ES2270609T3 - Proteina inhibidora de quimotaxis de staphylococcus y su uso. - Google Patents

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Abstract

La proteína inhibidora de Quimotaxis de Staphylococcus (proteína CHIPS), la cual se caracteriza por: a) un peso molecular de aproximadamente 17 kD; b) la secuencia de aminoácido del N - terminal como se da en la figura 4; y c) una actividad biológica que consiste en la capacidad de prevenir la unión de fMLP y/o C5a a granulocitos en una prueba como se describe en el Ejemplo 1, en 1.2, y fragmentos de éste que tiene la actividad biológica como se define en c).

Description

Proteína inhibidora de quimotaxis de Staphylococcus y su uso.
La presente invención se refiere a una nueva proteína que puede ser usada en el tratamiento de las reacciones de inflamación. La invención se refiere a un método adicional para purificar la proteína. Finalmente, la invención se refiere a una prueba de detección con la que pueden ser detectadas proteínas análogas.
Una reacción de inflamación en general es un proceso en el que las células de defensa se abren paso al origen de la infección y aseguran allí la eliminación de la causa. Mediadores diferentes son liberados, lo que colabora en la eliminación pero también produce los síntomas de la inflamación. Una diferencia puede estar entre las inflamaciones agudas (como la sepsis) y la inflamación crónica latente (como el reumatismo). En las personas con una resistencia baja pueden existir inflamaciones agudas más a menudo y más severas (como en el caso de SIDA).
Una infección con bacterias resulta en formación de factores quimostáticos que aseguran que los leucocitos van en busca de la fuente de la infección. Una sustancia quimostática está presente en un gradiente adelante en el que los leucocitos se mueven de una manera dirigida. El origen de un agente quimostático puede ser la misma bacteria. Estos agentes son proteínas por ejemplo pequeñas con un grupo terminal formil, como fMLP (N-formil-Metionil-Leucil-Fenilalanina). Otros agentes quimostáticos son factores complementados activados (anafiloxinas C3a y C5a), leucotrianos (tales como LTB4 (Leucotriano B4) y PAF (factor activador de plaqueta, singlas en inglés) y quimoquinas producidas por diferentes tipos de células tales como iinterleuquina-8 (monocitos y células de endotelio), RANTES (células T normal expresadas y secretadas sobre la activación y regulable), eotaxina, MCP (Monocitos de Proteína Quimostática), MIP (Proteína Inflamatoria de macrófago) y otros.
Algunas quimoquinas son solamente específicas para cada tipo de leucocitos, los otros afectan la pluralidad de las células. Los receptores para quimoquinas son subdivididos en dos grupos principales, receptores CC y CXC que pertenecen a todas las serpentinas, receptores que atraviesan la membrana 7 veces. Las serpentinas son de rodopsina como proteína de GTP de la misma manera que los receptores unidos aleatoriamente a la proteína.
La familia de citoquinas quimostáticas, quimoquinas, se caracteriza por 4 cisteínas conservadas. Dependiendo de la posición relativa de las primeras dos cisteínas, dos familias pueden ser distinguidas: la CXC o alfa quimoquinas y la CC ó beta quimoquinas. Las CXC quimoquinas son particularmente activas sobre los granulocitos mientras las CC quimoquinas activan un amplio rango de leucocitos incluyendo monocitos, eosinofilos, T-linfocitos, células NK y células dendriticas. Esta familia de quimoquinas al igual que los agentes quimostáticos tradicionales como fMLP y C5a enlazan y activan las serpentinas.
La neutralización de quimoquinas ya ha sido aplicada experimentalmente, en particular el administrar anticuerpos contra IL-8 que fue encontrado ser efectivo en varios modelos experimentales de inflamación en animales. Ha sido demostrado recientemente un número de receptores de quimoqinas (en particular CCRS y CXCR4) tienen una participación como cofactores en la infección de células por HIV. Para las cepas de HIV células T-trópicas, como las CXCR4 han sido identificados co-factores para cepas monotropicas como es CCR5. Bloqueando estos receptores con anticuerpos o ligandos se inhibe la infección de HIV en modelos in vitro. Además, personas con una variante genética del receptor CCR5 que consiste en una deleción de los 32 pares de bases se encontraron ser resistente a la infección con HIV.
