ES2342778T3 - Polipeptidos para la induccion de una respuesta inmunitaria de proteccion contra staphylococcus aureus. - Google Patents

Polipeptidos para la induccion de una respuesta inmunitaria de proteccion contra staphylococcus aureus. Download PDF

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Abstract

Un inmunógeno polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 1, en el que dicho polipéptido confiere inmunidad de protección contra S. aureus, y en el que si una o más regiones polipeptídicas adicionales están presentes, estas regiones adicionales no proporcionan un extremo carboxilo terminal que contenga los aminoácidos 609-645 de SEC ID NO:

Description

Polipéptido para la inducción de una respuesta inmunitaria de protección contra Staphylococcus aureus.
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica los beneficios de la Solicitud Provisional de EE.UU. Nº 60/489.840, presentada el 24 de julio, 2003 y de la Solicitud Provisional de EE.UU. Nº 60/520.115, presentada el 14 de noviembre, 2003.
Antecedentes de la invención
Las referencias citadas a lo largo de la presente solicitud no se admiten como técnica anterior de la invención reivindicada.
Staphylococcus aureus es un patógeno responsable de una extensa gama de enfermedades y trastornos. Los ejemplos de enfermedades y trastornos causados por S. aureus incluyen bacteriemia, endocarditis infecciosa, foliculitis, furunculosis, ántrax, impétigo, impétigo bulloso, celulitis, botriomicosis, síndrome del shock tóxico, síndrome de la piel escaldada, infecciones del sistema nervioso central, enfermedades oftalmológicas infecciosas e inflamatorias, osteomielitis y otras infecciones de articulaciones y huesos, e infecciones de las vías respiratorias. (The Staphylococci in Human Disease, Crossley y Archer (eds.), Churchill Livingstone Inc., 1997).
Es posible emplear estrategias de base inmunológica para intentar controlar las infecciones por S. aureus y la diseminación de S. aureus. Las estrategias de base inmunológica incluyen las inmunizaciones pasiva y activa. La inmunización pasiva utiliza inmunoglobulinas que tiene como diana S. aureus. La inmunización activa induce respuestas inmunitarias contra S. aureus.
Las vacunas potenciales contra S. aureus tienen como diana los polisacáridos y polipéptidos de S. aureus. El establecimiento de las dianas se puede lograr utilizando como componentes de la vacuna polisacáridos y polipéptidos apropiados de S. aureus. Ejemplos de potenciales componentes polisacáridos de la vacuna incluyen los polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8 de S. aureus. (Shinefield et al., N. Eng. J. Med. 346:491-496, 2002). Ejemplos de polipéptidos que se puede usar como posibles componentes de vacuna incluyen el colágeno adhesina, proteínas que fijan fibrinógeno, y el factor de aglomeración (o virulencia). (Mamo et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 10:47-54, 1994; Nilsson et al., J. Clin. Invest. 101:2640-2649, 1998; Josefsson et al, The Journal of Infectious Diseases 184:1572-1580, 2001).
La información relativa a las secuencias de polipéptidos de S. aureus se ha obtenido de la secuenciación del genoma de S. aureus. (Kuroda et al., Lancet 357:1225-1240, 2001; Baba et al., Lancet 359:1819-1827, 2000; Kunsch et al., Publicación de Patente Europea EP 0.786.519, publicada el 30 de julio, 1997). En cierta medida, se ha utilizado bioinformática en los intentos de caracterizar las secuencias de polipéptidos obtenidas de la secuenciación del genoma. (Kunsch et al., Publicación de Patente Europea EP 0.786.519, publicada el 30 de julio, 1997).
Como parte de los intentos de identificar los genes que codifican antígenos potenciales, se pueden utilizar técnicas tales como las que implican tecnología de expresión y sueros de pacientes infectados. (Foster et al., Publicación Internacional Número WO 01/98499, publicada el 27 de diciembre, 2001; Meinke et al., Publicación Internacional Número WO 02/059148, publicada el 1 de agosto, 2002).
Resumen de la invención
La presente invención muestra polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos relacionados estructuralmente con SEC ID NO: 1, los usos de tales polipéptidos, y los sistemas de expresión para producir estos polipéptidos. SEC ID NO: 1 es un derivado truncado de un polipéptido de longitud completa de S. aureus. El polipéptido de longitud completa se designa en este documento como "ORF0657n" de longitud completa. Los polipéptidos que contienen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1 han demostrado producir una respuesta inmunitaria de protección contra S. aureus.
La referencia a inmunidad o respuesta inmunitaria "protectora" indica la existencia de un nivel detectable de protección contra la infección de S. aureus. El nivel de protección se puede evaluar usando modelos animales tales como los que se describen en este documento.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un inmunógeno polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en la menos 90% a SEC ID NO: 1, en el que el polipéptido no contiene un extremo terminal carboxilo producido por los aminoácidos 609-645 de SEC ID NO: 2, y el polipéptido confiere inmunidad de protección contra S. aureus. SEC ID NO: 2 proporciona un polipéptido ORF0657n de longitud completa, en el que los aminoácidos 609-645 ofrecen el dominio terminal carboxilo que se inicia en el resto LPXTG (al que se hace referencia en este documento como "señal de clasificación de la pared celular").
La referencia a "inmunógeno" indica la capacidad para conferir inmunidad de protección.
La referencia a que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 1 indica que se encuentra presente una región relacionada con SEC ID NO: 1 y que puede haber presentes regiones polipeptídicas adicionales. Si hay presentes secuencias polipeptídicas adicionales, entonces el polipéptido carece del resto LPXTG carboxilo aportado por los aminoácidos 609-645 de SEC ID NO: 2.
Otro aspecto de la presente invención describe un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos que ofrece inmunidad de protección contra S. aureus. El inmunógeno comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 1, y una o múltiples regiones o restos adicionales unidos de forma covalente en el extremo terminal carboxilo o en el extremo terminal amino, en donde dichas regiones o restos adicionales no confieren un extremo terminal carboxilo que contiene los aminoácidos 609-645 de SEC ID NO: 2, en donde cada región o resto se selecciona independientemente de una región o resto que posee al menos una de las siguientes propiedades: potencia la respuesta inmunitaria, facilita la purificación, o facilita la estabilidad de polipéptidos.
La referencia a "región o resto adicional" indica una región o resto diferente de un polipéptido relacionado con ORF0657n que se produciría en un hospedador biológico, tal como un hospedador procariótico o eucariótico. La región o el resto adicionales pueden ser, por ejemplo, una región polipeptídica o no peptídica adicional.
Otro aspecto de la presente invención describe una composición capaz de inducir inmunidad de protección contra S. aureus en un paciente. La composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad inmunológicamente efectiva de un inmunógeno, según se ha descrito anteriormente, confiriendo inmunidad de protección contra S. aureus. Una cantidad inmunológicamente efectiva es una cantidad suficiente para proporcionar inmunidad de protección contra infecciones de S. aureus. La cantidad debe ser suficiente para prevenir de manera significativa la probabilidad o la gravedad de una infección de S. aureus.
Otro aspecto de la presente invención describe un ácido nucleico que comprende un gen recombinante que codifica un polipéptido, según se ha descrito anteriormente, que confiere inmunidad de protección contra S. aureus. Un gen recombinante contiene ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido, junto con elementos reguladores para la transcripción y el procesamiento adecuados (que pueden incluir elementos traduccionales y postraduccionales). El gen recombinante puede existir de forma independiente de un genoma hospedador, o puede formar parte de un genoma hospedador.
Un ácido nucleico recombinante es un ácido nucleico que, en virtud de su secuencia y/o forma, no se produce en la naturaleza. Ejemplos de ácidos nucleicos recombinantes incluyen ácido nucleico purificado, dos o más regiones de ácido nucleico combinadas entre sí, que proporcionan un ácido nucleico diferente del hallado en la naturaleza, y la ausencia de una o múltiples regiones de ácido nucleico (por ejemplo, regiones corriente arriba y corriente abajo), que se encuentran asociadas de manera natural entre sí.
Otro aspecto de la presente invención describe una célula recombinante. La célula comprende un gen recombinante que codifica un polipéptido, según se ha descrito anteriormente, que confiere inmunidad de protección contra
S. aureus.
Un aspecto adicional de la presente invención describe un procedimiento de preparación de un polipéptido según se ha descrito anteriormente, que proporciona inmunidad de protección contra S. aureus. El procedimiento comprende cultivar una célula recombinante que contiene ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido y la purificación del polipéptido.
Otro aspecto de la presente invención describe un polipéptido, según se ha descrito anteriormente, que confiere inmunidad de protección contra S. aureus, preparado por un proceso que comprende las etapas de cultivar una célula recombinante, que contiene ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido en un hospedador, y purificar el polipéptido. Se pueden emplear diferentes células hospedadoras. En una forma de realización de la presente invención, la célula hospedadora es una célula de levadura.
Otro aspecto de la presente invención describe un inmunógeno, según se ha descrito anteriormente, para inducir una respuesta inmunitaria de protección en un paciente contra S. aureus. El inmunógeno se administra al paciente en una cantidad inmunológicamente efectiva, que confiere inmunidad de protección contra S. aureus.
Otro aspecto de la presente invención describe un inmunógeno, según se ha descrito anteriormente, para inducir una respuesta anamnésica en un paciente. El procedimiento comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad efectiva de inmunógeno para producir la respuesta anamnésica.
Otro aspecto de la presente invención describe ácido nucleico que codifica un polipéptido relacionado con
ORF0657n, que ha sido optimizado para su expresión en levadura. Se optimizan uno o múltiples codones para la expresión en levadura.
\newpage
Otro aspecto de la presente invención describe un procedimiento para preparar un polipéptido, según se ha descrito anteriormente, que ofrece inmunidad de protección contra S. aureus en una célula de levadura recombinante. El procedimiento comprende las etapas de:
(a)
cultivar una célula de levadura recombinante bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido, en donde la célula de levadura recombinante comprende un gen recombinante que codifica el polipéptido, y donde el polipéptido es un polipéptido relacionado con ORF0657n de longitud completa, que ofrece inmunidad de protección contra la infección de S. aureus, o un fragmento del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 90% a la SEC ID NO: 1; y
(b)
purificar el polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Con la excepción de que términos particulares sean mutuamente excluyentes, la referencia a la palabra "o" indica cualquiera o ambas posibilidades. Se utilizan frases ocasionales, tales como "y/o" para destacar cualquiera o ambas posibilidades.
La referencia a términos abiertos tales como "comprende" permite la inclusión de elementos o etapas adicionales. Frases ocasionales tales como "uno o múltiples" se utilizan con términos abiertos para destacar la posibilidad de elementos o etapas adicionales.
A menos que se indique expresamente lo contrario, las referencias a términos tales como "un" o "una" no están limitadas a una sola. Por ejemplo, "una célula" no excluye "células". Se utilizan frases ocasionales tales como "uno o múltiples" para destacar la presencia de una pluralidad.
Otras características y ventajas de la presente invención resultan evidentes de las descripciones adicionales que se ofrecen en este documento, incluidos los diferentes ejemplos. Los ejemplos incluidos ilustran diferentes componentes y metodologías de utilidad para llevar la presente invención a la práctica. Los ejemplos no limitan la invención reivindicada. Basándose en la presente descripción, el experto en la técnica puede identificar y utilizar otros componentes y metodología útiles para llevar la presente invención a la práctica.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D ofrecen una ilustración esquemática de regiones polipeptídicas relacionadas con ORF0657n, cuya protección ha sido analizada en animales, y algunas secuencias ORF0657n diferentes. La Figura 1A ilustra un esquema de polipéptidos que fueron ensayados y demostraron ser protectores (mostrados en rectángulos macizos). La Figura 1B ofrece una secuencia de longitud completa usada como referencia para la Figura 1A (SEC ID NO: 2). La Figura 1C ilustra la SEC ID NO: 28. La SEC ID NO: 28 contiene una "cola de histidinas" en el extremo C-terminal (LEHHHHHH; SEC ID NO: 64). La SEC ID NO: 28 que contiene una cola de histidinas en el extremo carboxilo se designa también en este documento como "ORF0657n con cola de histidinas". La Figura 1D ilustra una secuencia ORF0657nl+.
Las Figuras 2A-2E ofrecen una comparación de secuencias de diferentes secuencias relacionadas con ORF0657n a través de la región ORF0657nH. Las SEC ID NOs: se indican en la Figura como "ID".
Las Figuras 3A, 3B y 3C ilustran la capacidad de los polipéptidos relacionados con ORF0657n, que proporcionan la secuencia de longitud completa, la región ORF657nH y la región ORF0657nl, de conferir inmunidad de protección contra S. aureus Becker. Los polipéptidos se utilizaron con un adyuvante de hidroxifosfato de aluminio (AHP). La Figura 3A ilustra los resultados con SEC ID NO: 28. La Figura 3B ilustra los resultados con SEC ID NO: 4 que contiene una cola de histidinas en el extremo carboxilo. La Figura 3C ilustra los resultados con SEC ID NO: 5 que contiene una cola de histidinas en el extremo carboxilo. La referencia a una "cola de histidinas en carboxilo" indica que el grupo de cola de histidinas LEHHHHHH (SEC ID NO: 64) se encuentra presente en el extremo carboxilo terminal.
Las Figuras 4A-4H ilustran la capacidad de los polipéptidos relacionados con ORF0657n para ofrecer inmunidad de protección contra diferentes exposiciones a S. aureus. Como inmunógeno se utilizó el polipéptido de la SEC ID NO: 28. La Figura 4A muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de exposición CL-10 (2,2 x 10^{8} UFC/ml). La Figura 4B muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de exposición CL-10 (2,1 x 10^{8} UFC/ml). La Figura 4C muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de exposición CL-13 (2,9 x 10^{8} UFC/ml). La Figura 4D muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de exposición CL-13 (2,8 x 10^{8} UFC/ml). La Figura 4E muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de exposición CL-30 (3,1 x 10^{8} UFC/ml). La Figura 4F muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de exposición CL-30 (3,0 x 10^{8} UFC/ml). La Figura 4G muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de exposición CL-18 (1,0 x 10^{8} UFC/ml). La Figura 4H muestra los resultados obtenidos con el uso de la cepa de exposición CL-21 (1,6 x 10^{8} UFC/ml).
