ES2270540T3 - Composicion para el tratamiento de infecciones de staphylococcus aureus. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la fórmula general Y (K ó S) PXTNF, en la que X es C, W ó I.
Description
Composición para el tratamiento de infecciones
de Staphylococcus aureus.
El Staphylococcus aureus produce
enfermedades sobre todo a través de la producción de factores de
virulencia tales como las hemolisinas, enterotoxinas y la toxina
del síndrome del shock tóxico. La síntesis de los factores de
virulencia en el S. aureus está controlada por una molécula
reguladora del ARN, la RNAIII (Novick, y col., EMBO J. 12,
3967 (1993), Balaban y col., FEMS Microbiol. Letts.
133, 155 (1995), Moerfeldt y col., EMBO J. 14, 4569 (1995)),
codificada por el locus agr. El gen rnaiii del locus
agr se transcribe en el cultivo únicamente a partir de la
fase medio exponencial del crecimiento, y se autoinduce por la
proteína que activa la proteína ARNIII (RAP) (Balaban y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 1619 (1995)). RAP
se secreta de manera continua por la bacteria y activa únicamente
ARNIII a un umbral de concentración (ibid.).
Los anticuerpos de RAP bloquean la activación de
rnaiii in vitro. Se produce un péptido, denominado
péptido que inhibe ARNIII (RIP) mediante una cepa no patógena de
S. aureus mutada mediante la nitrosoguanidina (ibid.).
RIP compete con RAP para la activación de ARNIII, y de esta manera
inhibe la producción de la toxina por S. aureus
(ibid).
Staphylococcus aureus produce
enfermedades que oscilan entre infecciones menores de la piel a
infecciones profundas que amenazan la vida tales como neumonía,
endocarditis, meningitis, infecciones de heridas después de una
operación, septicemia, y síndrome del shock tóxico (Silverstein y
col., en Microbiology, Davis y col., eds.
(Lippincott, Filadelfia, 1990), pp. 485-506). Los
pacientes hospitalizados tienen un riesgo concreto, con más de
500.000 infecciones nosocomiales por año (Panlilio, y col.,
Inf. Contr. and Hosp. Epidem. 13, 582 (1992). La emergencia
de resistencias al fármaco han vuelto inefectivos muchos de los
agentes antimicrobianos disponibles. Por tanto, se desean con
impaciencia procedimientos alternativos para la prevención y
tratamiento de las infecciones bacterianas en general, y de las
infecciones por S. aureus en particular. Esta invención se
dirige a esta necesidad y a otras.
Un aspecto de la invención es una composición
que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que comprende la fórmula general Y (K ó S) PXTNF, en la
que X es C, W, o I. Se proporcionan también las composiciones
farmacéuticas en algunas formas de realización.
Un aspecto adicional de la invención es una
composición de la reivindicación 1, en la que el polipéptido
comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la fórmula
general IKKY (K ó S) PXTNF, en la que X es C, W, o I.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de la composición de la reivindicación 1 para fabricar un
medicamento para tratar un huésped de una infección estafilocócica,
en la que se administra la composición de la reivindicación 1 al
huésped. En algunas formas de realización, el huésped es un paciente
humano. En algunas formas de realización adicionales el huésped es
un animal, tal como, pero no se limita a un animal experimental.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de un antagonista del receptor de RAP para fabricar un medicamento
para tratar un huésped de una infección estafilocócica, en la que se
administra al huésped un antagonista del receptor de RAP. En
algunas formas de realización, el huésped es un paciente humano. En
algunas formas de realización adicionales el huésped es un animal,
tal como, pero no se limita a un animal experimental. En algunas
formas de realización el antagonista es un polipéptido, un
peptidomimético, o un anticuerpo.
Un aspecto adicional de la invención es una
molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la
invención. La molécula de ácido nucleico puede ser ARN o ADN o una
molécula de ácido nucleico antisentido. En una forma de
realización, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de
nucleótido TAT TCG CCG TGG ACC AAT TTT.
La Figura 1 comprende los Paneles
A-D. La Figura 1A es un gráfico que representa un
ensayo para la activación de ARNIII tal como se describe en Balaban
y col. (más arriba). Se filtraron los sobrenadantes
post-exponenciales del S. aureus de tipo
salvaje (denominado como total) a través de una membrana de corte de
3-kD, y se recogió el filtrado que contenía el
octapéptido que codifica el agrD, (Guangyong, y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 12055 (1995)), (denominado
como < 3-kD). Se filtró el material retenido (que
contiene RAP) a través de una membrana de corte de
10-kD. Se aplicó el material mayor de
10-kD (denominado como > 10-kD) a
una columna de filtración en gel de HPLC, y se recogió el RAP
purificado (RAP). Se añadieron cantidades crecientes de cada una de
estas composiciones al S. aureus de tipo salvaje en estado
exponencial temprano, y se ensayaron respecto de su capacidad para
activar ARNIII. La Figura 1B es un gráfico que representa la
capacidad de las fracciones de 1 ml recogidas a partir de
sobrenadantes postexponenciales de S. aureus de tipo salvaje
y de S. aureus de agr nulo, fraccionadas mediante
filtración por gel para activar ARNIII. La Figura 1C es un gráfico
que representa la absorbancia a A_{280} de las fracciones de la
Figura 1B que contienen la actividad punta de inducción de ARNIII.
La Figura 1D es una fotografía del RAP purificado mediante
filtración por gel procedente del tipo salvaje (banda 1) y de la
cepa agr nulo (banda 2) separadas en SDS PAGE y tinción de
plata. Se indican los marcadores aproximados de peso molecular.