Además la inducción de quimotaxis, la migración dirigida de los leucocitos, a concentraciones bajas, un número de quimoquinas son también activadores potentes o modelos de otras funciones de los leucocitos. Es por lo tanto deseable conseguir un bloqueo de las quimoquinas por lo cual las reacciones de inflamación pueden ser mantenidas bajo control.
Es por lo tanto el objetivo de la presente invención proporcionar un nuevo agente con las propiedades inflamación-inhibición para el tratamiento de reacciones de inflamación agudas y crónicas por HIV.
Durante la investigación que resulta de la presente invención una proteína fue encontrada en el medio extracelular de crecimiento de Staphylococcus aureus (S. aureus) que se encontró capaz de bloquear diferentes receptores de quimoqina. La incubación de células diferentes con el medio resultó en una expresión enormemente reducida de un número de los receptores de quimoqina, ambas expresiones de receptores de agentes quimostáticos clásicos como fMLP y C5a sobre los granulocitos y de la expresión de CXCR4 y receptores de CCR5 sobre linfocitos, monocitos y macrófagos. La expresión de receptor reducida esta relacionada con quimotaxis enormemente reducida en comparación con las quimoquinas, tanto como una infección reducida con HIV.
La actividad de la proteína ya está manifiesta en el sobrenadante de cultivo crecido de S. aureus. De acuerdo con la invención sin embargo, la proteína activa también se purifica por medio de un número de Ligand Dye Column. Una pre-purificación fue primero ejecutada en la llamada "Columna amarilla" (columna de agarosa 4% empacada con tintura de ligando entrecruzado con reactivo "Amarillo 86" (Sigma)), seguido por una columna de cromatografía de absorción (llamada "Columna Verde" (columna de agarosa 4% empacada con tintura de ligando entrecruzado con reactivo " Verde 19" (Sigma)) y una columna de ADN (ADN celulosa (Pharmacia)). Las últimas columnas pueden ser intercambiadas. La columna de ADN remueve un contaminante con el mismo peso molecular que la proteína de acuerdo con la presente invención. La columna de cromatografía de absorción concentra la proteína y es selectiva para la proteína. Finalmente, una purificación posterior también tiene lugar por medio de una Filtración en gel y opcionalmente una concentración. En la filtración en gel se selecciona la proteína con el peso molecular de aproximadamente 17 kD. Esta es la proteína de acuerdo con la invención.
Cada paso en el método de purificación puede ser monitoreado por medio de la evaluación de la actividad a través del flujo o de los eluatos de las diferentes columnas. Esto tiene lugar por monitoreo tanto a través del flujo o de los eluatos es capaz de prevenir la unión de fMLP a granulocitos. Un protocolo de prueba extensivo se da en los ejemplos.
Los primeros 15 aminoácidos de la proteína purificada (N-terminal) fueron determinados por medio de micro-secuencia. Esta secuencia se da en la Figura 4. Con el análisis de secuencia no existe homología con cualquier secuencia de aminoácido conocida de bacteria o eucariota fue encontrada en la bases de datos. Ésta es por lo tanto una nueva y única proteína.
Debido a que esta proteína está aislada desde sobrenadante de S. aureus y da la inhibición de quimotaxis, esta proteína también esta designada como "CHIPS": Proteína Inhibitoria de Quimotaxis desde Staphiyococcus aureus.
La presente invención por tanto se refiere a la proteína, que se caracteriza de acuerdo con un primer aspecto de la misma proteína CHIPS la que están caracterizadas por:
a)
un peso molecular de aproximadamente 17 kD;
b)
la secuencia de aminoácido del N-terminal se da en la figura 4; y
c)
una actividad biológica que consta de la capacidad de prevenir el atar fMLP a granulocitos en una prueba como se describe en 1, y fragmentos biológicamente activos de ésta en el ejemplo.
La proteína de CHIPS influye en la quimotaxis de leucocitos de origen quimoatractante, como las bacterias. Ha sido encontrado de acuerdo con la invención que el número de al menos dos receptores (fMLP y C5a) sobre los leucocitos, en granulocitos especiales, está regulado descendentemente. La regulación descendente es reversible.