Las Figuras 5A y 5B ilustran mapas plasmídicos de plasmidios de expresión en S. cerevisiae. La Figura 5A ofrece un mapa plasmídico del vector pGAL110. La Figura 5B proporciona un mapa plasmídico para piUC-I que muestra una secuencia optimizada con codón de levadura, clonada bajo el control del promotor GAL1 de pGAL110.
Las Figuras 6A y 6B muestran transferencias de western que exhiben la expresión intracelular de un ORF0657n de longitud completa que tiene los aminoácidos 1-646 de la SEC ID NO: 28 (SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas del extremo carboxilo). Pista 1, estándares de tamaño molecular; pista 2, región de ORF0657n recombinante de longitud completa, purificada, producida por E. coli (SEC ID NO: 28), 100 ng; las pistas 3-6 contienen 20 \mug de lisado celular de levadura; las pistas 3 y 4, lisados celulares de fermentaciones duplicadas de transformantes de 1260 (Figura 6A) y 1309 (Figura 6B), que contienen solamente el vector pGAL110; las pistas 5 y 6, lisados celulares de fermentaciones duplicadas de transformantes de 1260 (Figura 6A) y 1309 (Figura 6B) que contienen pRUUnkC-pGAL110 que expresa la región ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 28, exenta de la cola de histidinas del extremo carboxilo).
Las Figuras 7A y 7B representan una tinción de Coomassie de un gel SDS-PAGE y una transferencia de western, respectivamente, que muestran la expresión intracelular en S. cerevisiae del ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 3. Pista 1, Panel A, BSA, 1,25 \mug; Panel B, ORF0657n recombinante, de longitud completa y purificada, producida por E. coli (SEC ID NO: 28), 100 ng; pista 2, lisado celular del productor de ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas del extremo carboxilo) en E. coli; Panel A, 1,25 \mug, Panel B, 0,5 \mug. Pistas 3-7, Paneles A y B, contienen 1,25 y 0,5 \mug de un lisado celular de levadura, respectivamente: pista 3, transformante que contiene solamente el vector pGAL110; pista 4, transformante que contiene ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas del extremo carboxilo); pistas 5, 6 y 7, transformante 1-1 que contiene piUC-S(-), que expresa la región ORF0657nH madura (SEC ID NO: 3); la pista 7 contiene un lisado celular (del transformante 1-1) que se congeló y, subsiguientemente, descongeló. La pista 8 contiene los estándares de tamaño molecular.
Las Figuras 8A-8U ofrecen ejemplos de diferentes secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos relacionados con ORF0657n. La Figura 8A ofrece una secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 29) que codifica la SEC ID NO: 2 más una cola de histidinas del extremo carboxilo. La Figura 8B ofrece una secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 30) que codifica la SEC ID NO: 4 más una cola de histidinas del extremo carboxilo. La Figura 8C ofrece una secuencia de ácido nucleico optimizada para levadura (SEC ID NO: 31) que codifica la SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas del extremo carboxilo. La Figura 8D ofrece una secuencia de ácido nucleico optimizada para levadura (SEC ID NO: 32) que codifica la SEC ID NO: 3. La Figura 8E ofrece una secuencia de ácido nucleico optimizada para levadura (SEC ID NO: 33) que codifica la SEC ID NO: 1. Las Figuras 8F-8M proporcionan secuencias de ácido nucleico optimizadas para levadura (SEC ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41) que codifican la SEC ID NO: 7, que contiene una metionina en su extremo amino terminal. Las Figuras 8N-8U ofrecen secuencias de ácido nucleico optimizadas para levadura (SEC ID NOs: 46-53) que codifican diferentes polipéptidos relacionados con ORF0657n, basados en SEC ID NO: 17 o SEC ID NO: 20.
La Figura 9 muestra una transferencia de western que compara la expresión intracelular de polipéptidos relacionados con ORF0657n en S. cerevisiae. Pistas 1 y 18, estándares de tamaño de peso molecular (MW). Pistas 2 y 3, 50 y 100 ng, respectivamente, de ORF0657nH purificado, producido en E. coli (SEC ID NO: 4 más una cola de histidinas en el extremo carboxilo). La pista 5 contiene 500 ng de proteína de lisado celular del transformante de control del vector de S. cerevisiae. Las pistas 7, 8 y 9 contienen 1,0, 2,0 y 4,0 \mug de lisado celular del transformante de S. cerevisiae que produce SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas del extremo carboxilo. Las pistas 11 y 12 contienen 50 y 100 ng de proteína, respectivamente, del lisado celular del transformante de S. cerevisiae que produce ORF0657nH (SEC ID NO: 3). Las pistas 14 y 15 contienen 250 y 500 ng de proteína, respectivamente, del lisado celular del transformante de S. cerevisiae que produce ORF0657nG (SEC ID NO: 44). La pista 17 contiene 250 ng de proteína del lisado celular de ORF0658nG (SEC ID NO: 44 más una cola de histidinas del extremo carboxilo), productor E. coli. Las pistas 4, 6, 10, 13 y 16 están vacías.
La Figura 10 ilustra los datos de inmunidad de protección de polipéptidos relacionados con ORF0657n producidos en E. coli y levadura. "ORF0657nH (E. coli)" corresponde a SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo. "ORF0657nl (E. coli)" corresponde a SEC ID NO: 5 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo. "ORF0657nC (E. coli)" corresponde a SEC ID NO: 28. "ORF0657nH (levadura)" corresponde a
SEC ID NO: 3.
La Figura 11 muestra un ejemplo de transferencia de western de expresión intracelular de ORF0657nl en S. cerevisiae. Pistas 1 y 25: estándares de tamaño MW. Pistas 2, 3 y 24: 25, 50 y 100 ng, respectivamente, de la región de ORF0657nH purificada (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo), producido en E. coli. Las pistas 4-23 contienen lisado celular de proteína de transformantes de levadura. Las pistas 13-21 representan lisados celulares duplicados, preparados a partir de la misma muestra de fermentación que los lisados de las pistas 4-12. Las pistas 4 y 13 contienen 200 ng de proteína de un transformante de un vector de control que contiene pGAL110. Las pistas 5 y 14 contienen 100 ng de proteína del transformante 1-1 que produce la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3). Las pistas 6 y 15 contienen 200 ng de proteína del transformante 1-1. Las pistas 7 y 16 contienen 100 ng de proteína, y las pistas 8 y 17 contienen 200 ng de proteína del transformante 1-1. Las pistas 9 y 18 contienen 100 ng de proteína, y las pistas 10 y 19 contienen 200 ng de proteína del transformante I2. Las pistas 11 y 20 contienen 100 ng de proteína, y las pistas 12 y 21 contienen 200 ng de proteína del transformante I3. Las pistas 22 y 23 contienen 100 ng y 200 ng de proteína del lisado celular preparado previamente a partir de una fermentación anterior del
transformante 1-1.
La Figura 12 proporciona datos sobre la inmunización de monos Rhesus. Se inmunizaron monos Rhesus con polipéptido relacionado con ORF0657n producido por levadura (ORF0657nH, SEC ID NO: 3), o con polipéptido relacionado con ORF0657n expresado en E. coli (ORF0657nC de longitud completa, SEC ID NO: 28), formulados con o sin AHP. Los monos del grupo de vacuna recibieron 50 mcg de polipéptidos relacionados con ORF0657n por vía intramuscular.
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Descripción detallada de la invención
Por medio del uso de un modelo animal, se ha demostrado que los polipéptidos relacionados con ORF0657n, incluidos los derivados de longitud completa y de longitud menor que contienen la región ORF0657n, confieren inmunidad de protección contra S. aureus. La Figura la ilustra la localización de diferentes regiones de polipéptido relacionado con ORF0657n que ofrecen inmunidad de protección contra la infección de S. aureus, y de las regiones que no proporcionaron inmunidad de protección. En la Figura 1a, ORF0657nl se refiere a una región correspondiente a SEC ID NO: 1 (exenta de metionina del extremo amino terminal), y ORF0657nH se refiere a una región correspondiente a SEC ID NO: 3 (exenta de metionina del extremo amino terminal).
Un polipéptido "relacionado" con ORF0657n contiene una región relacionada estructuralmente con un ORF0657n de longitud completa, o un fragmento del mismo. Los polipéptidos relacionados con ORF0657n son polipéptidos que tienen una secuencia idéntica en al menos aproximadamente 90% a la de una región correspondiente de un ORF0657n de origen natural. La referencia ORF0657n ilustrada en la Figura 1 corresponde a ORF0657n de S. aureus COL (SEC ID NO: 2).
La identidad porcentual con respecto a una secuencia de referencia se determina por alineamiento de la secuencia polipeptídica con la secuencia de referencia y la determinación del número de aminoácidos idénticos. Este número se divide por el número total de aminoácidos en la secuencia de referencia y, a continuación, se multiplica por 100 y se redondea hasta el número entero más próximo.
La Figura la ayuda a ilustrar la importancia de una región central que comprende una secuencia de aminoácidos relacionada estructuralmente con SEC ID NO: 1. La SEC ID NO: 1 comprende los aminoácidos 42-486 de ORF0657n COL. La SEC ID NO: 1 contiene igualmente una metionina del extremo amino terminal para facilitar la expresión. Los fragmentos polipeptídicos preparados a partir de los aminoácidos 461-609, aminoácidos 82-486 o los aminoácidos 42-196 de SEC ID NO: 2 no tuvieron acción protectora.
A lo largo de la solicitud, se hace referencia a diferentes secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. La Tabla 1 contiene un resumen de algunas de las secuencias de polipéptidos que indican la región y modificaciones adicionales de la Figura 1. La Tabla 2 ofrece un resumen de algunas de las secuencias de ácidos nucleicos.
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TABLA 1
1
2
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TABLA 2
3
4
5
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Polipéptidos relacionados con SEC ID NO: 1
Una región polipeptídica relacionada estructuralmente con SEC ID NO: 1 contiene una identidad de aminoácidos de al menos 90% con SEC ID NO: 1. Se pueden diseñar polipéptidos que contienen una región relacionada estructuralmente con SEC ID NO: 1 en base a las instrucciones que se exponen en este documento para obtener polipéptidos con acción de protección contra S. aureus.
Con el uso de SEC ID NO: 1 como marco de referencia, se pueden llevar a cabo alteraciones tomando en consideración la secuencia de aminoácidos de diferentes polipéptidos ORF0657n de origen natural y las propiedades conocidas de los aminoácidos. Las alteraciones incluyen adiciones, deleciones y/o sustituciones de uno o múltiples aminoácidos. El efecto global de las diferentes alteraciones se puede evaluar usando técnicas descritas en este documento, para confirmar la capacidad de un polipéptido particular para ofrecer inmunidad de protección.
Se ha observado que ORF0657n se encuentra bien conservado a través de una colección de aislados clínicos de S. aureus patológica y taxonómicamente diferentes. (Véase el Ejemplo 5 más adelante). La Figura 2 ofrece una comparación de secuencias de aminoácidos que contienen una SEC ID NO: 1. La comparación de secuencias ilustrada es para la región ORF0657nH. La región ORF0657nH incluye la región protectora de menor tamaño ORF0657nI.
La Figura 2 ofrece una comparación de secuencias de SEC ID NO: 1 y 3-27. La comparación pone de manifiesto las diferencias de aminoácidos entre aislados clínicos de S. aureus que se pueden usar como guía para el diseño de alteraciones potenciales de polipéptidos relacionados con S. aureus tales como las SEC ID NOs: 1 y 3. Además, se pueden llevar a cabo alteraciones tomando en consideración las propiedades conocidas de aminoácidos. Las SEC ID NOs: 1, 3-6 y 8-26 ilustran secuencias de origen natural que se inician en la posición número 3; las posiciones número 1 y 2 ilustran la adición de metionina y metionina-glicina al extremo amino terminal en algunas secuencias. Las SEC ID NOs: 11-26 se obtuvieron a partir de diferentes aislados clínicos. Las SEC ID NOs: 7 y 27 son variantes de la región ORF0657nH de SEC ID NO: 4, que contiene cinco sustituciones de aminoácidos en una región fuera de la región central de SEC ID NO: 1.
Como ayuda para la guía de alteraciones, se pueden usar secuencias ORF0657n adicionales en la comparación de secuencias. Las SEC ID NOs: 54-63 ofrecen ejemplos de secuencias de la región ORF0657nH de S. aureus, y las SEC ID NOs: 106b y 107 proporcionan la secuencia de longitud completa para las SEC ID NOs: 17 y 20.
Por lo general, cuando se sustituyen diferentes aminoácidos para conservar la actividad, resulta preferible intercambiar aminoácidos que tienen propiedades similares. Factores que se pueden tener en consideración para la sustitución de aminoácidos incluyen el tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad de los aminoácidos. En la técnica es bien conocido el efecto de los diferentes grupos Receptor de Servicios de los aminoácidos sobre las propiedades de los aminoácidos. (Véase, por ejemplo, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002, Anexo 1C).
En el intercambio de aminoácidos para mantener la actividad, el aminoácido de sustitución debe tener una o más propiedades similares tales como aproximadamente la misma carga y/o tamaño y/o polaridad y/o hidrofobicidad. Por ejemplo, la sustitución de valina por leucina, arginina por lisina y asparagina por glutamina tiene buenas perspectivas de no provocar cambios en la función polipeptídica.
Las alteraciones para alcanzar un propósito particular incluyen las diseñadas para facilitar la producción o eficacia del polipéptido; o la clonación del ácido nucleico codificado. La producción de polipéptidos se puede facilitar mediante el uso de un codón de iniciación (por ejemplo, que codifique metionina) adecuado para la expresión recombinante. Posteriormente, se puede eliminar la metionina durante el procesamiento celular. La clonación se puede facilitar, por ejemplo, mediante la introducción de sitios de restricción que pueden estar acompañados por adiciones o cambios de aminoácidos.
