de S-adenosilmetionina (SAM) y una cadena acilo grasa derivada de conjugados acilo-proteína portadora de grupos acilo (ACP). Los sustratos para la biosíntesis de AHL por LuxR están disponibles tanto en células procariotas como en células eucariotas; la expresión de LuxI en una célula eucariota es suficiente para producir
VAI-1.
En la práctica de la presente invención se pueden usar también análogos de autoinductores AHL naturales ("análogos de AHL"). Varios estudios de análogos de AHL han encontrado un número de análogos de AHL que presentan actividad significativa en sistemas de percepción de quórum, incluyendo: análogos de N-(3-oxohexanoil)-L-homoserina lactona ensayados en sistemas LuxR (Eberhard y col., Arch. Microbiol. 146:35-40, 1986; Greenberg y col., J. Bacteriol. 178:2897-2901, 1996) y EsaR (Bycroft y col., J. Antibiot. 46:441-454, 1993); análogos de N-(oxooctanoil)-L-homoserina lactona ensayados en el sistema TraR (Winans y col., J. Bacteriol. 180:5398-5405, 1998); y análogos de N-(oxododecanoil)-L-homoserina lactona (PAI), ensayados en el sistema LasB (Iglewski y col., J. Bacteriol. 178:5995-6000, 1996). En general, el alargamiento o acortamiento del grupo lateral acilo en uno o dos carbonos es el cambio mejor tolerado, tolerándose mejor las cadenas más largas que las cadenas más cortas. El mantenimiento del sustituyente 3-oxo se requiere generalmente para una buena actividad, y el sustituyente 1-oxo potencia la actividad. El sustituyente 1-oxo es suficiente para la unión pero no para la inducción. La reducción de la saturación de la cadena acilo se puede tolerar en cierta medida.
Las proteínas de tipo LuxR están compuestas de dos módulos, un dominio amino-terminal (restos 20-156 de LuxR) con una región de unión a AHL (restos 79-120 de LuxR) y un dominio de regulación de la transcripción carboxi-terminal (restos 160-250 de LuxR), que incluye un motivo de unión a ADN hélice-giro-hélice (restos 190-210 de LuxR). El tercio carboxi terminal de estas proteínas es homólogo a los dominios de unión a ADN de la superfamilia LuxR de reguladores transcripcionales. Se ha propuesto un mecanismo general de activación para esta superfamilia de proteínas mediante el cual un dominio amino terminal actúa negativamente para prevenir una interacción entre el dominio carboxi terminal y sitios de unión a ADN diana. Esta inhibición puede aliviarse mediante la actuación de un ligando que es un autoinductor en el caso de proteínas de tipo LuxR o un grupo fosforilo en el caso de reguladores de dos componentes. Las eliminaciones de hasta 40 aminoácidos del extremo carboxi terminal de LuxR dan como resultado proteínas que siguen siendo competentes para la unión a ADN regulador de lux pero no activan la expresión del operón lux. Por lo tanto se requiere la región entre los aminoácidos 211 y 250 de LuxR para la activación transcripcional posterior a la unión a ADN.
LuxR se une como un homomultímero al sitio de unión de LuxR, que tiene simetría díada, y una región requerida para la multimerización de restos entre los aminoácidos 116 y 161 de la porción amino terminal de la proteína.
El sitio de unión de LuxR, o caja lux (5'-ACCTGTAGGATCGTACAGGT-3'), es una repetición invertida de 20 nucleótidos centrada 44 nucleótidos cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción del operón de luminiscencia (Devine y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:5688-5692, 1989; Gray y col., J. Bacteriol. 176:3076-3080, 1994). De manera similar, se encuentran cajas tra de 18 pares de bases cadena arriba de al menos tres promotores regulados por TraR y se requieren para la activación transcripcional por TraR (Fuqua y Winans, J. Bacteriol. 178:435-440, 1996). Secuencias similares encontradas en promotores regulados por LasR se superponen invariablemente sobre los supuestos elementos -35 de promotores de tipo \sigma^{70} en un nucleótido. Las cajas lux y las son suficientemente similares de forma que LuxR puede activar la transcripción a partir del promotor lasB en presencia de VAI-1, y a la inversa, LasR puede activar la transcripción del operón de luminiscencia en presencia de PAI-1 (Gray y col., J. Bacteriol. 176:3076-3080, 1994). Se han comparado varias secuencias de tipo caja lux (denominadas también en el presente documento como "elementos de respuesta a AHL") (Tabla 2). La secuencia de tipo caja lux de consenso es 5'-RNSTGYAXGATNXTRCASRT-3'. Pueden producirse elementos de respuesta a AHL sintéticos variando uno o más nucleótidos de una secuencia de tipo caja lux nativa. Tal y como se discute en los ejemplos más adelante en el presente documento, cuando TraR se expresa en células de la zanahoria, un promotor que incluye la caja traA muestra un nivel más alto de lo esperado de actividad basal. Esta actividad basal puede reducirse significativamente sin eliminar la sensibilidad a AHL reemplazando la caja traA por una variante de la caja en la cual están alteradas un número pequeño de pares de bases de la caja traA. Pueden producirse promotores sensibles a AHL sintéticos reemplazando un elemento de respuesta a AHL procedente de un promotor por un elemento de respuesta a AHL procedente de otro promotor, o añadiendo un elemento de respuesta a AHL nativo o sintético a un promotor que carece de un elemento de respuesta a AHL funcional, tal como un promotor mínimo. Además, pueden estar presentes dos o más elementos de respuesta a AHL en un único promotor para hacer al promotor sensible a más de una AHL. Un promotor que comprende uno o más elementos de respuesta a AHL se denomina en el presente documento "promotor sensible a AHL".
TABLA 2 Secuencias de tipo caja lux nativas y variantes
5
Otros promotores regulados por TraR y LasR carecen de estos sitios. Por ejemplo, el gen lasI no presenta una caja las reconocible cadena arriba de su promotor (Passador y col., Science 260:1127-1130, 1993) y sin embargo es fuertemente inducible por LasR. De manera similar, el gen traM de A. tumefaciens parece presentar dos medios sitios cadena arriba de su promotor en lugar de una caja tra ortodoxa (Fuqua y col., J. Bacteriol. 177:1367-1373, 1995; Hwang y col., J. Bacteriol. 177:449-458, 1995) y es suavemente inducible por TraR. La proteína TraR activa también la expresión del gen traR en un promotor que aparentemente no presenta similitud con ningún motivo caja tra. En el caso de los promotores TraR que presentan una fuerte similitud con los motivos caja tra de consenso están activados hasta un alto nivel de expresión por 3-oxooctanoil-homoserina lactona (AAI), y los motivos más degenerados están asociados con niveles más bajos de inducción.
Los promotores de percepción de quórum pueden ser alterados para hacerlos sensibles a un autoinductor de tipo AHL diferente mediante "intercambio de operador", es decir, reemplazando secuencia(s) de tipo caja lux del promotor por una secuencia de tipo caja lux procedente de un promotor diferente. Por ejemplo, una secuencia de caja lux en un promotor puede ser reemplazada por una secuencia de caja tra o las. La sensibilidad a AHL puede modificarse también mediante "intercambio de dominio", es decir, reemplazando una región de unión a AHL de una proteína de tipo LuxR por la región de unión a AHL de otra proteína de tipo LuxR de manera que la especificidad de unión a ADN de la proteína quimérica resultante permanezca invariable. Por ejemplo, el reemplazo de la región de unión a VAI-1 de LuxR por la región de unión a AAI-1 de TraR provocaría la unión de la proteína quimérica resultante a la secuencia de caja lux y la modulación de la actividad transcripcional en respuesta a la unión del autoinductor VAI-1. Además, el dominio de activación de una proteína de tipo LuxR puede reemplazarse por otro dominio de activación que sea un activador bien conocido de la expresión génica en una célula huésped dada, tal como GAL4, VP16, u otros dominios activadores bien conocidos.
Se han buscado nuevos miembros de la familia LuxR-LuxI mediante la selección de bacterias para la liberación de autoinductores usando una cepa de Escherichia coli que contenía un regulón lux clonado pero que carecía de luxI (y por lo tanto no sintetizaba VAI-1). Se han llevado a cabo experimentos similares con regulador TraR de Agrobacterium tumefaciens para seleccionar bacterias del suelo patogénicas a plantas. Estos estudios han demostrado que LuxR y TraR son activados por un subgrupo de autoinductores conocidos. Se ha demostrado también que las proteínas de tipo LuxR tales como LuxR y LasR de Pseudomonas aeruginosa activan la expresión génica de lux después de la unión de derivados de los autoinductores afines con alteraciones en la longitud de la cadena acilo o en los grupos carbonilo, por ejemplo (Eberhard y col., Arch. Microbiol. 146:35-40, 1986; Kuo y col., J. Bacteriol. 176:7558-7565, 1994; Kuo y col., J. Bacteriol., 178:971-976, 1996; Pearson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:197-201, 1994; Fuqua y Winans, J. Bacteriol. 176:2796-2806, 1994).
Se reseña que EsaR, ExpR y YenR son represores de sus genes diana en lugar de activadores, y sus autoinductores respectivos aumentan la expresión de los genes reprimidos.
Los sistemas de percepción de quórum encontrarían muchos usos en la modulación de la expresión génica en eucariotas. Los sistemas de percepción de quórum se pueden usar para la activación o represión transcripcional. Esto se puede entender mejor por analogía al uso del "sistema Tet" para modular la transcripción de gen eucariota en base a la unión específica del receptor de tetraciclina (TetR) a sitios de operador. Se han desarrollado sistemas tanto "Tet-off" como "Tet-on" (Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89:5547-51, 1992). En un principio, la represión fuerte del promotor de polimerasa II (pol II) se consiguió colocando varios sitios de operador TetR adyacentes a la caja TATA, el sitio de unión para un factor de transcripción general ubicuo, TBP (proteína de unión a la caja TATA). En ausencia de inductor (tetraciclina o un análogo de tetraciclina), TetR se une a los sitios de operador, impidiendo estéricamente el reconocimiento de la caja TATA por parte de TBP. Esto previene la unión del complejo TFIID (del cual TBP es una parte central) al promotor y ensamblaje del complejo de iniciación de la transcripción sobre el promotor, reprimiendo de esta manera el inicio de la transcripción. Después de la aplicación de tetraciclina, TetR se disocia del promotor, aliviando la represión transcripcional. Este enfoque se ha demostrado que funciona también en plantas (Gatz, y col., Plant. J., 2:397-404, 1992; Gatz y Quail, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85:1394-7, 1988) y se ha aplicado también para regular promotores de polIII (Ulmasov y col., Plant Mol. Biol., 35:417-424, 1997).
Se ha descrito una estrategia para aumentar el intervalo dinámico de regulación génica mediante el sistema Tet (Rossi y col., Nat. Genet., 20:389-393, 1998). Esta estrategia aprovecha la existencia de (1) mutantes inversos de TetR (rTetR) que se unen al ADN sólo en presencia del ligando (un fenotipo opuesto a TetR de tipo silvestre), y (2) isoformas de TetR que pueden formar homodímeros (represor Tet presenta un dominio de dimerización y es activo solamente como dímero), pero no pueden formar heterodímeros. Fusionando la proteína del fenotipo inverso de clase B (rTetR_{B}) al dominio de activación de VP16 (para formar rtTA_{B}), y el represor de tipo silvestre de clase G (TetR_{G}) a un dominio de represión potente (denominado KRAB del gen kox1 humano) creando tTR_{G}, se crearon dos tipos de factores de transcripción eucariotas que responden al mismo ligando químico pero que ejercen efectos opuestos sobre la transcripción. En ausencia del ligando, solamente tTR_{G} se une cadena arriba del promotor mínimo regulado que contiene sitios tetO y reprime de forma activa los ya de por sí bajos niveles de transcripción basal a partir de este promotor. En presencia del ligando, (doxiciclina, un análogo de tetraciclina), tTR_{G} se disocia del ADN, pero rtTA_{B} adquiere la capacidad de unirse al ADN y activa la transcripción. Al mismo tiempo, como las proteínas TetR de clase B y de clase G no se heterodimerizan, no se pueden formar heterodímeros no productivos que contengan dominios tanto de activación como de represión. La ventaja de este sistema respecto a un sistema Tet-On convencional es una expresión de fondo menor a partir del promotor en ausencia de inductor. Una estrategia similar se puede emplear con el sistema de percepción de quórum descrito en el presente documento.
Un sistema de percepción de quórum simple estaría constituido por dos genes: (1) un gen de interés bajo el control de un promotor sensible a AHL, es decir, un promotor que incluye un elemento de respuesta a AHL (tal como una caja lux), y (2) un gen que codifica un polipéptido de unión al ADN que se une específicamente al elemento de respuesta a AHL, presentando ambos genes promotores que son funcionales en una célula eucariota. El polipéptido de unión a ADN incluye preferiblemente motivos de unión a AHL (para controlar la unión del elemento de respuesta a AHL mediante aplicación de una AHL) y un dominio de unión a ADN hélice-giro-hélice derivado de un receptor de AHL nativo. El polipéptido de unión a ADN preferiblemente incluye también una región de multimerización derivada de un receptor de AHL nativo. El polipéptido de unión a ADN incluye también una región de activación transcripcional de un receptor de AHL nativo (que no es funcional en eucariotas pero puede ser funcional en cloroplastos) o un dominio de activación o de represión transcripcional eucariota heterólogo que es bien conocido en la técnica, excepto cuando el polipéptido de unión al ADN se usa para la represión transcripcional pasiva por impedimento estérico, en cuyo caso un dominio de activación o represión transcripcional es opcional. La aplicación de una AHL y la unión de la AHL mediante el motivo de unión a AHL del polipéptido de unión a ADN provoca la unión específica del polipéptido de unión a ADN al elemento de respuesta a AHL. El dominio de activación (o represión) transcripcional del polipéptido de unión a ADN modula entonces la transcripción del promotor sensible a AHL hasta que los niveles de la AHL en la célula caigan por debajo de los niveles requeridos para afectar a la expresión génica.
En el caso de represión transcripcional "pasiva", la unión de AHL por el polipéptido de unión a ADN provoca su unión a uno o más elemento(s) de respuesta a AHL situados cerca de la caja TATA e interfiere estéricamente con el inicio de la transcripción por polII. Los fragmentos de unión a ADN del receptor de AHL, o polipéptidos de fusión recombinante que incluyen tal dominio de unión a ADN y secuencias polipeptídicas heterólogas, pueden usarse en lugar del polipéptido receptor de AHL de longitud completa para tal sistema de represión "pasivo".
El sistema de percepción de quórum puede usarse también para la represión "activa" de la transcripción. Por ejemplo, EsaR funciona como un represor (disociándose del ADN en presencia de su ligando, 3-oxohexanoil-homoserina lactona, C6-AHL); LuxR y algunos otros miembros de su familia (por ejemplo, TraR) adquieren la capacidad de unirse a ADN solamente en presencia del ligando. De esta forma, puede producirse un sistema de dos factores regulado por C6-AHL que es análogo al sistema Tet usando represión "activa" descrita anteriormente. EsaR se fusiona a un dominio de represión y LuxR a un dominio de activación; ambos responden a la misma AHL pero no se pueden heterodimerizar. La única diferencia entre el sistema de dos factores Tet descrito y un sistema de dos factores basado en LuxR/EsaR es que, a diferencia de diferentes isoformas de TetR, EsaR y LuxR reconocen elementos cis ligeramente diferentes. Este problema se soluciona colocando ambos sitios de unión LuxR y EsaR cadena arriba del promotor mínimo regulado o cambiando la especificidad de unión a ADN de una de estas proteínas por mutagénesis o por intercambio de dominios de unión a ADN.
Los sistemas de percepción de quórum pueden emplearse también para proporcionar un "interruptor" transcripcional que permanece activo indefinidamente una vez activado mediante aplicación de AHL exógena. Entre los ejemplos de tales interruptores se incluye el siguiente sistema de tres genes: (1) un gen de interés bajo el control de un promotor sensible a AHL (por ejemplo, un promotor que incluye una caja lux tal como el promotor del luxI); (2) un gen de AHL sintasa (por ejemplo, el gen luxI) bajo el control de un promotor que es sensible a la misma AHL; y (3) un gen de receptor de AHL (por ejemplo, el gen luxR) bajo el control de un promotor específico de tejido o constitutivo, por ejemplo. Una única aplicación de AHL a una célula transformada con los tres genes (que podría estar incluida en una única construcción de ADN) induciría a la AHL sintasa a sintetizar AHL, lo cual, a su vez, induciría la expresión continuada del gen de interés. Sustratos para la producción de AHL en células de plantas, incluyendo S-adenosilmetionina, y o bien derivados acilo-proteína portadora de grupos acilo (acil-ACP) o de coenzima A, están disponibles en plastos de células de plantas. La producción de moléculas señal de tipo AHL en plastos de células de plantas se ha demostrado dirigiendo el producto génico de la AHL sintasa yenI desde Yersinia entercolitica a los cloroplastos de plantas de tabaco transgénicas (Fray, y col., (1999), Nature Biotech., 17:1017-1020).
Células, tejidos, u organismos que contienen construcciones en las que se usa un sistema de percepción de quórum para controlar la expresión de un gen reportero unido de forma operativa bien conocido, incluyendo un marcador de información (gen chivato) tal como proteína fluorescente verde (GFP), luciferasa (luc), \beta-galactosidasa, o \beta-glucuronidasa, o un marcador de selección tal como un gen de resistencia al antibiótico, son útiles para cribar análogos de AHL que sean eficaces en la modulación de la expresión del gen reportero unido. Dichos análogos de AHL podrían cribarse adicionalmente mediante procedimientos bien conocidos para obtener análogos de AHL que sean no tóxicos, muestren buena captación por parte de la célula huésped, y presenten otras características deseables, tales como análogos de AHL útiles agronómicamente, por ejemplo.