La Figura 2A es una fotografía de un inmunoblot
de suero de animales vacunados y de control. Se separó el
sobrenadante postexponencial de S. aureus de tipo salvaje
(Bandas 1, 2) o de RAP purificado (Banda 3) en SDS al 12% PAGE, se
llevaron a cabo los análisis western blott, y se incubaron las
membranas en presencia de: Banda 1: suero recogido pre inmune
(banda 1a) o post inmune (banda 1b) procedente de un animal de
control inyectado con CFA (diluido 1:20). Banda 2: suero pre inmune
(banda 2a, diluido 1:20) o suero post inmune (banda 2b diluida
1:1000 y banda 3 diluida 1:20). Se indican en kilodaltons los
marcadores aproximados de peso molecular.
La Figura 2B es un gráfico que representa el
título de los anticuerpos anti-RAP frente al tamaño
de la lesión de los animales vacunados.
La Figura 3 es un gráfico que representa la
inhibición de ARNIII mediante RIP, sintética y purificada.
La Figura 4 comprende los paneles
4A-C. Las Figuras 4A y 4B son gráficos que
representan la inhibición de ARNIII mediante los péptidos RIP
sintéticos. La Figura 4C es un gráfico que representa la competición
entre RAP y RIP, sintética o purificada.
La Figura 5 es una fotografía de un ratón
inmunocompetente sin pelo estimulado únicamente con cytodex (ratón
de la parte superior) o con cytodex conjuntamente con S.
aureus SD (ratón de la parte inferior).
De manera general, la nomenclatura usada a
partir de ahora en el presente documento, y los procedimientos de
laboratorio para el cultivo celular y la bioquímica de proteínas son
aquellos bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. De
manera general, se llevaron a cabo las reacciones enzimáticas y la
cromatografía en columna de acuerdo con las especificaciones de los
fabricantes. A no ser que se defina de otra manera, todas las
técnicas y términos científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que entiende una persona normalmente
experta en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se
pueden usar cualquier procedimiento y materiales similares o
equivalentes a los que se describen en el presente documento en la
práctica o ensayo de la presente invención, se describen los
procedimientos y materiales preferidos. Para los objetivos de la
presente invención, se definen a continuación los términos
anteriores.
Los términos "farmacéuticamente aceptable"
o "terapéuticamente aceptable" se refieren a una sustancia que
no interfiere con la efectividad o la actividad biológica de los
ingredientes activos y que no es tóxica para el huésped o el
paciente.
Los términos "que codifica" o
"codifica" se refieren de manera general a la secuencia de
información que está presente en forma traducible, normalmente,
enlazada de manera operable con un promotor. Una secuencia está
enlazada de manera operable con un promotor cuando el promotor
funcional mejora la transcripción o expresión de esta secuencia. Se
considera también que una cepa antisentido codifica la secuencia,
debido a que está presente el mismo contenido informativo en una
forma fácilmente accesible, especialmente cuando se enlaza con una
secuencia que promueve la expresión de la cepa sentido. La
información es accesible usando el código genético, estándar o
modificado. Véase, por ejemplo Watson y col., (1987) The
Molecular Biology of the Gene (4ª Edición), Vols 1 & 2,
Benjamin, Menlo Park, California.
Tal como se usa para referirse a las secuencias
de ácido nucleico, el término "homólogo" indica que dos o más
secuencias de nucleótidos comparten la mayor parte de su secuencia.
De manera general, esto será de al menos un 70% de su secuencia y
de manera preferible de al menos un 95% de su secuencia. Otra
indicación de que las secuencias son sustancialmente idénticas es
si se hibridan con la misma secuencia de nucleótidos bajo
condiciones restrictivas (véase, por ejemplo, Sambrook y col.,
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva Cork, 1985). Las condiciones
restrictivas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en
diferentes circunstancias. De manera general, se seleccionan las
condiciones restrictivas para que sean aproximadamente 5ºC más
bajas que el punto de fusión térmico T_{m} para la secuencia
específica a una fuerza iónica y pH definidos. La T_{m} es la
temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de
la secuencia diana hibrida con una sonda que se ajusta
perfectamente. Normalmente, las condiciones restrictivas serán
aquellas en las que la concentración de sal sea al menos de
aproximadamente 0,2 molar a pH 7, y la temperatura sea al menos de
aproximadamente 60ºC.
Tal como se usa para referirse a las proteínas,
polipéptidos, o péptidos, cuyos términos se usan aquí de manera
intercambiable, se entiende que el término "homólogo" indica
dos proteínas o polipéptidos que comparten la mayor parte de sus
secuencias de aminoácidos, este será al menos de un 90% y
normalmente más de aproximadamente un 95%. La homología de los
polipéptidos o proteínas se mide normalmente usando el software de
análisis de secuencias, véase por ejemplo el Sequence Analysis
Software Package del Genetics Computer Group, University of
Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison
Wisconsin 53705. El software de análisis de proteínas empareja
secuencias similares usando la medida de la homología asignada a
diversas sustituciones, delecciones, y otras modificaciones. Las
sustituciones conservativas incluyen normalmente sustituciones
dentro de los siguientes grupos, glicina, alanita; valina,
isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina,
glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina,
tirosina.
El término "aislado" tal como se aplica a
los ácidos nucleicos, significa un ácido nucleico sustancialmente
separado de otras macromoléculas, componentes celulares, o
secuencias de ADN que acompañan de manera natural un ácido nucleico
nativo, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, otras secuencias de
ácidos nucleicos y similares. El término incluye un ácido nucleico
que se ha separado de su entorno natural, e incluye aislados de ADN
recombinante o clonado y análogos sintetizados químicamente, y
análogos sintetizados biológicamente mediante sistemas heterólogos.
Un ácido nucleico sustancialmente puro o biológicamente puro incluye
formas aisladas del ácido nucleico.
La frase "biológicamente puro" o
"sustancialmente puro" se refiere al material que está
sustancialmente o esencialmente libre de componentes que acompañan
normalmente este tal como se encuentra en su estado nativo.
El término "recombinante" se refiere a una
secuencia de ácido nucleico que no se produce de manera natural, o
se produce mediante la combinación artificial de dos segmentos de
secuencia separados de otra manera, es decir, mediante síntesis
química, ingeniería genética, y similares.
