ES2342778T3 - Polipeptidos para la induccion de una respuesta inmunitaria de proteccion contra staphylococcus aureus. - Google Patents
Polipeptidos para la induccion de una respuesta inmunitaria de proteccion contra staphylococcus aureus. Download PDFInfo
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Abstract
Un inmunógeno polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 1, en el que dicho polipéptido confiere inmunidad de protección contra S. aureus, y en el que si una o más regiones polipeptídicas adicionales están presentes, estas regiones adicionales no proporcionan un extremo carboxilo terminal que contenga los aminoácidos 609-645 de SEC ID NO:
Description
Polipéptido para la inducción de una respuesta
inmunitaria de protección contra Staphylococcus aureus.
La presente solicitud reivindica los beneficios
de la Solicitud Provisional de EE.UU. Nº 60/489.840, presentada el
24 de julio, 2003 y de la Solicitud Provisional de EE.UU. Nº
60/520.115, presentada el 14 de noviembre, 2003.
Las referencias citadas a lo largo de la
presente solicitud no se admiten como técnica anterior de la
invención reivindicada.
Staphylococcus aureus es un patógeno
responsable de una extensa gama de enfermedades y trastornos. Los
ejemplos de enfermedades y trastornos causados por S. aureus
incluyen bacteriemia, endocarditis infecciosa, foliculitis,
furunculosis, ántrax, impétigo, impétigo bulloso, celulitis,
botriomicosis, síndrome del shock tóxico, síndrome de la piel
escaldada, infecciones del sistema nervioso central, enfermedades
oftalmológicas infecciosas e inflamatorias, osteomielitis y otras
infecciones de articulaciones y huesos, e infecciones de las vías
respiratorias. (The Staphylococci in Human Disease, Crossley
y Archer (eds.), Churchill Livingstone Inc., 1997).
Es posible emplear estrategias de base
inmunológica para intentar controlar las infecciones por S.
aureus y la diseminación de S. aureus. Las estrategias
de base inmunológica incluyen las inmunizaciones pasiva y activa.
La inmunización pasiva utiliza inmunoglobulinas que tiene como diana
S. aureus. La inmunización activa induce respuestas
inmunitarias contra S. aureus.
Las vacunas potenciales contra S. aureus
tienen como diana los polisacáridos y polipéptidos de S.
aureus. El establecimiento de las dianas se puede lograr
utilizando como componentes de la vacuna polisacáridos y
polipéptidos apropiados de S. aureus. Ejemplos de potenciales
componentes polisacáridos de la vacuna incluyen los polisacáridos
capsulares de tipo 5 y tipo 8 de S. aureus. (Shinefield et
al., N. Eng. J. Med. 346:491-496, 2002).
Ejemplos de polipéptidos que se puede usar como posibles componentes
de vacuna incluyen el colágeno adhesina, proteínas que fijan
fibrinógeno, y el factor de aglomeración (o virulencia). (Mamo et
al., FEMS Immunology and Medical Microbiology
10:47-54, 1994; Nilsson et al., J. Clin.
Invest. 101:2640-2649, 1998; Josefsson et al,
The Journal of Infectious Diseases
184:1572-1580, 2001).
La información relativa a las secuencias de
polipéptidos de S. aureus se ha obtenido de la secuenciación
del genoma de S. aureus. (Kuroda et al., Lancet
357:1225-1240, 2001; Baba et al., Lancet
359:1819-1827, 2000; Kunsch et al.,
Publicación de Patente Europea EP 0.786.519, publicada el 30 de
julio, 1997). En cierta medida, se ha utilizado bioinformática en
los intentos de caracterizar las secuencias de polipéptidos
obtenidas de la secuenciación del genoma. (Kunsch et al.,
Publicación de Patente Europea EP 0.786.519, publicada el 30 de
julio, 1997).
Como parte de los intentos de identificar los
genes que codifican antígenos potenciales, se pueden utilizar
técnicas tales como las que implican tecnología de expresión y
sueros de pacientes infectados. (Foster et al., Publicación
Internacional Número WO 01/98499, publicada el 27 de diciembre,
2001; Meinke et al., Publicación Internacional Número WO
02/059148, publicada el 1 de agosto, 2002).
La presente invención muestra polipéptidos que
comprenden una secuencia de aminoácidos relacionados
estructuralmente con SEC ID NO: 1, los usos de tales polipéptidos,
y los sistemas de expresión para producir estos polipéptidos. SEC
ID NO: 1 es un derivado truncado de un polipéptido de longitud
completa de S. aureus. El polipéptido de longitud completa
se designa en este documento como "ORF0657n" de longitud
completa. Los polipéptidos que contienen la secuencia de
aminoácidos de SEC ID NO: 1 han demostrado producir una respuesta
inmunitaria de protección contra S. aureus.
La referencia a inmunidad o respuesta
inmunitaria "protectora" indica la existencia de un nivel
detectable de protección contra la infección de S. aureus. El
nivel de protección se puede evaluar usando modelos animales tales
como los que se describen en este documento.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un inmunógeno polipeptídico que comprende una secuencia de
aminoácidos idéntica en la menos 90% a SEC ID NO: 1, en el que el
polipéptido no contiene un extremo terminal carboxilo producido por
los aminoácidos 609-645 de SEC ID NO: 2, y el
polipéptido confiere inmunidad de protección contra S.
aureus. SEC ID NO: 2 proporciona un polipéptido ORF0657n de
longitud completa, en el que los aminoácidos
609-645 ofrecen el dominio terminal carboxilo que se
inicia en el resto LPXTG (al que se hace referencia en este
documento como "señal de clasificación de la pared
celular").
La referencia a "inmunógeno" indica la
capacidad para conferir inmunidad de protección.
La referencia a que comprende una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 1 indica que se
encuentra presente una región relacionada con SEC ID NO: 1 y que
puede haber presentes regiones polipeptídicas adicionales. Si hay
presentes secuencias polipeptídicas adicionales, entonces el
polipéptido carece del resto LPXTG carboxilo aportado por los
aminoácidos 609-645 de SEC ID NO: 2.
Otro aspecto de la presente invención describe
un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos que ofrece
inmunidad de protección contra S. aureus. El inmunógeno
comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a
SEC ID NO: 1, y una o múltiples regiones o restos adicionales unidos
de forma covalente en el extremo terminal carboxilo o en el extremo
terminal amino, en donde dichas regiones o restos adicionales no
confieren un extremo terminal carboxilo que contiene los aminoácidos
609-645 de SEC ID NO: 2, en donde cada región o
resto se selecciona independientemente de una región o resto que
posee al menos una de las siguientes propiedades: potencia la
respuesta inmunitaria, facilita la purificación, o facilita la
estabilidad de polipéptidos.
La referencia a "región o resto adicional"
indica una región o resto diferente de un polipéptido relacionado
con ORF0657n que se produciría en un hospedador biológico, tal como
un hospedador procariótico o eucariótico. La región o el resto
adicionales pueden ser, por ejemplo, una región polipeptídica o no
peptídica adicional.
Otro aspecto de la presente invención describe
una composición capaz de inducir inmunidad de protección contra
S. aureus en un paciente. La composición comprende un
vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad
inmunológicamente efectiva de un inmunógeno, según se ha descrito
anteriormente, confiriendo inmunidad de protección contra S.
aureus. Una cantidad inmunológicamente efectiva es una cantidad
suficiente para proporcionar inmunidad de protección contra
infecciones de S. aureus. La cantidad debe ser suficiente
para prevenir de manera significativa la probabilidad o la gravedad
de una infección de S. aureus.
Otro aspecto de la presente invención describe
un ácido nucleico que comprende un gen recombinante que codifica un
polipéptido, según se ha descrito anteriormente, que confiere
inmunidad de protección contra S. aureus. Un gen
recombinante contiene ácido nucleico recombinante que codifica un
polipéptido, junto con elementos reguladores para la transcripción
y el procesamiento adecuados (que pueden incluir elementos
traduccionales y postraduccionales). El gen recombinante puede
existir de forma independiente de un genoma hospedador, o puede
formar parte de un genoma hospedador.
Un ácido nucleico recombinante es un ácido
nucleico que, en virtud de su secuencia y/o forma, no se produce en
la naturaleza. Ejemplos de ácidos nucleicos recombinantes incluyen
ácido nucleico purificado, dos o más regiones de ácido nucleico
combinadas entre sí, que proporcionan un ácido nucleico diferente
del hallado en la naturaleza, y la ausencia de una o múltiples
regiones de ácido nucleico (por ejemplo, regiones corriente arriba y
corriente abajo), que se encuentran asociadas de manera natural
entre sí.
Otro aspecto de la presente invención describe
una célula recombinante. La célula comprende un gen recombinante que
codifica un polipéptido, según se ha descrito anteriormente, que
confiere inmunidad de protección contra
S. aureus.
S. aureus.
Un aspecto adicional de la presente invención
describe un procedimiento de preparación de un polipéptido según se
ha descrito anteriormente, que proporciona inmunidad de protección
contra S. aureus. El procedimiento comprende cultivar una
célula recombinante que contiene ácido nucleico recombinante que
codifica el polipéptido y la purificación del polipéptido.
Otro aspecto de la presente invención describe
un polipéptido, según se ha descrito anteriormente, que confiere
inmunidad de protección contra S. aureus, preparado por un
proceso que comprende las etapas de cultivar una célula
recombinante, que contiene ácido nucleico recombinante que codifica
el polipéptido en un hospedador, y purificar el polipéptido. Se
pueden emplear diferentes células hospedadoras. En una forma de
realización de la presente invención, la célula hospedadora es una
célula de levadura.
Otro aspecto de la presente invención describe
un inmunógeno, según se ha descrito anteriormente, para inducir una
respuesta inmunitaria de protección en un paciente contra S.
aureus. El inmunógeno se administra al paciente en una cantidad
inmunológicamente efectiva, que confiere inmunidad de protección
contra S. aureus.
Otro aspecto de la presente invención describe
un inmunógeno, según se ha descrito anteriormente, para inducir una
respuesta anamnésica en un paciente. El procedimiento comprende la
etapa de administrar al paciente una cantidad efectiva de inmunógeno
para producir la respuesta anamnésica.
Otro aspecto de la presente invención describe
ácido nucleico que codifica un polipéptido relacionado con
ORF0657n, que ha sido optimizado para su expresión en levadura. Se optimizan uno o múltiples codones para la expresión en levadura.
ORF0657n, que ha sido optimizado para su expresión en levadura. Se optimizan uno o múltiples codones para la expresión en levadura.
\newpage
Otro aspecto de la presente invención describe
un procedimiento para preparar un polipéptido, según se ha descrito
anteriormente, que ofrece inmunidad de protección contra S.
aureus en una célula de levadura recombinante. El procedimiento
comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar una célula de levadura recombinante bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido, en donde la célula de levadura recombinante comprende un gen recombinante que codifica el polipéptido, y donde el polipéptido es un polipéptido relacionado con ORF0657n de longitud completa, que ofrece inmunidad de protección contra la infección de S. aureus, o un fragmento del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 90% a la SEC ID NO: 1; y
- (b)
- purificar el polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Con la excepción de que términos particulares
sean mutuamente excluyentes, la referencia a la palabra "o"
indica cualquiera o ambas posibilidades. Se utilizan frases
ocasionales, tales como "y/o" para destacar cualquiera o ambas
posibilidades.
La referencia a términos abiertos tales como
"comprende" permite la inclusión de elementos o etapas
adicionales. Frases ocasionales tales como "uno o múltiples" se
utilizan con términos abiertos para destacar la posibilidad de
elementos o etapas adicionales.
A menos que se indique expresamente lo
contrario, las referencias a términos tales como "un" o
"una" no están limitadas a una sola. Por ejemplo, "una
célula" no excluye "células". Se utilizan frases ocasionales
tales como "uno o múltiples" para destacar la presencia de una
pluralidad.
Otras características y ventajas de la presente
invención resultan evidentes de las descripciones adicionales que
se ofrecen en este documento, incluidos los diferentes ejemplos. Los
ejemplos incluidos ilustran diferentes componentes y metodologías
de utilidad para llevar la presente invención a la práctica. Los
ejemplos no limitan la invención reivindicada. Basándose en la
presente descripción, el experto en la técnica puede identificar y
utilizar otros componentes y metodología útiles para llevar la
presente invención a la práctica.
Las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D ofrecen una
ilustración esquemática de regiones polipeptídicas relacionadas con
ORF0657n, cuya protección ha sido analizada en animales, y algunas
secuencias ORF0657n diferentes. La Figura 1A ilustra un esquema de
polipéptidos que fueron ensayados y demostraron ser protectores
(mostrados en rectángulos macizos). La Figura 1B ofrece una
secuencia de longitud completa usada como referencia para la Figura
1A (SEC ID NO: 2). La Figura 1C ilustra la SEC ID NO: 28. La SEC ID
NO: 28 contiene una "cola de histidinas" en el extremo
C-terminal (LEHHHHHH; SEC ID NO: 64). La SEC ID NO:
28 que contiene una cola de histidinas en el extremo carboxilo se
designa también en este documento como "ORF0657n con cola de
histidinas". La Figura 1D ilustra una secuencia ORF0657nl+.
Las Figuras 2A-2E ofrecen una
comparación de secuencias de diferentes secuencias relacionadas con
ORF0657n a través de la región ORF0657nH. Las SEC ID NOs: se indican
en la Figura como "ID".
Las Figuras 3A, 3B y 3C ilustran la capacidad de
los polipéptidos relacionados con ORF0657n, que proporcionan la
secuencia de longitud completa, la región ORF657nH y la región
ORF0657nl, de conferir inmunidad de protección contra S.
aureus Becker. Los polipéptidos se utilizaron con un adyuvante
de hidroxifosfato de aluminio (AHP). La Figura 3A ilustra los
resultados con SEC ID NO: 28. La Figura 3B ilustra los resultados
con SEC ID NO: 4 que contiene una cola de histidinas en el extremo
carboxilo. La Figura 3C ilustra los resultados con SEC ID NO: 5 que
contiene una cola de histidinas en el extremo carboxilo. La
referencia a una "cola de histidinas en carboxilo" indica que
el grupo de cola de histidinas LEHHHHHH (SEC ID NO: 64) se encuentra
presente en el extremo carboxilo terminal.
Las Figuras 4A-4H ilustran la
capacidad de los polipéptidos relacionados con ORF0657n para ofrecer
inmunidad de protección contra diferentes exposiciones a S.
aureus. Como inmunógeno se utilizó el polipéptido de la SEC ID
NO: 28. La Figura 4A muestra los resultados obtenidos con el uso de
la cepa de exposición CL-10 (2,2 x 10^{8} UFC/ml).
La Figura 4B muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa
de exposición CL-10 (2,1 x 10^{8} UFC/ml). La
Figura 4C muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de
exposición CL-13 (2,9 x 10^{8} UFC/ml). La Figura
4D muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de
exposición CL-13 (2,8 x 10^{8} UFC/ml). La Figura
4E muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de
exposición CL-30 (3,1 x 10^{8} UFC/ml). La Figura
4F muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de
exposición CL-30 (3,0 x 10^{8} UFC/ml). La Figura
4G muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de
exposición CL-18 (1,0 x 10^{8} UFC/ml). La Figura
4H muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de
exposición CL-21 (1,6 x 10^{8} UFC/ml).
Las Figuras 5A y 5B ilustran mapas plasmídicos
de plasmidios de expresión en S. cerevisiae. La Figura 5A
ofrece un mapa plasmídico del vector pGAL110. La Figura 5B
proporciona un mapa plasmídico para piUC-I que
muestra una secuencia optimizada con codón de levadura, clonada bajo
el control del promotor GAL1 de pGAL110.
Las Figuras 6A y 6B muestran transferencias de
western que exhiben la expresión intracelular de un ORF0657n de
longitud completa que tiene los aminoácidos 1-646 de
la SEC ID NO: 28 (SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas del
extremo carboxilo). Pista 1, estándares de tamaño molecular; pista
2, región de ORF0657n recombinante de longitud completa, purificada,
producida por E. coli (SEC ID NO: 28), 100 ng; las pistas
3-6 contienen 20 \mug de lisado celular de
levadura; las pistas 3 y 4, lisados celulares de fermentaciones
duplicadas de transformantes de 1260 (Figura 6A) y 1309 (Figura 6B),
que contienen solamente el vector pGAL110; las pistas 5 y 6, lisados
celulares de fermentaciones duplicadas de transformantes de 1260
(Figura 6A) y 1309 (Figura 6B) que contienen
pRUUnkC-pGAL110 que expresa la región ORF0657n de
longitud completa (SEC ID NO: 28, exenta de la cola de histidinas
del extremo carboxilo).
Las Figuras 7A y 7B representan una tinción de
Coomassie de un gel SDS-PAGE y una transferencia de
western, respectivamente, que muestran la expresión intracelular en
S. cerevisiae del ácido nucleico que codifica la SEC ID NO:
3. Pista 1, Panel A, BSA, 1,25 \mug; Panel B, ORF0657n
recombinante, de longitud completa y purificada, producida por E.
coli (SEC ID NO: 28), 100 ng; pista 2, lisado celular del
productor de ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas del
extremo carboxilo) en E. coli; Panel A, 1,25 \mug, Panel B,
0,5 \mug. Pistas 3-7, Paneles A y B, contienen
1,25 y 0,5 \mug de un lisado celular de levadura, respectivamente:
pista 3, transformante que contiene solamente el vector pGAL110;
pista 4, transformante que contiene ORF0657n de longitud completa
(SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas del extremo
carboxilo); pistas 5, 6 y 7, transformante 1-1 que
contiene piUC-S(-), que expresa la región ORF0657nH
madura (SEC ID NO: 3); la pista 7 contiene un lisado celular (del
transformante 1-1) que se congeló y,
subsiguientemente, descongeló. La pista 8 contiene los estándares de
tamaño molecular.
Las Figuras 8A-8U ofrecen
ejemplos de diferentes secuencias de ácidos nucleicos que codifican
polipéptidos relacionados con ORF0657n. La Figura 8A ofrece una
secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 29) que codifica la SEC ID
NO: 2 más una cola de histidinas del extremo carboxilo. La Figura 8B
ofrece una secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 30) que codifica
la SEC ID NO: 4 más una cola de histidinas del extremo carboxilo. La
Figura 8C ofrece una secuencia de ácido nucleico optimizada para
levadura (SEC ID NO: 31) que codifica la SEC ID NO: 28 exenta de la
cola de histidinas del extremo carboxilo. La Figura 8D ofrece una
secuencia de ácido nucleico optimizada para levadura (SEC ID NO: 32)
que codifica la SEC ID NO: 3. La Figura 8E ofrece una secuencia de
ácido nucleico optimizada para levadura (SEC ID NO: 33) que codifica
la SEC ID NO: 1. Las Figuras 8F-8M proporcionan
secuencias de ácido nucleico optimizadas para levadura (SEC ID NOs:
34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41) que codifican la SEC ID NO: 7, que
contiene una metionina en su extremo amino terminal. Las Figuras
8N-8U ofrecen secuencias de ácido nucleico
optimizadas para levadura (SEC ID NOs: 46-53) que
codifican diferentes polipéptidos relacionados con ORF0657n, basados
en SEC ID NO: 17 o SEC ID NO: 20.
La Figura 9 muestra una transferencia de western
que compara la expresión intracelular de polipéptidos relacionados
con ORF0657n en S. cerevisiae. Pistas 1 y 18, estándares de
tamaño de peso molecular (MW). Pistas 2 y 3, 50 y 100 ng,
respectivamente, de ORF0657nH purificado, producido en E.
coli (SEC ID NO: 4 más una cola de histidinas en el extremo
carboxilo). La pista 5 contiene 500 ng de proteína de lisado celular
del transformante de control del vector de S. cerevisiae. Las
pistas 7, 8 y 9 contienen 1,0, 2,0 y 4,0 \mug de lisado celular
del transformante de S. cerevisiae que produce SEC ID NO: 28
exenta de la cola de histidinas del extremo carboxilo. Las pistas 11
y 12 contienen 50 y 100 ng de proteína, respectivamente, del lisado
celular del transformante de S. cerevisiae que produce
ORF0657nH (SEC ID NO: 3). Las pistas 14 y 15 contienen 250 y 500 ng
de proteína, respectivamente, del lisado celular del transformante
de S. cerevisiae que produce ORF0657nG (SEC ID NO: 44). La
pista 17 contiene 250 ng de proteína del lisado celular de ORF0658nG
(SEC ID NO: 44 más una cola de histidinas del extremo carboxilo),
productor E. coli. Las pistas 4, 6, 10, 13 y 16 están
vacías.