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La eficacia de un polipéptido para inducir una respuesta inmunitaria se puede potenciar por medio de la potenciación de epítopos. La potenciación de epítopos se puede llevar a cabo usando diferentes técnicas tales como las que comprenden la alteración de residuos de anclaje para mejorar la afinidad peptídica por las moléculas MHC, así como aquellas que aumentan la afinidad del complejo péptido-MHC por un receptor de células T. (Berzofsky et al., Nature Review 1:209-219, 2001).
En diferentes formas de realización, con respecto a la región polipeptídica relacionada con la SEC ID NO: 1, la región es idéntica en al menos 90%, al menos 94% o al menos 99% a SEC ID NO: 1; difiere de SEC ID NO: 1 en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 alteraciones, o en hasta 50 alteraciones, o consiste en una región relacionada con ORF0657nI seleccionada del grupo consistente en:
aminoácidos 1 -442 de SEC ID NOs: 11, 15, 16, 18 ó 54;
aminoácidos 1-443 de SEC ID NO: 63;
aminoácidos 1-444 de SEC ID NOs: 57 ó 59;
aminoácidos 1-445 de SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 17, 19, 20, 55, 56 ó 58;
aminoácidos 1-446 ó 2-446 de SEC ID NOs: 1 ó 3;
aminoácidos 1-447 de SEC ID NOs: 25 ó 26; o
aminoácidos 1-447, 2-447, ó 3-447 de SEC ID NOs: 4, 5 ó 27;
aminoácidos 1-449 de SEC ID NOs: 61 ó 62;
aminoácidos 1-453 de SEC ID NO: 60; y
aminoácidos 1-454 de SEC ID NOs: 6, 21 ó 22.
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Aminoácidos adicionales pueden estar presentes. Los aminoácidos adicionales pueden estar en el extremo carboxilo o amino terminal. En diferentes formas de realización, se encuentran presentes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos adicionales. En formas de realización preferidas, metionina está presente en el extremo amino terminal; o en el extremo amino terminal se hallan presentes metionina-glicina.
En una forma de realización de la presente invención, el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 42, o un fragmento de la misma, que comprende una secuencia de aminoácidos relacionada estructuralmente con SEC ID NO: 1. En diferentes formas de realización con respecto a SEC ID NO: 42, el polipéptido es idéntico en al menos 94% o al menos 99% a SEC ID NO: 42; difiere de SEC ID NO: 42 en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 alteraciones, o en hasta 50 alteraciones, o en hasta 65 alteraciones; o consiste en SEC ID NO: 42 o una región relacionada con ORF0657nI+ seleccionada del grupo consistente en:
aminoácidos 1 -477 de SEC ID NOs: 11, 15, 16, 18 ó 54;
aminoácidos 1-478 de SEC ID NO: 63;
aminoácidos 1-479 de SEC ID NOs: 57 ó 59;
aminoácidos 1-480 de SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 17, 19, 20, 55, 56 ó 58;
aminoácidos 1-481 de SEC ID NOs: 23 ó 24;
aminoácidos 1-481 de SEC ID NOs: 1 ó 3;
aminoácidos 1-482 de SEC ID NOs: 25 ó 26
aminoácidos 1-482, 2-482, ó 3-482 de SEC ID NOs: 4, 5 ó 27;
aminoácidos 1-488 de SEC ID NOs: 61 ó 62;
aminoácidos 1-488 de SEC ID NO: 60; y aminoácidos 1-489 de SEC ID NOs: 6, 21 ó 22.
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En otra forma de realización de la presente invención, el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO:3 o un fragmento de la misma, que comprende una secuencia de aminoácidos relacionada estructuralmente con SEC ID NO:3; difiere de SEC ID NO: 3 en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 alteraciones, o en hasta 50 alteraciones, o en hasta 65 alteraciones; o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en SEC ID NOs: 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 54, 55, 57, 55, 59, 60, 61, 62 y 63.
En una forma de realización adicional, el polipéptido consiste en un polipéptido de SEC ID NO: 2 modificado por la inserción de una glicina tras la metionina inicial, o en dicho polipéptido sin la metionina inicial.
En una forma de realización adicional, el polipéptido es un polipéptido purificado. Un "polipéptido purificado" se encuentra presente en un ambiente exento de uno o más polipéptidos adicionales con los que se halla asociado naturalmente, y/o está representado por al menos aproximadamente 10% de la proteína total presente. En diferentes formas de realización, el polipéptido purificado representa al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 95% de la proteína total en una muestra o preparación.
En una forma de realización adicional, el polipéptido está "sustancialmente purificado". Un polipéptido sustancialmente purificado se encuentra presente en un ambiente exento de todos, o la mayoría de los restantes polipéptidos con los que se asocia naturalmente. Por ejemplo, un polipéptido de S. aureus sustancialmente purificado está presente en un ambiente exento de todos, o la mayor parte de otros polipéptidos de S. aureus. Un ambiente puede ser, por ejemplo, una muestra o preparación.
Las referencias a "purificado" o "sustancialmente purificado" no requieren someter el polipéptido a ninguna clase de purificación y pueden incluir, por ejemplo, un polipéptido sintetizado químicamente que no ha sido purificado.
La estabilidad del polipéptido se puede potenciar modificando el extremo carboxilo o amino terminal del polipéptido. Ejemplos de modificaciones posibles incluyen grupos protectores del extremo amino terminal tales como acetilo, propilo, succinilo, bencilo, benciloxicarbonilo o t-butiloxicarbonilo; y grupos protectores del extremo carboxilo terminal tales como amida, metilamida y etilamida.
En una forma de realización de la presente invención, el polipéptido de protección forma parte de un inmunógeno consistente en el polipéptido y una o múltiples regiones o restos adicionales, unidas de forma covalente al polipéptido en el extremo carboxilo terminal o el extremo amino terminal. Cada región o resto debe ser seleccionado independientemente de una región o resto que tenga al menos una de las propiedades siguientes: potenciación de la respuesta inmunitaria, facilitar la purificación, o facilitar la estabilidad del polipéptido. La estabilidad del polipéptido se puede potenciar, por ejemplo, usando grupos tales como polietilenglicol, que pueden estar presentes en el extremo amino o carboxilo terminal.
La purificación polipeptídica se puede potenciar agregando un grupo al extremo carboxilo o amino terminal para facilitar la purificación. Ejemplos de grupos que se han utilizado para facilitar la purificación incluyen polipéptidos que aportan etiquetas de afinidad. Ejemplos de etiquetas de afinidad incluyen la cola de seis histidinas, trpE, glutatión y proteína que se une a la maltosa.
La capacidad de un polipéptido para producir una respuesta inmunitaria se puede potenciar usando grupos que por lo general refuerzan la respuesta inmunitaria. Ejemplos de grupos que se pueden acoplar a un polipéptido para potenciar una respuesta inmunitaria contra el polipéptido incluyen citoquinas tales como IL-2. (Buchan et al., 2000, Molecular Immunology 37:545-552).
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Producción de Polipéptidos
Se pueden producir polipéptidos usando técnicas convencionales, incluidas las que comprenden síntesis química y las que comprenden purificación a partir de una célula que produce el polipéptido. Los procedimientos de síntesis química de polipéptidos son bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Vincent, Peptide and Protein Drug Delivery, Nueva York, N.Y., Decker, 1990). Las técnicas para la purificación de polipéptidos a partir de una célula se ilustran en los Ejemplos que aparecen más adelante. En la técnica, se conocen bien ejemplos adicionales de procedimientos de purificación. (Véase, por ejemplo, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002).
La obtención de polipéptidos a partir de una célula resulta facilitada por el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante para producir el polipéptido. Las técnicas de ácido nucleico recombinante para la producción de un polipéptido implican la introducción, o producción, de un gen recombinante que codifica el polipéptido en una célula, y la expresión del polipéptido.
Un gen recombinante contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido, junto con elementos de regulación para la expresión del polipéptido. El gen recombinante puede estar presente en un genoma celular, o puede formar parte de un vector de expresión.
Los elementos de regulación que pueden estar presentes como parte del gen recombinante incluyen los que están asociados naturalmente con la secuencia que codifica el polipéptido, y elementos de regulación exógenos que no están asociados de manera natural con la secuencia que codifica el polipéptido. Los elementos reguladores exógenos tales como un promotor exógeno pueden ser útiles para expresar un gen recombinante en un hospedador particular o para incrementar el nivel de expresión. Por lo general, los elementos reguladores que están presentes en un gen recombinante incluyen un promotor transcripcional, un sitio de unión de ribosomas, un terminador y un operador que está presente de forma opcional. Un elemento preferido para el procesamiento en células eucarióticas es una señal de poliadenilación.
La expresión de un gen recombinante en una célula se ve facilitada por medio del uso de un vector de expresión. Preferentemente, un vector de expresión adicional a un gen recombinante contiene también un origen de replicación para la replicación autónoma en una célula hospedadora, un marcador seleccionable, un número limitado de sitios de enzimas de restricción útiles, y un potencial para un número elevado de copias. Ejemplos de vectores de expresión son vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos y virus diseñados especialmente.
Debido a la redundancia del código genético, se puede utilizar un amplio número de diferentes secuencias de ácido nucleico de codificación para codificar un polipéptido particular. La redundancia del código genético surge porque prácticamente todos los aminoácidos son codificados por diferentes combinaciones de tripletes de nucleótidos o "codones". Los aminoácidos son codificados por codones de la forma siguiente:
A = Ala = Alanina: codones GCA, GCC, GCG, GCU
C = Cys = Cisteína: codones UGC, UGU
D = Asp = Ácido aspártico: codones GAC, GAU
E = Glu = Ácido glutámico: codones GAA, GAG
F = Phe = Fenilalanina: codones UUC, UUU
G = Gly = Glicina: codones GGA, GGC, GGG, GGU
H = His = Histidina: codones CAC, CAU
I = Ile = Isoleucina: codones AUA, AUC, AUU
K = Lys = Lisina: codones AAA, AAG
L = Leu = Leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M = Met = Metionina: codón AUG
N = Asn = Asparagina: codones AAC, AAU
P = Pro = Prolina: codones CCA, CCC, CCG, CCU
Q = Gln = Glutamina: codones CAA, CAG
R = Arg = Arginina: codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S = Ser = Serina: codones AGC, AGU, UCA, UCG, UCG, UCU
T = Thr = Treonina: codones ACA, ACC, ACG, ACU
V = Val = Valina: codones GUA, GUC, GUG, GUU
W = Trp = Triptófano: codón UGG
Y = Tyr = Tirosina: codones UAC, UAU
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Las células apropiadas para la expresión de ácido nucleico recombinante de polipéptidos relacionados con
ORF0657n son procarióticas y eucarióticas. Ejemplos de células procarióticas incluyen E. coli; miembros del género Staphylococcus tales como S. aureus; miembros del género Lactobacillus tales como L. plantarum; miembros del género Lactococcus tales como L. lactis; y miembros del género Bacillus tales como B. subtilis. Ejemplos de células eucarióticas incluyen células de mamífero; células de insecto; células de levadura tales como miembros del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae.), miembros del género Pichia (por ejemplo, P. pastoris), miembros del género Hansenula (por ejemplo, H. polymorpha), miembros del género Kluyveromyces (por ejemplo, K. lactis o K. fragilis), y miembros del género Schizosaccharomyces (por ejemplo, S. pombe).
En la técnica son bien conocidos los procedimientos para la producción de genes recombinantes, introducción en una célula y expresión del gen recombinante. Se ofrecen ejemplos de estos procedimientos en referencias bibliográficas tales como Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002, y Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
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Si se desea, la expresión en un hospedador particular se puede potenciar mediante la optimización de codones. La optimización de codones incluye el uso de codones más preferidos. En la técnica se conocen bien procedimientos para la optimización de codones en diferentes hospedadores.
Los polipéptidos relacionados con ORF0657n pueden contener modificaciones postraduccionales, por ejemplo, N-glicosilación, O-glicosilación, o acetilación. La referencia a "polipéptido" o una secuencia de "aminoácidos" de un polipéptido incluye polipéptidos que contienen uno o múltiples aminoácidos que presentan una modificación postraduccional de una célula hospedadora tal como una célula hospedadora de mamífero, insecto o levadura.
Las modificaciones postraduccionales se pueden llevar a cabo de forma química o utilizando hospedadores adecuados. Por ejemplo, en S. cerevisiae la naturaleza del penúltimo aminoácido parece determinar si se elimina la metionina N-terminal. Además, la naturaleza del penúltimo aminoácido determina también si el aminoácido N-terminal sufre una N^{\alpha}-acetilación (Huang et al., Biochemistry 26:8242-8246, 1987). Otro ejemplo incluye un polipéptido cuya diana es la secreción debido a la presencia de un líder secretor (por ejemplo, péptido señal), en donde el polipéptido está modificado por N-u O-glicosilación. (Kukuruzinska et al., Ann. Rev. Biochem., 56:915-944, 1987).
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Expresión en Levadura
Los polipéptidos relacionados con ORF0657n se expresan, preferentemente, en levadura, usando ácidos nucleicos de codificación que contienen codones optimizados para la expresión en levadura. La expresión en levadura se puede llevar a cabo usando un gen recombinante que codifica un polipéptido relacionado con ORF0657n y regiones reguladoras para la expresión en levadura. Dependiendo del sistema de expresión empleado, la proteína producida puede seguir siendo intracelular o se puede excretar fuera de la célula.
Preferentemente, el promotor para la expresión de un gen recombinante es un promotor inducible tal como un promotor del clúster de genes de galactosa de levadura (un promotor Gal tal como GAL1, GAL7, GAL10, MEL1), o el promotor PHO5 de fosfatasa ácida, o el promotor ADH2 de alcohol deshidrogenasa, o el promotor CUP1 de metalotioneína, regulado por el cobre. Ejemplos de promotores "constitutivos" que se podrían utilizar son los promotores GAP (TDH), PGK o TPI. (Romanos et al., YEAST 8:423-488, 1992).