La presente invención proporciona polipéptidos
para la prevención y el tratamiento de las infecciones por S.
aureus. Estos polipéptidos comprenden la fórmula general
Y(K ó S) PXTNF, en la que X es C, W o I, de manera
preferible W. En una forma de realización adicional, los
polipéptidos pueden tener la fórmula general IKKY (K ó S) PXTNF, en
la que X es C, W, o I, de manera preferible W. Los polipéptidos
tienen, de manera preferible, al menos 10 aminoácidos de longitud,
de manera preferible al menos siete aminoácidos de longitud.
Se incluyen también en el alcance de la
invención los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la
invención. Dichos ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN, o ácidos
nucleicos antisentido. En una forma de realización una molécula de
ADN aislado de la invención comprende la secuencia TAT TCG CCG TGG
ACC AAT TTT. Pueden proporcionarse las moléculas de ácido nucleico
de la invención en forma de moléculas aisladas, sintéticas o
purificadas, entre las que se incluyen pero no se limitan a "ADN
desnudo"; en vectores tales como, pero sin limitarse a plásmidos
o virus, entre los que se incluyen vectores de expresión, o
complejados con otros compuestos para la administración. Dichas
técnicas son bien conocidas en la técnica.
Los polipéptidos de la invención se sintetizan
de manera preferible de novo mediante cualquier técnica
comúnmente conocida en la técnica, o pueden codificarse mediante el
ácido nucleico, tal como el ARN o el ADN, liberado en el huésped.
Se describe a continuación, en la sección experimental, la
purificación a partir de los cultivos de S. aureus.
Los polipéptidos de la invención se administran
normalmente en huéspedes que tienen o tienen riesgo de tener una
infección estafilocócica tal como una infección por S.
aureus. Los huéspedes son normalmente pacientes humanos. Se
pueden tratar animales con las composiciones de la invención, entre
los que se incluyen, pero no se limitan a animales de importancia
comercial o veterinaria tales como vacas, ovejas, y cerdos, y
animales experimentales tales como ratas, ratones, o cobayas.
Normalmente, la composición de la invención se
administra en base diaria durante un período al menos de
1-5 días. Tal como se usa en el presente documento,
"dosis terapéutica" es una dosis que previene, alivia,
disminuye, o reduce de otra manera la severidad de los síntomas en
un paciente. Se pueden usar las composiciones de la invención de
manera profiláctica para prevenir las infecciones estafilocóccicas,
o se pueden usar de manera terapéutica tras el comienzo de los
síntomas. En algunas formas de realización, es deseable la inducción
de la formación de anticuerpos para el compuesto administrado. En
dichos ejemplos, se prefieren los protocolos de inmunización
estándar usados en la técnica. Las composiciones administradas para
la inmunización pueden incluir de manera adicional
coadyuvantes.
coadyuvantes.
En algunas formas de realización de la invención
se proporcionan los antagonistas del receptor de RAP. Sin quedar
limitado por ninguna teoría, RIP puede funcionar por competición con
el RAP por el enlace con el receptor de RAP, actuando de esta
manera como un antagonista del receptor de RAP. Dichos antagonistas
incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos que se enlazan de
manera específica con RAP; los anticuerpos que se enlazan de manera
específica con un ligando de RAP; los ligandos de RAP o RIP; los
ácidos nucleicos antisentido; y los análogos de péptido, no
péptido, y peptidomiméticos de RAP, RIP, y sus ligandos.
Los anticuerpos pueden ser sintéticos,
monoclonales, o policlonales y se pueden producir mediante técnicas
bien conocidas en la técnica. Para las aplicaciones terapéuticas se
prefieren a menudo los anticuerpos monoclonales "humanos" que
tienen regiones humanas constantes y variables con el fin de
minimizar la respuesta inmune de un paciente frente al anticuerpo.
Se pueden generar dichos anticuerpos mediante animales transgénicos
inmunizantes que contienen los genes de la inmunoglobulina humana.
Véase Jakobovits y col. Ann NY Acad Sci
764:525-535 (1995). En conexión con los anticuerpos
sintéticos y semi sintéticos, se pretende que dichos términos
cubran, pero no se limiten a los fragmentos de anticuerpo,
anticuerpos con el isotipo cambiado, anticuerpos humanizados (por
ejemplo, ratón -ser humano, ser humano- ratón, y similares),
híbridos, anticuerpos que tienen especificidades plurales,
moléculas similares a anticuerpos completamente sintéticos, y
similares.
\newpage
Tal como se describe a continuación, se pueden
seleccionar los anticuerpos respecto de su capacidad para bloquear
el enlace de un ligando con RAP o RIP y/o respecto de otras
propiedades, tales como la capacidad para proteger in vivo
contra la infección por S. aureus.
En algunas formas de realización de la
invención, se usan las moléculas de ácido nucleico antisentido como
antagonistas de RAP. Las moléculas de ácido nucleico antisentido son
cadenas de oligonucleótidos complementarios de ácidos nucleicos
diseñadas para enlazar con una secuencia específica de nucleótidos
para inhibir la producción de la proteína diana. Se pueden usar
estos agentes solos o en combinación con otros antagonistas. Se
puede proporcionar el antagonista antisentido en forma de un
oligonucleótido antisentido tal como ARN (véase, por ejemplo,
Murayama y col. Antisense Nucleic Acid Drug Dev.
7:109-114 (1997)). Se pueden proporcionar también
los genes antisentido en un vector vírico, tal como, por ejemplo, en
el virus de la hepatitis B (véase, por ejemplo, Ji y col.,
J. Viral Hepat. 4:167-173 (1997)); en virus
adenoasociados (véase, por ejemplo, Xiao y col., Brain
Res. 756:76-83 (1997)); o en otros sistemas que
incluyen, pero no se limitan a un HVJ (virus Sendai) - sistema de
liberación del gen del liposoma (véase, por ejemplo, Kaneda y
col. Ann. N.Y. Acad. Sci 811:299-308
(1997)); un "vector péptido" (véase, por ejemplo, Vidal y
col. CR Acad. Sci III 32):279-287
(1997)); en forma de un gen en un vector episomal o plásmido
(véase, por ejemplo, Cooper y col. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 94:6450-6455 (1997), Yew y col.