La Figura 10 ilustra los datos de inmunidad de
protección de polipéptidos relacionados con ORF0657n producidos en
E. coli y levadura. "ORF0657nH (E. coli)"
corresponde a SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo
carboxilo. "ORF0657nl (E. coli)" corresponde a SEC ID
NO: 5 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo.
"ORF0657nC (E. coli)" corresponde a SEC ID NO: 28.
"ORF0657nH (levadura)" corresponde a
SEC ID NO: 3.
SEC ID NO: 3.
La Figura 11 muestra un ejemplo de transferencia
de western de expresión intracelular de ORF0657nl en S.
cerevisiae. Pistas 1 y 25: estándares de tamaño MW. Pistas 2, 3
y 24: 25, 50 y 100 ng, respectivamente, de la región de ORF0657nH
purificada (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo
carboxilo), producido en E. coli. Las pistas
4-23 contienen lisado celular de proteína de
transformantes de levadura. Las pistas 13-21
representan lisados celulares duplicados, preparados a partir de la
misma muestra de fermentación que los lisados de las pistas
4-12. Las pistas 4 y 13 contienen 200 ng de proteína
de un transformante de un vector de control que contiene pGAL110.
Las pistas 5 y 14 contienen 100 ng de proteína del transformante
1-1 que produce la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3).
Las pistas 6 y 15 contienen 200 ng de proteína del transformante
1-1. Las pistas 7 y 16 contienen 100 ng de proteína,
y las pistas 8 y 17 contienen 200 ng de proteína del transformante
1-1. Las pistas 9 y 18 contienen 100 ng de proteína,
y las pistas 10 y 19 contienen 200 ng de proteína del transformante
I2. Las pistas 11 y 20 contienen 100 ng de proteína, y las pistas 12
y 21 contienen 200 ng de proteína del transformante I3. Las pistas
22 y 23 contienen 100 ng y 200 ng de proteína del lisado celular
preparado previamente a partir de una fermentación anterior
del
transformante 1-1.
transformante 1-1.
La Figura 12 proporciona datos sobre la
inmunización de monos Rhesus. Se inmunizaron monos Rhesus con
polipéptido relacionado con ORF0657n producido por levadura
(ORF0657nH, SEC ID NO: 3), o con polipéptido relacionado con
ORF0657n expresado en E. coli (ORF0657nC de longitud
completa, SEC ID NO: 28), formulados con o sin AHP. Los monos del
grupo de vacuna recibieron 50 mcg de polipéptidos relacionados con
ORF0657n por vía intramuscular.
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Por medio del uso de un modelo animal, se ha
demostrado que los polipéptidos relacionados con ORF0657n, incluidos
los derivados de longitud completa y de longitud menor que
contienen la región ORF0657n, confieren inmunidad de protección
contra S. aureus. La Figura la ilustra la localización de
diferentes regiones de polipéptido relacionado con ORF0657n que
ofrecen inmunidad de protección contra la infección de S.
aureus, y de las regiones que no proporcionaron inmunidad de
protección. En la Figura 1a, ORF0657nl se refiere a una región
correspondiente a SEC ID NO: 1 (exenta de metionina del extremo
amino terminal), y ORF0657nH se refiere a una región correspondiente
a SEC ID NO: 3 (exenta de metionina del extremo amino terminal).
Un polipéptido "relacionado" con ORF0657n
contiene una región relacionada estructuralmente con un ORF0657n de
longitud completa, o un fragmento del mismo. Los polipéptidos
relacionados con ORF0657n son polipéptidos que tienen una secuencia
idéntica en al menos aproximadamente 90% a la de una región
correspondiente de un ORF0657n de origen natural. La referencia
ORF0657n ilustrada en la Figura 1 corresponde a ORF0657n de S.
aureus COL (SEC ID NO: 2).
La identidad porcentual con respecto a una
secuencia de referencia se determina por alineamiento de la
secuencia polipeptídica con la secuencia de referencia y la
determinación del número de aminoácidos idénticos. Este número se
divide por el número total de aminoácidos en la secuencia de
referencia y, a continuación, se multiplica por 100 y se redondea
hasta el número entero más próximo.
La Figura la ayuda a ilustrar la importancia de
una región central que comprende una secuencia de aminoácidos
relacionada estructuralmente con SEC ID NO: 1. La SEC ID NO: 1
comprende los aminoácidos 42-486 de ORF0657n COL. La
SEC ID NO: 1 contiene igualmente una metionina del extremo amino
terminal para facilitar la expresión. Los fragmentos polipeptídicos
preparados a partir de los aminoácidos 461-609,
aminoácidos 82-486 o los aminoácidos
42-196 de SEC ID NO: 2 no tuvieron acción
protectora.
A lo largo de la solicitud, se hace referencia a
diferentes secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. La Tabla 1
contiene un resumen de algunas de las secuencias de polipéptidos que
indican la región y modificaciones adicionales de la Figura 1. La
Tabla 2 ofrece un resumen de algunas de las secuencias de ácidos
nucleicos.
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\vskip1.000000\baselineskip
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Una región polipeptídica relacionada
estructuralmente con SEC ID NO: 1 contiene una identidad de
aminoácidos de al menos 90% con SEC ID NO: 1. Se pueden diseñar
polipéptidos que contienen una región relacionada estructuralmente
con SEC ID NO: 1 en base a las instrucciones que se exponen en este
documento para obtener polipéptidos con acción de protección contra
S. aureus.
Con el uso de SEC ID NO: 1 como marco de
referencia, se pueden llevar a cabo alteraciones tomando en
consideración la secuencia de aminoácidos de diferentes
polipéptidos ORF0657n de origen natural y las propiedades conocidas
de los aminoácidos. Las alteraciones incluyen adiciones, deleciones
y/o sustituciones de uno o múltiples aminoácidos. El efecto global
de las diferentes alteraciones se puede evaluar usando técnicas
descritas en este documento, para confirmar la capacidad de un
polipéptido particular para ofrecer inmunidad de protección.
Se ha observado que ORF0657n se encuentra bien
conservado a través de una colección de aislados clínicos de S.
aureus patológica y taxonómicamente diferentes. (Véase el
Ejemplo 5 más adelante). La Figura 2 ofrece una comparación de
secuencias de aminoácidos que contienen una SEC ID NO: 1. La
comparación de secuencias ilustrada es para la región ORF0657nH. La
región ORF0657nH incluye la región protectora de menor tamaño
ORF0657nI.
La Figura 2 ofrece una comparación de secuencias
de SEC ID NO: 1 y 3-27. La comparación pone de
manifiesto las diferencias de aminoácidos entre aislados clínicos
de S. aureus que se pueden usar como guía para el diseño de
alteraciones potenciales de polipéptidos relacionados con S.
aureus tales como las SEC ID NOs: 1 y 3. Además, se pueden
llevar a cabo alteraciones tomando en consideración las propiedades
conocidas de aminoácidos. Las SEC ID NOs: 1, 3-6 y
8-26 ilustran secuencias de origen natural que se
inician en la posición número 3; las posiciones número 1 y 2
ilustran la adición de metionina y metionina-glicina
al extremo amino terminal en algunas secuencias. Las SEC ID NOs:
11-26 se obtuvieron a partir de diferentes aislados
clínicos. Las SEC ID NOs: 7 y 27 son variantes de la región
ORF0657nH de SEC ID NO: 4, que contiene cinco sustituciones de
aminoácidos en una región fuera de la región central de SEC ID NO:
1.
Como ayuda para la guía de alteraciones, se
pueden usar secuencias ORF0657n adicionales en la comparación de
secuencias. Las SEC ID NOs: 54-63 ofrecen ejemplos
de secuencias de la región ORF0657nH de S. aureus, y las SEC
ID NOs: 106b y 107 proporcionan la secuencia de longitud completa
para las SEC ID NOs: 17 y 20.
Por lo general, cuando se sustituyen diferentes
aminoácidos para conservar la actividad, resulta preferible
intercambiar aminoácidos que tienen propiedades similares. Factores
que se pueden tener en consideración para la sustitución de
aminoácidos incluyen el tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad de
los aminoácidos. En la técnica es bien conocido el efecto de los
diferentes grupos Receptor de Servicios de los aminoácidos sobre
las propiedades de los aminoácidos. (Véase, por ejemplo, Ausubel,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley,
1987-2002, Anexo 1C).
En el intercambio de aminoácidos para mantener
la actividad, el aminoácido de sustitución debe tener una o más
propiedades similares tales como aproximadamente la misma carga y/o
tamaño y/o polaridad y/o hidrofobicidad. Por ejemplo, la
sustitución de valina por leucina, arginina por lisina y asparagina
por glutamina tiene buenas perspectivas de no provocar cambios en la
función polipeptídica.
Las alteraciones para alcanzar un propósito
particular incluyen las diseñadas para facilitar la producción o
eficacia del polipéptido; o la clonación del ácido nucleico
codificado. La producción de polipéptidos se puede facilitar
mediante el uso de un codón de iniciación (por ejemplo, que
codifique metionina) adecuado para la expresión recombinante.
Posteriormente, se puede eliminar la metionina durante el
procesamiento celular. La clonación se puede facilitar, por
ejemplo, mediante la introducción de sitios de restricción que
pueden estar acompañados por adiciones o cambios de aminoácidos.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
La eficacia de un polipéptido para inducir una
respuesta inmunitaria se puede potenciar por medio de la
potenciación de epítopos. La potenciación de epítopos se puede
llevar a cabo usando diferentes técnicas tales como las que
comprenden la alteración de residuos de anclaje para mejorar la
afinidad peptídica por las moléculas MHC, así como aquellas que
aumentan la afinidad del complejo péptido-MHC por un
receptor de células T. (Berzofsky et al., Nature Review
1:209-219, 2001).
En diferentes formas de realización, con
respecto a la región polipeptídica relacionada con la SEC ID NO: 1,
la región es idéntica en al menos 90%, al menos 94% o al menos 99% a
SEC ID NO: 1; difiere de SEC ID NO: 1 en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25
alteraciones, o en hasta 50 alteraciones, o consiste en una región
relacionada con ORF0657nI seleccionada del grupo consistente en:
aminoácidos 1 -442 de SEC ID NOs: 11, 15, 16, 18
ó 54;
aminoácidos 1-443 de SEC ID NO:
63;
aminoácidos 1-444 de SEC ID NOs:
57 ó 59;
aminoácidos 1-445 de SEC ID NOs:
7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 17, 19, 20, 55, 56 ó 58;
aminoácidos 1-446 ó
2-446 de SEC ID NOs: 1 ó 3;
aminoácidos 1-447 de SEC ID NOs:
25 ó 26; o
aminoácidos 1-447,
2-447, ó 3-447 de SEC ID NOs: 4, 5 ó
27;
aminoácidos 1-449 de SEC ID NOs:
61 ó 62;
aminoácidos 1-453 de SEC ID NO:
60; y
aminoácidos 1-454 de SEC ID NOs:
6, 21 ó 22.
\vskip1.000000\baselineskip
Aminoácidos adicionales pueden estar presentes.
Los aminoácidos adicionales pueden estar en el extremo carboxilo o
amino terminal. En diferentes formas de realización, se encuentran
presentes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19 ó 20 aminoácidos adicionales. En formas de realización
preferidas, metionina está presente en el extremo amino terminal; o
en el extremo amino terminal se hallan presentes
metionina-glicina.
En una forma de realización de la presente
invención, el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos
idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 42, o un fragmento de la
misma, que comprende una secuencia de aminoácidos relacionada
estructuralmente con SEC ID NO: 1. En diferentes formas de
realización con respecto a SEC ID NO: 42, el polipéptido es
idéntico en al menos 94% o al menos 99% a SEC ID NO: 42; difiere de
SEC ID NO: 42 en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 alteraciones, o en
hasta 50 alteraciones, o en hasta 65 alteraciones; o consiste en SEC
ID NO: 42 o una región relacionada con ORF0657nI+ seleccionada del
grupo consistente en:
aminoácidos 1 -477 de SEC ID NOs: 11, 15, 16, 18
ó 54;
aminoácidos 1-478 de SEC ID NO:
63;
aminoácidos 1-479 de SEC ID NOs:
57 ó 59;
aminoácidos 1-480 de SEC ID NOs:
7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 17, 19, 20, 55, 56 ó 58;
aminoácidos 1-481 de SEC ID NOs:
23 ó 24;
aminoácidos 1-481 de SEC ID NOs:
1 ó 3;
aminoácidos 1-482 de SEC ID NOs:
25 ó 26
aminoácidos 1-482,
2-482, ó 3-482 de SEC ID NOs: 4, 5 ó
27;
aminoácidos 1-488 de SEC ID NOs:
61 ó 62;
aminoácidos 1-488 de SEC ID NO:
60; y aminoácidos 1-489 de SEC ID NOs: 6, 21 ó
22.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de la presente
invención, el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos
idéntica en al menos 90% a SEC ID NO:3 o un fragmento de la misma,
que comprende una secuencia de aminoácidos relacionada
estructuralmente con SEC ID NO:3; difiere de SEC ID NO: 3 en 0, 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24 ó 25 alteraciones, o en hasta 50 alteraciones, o en
hasta 65 alteraciones; o consiste en una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo consistente en SEC ID NOs: 3, 4, 6, 7, 8, 9,
10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 54, 55, 57, 55, 59, 60, 61, 62 y 63.
En una forma de realización adicional, el
polipéptido consiste en un polipéptido de SEC ID NO: 2 modificado
por la inserción de una glicina tras la metionina inicial, o en
dicho polipéptido sin la metionina inicial.
En una forma de realización adicional, el
polipéptido es un polipéptido purificado. Un "polipéptido
purificado" se encuentra presente en un ambiente exento de uno o
más polipéptidos adicionales con los que se halla asociado
naturalmente, y/o está representado por al menos aproximadamente 10%
de la proteína total presente. En diferentes formas de realización,
el polipéptido purificado representa al menos aproximadamente 50%,
al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 95% de la
proteína total en una muestra o preparación.
En una forma de realización adicional, el
polipéptido está "sustancialmente purificado". Un polipéptido
sustancialmente purificado se encuentra presente en un ambiente
exento de todos, o la mayoría de los restantes polipéptidos con los
que se asocia naturalmente. Por ejemplo, un polipéptido de S.
aureus sustancialmente purificado está presente en un ambiente
exento de todos, o la mayor parte de otros polipéptidos de S.
aureus. Un ambiente puede ser, por ejemplo, una muestra o
preparación.
Las referencias a "purificado" o
"sustancialmente purificado" no requieren someter el
polipéptido a ninguna clase de purificación y pueden incluir, por
ejemplo, un polipéptido sintetizado químicamente que no ha sido
purificado.
La estabilidad del polipéptido se puede
potenciar modificando el extremo carboxilo o amino terminal del
polipéptido. Ejemplos de modificaciones posibles incluyen grupos
protectores del extremo amino terminal tales como acetilo, propilo,
succinilo, bencilo, benciloxicarbonilo o t-butiloxicarbonilo;
y grupos protectores del extremo carboxilo terminal tales como
amida, metilamida y etilamida.
En una forma de realización de la presente
invención, el polipéptido de protección forma parte de un inmunógeno
consistente en el polipéptido y una o múltiples regiones o restos
adicionales, unidas de forma covalente al polipéptido en el extremo
carboxilo terminal o el extremo amino terminal. Cada región o resto
debe ser seleccionado independientemente de una región o resto que
tenga al menos una de las propiedades siguientes: potenciación de
la respuesta inmunitaria, facilitar la purificación, o facilitar la
estabilidad del polipéptido. La estabilidad del polipéptido se
puede potenciar, por ejemplo, usando grupos tales como
polietilenglicol, que pueden estar presentes en el extremo amino o
carboxilo terminal.
La purificación polipeptídica se puede potenciar
agregando un grupo al extremo carboxilo o amino terminal para
facilitar la purificación. Ejemplos de grupos que se han utilizado
para facilitar la purificación incluyen polipéptidos que aportan
etiquetas de afinidad. Ejemplos de etiquetas de afinidad incluyen la
cola de seis histidinas, trpE, glutatión y proteína que se
une a la maltosa.
La capacidad de un polipéptido para producir una
respuesta inmunitaria se puede potenciar usando grupos que por lo
general refuerzan la respuesta inmunitaria. Ejemplos de grupos que
se pueden acoplar a un polipéptido para potenciar una respuesta
inmunitaria contra el polipéptido incluyen citoquinas tales como
IL-2. (Buchan et al., 2000, Molecular
Immunology 37:545-552).
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden producir polipéptidos usando técnicas
convencionales, incluidas las que comprenden síntesis química y las
que comprenden purificación a partir de una célula que produce el
polipéptido. Los procedimientos de síntesis química de polipéptidos
son bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Vincent,
Peptide and Protein Drug Delivery, Nueva York, N.Y., Decker,
1990). Las técnicas para la purificación de polipéptidos a partir
de una célula se ilustran en los Ejemplos que aparecen más adelante.
En la técnica, se conocen bien ejemplos adicionales de
procedimientos de purificación. (Véase, por ejemplo, Ausubel,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley,
1987-2002).
La obtención de polipéptidos a partir de una
célula resulta facilitada por el uso de técnicas de ácido nucleico
recombinante para producir el polipéptido. Las técnicas de ácido
nucleico recombinante para la producción de un polipéptido implican
la introducción, o producción, de un gen recombinante que codifica
el polipéptido en una célula, y la expresión del polipéptido.
Un gen recombinante contiene un ácido nucleico
que codifica un polipéptido, junto con elementos de regulación para
la expresión del polipéptido. El gen recombinante puede estar
presente en un genoma celular, o puede formar parte de un vector de
expresión.
Los elementos de regulación que pueden estar
presentes como parte del gen recombinante incluyen los que están
asociados naturalmente con la secuencia que codifica el polipéptido,
y elementos de regulación exógenos que no están asociados de manera
natural con la secuencia que codifica el polipéptido. Los elementos
reguladores exógenos tales como un promotor exógeno pueden ser
útiles para expresar un gen recombinante en un hospedador
particular o para incrementar el nivel de expresión. Por lo general,
los elementos reguladores que están presentes en un gen
recombinante incluyen un promotor transcripcional, un sitio de unión
de ribosomas, un terminador y un operador que está presente de
forma opcional. Un elemento preferido para el procesamiento en
células eucarióticas es una señal de poliadenilación.
La expresión de un gen recombinante en una
célula se ve facilitada por medio del uso de un vector de expresión.
Preferentemente, un vector de expresión adicional a un gen
recombinante contiene también un origen de replicación para la
replicación autónoma en una célula hospedadora, un marcador
seleccionable, un número limitado de sitios de enzimas de
restricción útiles, y un potencial para un número elevado de copias.
Ejemplos de vectores de expresión son vectores de clonación,
vectores de clonación modificados, plásmidos y virus diseñados
especialmente.
Debido a la redundancia del código genético, se
puede utilizar un amplio número de diferentes secuencias de ácido
nucleico de codificación para codificar un polipéptido particular.