La resistencia a la infección por un patógeno bacteriano puede lograrse mediante la expresión en una planta de un gen de la AHL sintasa que produce una AHL que afecta al sistema de percepción de quórum del patógeno. Un número de especies de bacterias que emplean sistemas de percepción de quórum provocan enfermedad en la planta, por ejemplo Pseudomonas stewartii (marchitez bacteriana de Stewart y tizón de la hoja), Erwinia carotovora (pudriciones blandas), Agrobacterium tumefaciens (agallas en la zona de la corona), y Ralstonia solanacearum (marchitez vascular). La expresión en una planta de una AHL sintasa que produce una AHL usada como un inductor mediante un patógeno bacteriano causaría la activación de genes regulados que de lo contrario sólo se activarían cuando la densidad de población de la bacteria fuera alta. Los genes activados son ineficaces y las bacterias consumen energía en un proceso no productivo que limita finalmente su crecimiento. Como un ejemplo, N-octanoil-L-homoserina lactona, una C8-AHL está producida por SolI de Ralstonia solanacearum y es un buen agonista para el receptor TraR, pero también para el receptor LuxR, que normalmente responde a una AHL C6-sustituida. Otras especies que normalmente responden a la C6-AHL, tales como E. carotovora (ExpR) y P. stewartii (EsaR), por ejemplo, pueden también antagonizarse por la C8 AHL. De esta forma, la expresión transgénica del gen SolI en una planta conferiría resistencia a varios patógenos bacterianos.
La expresión de un gen de la AHL sintasa en una planta se puede usar también para hacer que las bacterias beneficiosas produzcan antibióticos que inhiban las bacterias patogénicas. Por ejemplo, Pseudomonas aureofaciens cepa 30-84, que se aisló de las raíces del trigo que eran resistentes a la enfermedad take-all (pudrición de la corona y raíz de cereales), produce un grupo de antibióticos de fenazina. La producción de antibiótico mediante esta cepa está regulada por una C6-AHL. La producción de la C6-AHL en células de plantas mediante la expresión de la AHL sintasa apropiada induce la producción de antibióticos en P. aureofaciens e inhibe el crecimiento de hongos patogénicos en las proximidades de la planta. (Bacterias asociadas a plantas que emplean sistemas de percepción de quórum se revisan en Annu. Rev. Phytopathol. 36:207-225, 1998).
Definiciones y Procedimientos
Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a aquellos expertos habituales en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra forma, los términos han de ser entendidos de acuerdo con el uso convencional por parte de los expertos habituales en la técnica relevante. Se pueden encontrar también definiciones de términos comunes en biología molecular en Rieger y col., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5ª edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1994. Se usa la nomenclatura para las bases de ADN tal y como se muestra en 37 CFR \NAK1,822. Se usa para los restos de aminoácidos la nomenclatura convencional de una y tres letras.
A. Construcciones de ácido nucleico
"(Secuencia de) ácido nucleico" o "(secuencia de) polinucleótido" se refiere a ARN o ADN de cadena única o de doble cadena, en concreto, un polímero de bases ribonucleótido o desoxirribonucleótido, respectivamente, cuya secuencia se proporciona en este documento desde el extremo 5' (cadena arriba) hasta el extremo 3' (cadena abajo). Se incluyen las secuencias tanto con sentido como sin sentido.
"Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico localizada cadena arriba o 5' respecto a un codón de partida traduccional de un marco abierto de lectura (o región que codifica proteína) de un gen y que está implicada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un "promotor de mamífero" es un promotor nativo o no nativo que es funcional en células de mamífero, un "promotor de planta" es funcional en células de planta, y así sucesivamente. Los promotores constitutivos son funcionales en la mayoría o en todos los tejidos de un organismo a lo largo del desarrollo. Los promotores "inducibles" expresan selectivamente una secuencia de ADN unida de forma operativa como respuesta a la presencia de un inductor químico endógeno o exógeno.
"Modulación" de la expresión se refiere a cualquier cambio en la expresión, incluyendo pero sin limitación, el aumento de la expresión (por ejemplo, inducción), reducción de la expresión (por ejemplo, represión), o cambio en la especificidad o momento de la expresión (por ejemplo, desde constitutiva hasta específica de tejido), o inducibilidad de la expresión, por ejemplo.
Promotores para la ARN polimerasa II, como aquellos de otros eucariotas superiores, están comprendidos por varios elementos distinguibles. Uno de estos elementos es la caja TATA o caja Goldberg-Hogness, que se requiere para una correcta expresión de genes eucariotas in vitro y para un inicio preciso y eficaz de la transcripción in vivo. La caja TATA se sitúa típicamente aproximadamente a de -25 a -35, es decir, a de 25 a 35 pares de bases (pb) cadena arriba (5') del sitio de inicio de la transcripción, o sitio del cap, que se define como la posición +1 (Breathnach y Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50:349-383, 1981; Messing y col., En: Genetic Engineering of Plants, Kosuge y col., eds., páginas 211-227, 1983). Otro elemento común, la caja CCAAT, está localizada entre -70 y -100 pb. En plantas, la caja CCAAT puede presentar una secuencia de consenso diferente que la secuencia funcionalmente análoga de promotores de mamífero (el análogo en plantas se ha denominado la "caja AGGA" para diferenciarlo de su homólogo en animales; Messing y col., En: Genetic Engineering of Plants, Kosuge y col., eds., páginas 211-227, 1983). Además, prácticamente todos los promotores incluyen potenciadores o secuencias de activación cadena arriba adicionales (Benoist y Chambon, Nature 290:304-310, 1981; Gruss y col., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 78:943-947, 1981; y Khoury y Gruss, Cell 27:313-314, 1983) que se extienden desde alrededor de -100 pb hasta -1.000 pb o más cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción.
Cuando se fusionan a secuencias de ADN heterólogas, dichos promotores hacen de forma típica que la secuencia fusionada tenga un patrón de expresión que es similar al de la secuencia génica con la que el promotor está asociado normalmente. Se pueden añadir fragmentos de promotor que incluyen secuencias reguladoras (por ejemplo, fusionados al extremo 5' de, o insertados en, otro promotor activo que tiene sus propias secuencias reguladoras parciales o completas (Fluhr y col., Science 232:1106-1112, 1986; Ellis y col., EMBO J. 6:11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84:8986-8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214:16-23, 1988; Comai y col., Plant Mol. Biol. 15:373-381, 1991)). Alternativamente, se han añadido secuencias reguladoras heterólogas a la región cadena arriba 5' de un promotor truncado inactivo, por ejemplo, un promotor que incluye solamente el núcleo TATA y, a veces, los elementos CCAAT (Fluhr y col., Science 232:1106-1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84:8986-8990, 1987; Aryan y col., Mol. Gen. Genet. 225:65-71, 1991).
Los promotores típicamente están comprendidos por múltiples "elementos reguladores transcripcionales que actúan en cis" distinguibles, o simplemente "elementos cis", cada uno de los cuales parece conferir un aspecto diferente del control global de la expresión génica (Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84:8986-8990, 1987; Ellis y col., EMBO J. 6:11-16, 1987; Benfey y col., EMBO J. 9:1677-1684, 1990). Dichos elementos cis unen factores proteicos que actúan en trans que regulan la transcripción. Algunos elementos cis unen más de un factor, y los factores de transcripción que actúan en trans pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un elemento cis (Johnson y McKnight, Ann. Rev. Biochem. 58:799-839, 1989). Por ejemplo en: Martin, Curr. Opinions Biotech. 7:130-138, 1996; Murai, En: Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, páginas 397-422; y Methods in Plant Molecular Biology, Maliga y col., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, páginas 233-300 se discuten factores de transcripción de plantas, elementos cis correspondientes, y el análisis de sus interacciones.
Los promotores se pueden manipular para producir promotores sintéticos o quiméricos que combinan elementos cis de dos o más promotores, por ejemplo, añadiendo una secuencia reguladora heteróloga a un promotor activo con sus propias secuencias reguladoras parciales o completas (Ellis y col., EMBO J. 6:11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84:8986-8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214:16-23, 1988; Comai y col., Plant Mol. Biol. 15:373-381, 1991). Se han desarrollado también promotores quiméricos añadiendo una secuencia reguladora heteróloga a la región cadena arriba 5' de un promotor truncado inactivo (también denominado promotor "mínimo"), es decir, un promotor que incluye solamente el núcleo TATA y, opcionalmente, elementos CCAAT (Fluhr y col., Science 232:1106-1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 84:8986-8990, 1987; Aryan y col., Mol. Gen. Genet. 225:65-71, 1991). Se pueden obtener elementos cis mediante síntesis química o mediante clonación a partir de promotores que incluyen dichos elementos, y pueden sintetizarse con secuencias de flanqueo adicionales que contienen sitios de enzima de restricción útiles para facilitar la posterior manipulación.
Un promotor "mínimo" o "basal" es capaz de reclutar y unir el complejo ARN polimerasa II y sus proteínas accesorias para permitir el inicio y la elongación transcripcionales. Sin embargo, un promotor mínimo carece de secuencias cis que recluten y unan factores de transcripción que modulan (por ejemplo, potencian, reprimen, confieren especificidad de tejido, confieren capacidad de inducción o capacidad de represión) la transcripción.
"Nativo". El término "nativo/a" se usa indistintamente con los términos "tipo silvestre" o "de origen natural".
"Heteróloga". Una secuencia "heteróloga" se origina a partir de una fuente o especie foránea o, si procede de la misma fuente, está modificada respecto a su forma original.
"Aislada". Una secuencia de ácido nucleico "aislada" está sustancialmente separada o retirada por purificación de otras secuencias de ácido nucleico con las que el ácido nucleico está normalmente asociado en la célula del organismo en la cual el ácido nucleico aparece de forma natural, en concreto, otro ADN cromosómico o extracromosómico. El término abarca ácidos nucleicos que están bioquímicamente purificados de forma que se retiren sustancialmente ácidos nucleicos contaminantes y otros componentes celulares. El término abarca también ácidos nucleicos recombinantes y ácidos nucleicos sintetizados químicamente.
Identidad Sustancial de Secuencia de Nucleótidos. La presente invención abarca secuencias de polinucleótidos que son sustancialmente idénticas a una secuencia de polinucleótidos nativa, que comprenden preferiblemente solamente sustituciones de aminoácidos conservativas respecto a una secuencia nativa, y manteniendo de forma más preferible una similitud funcional. Cuando se hace referencia a un gen de la AHL sintasa o gen del receptor de AHL particular, por ejemplo, están incluidas dichas secuencias sustancialmente similares.
Un primer ácido nucleico muestra "identidad sustancial" respecto a una secuencia de ácido nucleico de referencia si, cuando están alineadas de forma óptima (con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas de un total del 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación) con el otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe al menos aproximadamente un 75% de identidad de secuencia de nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad, de forma más preferible al menos aproximadamente un 85% de identidad, y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 90% de identidad a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, preferiblemente al menos 50 posiciones de nucleótidos, de forma más preferible al menos 100 posiciones de nucleótidos, y de la forma más preferible a lo largo de la longitud entera del primer ácido nucleico. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; mediante el algoritmo de alineamiento para homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:2444, 1988; preferiblemente mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). El ácido nucleico de referencia puede ser una molécula de longitud completa o una porción de una molécula más larga.
Alternativamente, dos ácidos nucleicos son sustancialmente similares si uno se hibrida con el otro en condiciones de hibridación rigurosas, tal y como se define más adelante en el presente documento.
Utilización preferencial de determinados codones: Con el fin de optimizar la traducción de un gen procariota (tal como un gen nativo que codifica una AHL sintasa o un receptor de AHL) en una célula huésped eucariota, uno o más codones del gen pueden ser alterados para reflejar la utilización preferencial de determinados codones de la célula huésped eucariota, es decir, los codones que están estadísticamente representados de forma más elevada en los genes de esa célula que en el gen procariota.
"Unido/a de forma operativa". Una primera secuencia de ácido nucleico está "unida de forma operativa" con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias están dispuestas de tal manera que la primera secuencia de ácido nucleico afecta a la función de la segunda secuencia de ácido nucleico. De forma preferible, las dos secuencias son parte de una única molécula de ácido nucleico contigua y de forma más preferible son adyacentes. Por ejemplo, un promotor está unido de forma operativa a un gen si el promotor lleva a cabo o media la transcripción del gen en una célula.
"Recombinante". Un ácido nucleico "recombinante" se construye mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia que de lo contrario estarían separados, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de ingeniería genética.
Se conocen bien técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, vol. 1-3, ed. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en lo sucesivo en el presente documento, "Sambrook y col., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel y col., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en lo sucesivo en el presente documento, "Ausubel y col., 1992"). Los procedimientos para la síntesis química de ácidos nucleicos se discuten, por ejemplo, en Beaucage y Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862, 1981, y Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981. La síntesis química de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo, por ejemplo, en sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comerciales.
Preparación de ácidos nucleicos recombinantes o sintetizados químicamente: Vectores, Transformación, Células huésped. Se pueden incorporar ácidos nucleicos naturales o sintéticos de acuerdo con la presente invención en construcciones de ácido nucleico recombinante, típicamente construcciones de ADN, capaces de introducción y replicación en una célula huésped. Dicha construcción es preferiblemente un vector que incluye un sistema de replicación (secuencia de replicación autónoma [ARS] u origen de replicación [ori]) y secuencias que hacen posible la transcripción y traducción de una secuencia que codifica polipéptido en una célula huésped dada.
Para la práctica de la presente invención, se discuten composiciones y procedimientos convencionales para preparar y usar vectores y células huésped y ejemplos de combinaciones funcionales de células huésped y vectores, entre otros, en Sambrook y col., 1989, o Ausubel y col., 1992. Se seleccionan secuencias de promotor y otras secuencias de vector necesarias de manera que sean funcionales en una célula huésped particular.
Se han descrito un número de vectores adecuados para la transfección estable de células de plantas o para el establecimiento de plantas transgénicas en, por ejemplo, Pouwels y col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, sup. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Gelvin y col., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, vectores de expresión eucariotas incluyen, por ejemplo, uno o más genes clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador de selección. Secuencias de control reguladoras incluyen, pero sin limitación, un promotor (incluyendo un sitio de inicio de la transcripción), un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación. Secuencias reguladoras a partir de la región 3'-no traducida de genes de plantas incluyen, por ejemplo, regiones 3'-de terminación para aumentar la estabilidad ARNm del ARNm, tales como la región de terminación PI-II de patata o las regiones 3'-de terminación de la octopina o nopalina sintasa (Thornburg y col., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 84:744, 1987; An y col., Plant Cell 1:115 (1989)). Se puede usar cualquier gen marcador de selección bien conocido, incluyendo, por ejemplo, genes que codifican genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a higromicina, kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina o espectinomicina); y genes de resistencia a herbicidas (por ejemplo, fosfinotricina acetiltransferasa). Dichas secuencias reguladoras 5' y 3', secuencias de terminación de la transcripción, señales de poliadenilación, marcadores de selección, etc. para uso en otras células eucariotas, por ejemplo, en células de levadura, de mamífero u otros tipos de células, son bien conocidas en la técnica.
Entre los ejemplos de promotores de plantas constitutivos útiles para la expresión génica en plantas se incluyen el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que confiere una expresión de alto nivel y constitutiva en la mayoría de los tejidos de las plantas (véase, por ejemplo, Odel y col., Nature 313:810, 1985), incluyendo monocot (véase, por ejemplo, Dekeyser y col., Plant Cell 2:591, 1990; Terada y Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220:389, 1990); el promotor de la nopalina sintasa (An y col., Plant Physiol. 88:547, 1988) y el promotor de la octopina sintasa (Fromm y col., Plant Cell 1:977, 1989).
Puede ser también ventajoso utilizar un sistema de percepción de quórum de acuerdo con la presente invención para regular la expresión de transgenes en orgánulos, incluyendo plastos tales como cloroplastos y mitocondrias. Por ejemplo, un gen que codifica un polipéptido que comprende (1) una secuencia de dirección al orgánulo (por ejemplo, cloroplasto) fusionada en fase con (2) un polipéptido receptor de AHL (por ejemplo, LuxR) se expresa a partir de un casete de expresión en el genoma nuclear de la célula de la planta. El receptor de AHL es dirigido al orgánulo mediante la secuencia de dirección y se activa por medio del inductor AHL para modular la actividad de un promotor sensible a AHL en el genoma del orgánulo. Alternativamente, un gen que codifica el receptor de AHL puede expresarse en el interior del orgánulo, por ejemplo, mediante la incorporación en el genoma organular, bajo el control de un promotor que es funcional en el orgánulo para modular la expresión de un promotor sensible a AHL en el orgánulo. Como una opción en cualquier caso, la AHL sintasa (por ejemplo, LuxI) podría expresarse o bien en el núcleo o en el orgánulo.
Pueden prepararse las construcciones de expresión para dirigir la expresión del regulador transcripcional a partir del núcleo de la célula de la planta, y dirigir la expresión de la secuencia de ADN de interés expresada a partir del promotor regulable en el plasto de la célula de la planta. Dichas construcciones pueden requerir el uso de un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP), tal como el CTP de la subunidad pequeña ribulosa-bisfosfato carboxilasa (ssuCTP), para dirigir la proteína activadora/represora al plasto de la célula de la planta. En la patente de EE.UU. nº 5.576.198, por ejemplo, se describen procedimientos para la transcripción regulada de secuencias de ADN en el plasto usando secuencias de control expresadas a partir del núcleo.