Hum Gene Ther. (:575-584 (1997)); en forma de
un gen en un péptido - agregado de ADN (véase, por ejemplo, Niidome
y col. J. Biol. Chem. 272:15307-15312
(1997)); en forma de un "ADN desnudo" (véase, por ejemplo, el
Documento de los Estados Unidos 5.580.859 y el Documento de los
Estados Unidos 5.589.466); y en sistemas de vectores lipídicos
(véase, por ejemplo, Lee y col. Crit Rev Ther Drug Carrier
Syst. 14:173-206 (1997)).
Se pueden seleccionar los antagonistas
candidatos del receptor de RAP respecto de la función mediante una
variedad de técnicas conocidas en la técnica y/o descritas dentro de
la presente solicitud, tales como la protección frente a la
infección por S. aureus en un modelo de ratón.
Se pueden encontrar una multitud de
formulaciones apropiadas de los antagonistas de la invención en los
formularios conocidos por todos los químicos farmacéuticos:
Remington's Pharmaceutical Sciences (15ª edición, Mack
Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1975)), de manera
particular el Capítulo 87, por Blaug, Seymour, a este respecto.
Estas formulaciones incluyen por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos,
gelatinas, ceras, aceites, lípidos, bases de absorción anhidra,
emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, carboceras en
emulsiones (polietilén glicoles de una variedad de pesos
moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen
carboceras.
Las cantidades de ingrediente activo necesarias
para la terapia efectiva dependerán de muchos factores diferentes,
que incluyen los medios de administración, el emplazamiento diana,
el estado fisiológico del paciente, y los diferentes medicamentos
administrados. De esta manera, deberán valorarse las dosificaciones
de tratamiento para optimizar la seguridad y eficacia. Normalmente,
las dosificaciones usadas in vitro pueden proporcionar una
guía útil de las cantidades útiles para la administración in
situ de los ingredientes activos. El ensayo animal de dosis
efectivas para el tratamiento de trastornos concretos proporcionara
indicaciones predictivas adicionales de la dosificación en seres
humanos. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en
Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of
Therapeutics, 7ª Edición (1985), MacMillan Publishing Company,
Nueva York, y Remington's Pharmaceutical Sciences 18ª
Edición (1990) Mack Publishing Co, Easton Penn. Se describen en
este documento los procedimientos de administración, entre los que
se incluyen la administración por vía oral, intravenosa,
intraperitoneal, intramuscular, transdermal, nasal, iontoforética, y
similares.
Se pueden administrar las composiciones de la
invención en una variedad de formas de dosificación unitaria
dependiendo del procedimiento de administración. Por ejemplo, las
formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración
oral incluyen formas de dosificación sólida tales como polvos,
comprimidos, píldoras, cápsulas, y grageas, y formas de
dosificación líquida, tales como elíxires, jarabes, y suspensiones.
Se pueden administrar también los ingredientes activos por vía
parenteral en formas de dosificación líquida estériles. Las
cápsulas de gelatina contienen el ingrediente activo y los vehículos
en polvo como ingredientes inactivos, tales como glucosa, lactosa,
sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de la celulosa,
estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina sódica, talco,
carbonato de magnesio y similares. Los ejemplos de ingredientes
inactivos adicionales que se pueden añadir para proporcionar color,
sabor, estabilidad, capacidad tamponante, dispersión u otras
características deseables conocidas son óxido de hierro rojo, gel de
sílice, lauril sulfato de sodio, dióxido de titanio, tinta blanca
comestible y similares. Se pueden usar diluyentes similares para
fabricar comprimidos comprimidos. Se pueden fabricar los comprimidos
y las cápsulas como productos de dosificación sostenida para
proporcionar la dosificación continua de la medicación durante un
período de horas. Los comprimidos comprimidos pueden estar
recubiertos de azúcar o recubierto por una película para enmascarar
cualquier sabor desagradable y proteger el comprimido de la
atmósfera, o entérico recubiertos para la desintegración selectiva
en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificación líquida
para la administración oral pueden contener colorantes y
aromatizantes para aumentar la aceptación del paciente.
Puede variar de manera amplia la concentración
de las composiciones de la invención en las formulaciones
farmacéuticas, es decir., desde menos de aproximadamente un 0,1%,
normalmente a o al menos aproximadamente un 2% hasta como mucho de
un 20% a un 50% o más en peso, y se seleccionará principalmente
mediante volúmenes fluidos, viscosidades, etc, de acuerdo con el
modo concreto de administración seleccionado.
Se pueden administrar también las composiciones
de la invención mediante liposomas. Los liposomas incluyen
emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales
líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas lamelares y
similares. En estas preparaciones, la composición de la invención
que se va a dosificar se incorpora como parte de un liposoma, sola
o en unión con una molécula que se enlaza con una diana deseada, tal
como un anticuerpo, o con otras composiciones terapéuticas o
inmunógenas. De esta manera, los liposomas rellenos o adornados con
una composición deseada de la invención, se pueden liberar
sistémicamente, o se pueden dirigir a un tejido de interés, donde a
continuación, los liposomas liberan las composiciones
terapéuticas/polipéptido inmunógeno
seleccionadas.
seleccionadas.
Los liposomas para uso en la invención se forman
a partir de lípidos estándar que forman vesículas, entre los que se
incluyen de manera general fosfolípidos neutro y cargados
negativamente y un esterol, tal como colesterol. La selección de
lípidos se guía de manera general por la consideración de, por
ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad al ácido y la
estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Están
disponibles una variedad de procedimientos para preparar liposomas,
tal como se describe en, por ejemplo, Szoka y col. Ann.
Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), Patentes de los Estados
Unidos N^{os} 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369,
incorporadas en el presente documento como referencia.