La invención se refiere a una composición terapéutica que consta de un excipiente apropiado y de la proteína CHIPS y/o fragmentos biológicamente de sí. La composición puede ser usada para el tratamiento de reacciones de inflamación aguda y crónica e infección por HIV. La proteína asegura que sean bloqueados los receptores que proporcionan el movimiento de leucocitos de la sustancia quimostática.
La invención se refiere a la proteína CHIPS y/o fragmentos activos biológicamente de ésta para el uso en el tratamiento de reacciones de inflamaciones agudas y crónicas e infección de HIV, tanto como el uso de la proteína CHIPS y/o fragmentos activos biológicamente de ésta para la fabricación de una preparación terapéutica para el tratamiento de dichos síntomas.
De acuerdo con un aspecto que sigue los anticuerpos de la invención contra la proteína CHIP y/o fragmentos de ésta se proporcionan para el uso en el tratamiento de la infección de staphylococcus. Las proteínas bloquearán la actividad de CHIPS o sus fragmentos y reiniciarán la quimotaxis terminada por la bacteria, con lo cual se restablece la defensa natural en contra de las bacterias.
Las composiciones terapéuticas, que contienen CHIPS o anticuerpos como ingrediente activo de acuerdo con la invención, serán particulamente intentados para parenteral, y luego usados específicamente, intravenosos. Las composiciones terapéuticas pueden ser preparadas por combinación (es decir mezclando, disolviendo, etc) CHIPS con excipientes apropiados aceptados farmacéuticamente para administración intravenosa. La concentración del ingrediente activo en una composición terapéutica que puede variar entre 0,001% y 100%, dependiendo de la naturaleza del tratamiento y el método de administración. La dosis del ingrediente activo para administrar igual depende de la ruta administrada y la aplicación, pero podría variar por ejemplo entre 0,001 y 1 mg por kg de peso corporal, preferentemente entre 1 \mug y 100 \mug por kg de peso corporal.
La invención posterior se refiere a un método de purificación de la proteína CHIPS, consta de:
a)
conducir en una columna de cromatografía de absorción el sobrenadante de cultivo de Staphylococcus aureus o de un líquido obtenido de ahí después de la pre-purificación;
b1)
posteriormente conduciendo el flujo a través de la columna de cromatografía de absorción primero sobre una columna de cromatografía de afinidad y después conducir el eluato de la columna de cromatografía de afinidad sobre una columna de ADN; o
b2)
posteriormente conduciendo el flujo a través de la columna de cromatografía de absorción primero sobre una columna de ADN y después conducir el flujo a través de la columna de ADN sobre una columna de cromatografía de absorción;
c)
conduciendo el flujo a través del eluato de la última columna del paso b) sobre una columna de filtración en gel y seleccionar la fracción con un peso molecular de aproximadamente 17 kD.
Flujo directo es el que se entiende y representa esa parte del líquido cargado que esta situado allí en donde los constituyentes que vienen desde la columna sin tratamiento adicional. Los componentes de este flujo directo no se unen a la columna. "Eluato" se entiende y significa el líquido que viene desde la columna después de la elución y que contiene a los componentes del líquido cargado a la columna que fue liberado otra vez de ella por la elución. En el método de acuerdo con la invención la absorción a la columna une más componentes del medio de cultivo cargado o un líquido obtenido de ahí después la pre-purificación. La columna de afinidad une CHIPS y la Snase (Staphylococcal Nuclease) que tiene el mismo peso molecular como CHIPS y la misma afinidad (ausencia de ella) para la columna de afinidad respectivamente la columna de absorción. La columna de ADN une solamente la Snase, por el cual es separado desde CHIPS.
Este método funciona particularmente bien si la primera columna de cromatografía de afinidad se llama Ligand Dye "Amarillo", la segunda columna de cromatografía de afinidad se llama columna Ligand Dye "Verde" y la columna de ADN como una columna de celulosa de ADN.