Además, se pueden preparar construcciones de expresión para dirigir la expresión de tanto el regulador transcripcional como de la secuencia de ADN de interés a partir del plasto de la célula de la planta.
Hibridación de ácido nucleico; "Condiciones Rigurosas"; "Específica". Los cebadores y las sondas de ácido nucleico de la presente invención se hibridan en condiciones rigurosas a una secuencia de ADN diana. El término "condiciones rigurosas" se define como condiciones bajo las cuales una sonda o cebador se híbrida específicamente con una(s) secuencia(s) diana y no con secuencias que no son diana, tal y como se puede determinar empíricamente. El término "condiciones rigurosas" se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico diana (es decir, a una secuencia de ácido nucleico particular de interés) mediante el procedimiento de hibridación específica discutido en Sambrook y col., 1989, en 9.52-9.55. Véase también, Sambrook y col., 1989, en 9.47-9.52, 9.56-9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12:203:213, 1984; y Wetmur y Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370, 1968. De forma preferible, la hibridación usando cebadores o sondas de ARN o ADN se lleva a cabo a 65ºC en 6x SSC, SDS al 0,5%, 5x solución de Denhardt, 100 \mug/ml de ADN no específico (por ejemplo, ADN de esperma de salmón sonicado) con lavado a 0,5x SSC, SDS al 0,5% a 65ºC. Se pueden usar temperaturas de hibridación y/o lavado inferiores para identificar secuencias relacionadas que presentan un menor grado de similitud de secuencia si se conserva la especificidad de unión de la sonda o cebador a la(s) secuencia(s) diana.
Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, mediante PCR) usando una pareja de cebadores de amplificación particular, "condiciones rigurosas" son condiciones que permiten que la pareja de cebadores se hibride solamente a la secuencia de ácido nucleico diana a la que se uniría un cebador que presentara la secuencia de tipo silvestre correspondiente (o su complementaria) y produzca de forma preferible un producto de amplificación único.
Fragmentos, Sondas, y Cebadores. Un fragmento de un ácido nucleico es una porción del ácido nucleico que es menor que su longitud completa y que comprende al menos una longitud mínima capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico nativo en condiciones de hibridación rigurosas. La longitud de dicho fragmento es preferiblemente de al menos 15 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos, y de la forma más preferible de al menos 30 nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico nativo.
Se pueden preparar cebadores y sondas de ácido nucleico en base a una secuencia génica nativa. Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al que está unido una etiqueta detectable o molécula informadora convencional, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima. "Cebadores" son ácidos nucleicos aislados que son apareados a una cadena de ADN diana complementaria mediante hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, después se extiende a lo largo de la cadena de ADN diana mediante una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Se pueden usar parejas de cebadores para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico convencionales.
Las sondas y los cebadores tienen generalmente una longitud de 15 nucleótidos o más, de forma preferible de 20 nucleótidos o más, de forma más preferible de 25 nucleótidos, y de la forma más preferible de 30 nucleótidos o más. Dichas sondas y cebadores se hibridan específicamente a una secuencia de ARN o ADN diana bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad. De forma preferible, las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invención presentan una similitud de secuencia completa con una secuencia diana, aunque se pueden diseñar mediante procedimientos convencionales sondas que difieren de una secuencia diana que mantengan la capacidad de hibridarse con la secuencia diana.
Los procedimientos para preparar y usar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989; Ausubel y col., 1992; e Innis y col., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Las parejas de cebadores para PCR se pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, usando programas de ordenador pretendidos para ese fin tales como Primer (Versión 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Amplificación de ácido nucleico. Tal y como se usa en el presente documento, "ADN amplificado" se refiere al producto de amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana. La amplificación de ácido nucleico se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los diversos procedimientos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la técnica se conocen una variedad de procedimientos de amplificación y se describen, entre otros, en las patentes de EE.UU. n^{os} 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San Diego, 1990.
Variantes de Secuencia de Nucleótidos de Ácidos Nucleicos Nativos. Usando el nucleótido y la secuencia de los promotores descritos en el presente documento, los expertos en la técnica pueden crear moléculas de ADN que presenten variaciones minoritarias en su secuencia de nucleótidos.
Moléculas de ADN "variantes" son moléculas de ADN que contienen cambios en los cuales uno o más nucleótidos de una secuencia de ADN nativo están eliminados, añadidos, y/o sustituidos, preferiblemente manteniendo sustancialmente al mismo tiempo la función promotora, o, en el caso de un fragmento de promotor, de afectar la transcripción de un promotor mínimo al que está unido de forma operativa. Se pueden producir moléculas de ADN variantes, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis de ADN convencionales o sintetizando químicamente la molécula de ADN variante o una porción de la misma.
Se pueden eliminar uno o más pares de bases a partir del extremo 5' o 3' de una secuencia de promotor para producir un promotor "truncado". Se pueden insertar, eliminar, o sustituir internamente a una secuencia de promotor uno o más pares de bases. Se pueden construir promotores en los cuales fragmentos o elementos del promotor están unidos de forma operativa, por ejemplo, colocando dicho fragmento cadena arriba de un promotor mínimo. Se pueden combinar sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para producir una construcción final.
Transformación
Una célula, tejido, órgano u organismo en el cual se ha introducido un ácido nucleico foráneo, tal como un vector recombinante, se considera "transformado", "transfectado", o "transgénico". Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" incluye también la progenie de la célula u organismo. En el caso de las plantas, una célula "transgénica" o "transformada" incluye también la progenie producida a partir de un programa de cultivo que emplea dicha planta "transgénica" como un precursor en un cruzamiento y que muestra un fenotipo alterado que resulta de la presencia y expresión de una construcción de ácido nucleico recombinante.
Se puede usar cualquier variedad de planta en la práctica de la presente invención incluyendo, pero sin limitación, plantas de cultivo monocotiledóneas y dicotiledóneas tales como maíz, soja, trigo, arroz, cebada, Brassica (por ejemplo, semilla de aceite de colza), algodón, lino, girasol, cártamo, sorgo, tabaco, lechuga, zanahoria, brécol y coliflor, sandía, tomate, melón y calabaza.
Procedimientos para el control de la expresión de gen eucariota
Construcciones de ácido nucleico tal y como se han descrito anteriormente, particularmente vectores de expresión que incluyen un gen de interés que se expresa bajo el control de un promotor sensible a AHL, son útiles en una amplia variedad de contextos.
En plantas transgénicas, por ejemplo, dichas construcciones se pueden usar para preparar plantas estériles masculinas o femeninas, usando un promotor sensible a AHL para modular la expresión de un gen que afecta a la función reproductora, por ejemplo matando un tejido reproductor masculino o femenino, haciendo un tejido reproductor masculino o femenino sensible al daño por parte de un compuesto químico exógeno tal como un herbicida o antibiótico, o interfiriendo con la función o desarrollo normal de un tejido reproductor masculino o femenino, por ejemplo. Dichas plantas estériles masculinas o femeninas son útiles para el cultivo híbrido. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n^{os} 5.356.799, 5.478.369, 5.633.441, 5.689.041, 5.723.763, 5.728.558, 5.728.926, 5.741.684, 5.750.867, 5.767.374; patentes europeas EP 329.308, 412.911; y documento WO 90/08828.
En plantas transgénicas que se transforman con vectores que incluyen no solamente un gen que codifica el receptor de AHL sino también tanto un gen de interés como un gen que codifica la AHL sintasa transcritos bajo el control de un promotor sensible a AHL correspondiente, la aplicación una vez de una AHL adecuada provoca la expresión del gen de interés de una manera continuada como resultado de la síntesis continuada de la AHL en la planta por autoinducción. Por lo tanto, la AHL puede aplicarse en forma de un revestimiento de semilla, o por medio de un pulverizador u otra forma de aplicación en un momento apropiado para estimular la expresión del gen sensible a AHL. La expresión del gen de interés puede estar restringida a un tejido u órgano deseado, por ejemplo, mediante el uso de un promotor específico de tejido o de órgano para conducir la expresión del gen que codifica el receptor de AHL.
Formulaciones de AHL para la modulación de la expresión génica en plantas
La presente invención puede usar formulaciones que incluyen una cantidad de una o más AHL que sea eficaz para modular la expresión de un gen en una célula, por ejemplo, una célula de planta, que ha sido puesta bajo el control de un promotor sensible a AHL.
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Dichas composiciones (preferiblemente composiciones acuosas), cuando se aplican a las plantas, se aplican al follaje, al suelo, o a la superficie del agua (por ejemplo, en un campo de arroz). Dichas composiciones pueden aplicarse también en forma de un tratamiento de semilla, por ejemplo, empapando semillas en una formulación líquida que contiene el compuesto de acuerdo con la invención o revistiendo semillas con el compuesto.
Dichas composiciones pueden incluir uno o más de los compuestos anteriores y, opcionalmente, otros ingredientes activos e inactivos. Por ejemplo, los compuestos anteriores pueden usarse en combinación con otros ingredientes activos o inactivos, tales como reguladores del crecimiento de las plantas, herbicidas, fungicidas, insecticidas, nematicidas, y bactericidas, por ejemplo.
Un compuesto se puede aplicar al medio de crecimiento o a las plantas que se van a tratar bien como tal o como un componente de una formulación que también incluye un vehículo agronómicamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes activos, incluyendo otros compuestos citados anteriormente. Por "vehículo agronómicamente aceptable" se entiende cualquier sustancia líquida o sólida que se pueda usar para disolver, dispersar, o difundir un compuesto en la composición sin alterar la eficacia del compuesto y que por sí misma no presente efectos perjudiciales significativos para el suelo, equipo, cultivos, o entorno agronómico. Dichas composiciones incluyen formulaciones o soluciones líquidas o sólidas, incluyendo polvos humectables, concentrados emulsionables, polvos, gránulos, granzas, aerosoles, concentrados de emulsión fluida, suspensiones, y soluciones, que pueden prepararse de acuerdo con cualquier procedimiento convencional. Una composición puede diluirse con un vehículo sólido o líquido agronómicamente adecuado. Dichas composiciones pueden incluir también uno o más adyuvantes agronómicamente aceptables tales como agentes tensioactivos aniónicos, catiónicos, o no iónicos (agentes humectantes, agentes de extensión, agentes de dispersión, agentes de suspensión, y agentes emulsionantes), agentes de acondicionamiento, agentes de adherencia y adhesivos. Se
pueden encontrar ejemplos de adyuvantes útiles en "Detergents and Emulsifier's Annual" (John W. McCutcheon, Inc.).
Las composiciones preferidas incluyen líquidos y polvos humectables, que contienen preferiblemente como un agente de acondicionamiento uno o más agentes tensioactivos en cantidades suficientes para hacer al/a los ingredien-
te(s) activo(s) fácilmente dispersables en agua o en aceite. La incorporación de un agente tensioactivo en el compuesto puede potenciar su eficacia. Entre los agentes de humectación adecuados se incluyen pero sin limitación alquil benceno y alquil naftaleno sulfonatos, alcoholes grasos sulfonados, aminas o amidas de ácido, ésteres de ácido de cadena larga de isotionato sódico, ésteres de sulfosuccinato sódico, ésteres de ácidos grasos sulfatados o sulfonados, sulfonatos de petróleo, aceites vegetales sulfonados, glicoles acetilénicos diterciarios, derivados de polioxietileno o alquilfenilos (particularmente isooctilfenol y nonilfenol) y derivados de polioxietileno de los ésteres de ácidos grasos nono-superiores de anhídridos de hexitol (por ejemplo, sorbitano). Entre los tensioactivos se incluyen pero sin limitación dihexil éster del ácido sulfonsuccínico de sodio, monolaurato de sorbitano POE 20, y octilfenoxi polietoxi etanol. Polvos humectables o gránulos dispersables son composiciones dispersables en agua que contienen uno o más ingredientes activos, un extensor sólido inerte, y uno o más agentes de humectación y dispersión. Los extensores sólidos inertes son normalmente de origen mineral tales como las arcillas naturales, tierra de diatomeas, sales y minerales sintéticos, derivados de sílice y similares. Entre los ejemplos de tales extensores se incluyen caolinitas, arcilla atapulgita, sales y silicato de magnesio sintético.
Los compuestos anteriores pueden disolverse en cualquier disolvente adecuado, incluyendo pero sin limitación, uno o una mezcla de los siguientes: agua, alcoholes, cetonas, hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos halogenados, dimetilformamida, dioxano, y dimetilsulfóxido. La concentración del ingrediente activo en la solución resultante puede determinarse empíricamente.
Con el fin de producir concentrados emulsionables, los compuestos se disuelven en un disolvente orgánico tal como benceno, tolueno, xileno, naftaleno metilado, aceite de maíz, terpentina, o-diclorobenceno, isoforona, ciclohexano, u oleato de metilo, o mezclas de los mismos, junto con un agente emulsionante convencional que permite la dispersión en agua, por ejemplo, derivados óxido de etileno de alquilfenoles o alcoholes de cadena larga, mercaptanos, ácidos carboxílicos, aminas reactivas, y alcoholes polihídricos parcialmente esterificados. Pueden usarse como emulsionantes sulfatos o sulfonatos solubles en disolvente, tales como las sales de metales alcalinotérreos o sales de amina de alquilbencenosulfonatos y los sulfatos sódicos de alcoholes grasos, que presentan propiedades tensioactivas ya sea en solitario o junto con un producto de reacción de tipo óxido de etileno. Los concentrados de emulsión fluida se formulan de forma similar e incluyen, además de los componentes de los concentrados emulsionables anteriores, agua y un agente estabilizante tal como un derivado de celulosa soluble en agua o una sal soluble en agua de un ácido poliacrílico. La concentración del ingrediente activo en dichos concentrados emulsionables es generalmente del 10% al 60% en peso y en concentrados de emulsión que fluye libremente es generalmente del 10% al 75% en peso.
Polvos humectables adecuados para la pulverización son mezclas de un compuesto anterior, un sólido finamente dividido (tal como una arcilla, un carbonato o silicato orgánico, o un gel de sílice), y un agente humectante, agente de adherencia, y/o agente de dispersión. La concentración de/de los ingrediente(s) activo(s) en dichos polvos está generalmente entre aproximadamente el 20% y el 98% en peso y está preferiblemente entre un 40% y un 75% en peso. Un agente de dispersión está presente opcionalmente en una concentración de entre el 0,5% y el 3% en peso de la composición. Un agente humectante puede constituir entre el 0,1% y el 5% en peso de la composición.
Polvos son mezclas de uno o más de los compuestos anteriores con sólidos orgánicos o inorgánicos inertes finamente divididos tales como harinas botánicas, almidón, diatomita, sílices, silicatos, carbonatos, y arcillas. Un procedimiento para preparar un polvo es diluir un polvo humectable con un vehículo finamente dividido. Un concentrado de polvo que contiene entre aproximadamente un 20% y un 80% de/de los ingrediente(s) activo(s) se puede diluir hasta una concentración final entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 10% en peso del polvo.
Las formulaciones particuladas (por ejemplo, granulares) se preparan impregnando el/los ingrediente(s) activo(s) en un material sólido, tal como tierra Fuller granular, vermiculita, mazorcas de maíz trituradas, harina de maíz, cáscaras de semilla (incluyendo salvado u otras cáscaras de grano), u otros materiales. Una solución de uno o más de los compuestos anteriores en un disolvente orgánico volátil se pulveriza o se mezcla con el sólido granular y el disolvente se retira por evaporación. El material granular puede tener cualquier tamaño adecuado, preferiblemente entre 1,18 mm y 0,25 mm (malla de 16 a 60). El ingrediente activo representa generalmente del 2% al 15% en peso de la formulación. De forma alternativa, la formulación se puede incorporar en formulaciones particuladas de liberación controlada mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, por encapsulación mediante polimerización interfacial y coacervación; disolviendo el ingrediente activo en una solución junto con un polímero seguido de evaporación del disolvente; mezclando el ingrediente activo con una cera o polímero (mezclando ingredientes secos seguido de fusión de la mezcla, o mezclando el ingrediente activo con un polímero o cera fundida, seguido de la solidificación de la mezcla), produciendo después partículas de la mezcla mediante prilado, trituración, extrusión o pulverización por congelación. El ingrediente activo representa generalmente entre el 5% y el 50% de dicha formulación de liberación controlada.
Se pueden formular sales de los compuestos anteriores y aplicarse como soluciones acuosas a una concentración de entre el 0,05% y el 50% en peso y preferiblemente entre el 0,1% y el 10% en peso y aplicarse a los cultivos en esta forma. Dichas soluciones se pueden preparar como concentrados que se diluyen con un disolvente acuoso u otro disolvente apropiado hasta la concentración deseada para su uso. Dichas soluciones incluyen opcionalmente un agente tensioactivo y/o uno o más materiales auxiliares para aumentar la actividad del ingrediente activo, tales como glicerina, metiletilcelulosa, hidroxietil celulosa, polioxietilensorbitan monooleato, polipropilenglicol, ácido poliacrílico, polietilen sodio malato, u óxido de polietileno. Dichos materiales auxiliares están presentes generalmente a una concentración del 0,1% al 5% en peso, preferiblemente entre el 0,5% y el 2% en peso de la solución. Dichas composiciones pueden incluir también opcionalmente un tensioactivo agronómicamente aceptable.