La célula hospedadora de levadura usada para la expresión recombinante se puede seleccionar o modificar por técnicas de ingeniería para facilitar la expresión del gen recombinante. Las mutaciones tales como mnn9, prb1 y/o pep4 son típicamente deseables. Para potenciar la expresión de promotores GAL, se puede lograr la sobreexpresión del factor de transcripción GAL4 (Hopper et al., Patente de EE.UU. 5.068.185).
La optimización de codones para un hospedador en particular se lleva a cabo sustituyendo codones que tienen un nivel de utilización bajo o moderado por codones que tienen un elevado nivel de expresión. El porcentaje de codones óptimos presentes en una secuencia de codificación puede variar. En diferentes formas de realización, el número de codones óptimos (incluidos los codones inicialmente presentes y los codones introducidos) es de al menos 50%, al menos 75%, al menos 95%, o de 100% del número total de codones.
La optimización de codones se puede efectuar de la manera siguiente:
1.
Para un codón particular, comparar la frecuencia del codón natural con la frecuencia de uso de codones globales por los genes de levadura.
2.
Si el codón no es uno de los utilizados normalmente por la levadura, sustituirlo por un codón optimizado para alta expresión en células de levadura.
3.
Repetir las etapas (1) y (2) para diferentes codones, hasta alcanzar el nivel deseado de optimización de los codones.
4.
Analizar en la nueva secuencia de codificación, la presencia de secuencias no deseadas generadas, tales como sitios de enzima de restricción, sitios de corte y empalme, promotores no deseados, palíndromos o secuencias de repetición no deseadas, secuencias de terminadores de la transcripción, y alta frecuencia de bases GC. Eliminar las secuencias no deseadas usando un codón alternativo.
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El uso de codones alternativos se describe en Lathe, J. Molec. Biol., 183:1-12, 1985. El uso de codones en diferentes hospedadores de levadura es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, Sharp et al., Yeast 7: 657-678, 1991, describe el uso de codones sinónimos en Saccharomyces cerevisiae.
Las Figuras 8C-8M proporcionan secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para levaduras. La Figura 8C ofrece una secuencia de ácidos nucleicos optimizada para levadura (SEC ID NO: 31) que codifica SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas en el extremo carboxilo. La Figura 8D proporciona una secuencia de ácidos nucleicos optimizada para levadura (SEC ID NO: 32) que codifica SEC ID NO: 3. La Figura 8E ofrece una secuencia de ácidos nucleicos optimizada para levadura (SEC ID NO: 33) que codifica SEC ID NO: 1. Las Figuras 8F-8M ofrecen secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para levadura (SEC ID NOs: 34-41), que codifican SEC ID NO: 7 que contiene una metionina en el extremo amino terminal. Las Figuras 8N-8U proporcionan secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para levadura (SEC ID NOs: 46-53) que codifican diferentes polipéptidos relacionados con ORF0657n basados en SEC ID NO: 17 o SEC ID NO: 20.
La expresión en levadura se puede lograr usando secuencias optimizadas, y secuencias no optimizadas para expresión en levadura (por ejemplo, nucleótidos 1-1935 o 124-1458 de SEC ID NO: 29, o nucleótidos 1-1710 de SEC ID NO: 30). En los Ejemplos siguientes se ilustran técnicas para expresión en levadura usando secuencias optimizadas y no optimizadas.
ORF0657n es una proteína de superficie que contiene una señal de clasificación de pared celular C-terminal de 36 aminoácidos, con un resto "LPXTG" conservado. (Schneedwind et al., 1993, EMBO, 12:4803-4811, 1993). Las proteínas que contienen una señal de clasificación de pared celular están fijadas a la envoltura de la pared celular por un mecanismo de transpeptidación catalizada por sortasa, una proteína unida a la membrana (Mazmanian et al., Science 299:906-909, 2001). Para la fijación, la proteína de superficie debe contener también un péptido señal N-terminal para exportar hacia la vía secretora. La sortasa produce entonces una escisión entre la treonina y la glicina del resto LPXTG y cataliza la formación de un enlace de amida entre el grupo carboxilo de la treonina y el grupo amino de los puentes cruzados del peptidoglicano.
La expresión en levadura demostró aumentar significativamente por medio de la eliminación de la secuencia de clasificación de la pared celular. En diferentes formas de realización, el polipéptido que codifica las construcciones carece de una secuencia funcional codificadora de clasificación de la pared celular y, más preferentemente, carece de secuencias funcionales que codifican la clasificación de pared celular y de péptido señal. Los correspondientes polipéptidos relacionados con ORF0657n preferidos carecen de una secuencia de clasificación de pared celular, o tanto de la secuencia de clasificación de pared celular como de la secuencia de péptido señal.
En diferentes formas de realización, al menos sustancialmente la totalidad de la secuencia de clasificación de la pared celular, o tanto la secuencia de clasificación de la pared celular como la secuencia de péptido señal, no se encuentran presentes en el polipéptido o en el ácido nucleico que codifica el polipéptido. En diferentes formas de realización, la expresión de proteínas está incrementada en al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, o al menos aproximadamente 20 veces mediante la eliminación al menos sustancialmente de la totalidad de la secuencia de clasificación de la pared celular, o de tanto la secuencia de clasificación de la pared celular como de la secuencia de péptido señal. Más preferentemente, la construcción codificadora contiene también uno o múltiples codones optimizados para expresión en levadura (por ejemplo, S. cerevisiae).
Se pueden ilustrar los ejemplos de regiones aproximadas para las secuencias de clasificación de pared celular y de péptido señal de ORF0657n con respecto a SEC ID NO: 2. Los aminoácidos 1-42 contienen la secuencia de péptido señal. Los aminoácidos 609-645 contienen la secuencia de clasificación de pared celular.
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Adyuvantes
Los adyuvantes son sustancias que pueden contribuir a que un inmunógeno produzca una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes pueden actuar por medio de diferentes mecanismos, tales como uno o más de los siguientes: aumentando la semivida biológica o inmunológica del antígeno; mejorando el suministro del antígeno a las células presentadoras de antígeno; mejorando el procesamiento y la presentación del antígeno por parte de las células presentadoras de antígeno; y mediante la inducción de citoquinas inmunomoduladoras. (Vogel, Clinical Infectious Diseases 30 (suppl. 3): págs. 266-270, 2000).
Para ayudar en la producción de una respuesta inmunitaria, se puede emplear una variedad de tipos diferentes de adyuvantes. Ejemplos de adyuvantes particulares incluyen hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, u otras sales de aluminio, fosfato de calcio, motivos CpG de ADN, monofosforil lípido A, toxina del cólera, toxina termolábil de E. coli, toxina pertussis, muramil dipéptido, adyuvante incompleto de Freund, MF59, SAF, complejos inmunoestimulantes, liposomas, microesferas biodegradables, saponinas, copolímeros de bloque no iónicos, análogos del péptido muramilo, polifosfaceno, polinucleótidos sintéticos, IFN-\gamma, IL-2, IL-12, e ISCOMS. (Vogel, Clinical Infectious Diseases 30 (suppl. 3): págs. 266-270, 2000; Klein et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 89:311-321, 2000; Rimmelzwaan et al., Vaccine 19:1180-1187, 2001; Kersten, Vaccine 21:915-920, 2003; O'Hagen, Curr. Drug Target Infect. Disord, 1:273-286, 2001).
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Pacientes en los que Inducir Inmunidad de Protección
El término "paciente" se refiere a un mamífero capaz de ser infectado por S. aureus. Un paciente puede ser tratado de manera profiláctica o terapéutica. El tratamiento profiláctico confiere una inmunidad de protección suficiente para reducir la probabilidad, o la gravedad, de una infección de S. aureus. El tratamiento terapéutico se puede efectuar para reducir la gravedad de una infección de S. aureus.
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El tratamiento profiláctico se puede llevar a cabo usando una vacuna que contiene un inmunógeno descrito en este documento. Este tratamiento se efectúa, preferentemente, en seres humanos. Las vacunas se pueden administrar a la población general o a las personas con un incremento del riesgo de una infección de S. aureus.
Las personas que presentan un riego incrementado de infecciones de S. aureus incluyen trabajadores sanitarios; pacientes hospitalizados; pacientes con un sistema inmunológico debilitado; pacientes sometidos a cirugía; pacientes que reciben implantes de cuerpos extraños, tales como un catéter o un dispositivo vascular; pacientes que van a ser sometidos a una terapia que debilite la inmunidad; personas con lesiones por quemaduras o heridas; y personas de grupos profesionales con un riesgo incrementado de sufrir lesiones por quemaduras o heridas. (The Staphylococci in Human Disease, Crossley y Archer (ed.), Churchill Livingstone Inc., 1997).
Los pacientes no humanos que pueden sufrir infecciones de S. aureus incluyen vacas, cerdos, ovejas, cabras, conejos, caballos, perros, gatos y ratones. El tratamiento de pacientes no humanos es útil para proteger a las mascotas y el ganado, así como para evaluar la eficacia de un tratamiento particular.
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Respuesta Anamnésica
Se ha demostrado que los polipéptidos relacionados con ORF0657n producen una respuesta inmunitaria rápida y efectiva en el mono Rhesus tras una única dosis. (Véase el Ejemplo 17, más adelante). La respuesta observada fue consistente con una respuesta anamnésica.
La producción de una respuesta anamnésica ofrece ventajas significativas tales como la capacidad para proporcionar inmunidad efectiva con el uso de una sola dosis, y ofrecer la inmunidad efectiva en un breve periodo de tiempo. En diferentes formas de realización, la respuesta anamnésica da como resultado un incremento de al menos 3 veces, al menos 5 veces o de al menos 6 veces de la media geométrica de los títulos, con respecto a los títulos preexistentes; y este incremento se produce en el plazo de 3, 5, 7, 9, 14 ó 21 días.
La capacidad de generar rápidamente una respuesta inmunitaria efectiva ofrece ahorro de costes en comparación con las vacunaciones con múltiples dosis, y se puede utilizar para vacunar a un paciente que presenta un incremento del riesgo de sufrir una infección de S. aureus. Las personas que presentan un riego incrementado de infecciones de S. aureus incluyen trabajadores sanitarios; pacientes hospitalizados; pacientes con un sistema inmunológico debilitado; pacientes sometidos a cirugía; pacientes que reciben implantes de cuerpos extraños, tales como un catéter o un dispositivo vascular; pacientes que van a ser sometidos a una terapia que debilite la inmunidad; personas con lesiones por quemaduras o heridas; y personas de grupos profesionales con un riesgo incrementado de sufrir lesiones por quemaduras o heridas. (The Staphylococci in Human Disease, Crossley y Archer (ed.), Churchill Livingstone Inc., 1997). En diferentes formas de realización, el paciente es vacunado inmediatamente o dentro de los 3, 5, 7, 9, 14 ó 21 días siguientes a un procedimiento médico.
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Vacunas de Combinación
Los polipéptidos relacionados con ORF0657n que confieren inmunidad de protección, se pueden usar solos o en combinación con otros inmunógenos para la inducción de una respuesta inmunitaria. Inmunógenos adicionales que pueden estar presentes incluyen: uno o múltiples inmunógenos de S. aureus adicionales, tales como los que se mencionan en la anterior sección Antecedentes de la Invención; uno o múltiples inmunógenos dirigidos contra uno o múltiples organismos del género Staphylococcus distintos tales como S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, o S. lugunensis; y uno o múltiples inmunógenos dirigidos contra otros organismos infecciosos.
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Sistema de Modelo Animal
En la evaluación de la eficacia de un polipéptido para producir una respuesta inmunitaria de protección contra S. aureus se ha utilizado un sistema de modelo animal. Dos obstáculos que se encontraron en el establecimiento de un modelo animal de protección fueron: (1) necesidad de una dosis de estimulación muy elevada para vencer la inmunidad innata, y (2) tasa de mortalidad excesivamente rápida para poder detectar una respuesta de protección. Específicamente, los ratones sucumbieron a la infección dentro de las 24 horas siguientes al estímulo bacteriano, lo que no daba tiempo suficiente para que las respuestas inmunitarias específicas resolvieran la infección. Al reducir la dosis, tanto los ratones de control como los inmunizados sobrevivieron a la infección.
Estos obstáculos se solucionaron usando un nuevo modelo de letalidad de cinética lenta, en el que intervienen S. aureus preparados a partir de células en fase estacionaria, adecuadamente tituladas, y administrados por vía intravenosa. Esta cinética lenta de mortalidad ofrece tiempo suficiente para que la defensa inmunitaria específica combata la infección bacteriana (por ejemplo, 10 días en lugar de 24 horas).
Las células de S. aureus en fase estacionaria se pueden obtener a partir de células cultivadas sobre un medio sólido. También se pueden obtener a partir de medios líquidos, si bien los resultados con células cultivadas sobre un medio sólido fueron más reproducibles. Convenientemente, las células se pueden cultivar durante la noche en un medio sólido. Por ejemplo, se puede cultivar S. aureus desde aproximadamente 18 hasta 24 horas bajo condiciones en las que el tiempo de duplicación es de aproximadamente 20-30 minutos.
El aislamiento de Staphylococcus a partir de un medio sólido o líquido se puede llevar a cabo usando técnicas convencionales para conservar la potencia de Staphylococcus. Los Staphylococcus aislados se pueden conservar, por ejemplo, a -70ºC en forma de suspensión lavada de alta densidad (>10^{9} unidades formadoras de colonias (UFC)/ml) en solución salina tamponada con fosfato que contiene glicerol.
La estimulación con Staphylococcus debe tener una potencia que provoque aproximadamente 80 a 90% de mortalidad en un modelo animal durante un periodo de aproximadamente 7 a 10 días, a partir del primer o segundo día. Se pueden llevar a cabo ensayos de titulación usando modelos animales para controlar la potencia del inóculo de Staphylococcus. Los experimentos de titulación se pueden realizar aproximadamente una a dos semanas antes de un ensayo de inoculación.