Finalmente, la invención también se refiere a una determinación o ensayo para determinar la actividad de CHIPS o proteínas con una función análoga, que consta de:
a)
introducir dentro de un primer compartimento células marcadas capaces de la quimotaxis, en particular leucocitos,
b)
introducir uno o más quimoatrayentes en un segundo compartimento separado del primer compartimento por una membrana permeable al menos a las células,
c)
colocar la proteína para hacer pruebas dentro del primer compartimento;
d)
medición de la cantidad de marcada en el segundo compartimento después de un tiempo determinado,
Las células son capaces de moverse a través de la membrana en dirección al quimoatractante. La presencia de CHIPS o una proteína análoga previene la emigración por desactivación del receptor(s) para el quimoatractante. Esta prueba puede ser aplicada en general para también determinar actividad moduladora quimotaxis de otras sustancias. Los pasos de método son entonces/lo mismo.
Proteínas análogas a la CHIPS que son encontrados en esta manera pueden ser sometidas a la misma purificación como CHIPS por lo tanto es capaz de determinar homología entre las dos.
La proteína CHIPS de acuerdo con la invención también ha sido encontrada en S. epidermis tanto como en S. aureus.
La manera en qué CHIPS fue aislada del sobrenadante de cultivo de Staphylococcus aureus vía los pasos de afinidad de ligando Dye y cromatografía de absorción, la gel filtración y la concentración, además de la prueba de actividad de CHIPS sobre receptores de quimoqina diferentes en leucocitos y la prueba de inhibición de la infección de HIV en células T y macrófagos se describen en los ejemplos que siguen abajo, que solamente intentan a modo ilustrativo y no se limitan a la invención en cualquier manera de forma absoluta.
La referencia es hecha en los ejemplos de las siguientes figuras:
Figura 1 indica la incubación de granulocitos con una serie de concentración de sobrenadante de Staphylococcus (SaS) y el efecto sobre los receptores de fMLP y los receptores C5a.
Figura 2 indica el efecto de una serie de concentración de SaS sobre la quimotaxis de granulocitos por fMLP.
Figura 3 indica las fracciones de la columna de gel filtración con la densidad óptica (OD) (línea con diamantes) y la actividad en el ensayo del receptor de fMLP como un porcentaje de inhibición (barras).
Figura 4 indica la secuencia de los primeros 15 aminoácidos (N-terminal) de CHIPS (de los 125 estimados en total).
Figura 5a muestra la incubación de granulocitos con una serie de concentración de CHIPS purificada y el efecto sobre los receptores de fMLP y los receptores de C5a.
Figura 5b muestra la incubación de granulocitos con una serie de concentración de CHIPS purificadasy el efecto sobre la migración dirigida a fMLP.
Figura 6 indica la expresión de CXCR4 sobre linfocitos.
Ejemplos Ejemplo 1 Identificación y aislamiento de CHIPS como molécula inhibidora de quimotaxis Materiales y métodos 1.1 Aislamiento de la proteína
Staphylococcus aureus 1690 (aislamiento clínico, Utrecht Teaching Hospital) o Staphylococcus aureus Newman (van Dr T J Foster, Dublín) se cultiva toda la noche en medio IMDM (Gibco) y se diluye posteriormente: 1: 40 en IMDM fresco en cultivo a 37ºC por 7 horas. Después del peleteo de las bacterias del sobrenadante de S. aureus (referido a SaS) se colecta, filtra sobre un filtro de 0.2 \mum y se usa inmediatamente más tarde. Ver también Veldkamp y col., Inflammation 21, 541-551 (1997).
Una cantidad de 2 litros de SaS se dirige sobre tres columnas (25 ml) acopladas conjuntamente. Estas tres columnas estan sucesivamente entrecruzadas, una columna empacada de 4% agarosa con ligando "reactivo amarillo 86" (Sigma), una columna empacada de 4% agarosa con Celulosa de ADN (Pharmacia) con ligando "Reactivo verde 19". Después del lavado de la columna verde (Reactivo verde 19) se eluye con 2 M NaCl y las fracciones activas son unidas y concentradas 10 X con polietilenglicol. El material concentrado se separa sobre una columna de gel filtración Pharmacia Superdex-200, después las fracciones activas son unidas, concentradas, dialisadas y congeladas. El material purificado final se resuspende en un volumen pequeño de agua estéril entre todo para análisis de micro-secuencia.