Los compuestos y formulaciones de la invención pueden aplicarse mediante un procedimiento convencional, incluyendo pero sin limitación, pulverizaciones hidráulicas, pulverizaciones aéreas, o polvos. Para aplicaciones de bajo volumen se usa normalmente una solución del compuesto. La formulación, el volumen, la concentración, la tasa de aplicación, el momento de la aplicación (incluyendo la etapa del desarrollo de la planta), y el procedimiento de aplicación apropiados dependerán de una serie de factores tales como el tipo de planta, el tipo de suelo, la fertilidad y factores medioambientales.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una AHL o análogo de AHL (o mezcla que incluye dos o más AHL o análogos de AHL) en una composición que es suficiente para modular la expresión de un gen bajo el control de un promotor sensible a AHL, preferiblemente una inducción o reducción de la expresión que es de al menos dos veces, preferiblemente cinco veces, y de forma más preferible al menos de diez veces en comparación con la actividad basal en ausencia de la AHL.
Formulaciones de AHL para la Modulación de la Expresión Génica Animal
El procedimiento de la presente invención es útil para la modulación de la expresión génica en una amplia variedad de animales o células o tejidos animales, incluyendo hongos (por ejemplo, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae), nematodos, insectos, anfibios, aves, y mamíferos, por ejemplo. Se puede usar cualquier formulación convencional para administrar una AHL a dicha célula, tejido u organismo.
Ejemplos Ejemplo 1 Inductores
El inductor para el control del sistema lux en Vibrio fisheri, N-(3-oxohexanoil)-L-homoserina lactona (OHHL, denominado también VAI-1) se sintetiza u obtiene a partir de una fuente comercial. Los procedimientos para la producción del inductor OHHL están descritos por Eberhard y col., Biochemistry 20:2444-2449, 1981. Otros inductores AHL pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales.
Ejemplo 2 Construcciones de Expresión 2A. Construcciones de Expresión Nuclear
Se preparan una serie de construcciones efectoras y reporteras para dirigir la expresión de LuxR y proteínas relacionadas y de la caja lux-GUS respectivamente. Las construcciones efectoras contienen el regulador transcripcional, y las construcciones reporteras contienen el promotor regulable que alberga las secuencias de la caja lux.
Las construcciones reporteras que emplean el gen reportero iudA (Jefferson y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:8447-8451, 1986) asociado de forma operativa con la caja luxR se preparan tal y como se describe más adelante. Se clonan en múltiples copias oligonucleótidos de cadena doble que codifican LuxR o sitios de unión homólogos en una construcción promotor 35S mínimo-reportero GUS. Las secuencias de los oligonucleótidos son tal y como se muestra a continuación:
caja EsaR 5'-AACTTAACCTGCACTATAGTACAGGTAACA-3'
caja LuxI 5'-AACTTAACCTGTAGGATCGTACAGGTAACA-3'
caja LasB 5'-AACTTAACCTGCCAGTTCTGGCAGGTAACA-3'
caja TraR 5'-AACTTAACGTGCAGATCTGCACATAACA-3'
En la Figura 4 se muestra un ejemplo de la construcción reportera, pMON53009, para EsaR. Se clonan cuatro copias del oligonucleótido caja EsaR cadena arriba del promotor 35S de CaMV mínimo (-46 truncado). Al promotor 35S mínimo le sigue el potenciador de la traducción W procedente de la proteína de la cápsida de TMV, gen \alpha-glucuronidasa iudA de E. coli (GUS), y la región 3'-no traducida del gen nopalina sintasa (3'NOS), que proporciona un terminador de la transcripción y una señal de poliadenilación. Las construcciones para otros miembros de la familia LuxR son idénticas con la excepción del número de copias y la secuencia del oligonucleótido que codifica el supuesto sitio de unión. Las construcciones se describen tal y como se muestra a continuación, mostrando como subrayados la secuencia del elemento cis, o el sitio de unión del regulador transcripcional.
La construcción pMON53006 contiene tres copias de la caja luxR (5'-AACTTAACCTGTAGGATCGTACAGGTA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 1).
La construcción pMON53007 contiene siete copias de la caja luxR (5'-AACTTAACCTGTAGGATCGTACAGGT
AACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 2).
La construcción pMON53008 contiene dos copias de la caja luxR (5'-AACTTAACCTGTAGGATCGTACAGGTA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 3).
La construcción pMON53009 contiene cuatro copias de la caja esaR (5'-AACTTAACCTGCACTATAGTACAGG
TAACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 4).
La construcción pMON53010 contiene tres copias de la caja esaR (5'-AACTTAACCTGCACTATAGTACAGGTA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 5).
La construcción pMON53031 contiene tres copias de la caja traI1 (5'-AACTTAACGTGCAGATCTGCACATAA
CA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 6).
La construcción pMON53032 contiene seis copias de la caja traI1 (5'-AACTTAACGTGCAGATCTGCACATA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (similar a la Figura 6, teniendo solamente 6 copias de la secuencia de la caja traI1).
La construcción pMON53035 contiene tres copias de la caja lasB (5'-AACTTAACCTGCCAGTTCTGGCAGGTA
ACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 7).
La construcción pMON53036 contiene cuatro copias de la caja lasB (5'-AACTTAACCTGCCAGTTCTGGCAGG
TAACA-3') clonada cadena arriba del promotor 35S mínimo (Figura 8).
Se preparan una serie de construcciones efectoras empleando diversos reguladores bacterianos. Se han aislado los marcos abiertos de lectura de LuxR, EsaR, LasR, RhIR y TraR a partir del ADN cromosómico bacteriano usando PCR. Los cebadores para la amplificación de los reguladores son tal y como se muestra a continuación: LuxR
(LuxR-N 5'-TGAAAAAGATAAATGCCGACGACACATACAGAA y LuxR-Cla 5'-AGCTTTATCGATGTACTTAAT
TTTTAAAGTATGG de Vibrio), EsaR (EsaR-Nde 5'-GGAGCCCATATGTTTTCTTTTTTCCTTGAAAAT y EsaR-Cla 5'-ACGTACGATCGATCCGCCCGTCGCAGTCACTAC), LasR (LasR-Nde 5'-GTAGCCATATGGCCTTGGTTGACGGTTTTC y LasR-Cla 5'-CATCGATCTGAGAGGCAAGATCAGAGAGTA), RhlR (RhlR-Nde 5'-CTTACTCATATGAGGAATGACGGAGGCTTT y RhlR-C CTGCGCTTCAGATGAGGCCCAGCGCCGCGG) y TraR
(TraR25' 5'-CATATGCAGCACTGGCTGG y TraR13' 5'-GTCGACCTCAGATGAGTTTCCG de la cepa A348 de Agrobacterium). Los fragmentos de la PCR que contienen marcos abiertos de lectura se clonan en una construcción de expresión. La construcción del vector contiene un promotor 35S modificado (doble potenciador) seguido del potenciador de la traducción de la proteína de la cápsida de TMV (W-guía), epitope de HA (hemoinfluenza) (MGYPYDVPDYAH) y la región 3'-no traducida del gen de la nopalina sintasa (3'NOS), que proporciona un terminador de la transcripción y una señal de poliadenilación. La región de 17 pares de bases del promotor 35S (de -17 a -1), que está inmediatamente cadena arriba del inicio de la transcripción (posición +1), se reemplaza por la secuencia del promotor del bacteriófago T7. El promotor 35S/T7 quimérico resultante tiene la ventaja frente al promotor 35S original de que permite el uso de la misma construcción tanto en ensayos in vivo en plantas (usando elementos promotores 35S) como en las reacciones de transcripción in vitro (usando el promotor T7 y la ARN polimerasa T7). El transcrito resultante se puede usar para programar una reacción de traducción in vitro convencional y sintetizar proteínas en un sistema libre de células. Como el promotor del T7 está cadena abajo de la caja TATA del promotor 35S, el reemplazo del tramo corto de la secuencia del promotor 35S nativo por la secuencia del fago no compromete la actividad del promotor 35S en células de plantas.
Los ejemplos de la construcción de expresión de doble propósito, pMON53004 y pMON53005, se muestran en las Figuras 11 y 12, respectivamente, para EsaR. El diseño de las construcciones 35S de CaMV-T7 para otros miembros de la familia LuxR es el mismo excepto por la región de codificación de la proteína EsaR.
Con el fin de conseguir la activación de la transcripción en el núcleo, se incorpora un potente dominio de activación en un grupo de construcciones. La fuente del dominio de activación procede del gen VP16 del Herpes simplex (aminoácidos 413-490 de la proteína VP16). Este dominio de activación se ha demostrado que funciona de manera muy eficaz en plantas (Ma y col., Nature 334:631-633, 1988).
Por consiguiente, todas las construcciones efectoras contienen el promotor 35S de CaMV modificado (potenciador duplicado, e35S con los nucleótidos -17 a -1 reemplazados por el promotor del fago T7. El promotor va seguido del potenciador de la traducción del virus del mosaico del tabaco (TMV) derivado de la proteína de la cápsida de TMV (también conocida como fragmento \Omega) seguido del sitio NcoI para la clonación. Si está indicado, esto va seguido de una secuencia sintética que codifica el epitope de la hemaglutinina (HA) de la gripe (MGYPYDVPDYAH) fusionado en fase con o bien el dominio de activación de VP16 o el marco abierto de lectura de la proteína receptora de AHL (también denominada en el presente documento proteína o elemento regulador de la transcripción). La terminación transcripcional y poliadenilación viene proporcionado por la región 3' de la nopalina sintasa (3'NOS).
La construcción pMON53002 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de LuxR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 9).
La construcción pMON53003 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de VP16-LuxR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 10).
La construcción pMON53004 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de EsaR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 11).
La construcción pMON53005 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de VP16-EsaR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 12).
La construcción pMON53015 contiene la fusión señal de localización nuclear de SV40-marco abierto de lectura (ORF) de VP16-EsaR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 13).
La construcción pMON53020 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de RhlR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 14).
La construcción pMON53021 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de VP16-RhlR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 15).
La construcción pMON53028 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de VP16-TraS bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 16).
La construcción pMON53029 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de TraR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS (Figura 17).
La construcción pMON53030 contiene la etiqueta epitópica de HA clonada de forma operativa cadena arriba de la fusión del marco abierto de lectura (ORF) de VP16-TraR bajo el control transcripcional de un promotor 35S potenciado modificado y 3'NOS, creando de esta manera la construcción de expresión 35S-HA-VP16-TraR-nos3' (Figura 18).
Se prepararon una serie de construcciones de casete de doble expresión que contenían los casetes tanto del regulador como del reportero para la transformación de plantas.
La construcción pMON53071 contiene el regulador EsaR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con cuatro copias de los elementos cis de esaR en el casete del reportero.
La construcción pMON53072 contiene el regulador EsaR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con cuatro copias de los elementos cis de esaR en el casete del reportero.
La construcción pMON53073 contiene el regulador TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con tres copias de los elementos cis de traI (véase la tabla 2 anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53074 contiene el regulador TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con tres copias de los elementos cis de traI (véase la tabla 2 anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53075 contiene el regulador TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con tres copias de los elementos cis de traAI (véase la tabla 2 anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53076 contiene el regulador TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con tres copias de los elementos cis de traAI (véase la tabla 2 anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53077 contiene el regulador TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con tres copias de los elementos cis de traA2 (véase la tabla 2 anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53078 contiene el regulador TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con tres copias de los elementos cis de traA2 (véase la tabla 2 anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53079 contiene el regulador TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero iudA bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con tres copias de los elementos cis de traA8 (véase la tabla 2 anterior) en el casete del reportero.
La construcción pMON53080 contiene el regulador TraR fusionado al dominio de activación de VP16 bajo el control del promotor 35S potenciado en el casete del efector y el gen reportero de la luciferasa bajo el control del promotor 35S mínimo fusionado con tres copias de los elementos cis de traA8 (véase la tabla 2 anterior) en el casete del reportero.
Las construcciones de expresión se usan en experimentos de transformación para obtener plantas transgénicas. Las plantas Arabidopsis thaliana transgénicas pueden obtenerse mediante transformación mediada por Agrobacterium tal y como describen Valverkens y col., (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540), o tal y como describen Bent y col., ((1994), Science 265:1856-1860), o Bechtold y col. ((1993), C. R. Acad. Sci., Life Sciences 316:1194-1199). Otras especies de plantas pueden transformarse de forma similar usando técnicas relacionadas.
2B. Construcciones de Expresión en Plastos
Se preparan una serie de construcciones para permitir la transcripción regulada de secuencias de ácido nucleico de interés en el plasto de la célula de la planta. De manera similar a las construcciones de expresión nuclear descritas en el ejemplo 2A, se preparan construcciones reporteras y efectoras; sin embargo, las construcciones en los plastos emplean elementos reguladores para la expresión en un plasto de una célula de una planta.
La secuencia Prrn/G10L se construye mediante la hibridación de dos secuencias de oligonucleótidos, T7guía1 y T7guía2 para crear el sitio de unión al ribosoma del plasto G10L.
T7guía1: 5'-AATTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC-3'
T7guía2: 5'-CATGGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAC-3'
La secuencia G10L se liga al extremo 3' de la secuencia del promotor Prrn en forma de un fragmento EcoRI/NcoI para crear la secuencia Prrn/G10L.
Se preparan una serie de construcciones que contienen diversas secuencias Shine-Dalgarno (SD) y de caja cadena abajo (DB). Se emplea PCR usando diversas combinaciones de cebadores para amplificar fragmentos que contienen las secuencias de SD y DB. Se llevan a cabo reacciones usando cebadores oligonucleótidos y plásmido pCGN5063 en pBluescript+ (Stratagene) que contiene el gen GUS bajo el control del promotor T7 y la región guía del gen 10 del bacteriófago T7 (similar a pCGN4055 descrito en la patente de EE.UU. 5.576.198). El promotor T7 y la región guía del gen 10 del bacteriófago T7 están presentes como un fragmento HindIII/NcoI. Las parejas de cebadores para cada construcción se diseñaron para introducir HindIII y NcoI en los extremos respectivos. Los fragmentos de PCR resultantes se purifican, se digieren con HindIII/NcoI, y se ligan al esqueleto del vector pCGN5063 digerido por HindIII/NcoI. El cebador directo que porta el sitio HindIII está diseñado para cebar en la región del promotor T7 y es común para todas las construcciones (G10L5' 5'-ACGTAAGCTTCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3').
El cebador inverso que contiene el sitio NcoI introduce las variantes de las secuencias Shine-Dalgarno y de la caja cadena abajo para las diversas construcciones y se enumera en la Tabla 3. Las variantes de la caja cadena abajo (DB) incluyen (a) gen 10 DB de tipo silvestre (wt DB) que presenta 7 bases complementarias al ARNr 16S (7/15) plastidial, (b) DB mutante con 15 bases complementarias al ARNr 16S (m1DB, 15/15) plastidial, (c) DB mutante con 11 bases complementarias al ARNr 16S (m2DB, 11/15) plastidial y (d) DB mutante con 0 bases (m3DB, 0/15) que potencialmente puede emparejarse con los 15 pares de bases anti-secuencia DB en el ARNr 16S del tabaco. Las variantes de la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) incluyen SD de tipo silvestre (wt SD) AAGGAG y SD mutante (mSD) UUCCUC.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3 Construcciones de Expresión en Plasto
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Genes quiméricos que codifican las proteínas reguladoras se insertan preferiblemente en el vector de expresión para dirigir su transcripción a partir del promotor Prrn. Así, en el genoma del plasto, los genes quiméricos que codifican las proteínas reguladoras se transcriben a partir del promotor Prrn/RBS, o del promotor Prrn/G10L en el plasto de la planta.
Se preparan una serie de construcciones para dirigir la expresión del gen GUS a partir de un promotor que contiene secuencias de la caja lux (construcciones reporteras) así como construcciones para la expresión de la proteína reguladora a partir de las secuencias del promotor Prrn/RBS y Prrn/G10L.
La región que codifica luxR y las secuencias cadena arriba se amplifican usando reacciones en cadena por la polimerasa (PCR) y se clonan en 5' de la secuencia de codificación de GUS. Se usa una reacción PCR de tres etapas para amplificar el promotor luxI/promotor luxR/secuencia de codificación de luxR para retirar el sitio Nco I de la secuencia de codificación de luxR. Se añade una secuencia terminadora de T7 orientada de forma opuesta en 5' de la secuencia de codificación de luxR para prevenir la lectura a través de la transcripción y la activación espúrea de la expresión del gen GUS. Además, se añade un sitio SalI/NotI al extremo 5' del terminador y se añade un sitio NcoI en el codón de partida del promotor LuxI junto con un sitio EcoRI para fines de clonación. Este fragmento se clona en pBluescript II y se secuencia para confirmar que la secuencia amplificada es correcta. El promotor de luxI/promotor de luxR/secuencia de codificación de luxR/fragmento terminador de T7 se subclona en pCGN6104 en forma de un fragmento SalI/NcoI. Este vector crea el sistema de expresión inducible para la expresión regulada de GUS por parte del inductor a partir del promotor luxI (Figura 19). El fragmento NotI de este plásmido se clona en el vector de homología con el plasto del tabaco pCGN6043 para proporcionar la expresión de la secuencia de GUS bajo el control del promotor luxI y de la proteína luxR. La construcción resultante contiene secuencias para la integración en la región rbcL mediante recombinación homóloga (Svab y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:913-917, 1993).