La redundancia del código genético surge porque prácticamente todos
los aminoácidos son codificados por diferentes combinaciones de
tripletes de nucleótidos o "codones". Los aminoácidos son
codificados por codones de la forma siguiente:
A = Ala = Alanina: codones GCA, GCC, GCG,
GCU
C = Cys = Cisteína: codones UGC, UGU
D = Asp = Ácido aspártico: codones GAC, GAU
E = Glu = Ácido glutámico: codones GAA, GAG
F = Phe = Fenilalanina: codones UUC, UUU
G = Gly = Glicina: codones GGA, GGC, GGG,
GGU
H = His = Histidina: codones CAC, CAU
I = Ile = Isoleucina: codones AUA, AUC, AUU
K = Lys = Lisina: codones AAA, AAG
L = Leu = Leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC,
CUG, CUU
M = Met = Metionina: codón AUG
N = Asn = Asparagina: codones AAC, AAU
P = Pro = Prolina: codones CCA, CCC, CCG,
CCU
Q = Gln = Glutamina: codones CAA, CAG
R = Arg = Arginina: codones AGA, AGG, CGA, CGC,
CGG, CGU
S = Ser = Serina: codones AGC, AGU, UCA, UCG,
UCG, UCU
T = Thr = Treonina: codones ACA, ACC, ACG,
ACU
V = Val = Valina: codones GUA, GUC, GUG, GUU
W = Trp = Triptófano: codón UGG
Y = Tyr = Tirosina: codones UAC, UAU
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Las células apropiadas para la expresión de
ácido nucleico recombinante de polipéptidos relacionados con
ORF0657n son procarióticas y eucarióticas. Ejemplos de células procarióticas incluyen E. coli; miembros del género Staphylococcus tales como S. aureus; miembros del género Lactobacillus tales como L. plantarum; miembros del género Lactococcus tales como L. lactis; y miembros del género Bacillus tales como B. subtilis. Ejemplos de células eucarióticas incluyen células de mamífero; células de insecto; células de levadura tales como miembros del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae.), miembros del género Pichia (por ejemplo, P. pastoris), miembros del género Hansenula (por ejemplo, H. polymorpha), miembros del género Kluyveromyces (por ejemplo, K. lactis o K. fragilis), y miembros del género Schizosaccharomyces (por ejemplo, S. pombe).
ORF0657n son procarióticas y eucarióticas. Ejemplos de células procarióticas incluyen E. coli; miembros del género Staphylococcus tales como S. aureus; miembros del género Lactobacillus tales como L. plantarum; miembros del género Lactococcus tales como L. lactis; y miembros del género Bacillus tales como B. subtilis. Ejemplos de células eucarióticas incluyen células de mamífero; células de insecto; células de levadura tales como miembros del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae.), miembros del género Pichia (por ejemplo, P. pastoris), miembros del género Hansenula (por ejemplo, H. polymorpha), miembros del género Kluyveromyces (por ejemplo, K. lactis o K. fragilis), y miembros del género Schizosaccharomyces (por ejemplo, S. pombe).
En la técnica son bien conocidos los
procedimientos para la producción de genes recombinantes,
introducción en una célula y expresión del gen recombinante. Se
ofrecen ejemplos de estos procedimientos en referencias
bibliográficas tales como Ausubel, Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley, 1987-2002, y Sambrook et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Si se desea, la expresión en un hospedador
particular se puede potenciar mediante la optimización de codones.
La optimización de codones incluye el uso de codones más preferidos.
En la técnica se conocen bien procedimientos para la optimización de
codones en diferentes hospedadores.
Los polipéptidos relacionados con ORF0657n
pueden contener modificaciones postraduccionales, por ejemplo,
N-glicosilación, O-glicosilación, o
acetilación. La referencia a "polipéptido" o una secuencia de
"aminoácidos" de un polipéptido incluye polipéptidos que
contienen uno o múltiples aminoácidos que presentan una modificación
postraduccional de una célula hospedadora tal como una célula
hospedadora de mamífero, insecto o levadura.
Las modificaciones postraduccionales se pueden
llevar a cabo de forma química o utilizando hospedadores adecuados.
Por ejemplo, en S. cerevisiae la naturaleza del penúltimo
aminoácido parece determinar si se elimina la metionina
N-terminal. Además, la naturaleza del penúltimo
aminoácido determina también si el aminoácido
N-terminal sufre una
N^{\alpha}-acetilación (Huang et al.,
Biochemistry 26:8242-8246, 1987). Otro ejemplo
incluye un polipéptido cuya diana es la secreción debido a la
presencia de un líder secretor (por ejemplo, péptido señal), en
donde el polipéptido está modificado por N-u
O-glicosilación. (Kukuruzinska et al., Ann. Rev.
Biochem., 56:915-944, 1987).
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos relacionados con ORF0657n se
expresan, preferentemente, en levadura, usando ácidos nucleicos de
codificación que contienen codones optimizados para la expresión en
levadura. La expresión en levadura se puede llevar a cabo usando un
gen recombinante que codifica un polipéptido relacionado con
ORF0657n y regiones reguladoras para la expresión en levadura.
Dependiendo del sistema de expresión empleado, la proteína producida
puede seguir siendo intracelular o se puede excretar fuera de la
célula.
Preferentemente, el promotor para la expresión
de un gen recombinante es un promotor inducible tal como un
promotor del clúster de genes de galactosa de levadura (un promotor
Gal tal como GAL1, GAL7, GAL10, MEL1), o el promotor
PHO5 de fosfatasa ácida, o el promotor ADH2 de alcohol
deshidrogenasa, o el promotor CUP1 de metalotioneína,
regulado por el cobre. Ejemplos de promotores "constitutivos"
que se podrían utilizar son los promotores GAP (TDH),
PGK o TPI. (Romanos et al., YEAST
8:423-488, 1992).
La célula hospedadora de levadura usada para la
expresión recombinante se puede seleccionar o modificar por
técnicas de ingeniería para facilitar la expresión del gen
recombinante. Las mutaciones tales como mnn9, prb1 y/o
pep4 son típicamente deseables. Para potenciar la expresión
de promotores GAL, se puede lograr la sobreexpresión del factor de
transcripción GAL4 (Hopper et al., Patente de EE.UU.
5.068.185).
La optimización de codones para un hospedador en
particular se lleva a cabo sustituyendo codones que tienen un nivel
de utilización bajo o moderado por codones que tienen un elevado
nivel de expresión. El porcentaje de codones óptimos presentes en
una secuencia de codificación puede variar. En diferentes formas de
realización, el número de codones óptimos (incluidos los codones
inicialmente presentes y los codones introducidos) es de al menos
50%, al menos 75%, al menos 95%, o de 100% del número total de
codones.
La optimización de codones se puede efectuar de
la manera siguiente:
- 1.
- Para un codón particular, comparar la frecuencia del codón natural con la frecuencia de uso de codones globales por los genes de levadura.
- 2.
- Si el codón no es uno de los utilizados normalmente por la levadura, sustituirlo por un codón optimizado para alta expresión en células de levadura.
- 3.
- Repetir las etapas (1) y (2) para diferentes codones, hasta alcanzar el nivel deseado de optimización de los codones.
- 4.
- Analizar en la nueva secuencia de codificación, la presencia de secuencias no deseadas generadas, tales como sitios de enzima de restricción, sitios de corte y empalme, promotores no deseados, palíndromos o secuencias de repetición no deseadas, secuencias de terminadores de la transcripción, y alta frecuencia de bases GC. Eliminar las secuencias no deseadas usando un codón alternativo.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de codones alternativos se describe en
Lathe, J. Molec. Biol., 183:1-12, 1985. El
uso de codones en diferentes hospedadores de levadura es bien
conocido en la técnica. Por ejemplo, Sharp et al., Yeast 7:
657-678, 1991, describe el uso de codones sinónimos
en Saccharomyces cerevisiae.
Las Figuras 8C-8M proporcionan
secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para levaduras. La Figura
8C ofrece una secuencia de ácidos nucleicos optimizada para
levadura (SEC ID NO: 31) que codifica SEC ID NO: 28 exenta de la
cola de histidinas en el extremo carboxilo. La Figura 8D proporciona
una secuencia de ácidos nucleicos optimizada para levadura (SEC ID
NO: 32) que codifica SEC ID NO: 3. La Figura 8E ofrece una secuencia
de ácidos nucleicos optimizada para levadura (SEC ID NO: 33) que
codifica SEC ID NO: 1. Las Figuras 8F-8M ofrecen
secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para levadura (SEC ID
NOs: 34-41), que codifican SEC ID NO: 7 que contiene
una metionina en el extremo amino terminal. Las Figuras
8N-8U proporcionan secuencias de ácidos nucleicos
optimizadas para levadura (SEC ID NOs: 46-53) que
codifican diferentes polipéptidos relacionados con ORF0657n basados
en SEC ID NO: 17 o SEC ID NO: 20.
La expresión en levadura se puede lograr usando
secuencias optimizadas, y secuencias no optimizadas para expresión
en levadura (por ejemplo, nucleótidos 1-1935 o
124-1458 de SEC ID NO: 29, o nucleótidos
1-1710 de SEC ID NO: 30). En los Ejemplos
siguientes se ilustran técnicas para expresión en levadura usando
secuencias optimizadas y no optimizadas.
ORF0657n es una proteína de superficie que
contiene una señal de clasificación de pared celular
C-terminal de 36 aminoácidos, con un resto
"LPXTG" conservado. (Schneedwind et al., 1993,
EMBO, 12:4803-4811, 1993). Las proteínas que
contienen una señal de clasificación de pared celular están fijadas
a la envoltura de la pared celular por un mecanismo de
transpeptidación catalizada por sortasa, una proteína unida a la
membrana (Mazmanian et al., Science
299:906-909, 2001). Para la fijación, la proteína de
superficie debe contener también un péptido señal
N-terminal para exportar hacia la vía secretora. La
sortasa produce entonces una escisión entre la treonina y la
glicina del resto LPXTG y cataliza la formación de un enlace de
amida entre el grupo carboxilo de la treonina y el grupo amino de
los puentes cruzados del peptidoglicano.
La expresión en levadura demostró aumentar
significativamente por medio de la eliminación de la secuencia de
clasificación de la pared celular. En diferentes formas de
realización, el polipéptido que codifica las construcciones carece
de una secuencia funcional codificadora de clasificación de la pared
celular y, más preferentemente, carece de secuencias funcionales
que codifican la clasificación de pared celular y de péptido señal.
Los correspondientes polipéptidos relacionados con ORF0657n
preferidos carecen de una secuencia de clasificación de pared
celular, o tanto de la secuencia de clasificación de pared celular
como de la secuencia de péptido señal.
En diferentes formas de realización, al menos
sustancialmente la totalidad de la secuencia de clasificación de la
pared celular, o tanto la secuencia de clasificación de la pared
celular como la secuencia de péptido señal, no se encuentran
presentes en el polipéptido o en el ácido nucleico que codifica el
polipéptido. En diferentes formas de realización, la expresión de
proteínas está incrementada en al menos aproximadamente 10 veces,
al menos aproximadamente 15 veces, o al menos aproximadamente 20
veces mediante la eliminación al menos sustancialmente de la
totalidad de la secuencia de clasificación de la pared celular, o de
tanto la secuencia de clasificación de la pared celular como de la
secuencia de péptido señal. Más preferentemente, la construcción
codificadora contiene también uno o múltiples codones optimizados
para expresión en levadura (por ejemplo, S. cerevisiae).
Se pueden ilustrar los ejemplos de regiones
aproximadas para las secuencias de clasificación de pared celular y
de péptido señal de ORF0657n con respecto a SEC ID NO: 2. Los
aminoácidos 1-42 contienen la secuencia de péptido
señal. Los aminoácidos 609-645 contienen la
secuencia de clasificación de pared celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Los adyuvantes son sustancias que pueden
contribuir a que un inmunógeno produzca una respuesta inmunitaria.
Los adyuvantes pueden actuar por medio de diferentes mecanismos,
tales como uno o más de los siguientes: aumentando la semivida
biológica o inmunológica del antígeno; mejorando el suministro del
antígeno a las células presentadoras de antígeno; mejorando el
procesamiento y la presentación del antígeno por parte de las
células presentadoras de antígeno; y mediante la inducción de
citoquinas inmunomoduladoras. (Vogel, Clinical Infectious
Diseases 30 (suppl. 3): págs. 266-270,
2000).
Para ayudar en la producción de una respuesta
inmunitaria, se puede emplear una variedad de tipos diferentes de
adyuvantes. Ejemplos de adyuvantes particulares incluyen hidróxido
de aluminio, fosfato de aluminio, u otras sales de aluminio, fosfato
de calcio, motivos CpG de ADN, monofosforil lípido A, toxina del
cólera, toxina termolábil de E. coli, toxina pertussis,
muramil dipéptido, adyuvante incompleto de Freund, MF59, SAF,
complejos inmunoestimulantes, liposomas, microesferas
biodegradables, saponinas, copolímeros de bloque no iónicos,
análogos del péptido muramilo, polifosfaceno, polinucleótidos
sintéticos, IFN-\gamma, IL-2,
IL-12, e ISCOMS. (Vogel, Clinical Infectious
Diseases 30 (suppl. 3): págs. 266-270, 2000;
Klein et al., Journal of Pharmaceutical Sciences,
89:311-321, 2000; Rimmelzwaan et al.,
Vaccine 19:1180-1187, 2001; Kersten,
Vaccine 21:915-920, 2003; O'Hagen, Curr.
Drug Target Infect. Disord, 1:273-286,
2001).
\vskip1.000000\baselineskip
El término "paciente" se refiere a un
mamífero capaz de ser infectado por S. aureus. Un paciente
puede ser tratado de manera profiláctica o terapéutica. El
tratamiento profiláctico confiere una inmunidad de protección
suficiente para reducir la probabilidad, o la gravedad, de una
infección de S. aureus. El tratamiento terapéutico se puede
efectuar para reducir la gravedad de una infección de S.
aureus.
\newpage
El tratamiento profiláctico se puede llevar a
cabo usando una vacuna que contiene un inmunógeno descrito en este
documento. Este tratamiento se efectúa, preferentemente, en seres
humanos. Las vacunas se pueden administrar a la población general o
a las personas con un incremento del riesgo de una infección de
S. aureus.
Las personas que presentan un riego incrementado
de infecciones de S. aureus incluyen trabajadores sanitarios;
pacientes hospitalizados; pacientes con un sistema inmunológico
debilitado; pacientes sometidos a cirugía; pacientes que reciben
implantes de cuerpos extraños, tales como un catéter o un
dispositivo vascular; pacientes que van a ser sometidos a una
terapia que debilite la inmunidad; personas con lesiones por
quemaduras o heridas; y personas de grupos profesionales con un
riesgo incrementado de sufrir lesiones por quemaduras o heridas.
(The Staphylococci in Human Disease, Crossley y Archer (ed.),
Churchill Livingstone Inc., 1997).
Los pacientes no humanos que pueden sufrir
infecciones de S. aureus incluyen vacas, cerdos, ovejas,
cabras, conejos, caballos, perros, gatos y ratones. El tratamiento
de pacientes no humanos es útil para proteger a las mascotas y el
ganado, así como para evaluar la eficacia de un tratamiento
particular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado que los polipéptidos
relacionados con ORF0657n producen una respuesta inmunitaria rápida
y efectiva en el mono Rhesus tras una única dosis. (Véase el Ejemplo
17, más adelante). La respuesta observada fue consistente con una
respuesta anamnésica.
La producción de una respuesta anamnésica ofrece
ventajas significativas tales como la capacidad para proporcionar
inmunidad efectiva con el uso de una sola dosis, y ofrecer la
inmunidad efectiva en un breve periodo de tiempo. En diferentes
formas de realización, la respuesta anamnésica da como resultado un
incremento de al menos 3 veces, al menos 5 veces o de al menos 6
veces de la media geométrica de los títulos, con respecto a los
títulos preexistentes; y este incremento se produce en el plazo de
3, 5, 7, 9, 14 ó 21 días.
La capacidad de generar rápidamente una
respuesta inmunitaria efectiva ofrece ahorro de costes en
comparación con las vacunaciones con múltiples dosis, y se puede
utilizar para vacunar a un paciente que presenta un incremento del
riesgo de sufrir una infección de S. aureus. Las personas que
presentan un riego incrementado de infecciones de S. aureus
incluyen trabajadores sanitarios; pacientes hospitalizados;
pacientes con un sistema inmunológico debilitado; pacientes
sometidos a cirugía; pacientes que reciben implantes de cuerpos
extraños, tales como un catéter o un dispositivo vascular;
pacientes que van a ser sometidos a una terapia que debilite la
inmunidad; personas con lesiones por quemaduras o heridas; y
personas de grupos profesionales con un riesgo incrementado de
sufrir lesiones por quemaduras o heridas. (The Staphylococci in
Human Disease, Crossley y Archer (ed.), Churchill Livingstone
Inc., 1997). En diferentes formas de realización, el paciente es
vacunado inmediatamente o dentro de los 3, 5, 7, 9, 14 ó 21 días
siguientes a un procedimiento médico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos relacionados con ORF0657n que
confieren inmunidad de protección, se pueden usar solos o en
combinación con otros inmunógenos para la inducción de una respuesta
inmunitaria. Inmunógenos adicionales que pueden estar presentes
incluyen: uno o múltiples inmunógenos de S. aureus
adicionales, tales como los que se mencionan en la anterior sección
Antecedentes de la Invención; uno o múltiples inmunógenos dirigidos
contra uno o múltiples organismos del género Staphylococcus
distintos tales como S. epidermidis, S. haemolyticus, S.
warneri, o S. lugunensis; y uno o múltiples inmunógenos
dirigidos contra otros organismos infecciosos.
\vskip1.000000\baselineskip
En la evaluación de la eficacia de un
polipéptido para producir una respuesta inmunitaria de protección
contra S. aureus se ha utilizado un sistema de modelo
animal. Dos obstáculos que se encontraron en el establecimiento de
un modelo animal de protección fueron: (1) necesidad de una dosis de
estimulación muy elevada para vencer la inmunidad innata, y (2)
tasa de mortalidad excesivamente rápida para poder detectar una
respuesta de protección. Específicamente, los ratones sucumbieron a
la infección dentro de las 24 horas siguientes al estímulo
bacteriano, lo que no daba tiempo suficiente para que las
respuestas inmunitarias específicas resolvieran la infección. Al
reducir la dosis, tanto los ratones de control como los inmunizados
sobrevivieron a la infección.
Estos obstáculos se solucionaron usando un nuevo
modelo de letalidad de cinética lenta, en el que intervienen S.
aureus preparados a partir de células en fase estacionaria,
adecuadamente tituladas, y administrados por vía intravenosa. Esta
cinética lenta de mortalidad ofrece tiempo suficiente para que la
defensa inmunitaria específica combata la infección bacteriana (por
ejemplo, 10 días en lugar de 24 horas).
Las células de S. aureus en fase
estacionaria se pueden obtener a partir de células cultivadas sobre
un medio sólido. También se pueden obtener a partir de medios
líquidos, si bien los resultados con células cultivadas sobre un
medio sólido fueron más reproducibles. Convenientemente, las células
se pueden cultivar durante la noche en un medio sólido. Por
ejemplo, se puede cultivar S. aureus desde aproximadamente 18
hasta 24 horas bajo condiciones en las que el tiempo de duplicación
es de aproximadamente 20-30 minutos.
El aislamiento de Staphylococcus a partir
de un medio sólido o líquido se puede llevar a cabo usando técnicas
convencionales para conservar la potencia de Staphylococcus.
Los Staphylococcus aislados se pueden conservar, por
ejemplo, a -70ºC en forma de suspensión lavada de alta densidad
(>10^{9} unidades formadoras de colonias (UFC)/ml) en solución
salina tamponada con fosfato que contiene glicerol.
La estimulación con Staphylococcus debe
tener una potencia que provoque aproximadamente 80 a 90% de
mortalidad en un modelo animal durante un periodo de
aproximadamente 7 a 10 días, a partir del primer o segundo día. Se
pueden llevar a cabo ensayos de titulación usando modelos animales
para controlar la potencia del inóculo de Staphylococcus.
Los experimentos de titulación se pueden realizar aproximadamente
una a dos semanas antes de un ensayo de inoculación.
La potencia inicial para los experimentos de
titulación puede estar basada en experimentos previos. Para el
modelo animal, el estímulo adecuado con la cepa Becker de S.
aureus estuvo dentro del intervalo de 5 x 10^{8} a 8 x
10^{8} UFC/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inmunógenos se pueden formular y administrar
a un paciente siguiendo las normas que se ofrecen en este
documento, junto con procedimientos bien conocidos en la técnica.