La potencia inicial para los experimentos de titulación puede estar basada en experimentos previos. Para el modelo animal, el estímulo adecuado con la cepa Becker de S. aureus estuvo dentro del intervalo de 5 x 10^{8} a 8 x 10^{8} UFC/ml.
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Administración
Los inmunógenos se pueden formular y administrar a un paciente siguiendo las normas que se ofrecen en este documento, junto con procedimientos bien conocidos en la técnica. Las directrices para la administración farmacéutica en general se proporcionan, por ejemplo, en Vaccines, eds. Plotkin y Orenstein, W.B. Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical Sciences, 20ª edición, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000; y Modern Pharmaceutics, 2ª edición, eds. Banker y Rhodes, Marcel Dekker Inc., 1990.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables facilitan la conservación y administración de un inmunógeno a un paciente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener diferentes componentes tales como un tampón, agua esterilizada para inyección, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato, sacarosa, histidina, sales y polisorbato.
Los inmunógenos se pueden administrar por diferentes vías tales como subcutánea, intramuscular, o mucosa. La administración subcutánea e intramuscular se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, agujas o inyectores a presión.
Los regímenes de dosificación apropiados se determinan preferentemente teniendo en consideración factores bien conocidos en la técnica, incluidos edad, peso, sexo y estado clínico del paciente; vía de administración; efecto deseado; y compuesto particular empleado. El inmunógeno se puede usar en formatos de vacuna multi-dosis. Se prevé que la dosis consista en polipéptido total dentro de un intervalo de 1,0 \mug hasta 1,0 mg. En diferentes formas de realización de la presente invención, el intervalo es de 0,01 mg hasta 1,0 mg y de 0,1 mg hasta 1,0 mg.
Los intervalos de tiempo entre dosis dependen de factores bien conocidos en la técnica. Tras la administración inicial, si un individuo particular lo requiere, se pueden administrar una o múltiples dosis de recuerdo subsiguientemente para mantener o reforzar los títulos de anticuerpo. Un ejemplo de un régimen de dosificación sería día 1, 1 mes, una tercera dosis a los 4, 6 ó 12 meses, y dosis de recuerdo adicionales a intervalos más separados.
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Generación de Anticuerpos
Se puede utilizar un polipéptido relacionado con ORF0657n capaz de inducir inmunidad de protección para generar anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se unen al polipéptido o a S. aureus. Estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpo tienen diferentes usos, incluidos el uso en la purificación de polipéptidos, identificación de S. aureus, o en el tratamiento terapéutico o profiláctico contra la infección de S. aureus.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. En la técnica se conocen procedimientos para la producción y el uso de anticuerpos. Se describen ejemplos de estos procedimientos en Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998; Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, y Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975.
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Ejemplos
A continuación, se ofrecen ejemplos que ilustran adicionalmente las diferentes características de la presente invención. Los ejemplos ilustran también la metodología útil para llevar la invención a la práctica. Estos ejemplos no limitan la invención reivindicada.
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Ejemplo 1 Uso de la Región ORFQ657n para Conferir Inmunidad de Protección
Este ejemplo ilustra la capacidad de la región ORF0657n de longitud completa para ofrecer inmunidad de protección.
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Clonación y Expresión de ÜRF0657n
Se diseñaron cebadores de PCR para amplificar el gen que codifica ORF0657n, comenzando en el primer residuo de asparagina y finalizando antes del codón de terminación en el residuo de asparagina terminal. Estos cebadores de PCR tuvieron, igualmente, sitios NcoI (cebador hacia adelante) y XhoI (cebador reverso) adicionales para facilitar la clonación en el vector de expresión.
La proteína codificada se diseñó para ser expresada a partir del vector pET28 con los residuos His terminales y el codón de terminación codificados por el vector. Además, se agregó un residuo de glicina a la proteína después del iniciador de metionina. La secuencia amplificada de ADN resultante codifica un ORF0657n con una cola de histidinas en el extremo carboxilo (SEC ID NO: 28).
Las secuencias amplificadas por PCR se ligaron en el vector pET28 (Novagen) usando los sitios NcoI/XhoI que habían sido creados por técnicas de ingeniería en los cebadores de PCR, y que se introdujeron en DH5a de E. coli (Invitrogen) por choque térmico. La mezcla de transformación se cultivó durante la noche sobre placas de agar Luria-Bertani (LB) con 100 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Se seleccionaron colonias, que se cultivaron en LB con 30 \mug/ml de kanamicina, se produjeron minipreps de ADN (Promega), y se determinó la integridad del inserto por digestión de restricción y PCR. Se secuenciaron cuatro minipreps con tamaño correcto de inserto, usando los cebadores M13F (SEC ID NO: 65), M13R (SEC ID NO: 66), ORF0657nF (SEC ID NO: 67), y ORF0657nR (SEC ID NO: 68). Se seleccionó un clon que no contuvo cambios de ADN de la secuencia deseada. Se transformaron células de E. coli HMS174 (DE3) (Novagen) y se cultivaron sobre placas LB que contuvieron kanamicina (30 \mug/ml); se seleccionaron 3 colonias (UnkC-1, UnkC-2 y UnkC-3) para los ensayos de expresión. Los cultivos LB líquidos (kanamicina) se incubaron a 37ºC, 250 rpm hasta que la A_{600} fue de entre 0,6 y 1,0 y, a continuación, se indujeron mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM, seguido de tres horas adicionales de incubación. Los cultivos se cosecharon por centrifugación a 5000 x g durante 5 minutos a 4ºC. Las células se resuspendieron en 500 \mul de tampón de lisis (BugBuster, con inhibidores de proteasa, Novagen). Se agregó un volumen igual de tampón de carga (suplementado con \beta-mercapto-etanol a un 5% de volumen final) antes de calentar las muestras a 70ºC durante 5 minutos. Los extractos se analizaron sobre geles Novex 4- 20% de Tris-Glicina y se visualizaron las proteínas (teñidas con azul Coomassie), se transfirieron sobre nitrocelulosa y se analizaron con anticuerpos anti-HIS6 (Zymed).
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Purificación de ORF0657n
Se logró una incremento directo a escala del procedimiento a menor escala anterior en fermentadores de tanque agitados (escala a 75 litros) con un volumen de trabajo de 50 litros. El inoculo se cultivó en un matraz de 250 ml que contuvo 50 ml de medio Luria-Bertani (LB) (más kanamicina), que fue inoculado con 1 ml de cultivo de siembra congelado, y se cultivó durante 3 horas. Se utilizó 1 ml de esta siembra para inocular un matraz de 2 litros que contuvo 500 ml de medio LB (más kanamicina), y se incubó durante 16 horas. Los parámetros de fermentación del fermentador fueron: presión = 5 psig, velocidad de agitación = 300 rpm, caudal de aire = 15 litros/minuto, y temperatura = 37ºC. Las células se cultivaron hasta una densidad óptica (DO) de 0,8 unidades de densidad óptica, a una longitud de onda de 600 nm, y fueron inducidas con isopropil-\beta-K-tiogalactosida (IPTG) a una concentración de 1 mM. El periodo de inducción con IPTG fue de 3 horas. Las células se cosecharon bajando la temperatura a 15ºC, se concentraron haciéndolas pasar a través de un cartucho de fibra hueca 500KMWCO, y se centrifugaron a 9.000 x gravedad a 4ºC durante 20
minutos. Se decantaron los sobrenadantes, y los conglomerados de células húmedas de E. coli se congelaron a -70ºC.
Las células de E. coli recombinante (peso de las células húmedas 19,2 g) se suspendieron en Tampón de Lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,1 M, MgCl_{2} 2 mM, imidazol 1 mM, 0,1% de Tween®-80, e hidrocloruro de guanidina 6M) a 8 ml por gramo de peso de células húmedas. Se agregó a la suspensión Cóctel de Inhibidor de Proteasa para uso con proteínas poli-marcadas con histidina (Sigma, P8849), a una concentración de 0,65 ml por gramo de pasta celular. Adicionalmente, se agregó lisozima a una concentración de 1 mg/ml, y se agregó Benzonase® (EM Ind.) a una concentración de 1 \mul/ml. La lisis celular se logró haciendo pasar la suspensión a través de un microfluidizador a 14.000 PSI (Microfluidics Modelo 110S) cuatro veces a 4ºC. El residuo celular se aglomeró a 11.000 x g durante 30 minutos a 4ºC, y se retuvo el sobrenadante.
Las proteínas portadoras de una marca His se purificaron desde el sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con 20 ml de Ni+-NTA agarosa (Qiagen) a 4ºC, con una suave inversión durante 2 horas. la mezcla se vertió en una columna abierta (1,5 cm x 20 cm) y se recogió a granel la fracción no fijada. La columna se lavó con Tampón de Lavado (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 0,15 M, 0,1% de Tween®-80). El ORF0657n marcado con His se eluyó con un gradiente de fase de imidazol 300 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Tween®-80.
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Por medio de SDS-PAGE teñido con Coomassie se detectaron las fracciones que contuvieron ORF0657n marcado con His (SEC ID NO: 28), y se combinaron. Las fracciones combinadas se filtraron a través de un filtro de 0,2 micrómetros para eliminar el material particulado, y se aplicaron a una columna de exclusión de tamaño (columna Sephacryl S-300 26/60, Amersham Biosciences), y se eluyeron a 1 ml/min con MOPS 10 mM, pH 7,1, NaCl 150 mM. Las fracciones que contuvieron ORF0657n marcado con His se detectaron por SDS-PAGE teñido con Coomassie y transferencia de western (anti-tetra his Mab, Qiagen). Se eliminó la endotoxina por filtración a través de un Biofiltro Zeta-Plus (CUNO). La concentración de proteínas se determinó por BCA (Pierce). La pureza se determinó por densitometría de geles teñidos con Coomassie.
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Ejemplo 2 Preparación del Estímulo de S. aureus
Se cultivó S. aureus sobre placas de Tryptic Soy Agar (TSA) (Becton Dickinson, Sparks, MD) a 37ºC durante una noche. Las bacterias se retiraron de las placas TSA por lavado, mediante la adición de 5 ml de PBS sobre una placa y resuspendiendo suavemente las bacterias con un diseminador esterilizado. La suspensión bacteriana se centrifugó a 6000 rpm durante 20 minutos usando una centrifugadora Sorvll RC-5B (DuPont Instruments). El aglomerado se resuspendió en glicerol al 16% y se conservaron partes alícuotas congeladas a -70ºC.
Antes de usarlos, los inóculos se descongelaron, se diluyeron de manera apropiada y se utilizaron para infectar. Cada stock se tituló al menos 3 veces para determinar la dosis adecuada para inducir una cinética lenta de muerte de ratones no infectados anteriormente. La potencia del inóculo bacteriano (capacidad para matar 80% a 90% de los ratones) se monitorizó de forma constante para garantizar la reproducibilidad del modelo. 10 días antes de cada experimento de estimulación, se estimuló y monitorizó un grupo de 10 animales de control (inmunizados solamente con el adyuvante).
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Ejemplo 3 Estudios de Protección Usando Polipéptidos Relacionados con ORFQ657n Marcados con His
Se inmunizaron 25 ratones BALB/c con tres dosis de ORF0657n marcado con His (SEC ID NO: 28), 20 \mug por dosis, sobre adyuvante de hidroxifosfato de aluminio (450 \mug por dosis). El adyuvante hidroxifosfato de aluminio (AHP) aparece descrito en Klein et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89, 311 -321, 2000. Las dosis se administraron como dos inyecciones intramusculares de 50 \mul los días 0, 7 y 21. El día 28, se tomaron muestras de sangre de los ratones, y en sus sueros se analizó la reactividad frente a ORF0657n por ELISA.
El día 35 del experimento, los ratones fueron estimulados por una inyección intravenosa de S. aureus cultivado, a una dosis (7,3 x 10^{8} UFC/ml) que, según se determinó en los ensayos de titulación, provoca la muerte durante un periodo de aproximadamente 2 a 7 días. La supervivencia en este modelo letal de cinética lenta de mortalidad se evaluó frente a un grupo de ratones de control, que habían sido falsamente inmunizados con AHP. La supervivencia de los ratones se monitorizó durante un periodo de 14 días (Figura 3A). Al final del experimento, 11 ratones sobrevivieron en el grupo inmunizado con ORF0657n, en comparación con tres que lo hicieron en el grupo de control de AHP.
Las Figuras 3B y 3C ilustran la protección usando polipéptidos correspondientes a las regiones ORF0657nH y ORF0657nI. La Figura 3B ilustra la protección con SEC ID NO: 4 que contiene una cola de histidinas en el extremo carboxilo. La Figura 3C ilustra los resultados con SEC ID NO: 5 que contiene una cola de histidinas en el extremo carboxilo.
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Ejemplo 4 Obtención de Secuencias de ORFQ657n
Se ha afirmado que ORF0657n desempeña un papel en la adquisición de hierro por parte de S. aureus. (Andrade et al., Genome Biology 3(9):47.1-47.5, 2003). Las secuencias de ORF0657n, alunas de las cuales provienen de fuentes diferentes, han recibido distintas designaciones en diferentes referencias bibliográficas. (Por ejemplo, véanse Etz et al., PNAS USA, 99:6573-6578 (LPXTGVI); Baba et al., The Lancet 359:1819-1827, 2002 (MW1011); Kuroda et al., The Lancet 357, 1225-1240, 2001 (SA0976); Andrade et al., Genome Biology 3(9): 47.1-47.5, 2003 (S_aur2); Mazmanian et al., Science 299:906-909, 2003 (isdB); Mazmanian et al., Molecular Microbiology 40:1049-1057, 2001 (sasJ); Taylor et al., Mol. Microbiol. 43:163-1614, 2002 (sirH).