Se puede administrar una suspensión de liposomas
que contiene una composición de la invención por vía intravenosa,
local, tópica, etc. En una dosis que varía de acuerdo con, inter
alia, la manera de administración, la composición de la
invención que está siendo liberada, y el estado de la enfermedad que
está siendo tratada.
Para las composiciones sólidas, se pueden usar
vehículos sólidos no tóxicos convencionales, por ejemplo, calidades
farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio,
sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de
magnesio, y similares. Para la administración oral, se forma una
composición no tóxica farmacéuticamente aceptable que incorpora
cualquiera de los excipientes empleados normalmente, tales como los
vehículos relacionados anteriormente, y de manera general un
10-95% de ingrediente activo, esto es, una o más
composiciones de la invención, y de manera preferible a una
concentración del 25-75%.
Para administración en aerosol, las
composiciones de la invención se suministran de forma preferible en
forma finamente dividida junto con un tensioactivo y un propelente.
Los porcentajes típicos de la invención son un 0,01% - 20% en peso,
de manera preferible un 1% - 10%. El tensioactivo debe, por
supuesto, no ser tóxico, y de manera preferible ser soluble en el
propelente. Representativos de dichos agentes son los ésteres o
ésteres parciales de ácidos grasos que contienen entre 6 y 22
átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico,
láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y
oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico.
Se pueden emplear los ésteres mixtos, tales como los glicéridos
mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir un 0,1% - 20%
en peso de la composición, de manera preferible un
0,25-5%. El resto de la composición es, de
ordinario, propelente. Se puede incluir también un vehículo, tal
como se desee, tal como, por ejemplo, lecitina para
dosificación
intranasal.
intranasal.
Se pueden dosificar de manera adicional los
constructos de la invención en un sistema de tipo depósito, una
forma encapsulada, o un implante mediante técnicas bien conocidas en
la técnica. De manera similar, se pueden dosificar los constructos
mediante una bomba en un tejido de interés.
Cualquiera de las formulaciones anteriores puede
ser apropiada en los tratamientos y terapias de acuerdo con la
presente invención, siempre que el agente activo en la formulación
no se inactive por la formulación y que la formulación sea
fisiológicamente compatible.
Se pueden preparar anticuerpos policlonales y/o
monoclonales de los polipéptidos de la presente invención. Se
pueden preparar polipéptidos de la propia invención tal como se
describe en el presente documento, y acoplarse con una molécula
vehículo, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, e
inyectarse en conejos en momentos seleccionados a lo largo de
varios meses. Se pude ensayar el suero de conejo respecto de la
inmunoreactividad de los polipéptidos anteriores. Se pueden
fabricar anticuerpos monoclonales inyectando los polipéptidos en
ratones. Se pueden seleccionar los anticuerpos monoclonales mediante
procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe, por
ejemplo, en Harlow y Lane (1988) Antibodies: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, y Goding (1986)
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.)
Academic Press, Nueva York. Se ensayarán los anticuerpos respecto
de la inmunoreactividad específica con un epitopo de los
polipéptidos. Estos anticuerpos encontrarán uso en ensayos
diagnósticos o como ingrediente activo en una composición
farmacéutica.
Para la producción de anticuerpos policlonales,
se selecciona un sistema diana inmune apropiado, normalmente un
ratón o conejo, aunque se pueden usar otras especies tales como
cabras, ovejas, vacas, cobayas, y ratas. El antígeno
sustancialmente purificado se presenta en el sistema inmune de
acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica.
Normalmente, se ensaya la respuesta inmunológica mediante un
inmunoensayo. Entre los que ejemplos adecuados se incluyen ELISA,
RIA, ensayo fluorescentes, o similares. Estos anticuerpos
encontrarán uso en ensayos diagnósticos o como un ingrediente
activo en una composición farmacéutica.
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren
y no limiten el alcance de esta invención.
En estos experimentos, se purificó RAP a partir
de sobrenadantes post exponenciales de S. aureus de tipo
salvaje (Fig. 1) tal como se ha descrito en Balaban y col.
(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 1619 (1995)). Las fracciones
punta (Fig. 1B, C) contenían una proteína de aproximadamente 38 kD
(Fig. 1D). Se hizo correr RAP purificado mediante HPLC sobre SDS
PAGE, se emborronó sobre una membrana PVDF, se tiñó con la tinción
de Coomasie, y la proteína, y se usó la proteína de
38-kD purificada para el secuenciamiento
N-terminal mediante la degradación de Edman. Se
determinó que la secuencia NH_{2} terminal de RAP era IKKYKPITN.
Esta secuencia no mostró homología significativa con proteínas
conocidas
Se purificó también RAP a partir de
sobrenadantes exponenciales de una cepa de agr nulo en la que
se reemplazó el locus agr completo con el marcador tetM
(Novick y col. EMBO J:3967 (1993)), lo que sugiere que
RAP es independiente de agr.
Usamos el modelo de murina de la infección
cutánea (Bunce y col., Infect. Immun. 60, 2636 (1992))
para ensayar si la inmunización con RAP puede inhibir la infección
por S. aureus. En este modelo, cuando se inyectó la cepa
difusa Smith de tipo salvaje (SD) del S. aureus por vía
subcutánea conjuntamente con perlas de dextrano (Cytodex), se
indujo tras 24 h una lesión visible y mensurable (celulitis). En
contraste, no se indujo lesión en los animales a los que se
inyectaron únicamente perlas de cytodex.