Las directrices para la administración farmacéutica en general se
proporcionan, por ejemplo, en Vaccines, eds. Plotkin y Orenstein,
W.B. Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical
Sciences, 20ª edición, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000; y
Modern Pharmaceutics, 2ª edición, eds. Banker y Rhodes,
Marcel Dekker Inc., 1990.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables
facilitan la conservación y administración de un inmunógeno a un
paciente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener
diferentes componentes tales como un tampón, agua esterilizada para
inyección, solución salina normal o solución salina tamponada con
fosfato, sacarosa, histidina, sales y polisorbato.
Los inmunógenos se pueden administrar por
diferentes vías tales como subcutánea, intramuscular, o mucosa. La
administración subcutánea e intramuscular se puede llevar a cabo
usando, por ejemplo, agujas o inyectores a presión.
Los regímenes de dosificación apropiados se
determinan preferentemente teniendo en consideración factores bien
conocidos en la técnica, incluidos edad, peso, sexo y estado clínico
del paciente; vía de administración; efecto deseado; y compuesto
particular empleado. El inmunógeno se puede usar en formatos de
vacuna multi-dosis. Se prevé que la dosis consista
en polipéptido total dentro de un intervalo de 1,0 \mug hasta 1,0
mg. En diferentes formas de realización de la presente invención,
el intervalo es de 0,01 mg hasta 1,0 mg y de 0,1 mg hasta 1,0
mg.
Los intervalos de tiempo entre dosis dependen de
factores bien conocidos en la técnica. Tras la administración
inicial, si un individuo particular lo requiere, se pueden
administrar una o múltiples dosis de recuerdo subsiguientemente para
mantener o reforzar los títulos de anticuerpo. Un ejemplo de un
régimen de dosificación sería día 1, 1 mes, una tercera dosis a los
4, 6 ó 12 meses, y dosis de recuerdo adicionales a intervalos más
separados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede utilizar un polipéptido relacionado con
ORF0657n capaz de inducir inmunidad de protección para generar
anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se unen al polipéptido o
a S. aureus. Estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpo
tienen diferentes usos, incluidos el uso en la purificación de
polipéptidos, identificación de S. aureus, o en el
tratamiento terapéutico o profiláctico contra la infección de S.
aureus.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o
monoclonales. En la técnica se conocen procedimientos para la
producción y el uso de anticuerpos. Se describen ejemplos de estos
procedimientos en Ausubel, Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley, 1987-1998; Harlow et
al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1988, y Kohler et al., Nature
256:495-497, 1975.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se ofrecen ejemplos que ilustran
adicionalmente las diferentes características de la presente
invención. Los ejemplos ilustran también la metodología útil para
llevar la invención a la práctica. Estos ejemplos no limitan la
invención reivindicada.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la capacidad de la región
ORF0657n de longitud completa para ofrecer inmunidad de
protección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron cebadores de PCR para amplificar el
gen que codifica ORF0657n, comenzando en el primer residuo de
asparagina y finalizando antes del codón de terminación en el
residuo de asparagina terminal. Estos cebadores de PCR tuvieron,
igualmente, sitios NcoI (cebador hacia adelante) y
XhoI (cebador reverso) adicionales para facilitar la
clonación en el vector de expresión.
La proteína codificada se diseñó para ser
expresada a partir del vector pET28 con los residuos His terminales
y el codón de terminación codificados por el vector. Además, se
agregó un residuo de glicina a la proteína después del iniciador de
metionina. La secuencia amplificada de ADN resultante codifica un
ORF0657n con una cola de histidinas en el extremo carboxilo (SEC ID
NO: 28).
Las secuencias amplificadas por PCR se ligaron
en el vector pET28 (Novagen) usando los sitios NcoI/XhoI que
habían sido creados por técnicas de ingeniería en los cebadores de
PCR, y que se introdujeron en DH5a de E. coli (Invitrogen)
por choque térmico. La mezcla de transformación se cultivó durante
la noche sobre placas de agar Luria-Bertani (LB)
con 100 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Se seleccionaron colonias,
que se cultivaron en LB con 30 \mug/ml de kanamicina, se
produjeron minipreps de ADN (Promega), y se determinó la integridad
del inserto por digestión de restricción y PCR. Se secuenciaron
cuatro minipreps con tamaño correcto de inserto, usando los
cebadores M13F (SEC ID NO: 65), M13R (SEC ID NO: 66), ORF0657nF (SEC
ID NO: 67), y ORF0657nR (SEC ID NO: 68). Se seleccionó un clon que
no contuvo cambios de ADN de la secuencia deseada. Se transformaron
células de E. coli HMS174 (DE3) (Novagen) y se cultivaron
sobre placas LB que contuvieron kanamicina (30 \mug/ml); se
seleccionaron 3 colonias (UnkC-1,
UnkC-2 y UnkC-3) para los ensayos de
expresión. Los cultivos LB líquidos (kanamicina) se incubaron a
37ºC, 250 rpm hasta que la A_{600} fue de entre 0,6 y 1,0 y, a
continuación, se indujeron mediante la adición de IPTG a una
concentración final de 1 mM, seguido de tres horas adicionales de
incubación. Los cultivos se cosecharon por centrifugación a 5000 x g
durante 5 minutos a 4ºC. Las células se resuspendieron en 500
\mul de tampón de lisis (BugBuster, con inhibidores de proteasa,
Novagen). Se agregó un volumen igual de tampón de carga
(suplementado con
\beta-mercapto-etanol a un 5% de
volumen final) antes de calentar las muestras a 70ºC durante 5
minutos. Los extractos se analizaron sobre geles Novex 4- 20% de
Tris-Glicina y se visualizaron las proteínas
(teñidas con azul Coomassie), se transfirieron sobre nitrocelulosa y
se analizaron con anticuerpos anti-HIS6 (Zymed).
\vskip1.000000\baselineskip
Se logró una incremento directo a escala del
procedimiento a menor escala anterior en fermentadores de tanque
agitados (escala a 75 litros) con un volumen de trabajo de 50
litros. El inoculo se cultivó en un matraz de 250 ml que contuvo 50
ml de medio Luria-Bertani (LB) (más kanamicina), que
fue inoculado con 1 ml de cultivo de siembra congelado, y se
cultivó durante 3 horas. Se utilizó 1 ml de esta siembra para
inocular un matraz de 2 litros que contuvo 500 ml de medio LB (más
kanamicina), y se incubó durante 16 horas. Los parámetros de
fermentación del fermentador fueron: presión = 5 psig, velocidad de
agitación = 300 rpm, caudal de aire = 15 litros/minuto, y
temperatura = 37ºC. Las células se cultivaron hasta una densidad
óptica (DO) de 0,8 unidades de densidad óptica, a una longitud de
onda de 600 nm, y fueron inducidas con
isopropil-\beta-K-tiogalactosida
(IPTG) a una concentración de 1 mM. El periodo de inducción con
IPTG fue de 3 horas. Las células se cosecharon bajando la
temperatura a 15ºC, se concentraron haciéndolas pasar a través de un
cartucho de fibra hueca 500KMWCO, y se centrifugaron a 9.000 x
gravedad a 4ºC durante 20
minutos. Se decantaron los sobrenadantes, y los conglomerados de células húmedas de E. coli se congelaron a -70ºC.
minutos. Se decantaron los sobrenadantes, y los conglomerados de células húmedas de E. coli se congelaron a -70ºC.
Las células de E. coli recombinante (peso
de las células húmedas 19,2 g) se suspendieron en Tampón de Lisis
(Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,1 M, MgCl_{2} 2
mM, imidazol 1 mM, 0,1% de Tween®-80, e hidrocloruro de guanidina
6M) a 8 ml por gramo de peso de células húmedas. Se agregó a la
suspensión Cóctel de Inhibidor de Proteasa para uso con proteínas
poli-marcadas con histidina (Sigma, P8849), a una
concentración de 0,65 ml por gramo de pasta celular.
Adicionalmente, se agregó lisozima a una concentración de 1 mg/ml, y
se agregó Benzonase® (EM Ind.) a una concentración de 1 \mul/ml.
La lisis celular se logró haciendo pasar la suspensión a través de
un microfluidizador a 14.000 PSI (Microfluidics Modelo 110S) cuatro
veces a 4ºC. El residuo celular se aglomeró a 11.000 x g durante 30
minutos a 4ºC, y se retuvo el sobrenadante.
Las proteínas portadoras de una marca His se
purificaron desde el sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con 20
ml de Ni+-NTA agarosa (Qiagen) a 4ºC, con una suave inversión
durante 2 horas. la mezcla se vertió en una columna abierta (1,5 cm
x 20 cm) y se recogió a granel la fracción no fijada. La columna se
lavó con Tampón de Lavado (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0,
NaCl 0,15 M, 0,1% de Tween®-80). El ORF0657n marcado con His se
eluyó con un gradiente de fase de imidazol 300 mM,
Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de
Tween®-80.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Por medio de SDS-PAGE teñido con
Coomassie se detectaron las fracciones que contuvieron ORF0657n
marcado con His (SEC ID NO: 28), y se combinaron. Las fracciones
combinadas se filtraron a través de un filtro de 0,2 micrómetros
para eliminar el material particulado, y se aplicaron a una columna
de exclusión de tamaño (columna Sephacryl S-300
26/60, Amersham Biosciences), y se eluyeron a 1 ml/min con MOPS 10
mM, pH 7,1, NaCl 150 mM. Las fracciones que contuvieron ORF0657n
marcado con His se detectaron por SDS-PAGE teñido
con Coomassie y transferencia de western
(anti-tetra his Mab, Qiagen). Se eliminó la
endotoxina por filtración a través de un Biofiltro
Zeta-Plus (CUNO). La concentración de proteínas se
determinó por BCA (Pierce). La pureza se determinó por densitometría
de geles teñidos con Coomassie.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó S. aureus sobre placas de
Tryptic Soy Agar (TSA) (Becton Dickinson, Sparks, MD) a 37ºC durante
una noche. Las bacterias se retiraron de las placas TSA por lavado,
mediante la adición de 5 ml de PBS sobre una placa y resuspendiendo
suavemente las bacterias con un diseminador esterilizado. La
suspensión bacteriana se centrifugó a 6000 rpm durante 20 minutos
usando una centrifugadora Sorvll RC-5B (DuPont
Instruments). El aglomerado se resuspendió en glicerol al 16% y se
conservaron partes alícuotas congeladas a -70ºC.
Antes de usarlos, los inóculos se descongelaron,
se diluyeron de manera apropiada y se utilizaron para infectar.
Cada stock se tituló al menos 3 veces para determinar la dosis
adecuada para inducir una cinética lenta de muerte de ratones no
infectados anteriormente. La potencia del inóculo bacteriano
(capacidad para matar 80% a 90% de los ratones) se monitorizó de
forma constante para garantizar la reproducibilidad del modelo. 10
días antes de cada experimento de estimulación, se estimuló y
monitorizó un grupo de 10 animales de control (inmunizados solamente
con el adyuvante).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron 25 ratones BALB/c con tres dosis
de ORF0657n marcado con His (SEC ID NO: 28), 20 \mug por dosis,
sobre adyuvante de hidroxifosfato de aluminio (450 \mug por
dosis). El adyuvante hidroxifosfato de aluminio (AHP) aparece
descrito en Klein et al., Journal of Pharmaceutical Sciences
89, 311 -321, 2000. Las dosis se administraron como dos inyecciones
intramusculares de 50 \mul los días 0, 7 y 21. El día 28, se
tomaron muestras de sangre de los ratones, y en sus sueros se
analizó la reactividad frente a ORF0657n por ELISA.
El día 35 del experimento, los ratones fueron
estimulados por una inyección intravenosa de S. aureus
cultivado, a una dosis (7,3 x 10^{8} UFC/ml) que, según se
determinó en los ensayos de titulación, provoca la muerte durante
un periodo de aproximadamente 2 a 7 días. La supervivencia en este
modelo letal de cinética lenta de mortalidad se evaluó frente a un
grupo de ratones de control, que habían sido falsamente inmunizados
con AHP. La supervivencia de los ratones se monitorizó durante un
periodo de 14 días (Figura 3A). Al final del experimento, 11
ratones sobrevivieron en el grupo inmunizado con ORF0657n, en
comparación con tres que lo hicieron en el grupo de control de
AHP.
Las Figuras 3B y 3C ilustran la protección
usando polipéptidos correspondientes a las regiones ORF0657nH y
ORF0657nI. La Figura 3B ilustra la protección con SEC ID NO: 4 que
contiene una cola de histidinas en el extremo carboxilo. La Figura
3C ilustra los resultados con SEC ID NO: 5 que contiene una cola de
histidinas en el extremo carboxilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha afirmado que ORF0657n desempeña un papel
en la adquisición de hierro por parte de S. aureus. (Andrade
et al., Genome Biology 3(9):47.1-47.5,
2003). Las secuencias de ORF0657n, alunas de las cuales provienen de
fuentes diferentes, han recibido distintas designaciones en
diferentes referencias bibliográficas. (Por ejemplo, véanse Etz
et al., PNAS USA, 99:6573-6578 (LPXTGVI);
Baba et al., The Lancet 359:1819-1827, 2002
(MW1011); Kuroda et al., The Lancet 357,
1225-1240, 2001 (SA0976); Andrade et al., Genome
Biology 3(9): 47.1-47.5, 2003 (S_aur2);
Mazmanian et al., Science 299:906-909, 2003
(isdB); Mazmanian et al., Molecular Microbiology
40:1049-1057, 2001 (sasJ); Taylor et al., Mol.
Microbiol. 43:163-1614, 2002 (sirH).
En diferentes publicaciones de patente parece
estar descrita la oferta de una secuencia polipeptídica
correspondiente a una secuencia de proteínas de ORF0657n. (Meinke
et al., Publicación Internacional Número WO 02/059148,
publicada el 1 de agosto de 2002; Wang et al., Publicación
Internacional Número WO 02/077183, publicada el 3 de octubre de
2002; Masignani et al., Publicación Internacional Número WO
02/004868, publicada el 28 de noviembre de 2002; Foster et
al., Publicación Internacional Número WO 02/102829, publicada el
27 de diciembre de 2002, y Foster et al., Publicación
Internacional Número WO 03/011899, publicada el 13 de febrero de
2003).
\global\parskip1.000000\baselineskip
A partir de diferentes aislados clínicos de
S. aureus se obtuvo ADN genómico. Se agregaron aislados
clínicos a 3 ml de Caldo de Cultivo Difco Tryptic Soy (Becton
Dickinson, Sparks, MD) y se incubaron a 37ºC durante la noche a 150
rpm. Los cultivos de la noche anterior se centrifugaron en tubos
Eppendorf de 1,5 ml a 14.000 rpm durante 5 minutos. Se decantó el
caldo de cultivo, y los aglomerados se resuspendieron en 500 \mul
de tampón de resuspensión (sacarosa al 25%, Tris 10 mM, pH 7,5). Se
agregó una alícuota de 5 \mul de una solución de 2 mg/ml de
lisostafina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a cada
aglomerado resuspendido. A continuación, se incubaron las
suspensiones a 37ºC durante 1 hora.
Al final del periodo de incubación, se agregaron
a cada tubo 250 \mul de SDS al 2% y se sometió a un sistema de
torbellino hasta que la viscosidad de la solución disminuyó de forma
notoria. Se agregaron 250 \mul de una solución de
fenol-cloroformo-isoamilo (25:24:1,
en volumen) (Gibco/Invitrogen Corporation, Grand Island, NY). La
mezcla se sometió a torbellino durante 30 segundos y se centrifugó
durante 5 minutos a 14.000 rpm. Se retiró la fase acuosa superior y
se repitieron las etapas de precipitación hasta que prácticamente no
se detectaron interfaces. A cada tubo se agregó 0,1 volumen de
NaOAc 3 M, pH 4,8, y se mezcló. Entonces, se agregó 1 volumen de
isopropanol, y se volvió a mezclar. Los tubos se incubaron durante
5 minutos a temperatura ambiente y, seguidamente, se centrifugaron
a 14.000 rpm durante 15 minutos. Se decantó el sobrenadante y los
tubos se dejaron secar boca abajo sobre papel tisú. Los aglomerados
se resuspendieron en 50 \mul de H_{2}O estéril.
El ADN aislado se usó como molde para la PCR. El
gen se amplificó usando un cebador hacia adelante
(ORF0657nF, SEC ID NO: 67) y un cebador reverso (ORF0657nR, SEC ID NO: 68). Los productos de PCR se secuenciaron usando los protocolos estándar Big Dye.
(ORF0657nF, SEC ID NO: 67) y un cebador reverso (ORF0657nR, SEC ID NO: 68). Los productos de PCR se secuenciaron usando los protocolos estándar Big Dye.
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A través de una colección de aislados clínicos
de S. aureus patológica y taxonómicamente diferentes, se
observó que ORF0657n está bien conservado. La Tabla 3 ofrece un
resumen de la identidad porcentual entre los diferentes aislados,
incluidos los aislados clínicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La identidad porcentual (% ID) se determinó
alineando la secuencia polipeptídica con SC ID NO: 2 y determinando
el número de aminoácidos idénticos. Este número se dividió por el
número total de aminoácidos (de SEC ID NO: 2) y, a continuación, se
multiplicó por 100 y se redondeó hasta el número entero más
próximo.
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Se evaluó la eficacia de ORF0657n como
inmunógeno contra diferentes aislados clínicos de S. aureus,
usando ORF0657n marcado con His (SEC ID NO: 28) como inmunógeno. A
modo de inóculo de estimulación, se utilizó un subconjunto de
aislados taxonómicamente diferentes descrito en la Tabla 3. Las
secuencias de ORF0657n en estos distintos aislados difirieron de la
secuencia de ORF0657n usada en la vacuna.
Las cepas de estimulación obtenidas se
prepararon según las técnicas descritas en el Ejemplo 2. Se
inmunizaron y estimularon ratones de acuerdo con los procedimientos
descritos en el Ejemplo 3, y fueron monitorizados durante 10 días.
Los inóculos de estimulación usados de manera convencional en los
modelos superan en alto grado a los que se encuentran típicamente en
infecciones humanas.
Se demostró protección contra cepas tanto
sensibles como resistentes a meticilina. Los resultados se muestran
en las Figuras 4A-4H.
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La secuencia de ácidos nucleicos que codifica
los aminoácidos 1-646 de SEC ID NO: 28 se optimizó a
nivel de codones para la expresión en levadura. En la Figura 8C se
representa una secuencia optimizada a nivel de codones para los
aminoácidos 1-646 de SEC ID NO: 28 (SEC ID NO:
31).
Como construcción inicial para la optimización,
se utilizó la SEC ID NO: 29 exenta de la región que codifica la
cola de histidinas el extremo carboxilo. El empleo global de codones
de la secuencia de codificación antes de la optimización fue: los
genes de levadura de alta expresión utilizaron con muy baja
frecuencia o nunca 28% de los codones (179), en tanto que 20% (126)
mostraron una utilización moderadamente escasa.
La optimización de codones de los ácidos
nucleicos que codifican los aminoácidos 1 -646 de SEC ID NO: 28 se
llevó a la práctica para sustituir los codones que tienen una
expresión baja o moderada por codones con una elevada expresión de
la levadura. Además, se agregó un codón de glicina a la segunda
posición. La optimización de codones se llevó a cabo usando el
programa de software MacDNAsis Pro V 3.0. La tabla de parámetros
empleada para la retrotraducción de proteínas muestra la presencia
de codones de S. cerevisiae altamente expresados. En
MacDNAsis Pro, la función usada es "Traducir > [Proteína
-\rightarrow ADN]". El resultado se denomina "Conversión de
Aminoácido".
En algunos casos, existe más de un codón
altamente expresado para un determinado aminoácido. Por ejemplo, la
serina se codifica por "TCT" o "TCC". En estos casos, se
emplearon números aproximadamente iguales de los dos codones
diferentes. La Tabla 4 presenta una tabla de codones para codones
altamente expresados en S. cerevisiae.
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\vskip1.000000\baselineskip
Todos los codones que no fueron óptimos se
cambiaron por codones hallados en genes de levadura de elevada
expresión, con la excepción de dos codones de alanina, que se
cambiaron por codones hallados en genes de expresión moderada (GCG
que comienzan en los nucleótidos 505 y 1546) de la SEC ID NO:
31.