En diferentes publicaciones de patente parece estar descrita la oferta de una secuencia polipeptídica correspondiente a una secuencia de proteínas de ORF0657n. (Meinke et al., Publicación Internacional Número WO 02/059148, publicada el 1 de agosto de 2002; Wang et al., Publicación Internacional Número WO 02/077183, publicada el 3 de octubre de 2002; Masignani et al., Publicación Internacional Número WO 02/004868, publicada el 28 de noviembre de 2002; Foster et al., Publicación Internacional Número WO 02/102829, publicada el 27 de diciembre de 2002, y Foster et al., Publicación Internacional Número WO 03/011899, publicada el 13 de febrero de 2003).
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A partir de diferentes aislados clínicos de S. aureus se obtuvo ADN genómico. Se agregaron aislados clínicos a 3 ml de Caldo de Cultivo Difco Tryptic Soy (Becton Dickinson, Sparks, MD) y se incubaron a 37ºC durante la noche a 150 rpm. Los cultivos de la noche anterior se centrifugaron en tubos Eppendorf de 1,5 ml a 14.000 rpm durante 5 minutos. Se decantó el caldo de cultivo, y los aglomerados se resuspendieron en 500 \mul de tampón de resuspensión (sacarosa al 25%, Tris 10 mM, pH 7,5). Se agregó una alícuota de 5 \mul de una solución de 2 mg/ml de lisostafina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a cada aglomerado resuspendido. A continuación, se incubaron las suspensiones a 37ºC durante 1 hora.
Al final del periodo de incubación, se agregaron a cada tubo 250 \mul de SDS al 2% y se sometió a un sistema de torbellino hasta que la viscosidad de la solución disminuyó de forma notoria. Se agregaron 250 \mul de una solución de fenol-cloroformo-isoamilo (25:24:1, en volumen) (Gibco/Invitrogen Corporation, Grand Island, NY). La mezcla se sometió a torbellino durante 30 segundos y se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 rpm. Se retiró la fase acuosa superior y se repitieron las etapas de precipitación hasta que prácticamente no se detectaron interfaces. A cada tubo se agregó 0,1 volumen de NaOAc 3 M, pH 4,8, y se mezcló. Entonces, se agregó 1 volumen de isopropanol, y se volvió a mezclar. Los tubos se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y, seguidamente, se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 minutos. Se decantó el sobrenadante y los tubos se dejaron secar boca abajo sobre papel tisú. Los aglomerados se resuspendieron en 50 \mul de H_{2}O estéril.
El ADN aislado se usó como molde para la PCR. El gen se amplificó usando un cebador hacia adelante
(ORF0657nF, SEC ID NO: 67) y un cebador reverso (ORF0657nR, SEC ID NO: 68). Los productos de PCR se secuenciaron usando los protocolos estándar Big Dye.
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Ejemplo 5 Comparación de ORFQ657n de Diferentes Aislados Clínicos de S. aureus
A través de una colección de aislados clínicos de S. aureus patológica y taxonómicamente diferentes, se observó que ORF0657n está bien conservado. La Tabla 3 ofrece un resumen de la identidad porcentual entre los diferentes aislados, incluidos los aislados clínicos.
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TABLA 3
6
7
La identidad porcentual (% ID) se determinó alineando la secuencia polipeptídica con SC ID NO: 2 y determinando el número de aminoácidos idénticos. Este número se dividió por el número total de aminoácidos (de SEC ID NO: 2) y, a continuación, se multiplicó por 100 y se redondeó hasta el número entero más próximo.
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Ejemplo 6 Protección Contra Diferentes Aislados Clínicos de S. aureus
Se evaluó la eficacia de ORF0657n como inmunógeno contra diferentes aislados clínicos de S. aureus, usando ORF0657n marcado con His (SEC ID NO: 28) como inmunógeno. A modo de inóculo de estimulación, se utilizó un subconjunto de aislados taxonómicamente diferentes descrito en la Tabla 3. Las secuencias de ORF0657n en estos distintos aislados difirieron de la secuencia de ORF0657n usada en la vacuna.
Las cepas de estimulación obtenidas se prepararon según las técnicas descritas en el Ejemplo 2. Se inmunizaron y estimularon ratones de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 3, y fueron monitorizados durante 10 días. Los inóculos de estimulación usados de manera convencional en los modelos superan en alto grado a los que se encuentran típicamente en infecciones humanas.
Se demostró protección contra cepas tanto sensibles como resistentes a meticilina. Los resultados se muestran en las Figuras 4A-4H.
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Ejemplo 7 Optimización a Nivel de Codones de SEC ID NO: 28 para la Expresión en Levadura
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos 1-646 de SEC ID NO: 28 se optimizó a nivel de codones para la expresión en levadura. En la Figura 8C se representa una secuencia optimizada a nivel de codones para los aminoácidos 1-646 de SEC ID NO: 28 (SEC ID NO: 31).
Como construcción inicial para la optimización, se utilizó la SEC ID NO: 29 exenta de la región que codifica la cola de histidinas el extremo carboxilo. El empleo global de codones de la secuencia de codificación antes de la optimización fue: los genes de levadura de alta expresión utilizaron con muy baja frecuencia o nunca 28% de los codones (179), en tanto que 20% (126) mostraron una utilización moderadamente escasa.
La optimización de codones de los ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos 1 -646 de SEC ID NO: 28 se llevó a la práctica para sustituir los codones que tienen una expresión baja o moderada por codones con una elevada expresión de la levadura. Además, se agregó un codón de glicina a la segunda posición. La optimización de codones se llevó a cabo usando el programa de software MacDNAsis Pro V 3.0. La tabla de parámetros empleada para la retrotraducción de proteínas muestra la presencia de codones de S. cerevisiae altamente expresados. En MacDNAsis Pro, la función usada es "Traducir > [Proteína -\rightarrow ADN]". El resultado se denomina "Conversión de Aminoácido".
En algunos casos, existe más de un codón altamente expresado para un determinado aminoácido. Por ejemplo, la serina se codifica por "TCT" o "TCC". En estos casos, se emplearon números aproximadamente iguales de los dos codones diferentes. La Tabla 4 presenta una tabla de codones para codones altamente expresados en S. cerevisiae.
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TABLA 4
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Todos los codones que no fueron óptimos se cambiaron por codones hallados en genes de levadura de elevada expresión, con la excepción de dos codones de alanina, que se cambiaron por codones hallados en genes de expresión moderada (GCG que comienzan en los nucleótidos 505 y 1546) de la SEC ID NO: 31.
La secuencia global que codifica ORF0657n se preparó por medio de la hibridación y extensión de 25 oligómeros (SEC ID NOs: 69-93) diseñados para codificar la secuencia final deseada. Los oligómeros tuvieron una longitud de 85-110 pb. Los oligómeros fueron una secuencia alternativa de codificación de ORF0657n. Cada oligómero tuvo un solapamiento complementario de 25-29 pb con el oligómero adyacente, y la estructura dúplex tuvo una Tm de 80-84ºC. Esta se calculó de forma manual, asignando a un par de bases GC un valor de 4ºC, y a un par de bases AT el valor de 2ºC.
Se llevaron a cabo siete reacciones de extensión separadas, utilizando tres o cuatro oligómeros solapados con los adyacentes, y cebadores sentido y anti-sentido de PCR (23-26) nt de longitud con una Tm dúplex de 70-72ºC. Se usó ADN-polimerasa Pfu nativa (STRATAGENE, La Jolla, CA) para las reacciones de PCR en una estrategia de "touchdown" del modo siguiente: 95ºC, 90 segundos, un ciclo; 95ºC, 30 segundos, 55ºC, 30 segundos, 68ºC, 3 minutos durante 5 ciclos, seguidos inmediatamente por una segunda serie de reacciones; 95ºC, 30 segundos, 52ºC, 30 segundos, 68ºC, 3 minutos durante 20 ciclos. La reacción se completó por incubación a 68ºC durante 7 minutos. Como resultado de estas reacciones de PCR, se crearon siete fragmentos co-lineales del gen (a los que se designa en este documento como 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, por conveniencia).
Los fragmentos se aislaron por electroforesis sobre gel de agarosa, y se escindieron y purificaron productos del tamaño apropiado usando el procedimiento GENE CLEAN® II (QBIOgene, Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. En reacciones de PCR subsiguientes, se combinaron los fragmentos co-lineales 1, 2 y 3, los fragmentos co-lineales 4 y 5, y los fragmentos co-lineales 6 y 7 con los cebadores adecuados para dar los fragmentos A, B y C, respectivamente. A continuación, se ensambló el gen completo para ORF0657n por medio de una reacción de PCR adicional, en la que se combinaron los fragmentos A, B y C usando cebadores sentido y anti-sentido distales. El producto de PCR final se aisló sobre gel y se clonó en pCR®-Blunt II-TOPO® (INVITROGEN, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtuvo la secuencia de ADN de diversos clones independientes y se identificaron los errores.
Se corrigieron los errores en diferentes segmentos de tres clones independientes, pUC3, pUC4 y pUC6, de manera secuencial, usando el Kit de Mutagénesis dirigida al Sitio QUIK-CHANGE, o bien de forma simultánea, con el Kit de Multi Mutagénesis dirigida al Sitio QUIK-CHANGE (STRATAGENE, La Jolla, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuencia corregida final se obtuvo por medio del intercambio de fragmentos de restricción reparados de los tres clones. Se intercambió un fragmento XmnI de 1,1 kb del clon pUC4 por el correspondiente fragmento XmnI de pUC3 para construir pUnkC 13. Se intercambió un fragmento AccI reparado, de 456 pb, de pUC6 por el fragmento correspondiente de pUnkC 13 para construir pUnkCR1, y se verificó la secuencia de ADN.
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Ejemplo 8 Construcción de Cepas de Saccharomyces cerevisiae para la Expresión de Genes Recombinantes
Este ejemplo ilustra las técnicas que se pueden utilizar para obtener cepas de Saccharomyces cerevisiae para la expresión de genes recombinantes. A continuación, se describe la creación de cepas designadas 1260 y 1309. Puesto que los antecedentes genéticos de una cepa pueden influir de manera importante sobre las propiedades de una cepa para la expresión de una proteína heteróloga, se intentó construir cepas de levadura con diferentes antecedentes genéticos que contuvieron también varios marcadores genéticos deseables: (1) mutación mnn9 para prevenir la hiperglicosilación de las proteínas secretadas; (2) mutaciones de las proteasas prb1 y/o pep4 para reducir los problemas con la proteólisis, y (3) sobreexpresión del factor de transcripción GAL4 con el fin de incrementar la expresión a partir de los promotores GAL.
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Construcción de la Cepa de S. cerevisiae Designada 1260
Se construyó una cepa inicial de S. cerevisiae de la siguiente manera: se cruzó la cepa de S. cerevisiae Y379-5D (MAT\alpha, cyh2, nibl, rho^{-}, cirº) (Livingston, Genetics 86:73-84, 1977) con la cepa DC04 (MAT\alpha, adel, adeX, leu2-04, cirº) (Broach et al., Cell 21:501-508, 1980). La cepa diploide resultante se esporuló y se diseccionaron las tétradas por procedimientos convencionales. Una de las esporas haploides dio origen a la cepa 2150-2-3 (MAT\alpha, adel, leu2-04, cirº). La cepa de S. cerevisiae de tipo apareamiento \alpha LB3471C (MAT\alpha, mnn9) es la cepa de S. cerevisiae X2180-1B (MAT\alpha, SUC2, mal, mel, gal2, CUP1; número de la ATCC 204504), que contiene una mutación mnn9. LB-347-1C se apareó con la cepa tipo 2150-2-3 (MAT\alpha, leu2-04, adel) mezclando la cepa en una placa de agar con medio completo de YEHDG (Carty et al., J. Ind. Micro. 2:117-121, 1987). Para la seleccionar de diploides, las cepas apareadas se sembraron en forma de réplica sobre placas con medio mínimo sin leucina y que como única fuente de carbono contuvo sacarosa al 2%. Después de aislar colonias individuales, los diploides se esporularon y los asci se diseccionaron por técnicas convencionales. Se aisló la cepa KHY-107 como espora haploide individual y se caracterizó como ADE1, leu2 y mnn9 (por medio de la técnica de tinción de Schiff). Se estableció un stock congelado en glicerol, que se conservó a -70ºC.
KHY-107 (cir^{+}) se cultivó a partir del stock a -70ºC y se transformó con el vector de levadura pC1/1, que contiene el gen de levadura LEU2-d y está relacionado con pJDB219 (Beggs, Nature 275:104-109, 1978), excepto que el ADN pMB9 está sustituido por ADN pBR322. Se cultivó un transformante aislado en medio líquido selectivo (exento de leucina y que contiene sorbitol 1 M), y, a continuación, se cultivó a través de múltiples pasajes en medio rico (que contiene sorbitol 1 M) para perder tanto pC1/1 como ADN 2 \mu. Las colonias que habían perdido pC1/1 (incapaces de crecer en un medio exento de leucina) se analizaron por hibridación ADN-ADN en busca de ADN 2 \mu. Se seleccionó un clon
aislado, KHY-107 (cirº)-1, que no exhibe ADN 2 \mu, que se estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol.
KHY-107 (cirº)-1 se convirtió en ura3 por disrupción génica. Se construyó un plásmido que contiene el gen URA3 de S. cerevisiae afectado por 2 copias del gen Aph3'l de Tn903. El casete 5'-URA3-Aph3'l-URA3-3' se escindió del vector y se usó para transformar KHY-107 (cirº)-1. Los transformantes que habían integrado el casete ura3 afectado por la disrupción se seleccionaron sobre placas de ácido 5-fluoro-orótico (Kaiser, C. et al., Methods in Yeast Genetics, Edición 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, Nueva York; 1994), páginas 214-215) y demostraron, subsiguientemente, ser incapaces de crecer sobre medio exento de uracilo. Se seleccionó un clon aislado, KHY-107ura3(PN_{2}), que se estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol.