Se obtuvieron ratones machos sin pelo,
inmunocompetentes, consanguíneos, de cuarenta y ocho semanas de edad
(20-30 g), de la cepa
Crl:SKH1(hrhr)Br, procedentes de Charles River,
Wilmington, MA. y se usaron para estos experimentos. Para la
vacunación profiláctica con RAP (purificada a partir de una cepa de
S. aureus de tipo salvaje) o RAP* (purificada a partir de
agr nulo), se inyectaron 10 \mug de RAP, purificada en una
columna de filtración por gel tal como han descrito Balaban y
col. (más arriba) junto con coadyuvante de Freund
completo (CFA) en una primera inyección y coadyuvante de Freund
incompleto (ICFA) en una segunda y tercera inyección, por vía
subcutánea, en ratones machos inmunocompetentes sin pelo de 4
semanas de edad en los días 0, 7 y 21. Se inyectaron los ratones
control sólo con el coadyuvante o no se inyectaron con nada (no
tratados). Se estimularon los ratones vacunados y control el día 31
con 1,24 x 10^{8} S. aureus Difuso de Smith por vía
subcutánea junto con 1 mg de perlas de cytodex (10) para inducir
una infección local. Se midió diariamente el tamaño de la lesión, y
se presentó en forma de área = 0,5 {p (longitud) (anchura)} (Tabla
1). La Figura 5 representa gráficamente las apariencias típicas de
los ratones control o protegidos (ratón de la parte superior) y los
ratones que desarrollaron la celulitis (ratón de la parte
inferior).
Tras el estímulo con S. aureus, el 72%
(24/33) de los ratones vacunados con RAP permanecieron libres de
enfermedad en comparación con el 30% (3/10) de los controles
inmunizados con coadyuvante de Freund completo (CFA) y con el 0% de
los controles no tratados. Esta diferencia fue estadísticamente
significativa (RAP frente a no tratados: p < 0,0001; RAP frente
a CFA: CFA: p = 0,0031) usando el ensayo de la probabilidad exacta
de Fisher. Se usó el Ensayo de la Probabilidad Exacta de Fisher para
comparar las proporciones de ratones que desarrollaron lesiones y
ratones que desarrollaron anticuerpos anti-RAP entre
los grupos experimentales (controles CFA vacunados con RAP,
controles no tratados). Se comparó el tamaño de las lesiones entre
los animales que desarrollaron lesiones post estímulo con S.
aureus, usando un análisis de varianza de factor único. Se
llevó a cabo el ensayo post-hoc usando las
menores diferencias significativas protegidas de Fisher.
De manera adicional, en los ratones que
desarrollaron lesiones, el tamaño medio de la lesión fue un 50% más
pequeño que en los ratones control con CFA (177 mm^{2}) y un 76%
más pequeñas que en los controle no tratados (370 mm^{2}). Los
animales que murieron tenían extensas lesiones que se extendían en
más de la cuarta parte de su cuerpo. Únicamente un 3% (1/33) de los
animales vacunados con RAP murieron como resultado del estímulo,
mientras que murieron el 22% de los animales control (5/22).
Para determinar si se generaron anticuerpos de
RAP, se analizó el suero de los animales vacunados y control
mediante inmunoblotting (Figura 2A) y la actividad enlazante de los
sobrenadantes post exponenciales de S. aureus de tipo
salvaje que contenían RAP. Para estimar los niveles de anticuerpo
frente al antígeno inyectado, se recogió una gota de sangre (50
\mul) de la punta de la cola antes de la vacunación (suero
preinmune) y 7 días después de la tercera vacunación (suero post
inmune, 3 días antes del estímulo bacteriano). Se determinó el
valor de anticuerpo Anti-RAP mediante western
blotting. Se añadió suero al borrón (que contenía los sobrenadantes
post exponenciales) en diluciones crecientes, hasta que no apareció
la banda. Se determinó el valor de la mayor dilución que continúa
reaccionando con RAP. Los animales vacunados con RAP desarrollaron
anticuerpos respecto de una proteína de 38-kD, y
podrían enlazarse también con RAP purificado.
La mayor parte de los animales vacunados (33/34)
desarrollaron anticuerpos respecto de RAP (con valores que oscilan
entre 1:50-1:16.000) como resultado de las
inyecciones, mientras que los animales control no. Sin embargo,
algunos de los animales contenían anticuerpos preinmunes con
respecto a RAP (valores que oscilan entre
1:40-1:2000) y desarrollaron pequeñas lesiones tras
el estímulo con S. aureus. El valor de los anticuerpos con
respecto a RAP (en un total de 81 animales vacunados o control) está
correlacionado de manera inversa con el tamaño de lesión (Fig. 2B).
Para los objetivos de este cálculo, se asume que los animales que
murieron (de celulitis extensa) tuvieron un tamaño de la lesión de
981 mm^{2}.
Los ratones vacunados con RAP que se purificó a
partir de una cepa de S. aureus agr nulo tal como se ha
descrito anteriormente tuvieron el mismo grado de protección que
los animales vacunados con RAP que se purificó a partir de una cepa
de tipo salvaje. Esto excluye la contribución de los productos
procedentes de otros genes conocidos por regular ARNIII, tal como
el octapéptido codificado por agrD (Guangyong y col.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 12055 (1995)).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El S. aureus no patogénico (ATCC 55619)
produjo el péptido RIP que inhibe la transcripción de la ARNIII
(Fig. 3) y compite con RAP para la activación de la virulencia
(Balaban y col., más arriba). Se sometió el RIP purificado
mediante HPLC (ibid) a secuenciamiento mediante la
degradación de Edman. Se determinó que la secuencia de aminoácidos
era YSPXTNF, en la que X es un aminoácido modificado, C, I, o W, que
tiene una homología de secuencia con la secuencia NH_{2} terminal
de RAP. Sin estar limitado por ninguna teoría, esto sugiere que el
gen que codifica RIP puede ser un derivado del gen que codifica
RAP.
Se sintetizó un péptido sintético que tenía la
secuencia YSPWTNF (denominado como Pep en el presente documento) y
se ensayó respecto de su capacidad para inhibir la ARNIII in
vitro. El péptido sintético inhibió la inducción de ARNII de
manera comparable a RIP (Fig. 3).