Se construye una segunda construcción de transformación para la expresión del gen GUS a partir del plasto de la planta. Esta construcción contiene la secuencia de codificación de GUS unida de forma operativa al promotor luxI, tal y como se ha descrito anteriormente, y la secuencia de codificación de luxR bajo el control del promotor/sitio de unión a ribosoma Prrn/G10L. Esta construcción también contiene secuencia para proporcionar la integración del casete de expresión en el genoma del cloroplasto en la región rbcL (Svab y col. (1993), referencia citada anteriormente). La inclusión del promotor/RBS Prrn:G10L en esta construcción de expresión proporciona la expresión de alto nivel de la forma inactiva de la proteína luxR en plastos de células de plantas (Figura 20).
Se prepara un tercer casete de expresión para ensayar la capacidad del sistema para controlar la ARN polimerasa T7 y los genes diana cadena abajo procedentes todos del interior del plasto. En este casete, la secuencia de codificación de luxR está dirigida por la secuencia Prrn/G10L (descrita anteriormente), que controla la expresión de la ARN polimerasa T7 bajo el control de la secuencia LuxI. El gen GUS está a su vez controlado por el promotor T7. El casete Prrn/G10L:luxR/LuxI:ARN polimerasa T7/T7/GUS (Figura 21) se clona en el casete de homología con T7:GUS/rbcL, pCGN6116.
Se preparan dos construcciones de expresión para ensayar el sistema de represión esaR para expresar las secuencias de ADN de interés del plasto de la planta.
La región de codificación de esaR se amplifica mediante PCR y se liga a la secuencia terminadora de la polimerasa T7 y al Prrn:G10L. La secuencia del promotor esaR se clona en una orientación de expresión divergente de Prrn:G10L/secuencia de codificación de esaR/terminador de T7. Un fragmento que contiene la secuencia de codificación de GUS con el psbA 3' y el terminador de polimerasa T7 se clonan para ser transcritos a partir de la secuencia del promotor esaR. El fragmento resultante que contiene dos casetes expresados de manera divergente, Prrn:G10L/esaR/terminador T7 y esaR/GUS/psbA 3'/terminador T7 (Figura 22), se clonan en un vector para permitir la integración de los casetes de expresión así como también contiene secuencias para la selección de plantas transplastómicas usando espectinomicina (psbA 3'/aad A).
Se prepara un vector de expresión en planta para expresar la ARN polimerasa T7 a partir del promotor esaR. La secuencia de codificación de la ARN polimerasa T7 se clona para ser expresada a partir del promotor esaR tal y como se ha descrito anteriormente para la expresión de la secuencia de codificación de GUS. Se clona un fragmento que contiene casetes de transcripción divergentes, Prrn:G10L/esaR/rps 16 3'/terminador T7 (cadena complementaria) y PesaR/ARN polimerasa T7/psbA 3'/terminador T7, en forma de un fragmento NotI en un vector que contiene elementos para la integración de las secuencias de expresión en el genoma del plasto. El vector también contiene una secuencia de codificación de GUS expresada a partir de un promotor de polimerasa T7, y secuencias para la expresión del gen marcador aadA. Esta construcción (Figura 23) permite la expresión controlada por inductor de la ARN poli-
merasa T7 regulando adicionalmente la expresión de la secuencia de codificación de GUS a partir del promotor T7.
Ejemplo 3 Inducción de la Expresión de GUS en E. Coli
Las construcciones nucleares descritas en el ejemplo 2A anterior se transforman en la cepa S10200 de E. coli. Colonias transformadas positivas, que son resistentes a ampicilina, crecen en medios de cultivo que o bien carecen del inductor AHL o contienen AHL. Las colonias cultivadas se seleccionan para la producción de GUS ensayando la actividad enzimática GUS de preparaciones de lisado celular para confirmar la expresión controlada por inductor. Los ensayos de la actividad GUS se llevan a cabo tal y como han descrito Jefferson y col. (EMBO J. 6:3901-3907, 1987).
Ejemplo 4 Transformación de Plantas 4A. Transfección en Células de Plantas
Se aislaron y purificaron plásmidos para transfección usando el kit de aislamiento de ADN del plásmido Megaprep (Qiagen). Se prepararon protoplastos de zanahoria para transfecciones a partir de un cultivo de suspensión de células de zanahoria y se transfectaron con ADN purificado tal y como se ha descrito en Ulmasov y col., Plant Cell 7:1611-1623, 1995. En resumen, se incubaron 10 \mug del plásmido reportero y 5 \mug del plásmido efector con 10^{6} protoplastos durante cinco minutos a temperatura ambiente en presencia de una solución de polietilenglicol-calcio. Después de diluir aproximadamente diez veces con el medio de cultivo, los protoplastos se incubaron en la oscuridad durante 36 horas o bien en presencia o bien en ausencia del inductor 3-oxohexanoil-homoserina lactona (OHHL, mezcla racémica de los isómeros L y D, adquirido en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Después de la incubación, se recogieron los protoplastos mediante una centrifugación a baja velocidad, se lisaron y se midió el nivel de actividad GUS usando el ensayo GUS fluorométrico (Jefferson y col., EMBO J. 6:3901-3907, 1987). Cada combinación ADN/AHL se realizó por triplicado y se ajustaron los promedios de las actividades GUS restando el valor de fondo del control de transfección "sin ADN".
4B. Transformación de Plasto
En Svab y col. (1990, referencia citada anteriormente) y Svab y col. (1993, referencia citada anteriormente) se reseña la transformación estable de genomas de plastos del tabaco mediante bombardeo de partículas. Los procedimientos que se describen en esas referencias se pueden emplear para obtener plantas transformadas con las construcciones de expresión de plastos descritas en el presente documento. Dichos procedimientos implican generalmente el bombardeo con ADN de un explanto huésped diana, preferiblemente un explanto preparado a partir de un tejido rico en plastos metabólicamente activos, tales como tejidos de planta verde incluyendo hojas o cotiledones.
Las semillas del tabaco (N. tabacum v. Xanthi N/C) se esterilizan superficialmente en una solución de clorox al 50% (hipoclorito sódico al 2,5%) durante 20 minutos y se aclaran cuatro veces con H_{2}O estéril. Estas semillas se siembran asépticamente en placas sobre un medio de 0,2x sales MS y se deja que germinen. Los semilleros se desarrollan sobre medio de agar solidificado con la solución salina MS con 30 g/l de sacarosa (Murashige y col., Physiol. Plant 15:493-497, 1962).
Microproyectiles de wolframio (1,0 \muM) o de oro (0,6 \muM) se recubren con ADN de plásmido de acuerdo con Maliga (Methods in Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual, Eds. Maliga y col., Cold Spring Harbor Press, 1993) y se usan para bombardear hojas maduras, colocadas en posición abaxial boca arriba sobre medio RMOP; sales MS, 1 mg/l de BAP, 0,1 mg/l de NAA, 30 g/l de sacarosa y phytagar al 0,7% (Svab y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:8526-8530, 1990) usando el sistema de He PDS 1000 de Bio-Rad (Sanford y col., Technique 3:3-16). Los plásmidos pZS223 y pZS224 se usan como el ADN de plásmido de recubrimiento.
El tejido bombardeado se cultiva posteriormente durante aproximadamente 2 días en un medio que promueve la división celular, después de lo cual el tejido de la planta se transfiere a un medio selectivo que contiene una cantidad inhibidora del agente selectivo particular. Los explantos transformados forman brotes verdes en aproximadamente 3-8 semanas. Las hojas de esos brotes se subcutivan posteriormente en el mismo medio selectivo para asegurar la producción y selección de brotes homoplásmicos.
Ejemplo 5 Análisis de Plantas Transgénicas 5A. Análisis de Transfección
Cuando la construcción caja esaR (4X)-reportero GUS, pMON53009, se transfectó en protoplastos de zanahoria junto con 35S-CAT (construcción efectora "neutra" para compensar la cantidad total de ADN en la reacción), la actividad GUS parecía ser aproximadamente 3-4 veces superior que la del promotor mínimo. Esto es probablemente resultado de una débil activación por medio de la unión de factores de transcripción endógenos a elementos caja esaR multimerizados con baja afinidad. Es habitual observar un valor de fondo superior con multímeros de elementos cis, ya que la multimerización a menudo promueve la unión sinérgica de factores de transcripción. También es posible que el valor de fondo esté provocado por elementos cis de planta crípticos insertados en la caja esaR o la región espaciadora de 10 pares de bases, que separa una caja esaR de otra. Cuando se usó en el experimento de transfección la construcción que codifica la fusión VP16-EsaR (pMON53005), el nivel de expresión del gen reportero fue significativamente superior (aproximadamente 40-50 veces) que el nivel de expresión de la construcción del promotor mínimo. Esta potente activación mediante la construcción VP16-EsaR disminuyó hasta 3,3 veces por la adición del inductor, (3-oxohexanoil-L-homoserina lactona) de una manera dependiente de la dosis.
Este resultado indica que la proteína de fusión VP16-EsaR probablemente se une a los elementos cis de manera autónoma, en ausencia de ARN polimerasa bacteriana, y que esta unión puede invertirse mediante su ligando, AHL. Este resultado es también consistente con la hipótesis de que, a diferencia de algunos otros miembros de la familia LuxR, EsaR funciona como un represor, y no como un activador en células bacterianas. Este modo de acción fue propuesto por otros en base a los datos obtenidos a partir de experimentos genéticos (von Bodman y Farrand, J. Bacteriol., 177:5000-5008, 1995; von Bodman y col., Proc. Natl. Acad. EE.UU. 95:7687-7692, 1998). El hecho de que la transcripción dependiente de EsaR pueda estar regulada en células de plantas mediante concentraciones bajas de su ligando natural sugiere que este compuesto AHL es capaz de penetrar membranas de células de plantas y es suficientemente estable como para conseguir su efecto durante el periodo de tiempo experimental de 36 horas.
La activación por parte de la construcción VP16-EsaR estaba específicamente restringida a la construcción del reportero que contiene la caja esaR. Cuando se usó en combinación con otros reporteros, GAL4(4X) (cuatro copias del sitio GAL4) cadena arriba del promotor 35S mínimo, o siete copias de la caja luxI, no se observó activación, indicando que el dominio de unión al ADN de esaR no reconoce los sitios no relacionados (GAL4) ni incluso los sitios estrechamente relacionados (luxI) con afinidad suficiente para proporcionar una activación detectable.
La expresión del gen iudA a partir de la caja TraI1 (pMON53031) usando el regulador TraR (pMON53030) se determina también tal y como se describe para las construcciones EsaR anteriormente. Los resultados se muestran más adelante en la Tabla 4.
Diez \mug del plásmido reportero (pMON53031), y la cantidad indicada del plásmido efector 35S por reacción se usó para la transfección por triplicado. Después de la transfección, los protoplastos se incubaron en la oscuridad durante 36 horas o bien en ausencia o bien en presencia de la 3-oxooctanoil-L-homoserina lactona (OOHL). Las columnas "inductor --" e "inductor +" son promedios de las actividades GUS.
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TABLA 4 Inducción de la Expresión del gen iudA a partir de la caja traI1 Usando TraR
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Los resultados de los ensayos en células de plantas anteriores demuestran que se puede obtener al menos una inducción de GUS de 5,2 veces usando construcciones de activación o de represión usando los procedimientos de la presente invención. Además, las construcciones de reportero mostraron un valor de fondo hasta 40 veces más alto en comparación con el promotor mínimo, lo que sugiere que el valor de fondo era debido al reconocimiento y la unión por parte de factores endógenos a los elementos de la caja tra. Finalmente, la inducción no parecía tener lugar en ausencia del inductor.
5B. Análisis de Plantas Transplastómicas
Se analizaron plantas de plasto transformado seleccionadas para la expresión del gen marcador aadA para determinar si se ha transformado el contenido total de plasto de la planta (transformantes homoplásmicos). De manera típica, después de dos rondas de formación de brotes y selección con espectinomicina, aproximadamente el 50% de las plántulas transgénicas que se analizaron son homoplásmicas según se determinó mediante el análisis de transferencia Southern del ADN del plasto. Se seleccionaron plántulas homoplásmicas para un cultivo adicional.
Se usó análisis de transferencia Southern para confirmar la integración de los casetes de expresión quiméricos en el genoma del plasto. La preparación, electroforesis, y transferencia del ADN a filtros se realizó tal y como se ha descrito en Svab y col., 1993, (referencia citada anteriormente). El ADN total celular de la planta se preparó tal y como han descrito Dellaporta y col., Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21, 1983.
Para medir la transcripción dependiente de AHL del gen GUS, muestras de ARN celular total procedentes del tejido de la hoja, tratadas o sin tratar con AHL, se sometieron a análisis Northern con una sonda específica para GUS. Se preparó el ARN total de la planta tal y como han descrito Hughes y col. en Plant Mol. Biol. Rep. 6:253-257, 1988, o mediante el uso del reactivo TRIzol (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) siguiendo el protocolo de los fabricantes. Una única banda de ARNm abundante del tamaño esperado (2,1 kb) estaba presente solamente en las muestras de ARN extraídas del tejido de la hoja tratada con AHL. Esto indica que la transcripción del transgen de GUS depende de la aplicación de AHL.
Para demostrar que los transcritos T7 GUS se traducen en los plastos transgénicos, se midió en diversos tejidos la actividad específica B-glucuronidasa. Los ensayos GUS se llevaron a cabo tal y como han descrito Jefferson y col. en EMBO J. 6:3901-3907, 1987.
5C. Análisis de Arabidopsis Transgénica
Se analizó la inducción de la actividad GUS en plantas Arabidopsis transgénicas que contenían los genes reportero TraA8(3X)-GUS y activador 35S-VP16-TraR (pMON53077). Ocho plantas mostraron actividad GUS en presencia de C8-HSL. Tres de esas ocho mostraron fuerte activación con niveles muy bajos de actividad de fondo. Sin embargo, fue difícil determinar con precisión el nº de veces de inducción debido a la extremadamente baja actividad no inducida, pero una estimación preliminar sugiere que se trata de una inducción de no menos de 75 a 150 veces. Los ensayos GUS se llevaron a cabo tal y como han descrito Jefferson y col. (referencia citada anteriormente).
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Además, se visualizaron hojas desprendidas incubadas durante 24 horas en medio MS con o sin HSL 100 \muM para la inducción de la actividad GUS después de tinción. Hojas caulinares tratadas con el inductor durante 24 horas exhibieron actividad inducida uniforme tal y como se reveló mediante tinción histoquímica para la actividad de GUS. Los resultados de la tinción histoquímica se proporcionan en la Figura 25.
Ejemplo 6 Secuencias de Caja tra Mutadas reducen la Expresión de Fondo en Células de Zanahoria
Con el fin de aumentar los niveles de inducibilidad del sistema TraR en células de zanahoria fue necesario disminuir los niveles de la actividad de fondo del gen reportero caja tra-GUS.
Este gen, que contiene tres copias de la caja traI1 cadena arriba del promotor 35S mínimo, demostró una actividad bastante alta, una actividad 10 a 50 veces mayor que la del promotor 35S mínimo, incluso sin el efector VP16-TraR. Esta actividad de fondo es aparentemente resultado de la activación por un factor de transcripción endógeno que se une a una(s) secuencia(s) críptica(s) en la caja tra y activa la transcripción independientemente de TraR. Como no se han reseñado hasta la fecha TraR u homólogos de los mismos en las plantas, no es probable que la especificidad de unión a ADN del factor endógeno sea idéntica a la de TraR.
Partiendo de la hipótesis de que no todo nucleótido en la caja tra es críticamente importante para la unión, los inventores intentaron cambiar la secuencia de la caja tra de manera que siguiera siendo reconocida por TraR, pero no por el factor endógeno de plantas. Se diseñaron diez oligonucleótidos de cadena doble que contenían una o dos alteraciones de bases de la caja traA, un sitio de unión traR perfectamente palindrómico de origen natural, tal y como se muestra en la Tabla 2 (traA1 a traA9 y traA-1). En las variantes de tipo traA, traA1 a 9, se dispusieron simétricamente dos cambios de pares de bases tal y como se muestra en la Tabla 2 (indicando las bases cambiadas con letras minúsculas).
Las cajas tra de tipo silvestre y variantes se clonaron en múltiples copias cadena arriba del promotor 35S mínimo. Los plásmidos resultantes son tal y como se muestra a continuación (véase la Tabla 2 anterior para la secuencia de las cajas tra usadas).
pMON53041:
caja traA1 (3X)-46GUS, cl. 35
pMON53042:
caja traA2 (3X)-46GUS, cl. 43
pMON53043:
caja traA3 (3X)-46GUS, cl. 4
pMON53044:
caja traA4 (3X)-46GUS, cl. 23
pMON53045:
caja traA5 (3X)-46GUS, cl. 2
pMON53046:
caja traA6 (3X)-46GUS, cl. 21
pMON53047:
caja traA7 (3X)-46GUS, cl. 15
pMON53048:
caja traA8 (3X)-46GUS, cl. 4
pMON53049:
caja traA9 (3X)-46GUS, cl. 8
pMON53050:
caja traA (3X)-46GUS, cl. 17
pMON53051:
caja traA-1 (3X)-46GUS, cl. 14
Cada una de las construcciones contenía tres copias de un oligonucleótido doble mutante con mutaciones simétricas en ambas mitades del palindroma (marcadas en minúscula en la Tabla 2). Estas construcciones se ensayaron para evaluar la actividad GUS de fondo y la sensibilidad a TraR en protoplastos de zanahoria. Los resultados de dos experimentos de transfección independientes (Tablas 5 y 6) indican que tres construcciones, pMON53041 (traA1), pMON53042 (traA2) y pMON53048 (traA8) han retenido la capacidad de activarse por la fusión VP16-TraR, mientras que otras pierden su sensibilidad a TraR. Al mismo tiempo, la actividad de fondo de estas construcciones se redujo significativamente, dando como resultado niveles superiores de inducibilidad (inducción de hasta 17 veces con la construcción traA1, línea 4 en la Tabla 6).