KHY-107ura3(PN_{2}) se cultivó en medio complejo (que contiene sorbitol 1 M) y a continuación se sembró en placa sobre medio sintético que contiene canavanina en lugar de arginina, y se obtuvieron mutantes resistentes a canavanina (can^{R}). Por medio del sembrado en rayas sobre medio sintético sólido que contuvo canavanina en lugar de arginina, se buscaron colonias aisladas de mutantes can^{R} espontáneos. Por ensayos de complementación genética convencionales, se demostró que las colonias aisladas eran can1. Se seleccionó una colonia can1 aislada, DMY10, que se conservó como stock congelado (-70ºC) en glicerol.
Para la sobreexpresión del factor de transcripción GAL4 de levadura, se integró el gen de fusión GAL10p-GAL4 en el gen HIS3 de DMY10. El casete 5'-HIS3-GAL10p-GAL4-URA3-HIS3-3' se escindió de pKHint-C (Schultz et al., Gene 61:123-133, 1987) y se usó para transformar DMY10. Se seleccionaron los transformantes que habían integrado el casete sobre medio sintético sólido exento de uracilo y, subsiguientemente, se demostró que eran incapaces de crecer en medio exento de histidina. Se verificó la integración del casete sólo en el locus HIS3 por hibridación de Southern. Se seleccionó un integrante aislado, DMY10int-3, que se estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol. Esta cepa se designó como CF52.
El plásmido FP8\DeltaH, portador del gen PRB1 de S. cerevisiae (Moehle et al., Genetics 115:255- 263, 1987) se digirió con HindIII más XhoI, y el fragmento de ADN de 3,2 kpb portador del gen PRB1 se purificó sobre gel y se crearon extremos romos mediante tratamiento con ADN-polimerasa T4. El plásmido pUC18 se digirió con BamHI, se purificó sobre gel y sus extremos se hicieron romos por tratamiento con ADN-polimerasa T4. El fragmento del vector resultante se ligó con el fragmento del gen PRB1 anterior para dar el plásmido pUC18-PRB1. El plásmido YEp6 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76:1035, 1979), que contiene el gen HIS3, se digirió con BamHI. El fragmento BamHI de 1,7 kpb resultante, portador del gen HIS3 funcional, se purificó sobre gel y sus extremos se hicieron romos por tratamiento con ADN-polimerasa T4. El vector pUC18-PRB1 se digirió con EcoRV más NcoI, que corta en el interior de la secuencia que codifica PRB1 y elimina el sitio activo de proteasa B y la secuencia de flanqueo. El fragmento EcoRV-NcoI de 5,7 kpb, portador de las porciones 5' y 3' residuales de la secuencia de codificación de PRB1 en pUC18, se purificó sobre gel, sus extremos se hicieron romos por tratamiento con ADN-polimerasa T4, se defosforiló con fosfatasa alcalina, y se ligó con el fragmento HIS3 de extremos romos descrito anteriormente. El plásmido resultante (designado pUC18-prb1::HIS3, stock nº 1245) contiene el gen HIS3 funcional en lugar de la porción del gen PRB1 que había sido eliminada anteriormente.
El vector de disrupción del gen PRB1 (pUC18-prb1::HIS3) se digirió con SacI más XbaI para generar un casete lineal de disrupción prb::HIS3, y se utilizó para la transformación de la cepa CF52 por medio del procedimiento de acetato de litio (Ito et al., J. Bacteriol. 153:163, 1983). Se seleccionaron transformantes His^{+} sobre medio de agar sintético exento de histidina y se sembraron nuevamente en rayas sobre el mismo medio, en busca de aislados clónicos. Se preparó ADN genómico a partir de una serie de los aislados His^{+} resultantes, se digirió con EcoRI y, a continuación, se sometió a electroforesis sobre geles de agarosa al 0,8%. Los análisis de transferencia de Southern confirmaron la presencia de la disrupción del gen prb1\Delta::HIS3 deseada.
Uno de los aislados que contiene la disrupción prb1\Delta::HIS3 deseada se seleccionó para uso posterior y se designó como cepa nº 1260. Se prepararon stocks congelados de la cepa nº 1260 para su conservación a -70ºC. El genotipo resultante de la cepa 1260 es el siguiente: MAT\alpha, leu2-2, 112, mnn9, ura3\Delta, can1, his3\Delta::GAL 10p-GAL4-URA3, prb1\Delta::HIS3, cirº.
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Construcción de la Cepa de S. cerevisiae Designada 1309
La cepa de S. cerevisiae BJ1995 (MAT\alpha, leu2, trp1, ura3-52, prb1-1122, pep4-3, gal2) ha sido descrita previamente (Jones, E.W., Tackling the Protease Problem in Saccharomyces cerevisiae, Methods in Enzymology 194 (1991), páginas 428-453). Se aisló un derivado cirº de BJ1995 que careció del plásmido de ADN 2 \mu endógeno usando el procedimiento descrito para la construcción de la cepa 1260. El aislado cirº resultante se designó cepa 91 y se conservó como stock congelado (-70ºC) en glicerol.
Seguidamente, se construyó un derivado de la cepa 91, que muestra una sobreproducción del factor de transcripción GAL4 con el fin de incrementar la transcripción a partir de los promotores GAL. El plásmido pKHint-C (Schultz et al., Gene 61:123-133, 1987) se digirió con BamHI y se utilizó el casete 5'-HIS3-GAL10p-GAL4-URA3-HIS3-3' resultante para transformar la cepa 91. Se seleccionaron los transformantes que habían integrado el casete sobre medio sintético sólido exento de uracilo y, subsiguientemente, demostraron ser incapaces de crecer en medio exento de histidina. La integración deseada del casete en el locus HIS3 se verificó por hibridación de Southern, usando una sonda para el gen HIS3 de levadura. Se seleccionó un integrante asilado, BJ1995cirºint nº 22, y se estableció como stock congelado (-70ºC) en glicerol. Este aislado se designó cepa 1282.
Seguidamente, se aisló un derivado de la cepa 1282 que contuvo una disrupción del gen MNN9, de acuerdo con la serie de etapas siguientes. Con el fin de provocar la disrupción del gen MNN9 fue necesario clonar, en primer lugar, el gen MNN9 a partir del ADN genómico de S. cerevisiae al objeto de preparar un vector de disrupción de genes. Esto se consiguió por tecnología PCR convencional. Se diseñaron un cebador 5'-sentido y un cebador 3'-antisentido para la PCR de la secuencia de codificación de MNN9 de longitud completa, basados en la secuencia publicada para el gen MNN9 de levadura (MacKay et al., Publicación Europea Número EP o314096, Fecha de Publicación Internacional 3 de mayo, 1989). Se utilizaron los siguientes oligodesoxinucleótidos cebadores que contienen sitios HindIII de flanqueo (subrayados): cebador sentido (SEC ID NO: 94): 5'-CTT A AA GCT T AT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3'; cebador antisentido (SEC ID NO: 95): 5'-TGA T AA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3'. El codón de metionina iniciador para el gen MNN9 se destaca en negritas.
La PCR se llevó a cabo usando ADN genómico de S. cerevisiae como molde. El fragmento de PCR de 1,2 kpb resultante, portador del gen MNN9, se digirió con HindIII, y se ligó con pUC13 digerido con HindIII y tratado con fosfatasa alcalina. El plásmido resultante se designó p1183. Se aisló el gen TRP1 de levadura a partir de YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76:1035-1039, 1979) en forma de un fragmento EcoRI-BglII de 0,85 kb, cuyos extremos se hicieron romos, y a continuación, se insertó en el sitio PmII de p1183. El sitio PmII está en el centro de la secuencia de codificación de MNN9 y, por lo tanto, la inserción del gen TRP1 en ese sitio da como resultado la disrupción del gen. Seguidamente, se digirió el plásmido resultante pUC13-mnn9::TRP1 (pH1185-239-1) con HpaI más EcoRI y se usó el casete 5'-mnn9-TRP1-mnn9-3' para la transformación de la cepa 1282 por el procedimiento de acetato de litio (Ito et al., J. Bacteriol. 153:163, 1983).
Los transformantes Trp^{+} se seleccionaron sobre placas de agar con medio sintético exento de triptófano, y se sembraron nuevamente en rayas sobre las mismas placas para detectar aislados de colonias individuales. Se preparó ADN genómico a partir de una serie de los aislados Trp^{+} resultantes, se digirió con HindIII y, a continuación, se sometió a electroforesis sobre geles de agarosa al 0,8%. Mediante análisis de transferencia de Southern se confirmó la presencia de la disrupción deseada del gen mnn9::TRP1. Se seleccionó uno de estos aislados que contiene la disrupción deseada de mnn9::TRP1 para su uso posterior, y se designó cepa 1309. Se prepararon stocks congelados en glicerol para la cepa 1309 para su conservación a -70ºC. El genotipo de la cepa 1309 es el siguiente: MAT\alpha, leu2, mnn9::TRP1, trp1, ura3-52, his3\Delta::GAL10p-GAL4-URA3, prb1-1122, pep4-3, gal2, cirº.
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Ejemplo 9 Expresión de la Región ORFQ657n de Longitud Completa
ORF0657n de longitud completa se expresó en E. coli (SEC ID NO: 28, ORF0657n marcado con His) y S. cerevisiae (aminoácidos 1-646 de SEC ID NO: 28), y se compararon los productos de expresión.
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Expresión en S. cerevisiae
A partir del clon final corregido, pUnkCR1 (Ejemplo 7), se amplificó el ADN que codifica la proteína ORF0657n con codones optimizados para expresión en levadura, utilizando los siguientes cebadores sentido y antisentido, respectivamente, UnkCY-F (SEC ID NO: 96), 5'AAC GG TTT GGA TCC CAC AAA ACA AAA TGG GTA ACA AGC AAC AAA AGG AAT TC3', y UnkCY-R (SEC ID MO: 97), 5'AAC CGG TTT GGA TCC TTA GTT CTT TCT CTT TCT TGG CAA GAC3', que contiene sitios de restricción BamHI de flanqueo. El cebador sentido contiene una secuencia una secuencia 5' no traducida y un codón ATG, y el cebador antisentido contiene TAA como codón de terminación. El producto resultante, de 1,9 kb, se aisló sobre gel y se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1 (INVITROGEN CORPORATION, Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante, para construir el plásmido UnkC-B1. Subsiguientemente, se verificó la secuencia de ADN del inserto. El fragmento BamHI se aisló sobre gel y se sub-clonó en la orientación apropiada en un vector de levadura (pGAL110, Figura 5A) para construir pRUnkC-pGAL110. La secuencia del inserto se verificó por secuenciación de ADN.
Se utilizó ADN plasmídico de pRUnkC-pGAL110 para transformar cepas de S. cerevisiae que contienen una mutación leu2 a prototrofia de leucina (Leu^{+}), empleando un protocolo de transformación de esferoplastos (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75:1929-33, 1978). La construcción de las cepas 1260 y 1309 se describe en el Ejemplo 8 anterior.
Se seleccionaron transformantes sobre medio de agar sintético exento de leucina y que contuvo sorbitol 1 M. Las capas superior e inferior del medio de agar sintético, exento de leucina y que contuvo sorbitol 1 M, se obtuvieron de REMEL, Lenexa, KS (n^{os} de catálogo 09459 y 92155, respectivamente). Mediante cultivo seriado sobre placas sin leucina SD (KD MEDICAL, Columbia, MD) se obtuvieron aislados Leu^{+} clónicos.
Para el análisis de múltiples transformantes, se llevaron a cabo cultivos de producción de 5,0 ml en tubos de cultivos en rotación lenta a 30ºC. Subsiguientemente, se confirmó la producción para transformantes seleccionados en cultivos de 25 ml en un matraz de 125 ml. En ambos casos, se efectuaron cultivos de siembras de 5 ml a 30ºC en medio sin leucina 5x que contuvo 4,0% de glucosa y sorbitol 0,1 M, durante 18-24 horas, hasta una DO_{600} de 1,5-3,0/ml. El medio sin leucina 5x contiene los siguientes componentes por litro: Base Nitrogenada de Levadura sin aminoácidos o sulfato de amonio adicionales, 8,5 g; adenina, 0,40 g; L-tirosina, 0,25 g; uracilo, 0,20 g; ácido succínico, 10,0 g; sulfato de amonio, 5,0 g; y 50 ml de Solución sin Leucina nº 3. La Solución sin Leucina nº 3 contiene, por litro de agua destilada, L-arginina, 2 g; L-histidina, 1,0 g; L-isoleucina, 6 g; L-lisina, 4,0 g; L-metionina, 1,0 g; L-fenilalanina, 6,0 g; L-triptófano, 4,0 g. El pH del medio se ajustó a 5,3 con hidróxido de sodio al 50%.
Para la producción en tubos, se transfirió una parte alícuota de 0,3 ml del cultivo de siembra a 5,0 ml de medio sin leucina 5x, que contuvo glucosa al 2%, galactosa al 4%, o a medio YEHDG durante 72 horas, hasta una DO_{600} final de 5-16,0/ml. El medio YEHDG contiene, por litro: L-Hy-Soja-peptona-Sheffield, 10 g; extracto de levadura, 20 g; L-dextrosa, 16 g; D(+)-galactosa, 40 g. Para la producción en matraces, se transfirió una parte alícuota de 1,5 ml del cultivo de siembra a 25 ml de medio y se cultivó de la forma descrita anteriormente, con agitación a 220 rpm.
Después de cosechar 10 unidades DO por muestra, se disgregaron los aglomerados celulares con perlas de vidrio en 0,3 ml de tampón de lisis (tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,2, NaCl 0,5 M, PMSF 2 mM). El lisado se recuperó por centrifugación, las células/perlas no disgregadas se lavaron con 0,3 ml de tampón de lisado, y se combinaron los sobrenadantes clarificados. La concentración de proteínas se determinó mediante el sistema Reactivo de Tinción para Ensayo de Proteínas de BIO-RAD (BIO-RAD, Hercules, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. En los lisados celulares se analizó la expresión de ORF0657n por análisis de inmuno-transferencia posterior a electroforesis sobre geles de Tris-glicina de gradiente de 4-20% (INVITROGEN, Carlsbad, CA) en tampón 1X Tris-glicina SDS (BIO-RAD) bajo condiciones de educción y desnaturalización. Las muestras contuvieron 20 \mug de la proteína celular total. Los geles se sometieron a electro-transferencia sobre filtros de membrana de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros (Optitran de Schleicher y Schuell, Keene, NH). Para calcular el tamaño de la proteína, se analizaron en paralelo con los lisados estándares pre-teñidos de entre 6,4 y 203 kDa (Broad Range Prestained SDS-PAGE Standard, BIO-RAD).