La secuencia global que codifica ORF0657n se
preparó por medio de la hibridación y extensión de 25 oligómeros
(SEC ID NOs: 69-93) diseñados para codificar la
secuencia final deseada. Los oligómeros tuvieron una longitud de
85-110 pb. Los oligómeros fueron una secuencia
alternativa de codificación de ORF0657n. Cada oligómero tuvo un
solapamiento complementario de 25-29 pb con el
oligómero adyacente, y la estructura dúplex tuvo una Tm de
80-84ºC. Esta se calculó de forma manual, asignando
a un par de bases GC un valor de 4ºC, y a un par de bases AT el
valor de 2ºC.
Se llevaron a cabo siete reacciones de extensión
separadas, utilizando tres o cuatro oligómeros solapados con los
adyacentes, y cebadores sentido y anti-sentido de
PCR (23-26) nt de longitud con una Tm dúplex de
70-72ºC. Se usó ADN-polimerasa Pfu
nativa (STRATAGENE, La Jolla, CA) para las reacciones de PCR en una
estrategia de "touchdown" del modo siguiente: 95ºC, 90
segundos, un ciclo; 95ºC, 30 segundos, 55ºC, 30 segundos, 68ºC, 3
minutos durante 5 ciclos, seguidos inmediatamente por una segunda
serie de reacciones; 95ºC, 30 segundos, 52ºC, 30 segundos, 68ºC, 3
minutos durante 20 ciclos. La reacción se completó por incubación a
68ºC durante 7 minutos. Como resultado de estas reacciones de PCR,
se crearon siete fragmentos co-lineales del gen (a
los que se designa en este documento como 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, por
conveniencia).
Los fragmentos se aislaron por electroforesis
sobre gel de agarosa, y se escindieron y purificaron productos del
tamaño apropiado usando el procedimiento GENE CLEAN® II (QBIOgene,
Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. En
reacciones de PCR subsiguientes, se combinaron los fragmentos
co-lineales 1, 2 y 3, los fragmentos
co-lineales 4 y 5, y los fragmentos
co-lineales 6 y 7 con los cebadores adecuados para
dar los fragmentos A, B y C, respectivamente. A continuación, se
ensambló el gen completo para ORF0657n por medio de una reacción de
PCR adicional, en la que se combinaron los fragmentos A, B y C
usando cebadores sentido y anti-sentido distales.
El producto de PCR final se aisló sobre gel y se clonó en pCR®-Blunt
II-TOPO® (INVITROGEN, Carlsbad, CA), de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Se obtuvo la secuencia de ADN de
diversos clones independientes y se identificaron los errores.
Se corrigieron los errores en diferentes
segmentos de tres clones independientes, pUC3, pUC4 y pUC6, de
manera secuencial, usando el Kit de Mutagénesis dirigida al Sitio
QUIK-CHANGE, o bien de forma simultánea, con el Kit
de Multi Mutagénesis dirigida al Sitio QUIK-CHANGE
(STRATAGENE, La Jolla, CA), siguiendo las instrucciones del
fabricante. La secuencia corregida final se obtuvo por medio del
intercambio de fragmentos de restricción reparados de los tres
clones. Se intercambió un fragmento XmnI de 1,1 kb del clon
pUC4 por el correspondiente fragmento XmnI de pUC3 para
construir pUnkC 13. Se intercambió un fragmento AccI
reparado, de 456 pb, de pUC6 por el fragmento correspondiente de
pUnkC 13 para construir pUnkCR1, y se verificó la secuencia de
ADN.
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Este ejemplo ilustra las técnicas que se pueden
utilizar para obtener cepas de Saccharomyces cerevisiae para
la expresión de genes recombinantes. A continuación, se describe la
creación de cepas designadas 1260 y 1309. Puesto que los
antecedentes genéticos de una cepa pueden influir de manera
importante sobre las propiedades de una cepa para la expresión de
una proteína heteróloga, se intentó construir cepas de levadura con
diferentes antecedentes genéticos que contuvieron también varios
marcadores genéticos deseables: (1) mutación mnn9 para
prevenir la hiperglicosilación de las proteínas secretadas; (2)
mutaciones de las proteasas prb1 y/o pep4 para
reducir los problemas con la proteólisis, y (3) sobreexpresión del
factor de transcripción GAL4 con el fin de incrementar la
expresión a partir de los promotores GAL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó una cepa inicial de S.
cerevisiae de la siguiente manera: se cruzó la cepa de S.
cerevisiae Y379-5D (MAT\alpha, cyh2, nibl,
rho^{-}, cirº) (Livingston, Genetics
86:73-84, 1977) con la cepa DC04 (MAT\alpha,
adel, adeX, leu2-04, cirº) (Broach et al.,
Cell 21:501-508, 1980). La cepa diploide
resultante se esporuló y se diseccionaron las tétradas por
procedimientos convencionales. Una de las esporas haploides dio
origen a la cepa 2150-2-3
(MAT\alpha, adel, leu2-04, cirº). La cepa
de S. cerevisiae de tipo apareamiento \alpha LB3471C
(MAT\alpha, mnn9) es la cepa de S. cerevisiae
X2180-1B (MAT\alpha, SUC2, mal, mel, gal2,
CUP1; número de la ATCC 204504), que contiene una mutación
mnn9. LB-347-1C se apareó con la
cepa tipo 2150-2-3 (MAT\alpha,
leu2-04, adel) mezclando la cepa en una placa
de agar con medio completo de YEHDG (Carty et al., J. Ind.
Micro. 2:117-121, 1987). Para la seleccionar de
diploides, las cepas apareadas se sembraron en forma de réplica
sobre placas con medio mínimo sin leucina y que como única fuente
de carbono contuvo sacarosa al 2%. Después de aislar colonias
individuales, los diploides se esporularon y los asci se
diseccionaron por técnicas convencionales. Se aisló la cepa
KHY-107 como espora haploide individual y se
caracterizó como ADE1, leu2 y mnn9 (por medio de la
técnica de tinción de Schiff). Se estableció un stock congelado en
glicerol, que se conservó a -70ºC.
KHY-107 (cir^{+}) se
cultivó a partir del stock a -70ºC y se transformó con el vector de
levadura pC1/1, que contiene el gen de levadura
LEU2-d y está relacionado con pJDB219 (Beggs,
Nature 275:104-109, 1978), excepto que el
ADN pMB9 está sustituido por ADN pBR322. Se cultivó un transformante
aislado en medio líquido selectivo (exento de leucina y que
contiene sorbitol 1 M), y, a continuación, se cultivó a través de
múltiples pasajes en medio rico (que contiene sorbitol 1 M) para
perder tanto pC1/1 como ADN 2 \mu. Las colonias que habían
perdido pC1/1 (incapaces de crecer en un medio exento de leucina) se
analizaron por hibridación ADN-ADN en busca de ADN
2 \mu. Se seleccionó un clon
aislado, KHY-107 (cirº)-1, que no exhibe ADN 2 \mu, que se estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol.
aislado, KHY-107 (cirº)-1, que no exhibe ADN 2 \mu, que se estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol.
KHY-107
(cirº)-1 se convirtió en ura3 por disrupción
génica. Se construyó un plásmido que contiene el gen URA3 de
S. cerevisiae afectado por 2 copias del gen Aph3'l de Tn903.
El casete
5'-URA3-Aph3'l-URA3-3'
se escindió del vector y se usó para transformar
KHY-107 (cirº)-1. Los
transformantes que habían integrado el casete ura3 afectado por la
disrupción se seleccionaron sobre placas de ácido
5-fluoro-orótico (Kaiser, C. et
al., Methods in Yeast Genetics, Edición 1994, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, Nueva York; 1994),
páginas 214-215) y demostraron, subsiguientemente,
ser incapaces de crecer sobre medio exento de uracilo. Se seleccionó
un clon aislado, KHY-107ura3(PN_{2}), que
se estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol.
KHY-107ura3(PN_{2}) se
cultivó en medio complejo (que contiene sorbitol 1 M) y a
continuación se sembró en placa sobre medio sintético que contiene
canavanina en lugar de arginina, y se obtuvieron mutantes
resistentes a canavanina (can^{R}). Por medio del sembrado en
rayas sobre medio sintético sólido que contuvo canavanina en lugar
de arginina, se buscaron colonias aisladas de mutantes can^{R}
espontáneos. Por ensayos de complementación genética
convencionales, se demostró que las colonias aisladas eran
can1. Se seleccionó una colonia can1 aislada, DMY10,
que se conservó como stock congelado (-70ºC) en glicerol.
Para la sobreexpresión del factor de
transcripción GAL4 de levadura, se integró el gen de fusión
GAL10p-GAL4 en el gen HIS3 de DMY10.
El casete
5'-HIS3-GAL10p-GAL4-URA3-HIS3-3'
se escindió de pKHint-C (Schultz et al.,
Gene 61:123-133, 1987) y se usó para transformar
DMY10. Se seleccionaron los transformantes que habían integrado el
casete sobre medio sintético sólido exento de uracilo y,
subsiguientemente, se demostró que eran incapaces de crecer en
medio exento de histidina. Se verificó la integración del casete
sólo en el locus HIS3 por hibridación de Southern. Se
seleccionó un integrante aislado, DMY10int-3, que se
estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol. Esta cepa se
designó como CF52.
El plásmido FP8\DeltaH, portador del gen PRB1
de S. cerevisiae (Moehle et al., Genetics 115:255-
263, 1987) se digirió con HindIII más XhoI, y el
fragmento de ADN de 3,2 kpb portador del gen PRB1 se purificó
sobre gel y se crearon extremos romos mediante tratamiento con
ADN-polimerasa T4. El plásmido pUC18 se digirió con
BamHI, se purificó sobre gel y sus extremos se hicieron romos
por tratamiento con ADN-polimerasa T4. El fragmento
del vector resultante se ligó con el fragmento del gen PRB1
anterior para dar el plásmido pUC18-PRB1. El
plásmido YEp6 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA
76:1035, 1979), que contiene el gen HIS3, se digirió con
BamHI. El fragmento BamHI de 1,7 kpb resultante,
portador del gen HIS3 funcional, se purificó sobre gel y sus
extremos se hicieron romos por tratamiento con
ADN-polimerasa T4. El vector
pUC18-PRB1 se digirió con EcoRV más
NcoI, que corta en el interior de la secuencia que codifica
PRB1 y elimina el sitio activo de proteasa B y la secuencia de
flanqueo. El fragmento EcoRV-NcoI de 5,7 kpb, portador
de las porciones 5' y 3' residuales de la secuencia de codificación
de PRB1 en pUC18, se purificó sobre gel, sus extremos se
hicieron romos por tratamiento con ADN-polimerasa
T4, se defosforiló con fosfatasa alcalina, y se ligó con el
fragmento HIS3 de extremos romos descrito anteriormente. El
plásmido resultante (designado pUC18-prb1::HIS3,
stock nº 1245) contiene el gen HIS3 funcional en lugar de la
porción del gen PRB1 que había sido eliminada
anteriormente.
El vector de disrupción del gen PRB1
(pUC18-prb1::HIS3) se digirió con SacI más
XbaI para generar un casete lineal de disrupción
prb::HIS3, y se utilizó para la transformación de la cepa
CF52 por medio del procedimiento de acetato de litio (Ito et
al., J. Bacteriol. 153:163, 1983). Se seleccionaron
transformantes His^{+} sobre medio de agar sintético exento de
histidina y se sembraron nuevamente en rayas sobre el mismo medio,
en busca de aislados clónicos. Se preparó ADN genómico a partir de
una serie de los aislados His^{+} resultantes, se digirió con
EcoRI y, a continuación, se sometió a electroforesis sobre
geles de agarosa al 0,8%. Los análisis de transferencia de Southern
confirmaron la presencia de la disrupción del gen
prb1\Delta::HIS3 deseada.
Uno de los aislados que contiene la disrupción
prb1\Delta::HIS3 deseada se seleccionó para uso posterior
y se designó como cepa nº 1260. Se prepararon stocks congelados de
la cepa nº 1260 para su conservación a -70ºC. El genotipo
resultante de la cepa 1260 es el siguiente: MAT\alpha,
leu2-2, 112, mnn9, ura3\Delta, can1,
his3\Delta::GAL 10p-GAL4-URA3,
prb1\Delta::HIS3, cirº.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de S. cerevisiae BJ1995
(MAT\alpha, leu2, trp1, ura3-52,
prb1-1122, pep4-3, gal2) ha sido
descrita previamente (Jones, E.W., Tackling the Protease Problem in
Saccharomyces cerevisiae, Methods in Enzymology 194 (1991),
páginas 428-453). Se aisló un derivado cirº de
BJ1995 que careció del plásmido de ADN 2 \mu endógeno usando el
procedimiento descrito para la construcción de la cepa 1260. El
aislado cirº resultante se designó cepa 91 y se conservó como stock
congelado (-70ºC) en glicerol.
Seguidamente, se construyó un derivado de la
cepa 91, que muestra una sobreproducción del factor de transcripción
GAL4 con el fin de incrementar la transcripción a partir de
los promotores GAL. El plásmido pKHint-C (Schultz
et al., Gene 61:123-133, 1987) se digirió con
BamHI y se utilizó el casete
5'-HIS3-GAL10p-GAL4-URA3-HIS3-3'
resultante para transformar la cepa 91. Se seleccionaron los
transformantes que habían integrado el casete sobre medio sintético
sólido exento de uracilo y, subsiguientemente, demostraron ser
incapaces de crecer en medio exento de histidina. La integración
deseada del casete en el locus HIS3 se verificó por
hibridación de Southern, usando una sonda para el gen HIS3
de levadura. Se seleccionó un integrante asilado, BJ1995cirºint nº
22, y se estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol. Este
aislado se designó cepa 1282.
Seguidamente, se aisló un derivado de la cepa
1282 que contuvo una disrupción del gen MNN9, de acuerdo con
la serie de etapas siguientes. Con el fin de provocar la disrupción
del gen MNN9 fue necesario clonar, en primer lugar, el gen
MNN9 a partir del ADN genómico de S. cerevisiae al
objeto de preparar un vector de disrupción de genes. Esto se
consiguió por tecnología PCR convencional. Se diseñaron un cebador
5'-sentido y un cebador
3'-antisentido para la PCR de la secuencia de
codificación de MNN9 de longitud completa, basados en la
secuencia publicada para el gen MNN9 de levadura (MacKay
et al., Publicación Europea Número EP o314096, Fecha de
Publicación Internacional 3 de mayo, 1989). Se utilizaron los
siguientes oligodesoxinucleótidos cebadores que contienen sitios
HindIII de flanqueo (subrayados): cebador sentido (SEC ID NO:
94): 5'-CTT A AA GCT
T AT GTC ACT TTC TCT TGT ATC
G-3'; cebador antisentido (SEC ID NO: 95):
5'-TGA T AA GCT
TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3'.
El codón de metionina iniciador para el gen MNN9 se destaca en
negritas.
La PCR se llevó a cabo usando ADN genómico de
S. cerevisiae como molde. El fragmento de PCR de 1,2 kpb
resultante, portador del gen MNN9, se digirió con HindIII, y
se ligó con pUC13 digerido con HindIII y tratado con
fosfatasa alcalina. El plásmido resultante se designó p1183. Se
aisló el gen TRP1 de levadura a partir de YRp7 (Struhl et
al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76:1035-1039,
1979) en forma de un fragmento EcoRI-BglII de 0,85 kb,
cuyos extremos se hicieron romos, y a continuación, se insertó en el
sitio PmII de p1183. El sitio PmII está en el centro
de la secuencia de codificación de MNN9 y, por lo tanto, la
inserción del gen TRP1 en ese sitio da como resultado la
disrupción del gen. Seguidamente, se digirió el plásmido resultante
pUC13-mnn9::TRP1
(pH1185-239-1) con HpaI más
EcoRI y se usó el casete
5'-mnn9-TRP1-mnn9-3'
para la transformación de la cepa 1282 por el procedimiento de
acetato de litio (Ito et al., J. Bacteriol. 153:163,
1983).
Los transformantes Trp^{+} se seleccionaron
sobre placas de agar con medio sintético exento de triptófano, y se
sembraron nuevamente en rayas sobre las mismas placas para detectar
aislados de colonias individuales. Se preparó ADN genómico a partir
de una serie de los aislados Trp^{+} resultantes, se digirió con
HindIII y, a continuación, se sometió a electroforesis sobre geles
de agarosa al 0,8%. Mediante análisis de transferencia de Southern
se confirmó la presencia de la disrupción deseada del gen
mnn9::TRP1. Se seleccionó uno de estos aislados que contiene
la disrupción deseada de mnn9::TRP1 para su uso posterior, y
se designó cepa 1309. Se prepararon stocks congelados en glicerol
para la cepa 1309 para su conservación a -70ºC. El genotipo de la
cepa 1309 es el siguiente: MAT\alpha, leu2, mnn9::TRP1, trp1,
ura3-52,
his3\Delta::GAL10p-GAL4-URA3,
prb1-1122, pep4-3, gal2,
cirº.
\vskip1.000000\baselineskip
ORF0657n de longitud completa se expresó en
E. coli (SEC ID NO: 28, ORF0657n marcado con His) y S.
cerevisiae (aminoácidos 1-646 de SEC ID NO: 28),
y se compararon los productos de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del clon final corregido, pUnkCR1
(Ejemplo 7), se amplificó el ADN que codifica la proteína ORF0657n
con codones optimizados para expresión en levadura, utilizando los
siguientes cebadores sentido y antisentido, respectivamente,
UnkCY-F (SEC ID NO: 96), 5'AAC GG TTT GGA
TCC CAC AAA ACA AAA TGG GTA ACA AGC AAC AAA AGG AAT TC3', y
UnkCY-R (SEC ID MO: 97), 5'AAC CGG TTT GGA
TCC TTA GTT CTT TCT CTT TCT TGG CAA GAC3', que contiene
sitios de restricción BamHI de flanqueo. El cebador sentido
contiene una secuencia una secuencia 5' no traducida y un codón
ATG, y el cebador antisentido contiene TAA como codón de
terminación. El producto resultante, de 1,9 kb, se aisló sobre gel
y se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1 (INVITROGEN CORPORATION,
Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante, para
construir el plásmido UnkC-B1. Subsiguientemente, se
verificó la secuencia de ADN del inserto. El fragmento BamHI
se aisló sobre gel y se sub-clonó en la orientación
apropiada en un vector de levadura (pGAL110, Figura 5A) para
construir pRUnkC-pGAL110. La secuencia del inserto
se verificó por secuenciación de ADN.
Se utilizó ADN plasmídico de
pRUnkC-pGAL110 para transformar cepas de S.
cerevisiae que contienen una mutación leu2 a prototrofia
de leucina (Leu^{+}), empleando un protocolo de transformación de
esferoplastos (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA,
75:1929-33, 1978). La construcción de las cepas 1260
y 1309 se describe en el Ejemplo 8 anterior.
Se seleccionaron transformantes sobre medio de
agar sintético exento de leucina y que contuvo sorbitol 1 M. Las
capas superior e inferior del medio de agar sintético, exento de
leucina y que contuvo sorbitol 1 M, se obtuvieron de REMEL, Lenexa,
KS (n^{os} de catálogo 09459 y 92155, respectivamente). Mediante
cultivo seriado sobre placas sin leucina SD (KD MEDICAL, Columbia,
MD) se obtuvieron aislados Leu^{+} clónicos.
Para el análisis de múltiples transformantes, se
llevaron a cabo cultivos de producción de 5,0 ml en tubos de
cultivos en rotación lenta a 30ºC. Subsiguientemente, se confirmó la
producción para transformantes seleccionados en cultivos de 25 ml
en un matraz de 125 ml. En ambos casos, se efectuaron cultivos de
siembras de 5 ml a 30ºC en medio sin leucina 5x que contuvo 4,0% de
glucosa y sorbitol 0,1 M, durante 18-24 horas, hasta
una DO_{600} de 1,5-3,0/ml. El medio sin leucina
5x contiene los siguientes componentes por litro: Base Nitrogenada
de Levadura sin aminoácidos o sulfato de amonio adicionales, 8,5 g;
adenina, 0,40 g; L-tirosina, 0,25 g; uracilo, 0,20
g; ácido succínico, 10,0 g; sulfato de amonio, 5,0 g; y 50 ml de
Solución sin Leucina nº 3. La Solución sin Leucina nº 3 contiene,
por litro de agua destilada, L-arginina, 2 g;
L-histidina, 1,0 g; L-isoleucina, 6
g; L-lisina, 4,0 g; L-metionina, 1,0
g; L-fenilalanina, 6,0 g;
L-triptófano, 4,0 g. El pH del medio se ajustó a 5,3
con hidróxido de sodio al 50%.