Para este propósito una muestra se analiza sobre un gel de 12.5% SDS-PAGE (Mini-Protean II; BioRad) y transferida por Immobilon-P, membranas de PVDF (Millipore) por medio de mini-Trans Blotter (BioRad). Las proteínas están manchadas con el color azul de Coomassie y se extirpa la proteína de aproximadamente 17 kD. La secuencia de aminoácido del N-terminal de esta muestra se determina de acuerdo con el procedimiento automatizado de Edman, en el que se usa está un Perkin Elmer/Applied Biosystems 476A. Los aminoácidos derivados son analizados por medio de HPLC.
1.2 Unión de fMLP para granulocitos
Los granulocitos son separados de la sangre heparinizadas de voluntarios sanos vía un gradiente Histopaque-Ficoll de acuerdo con el método estandar (Troelstra et al, J Leukocytes Biol. 61: 173-178 (1997). Los eritrocitos remanentes en la fracción de granulocitos se destruyen con agua estéril (durante 30 segundo) y lavadas después de recobradas la isotonicidad. Las células son finalmente resuspendidas en RPMI (Gibco) con 0,05% de albúmina de suero humano (RPMI/HSA).
En tubos de Falcon de 50 \mul de células (células de 5 x 10^{6}/ml) se incuban con 50 \mul de CHIPS-conteniendo material (SaS, CHIPS purificados o fracciones de columna) durante 30 minutos a 37ºC. Las células son colocadas sobre hielo y lavadas una vez RPMI/HSA (a 4ºC) y resuspendidas en 50 \mul de medio fresco. 5 \mul de fMLP marcado BODIPY (concentración final de 0,1 \muM, sondas moleculares) se adiciona luego y la muestra se incuba durante 60 minutos sobre hielo. Después de lavar el fMLP fluorescente unido a los granulocitos se analiza con un flujocitometro (FACScan;
Becton Dickinson). El valor de fluorescencia medio de 5000 granulocitos es calculado con software Lysis II.
1.3 Quimotaxis
Para determinar la migración dirigida se usa el sistema Transwel (Costar) que consiste de un compartimento superior y un compartimento más abajo separado por una membrana de policarbonato de 3 \mum. Los granulocitos son marcados con BCECF (2-carboxietil-5- (y -6-) carboxifluorescente; sondas moleculares), un marcador fluorescente que entra en el citoplasma de las células. Las células (5 x 10^{6}) se incuban 20 minutos a 22ºC con 3 \mum BCECFAM (el ester acetometilo de 2-carboxietil-5- (y -6-) -carboxifluorescente), lavados posteriormente por tres veces y resuspendidas 5 x 10^{6} células/ml en RPMI/HSA. Los 100 \mul de células y la cantidad deseada de proteína CHIPS se introducen en el compartimento superior del sistema de Transwel y el conjunto se resuspende en los pocillos de una placa de microtítulo de 24 pocillos estandar (Costar). Cada pocillo contiene 600 \mul RPMI/HSA con ó sin la adición de la quimoatractante para la prueba. Los quimoatrayentes son: C5a recombinante (Sigma), interleuquina-8 recombinante (Pepro Tech), Factor activador de plaqueta-16 (PAF-16; Calbiochem) o fMLP (Sigma). Después de 60 minutos la incubación a 37ºC el recipiente Transwel se levanta de los pocillos y la placa de microtítulo se analiza por fluorescencia en un CyoFluorII (PerSeptiveBiosystems). El grado de fluorescencia es una medida directa para el número de granulocitos que ha migrado a través de la membrana y se expresa como un porcentaje de la fluorescencia del número adicional de células.
Resultados
Figura 1 indica el efecto de la incubación de granulocitos con una serie de concentración de sobrenadante de Staphylococcus (SaS) sobre los receptores de fMLP y los receptores de C5a. Una regulación descendentemente fuerte de ambos receptores son visibles tanto C5A como fMLP.
Figura 2 muestra que la quimotaxis (movimiento celular) para el atrayente (fMLP) que esta fuertemente inhibido.
Figura 3 muestra que la actividad inhibidora más fuerte esta situada en el mismo rango de elución entre 240 y 280 ml. Las fracciones de volumen corresponden aquí con una proteína de aproximadamente 17 kD.