Aunque la segunda transfección no fue tan eficaz como la primera transfección, sus resultados apoyan la conclusión de que las mutaciones en las posiciones 1, 2 y 8 en la caja tra canónica (contando desde el primer nucleótido) pueden ser toleradas por TraR y producen niveles de inducibilidad superiores después de la estimulación con C8-AHL.
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TABLA 5 Niveles de Expresión Transitorios en Protoplastos de Zanahoria para Construcciones con Tres Copias de la Caja tra y Variantes de la Caja tra (Primera Transfección)
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Las muestras "inductor +" contenían C8-AHL 12,5 \muM. Se usó 35S-CAT en transfeciones "construcción de reportero en solitario" para compensar el ADN del efector TraR.
TABLA 6 Niveles de Expresión Transitorios en Protoplastos de Zanahoria para Construcciones con Tres Copias de la Caja tra y Variantes de la Caja tra (Segunda Transfección)
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Las muestras "inductor +" contenían C8-AHL 12,5 \muM. Se usó 35S-CAT en transfeciones "construcción de reportero en solitario" para compensar el ADN del efector.
Los inventores han ensayado también construcciones que contienen cuatro copias de la caja traA8 (pMON53055, TraA8 (4X)-46GUS, cl. 16), y consiguieron una inducción de 25,7 veces (Tabla 7).
TABLA 7 Niveles de Expresión Transitorios en Protoplastos de Zanahoria para Construcciones con Tres o Cuatro Copias de la Caja tra8
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La Tabla 7 contiene también datos que indican que TraM y TraS se pueden usar para regular a la baja la activación mediada por TraR en células de plantas, de una manera que es similar a lo que ocurre en el huésped natural. Esto puede ser útil si es deseable prevenir la inducibilidad por AHL en ciertos órganos, tejidos o tipos de células. Por ejemplo, mediante la expresión de TraM (que trabaja de una manera muy eficaz, comparar líneas 8 y 10 de la Tabla 7) bajo el control del promotor específico de tejido apropiado, el sistema completo se puede mantener inactivo en presencia del ligando.
Ejemplo 7 Construcciones Sensibles a AHL en levadura
Se ensayó la funcionalidad de las construcciones sensibles a AHL en levadura (Saccharomyces cerevisiae). Con el fin de producir construcciones de reportero en levadura, se clonaron tres copias de un elemento sensible a AHL, las cajas tra y esa, en pLacZi (un componente del "Sistema del Mono-híbrido de MATCHMAKER" nº de catálogo K1603-1, Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), un vector reportero y de integración de levadura, cadena arriba del promotor mínimo del gen del iso-1-citocromo C de levadura (P_{CYC1}), sirviendo lacZ como el gen reportero. pLacZi es un vector integrativo que se puede integrar de manera estable en el genoma de la levadura después de la linealización. Se produjeron construcciones de plásmido efector mediante la clonación de TraR y EsaR en pGAL415 a partir de un promotor GAL1 inducible por la presencia de galactosa. Cuando se transforman en las células de levaduras, dichos pares activador/reportero son útiles para llevar a cabo cribados genéticos para nuevos alelos de receptores de AHL con características cambiadas o mejoradas, para seleccionar moléculas variantes de AHL que sean activas como inductores, para mutaciones de la caja tra, etc. Las construcciones en levadura sensibles a AHL son generalmente útiles para regular la expresión de polipéptidos foráneos en células de levaduras.
La cepa de S. cerevisiae 204142, un auxótrofo no patogénico de uracilo, leucina y triptófano (MATa ura3-52 leu2-delta1 trp1-delta63 [RF45527]) se transformó mediante el procedimiento de Acetato de Litio con pLacZi-traA8(6X) para crear una cepa reportera con traA8(6X) LacZi::ura3 (204142A). 204142A se transformó posteriormente con o bien pGAL415 que portaba un marcador de leucina para crear una cepa control (204142B) o con pGAL415TraR que portaba un marcador de leucina para crear una cepa de ensayo (204142C). Se midió la actividad beta-galactosidasa usando el sistema de ensayo quimioluminiscente Galacto-Star (Tropix, Inc., Bedford, MA) siguiendo el protocolo de los fabricantes, y resumido en el presente documento.
Todas las cepas de levadura se cultivaron sobre placas de medio sólido (medio SD; 6,7 mg/ml de nitrógeno de levadura y 40 mg/ml de glucosa más agar), suplementado con los aminoácidos apropiados, triptófano (0,4 mg/ml) y leucina (0,6 mg/ml) para 204142A, y suplementado con triptófano (0,4 mg/ml) para 204142B y 204142C. Las células se dejaron crecer durante toda la noche a 30ºC y se usaron para inocular medio líquido de crecimiento SR (6,7 mg/ml de nitrógeno de levadura y 40 mg/ml de glucosa) suplementado con los aminoácidos apropiados. Los cultivos inoculados se pusieron a 30ºC con agitación a 300 rpm en un matraz o tubo con una relación aproximada líquido/aire de 0,1. Las células se dejaron crecer hasta una absorbancia de A_{600} entre 0,2 y 0,5.
Las células de levadura se distribuyeron en asignadores de 450 \mul en pocillos de 2 ml de placas de 96 pocillos profundos. Se distribuyó una solución de Glucosa al 20% (represor) o Galactosa al 20% (inductor) mediante asignadores de 50 \mul a cada pocillo para producir una concentración final del 2%. Se añadió homoserina lactona (hsl) a diversas concentraciones a partir de una solución madre con una concentración 100 mM en DMSO al 100%. Se suplementaron muestras control sin hsl con volúmenes iguales de DMSO al 100%.
Las placas se pusieron a 30ºC sobre un agitador de placas de titulación fijado a una velocidad 8 durante 5 horas antes de retirar 100 \mul de cada pocillo para la medición de la A_{600}. Los restantes 400 \mul de células se lisaron añadiendo 200 \mul de 3 X solución de lisis (3X solución madre: Fosfato de Potasio 50 mM (pH 7,8), Triton X-100 al 0,1%, 1 mg/ml de CTAB, 1 mg/ml de Desoxicolato de Sodio, DTT 1 mM) y se pusieron a 4ºC durante toda una noche sobre un agitador de placas de titulación fijado a velocidad 8.
El día siguiente, las placas se llevaron a temperatura ambiente y se pipetearon alícuotas de 75 \mul de células en placas de microensayo de 96 pocillos negras que contenían 75 \mul de 2X solución de sustrato (Tropix, Inc., Bedford, MA), y se calentó hasta temperatura ambiente. Las células lisadas y la solución de sustrato se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos antes de que se midiera la emisión de luz usando un contador multitécnica Víctor®.
La proteína restante (525 \mul) se recogió en el sobrenadante después de la centrifugación (centrífuga de placas 4K15 Sigma®, 6.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC). Se midió la concentración de proteína usando un Equipo de Ensayo de Proteína Pierce BCA-200 mezclando 25 \mul de sobrenadante con 200 \mul del reactivo operativo BCA en una placa de microensayo transparente de 96 pocillos. La mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos antes de que se midiera la A_{562}. Un blanco que contenía 1X solución de lisis se restó de las lecturas de las muestras y se determinó la concentración de proteína usando una curva patrón a partir de muestras de BSA medidas en el mismo ensayo.
Se midió la emisión de luz como cuentas por segundo (CPS). Se promedió una fila de lecturas blanco de CPS obtenidas a partir de una mezcla constituida por 1 X solución de lisis y 1 X solución de sustrato y se restó de cada lectura de CPS de ensayo. Se dividió las CPS entre la proteína total calculada a partir del ensayo BCA para dar la actividad \beta-galactosidasa (CPS/mg de proteína). Para obtener el aumento en nº de veces entre las muestras, éstas se dividieron entre el nivel basal de actividad \beta-galactosidasa observado en la cepa control (204142B) bajo condiciones represivas.
Los resultados de inducibilidad del gen reportero se muestran en la Figura 26. Se observó una fuerte inducción en presencia de C8-HSL cuando se dejaron crecer células de levadura sobre galactosa, mientras que en ausencia del inductor, o TraR (células cultivadas sobre glucosa), la actividad estaba por debajo de los límites de detección (indistinguible de cepas que carecían de TraR y/o de gen reportero lacZ conjuntamente). Se ensayaron extractos celulares de dos líneas independientes (cepa YPH499, cl. 5 y 6) que contenían el gen reportero \beta-galactosidasa conducido por un promotor mínimo con 3 copias del elemento TraA8 para evaluar la actividad \beta-gal usando un ensayo quimioluminiscente y demostraron una fuerte inducción después de 5 horas de cultivo sobre galactosa en presencia de C8-HSL 50 \muM. En ausencia de AHL o TraR (5 horas de cultivo sobre glucosa), la actividad detectada en los extractos era tan baja como en la cepa YPH499 que carecía del gen reportero LacZ.
Ejemplo 8 Síntesis de Análogos de AHL
Se prepararon \beta-cetoésteres mediante un procedimiento reseñado previamente (Wierenga, y col. (1979) J. Org. Chem. 44(2):310-311).
Procedimiento General para la Preparación de 2-Azidobutirolactonas: Las 2-bromobutirolactonas se prepararon de acuerdo con un procedimiento previamente reseñado y se usaron sin purificación adicional (2). 2-Bromobutirolactona bruta (20-50 mmoles) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (20-40 ml). Se añadieron un catalizador de transferencia de fase (Aliquat®336, 10-20 gotas) y una solución de azida sódica (4,8 equivalentes) disuelta en agua (30-60 ml) a la solución de CH_{2}Cl_{2}. La bifase se agitó enérgicamente durante 16-28 horas, después se añadió agua (50-75 ml) y la fase orgánica se separó. La fase acuosa se lavó con CH_{2}Cl_{2} (3 x 40 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron proporcionando un líquido amarillo. Se observaron los cuatro diastereoisómeros. Los productos brutos se purificaron y los isómeros cis se separaron de los isómeros trans mediante cromatografía sobre gel de sílice.
2(S)-Azido-2-metilbutirolactona y 2(R)-Azido-2-metilbutirolactona: La reacción de azidación se llevó a cabo con 2-bromo-2-metilbutirolactona (31,2 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 7:93) proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (2,1 g, 47%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,32 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 1,62 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 175,0, 65,1, 61,1, 35,3, 19,7.
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2-Azido-3-metilbutirolactonas: 3-Metilbutirolactona, requerida para la preparación de la correspondiente bromolactona, se preparó tal y como se ha reseñado previamente (3,4), con la excepción de que se usó metanol en lugar de etanol en la reacción de hidrogenación (Nota: el producto bruto contenía una cantidad significativa del éster metílico del producto de anillo abierto que surge a partir de la adición de metanol a la lactona. Este producto secundario, sin embargo, se convirtió cuantitativamente en el producto deseado durante la destilación). La reacción de azidación se llevó a cabo con 2-bromo-3-metilbutirolactona (19,6 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 15:85) proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (1,52 g, 55%, cis:trans (aislado) = 1:1,5). Isómeros cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,36 (dd, J = 9,1, 6,2 Hz, 1H), 4,28 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,02 (dd, J = 9,1, 4,3 Hz, 1H), 2,75 (m, 1H), 1,12 (d, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,9, 72,3, 60,4, 34,4, 12,2. Isómero trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,47 (dd, J = 9,1, 7,8 Hz, 1H), 3,85 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,84 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 2,46 (m, 1H), 1,24 (d, J = 6,7 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 173,2, 71,2, 63,3, 37,3, 14,6.
2-Azido-4-metilbutirolactonas: La reacción de azidación se llevó a cabo con 2-bromo-4-metilbutirolactona (Aldrich, 23,7 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexa-
no, 15:85) proporcionando los productos cis en forma de un sólido cristalino de color blanco y los productos trans en forma de un líquido incoloro (2,8 g, 83%, cis:trans (aislado) = 1,8:1). Isómeros cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,56 (m, 1H), 4,36 (dd, J = 11,0, 8,6 Hz, 1H), 2,69 (ddd, J = 13,0, 8,5, 5,3 Hz, 1H), 1,76 (dt, J = 12,9, 10,5 Hz, 1H), 1,47 (d, J = 6,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 173,1, 74,3, 58,1, 36,5, 20,7. Isómeros trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,76 (m, 1H), 4,33 (dd, J = 8,1, 5,6 Hz, 1H), 2,27 (ddd, J = 13,4, 7,0, 6,1 Hz, 1H), 2,13 (ddd, J = 13,7, 8,1, 5,8 Hz, 1H), 1,42 (d, J = 6,4 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,9, 75,5, 57,4, 35,6,
20,9.
2-Azido-4-etilbutirolactonas: La reacción de azidación se llevó a cabo con 2-bromo-4-etilbutirolactona (43,0 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 10:90) proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (3,2 g, 47%, cis:trans (aislado) = 2,8:1). Isómeros cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,37 (m, 1H), 4,35 (dd, J = 11,1, 8,7 Hz, 1H), 2,64 (ddd, J = 12,9, 8,7, 5,5 Hz, 1H), 1,74 (m, 3H), 1,02 (t, J = 7,5 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 173,1, 79,1, 57,8, 34,4, 28,2, 9,1. Isómeros trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,55 (m, 1H), 4,30 (dd, J = 8,1, 6,2 Hz, 1H), 2,23 (ddd, J = 13,7, 7,3, 6,4 Hz, 1H), 2,17 (ddd, J = 14,0, 8,2, 5,6 Hz, 1H), 1,85-1,58 (m, 2H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,9, 80,4, 57,2, 33,5, 28,2, 9,3.
2-Azido-4-butilbutirolactonas: La reacción de azidación se llevó a cabo con 2-bromo-4-butilbutirolactona (31,6 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 10:90) proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (2,9 g, 50%, cis:trans (aislado) = 3,1:1). Isómeros cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,42 (m, 1H), 4,36 (dd, J = 11,0, 8,6 Hz, 1H), 2,66 (ddd, J = 13,4, 8,1, 4,7 Hz, 1H), 1,82-1,72 (m, 1H), 1,77 (dt, J = 13,2, 10,6 Hz, 1H), 1,65 (m, 1H), 1,49-1,30 (m, 4H), 0,92 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 173,1, 77,9, 57,8, 34,83, 34,80, 26,9, 22,2, 13,7. Isómeros trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 4,60 (m, 1H), 4,29 (dd, J = 8,1, 5,9 Hz, 1H), 2,23 (ddd, J = 13,4, 7,1, 6,1 Hz, 1H), 2,15 (ddd, J = 13,8, 8,0, 5,8 Hz, 1H), 1,77-1,55 (m, 2H), 1,48-1,30 (m, 4H), 0,92 (t, J = 7,1 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,9, 79,2, 57,2, 35,0, 34,1, 27,2, 22,2, 13,7.
2-Azido-4-fenilbutirolactonas: La reacción de azidación se llevó a cabo con 2-bromo-4-fenilbutirolactona (21,7 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 15:85) proporcionando los productos en forma de líquidos incoloros (2,4 g, 54%, cis:trans (aislado) = 3,7:1). Isómeros cis : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,42-7,32 (m, 5H), 5,39 (dd, J = 10,6, 5,5 Hz, 1H), 4,49 (dd, J = 11,3, 8,6 Hz, 1H), 2,94 (ddd, J = 13,2, 8,3, 5,3 Hz, 1H), 2,12 (dt, J = 12,9, 11,0 Hz, 1H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,8, 137,3, 129,1, 128,9, 125,7, 78,3, 58,1, 37,3. Isómeros trans : ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,43-7,26 (m, 5H), 5,64 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 7,7, 6,0 Hz, 1H), 2,55 (ddd, J = 13,4, 7,0, 6,3 Hz, 1H), 2,48 (ddd, J = 13,6, 7,7, 6,0 Hz, 1H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 172,7, 138,0, 128,9, 128,8, 125,0, 79,2, 57,0, 36,8.
Procedimiento General para la Preparación de Clorhidratos de Homoserina Lactonas: (Nota: Las 2-Azido-4-fenilbutirolactonas no se redujeron usando este procedimiento). La 2-azidobutirolactona correspondiente (2-20 mmoles) disuelta en metanol (2-10 ml/mmol, típicamente 5 ml/mmol), HCl concentrado (10-30 gotas), y Pd al 10%/C (seco, 3-10% en moles, típicamente 5% en moles) se agitaron en atmósfera de H_{2} durante 24 horas o hasta que el análisis por TLC indicó que no quedaba azida de partida. La reacción se filtró a través de celita y se concentró a vacío retirando el metanol. Los productos brutos se disolvieron en HCl 4N (generalmente 1 ml/mmol), después se congelaron y se liofilizaron proporcionando los productos en forma de sólidos de color blanco o blanquecino.
Clorhidratos de 2-Metil-(S)-homoserina lactona y 2-metil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-2-metilhomoserina lactona (6,1 mmoles, isómeros cis) proporcionando los productos en forma de un sólido hidroscópico de color blanquecino (1,21 g, 131%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,56 (td, J = 9,5, 1,9 Hz, 1H), 4,46 (td, J = 9,9, 6,4 Hz, 1H), 2,64 (dt, J = 12,9, 9,8 Hz, 1H), 2,52 (ddd, J = 13,0, 6,5, 1,7 Hz, 1H), 1,64 (s, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 176,2, 66,8, 56,8, 34,4, 20,8.