Para la producción en tubos, se transfirió una
parte alícuota de 0,3 ml del cultivo de siembra a 5,0 ml de medio
sin leucina 5x, que contuvo glucosa al 2%, galactosa al 4%, o a
medio YEHDG durante 72 horas, hasta una DO_{600} final de
5-16,0/ml. El medio YEHDG contiene, por litro:
L-Hy-Soja-peptona-Sheffield,
10 g; extracto de levadura, 20 g; L-dextrosa, 16 g;
D(+)-galactosa, 40 g. Para la producción en
matraces, se transfirió una parte alícuota de 1,5 ml del cultivo de
siembra a 25 ml de medio y se cultivó de la forma descrita
anteriormente, con agitación a 220 rpm.
Después de cosechar 10 unidades DO por muestra,
se disgregaron los aglomerados celulares con perlas de vidrio en
0,3 ml de tampón de lisis (tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,2,
NaCl 0,5 M, PMSF 2 mM). El lisado se recuperó por centrifugación,
las células/perlas no disgregadas se lavaron con 0,3 ml de tampón de
lisado, y se combinaron los sobrenadantes clarificados. La
concentración de proteínas se determinó mediante el sistema
Reactivo de Tinción para Ensayo de Proteínas de
BIO-RAD (BIO-RAD, Hercules, CA)
siguiendo las instrucciones del fabricante. En los lisados
celulares se analizó la expresión de ORF0657n por análisis de
inmuno-transferencia posterior a electroforesis
sobre geles de Tris-glicina de gradiente de
4-20% (INVITROGEN, Carlsbad, CA) en tampón 1X
Tris-glicina SDS (BIO-RAD) bajo
condiciones de educción y desnaturalización. Las muestras
contuvieron 20 \mug de la proteína celular total. Los geles se
sometieron a electro-transferencia sobre filtros de
membrana de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros (Optitran de
Schleicher y Schuell, Keene, NH). Para calcular el tamaño de la
proteína, se analizaron en paralelo con los lisados estándares
pre-teñidos de entre 6,4 y 203 kDa (Broad Range
Prestained SDS-PAGE Standard,
BIO-RAD).
\vskip1.000000\baselineskip
Como estándares se utilizaron ORF0657n marcado
con His (SEC ID NO: 28), purificado a partir del cultivo productor
de E. coli (hospedador E. coli HMS 174(DE3),
NOVAGEN, Madison, WI), inducido para producir ORF0657n, y un lisado
celular. La transformación de E. coli se llevó a cabo con un
vector de expresión que expresó ORF0657n marcado con His. La
cultivo de E. coli se efectuó durante la noche en caldo LB
que contuvo 30 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Al día siguiente, se
utilizaron 60 \mul del cultivo de la noche anterior para inocular
6,0 ml de LB más 30 \mug por ml de kanamicina. El cultivo se llevó
a cabo a 37ºC durante aproximadamente 3 horas, hasta que la
DO_{600} fue de entre 0,4-1,0. La expresión se
indujo con IPTG 1 mM durante 2 horas a 37ºC. Se cosecharon las
células y se conservó el aglomerado celular a -80ºC.
El lisado de E. coli se preparó usando el
Reactivo de Extracción de Proteína Bugbuster (NOVAGEN, Madison,
WI), siguiendo el protocolo del fabricante. Las proteínas se
sometieron a inmunodetección mediante transferencia de western
usando un anticuerpo monoclonal de ratón (designado "2H2B8")
contra ORF0657n como anticuerpo primario, y anticuerpo completo
unido por peroxidasa de rábano picante a IgG
anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San
Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El Mab 2H2B8 se
generó por inmunización de ratones con ORF0657n de longitud
completa, producido por E. coli, y purificado. El Mab 2H2B8
se seleccionó por ELISA y demostró ser específico para ORF0657n.
Los filtros se procesaron usando el Kit de Sustrato Conjugado HRP de
BIO-RAD.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del análisis inicial de transformantes
de levadura, se seleccionó un transformante para cada una de las
cepas 1260 y 1309 como los mejores productores de la región ORF0657n
de longitud completa (SEC ID NO: 28 exento de la cola de histidinas
en el extremo carboxilo). En las Figuras 6A y 6B se muestra un
ejemplo de su producción de la región ORF0657n de longitud
completa, después de una fermentación de 72 horas en medio YEHDG,
comparada con la producción de la región ORF0657n (SEC ID NO: 28) en
E. coli.
Tal como se muestra en las Figuras 6A (cepa
1260) y 6B (cepa 1309), pistas 5 y 6, la proteína principal
detectada por análisis de transferencia de western con mAb 2H2B8
tuvo \sim105-110 kDa. La proteína de
\sim105-110 kDa correspondió en tamaño a la
proteína de mayor tamaño detectada en la muestra de ORF0657n
recombinante purificado, producido en E. coli (SEC ID NO:
28, pista 2), o un extracto del cultivo productor de ORF0657n de
E. coli (este último no está incluido en los geles que se
muestra en la Figura 6). Las proteínas de 105-110
kDa producidas por E. coli y S. cerevisiae tienen un
peso molecular mayor que el tamaño previsto por los inventores en el
sistema de electroforesis sobre gel. Es necesario señalar que la
especie predominante detectada en los controles de E. coli
fue de tamaño menor, \sim95 kDa, y co-migró con
una cantidad mínima de la proteína producida por la levadura. Se
cree que la proteína de 105-110 kDa corresponde al
ORF0657n de longitud completa que se expresó con el líder secretor
de E. coli tanto en E. coli como en S.
cerevisiae, y la proteína de 95 kDa se considera que es un
producto de degradación. No se observó ninguna detección con un
extracto de un transformante de control obtenido con el vector
pGAL110 solo (pistas 3 y 4).
La cantidad estimada de región ORF0657n (SEC ID
NO: 28, exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo),
producida por los transformantes de las cepas 1260 y 1309, fue de
\sim10 microgramos de ORF0657n/ml de medio YEHDG, en donde la
región ORF0657n comprende -2% de la proteína total, según se
determina por transferencia de western semicuantitativa con 100 ng
de ORF0657n (SEC ID NO: 28) purificado como estándar. Tanto las
cantidades expresadas como los % de región ORF0657n (SEC ID NO: 28
exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo) de la
proteína total fueron más elevados a las 72 horas, en comparación
con 48 horas, en ambas cepas (datos no presentados). El título de
la región ORF0657n (SEC ID NO: 28 exento de la cola de histidinas en
el extremo carboxilo) producido por los transformantes de 1260 en
medio de leucina 5X que contiene glucosa al 2% y galactosa al 4%,
fue de \sim8,0 \mug/ml, y el % total de proteína fue de 2,0.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pKH4-3B (Carty et
al., Biotechnol. Lett. 12:879-884, 1990)
contiene el líder pre-pro secretor del factor de
levadura alfa (MF\alpha). La fusión de una proteína deseada con
este líder da como resultado un producto de traducción que es
escindido, en primer lugar, por la señal peptidasa de S.
cerevisiae. Subsiguientemente, la proteasa Kex2 provoca una
escisión detrás del "residuo Lys Arg" en el líder secretor, y
se libera la proteína madura. Se utilizó el promotor GAL110
inducible de S. cerevisiae para estimular la expresión de
proteína.
El vector pKH4-3B se usó para
expresar un gen optimizado a nivel del codón que codifica una SEC ID
NO: 3 alterada. La SEC ID NO: 3 se alteró mediante la eliminación
de la metionina del extremo amino terminal y agregando una
secuencia líder en el extremo amino terminal. Los nucleótidos
4-1710 de SEC ID NO: 32 proporcionan la región
optimizada a nivel de codón que codifica SEC ID NO: 3, y la
secuencia codificadora líder es aportada por el vector
pKH4-3B, preparado de la forma descrita a
continuación.
Se llevó a cabo una fusión marco del líder
pre-pro secretor del factor alfa de
pKH4-3B con la región ORF0657nH de SEC ID NO: 3.
Esto se logró por la digestión del vector pKH4-3B
con SphI, seguida del tratamiento con
ADN-polimerasa T4 para eliminar la protuberancia de
SphI, creando un extremo romo en el extremo 5', con el codón
apropiado del líder. A continuación, el vector se digirió con
BamHI para crear un sitio de clonación 3'. Esta construcción
requiere de un producto de PCR con un extremo romo 5',
correspondiente al segundo codón de la región ORF0657nH
reconstruida (SEC ID NO: 32), y un extremo terminal 3' con un codón
de terminación y un sitio de restricción BamHI.
El ADN que codifica la región ORF0657nH con
codones optimizados para la expresión en levadura, se amplificó a
partir de pUnkCR1 (Ejemplo 7) utilizando los siguientes cebadores
sentido y antisentido, respectivamente: UCKHS2 (SEC ID NO: 98)
5'GCT GAA GAA ACT GGT GGT ACC AAC3' y UCKHA2, (SEC ID NO: 99) 5' GTC
ACG GAT CCT TAA GAC TTA GCC TTG TTT TCT TGA
GTG TTC3'. El extremo 5' del cebador sentido, GCT, codifica alanina,
es decir, el extremo N-terminal predeterminado de
la región ORF0657nH. El cebador antisentido contiene un codón de
terminación TAA y un sitio BamHI (subrayado). El producto de PCR
resultante, de 1,7 kb, se aisló sobre gel y se clonó en
pH4-3B (preparado de la forma descrita
anteriormente), para construir pUS38. Se verificó la totalidad de
la secuencia de ADN del inserto y la secuencia parcial del vector, y
se demostró que la fusión deseada al elemento secretor se había
realizado. La escisión adecuada mediante Kex2p de la proteína
inicial expresada a partir de esta construcción daría como
resultado una proteína correspondiente a SEC ID NO: 3 exenta de
metionina N-terminal.
El plásmido pUS38 se usó para transformar las
cepas 1260 y 1309 de S. cerevisiae a prototrofia de leucina
(Leu^{+}) mediante el protocolo de transformación de esferoplastos
(Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA
75:1939-33, 1978). Los transformantes se
seleccionaron en medio de agar sintético exento de leucina y que
contuvo sorbitol 1 M. Las capas superior e inferior de medio de agar
sintético exento de leucina y que contiene sorbitol 1 M se
obtuvieron de REMEL, Lenexa, KS (nº de catálogo 09459 y 92155,
respectivamente). Mediante el cultivo seriado sobre placas sin
leucina SD (KD MEDICAL, Columbia, MD) se obtuvieron aislados
Leu^{+} clónicos.
Para llevar a cabo el análisis de múltiples
transformantes, se realizaron cultivos de 5 ml a 30ºC en medio sin
leucina 5X que contuvo los siguientes componentes por litro: Base
Nitrogenada de Levadura sin aminoácidos o sulfato de amonio
adicionales, 8,5 g; adenina, 0,40 g; L-tirosina,
0,25 g; uracilo, 0,20 g; ácido succínico, 10,0 g; sulfato de
amonio, 5,0 g; y 50 ml de Solución sin Leucina nº 3. La Solución sin
Leucina nº 3 contiene, por litro de agua destilada,
L-arginina, 2 g; L-histidina, 1,0 g;
L-isoleucina, 6 g; L-lisina, 4,0 g;
L-metionina, 1,0 g; L-fenilalanina,
6,0 g; L-triptófano, 4,0 g. El pH del medio se
ajustó a 5,3 con hidróxido de sodio al 50%. Se transfirió una
alícuota de 0,3 ml a 5,0 ml de medio sin leucina 5x que contuvo
glucosa al 2% más galactosa al 4%, o a medio YEHDG, durante 72
horas, hasta una DO_{600} final de 10-20,0/ml. El
medio YEHDG contiene, por litro:
L-Hy-Soja-peptona-Sheffield,
10 g; extracto de levadura, 20 g; L-dextrosa, 16 g;
D(+)-galactosa, 40 g.
Las fermentaciones se cosecharon eliminando las
células de levadura y analizando directamente en los sobrenadantes
la expresión de la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) por análisis de
transferencia de western, o por tinción de Coomassie de geles de
SDS-PAGE. Para el análisis de
inmuno-transferencia, muestras de 10 a 25
microlitros se sometieron a electroforesis sobre geles de
Tris-HCl con gradiente de 4-15%
(BIORAD, Hercules, CA) en tampón SDS 1X tris glicina (BIORAD,
Hercules, CA), bajo condiciones de reducción y desnaturalización.
Los geles se electrotransfirieron sobre filtros de membrana PVDF de
0,2 micrómetros. Las proteínas se sometieron a inmunodetección con
el anticuerpo monoclonal 2H2B8 como anticuerpo primario, y
anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG
anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San
Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El mAb 2H2B8 se
describe en el Ejemplo 9. Los filtros se procesaron usando el kit de
Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN
ELMER, Wellesley, MA).
Para el análisis de expresión de la región
ORF0657nH de levadura recombinante (SEC ID NO: 3) por tinción de
Coomassie de geles SDS-PAGE, las muestras se
sometieron a electroforesis sobre geles Tris-HCl de
gradiente 4-15% (BIO-RAD) en tampón
de SDS 1X Tris glicina (BIO-RAD), bajo condiciones
de reducción y desnaturalización. Los geles se tiñeron con
Coomassie Bio-Safe, una tinción G250 de Coomassie,
siguiendo el protocolo del fabricante (BIO-RAD).
Como estándar cualitativo, se utilizó un lisado
celular del cultivo de E. coli que produjo ORF0657nH (SEC ID
NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo). La
secuencia de aminoácidos predicha de la región ORF0657nH expresada
en E. coli es idéntica a la secuencia de aminoácidos predicha
de la región ORF0657nH expresada a nivel interno en S.
cerevisiae (SEC ID NO: 3), con la excepción de la presencia de
glicina detrás de la metionina N-terminal en la
construcción de E. coli.
Para producir la región ORF0657nH en E.
coli, el cultivo productor se cultivó durante la noche en caldo
LB que contuvo 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Se utilizó un
pET28 que codifica la SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el
extremo carboxilo para obtener la expresión de la proteína. Al día
siguiente, se utilizaron 500 \mul del cultivo de la noche
anterior para inocular 5,0 ml de caldo LB más 50 \mug por ml de
kanamicina. El cultivo se efectuó a 37ºC durante aproximadamente 3
horas hasta una DO_{600} de 0,6. La expresión se indujo con IPTG
1 mM durante 3,5 horas a 37ºC. Se cosecharon las células y el
aglomerado celular se conservó a -80ºC. El lisado de E. coli
se preparó usando el Reactivo de Extracción de Proteína Bugbuster
(NOVAGEN, Madison, WI), siguiendo las instrucciones del
fabricante.
También se incluyó como estándar la proteína de
un lisado celular del transformante de S. cerevisiae, que
expresa a nivel interno la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3), descrita
y preparada como se indica en el siguiente Ejemplo 11. Para
calcular el tamaño de la proteína, se analizaron en paralelo
estándares pre-teñidos de entre 10 y 250 kDa
(BIO-RAD) junto con las muestras sobre geles
SDS-PAGE tanto para tinción de Coomassie como para
evaluación de western.
La producción de la especie deseada se obtuvo en
medio sin leucina 5x que contuvo glucosa al 2% más galactosa al 4%.
Los transformantes que contuvieron pUS38 de ambas cepas 1260 y 1309
secretaron una proteína de \sim80 kDa que mostró una
co-migración muy próxima a la de la región ORF0657nH
expresada a nivel interno en la levadura (del ácido nucleico que
codifica la SEC ID NO: 3) y el ORF0657nH expresado en E. coli
(del ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 4 con una cola de
histidinas en el extremo carboxilo), que se detectó por
transferencia de western y tinción de Coomassie. En un experimento
típico, 500 ng de estos lisados de control y 25 microlitros de
sobrenadante del medio se sometieron a electroforesis. La detección
fue específica; la proteína de 80 kDa no se detectó en el
sobrenadante de un transformante que contiene el vector solo ni por
transferencia de western ni por tinción de Coomassie. La proteína
de \sim80 kDa secretada podría corresponder a una región ORF0657nH
(SEC ID NO: 3) madura no glicosilada o, alternativamente, podría
contener unos pocos residuos glicosilo. El anticuerpo detectó una
especie de peso molecular mayor en los sobrenadantes, así como dos
proteínas de menor peso molecular, todas las cuales se tiñeron con
Azul Coomassie. La especie de peso molecular más elevado podría
contener líder no procesado y/o podría estar glicosilada. Las
especies de bajo PM son, probablemente, productos de
degradación.
El cálculo de la cantidad de la especie de 80
kDa secretada por los transformantes de las cepas 1260 y 1309 fue
de \sim2 \mug por ml de medio de cultivo. Este valor se
determinó comparando la señal de western a 80 kDa con la de la
muestra del lisado de células de levadura que contiene la región
ORF0657nH (SEC ID NO: 3), lo que permite sugerir que la región
ORF0657nH comprende al menos 50% de la proteína total. El título
combinado de la especie restante de la región ORF0657n se determinó
en aproximadamente 50 \mug por ml de medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Por medio de la expresión intracelular de SEC ID
NO: 3 en S. cerevisiae se obtuvo una producción de muy alto
nivel de una proteína de tamaño discreto. La expresión se logró
usando una secuencia de ácidos nucleicos codificadora optimizada
para levadura.
A partir de pUnkCR1 se amplificó el ADN que
codifica la región ORF0657nH con cocones optimizados para la
expresión en levadura (SEC ID NO: 32) (Ejemplo 7), usando los
siguientes cebadores sentido y antisentido, respectivamente: (SEC
ID NO: 100) 5'GGGGGGATCC CACAAAACAA ATG GCT GAA GAA GAA ACT
GGT ACT GGT GG3', y (SEC ID NO: 101) 5'GGG GGG GGATCC TTAAGA
CTT AGC CTT GTT TTC TTG AGT3', con sitios de restricción
BamHI de flanqueo (subrayados). El cebador sentido contiene
una secuencia líder 5' no traducida y un codón ATG, y el cebador
antisentido contiene TAA como codón de terminación.
El producto de 1,7 kb resultante se aisló sobre
gel y se clonó en un vector TOPO TA pCR2.1 (INVITROGEN CORPORATION;
Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante, para
construir el plásmido pCR_iUCS-2.4. Seguidamente,
se determinó la secuencia de ADN del inserto a partir de dos clones
independientes: pCR_iUCS2.2 y pCR_iUCS2.4. Se encontró un único
error de PCR en cada uno de los insertos, localizados en diferentes
fragmentos HindIII de cada plásmido. Se obtuvo un plásmido
con la secuencia correcta intercambiando el fragmento HindIII
de 1,3 kb de pCR_iUC-S2.2 con la secuencia
correcta, por el correspondiente fragmento de
pCR_iUC-S2.4.
El fragmento de 1,3 kb de
pCR_iUC-S2.2 y el fragmento de 4,3 kb de
pCR_iUC-S2.4 se aislaron sobre gel y se ligaron. Se
seleccionó un clon con los fragmentos deseados,
pCR_iUC-S, y por secuenciación de ADN se verificaron
la orientación apropiada y la secuencia de nucleótidos.
Subsiguientemente, se sub-clonó el fragmento BamHI
de 1,7 kb en pGAL110 (Fig. 5A) para construir
piUC-S(-).
Se utilizó ADN plasmídico de
piUC-S(-) para transformar las cepas 1260 y 1309 de
S. cerevisiae a prototrofia de leucina (Leu^{+}) aplicando
un protocolo de transformación de esferoplastos (Hinnen et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75:1929-33, 1978).