Figura 4 indica la secuencia de los primeros 35 aminoácidos de CHIPS (N-terminal) de los 125 aproximadamente en total. En base de esta secuencia un péptido sintético fue hecho de los primeros 15 aminoácidos de acuerdo con el estandar químico Fmoc como se describe entre todo en De Haas y col., J. Immunol. 161: 3607-3615 (1998) y Alonso de Velasco y col., Infect. Immun. 62: 799-808 (1994). Los anticuerpos generados contra este péptido en conejos (acoplado a KLH de acuerdo con las instrucciones del fabricante, Pierce, e inmunizar subcutaneamente con Adyuvante completo Freund, seguido por una inyección reforzada con Adyuvante incompleto de Freund), como se describe por ejemplo en Alonso de Velasco y col., supra, neutralizada la actividad de CHIPS.
Ejemplo 2 Expresión Reducida de receptores de quimoqina sobre granulocitos debido a CHIPS Materiales y métodos 2.1 Expresión del receptor
La expresión de los receptores de diferentes quimoqina se determina con anticuerpos específicos marcados fluorescentes y flujocitometría. El procedimiento seguido es análogo a lo descrito bajo 1.2 en el Ejemplo 1. El uso lo hace de los siguientes monoclonales: S5/1, anti-CD88 (receptor de C5a) de Serotec Ltd; SE2, anti-CDw128A (receptor de IL-8) de Alexis Corporation; Anti-PAF Receptor de Alexis Corporation. Después de la incubación con CHIPS las células son incubadas por 30 minutos en hielo con 5 \mug/ml de anticuerpo y después de lavado son marcados con F (ab)-2-FITC- marcado con Ig anti-murino de cabra (Dako).
La fluorescencia media de los granulocitos es una medida de la cantidad de receptores sobre la superficie de las células. La expresión relativa, después de la sustracción del valor de fondo, se expresa como un porcentaje de las células que son incubadas con tampon control.
Resultados
Figura 5a indica que ambos receptores de C5a y fMLP también desaparecen de la superficie de las células debido a CHIPS purificada.
Figura 5b muestra la incubación de granulocitos con una serie de concentración de CHIPS purificada y el efecto sobre la migración dirigida a fMLP. Puede ser visto que la quimotaxis (el movimiento de las células) para fMLP se inhibe totalmente y es dependientemente a la dosis de CHIPS purificada.
Ejemplo 3 Expresión reducida de receptores de quimoqina sobre células T debido a CHIPS Materiales y métodos 3.1 Expresión de receptores
Leucocitos mononuclear (monocitos 20% y linfocitos 80%) están separadas desde sangre heparinizadas de voluntarios sanos vía un gradiente Ficoll (Pharmacia) de acuerdo con el método estandar (Antal-Szalmas y col. J Leucocitos Biol. 61, 721-728 (1997). Después de lavar las células son resuspendido en RPMI/HSA. El procedimiento seguido para medición de la expresión de los receptores diferentes de quimoqina es como se describe en 2.1 bajo el ejemplo 2. Medir la expresión del co-receptores limfotroficos para HIV (CXCR4) se hizo usando el monoclonal 12G5 anti-CXCR4 de Becton Dickinson.
Resultados
Figura 6 muestra que después de la incubación de células mononuclear con CHIPS, la expresión de CXCR4 sobre linfocitos desaparece.

Claims (14)

1. La proteína inhibidora de Quimotaxis de Staphylococcus (proteína CHIPS), la cual se caracteriza por:
a)
un peso molecular de aproximadamente 17 kD;
b)
la secuencia de aminoácido del N-terminal como se da en la figura 4; y
c)
una actividad biológica que consiste en la capacidad de prevenir la unión de fMLP y/o C5a a granulocitos en una prueba como se describe en el Ejemplo 1, en 1.2, y fragmentos de éste que tiene la actividad biológica como se define en c).
2. La proteína CHIPS y/o los fragmentos biológicamente activos de ésta como se reivindica en reivindicación 1 para usar como medicina.
3. La proteína CHIPS y/o los fragmentos biológicamente activos de ésta como se reivindica en la reivindicación 1 para el uso en el tratamiento de las reacciones de inflamación aguda y crónica y la infección HIV.