Clorhidratos de 3(R)-Metil-(S)-homoserina lactona y 3(S)-metil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-3-metilhomoserina lactona (3,3 mmoles, isómeros cis) proporcionando los productos en forma de un sólido hidroscópico de color ámbar (500 mg, 101%). La estereoquímica se asignó en base al trabajo previo (5). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,53 (m, 2H), 4,18 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 3,01 (m, 1H), 1,16 (d, J = 7,3 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,5, 74,2, 53,3, 33,9, 13,0.
Clorhidratos de 3(S)-Metil-(S)-homoserina lactona y 3(R)-metil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-3-metilhomoserina lactona (2,2 mmoles, isómeros trans) proporcionando los productos en forma de un sólido de color blanquecino (290 mg, 87%). La estereoquímica se asignó en base al trabajo previo (5). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,56 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 4,03 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 3,96 (t, J = 9,7 Hz, 1H), 2,74 (m, 1H), 1,31 (d, J = 6,5 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,8, 72,9, 55,8, 37,1, 14,0.
Clorhidratos de 4(S)-Metil-(R)-homoserina lactona y 4(R)-metil-(S)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-4-metilhomoserina lactona (10,4 mmoles, isómeros cis) proporcionando los productos en forma de un sólido de color blanquecino (1,6 g, 102%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,85 (m, 1H), 4,54 (dd, J = 12,0, 8,7 Hz, 1H), 2,94 (ddd, J = 12,8, 8,4, 4,8 Hz, 1H), 2,07 (c, J = 11,8 Hz, 1H), 1,50 (d, J = 6,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 174,1, 77,3, 50,2, 34,6, 19,7.
Clorhidratos de 4(S)-Metil-(S)-homoserina lactona y 4(R)-metil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-4-metilhomoserina lactona (6,2 mmoles, isómeros trans) proporcionando los productos en forma de un sólido de color blanquecino (910 mg, 98%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,87 (m a, 1H), 4,42 (t a, J = 9,4 Hz, 1H), 2,40 (m a, 2H), 1,28 (d a, J = 4,8 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 174,3, 77,5, 48,2, 32,1,
20,1.
Clorhidratos de 4(S)-Etil-(R)-homoserina lactona y 4(R)-etil-(S)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-4-etilhomoserina lactona (7,9 mmoles, isómeros cis) proporcionando los productos en forma de un sólido de color blanco (1,3 g, 97%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,55 (m, 1H), 4,43 (dd, J = 12,1, 8,9 Hz, 1H), 2,82 (ddd, J = 12,4, 8,6, 5,1 Hz, 1H), 1,96 (td, J = 12,2, 10,5 Hz, 1H), 1,79 (m, 2H), 1,04 (t, J = 7,5 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,4, 81,3, 50,8, 34,1, 28,9, 9,5.
Clorhidratos de 4(S)-Etil-(S)-homoserina lactona y 4(R)-etil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-4-etilhomoserina lactona (4,9 mmoles, isómeros trans) proporcionando los productos en forma de un sólido hidroscópico de color blanquecino (760 mg, 94%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,69 (m, 1H), 4,43 (t, J = 9,8 Hz, 1H), 2,52 (m, 2H), 1,75 (m, 2H), 1,02 (t, J = 7,4 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,6, 81,8, 49,0, 31,8, 29,1, 9,9.
Clorhidratos de 4(S)-Butil-(R)-homoserina lactona y 4(R)-butil-(S)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-4-butilhomoserina lactona (12,0 mmoles, isómeros cis) proporcionando los productos en forma de un sólido de color blanco (2,1 g, 91%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,61 (m, 1H), 4,42 (dd, J = 12,1, 8,6 Hz, 1H), 2,82 (ddd, J = 12,3, 8,7, 5,1 Hz, 1H), 1,96 (td, J = 12,1, 10,7 Hz, 1H), 1,85-1,66 (m, 2H), 1,54-1,29 (m, 4H), 0,95 (t, J = 7,1 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,4, 80,2, 50,8, 35,7, 34,6, 28,3, 23,4, 14,2.
Clorhidratos de 4(S)-Butil-(S)-homoserina lactona y 4(R)-butil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-4-butilhomoserina lactona (3,9 mmoles, isómeros trans) proporcionando los productos en forma de un sólido hidroscópico de color blanquecino (690 mg, 92%). ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 4,74 (m, 1H), 4,42 (t, J = 9,8 Hz, 1H), 2,49 (m, 2H), 1,86-1,63 (m, 2H), 1,54-1,28 (m, 4H), 0,95 (t, J = 6,9 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,6, 80,6, 53,6, 35,8, 32,2, 28,6, 23,3, 14,2.
Clorhidratos de 4(S)-Fenil-(R)-homoserina lactona y 4(R)-fenil-(S)-homoserina lactona: Los compuestos sustituidos con fenilo se redujeron mediante el procedimiento descrito por Bloch y colaboradores (6). La reacción se llevó a cabo usando 2-azido-4-fenilhomoserina lactona (8,8 mmoles, isómeros cis, adición/agitación durante 0,75 horas, calentamiento durante 2 horas) proporcionando los productos en forma de un sólido de color blanco (2,3 g, 117%). Los productos también contenían las impurezas PPh_{3} y P(O)Ph_{3} según se determinó mediante espectroscopía de RMN. La integración de los productos y las impurezas indicó que la mezcla era del 65,9% en peso de los productos (1,6 g, 85% de rendimiento de producto) y se usaron sin purificación adicional. ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 7,66-7,39 (m, 5H), 5,62 (dd, J = 10,8, 5,4 Hz, 1H), 4,62 (dd, J = 12,1, 8,6 Hz, 1H), 3,11 (ddd, J = 12,5, 8,5, 5,2 Hz, 1H), 2,33 (td, J = 12,2, 11,0 Hz, 1H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,2, 138,8, 130,0, 129,9, 127,3, 80,7, 51,2, 37,1.
Clorhidratos de 4(S)-Fenil-(S)-homoserina lactona y 4(R)-fenil-(R)-homoserina lactona: Los compuestos sustituidos con fenilo se redujeron mediante el procedimiento descrito por Bloch y colaboradores (6). La reducción se llevó a cabo usando 2-azido-4-fenilhomoserina lactona (2,4 mmoles, isómeros trans, adición/agitación durante 3,5 horas, calentamiento durante 3 horas) proporcionando los productos en forma de un sólido de color blanco (680 mg, 135%). Bajo estas condiciones, se observó racemización en la posición 2 proporcionando una mezcla 2:1 de los isómeros trans:cis. Los productos también contenían las impurezas PPh_{3} y P(O)Ph_{3} según se determinó mediante espectroscopía de RMN. La integración de los productos y las impurezas indicó que la mezcla era del 73,2% en peso de los productos (498 mg, 99% de rendimiento de producto) y se usaron sin purificación adicional. ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD) \delta 7,66-7,39 (m, 5H), 5,87 (dd, J = 8,5, 2,6 Hz, 1H), 4,42 (t, J = 9,7 Hz, 1H), 2,88 (ddd, J = 13,3, 10,2, 8,5 Hz, 1H), 2,80 (ddd, J = 13,0, 9,6, 3,2 Hz, 1H); ^{13}C RMN (100 MHz, CD_{3}OD) \delta 173,5, 139,8, 130,1, 129,8, 126,3, 80,2, 51,2, 34,8.
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Procedimiento General para la preparación de N-Acilhomoserina lactonas: Una mezcla del éster etílico (1-5 mmoles) e hidróxido sódico al 5% (1,7 equivalentes) se agitó a 35ºC durante 1-1,5 horas y después se añadió a diclorometano (75-100 ml). La mezcla se enfrió en un baño de hielo, se agitó enérgicamente, después se añadió gota a gota ácido clorhídrico concentrado (1,8 equivalentes) (Nota: un exceso significativo de ácido o de calor da como resultado la descarboxilación de los productos ácido b-cetocarboxílico). La fase de diclorometano se separó, se secó (MgSO_{4}), y se concentró al vacío a temperatura ambiente. El residuo sólido de color blanco se recogió en THF anhidro (10-15 ml) y se añadió a una suspensión agitada de bromhidrato o clorhidrato de homoserina lactona (0,8 equivalentes), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (0,9 equivalentes), y diisopropil etilamina (1,8 equivalentes) en THF anhidro (15 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18-24 horas. La solución resultante se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo y de nuevo se concentró proporcionando un aceite de color ámbar. El producto bruto se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice proporcionando un sólido de color blanco. En la mayoría de los casos, se requirieron dos separaciones cromatográficas para obtener el material puro.
N-(\beta-Cetooctanoil)-2-metil-(S)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-2-metil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (3,3 mmoles) y clorhidrato de 3-metilhomoserina lactona (2,6 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía sobre gel de sílice radial en dos ejecuciones secuenciales (AcOEt:hexano, 1:1 después AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 25:75) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (37 mg, 6%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,70 (s a, 1H), 4,50 (td, J = 9,4, 2,4 Hz, 1H), 4,25 (td, J = 9,3, 7,4 Hz, 1H), 3,45 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 3,22 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,28 (ddd, J = 12,8, 7,3, 2,6 Hz, 1H), 1,60-1,50 (m, 2H), 1,53 (s, 3H), 1,36-1,21 (m, 4H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,8, 177,1, 165,6, 65,2, 55,6, 48,2, 43,7, 34,2, 31,0, 22,9, 22,5, 22,3, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}: 256,1549. Encontrado: 256,1562.
N-(\beta-Cetooctanoil)-3(S)-metil-(R)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-3(R)-metil-(S)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (2,6 mmoles) y clorhidrato de 3-metilhomoserina lactona (1,9 mmoles, isómeros cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice seguido de cromatografía sobre gel de sílice radial (AcOEt:hexano, 1:1; después AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:3) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (100 mg, 22%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,73 (d a, J = 5,1 Hz, 1H), 4,77 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 4,43 (dd, J = 9,1, 5,1 Hz, 1H), 4,11 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,50 (s, 2H), 2,98 (m, 1H), 2,54 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,64-1,56 (m, 2H), 1,36-1,24 (m, 4H), 1,01 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,1, 174,6, 166,5, 72,6, 53,1, 48,3, 43,8, 33,8, 31,1, 28,1, 23,0, 22,3, 13,8, 12,8; EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}: 256,1549. Encontrado: 256,1550.
N-(\beta-Cetooctanoil)-3(S)-metil-(S)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-3(R)-metil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (2,4 mmoles) y clorhidrato de 3-metilhomoserina lactona (1,8 mmoles, isómeros trans). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice seguido de cromatografía sobre gel de sílice radial (AcOEt:hexano, 1:1) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (260 mg, 43%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,57 (d a, J = 7,8 Hz, 1H), 4,45 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 4,38 (dd, J = 11,6, 8,1 Hz, 1H), 3,85 (dd, J = 10,7, 9,1 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H), 2,61 (m, 1H), 2,54 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,63-1,56 (m, 2H), 1,35-1,23 (m, 4H), 1,21 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,6, 174,6, 166,6, 71,4, 55,2, 48,3, 43,7, 37,8, 31,1, 28,1, 23,0, 22,3, 14,7, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}: 256,1549. Encontrado: 256,1551.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-metil-(S)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-metil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (0,95 mmoles) y clorhidrato de 4-metilhomoserina lactona (0,40 mmoles, isómeros cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía sobre gel de sílice radial dos veces (usando en primer lugar AcOEt:hexano, 3:2; después usando iPrOH:CH_{2}Cl_{2}, 1:20) proporcionando el producto en forma de un líquido incoloro transparente (67 mg, 71%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,55 (d a, J = 5,4 Hz, 1H), 4,62 (ddd, J = 12,2, 8,4, 6,8 Hz, 1H), 4,49 (m, 1H), 3,39 (s, 2H), 2,78 (ddd, J = 12,6, 8,1, 4,8 Hz, 1H), 2,45 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,74 (td, J = 12,1, 10,9 Hz, 1H), 1,52 (m, 2H), 1,40 (d, J = 6,2 Hz, 3H), 1,30-1,15 (m, 4H), 0,82 (t, J = 6,7 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,5, 174,4, 166,3, 74,6, 50,7, 48,2, 43,8, 37,8, 31,1, 23,0, 22,3, 20,6, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}: 256,1549. Encontrado: 256,1539.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-metil-(R)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-metil-(S)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (0,58 mmoles) y clorhidrato de 4-metilhomoserina lactona (0,43 mmoles, isómeros trans). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía sobre gel de sílice radial dos veces (usando en primer lugar AcOEt:CH_{2}Cl_{2}:hexano, 6:1:3; después usando iPrOH:AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:1:20) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (31 mg, 27%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,60 (d a, J = 5,6 Hz, 1H), 4,77 (m, 1H), 4,59 (td, J = 9,7, 6,7 Hz, 1H), 3,39 (s, 2H), 2,45 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,39-2,22 (m, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,36 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 1,30-1,15 (m, 4H), 0,82 (t, J = 7,1 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,7, 174,5, 166,2, 74,8, 48,3, 48,0, 43,9, 35,4, 31,1, 23,0, 22,4, 21,3, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{22}NO_{4}: 256,1549. Encontrado: 256,1556.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-etil-(S)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-etil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (3,2 mmoles) y clorhidrato de 4-etilhomoserina lactona (2,4 mmoles, isómeros cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice seguido de cromatografía sobre gel de sílice radial (AcOEt:hexano, 1:1; después AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 10:90) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (310 mg, 48%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,62 (d a, J = 6,2 Hz, 1H), 4,69 (ddd, J = 12,1, 8,3, 6,7 Hz, 1H), 4,38 (m, 1H), 3,47 (s, 2H), 2,80 (ddd, J = 12,4, 8,3, 5,0 Hz, 1H), 2,53 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,88-1,55 (m, 6H), 1,36-1,22 (m, 4H), 1,01 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,4, 174,5, 166,3, 79,4, 50,4, 48,3, 43,7, 35,6, 31,1, 28,1, 23,0, 22,3, 13,8, 9,1; EMAR Calculado para M+H C_{14}H_{24}NO_{4}: 270,1705. Encontrado: 270,1692.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-etil-(R)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-etil-(S)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (2,4 mmoles) y clorhidrato de 4-etilhomoserina lactona (1,8 mmoles, isómeros trans). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt:hexano, 1:1) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (300 mg, 62%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,70 (d a, J = 6,4 Hz, 1H), 4,60 (m, 2H), 3,46 (s, 2H), 2,53 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,35-2,27 (m, 1H), 1,80-1,55 (m, 6H), 1,36-1,22 (m, 4H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,5, 174,8, 166,3, 79,9, 48,4, 48,2, 43,7, 33,4, 31,1, 28,4, 23,0, 22,3, 13,8, 9,5; EMAR Calculado para M+H C_{14}H_{24}NO_{4}: 270,1705. Encontrado: 270,1700.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-butil-(S)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-butil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (1,0 mmoles) y clorhidrato de 4-butilhomoserina lactona (1,2 mmoles, isómeros cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}:hexano, 3:2:5) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (204 mg, 68%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,59 (d a, J = 5,6 Hz, 1H), 4,66 (ddd, J = 12,1, 8,2, 6,6 Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 3,46 (s, 2H), 2,83 (ddd, J = 12,6, 8,2, 4,7 Hz, 1H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,86-1,74 (m, 3H), 1,72-1,54 (m, 2H), 1,50-1,20 (m, 8H), 0,92 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,5, 174,4, 166,2, 78,3, 50,4, 48,1, 43,9, 36,3, 34,8, 31,1, 27,1, 23,0, 22,3, 13,9, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{16}H_{28}NO_{4}: 298,2018. Encontrado: 298,2016.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-butil-(R)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-butil-(S)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (2,3 mmoles) y clorhidrato de 4-butilhomoserina lactona (1,1 mmoles, isómeros trans). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}:hexano, 3:2:5) dos veces proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (210 mg, 64%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,64 (d a, J = 6,2 Hz, 1H), 4,63 (m, 2H), 3,46 (s, 2H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,46 (ddd, J = 12,8, 9,7, 2,8 Hz, 1H), 2,29 (ddd, J = 13,0, 10,1, 8,5 Hz, 1H), 1,78-1,66 (m, 1H), 1,66-1,54 (m, 3H), 1,48-1,22 (m, 8H), 0,91 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,7, 174,6, 166,1, 78,6, 48,4, 47,9, 43,9, 35,1, 34,0, 31,1, 27,4, 23,0, 22,35, 22,29, 13,9, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{16}H_{28}NO_{4}: 298,2018. Encontrado: 298,2024.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-fenil-(S)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-fenil-(R)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (1,3 mmoles) y clorhidrato de 4-fenilhomoserina lactona (1,2 mmoles, isómeros cis). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:9) dos veces proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (273 mg, 71%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,77 (d a, J = 6,2 Hz, 1H), 7,40-7,35 (m, 5H), 5,41 (dd, J = 11,0, 5,4 Hz, 1H), 4,80 (ddd, J = 12,1, 8,2, 6,9 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H), 3,07 (ddd, J = 12,6, 8,3, 5,4 Hz, 1H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,24 (c, J = 11,9 Hz, 1H), 1,62-1,55 (m, 2H), 1,36-1,21 (m, 4H), 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,5, 174,0, 166,3, 137,8, 128,9, 128,8, 125,9, 78,8, 50,8, 48,1, 43,8, 38,2, 31,1, 23,0, 22,3, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{18}H_{24}NO_{4}: 318,1705. Encontrado: 318,1707.