Los transformantes se seleccionaron sobre medio de agar sintético
exento de leucina y que contuvo sorbitol 1 M. Las capas superior e
inferior de medio de agra sintético exento de leucina y con
sorbitol 1 M se obtuvieron en REMEL, Lenexa, KS (nº de catálogo
09459 y 92155, respectivamente). Se obtuvieron aislados Leu^{+}
clónicos por cultivo seriado sobre placas sin Leu SD (KD MEDICAL,
Columbia, MD).
En múltiples transformantes se analizó la
producción de la región ORF0657nH usando las condiciones de
fermentación descritas en el Ejemplo 9. En los lisados celulares se
analizó la producción de la región ORF0657nH por análisis de
transferencia de western o por análisis de geles
SDS-PAGE teñidos con azul Coomassie.
Para el análisis de transferencia de western,
las muestras se sometieron a electroforesis sobre geles
Tris-HCl Criterion en gradiente
4-15% (BIO-RAD, Hercules, CA) en
tampón 1X Tris glicina SDS (BIORAD), bajo condiciones de reducción
y desnaturalización. Los geles se sometieron a
electro-transferencia sobre filtros de membrana
PVDF de 0,2 micrómetros. Las proteínas se
inmuno-detectaron por transferencia de western
usando un anticuerpo monoclonal contra ORF0657n de longitud
completa (SEC ID NO: 3), 2H2B8, como anticuerpo primario, y
anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG
anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San
Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El Mab 2H2B8 se ha
descrito en el Ejemplo 9. Los filtros se procesaron usando el kit de
Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN
ELMER, Wellesley, MA).
Para el análisis de expresión de ORF0657nH de
levadura recombinante (codificado por SEC ID NO: 32) por medio de
tinción Coomassie de geles SDS-PAGE, las muestras se
sometieron a electroforesis sobre geles Tris-HCl
Criterion en gradiente 4-15%
(BIO-RAD) en tampón 1X Tris glicina SDS (BIORAD),
bajo condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se
tiñeron con Coomassie Bio-Safe, una tinción G250 de
Coomassie (BIO-RAD), siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Las muestras de lisado de células de levadura
sometidas a electroforesis contuvieron 0,5 y 1,25 \mug de
proteína total de levadura celular, respectivamente, para la
transferencia de western y la tinción con Coomassie. Como estándar
cuantitativo para la tinción con Coomassie, se usó BSA purificado
(100X, NEW ENGLAND BIOLABS, Beverly, MA). Se utilizó la región
ORF0657n recombinante y de longitud completa de E. coli,
purificada (SEC ID NO: 28) como estándar cuantitativo para los
ensayos de western. Como estándar cualitativo, se empleó en ambas
evaluaciones un lisado celular del cultivo de E. coli que
produjo la región ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de
histidinas en el extremo carboxilo), inducido para producir
ORF0657nH.
Para producir la región ORF0657nH (SEC ID NO: 4
más una cola de histidinas en el extremo carboxilo) en E.
coli, el cultivo productor se cultivó durante la noche en caldo
LB que contuvo 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Al día siguiente,
se usaron 500 \mul del cultivo de la noche anterior para inocular
5,0 ml de caldo LB más 50 \mug por ml de kanamicina. El cultivo
se sometió a 37ºC durante aproximadamente 3 horas, hasta una
DO_{600} de 0,6. La expresión se indujo con IPTG 1 mM durante 3,5
horas a 37ºC. Se cosecharon las células y los aglomerados celulares
se conservaron a -80ºC. El lisado de E. coli se preparó
usando el Reactivo de Extracción de Proteína Bugbuster (NOVAGEN,
Madison, WI), siguiendo el protocolo del fabricante. Para calcular
el tamaño de la proteína, se procesaron en paralelo estándares
pre-teñidos entre 10 y 250 kDa con los lisados
(BIO-RAD).
A partir del análisis inicial, se seleccionó un
transformante de la cepa de levadura 1260, designado
1-1, como el mejor productor de la región ORF0657nH
(SEC ID NO: 3). En las Figuras 7A y 7B se muestra un ejemplo de la
producción de la región ORF0657nH después de 72 horas de
fermentación en medio complejo YEHDG en matraces de agitación. La
proteína principal detectada por tinción Coomassie (A) o por medio
de anticuerpo (B) fue de \sim85 kDa (véanse las pistas 5, 6 y 7),
y co-migró con el ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una
cola de histidinas en el extremo carboxilo; pista 2) de E.
coli. El PM tanto del ORF0657n expresado por E. coli como
del ORF0657n expresado por la levadura fue mayor que el tamaño
predicho en el sistema de electroforesis sobre gel de los
inventores. La detección de la proteína de \sim85 kDa fue
específica; no se observó detección en un lisado celular de un
transformante que contuvo el vector pGAL110 solo (pista 3). Se
produjo una cantidad significativamente mayor de región ORF0657nH
(SEC ID NO: 3) comparada con la región ORF0657n de longitud completa
(SEC ID NO:28 exenta de la cola de histidinas en el extremo
carboxilo); compárense las pistas 5, 6 y 7 con la pista 4. El
transformante que contuvo ORF0657n de longitud completa se fermentó
al mismo tiempo que el transformante que contuvo la región
ORF0657nH (SEC ID NO: 3), bajo condiciones idénticas. Se observó
escasa evidencia de degradación de la región ORF0657nH madura,
expresada por la levadura.
Para evaluar la estabilidad de la proteína, una
muestra de un lisado celular del transformante 1-1,
que había sido congelada durante varios días y subsiguientemente
descongelada, se incluyó en el gel (Figura 7, pista 7). Se puede
observar que la integridad y la cantidad de esta muestra son
similares a las muestras recientes (pistas 5 y 6). La ausencia de
degradación y la estabilidad de la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3)
se confirmaron por transferencia de western usando un anticuerpo
policlonal de cabra generado contra el ORF0657n de longitud completa
de E. coli (SEC ID NO: 28) (no se muestran los datos).
Un cálculo de la cantidad de región ORF0657nH
(SEC ID NO: 3) de la transferencia de western y del gel Coomassie
fue de \sim360 \mug por ml de medio YEHD, y el % de proteína
total se estimó en \sim50. La cantidad producida en medio
definido fue de 225 \mug/ml de medio de cultivo, y el % de
proteína total también fue de \sim50. La cantidad de región
ORF0657nH (SEC ID NO: 3), comparada con la cantidad de región
ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 28 sin cola de histidinas
en el extremo carboxilo) fue superior (350 frente a 10 \mug/ml,
respectivamente) y, así mismo, el % de proteína total fue mayor (50
frente a 2,0).
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión intracelular de los polipéptidos
relacionados con ORF0657n se evaluó en el siguiente ejemplo, usando
una construcción de ADN que codifica la región ORF0657nG (SEC ID NO:
44). ORF0657nG (SEC ID NO: 44) es una versión truncada de SEC ID
NO: 2, que carece de la secuencia de señal
amino-terminal. SEC ID NO: 44 conserva la metionina
N-terminal y los aminoácidos 42-645
de SEC ID NO: 2.
A partir de pUnkCR1 (Ejemplo 7) se amplificó ADN
optimizado para levadura que codifica la región ORF0657nG (SEC ID
NO: 44), utilizando los siguientes cebadores sentido y antisentido,
respectivamente,
5'GGGGGGATCCCAC
AAAACAAATGGCTGAAGAAACTGGTGG3' (sec id no: 102) y 5'GGGGGGGATCCTTAGTTCTTTCTCTTTCT
TGG3' (SEC ID NO: 103), con sitios de restricción BamHI de flanqueo. El cebador sentido contiene una secuencia líder 5' no traducida y un codón ATG, y el cebador antisentido contiene TAA como codón de terminación. El producto de 1,8 kb resultante se aisló sobre gel y se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1, siguiendo las instrucciones del fabricante (INVITROGEN CORPORATION, Carlsbad, CA), para construir el plásmido pCR_iUC-L4. El análisis de secuencia de ADN confirmó que se produjo una única deleción en el extremo 5'.
AAAACAAATGGCTGAAGAAACTGGTGG3' (sec id no: 102) y 5'GGGGGGGATCCTTAGTTCTTTCTCTTTCT
TGG3' (SEC ID NO: 103), con sitios de restricción BamHI de flanqueo. El cebador sentido contiene una secuencia líder 5' no traducida y un codón ATG, y el cebador antisentido contiene TAA como codón de terminación. El producto de 1,8 kb resultante se aisló sobre gel y se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1, siguiendo las instrucciones del fabricante (INVITROGEN CORPORATION, Carlsbad, CA), para construir el plásmido pCR_iUC-L4. El análisis de secuencia de ADN confirmó que se produjo una única deleción en el extremo 5'.
Se obtuvo un clon con la secuencia correcta
intercambiando el fragmento HindIII-HindIII de 1,3 kb
de pCR_iUC-S2.2 que contuvo la secuencia correcta
(véase el Ejemplo 11) por el correspondiente fragmento de
pCR_iUC-L4. Se aislaron sobre gel y se ligaron el
fragmento de 1,3 kb de pCR_iUCS2.2 y el fragmento de 4,4 kb de
pCR_iUC-L4. Se seleccionó un clon con los
fragmentos deseados, pCR_iUC-L, y por secuenciación
de ADN se verificaron la orientación adecuada y la secuencia de
nucleótidos. Subsiguientemente, el fragmento de 1,8 kb BamHI
se sub-clonó en pGAL110 para construir
piUC-L(-) y se verificó la secuencia de ADN.
Se usó ADN plasmídico de piUC_L(-) para
transformar la cepa 1260 de S. cerevisiae a prototrofia de
leucina (Leu^{+}), según se ha descrito en el Ejemplo 9.En
diversos transformantes de levadura se analizó la producción
intracelular de la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44), usando las
condiciones de fermentación y disrupción celular descritas en el
Ejemplo 11. En 0,25-0,5 \mug de proteína de lisado
celular se analizó la producción de la región ORF0657nG por
análisis de transferencia de western, según se ha descrito en el
Ejemplo 11. Se utilizó la región ORF0657nH de E. coli
purificada (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo
carboxilo) como estándar cuantitativo, y se usó un lisado celular
del cultivo de E. coli que produjo la región ORF0657nG (SEC
ID NO: 44 con cola de histidinas en el extremo carboxilo), inducido
para producir la región ORF0657nG, como estándar cualitativo. Las
muestras se sometieron a electroforesis sobre geles
Tris-HCl Criterion en gradiente
4-15% (BIO-RAD, Hercules, CA) en
tampón 1X Tris glicina SDS (BIO-RAD), bajo
condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se
sometieron a electro-transferencia sobre filtros de
membrana PVDF de 0,2 micrómetros (BIO-RAD).
Las proteínas se
inmuno-detectaron por transferencia de western,
usando un anticuerpo policlonal contra
ORF0657n de longitud completa, purificado, producido en E. coli (SEC ID NO: 28, exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo) como anticuerpo primario, y anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El anticuerpo policlonal se generó por inmunización con la región ORF0657n de longitud completa, producida por E. coli (SEC ID NO: 28). Los filtros se procesaron usando el kit de Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN ELMER, Wellesley, MA).
ORF0657n de longitud completa, purificado, producido en E. coli (SEC ID NO: 28, exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo) como anticuerpo primario, y anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El anticuerpo policlonal se generó por inmunización con la región ORF0657n de longitud completa, producida por E. coli (SEC ID NO: 28). Los filtros se procesaron usando el kit de Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN ELMER, Wellesley, MA).
Von fines comparativos, se clonó una región
ORF0657nG (SEC ID NO: 44 con una cola de histidinas en el extremo
carboxilo) en un vector de expresión de E. coli, según se ha
descrito en el Ejemplo 1, y se expresó. La producir la región
ORF0657nG en E. coli, el cultivo de producción se cultivó
durante la noche en caldo LB que contuvo 50 \mug/ml de kanamicina
a 37ºC. Al día siguiente, se usaron 500 \mul del cultivo de la
noche anterior para inocular 5,0 ml de caldo LB más 50 \mug por
ml de kanamicina. El cultivo se desarrolló a 37ºC durante
aproximadamente 3 horas, hasta una DO_{600} de 0,6. La expresión
se indujo con IPTG 1 mM durante 3,5 horas a 37ºC. Se cosecharon las
células y los aglomerados celulares se conservaron a -80ºC. El
lisado de E. coli se preparó usando Reactivo de Extracción
de Proteína Bugbuster, siguiendo las instrucciones del fabricante
(NOVAGEN, Madison, WI). Para calcular el tamaño de la proteína, se
procesaron en paralelo estándares pre-teñidos de
entre 10 y 250 kDa (BIO-RAD) con los lisados.
A partir del análisis inicial, se seleccionó un
transformante de la cepa de levadura 1260, designado
iUC-L3, como buen productor de región ORF0657nG
después de 72 horas de fermentación en medio complejo YEHDG en tubos
de cultivo, tal como ha descrito en el Ejemplo 11. La proteína
principal detectada con tinción de Coomassie o por medio del
anticuerpo tuvo \sim85 kDa y co-migró con la
región ORF0657nG expresada en E. coli (SEC ID NO: 44 con una
cola de histidinas en el extremo carboxilo). El PM tanto de la
región ORF0657nG expresada en E. coli como de la región
ORF0657nG expresada por la levadura fue mayor que el tamaño predicho
en el sistema de electroforesis sobre gel de los inventores. La
detección de la proteína de \sim85 kDa fue específica; no se
observó detección en un lisado celular de un transformante que
contuvo el vector pGAL110 solo. El título promedio de ORF0657nG,
determinado a partir de 3 ensayos de transferencia de western, fue
de 30 \mug/ml de medio YEHDG, y se calculó que el % de proteína
total fue 10,0 (véase el Ejemplo 13 siguiente).
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó el efecto de eliminar la región
codificadora C-terminal de sortasa celular
carboxílica de ORF0657n de forma individual, y en combinación con
la retirada de la región de señal N-terminal, usando
los genes de ORF0657n optimizados a nivel de codones SEC ID NOs:
31, 32 y 45. La SEC ID NO: 31 codifica la región ORF0657n de
longitud completa. La SEC ID NO: 32 codifica la región ORF0657nH,
que carece tanto de una secuencia de señal
N-terminal como de la región de clasificación de
pared celular C-terminal. La SEC ID NO: 45 codifica
la región ORF0657nG que carece solamente de la secuencia de péptido
señal.
Un transformante que expresa la región ORF0657n
de longitud completa (SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas
en el extremo carboxilo; transformante rUnkCI), uno que expresa la
región ORF0657nH (SEC ID NO: 3, transformante 1-1),
y uno que expresa la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44; transformante
iUC-L3) se fermentaron, se prepararon y analizaron
lisados celulares, según se ha descrito en el Ejemplo 11. En la
Figura 9 se muestra una transferencia de western representativa. La
cantidad de lisado celular de proteína cargada en el gel a partir de
los diferentes transformantes no fue igual, con el fin de compensar
los diferentes niveles de expresión de las tres construcciones que
codifican regiones ORF0657n. En cada caso, se cargaron al menos dos
cantidades diferentes de lisado celular de proteína de cada
transformante que contuvo ORF0657n.
En la Figura 9 se muestran resultados típicos,
que demuestran que la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) se expresó
significativamente mejor que la región ORF0657n de longitud completa
(SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas en el extremo
carboxilo), o la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44). Se detectó una
señal sustancial con sólo 50 y 100 ng de proteína de lisado celular
productor de la región ORF0657nH, tal como se muestra en las pistas
11 y 12. Por el contrario, se usaron 1,0 y 2,0 \mug de proteína de
lisado celular del productor de la región ORF9657nC, pistas 7 y 8k,
respectivamente. Se detectó una buena señal para la región ORF0657nG
con menor proteína; se cargaron 250 y 500 ng de proteína, tal como
se muestra en las pistas 14 y 15.
La Tabla 4 muestra una comparación del título
promedio de cada una de las tres ORF y el % de proteína total
determinado a partir de tres transferencias de western
independientes. Se prepararon lisados celulares frescos para cada
transferencia de western. Los promedios incluyen los resultados de
dos fermentaciones independientes. La cantidad de ORF0657n
específico se determinó en relación con el estándar ORF0657nH de
E. coli purificado (SEC ID NO: 4 más una cola de histidinas
en el extremo carboxilo).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La eliminación de la secuencia del péptido señal
potenció el % y el título de proteína total 2,5 a 3 veces, según se
determina comparando la expresión de la región ORF0657n de longitud
completa (SEC ID NO: 28 sin la cola de histidinas en el extremo
carboxilo) y la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44). La eliminación
tanto del péptido señal como de la secuencia de clasificación de la
pared celular potenció la expresión en 8-14 veces,
en comparación con la eliminación de solamente la secuencia de
péptido señal (compárense las regiones G y H), y potenció la
expresión entre 20 y 42,5 veces en comparación con la proteína de
longitud completa (regiones C frente a H). La magnitud del aumento
de expresión tras la eliminación de la secuencia de clasificación de
pared celular fue inesperada.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de pUnkCR1 (Ejemplo 7) se amplificó ADN
que codifica la región ORF0657nI, con codones optimizados para la
expresión en levadura (SEC ID NO: 33), utilizando los siguientes
cebadores sentido y antisentido, respectivamente:
5'CTCCGGATCCCACAAAACAAAATGGCTGAAGAAACTGGT3' (SEC ID NO: 104),
y 5'GCTGCCGGGATCCTTATGGGGCTTAGATGGGGTAG3' (SEC ID NO: 105),
con sitios de restricción BamHI de flanqueo (subrayados). El
cebador sentido contiene una secuencia líder 5' no traducida y un
codón ATG, y el cebador antisentido contiene TAA como codón de
terminación. El producto resultante, de 1,3 kb, se aisló sobre gel
y se clonó en pGAL110 (Fig. 5A) para construir
piUC-I (Fig. 5B), y se verificó la secuencia de
ADN.
Se utilizó el ADN plasmídico de
piUC-I para transformar la cepa 1260 de S.
cerevisiae a prototrofia de leucina (Leu^{+}), según se ha
descrito en el Ejemplo 9. En tres transformantes Leu^{+} se
analizó la producción intracelular de la región ORF0657nI (SEC ID
NO: 1) usando la condiciones a pequeña escala para la fermentación
(cultivos de 5,0 ml), según se ha descrito en el Ejemplo 9.
La producción se comparó con la de la región
ORF0657nH (SEC ID NO: 3), producida por el transformante
1-1 de S. cerevisiae (véase el Ejemplo 11).
Se prepararon lisados celulares según se describe en ejemplo 9, y
se analizó en 100 y 200 ng de la proteína del lisado celular de
levadura la producción de ORF0657nI y ORF0657nH por análisis de la
transferencia de western semicuantitativa, según se ha descrito en
el Ejemplo 11. Como estándar cuantitativo se utilizó ORF0657nH
purificado de E. coli (SEC ID NO: 4 con una cola de
histidinas en el extremo carboxilo). Las muestras se sometieron a
electroforesis sobre geles Tris-HCl Criterion en
gradiente 4-15% (BIO-RAD, Hercules,
CA) en tampón 1X Tris glicina SDS (BIORAD), bajo condiciones de
reducción y desnaturalización. Los geles se sometieron a
electro-transferencia sobre filtros de membrana PVDF
de 0,2 micrómetros (BIO-RAD). Se procedió a la
inmuno-detección de las proteínas por transferencia
de western, usando un anticuerpo policlonal contra ORF0657n de
E. coli de longitud completa (SEC ID NO: 28) como anticuerpo
primario, y anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano
picante a IgG anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED
LABORATORIES, San Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El
anticuerpo policlonal se generó por inmunización con la región
ORF0657n de longitud completa, producida por
E. coli (SEC ID NO: 28). Los filtros se procesaron usando el kit de Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN ELMER, Wellesley, MA). Para calcular el tamaño de proteína, se procesaron en paralelo estándares pre-teñidos de entre 10 y 250 kDa (BIO-RAD) con los lisados.
E. coli (SEC ID NO: 28). Los filtros se procesaron usando el kit de Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN ELMER, Wellesley, MA). Para calcular el tamaño de proteína, se procesaron en paralelo estándares pre-teñidos de entre 10 y 250 kDa (BIO-RAD) con los lisados.