Se ensayó RIP sintético purificado (Balaban y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 1619 (1995))
respecto de su capacidad para suprimir la infección en el modelo de
infección cutánea por S. aureus en la murina. Se incubó
S. aureus Difuso de Smith (8,5 x 10^{7} - 1,4 x 10^{9})
en presencia de RIP, que se purificó a partir de 5 ml de caldo de
cultivo postexponencial de ATCC 55619 en solución salina, o
únicamente con solución salina como control, con 0,5 mg de RIP
sintético (Pep) en una solución de DMSO final del 3% (en solución
salina), o únicamente con DMSO al 3% en solución salina como
control, durante 30 min a 37ºC. Se inyectó por vía subcutánea la
bacteria + RIP, la bacteria + Pep, la bacteria + la solución salina
o la bacteria + la mezcla de DMSO junto con las perlas de cytodex
(1 mg) en ratones macho inmunocompetentes sin pelo de 8 semanas de
edad para inducir una infección local. Se midió diariamente el
tamaño de la lesión. Para estos experimentos se preseleccionaron
los ratones para eliminar los individuos con anticuerpos
anti-RAP. Se produjo una cantidad fija de
infecciones atenuadas con RIP (aproximadamente 10 mg) con inóculos
crecientes de la cepa de S. aureus Difuso de Smith (SD). De
los animales que se inyectaron con 8,5 x 10^{7} bacterias junto
con RIP, tres de cada cuatro no desarrollaron nada de infección, en
comparación con únicamente uno de cuatro animales control que se
inyectaron con la bacteria y la solución salina (Tabla 2). Cuando se
usó un inóculo aumentado de bacterias (1,4 x 10^{8} células por
infección), se protegieron cuatro de ocho animales, mientras que
los cuatro restantes desarrollaron una lesión que fue un 55% más
pequeña que la de los animales control (Tabla 2). Todos los
animales (7/7) del control estimulados con SD y solución salina
desarrollaron una lesión. Cuando se usó un mayor número de
bacterias (1,4 x 10^{9}), el RIP sintético (0,5 mg de Pep)
protegió a los animales, de los que el 90% (9/10) de los animales
no mostraron signos de enfermedad
(Tabla 2).
(Tabla 2).
Se diseñaron oligonucleótidos degenerados a
partir de la secuencia de aminoácidos YSPWTNF. Se amplificó el gen
rip mediante la PCR usando Taq ADN polimerasa. Se clonó el
producto de la PCR en pCR2.1 (Invitrogen) y se secuenció. Se
determinó que la secuencia de ADN del gen rip era TAT TCG CCG
TGG ACC AAT TTT.
Se sintetizaron los péptidos sintéticos
correspondientes a RIP y se ensayaron respecto de su capacidad para
inhibir la ARNIII in vitro (Figura 4A, B) o para competir con
RAP en la activación de la ARNIII (Figura 4C). En estas Figuras,
RAP tiene la secuencia IKKYKPITN; Pep 1 es PCTNF; Pep2 es YSPWTNF;
B1 es YKPITNF; B2 es YSPITNF; y B3 es YKPWTNF.
En estos experimentos se añadieron los péptidos
RIP o el tampón de control a 2 X 10^{7} células ATCC 55620 que
contenían el plásmido de fusión de agr P3 -blaZ. Se hicieron
crecer las células en una placa de microvaloración a partir de la
fase exponencial temprana de crecimiento (antes de que rnaiii
esté normalmente activado) durante 2 h (cuando rnaiii está
normalmente activado) a 37ºC con agitación. Se detuvo la reacción
mediante la adición de 10 \mul de CY que contenía azida. Se midió
la actividad de la \beta-lactamasa mediante la
adición de 50 \mul de nitrocefina (132 \mug/ml en tampón
fosfato de sodio 0,1 M, pH 5,8) y se leyó a 490-650
nm. Para determinar la competición entre RAP y RIP purificado o
sintético, se añadió RAP a las células en presencia o ausencia de
RIP, y se midió la ARNIII 2 horas más tarde. En resumen, Pep2
inhibió ARNIII un 100% a menos de 1 ng; B1 inhibió ARNIII un 50% a
2 \mug; B2 inhibió ARNIII un 50% a 66,6 \mug; y B3 inhibió
ARNIII un 100% a 4 \mug
Se han descrito en otros sistemas bacterianos
mecanismos reguladores que implican autoinductores (Rappuoli, y
col. en: Signal Transduction and Bacterial Virulence, R.
Rappuoli, V. Scarlato, B. Arico eds (Springer Verlag, Heidelberg
1995). pp. 1-4.), que incluyen la competencia y
esporulación en Bacillus subtilis y en Streptococcus
pneumoniae (Magnuson y col. Cell 77,207 (1994)), la
conjugación en Enterococcus faecalis (Swift y col.,
Trends in Microbiol. 2, 193 (1994)) y la producción de elastasa en
Pseudomonas aeruginosa (Pearson y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 92, 1490 (1995)). Además, se han identificado
compuestos que inhiben la fosforilación del sistema de transducción
de la señal de dos componentes bacterianos en P. aeruginosa
(Roychoudhury, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
90, 965 (1993)). Dirigir los autoinductores de la virulencia o la
señal de transducción que ellos activan puede por tanto ser útil en
la prevención de la patogénesis de diferentes bacterias conocidas
que se regulan mediante regulones globales.
Las vacunas bacterianas actuales se dirigen
contra S. aureus o contra las exotoxinas que éste produce
((Lee, Trends in Microbiol. 4, 162 (1996)), R. Naso y A.