4. Uso de la proteína CHIPS y/o los fragmentos biológicamente activos de ésta como se reivindica en la Reivindicación 1 para la fabricación de una preparación terapéutica para el tratamiento de las reacciones de inflamación aguda y crónica y la infección de HIV.
5. Anticuerpos contra la proteína CHIPS y/o los fragmentos biológicamente activos de ésta como se reivindica en la Reivindicación 1.
6. Los anticuerpos como se reivindican en la Reivindicación 5 para el uso en el tratamiento de la infección de Staphylococcus.
7. Composición terapéutica que consta de un excipiente apropiado y la proteína CHIPS y/o los fragmentos biológicamente activos de ésta como se reivindica en la Reivindicación 1.
8. Composición que se reivindica en la Reivindicación 7 para tratamiento de las reacciones de inflamación aguda y crónica y la infección de HIV.
9. Composición terapéutica que consta de un excipiente apropiado y de uno o más anticuerpos contra la proteína CHIPS y/o los fragmentos biológicamente activos de ésta como se reivindica en la Reivindicación 1.
10. Método de purificación de la proteína CHIPS como se reivindica en la reivindicación 1, que consiste en los pasos:
a)
dirigida sobre una columna de cromatografía de absorción el sobrenadante de cultivo de Staphylococcus aureus o un líquido obtenido después de pre-purificación;
b1)
secuencialmente se dirige el flujo a través de la columna de cromatografía de absorción primero sobre una columna de cromatografía por afinidad y luego se dirige el eluato de la columna de cromatografía por afinidad sobre una columna de DNA; o
b2)
secuencialmente se dirige el flujo a través de la columna de cromatografía de absorción primero sobre una columna de ADN y después dirigir el flujo a través de una columna de ADN sobre una columna de cromatografía de absorción;
c)
dirigir el flujo a través de la última columna del paso b1) respectivamente el eluato de la última columna del paso b2) sobre una columna de filtración en gel y seleccionar la fracción con peso molecular aproximado de 17 kD.
11. El método que se reivindica en la Reivindicación 10, caracterizado porque la columna de cromatografía de afinidad es una columna llamada Ligand Dye "Amarillo", la columna de cromatografía de absorción se llama columna Ligand Dye "Verde" y la columna de ADN es una columna de celulosa de ADN.
12. EL método de determinación de la actividad de la proteína CHIPS y/o los fragmentos biológicamente activos de ésta como se reivindica en la Reivindicación 1, que consta de los pasos:
a)
introducir en un primer compartimento células marcadas capaces de quimotaxis, en particular Leucocitos,
b)
introducir uno o más quimoatrayentes en un segundo compartimento separado del primer compartimento por una membrana permeable al menos a las células,
c)
colocar la proteína para hacer pruebas en el primer compartimento,
d)
medir la cantidad de marcaje en el segundo compartimento después de un tiempo determinado.
13. El método de determinación de actividad moduladora de quimotaxis de la proteína CHIPS y/o fragmentos biológicamente activo éstos como se reivindica en la Reivindicación 1 que consta de los siguientes pasos:
a)
introducir en un primer compartimento células marcadas capaces de quimotaxis, en particular Leucocitos.
b)
introducir uno o más quimoatrayentes en un segundo compartimento separado por el primer compartimento por una membrana permeable al menos a las células,
c)
colocar la sustancia para la prueba en el primer compartimento.
d)
medir la cantidad de marcaje en el segundo compartimento después de una vez determinada.
14. El método de determinación de la unión de fMLP a granulocitos en presencia de material que contiene CHIPS que consta de los pasos:
a)
incubación de granulocitos suspendidos en medio RPMI con 0,05% de Albúmina de Suero Humana (RPMI/HSA) con material que contiene CHIPS por 30 min. a 37ºC;
b)
colocar los granulocitos en hielo y lavarlos una vez en RPMI/HSA a 4ºC;
c)
resuspender los granulocitos en medio fresco RPMI/HSA;
d)
incubar los granulocitos con fMLP marcado con fluorescencia acorde al efecto de unión de fMLP marcado a granulocitos;
e)
eliminación por lavado de marcado fluerecente no unido; y
f)
analizar la unión de fMPL fluorescente a los granulocitos por medición de la fluorescencia.
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