La Figura 11 muestra los resultados de 72 horas
de fermentación en medio YEHDG complejo en tubos de cultivo. Tal
como se muestra en las pistas 5, 6, 14, 15, 21 y 22, se obtuvo una
intensa detección de la región ORF9657nH expresada por levadura
(SEC ID NO: 3). Así mismo, se detectó fácilmente una proteína de
\sim60 kDa en los transformantes construidos para expresar
ORF0657nI (SEC ID NO: 1), tal como se ve en las pistas
7-12 y 16-21. El ORF0657nI
expresado en levadura (SEC ID NO: 1) co-migró con
ORF0657nI (SEC ID NO: 5 con una cola de histidinas en el extremo
carboxilo) expresado y purificado a partir de E. coli (no se
muestran los datos). El PM tanto de la región ORF0657nI expresado
en E. coli como de la región ORF0657nI expresado en levadura
fue mayor que el tamaño predicho en el sistema de electroforesis
sobre gel de los inventores. La proteína de 60 kDa detectada en los
transformantes construidos para expresar la región ORF0657nI (SEC ID
NO: 1) fue específica; no se detectó ninguna proteína en un lisado
celular derivado de un transformante de control del vector (pistas 4
y 13).
La cantidad de región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) y
de la región ORF0657nI (SEC ID NO: 1) sobre el gel se calculó a
partir de la transferencia de western semicuantitativa, por
comparación con una cantidad conocida de ORF0657nH (SEC ID NO: 4
con una cola de histidinas en el extremo carboxilo). Los títulos y
porcentajes de proteína total se calcularon como el valor promedio
determinado a partir de los lisados duplicados que contuvieron las
dos cantidades diferentes de proteína en el gel. Los títulos
volumétricos de la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) determinados a
partir de una muestra recién fermentada y de un lisado celular
congelado fueron comparables, \sim500 y \sim550 \mug/ml de
medio de cultivo, y se produjeron 320 \mug de región ORF0657nI
(SEC ID NO: 1) por ml de medio de cultivo (el título para la región
ORF0657nI corresponde al transformante 1-1). El
porcentaje de proteína total en la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3)
se estimó en 78% y 80%, respectivamente, en tanto que ORF0657nI (SEC
ID NO: 1) comprendió 45% de la proteína total.
De esta forma, la región ORF0657nI se expresó
bien en S. cerevisiae, con un título aproximadamente ,5 veces
más bajo que el de ORF0657nH (SEC ID NO: 3), y el % de proteína
total fue aproximadamente 1,3 veces menor. La correcta expresión de
la región ORF0657nI en levadura se confirmó por tinción de Coomassie
de un gel SDS-PAGE que contuvo los lisados
celulares. La expresión de la región ORF0657nI en medio YEHDG fue
mensurable: la producción en matraces de agitación de 125 ml o 2 l
fue comparable a la expresión a escala reducida en los tubos de
cultivo.
La región ORF0657nI (SEC ID NO: 1) también se
expresó bien en medio sin leucina 5X definido (medio descrito en el
Ejemplo 9). El título fue sólo \sim1,5 veces menor que el título
en el medio complejo YEHDG, en tanto que el % de proteína total fue
comparable en ambos medios. La integridad de ORF0657nI fue buena en
ambos medios, sin que se detectara una degradación significativa.
La producción de ORF0657nI fue mayor a las 72que a las 96 horas
tanto en el medio complejo como en el medio sin leucina 5X, cuando
se comprobó en fermentaciones llevadas a cabo en matraces de
agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó stock de siembra congelado de la cepa
1-1 de levadura (cepa 1260 transformada con el
plásmido piUC-S(-); descrito en el Ejemplo 11) para
la fermentación y purificación a gran escala. El vial de stock de
siembra se descongeló y se utilizó 1,0 ml para inocular un matraz
de Erlenmeyer de 250 ml que contuvo 50 ml de un medio selectivo sin
leucina (medio Leu^{-} 5X, Bayne et al., Gene
66(2):235-44, 1988) que contuvo glucosa al
4%. El matraz se incubó a 28ºC, 250 rpm sobre un agitador de
rotación. Después de 24 horas (glucosa residual 23,5 g/l), se
agregó un volumen de cultivo de 13 ml a un matraz de 2 l que contuvo
977 ml del mismo medio. Nuevamente, el matraz se incubó a 28ºC y se
agitó a 250 rpm. Después de 24 horas (glucosa residual 4,04 g/l),
el contenido del matraz de 2 l se usó para inocular un reactor de 20
l que contuvo un medio químicamente definido (Oura, Biotechnol.
Bioenginner. 16:1197, 1974), que estuvo optimizado pata las
cepas empleadas. Este medio contuvo 20 g/l de glucosa, seguidos de
25 g/l de galactosa para la inducción. El reactor se hizo funcionar
a 28ºC, 4,7 l/min, 15 psig y 300 rpm. Bajo estas condiciones, se
mantuvieron niveles de oxigeno disuelto mayores que 30% de
saturación. El crecimiento celular se monitorizó por el consumo de
glucosa, densidad óptica (A_{600} nm, cubetas de 1 -cm), peso de
células en seco, utilización de galactosa y producción de
etanol. El cultivo se continuó durante 9o horas, alcanzando una A_{600} de 33,9 y un peso de células en seco de 17,5 g/l.
etanol. El cultivo se continuó durante 9o horas, alcanzando una A_{600} de 33,9 y un peso de células en seco de 17,5 g/l.
El cultivo se cosechó a través de filtración de
flujo tangencial en fibras huecas (AMICON cartucho
Hump01-43) utilizando un dispositivo de cosecha
AMICON DC-10 (NELLEPORE, Billerica, MA). Se desechó
el permeato y se concentraron las células, se sometieron a
diafiltración con PBS y se recogieron por centrifugación a 8000
rpm, 4ºC durante 20 minutos, usando un dispositivo Sorvall Evolution
RC (rotor SLA-3000). Las células se conservaron a
-70ºC.
Para evaluar la producción de ORF0657nH por
parte de la cepa 1-1 en la fermentación a gran
escala, se prepararon lisados celulares de 10 unidades de
DO_{600} del cultivo cosechado, y se evaluaron según se detalla en
el Ejemplo 1 (no se muestran los resultados). Igualmente, se evaluó
la producción de ORF0657nH a partir de una fermentación en matraz
de agitación (72 horas, medio YEHDG complejo). Los resultados de un
análisis de transferencia de western (llevado a cabo según se ha
descrito en el Ejemplo 11) demostraron que la proteína producida por
la fermentación a gran escala co-migró con el
ORF0657nH producido en la fermentación en matraz de agitación (no
se muestran los resultados). El título de ORF0657nH de la
fermentación a gran escala (20 l) se estimó en 739 \mug por ml, y
se calculó que el porcentaje de proteína total fue de 55%, en
comparación con 732 \mug/ml y 58% de proteína total para el
matraz de agitación (usando el procedimiento semicuantitativo de
western descrito en el Ejemplo 11). Estos resultados ponen de
manifiesto la posibilidad de aumentar la producción de ORF0657n en
levadura.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la capacidad para conferir inmunidad
de protección de los polipéptidos relacionados con ORF0657n
producidos en levadura, expresando un polipéptido de SEC ID NO: en
levadura. Como controles se usaron ORF0657nC de longitud completa
(SEC ID NO: 28), ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas
en el extremo carboxilo) y ORF0657nI (SEC ID NO: 5 con una cola de
histidinas en el extremo carboxilo), expresados en E. coli,
así como adyuvante solo.
Se obtuvo un polipéptido relacionado con
ORF0657n de SEC ID NO: 3 a partir de levadura y se usó en un modelo
animal para proporcionar inmunidad de protección. El polipéptido de
SEC ID NO: 3 se expresó de la forma descrita en el Ejemplo 11.
Células congeladas de S. cerevisiae
recombinante que expresan ORF0657nH (SEC ID NO: 3) se resuspendieron
a 5 ml por gramo de peso húmedo de células en MOPS 0,2 M, pH 7,0,
con inhibidores de proteasa (exento de EDTA). Se preparo un lisado
mediante cuatro pasajes a través de un microfluidizador a 95,2 Mpa
(Microfluidics Modelo 110S). El lisado se clarificó por
centrifugación (10.000 X g, 20 minutos, 2-8ºC),
seguida de filtración gruesa (pre-filtro de fibra de
vidrio, Millipore) y filtración fina (acetato de celulosa, 0,2
\mum, Whatman).
El Lisado Clarificado se fraccionó en una
columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (Pharmacia
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR, fase móvil: MOPS
0,2 M, pH 7,0). Las fracciones se analizaron por
SDS-PAGE con detección de Coomassie y transferencia
de western, usando antisuero específico para la proteína ORF0657n
(preparado contra ORF0657n de longitud completa, SEC ID NO: 28). Se
combinaron las fracciones que contuvieron el producto.
El Producto de SEC se sometió a filtración
estéril a través de acetato de celulosa 0,2 \mum, bajo condiciones
asépticas. La pureza del Producto Filtrado con Esterilidad fue
\geq o superior, y 94% por SDS-PAGE y
transferencia de western. El Producto de Filtración Estéril se
formuló a 0,2 mg/ml con AHP y Timerosal.
La capacidad de los polipéptidos relacionados
con ORF0657n producidos en levadura para conferir inmunidad de
protección se ilustra en la Figura 10. ORF0657nH (SEC ID NO: 3)
expresado en levadura ofreció una inmunidad de protección
equivalente a las de los polipéptidos expresados en E.
coli.
\vskip1.000000\baselineskip
Tres grupos de monos Rhesus se inmunizaron con
polipéptido relacionado con ORF0657n producido por levadura
(ORF0657nH, SEC ID NO: 3) o polipéptido relacionado con ORF0657
expresado en E. coli (ORF0657n de longitud completa, SEC ID
NO: 28), formulados con o sin AHP. Los monos del grupo de vacuna
recibieron 50 mcg de polipéptidos relacionados con ORF0657n por vía
intramuscular.
Como se muestra en la Figura 12, los animales
del grupo de vacuna respondieron, después de una única dosis, con un
aumento de 3 a 6 veces de la media geométrica de los títulos, frente
a títulos previos modestos, lo que sugiere la existencia de una
respuesta anamnésica. Por el contrario, la media geométrica de
títulos correspondientes a los animales del grupo de control se
mantuvo inalterada (dentro de la variabilidad del ensayo con
anticuerpo). Después de una segunda dosis de vacuna, la media
geométrica de los títulos posteriores a la dosis uno en los grupos
de vacuna y de control variaron muy poco en comparación con los
títulos posteriores a la dosis.
Para observar el desarrollo de respuestas de
anticuerpo después de sólo una dosis, el grupo que recibió la región
ORF0657nH (SEC ID NO: 3) expresada en levadura fue sometido a un
seguimiento de 3 meses (última fecha estudiada). Los títulos de
anticuerpo siguieron aumentando después de 9 días, alcanzando
niveles que no fueron superados incluso después de 2 ó 3 dosis de
vacuna.
Estas observaciones sugieren que una dosis de la
vacuna puede desencadenar respuestas sustanciales y duraderas de
anticuerpo subsiguientes a la estimulación natural del sistema
inmunológico debida, probablemente, a la exposición ambiental a
S. aureus. El estudio de los títulos de anticuerpo
preexistentes en el ser humano demostró la presencia de modestos
títulos de anticuerpo contra ORF0657n en todas las muestras
analizadas (no se muestran los datos).
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Merck & Co, Inc,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS PARA INDUCIR UNA
RESPUESTA INMUNE PROTECTORA CONTRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21669YPCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/489, 840
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-07-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/520, 115
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-11-2003
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para windows versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nl con metionina en el
extremo amino
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 645
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<212> PRT
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<213> S. aureus
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 569
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> ORF0657nH con metionina en el
extremo amino
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 570
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH con
metionina-glicina en el extremo amino
\newpage
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<400> 4
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<211> 447
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH con
metionina-glicina en el extremo amino
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<400> 5
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<211> 576
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> ORF0657nH
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> ORF0657nH
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> ORF0657nH
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<211> 568
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<212>PRT
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<223> ORF0657nH
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<210> 11
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<211> 565
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<400> 11
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 566
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<210> 15
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<211> 564
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<212> PRT
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<223> ORF0657nH
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<211> 565
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<211> 565
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<400> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<400> 21
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<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<400> 22
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<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 570
\vskip0.400000\baselineskip
<212>PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 654
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SEC ID Nº: 2 modificada para
contener una glicina después de la metionina del extremo amino una
carboxil His-T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1962
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657n de longitud completa +
Carboxil Marcador - His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1737
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH + Carboxyl Marcadr -
His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1941
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica SEC ID Nº: 28 sin un
Carboxil Marcador - His y tiene codones optimizados para la
expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 3 y tiene
codones optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 1 y tiene
codones optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 481
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nl+
\newpage
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<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 42 y tiene
codones optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 605
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORF0657nG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1818
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 44 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que
contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados
para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la región SEC ID Nº: 17 l+,
optimizada a nivel de codón para la expresión en levadura, y
codifica un codón de iniciación de metionina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la región SEC ID Nº: 17 l,
optimizada a nivel de codón para la expresión en levadura, y
codifica un codón de iniciación de metionina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1938
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica ORF0657n de longitud
completa que contiene la SEC ID Nº: 17 modificada para contener una
glicina después de la metionina del extremo amino y tiene codones
optimizados para la expresión en levadura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codificada la SEC ID Nº: 20, tiene
codones optimizados para la expresión en levadura, codifica un codón
de iniciación de metionina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la región SEC ID Nº: 20 l+,
optimizada a nivel de codón para la expresión en levadura, y
codifica un codón de iniciación de metionina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la región SEC ID Nº: 20I,
optimizada a nivel de codón para la expresión en levadura, y
codifica un codón de iniciación de metionina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1938
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica ORF0657n de longitud
completa que contiene la SEC ID Nº: 20 modificada para contener una
glicina después de la metionina del extremo amino y tiene codones
optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 565
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Unknown
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 567
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 566
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His-Tag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggccgtcg ttttac
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Iniciador
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<223> Iniciador
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\hfill41
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<220>
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<223> Iniciador
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<212> ADN
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<220>
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<223> Iniciador
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Iniciador
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<211> 644
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<212> PRT
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<213> S. aureus
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<400> 106
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<211> 644
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<212> PRT
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<213> S. aureus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
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Claims (31)
1. Un inmunógeno polipeptídico que comprende una
secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 1, en
el que dicho polipéptido confiere inmunidad de protección contra
S. aureus, y en el que si una o más regiones polipeptídicas
adicionales están presentes, estas regiones adicionales no
proporcionan un extremo carboxilo terminal que contenga los
aminoácidos 609-645 de SEC ID NO: 2.
2. El polipéptido según la reivindicación 1, en
el que dicho polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos
idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 3, o a un fragmento de la
misma, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al
menos 90% a SEC ID NO: 1.
3. El polipéptido según la reivindicación 2, en
el que dicho polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos
idéntica en al menos 94% a SEC ID NO: 3, o a un fragmento de la
misma, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al
menos 94% a SEC ID NO: 1.
4. El polipéptido según la reivindicación 3, en
el que dicho polipéptido consiste en una secuencia idéntica en al
menos 94% a SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 42.
5. El polipéptido según la reivindicación 1, en
el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO:
42, o difiere de dichas secuencias en hasta 25 alteraciones de
aminoácidos.
6. El polipéptido según la reivindicación 5, en
el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO:
42, o difiere de dichas secuencias en hasta 10 alteraciones de
aminoácidos.
7. El polipéptido según la reivindicación 6, en
el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO:
42, o difiere de dichas secuencias en hasta 5 alteraciones de
aminoácidos.
8. El polipéptido según la reivindicación 1, en
el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO:
42.
9. El polipéptido según la reivindicación 1, en
el que dicho polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de
SEC ID NOs: 1, 3, 7, 17, 20 ó 42, y hasta 20 aminoácidos
adicionales.
10. El polipéptido según la reivindicación 5, en
el que dicho polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de
SEC ID NOs: 7, 17 ó 20.
11. El polipéptido según cualquier
reivindicación anterior, exento de la totalidad o de la mayor parte
de los restantes polipéptidos a los que el polipéptido se encuentra
asociado de manera natural.
12. Un inmunógeno consistente en los
polipéptidos según cualquier reivindicación anterior, en el que
dicho inmunógeno consiste en dicha secuencia de aminoácidos y una o
múltiples regiones o restos adicionales, unidos covalentemente con
dicha secuencia en el extremo carboxi o amino terminal, en el que
cada región o resto se selecciona de manera independiente de una
región o resto que tiene al menos una de las propiedades siguientes:
potencia la respuesta inmunitaria, facilita la purificación, o
facilita la estabilidad del polipéptido.
13. Una composición capaz de inducir una
respuesta inmunitaria de protección en un paciente, que comprende
una cantidad inmunológicamente efectiva del inmunógeno según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
14. La composición según la reivindicación 13,
en el que dicha composición comprende, adicionalmente, un
adyuvante.
15. Un ácido nucleico que comprende un gen
recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
el inmunógeno polipeptídico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10.
16. El ácido nucleico según la reivindicación
15, en el que el gen recombinante no codifica una secuencia que
codifique un péptido señal celular, y no codifica una secuencia de
señal de clasificación de pared celular.
17. El ácido nucleico según la reivindicación
16, en el que dicho gen recombinante contiene uno o múltiples
codones optimizados para la expresión en una levadura.
18. El ácido nucleico según la reivindicación
17, en el que dicha secuencia nucleotídica está optimizada a nivel
de codones en al menos 50% para la expresión en levadura.
19. El ácido nucleico según la reivindicación
16, en el que dicha secuencia nucleotídica se selecciona del grupo
consistente en: SEC ID NO: 30; SEC ID NO: 31; SEC ID NO: 32; SEC ID
NO: 33; SEC ID NO: 34; SEC ID NO: 35; SEC ID NO: 36; SEC ID NO: 37;
SEC ID NO: 38; SEC ID NO: 39; SEC ID NO: 40; SEC ID NO:41; SEC ID
NO: 46; SEC ID NO: 47; SEC ID NO: 48; SEC ID NO: 49; SEC ID NO: 50;
SEC ID NO: 51; SEC ID NO: 52 y SEC ID NO: 53.
20. El ácido nucleico según la reivindicación 15
ó 19, en el que dicho ácido nucleico es un vector de expresión.
21. Una célula recombinante que comprende el
ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a
20.
22. Un procedimiento para preparar un
polipéptido de S. aureus que ofrece inmunidad de protección,
que comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar la célula recombinante de la reivindicación 21 bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y
- (b)
- purificar dicho polipéptido.
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23. El procedimiento según la reivindicación 22,
en el que dicha célula recombinante es un S. cerevisiae.
24. Un inmunógeno según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 para utilizar en un procedimiento de
tratamiento del cuerpo humano mediante una terapia.
25. El inmunógeno según la reivindicación 24,
para ofrecer inmunidad de protección contra S. aureus.
26. El inmunógeno según la reivindicación 25, en
el que dicho paciente es un ser humano.
27. El inmunógeno según la reivindicación 25, en
el que dicho paciente recibe tratamiento profiláctico contra una
infección de S. aureus.
28. El inmunógeno según la reivindicación 24,
para inducir una respuesta anamnésica.
29. El inmunógeno según la reivindicación 28, en
el que dicha respuesta anamnésica da como resultado un aumento de al
menos 3 veces del título geométrico con respecto al título
preexistente, en un plazo de 3 días.
30. Uso de un inmunógeno según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12 para la fabricación de un medicamento
para ser usado en un procedimiento según se define en una cualquiera
de las reivindicaciones 25 a 29.
31. Un inmunógeno según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en combinación con inmunógenos adicionales
seleccionados de: uno o múltiples inmunógenos de S. aureus
adicionales; uno o múltiples inmunógenos dirigidos contra uno o
múltiples organismos Staphylococcus adicionales; y uno o múltiples
inmunógenos dirigidos contra otros organismos infecciosos.
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