N-(\beta-Cetooctanoil)-4(R)-fenil-(R)-homoserina lactona y N-(\beta-Cetooctanoil)-4(S)-fenil-(S)-homoserina lactona: La reacción se llevó a cabo con 3-oxooctanoato de etilo (1,0 mmoles) y clorhidrato de 4-fenilhomoserina lactona (1,1 mmoles, trans:cis = 2:1). La purificación y separación de los isómeros trans se llevó a cabo mediante cromatografía sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:9) tres veces proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (144 mg, 41%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,77 (d a, J = 6,7 Hz, 1H), 7,41-7,28 (m, 5H), 5,75 (dd, J = 8,3, 2,7 Hz, 1H), 4,58 (td, J = 9,6, 6,8 Hz, 1H), 3,47 (s, 2H), 2,77 (ddd, J = 12,7, 9,3, 3,2 Hz, 1H), 2,68 (ddd, J = 12,9, 10,1, 8,5 Hz, 1H), 2,52 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,63-1,55 (m, 2H), 1,36-1,22 (m, 4H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 206,7, 174,6, 166,2, 139,0, 128,9, 128,4, 124,9, 78,4, 48,2, 48,0, 43,9, 36,4, 31,1, 23,0, 22,3, 13,8; EMAR Calculado para M+H C_{18}H_{24}NO_{4}: 318,1705. Encontrado: 318,1695.
N-(\alpha-Metil-\beta-cetooctanoil)-(S)-homoserina: La reacción se llevó a cabo con 2-metil-3-oxooctanoato de etilo (0,57 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina lactona (0,85 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:4; después iPrOH:CH_{2}Cl_{2}, 1:20) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (69 mg, 47%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,95 (s a, 1H), 4,57-4,44 (m, 2H), 4,30-4,22 (m, 1H), 3,50-3,42 (m, 1H), 2,81-2,70 (m, 1H), 2,58-2,52 (m, 2H), 2,25-2,10 (m, 1H), 1,60-1,52 (m, 2H), 1,45-1,38 (m, 3H), 1,25-1,19 (m, 4H), 0,87 (t, J = 7,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 210,56, 210,52, 175,73, 175,72, 171,42, 171,39, 66,91, 66,86, 54,59, 54,55, 50,26, 50,19, 42,79, 42,54, 32,2, 30,9, 24,0, 23,4, 16,33, 16,25, 14,9; EMAR Calculado para M+H C_{13}H_{21}NO_{4}: 256,1549. Encontrado: 256,1560.
N-(\alpha,\alpha-Dimetil-\beta-cetooctanoil)-(S)-homoserina: Después de la hidrólisis del éster la reacción se llevó a cabo con ácido 2,2-dimetil-3-oxooctanoico (0,46 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina lactona (0,85 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:4; después CH_{2}Cl_{2}:AcOEt:hexano, 1:1:3) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (51 mg, 41%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,45 (s a, 1H), 4,53-4,43 (m, 2H), 4,32-4,23 (m, 1H), 2,81-2,72 (m, 1H), 2,52 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,21-2,09 (m, 1H), 1,60-1,51 (m, 2H), 1,41 (d, J = 2,4 Hz, 6H), 1,30-1,19 (m, 4H), 0,87 (t, J = 7,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 211,1, 174,9, 173,2, 66,0, 55,7, 49,5, 38,3, 31,4, 29,9, 23,5, 22,7, 22,6, 14,0; EMAR Calculado para M+H C_{14}H_{23}NO_{4}: 270,1705. Encontrado: 270,1700.
N-(\alpha-Etil-\beta-cetooctanoil)-(S)-homoserina: Después de la hidrólisis del éster la reacción se llevó a cabo con ácido 2-etil-3-oxooctanoico (0,81 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina lactona (0,77 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice radial (AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:4; después AcOEt:hexano, 1:1) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (155 mg, 74%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,97 (d a, J = 35,5 Hz, 1H), 4,58-4,50 (m, 1H), 4,50-4,42 (m, 1H), 4,30-4,21 (m, 1H), 3,37 (c, J = 8,0 Hz, 1H), 2,81-2,68 (m, 1H), 2,58-2,50 (m, 2H), 2,23-2,10 (m, 1H), 1,98-1,80 (m, 2H), 1,62-1,52 (m, 4H), 1,36-1,20 (m, 4H), 0,96 (c, J = 5,6 Hz, 3H), 0,87 (t, J = 7,2 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 209,90, 209,83, 174,7, 169,6, 169,5, 66,0, 65,9, 61,3, 61,2, 49,3, 49,2, 43,2, 42,9, 31,3, 30,05, 30,01, 24,96, 24,94, 23,0, 22,5, 14,0, 11,93, 11,90; EMAR Calculado para M+H C_{14}H_{23}NO_{4}: 270,1705. Encontrado: 270,1692.
N-(\alpha-Butil-\beta-cetooctanoil)-(S)-homoserina: Después de la hidrólisis del éster la reacción se llevó a cabo con ácido 2-butil-3-oxooctanoico (0,23 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina lactona (0,36 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice radial (AcOEt:hexano, 1:1; después AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:4) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (36 mg, 52%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,89 (d a, J = 35,5 Hz, 1H), 4,56-4,41 (m, 2H), 4,33-4,21 (m, 1H), 3,42 (c, J = 7,4 Hz, 1H), 2,80-2,70 (m, 1H), 2,56-2,48 (m, 2H), 2,22-2,08 (m, 1H), 1,96-1,72 (m, 2H), 1,63-1,50 (m, 2H), 1,38-1,20 (m, 8H), 0,93-0,84 (m, 6H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 207,2, 207,1, 174,8, 169,69, 169,62, 66,0, 65,9, 60,82, 60,80, 49,4, 49,3, 31,6, 30,85, 30,83, 29,9, 29,8, 29,6, 29,14, 29,13, 27,38, 27,36, 22,6, 14,1; EMAR Calculado para M+H C_{16}H_{27}NO_{4}: 298,2018. Encontrado: 298,2020.
N-(\alpha-Hexil-\beta-cetobutanoil)-(S)-homoserina: Después de la hidrólisis del éster la reacción se llevó a cabo con ácido 2-hexil-3-oxobutanoico (0,83 mmoles) y bromhidrato de (S)-homoserina lactona (0,65 mmoles). La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice radial (AcOEt:hexano, 1:1; después AcOEt:CH_{2}Cl_{2}, 1:3) proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (147 mg, 84%). ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,87 (d a, J = 21,3 Hz, 1H), 4,58-4,43 (m, 2H), 4,30-4,22 (m, 1H), 3,40 (c, J = 8,0 Hz, 1H), 2,80-2,70 (m, 1H), 2,25 (d, J = 2,4 Hz, 3H), 2,23-2,12 (m, 1H), 1,91-1,78 (m, 2H), 1,35-1,20 (m, 6H), 0,92-0,82 (m, 3H), 0,85 (t, J = 6,8 Hz, 3H); ^{13}C RMN (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 209,8, 174,7, 169,7, 169,6, 66,0, 65,9, 65,32, 65,30, 65,2, 60,0, 49,3, 49,2, 43,2, 42,9, 31,35, 31,33, 31,27, 31,24, 30,0, 29,6, 29,5, 23,1, 22,5, 14,0, 13,9.
La estructura genérica de la molécula de AHL y las sustituciones realizadas a la estructura se proporcionan en la Figura 27.
Ejemplo 9 Análisis de los Análogos de AHL
Se preparan protoplastos de zanahoria tal y como se ha descrito en el ejemplo 4A anterior.
Se transfectaron protoplastos de zanahoria con la construcción del reportero TraA8 (4X)- GUS con el gen activador 35S-VP16-TraR y se ensayó en ellos la inducción de GUS mediante la aplicación de AHL de tipo silvestre y los diversos análogos de AHL descritos en el Ejemplo 8.
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(Tabla pasa a página siguiente)
17
18
TABLA 9 Ensayos transitorios en protoplastos de zanahoria de análogos de AHL
19
La actividad \beta-galactosidasa en protoplastos de zanahoria inducidos y no inducidos que contienen las construcciones del gen reportero TraA8(4X)-GUS y del gen activador 35S-VP16-TraR inducida usando diversos análogos de AHL mostrados en las Tablas 8 y 9 se proporciona en forma gráfica en las Figuras 28 y 29.
<110> Calgene LLC
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<120> Control de la Expresión génica en células eucariotas
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<130> 15376/00/WO
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<150> 60/148,441
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<151> 01-07-1999
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<150> 60/177,578
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<151> 22-01-2000
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<150> 60/195,690
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<151> 07-04-2000
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<160> 57
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<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 1
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acctgtagga tcgtacaggt 
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20 
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<210> 2
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<221> misc_feature
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<222> (1)...(18)
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 2
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rnstgyagat ntrcasrt 
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18 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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acctgtagga tcgtacaggt 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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gaatggatca ttttgcaggt 
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20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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acctgccagt tctggcaggt 
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20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 6
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acctgcacta tagtacaggc 
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20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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ccctgtcaat cctgacagtt 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucléotido Sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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atgtgcagat ctgcacat 
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 16
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atgagcagat ctgctcat 
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18 
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<210> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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atgtccagat ctggacat 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 18
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<212> ADN
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atgtgaagat cttcacat 
\hfill
18 
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<212> ADN
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atgtgcggat ccgcacat 
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<223> Oligonucleótido Sintético
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atgtgcaaat ttgcacat 
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atgtgcagta ctgcacat 
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18 
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17 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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<220>
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aacttaacct gccagttctg gcaggtaaca 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\hfill
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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aacttaacct gtaggatcgt acaggtaaca 
\hfill
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<220>
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\hfill
30 
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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aacttaacct gcactatagt acaggtaaca 
\hfill
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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aacttaacgt gcagatctgc acataaca 
\hfill
28 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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aacttaacgt gcagatctgc acataaca 
\hfill
28 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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aacttaacct gccagttctg gcaggtaaca 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacttaacct gccagttctg gcaggtaaca 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaaaaagat aaatgccgac gacacataca gaa 
\hfill
33 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 37
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctttatcg atgtacttaa tttttaaagt atgg 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagcccata tgttttcttt tttccttgaa aat 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Olígonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtacgatc gatccgcccg tcgcagtcac tac 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtagccatat ggccttggtt gacggttttc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcgatctg agaggcaaga tcagagagta 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttactcata tgaggaatga cggaggcttt 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcgcttca gatgaggccc agcgccgcgg 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
catatgcagc actggctgg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 45
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gtcgacctca gatgagtttc cg 
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22 
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<210> 46
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<223> epítope de hemaglutinina de la gripe
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<400> 46
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\sa{Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala His}
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<210> 47
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 47
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aattgtagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacc 
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44 
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<210> 48
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 48
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catgggtata tctccttctt aaagttaaac aaaattattt ctac 
\hfill
44 
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<210> 49
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 49
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acgtaagctt cgaaattaat acgactcact ataggg 
\hfill
36 
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<223> Oligonucleótido Sintético
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aaggag 
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6 
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 51
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uuccuc 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 52
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20 
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<210> 53
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<211> 76
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 53
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21 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 54
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22 
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<210> 55
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleátído Sintético
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<400> 55
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23 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> O1iqonucleátido Sintético
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24 
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<210> 57
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido Sintético
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<400> 57
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25

Claims (26)

1. Un polinucleótido de origen no natural que comprende un promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un promotor 35S/T7 quimérico unido de manera operativa a una secuencia que codifica un polipéptido que se une específicamente a un elemento de respuesta a homoserina lactona acilada (AHL).
2. El polinucleótido de la reivindicación 1 en el que dicho promotor está unido de manera operativa a una secuencia que codifica un polipéptido de unión al ADN que se une específicamente a un elemento de respuesta a AHL.
3. El polinucleótido de la reivindicación 2 en el que el polipéptido de unión a ADN comprende un motivo de unión a AHL y un dominio de unión a un elemento de respuesta a AHL.
4. El polinucleótido de la reivindicación 3 en el que el polipéptido de unión al ADN comprende además un miembro del grupo constituido por un dominio de activación transcripcional eucariota y un dominio de represión transcripcional eucariota.
5. El polipéptido de la reivindicación 3 en el que la unión de una AHL mediante el motivo de unión a AHL provoca la unión específica del polipéptido de unión al ADN a un elemento de respuesta a AHL.
6. El polinucleótido de la reivindicación 3 en el que el polipéptido de unión al ADN se une a un elemento de respuesta a AHL a menos que una AHL esté unida mediante el motivo de unión a AHL.
7. El polinucleótido de la reivindicación 1 en el que dicho promotor está unido de manera operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL.
8. El polinucleótido de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL.
9. El polinucleótido de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un promotor que es funcional en una célula eucariota unido de manera operativa a una secuencia que codifica una AHL sintasa.
10. El polinucleótido de la reivindicación 9 en el que dicho promotor que es funcional en una célula eucariota unido de manera operativa a la secuencia que codifica una AHL sintasa comprende un elemento de respuesta a
AHL.
11. El polinucleótido de la reivindicación 1 que comprende:
una primera secuencia que comprende un primer promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL, y
una segunda secuencia que comprende un segundo promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en la célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL, en el que el receptor de AHL se une al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor.
12. El polinucleótido de la reivindicación 1 que comprende:
una primera secuencia que comprende un primer promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL,
una segunda secuencia que comprende un segundo promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a una secuencia que codifica una AHL sintasa que, cuando se expresa en la célula eucariota, sintetiza una AHL, y
una tercera secuencia que comprende un tercer promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en la célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL, en el que la unión de la AHL mediante el receptor de AHL provoca la unión del receptor de AHL al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor.
13. Un organismo que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 seleccionado entre el grupo constituido por una levadura, un mamífero no humano, y una planta.
14. Una célula eucariota aislada que comprende una primera secuencia que comprende un primer promotor que es funcional en la célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a homoserina lactona acilada (AHL) unido de forma operativa a un gen de interés;
y una segunda secuencia que comprende un segundo promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en la célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL, en el que la unión de una AHL mediante el receptor de AHL provoca la unión del receptor de AHL al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor.
15. La célula eucariota de la reivindicación 14 en la que al menos uno de entre el primer o el segundo promotor es un promotor no constitutivo.
16. La célula eucariota de la reivindicación 14 en la que el gen de interés es un marcador de selección o de información (gen chivato).
17. Una célula eucariota aislada que comprende:
un núcleo;
un orgánulo;
una primera secuencia que comprende un promotor que es funcional en el orgánulo que comprende un elemento de respuesta a homoserina lactona acilada (AHL) unido de forma operativa a un gen de interés; y
una segunda secuencia que comprende un segundo promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en el núcleo y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un polipéptido que comprende (i) un péptido de transporte hacia el orgánulo y (ii) un receptor de AHL, en el que el receptor de AHL se une al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor tras la unión de una AHL.
18. La célula eucariota de la reivindicación 17 en la que el orgánulo es un plasto y el péptido de transporte hacia el orgánulo es un péptido de transporte hacia el plasto.
19. La célula eucariota de la reivindicación 18 en la que el plasto es un cloroplasto y el péptido de transporte hacia el plasto es un péptido de transporte hacia el cloroplasto.
20. Una célula eucariota aislada que comprende un orgánulo, comprendiendo el orgánulo:
una primera secuencia que comprende un promotor que es funcional en el orgánulo que comprende un elemento de respuesta a homoserina lactona acilada (AHL) unido de forma operativa a un gen de interés; y
una segunda secuencia que comprende un promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en el orgánulo y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un receptor de AHL, en el que el receptor de AHL se une al elemento de respuesta a AHL y modula la transcripción del primer promotor tras la unión de una AHL.
21. La célula eucariota de la reivindicación 20 en la que el orgánulo es un plasto.
22. La célula eucariota de la reivindicación 21 en la que el plasto es un cloroplasto.
23. Un procedimiento de modulación de la expresión de un polinucleótido que comprende un primer promotor que es funcional en una célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a homoserina lactona acilada (AHL), comprendiendo el procedimiento
la expresión en la célula eucariota de un receptor de AHL usando el polinucleótido de la reivindicación 1, y
la aplicación a la célula de una composición que comprende una AHL que está unida por el receptor de AHL, provocando la modulación de la transcripción del polinucleótido por parte del receptor de AHL,
con la condición de que dicho procedimiento se aplique ex vivo si la célula eucariota es una célula humana o una célula animal.
24. El procedimiento de la reivindicación 23 en el que la etapa de aplicación a una célula comprende aplicar la composición a un organismo que comprende la célula, con la condición de que el organismo no sea humano ni
animal.
25. El procedimiento de la reivindicación 24 en el que la célula es una célula de planta y la etapa de aplicación a una célula comprende la aplicación de la composición a una semilla o una planta que comprende la célula o al
suelo.
26. Un procedimiento de identificación de una homoserina lactona acilada (AHL) que está unida por un receptor de AHL, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) proporcionar una célula eucariota aislada que comprende (i) un primer promotor que es funcional en la célula eucariota que comprende un elemento de respuesta a AHL unido de forma operativa a una secuencia que codifica un marcador de selección o de información (gen chivato), y (ii) un segundo promotor que comprende un promotor 35S/T7 quimérico, es funcional en una célula eucariota y está unido de forma operativa a una secuencia que codifica un receptor de AHL, en el que la unión de una AHL por el receptor de AHL provoca la expresión del marcador;
(b) aplicar a la célula una composición que comprende la AHL, y
(c) detectar la expresión del marcador.
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