Fattom, en: Novel Strategies in Design and Production of
Vaccines, S. Cohen y A. Shafferman, eds (Plenum Press, Nueva
York, 1996) pp. 133-140, pero estos procedimientos
encuentran un éxito limitado. Con el inexorable aumento de la
resistencia a los antibióticos entre las bacterias en general
(Arthur y col., Antimicrob. Agents and Chemoter. 37,
1563(1993)) y entre los estafilococos en particular (Noble y
col. FEMS Microbiol. Lett. 93, 195 (1992)), existe una
necesidad de desarrollar nuevos procedimientos para controlar las
infecciones bacterianas. Nuestra solución es interferir de manera
directa con la virulencia bacteriana interfiriendo la señal de
transducción que conduce a la producción de toxinas. Reduciendo el
potencial patógeno de las bacterias, esta solución sería sinérgica
con las terapias antimicrobianas actuales y los mecanismos inmunes
del huésped natural. Debido a que la supresión dirigida de la
virulencia, no mataría a las bacterias, sino más bien, interferiría
con su patogenicidad, sería equivalente a una disminución de las
presiones selectivas para la emergencia de nuevas cepas de S.
aureus resistente.
Se recogió suero de vacas lecheras lactantes con
uno o más cultivos lácteos positivos de S. aureus (positivo),
y de vacas lactantes que no tenían registro de haber tenido casos
clínicos de mastitis por S. aureus en una lactación
(negativo) (Tabla 3A), y de terneros que tenían 1 mes y 4 meses de
edad (Tabla 3B). Se ensayó el suero respecto de los anticuerpos
anti-RAP mediante análisis western blotting frente a
los sobrenadantes postexponenciales de S. aureus de tipo
salvaje que contenía RAP. Tal como se muestra en la Tabla 3A,
únicamente un 10% (2/20) de vacas S. aureus positivo
contienen anticuerpos anti-RAP, mientras que un 63%
(7/11) de vacas S. aureus negativo contienen anticuerpos
anti-RAP. Tal como se muestra en la Tabla 3B, un
38-46% de los terneros contenían anticuerpos
anti-RAP. Se seguirán en el futuro las vacas S.
aureus negativo así como los terneros respecto de la
correlación entre el valor de los anticuerpos
anti-RAP y los índices de infección natural. Tal
como se muestra en la Tabla 3A, un 60% (12/20) de las vacas
positivas en comparación con un 18% (2/11) de las vacas negativas
contenían también anticuerpos respecto de diversas proteínas sin
identificar en el sobrenadante de S. aureus (que se supone
que son anticuerpos de diferentes proteínas de S.
aureus).
De esta manera, estos datos indican que la
mayoría de vacas lecheras que son negativas respecto de la mastitis
por S. aureus contienen de manera natural los anticuerpos
anti-RAP. Estos resultados apoyan el uso de RAP
como un emplazamiento de diana útil para vacuna para la prevención
de las infecciones estafilocócicas.
| Vaca | n | RAP | Otras proteínas de S.aureus | No anti S. aureus |
| Negativo | 11 | 7 (63%) | 2 (18%) | 1 (18%) |
| Positivo | 20 | 2 (10%) | 12 (60%) | 6 (30%) |
| Terneros | n | RAP | Otras proteínas de S. aureus | No anti S-aureus |
| 1 mes de edad | 20 | 5 (35%) | 2 (10%) | 13 (65%) |
| 4 meses de edad | 20 | 6 (46) | 1(5) | 13 (65%) |
Como será evidente para aquellas personas
expertas en la técnica a la cual pertenece la invención, la presente
invención se puede llevar a cabo en diferentes formas que aquellas
específicamente descritas anteriormente, sin apartarse del espíritu
del espíritu ni de las características esenciales de la invención.
Las formas de realización concretas de la invención descritas
anteriormente deben considerarse, por tanto, ilustrativas y no
restrictivas. El alcance de la presente invención es tal como se
muestra en las reivindicaciones adjuntas en lugar de estar limitado
a los ejemplos contenidos en la descripción anterior.
Claims (26)
1. Una composición que comprende un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que
comprende la fórmula general Y (K ó S) PXTNF, en la que X es C, W ó
I.
2. La composición de la reivindicación 1, en
la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que
comprende la fórmula general IKKY (K o S) PXTNF, en la que X es C, W
ó I.
3. El uso de un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos que comprenden la fórmula general Y (K ó
S) PXTNF, en la que X es C, W ó I, en la fabricación de un
medicamento para uso en el tratamiento de un huésped para la
infección estafilocócica en un huésped.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que el huésped es un paciente humano.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que el huésped es un animal.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que el animal es un animal experimental.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que el medicamento se administra después del comienzo de los
síntomas.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que el medicamento se administra de manera profiláctica.
9. El uso de un antagonista que inhibe la
activación de la ARNIII mediante RAP en la fabricación de un
medicamento para uso en el tratamiento de un huésped para una
infección estafilocócica.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9
en el que el antagonista es un anticuerpo antagonista de la
activación de la ARNIII mediante RAP.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9
en la que el antagonista es un anticuerpo que se enlaza de manera
específica con RAP, un anticuerpo que se enlaza de manera específica
con un ligando de RAP, un ligando de RAP o RIP, un ácido nucleico
antisentido o un péptido, no péptido o análogo peptidomimético de
RAP, RIP o un ligando de RAP o RIP.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que el huésped es un paciente humano.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que el huésped e un animal.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación
13, en el que el animal es un animal experimental.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que el antagonista es un polipéptido.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que el antagonista es un peptidomimético.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 9
en el que el antagonista es un anticuerpo.
18. Una composición farmacéutica que comprende
el polipéptido de la reivindicación 1.
19. Una composición que comprende una molécula
de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido de la
reivindicación 1.
20. La composición de la reivindicación 19, en
la que la molécula de ácido nucleico es ARN.
21. La composición de la reivindicación 19, en
la que la molécula de ácido nucleico es ADN.
22. La composición de la reivindicación 19, en
la que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido
nucleico antisentido.
23. La composición de la reivindicación 19, en
la que la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de
nucleótido TAT TCG CCG TGG ACC AAT TTT.
24. Una composición que comprende un
anticuerpo que se enlaza de manera específica con el polipéptido de
la reivindicación 1.
25. La composición de la reivindicación 24, en
la que el anticuerpo es monoclonal.
26. La composición de la reivindicación 24, en
la que el anticuerpo es policlonal.
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