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Estándar de E. coli
Como estándares se utilizaron ORF0657n marcado con His (SEC ID NO: 28), purificado a partir del cultivo productor de E. coli (hospedador E. coli HMS 174(DE3), NOVAGEN, Madison, WI), inducido para producir ORF0657n, y un lisado celular. La transformación de E. coli se llevó a cabo con un vector de expresión que expresó ORF0657n marcado con His. La cultivo de E. coli se efectuó durante la noche en caldo LB que contuvo 30 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Al día siguiente, se utilizaron 60 \mul del cultivo de la noche anterior para inocular 6,0 ml de LB más 30 \mug por ml de kanamicina. El cultivo se llevó a cabo a 37ºC durante aproximadamente 3 horas, hasta que la DO_{600} fue de entre 0,4-1,0. La expresión se indujo con IPTG 1 mM durante 2 horas a 37ºC. Se cosecharon las células y se conservó el aglomerado celular a -80ºC.
El lisado de E. coli se preparó usando el Reactivo de Extracción de Proteína Bugbuster (NOVAGEN, Madison, WI), siguiendo el protocolo del fabricante. Las proteínas se sometieron a inmunodetección mediante transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal de ratón (designado "2H2B8") contra ORF0657n como anticuerpo primario, y anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El Mab 2H2B8 se generó por inmunización de ratones con ORF0657n de longitud completa, producido por E. coli, y purificado. El Mab 2H2B8 se seleccionó por ELISA y demostró ser específico para ORF0657n. Los filtros se procesaron usando el Kit de Sustrato Conjugado HRP de BIO-RAD.
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Productos de Expresión de E. coli y S. cerevisiae
A partir del análisis inicial de transformantes de levadura, se seleccionó un transformante para cada una de las cepas 1260 y 1309 como los mejores productores de la región ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 28 exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo). En las Figuras 6A y 6B se muestra un ejemplo de su producción de la región ORF0657n de longitud completa, después de una fermentación de 72 horas en medio YEHDG, comparada con la producción de la región ORF0657n (SEC ID NO: 28) en E. coli.
Tal como se muestra en las Figuras 6A (cepa 1260) y 6B (cepa 1309), pistas 5 y 6, la proteína principal detectada por análisis de transferencia de western con mAb 2H2B8 tuvo \sim105-110 kDa. La proteína de \sim105-110 kDa correspondió en tamaño a la proteína de mayor tamaño detectada en la muestra de ORF0657n recombinante purificado, producido en E. coli (SEC ID NO: 28, pista 2), o un extracto del cultivo productor de ORF0657n de E. coli (este último no está incluido en los geles que se muestra en la Figura 6). Las proteínas de 105-110 kDa producidas por E. coli y S. cerevisiae tienen un peso molecular mayor que el tamaño previsto por los inventores en el sistema de electroforesis sobre gel. Es necesario señalar que la especie predominante detectada en los controles de E. coli fue de tamaño menor, \sim95 kDa, y co-migró con una cantidad mínima de la proteína producida por la levadura. Se cree que la proteína de 105-110 kDa corresponde al ORF0657n de longitud completa que se expresó con el líder secretor de E. coli tanto en E. coli como en S. cerevisiae, y la proteína de 95 kDa se considera que es un producto de degradación. No se observó ninguna detección con un extracto de un transformante de control obtenido con el vector pGAL110 solo (pistas 3 y 4).
La cantidad estimada de región ORF0657n (SEC ID NO: 28, exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo), producida por los transformantes de las cepas 1260 y 1309, fue de \sim10 microgramos de ORF0657n/ml de medio YEHDG, en donde la región ORF0657n comprende -2% de la proteína total, según se determina por transferencia de western semicuantitativa con 100 ng de ORF0657n (SEC ID NO: 28) purificado como estándar. Tanto las cantidades expresadas como los % de región ORF0657n (SEC ID NO: 28 exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo) de la proteína total fueron más elevados a las 72 horas, en comparación con 48 horas, en ambas cepas (datos no presentados). El título de la región ORF0657n (SEC ID NO: 28 exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo) producido por los transformantes de 1260 en medio de leucina 5X que contiene glucosa al 2% y galactosa al 4%, fue de \sim8,0 \mug/ml, y el % total de proteína fue de 2,0.
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Ejemplo 10 Expresión de una Secuencia Secretada, Optimizada a Nivel de Codones, que Codifica una Región QRF0657nH
El vector pKH4-3B (Carty et al., Biotechnol. Lett. 12:879-884, 1990) contiene el líder pre-pro secretor del factor de levadura alfa (MF\alpha). La fusión de una proteína deseada con este líder da como resultado un producto de traducción que es escindido, en primer lugar, por la señal peptidasa de S. cerevisiae. Subsiguientemente, la proteasa Kex2 provoca una escisión detrás del "residuo Lys Arg" en el líder secretor, y se libera la proteína madura. Se utilizó el promotor GAL110 inducible de S. cerevisiae para estimular la expresión de proteína.
El vector pKH4-3B se usó para expresar un gen optimizado a nivel del codón que codifica una SEC ID NO: 3 alterada. La SEC ID NO: 3 se alteró mediante la eliminación de la metionina del extremo amino terminal y agregando una secuencia líder en el extremo amino terminal. Los nucleótidos 4-1710 de SEC ID NO: 32 proporcionan la región optimizada a nivel de codón que codifica SEC ID NO: 3, y la secuencia codificadora líder es aportada por el vector pKH4-3B, preparado de la forma descrita a continuación.
Se llevó a cabo una fusión marco del líder pre-pro secretor del factor alfa de pKH4-3B con la región ORF0657nH de SEC ID NO: 3. Esto se logró por la digestión del vector pKH4-3B con SphI, seguida del tratamiento con ADN-polimerasa T4 para eliminar la protuberancia de SphI, creando un extremo romo en el extremo 5', con el codón apropiado del líder. A continuación, el vector se digirió con BamHI para crear un sitio de clonación 3'. Esta construcción requiere de un producto de PCR con un extremo romo 5', correspondiente al segundo codón de la región ORF0657nH reconstruida (SEC ID NO: 32), y un extremo terminal 3' con un codón de terminación y un sitio de restricción BamHI.
El ADN que codifica la región ORF0657nH con codones optimizados para la expresión en levadura, se amplificó a partir de pUnkCR1 (Ejemplo 7) utilizando los siguientes cebadores sentido y antisentido, respectivamente: UCKHS2 (SEC ID NO: 98) 5'GCT GAA GAA ACT GGT GGT ACC AAC3' y UCKHA2, (SEC ID NO: 99) 5' GTC ACG GAT CCT TAA GAC TTA GCC TTG TTT TCT TGA GTG TTC3'. El extremo 5' del cebador sentido, GCT, codifica alanina, es decir, el extremo N-terminal predeterminado de la región ORF0657nH. El cebador antisentido contiene un codón de terminación TAA y un sitio BamHI (subrayado). El producto de PCR resultante, de 1,7 kb, se aisló sobre gel y se clonó en pH4-3B (preparado de la forma descrita anteriormente), para construir pUS38. Se verificó la totalidad de la secuencia de ADN del inserto y la secuencia parcial del vector, y se demostró que la fusión deseada al elemento secretor se había realizado. La escisión adecuada mediante Kex2p de la proteína inicial expresada a partir de esta construcción daría como resultado una proteína correspondiente a SEC ID NO: 3 exenta de metionina N-terminal.
El plásmido pUS38 se usó para transformar las cepas 1260 y 1309 de S. cerevisiae a prototrofia de leucina (Leu^{+}) mediante el protocolo de transformación de esferoplastos (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 75:1939-33, 1978). Los transformantes se seleccionaron en medio de agar sintético exento de leucina y que contuvo sorbitol 1 M. Las capas superior e inferior de medio de agar sintético exento de leucina y que contiene sorbitol 1 M se obtuvieron de REMEL, Lenexa, KS (nº de catálogo 09459 y 92155, respectivamente). Mediante el cultivo seriado sobre placas sin leucina SD (KD MEDICAL, Columbia, MD) se obtuvieron aislados Leu^{+} clónicos.
Para llevar a cabo el análisis de múltiples transformantes, se realizaron cultivos de 5 ml a 30ºC en medio sin leucina 5X que contuvo los siguientes componentes por litro: Base Nitrogenada de Levadura sin aminoácidos o sulfato de amonio adicionales, 8,5 g; adenina, 0,40 g; L-tirosina, 0,25 g; uracilo, 0,20 g; ácido succínico, 10,0 g; sulfato de amonio, 5,0 g; y 50 ml de Solución sin Leucina nº 3. La Solución sin Leucina nº 3 contiene, por litro de agua destilada, L-arginina, 2 g; L-histidina, 1,0 g; L-isoleucina, 6 g; L-lisina, 4,0 g; L-metionina, 1,0 g; L-fenilalanina, 6,0 g; L-triptófano, 4,0 g. El pH del medio se ajustó a 5,3 con hidróxido de sodio al 50%. Se transfirió una alícuota de 0,3 ml a 5,0 ml de medio sin leucina 5x que contuvo glucosa al 2% más galactosa al 4%, o a medio YEHDG, durante 72 horas, hasta una DO_{600} final de 10-20,0/ml. El medio YEHDG contiene, por litro: L-Hy-Soja-peptona-Sheffield, 10 g; extracto de levadura, 20 g; L-dextrosa, 16 g; D(+)-galactosa, 40 g.
Las fermentaciones se cosecharon eliminando las células de levadura y analizando directamente en los sobrenadantes la expresión de la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) por análisis de transferencia de western, o por tinción de Coomassie de geles de SDS-PAGE. Para el análisis de inmuno-transferencia, muestras de 10 a 25 microlitros se sometieron a electroforesis sobre geles de Tris-HCl con gradiente de 4-15% (BIORAD, Hercules, CA) en tampón SDS 1X tris glicina (BIORAD, Hercules, CA), bajo condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se electrotransfirieron sobre filtros de membrana PVDF de 0,2 micrómetros. Las proteínas se sometieron a inmunodetección con el anticuerpo monoclonal 2H2B8 como anticuerpo primario, y anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El mAb 2H2B8 se describe en el Ejemplo 9. Los filtros se procesaron usando el kit de Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN ELMER, Wellesley, MA).
Para el análisis de expresión de la región ORF0657nH de levadura recombinante (SEC ID NO: 3) por tinción de Coomassie de geles SDS-PAGE, las muestras se sometieron a electroforesis sobre geles Tris-HCl de gradiente 4-15% (BIO-RAD) en tampón de SDS 1X Tris glicina (BIO-RAD), bajo condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se tiñeron con Coomassie Bio-Safe, una tinción G250 de Coomassie, siguiendo el protocolo del fabricante (BIO-RAD).
Como estándar cualitativo, se utilizó un lisado celular del cultivo de E. coli que produjo ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo). La secuencia de aminoácidos predicha de la región ORF0657nH expresada en E. coli es idéntica a la secuencia de aminoácidos predicha de la región ORF0657nH expresada a nivel interno en S. cerevisiae (SEC ID NO: 3), con la excepción de la presencia de glicina detrás de la metionina N-terminal en la construcción de E. coli.
Para producir la región ORF0657nH en E. coli, el cultivo productor se cultivó durante la noche en caldo LB que contuvo 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Se utilizó un pET28 que codifica la SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo para obtener la expresión de la proteína. Al día siguiente, se utilizaron 500 \mul del cultivo de la noche anterior para inocular 5,0 ml de caldo LB más 50 \mug por ml de kanamicina. El cultivo se efectuó a 37ºC durante aproximadamente 3 horas hasta una DO_{600} de 0,6. La expresión se indujo con IPTG 1 mM durante 3,5 horas a 37ºC. Se cosecharon las células y el aglomerado celular se conservó a -80ºC. El lisado de E. coli se preparó usando el Reactivo de Extracción de Proteína Bugbuster (NOVAGEN, Madison, WI), siguiendo las instrucciones del fabricante.
También se incluyó como estándar la proteína de un lisado celular del transformante de S. cerevisiae, que expresa a nivel interno la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3), descrita y preparada como se indica en el siguiente Ejemplo 11. Para calcular el tamaño de la proteína, se analizaron en paralelo estándares pre-teñidos de entre 10 y 250 kDa (BIO-RAD) junto con las muestras sobre geles SDS-PAGE tanto para tinción de Coomassie como para evaluación de western.
La producción de la especie deseada se obtuvo en medio sin leucina 5x que contuvo glucosa al 2% más galactosa al 4%. Los transformantes que contuvieron pUS38 de ambas cepas 1260 y 1309 secretaron una proteína de \sim80 kDa que mostró una co-migración muy próxima a la de la región ORF0657nH expresada a nivel interno en la levadura (del ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 3) y el ORF0657nH expresado en E. coli (del ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo), que se detectó por transferencia de western y tinción de Coomassie. En un experimento típico, 500 ng de estos lisados de control y 25 microlitros de sobrenadante del medio se sometieron a electroforesis. La detección fue específica; la proteína de 80 kDa no se detectó en el sobrenadante de un transformante que contiene el vector solo ni por transferencia de western ni por tinción de Coomassie. La proteína de \sim80 kDa secretada podría corresponder a una región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) madura no glicosilada o, alternativamente, podría contener unos pocos residuos glicosilo. El anticuerpo detectó una especie de peso molecular mayor en los sobrenadantes, así como dos proteínas de menor peso molecular, todas las cuales se tiñeron con Azul Coomassie. La especie de peso molecular más elevado podría contener líder no procesado y/o podría estar glicosilada. Las especies de bajo PM son, probablemente, productos de degradación.
El cálculo de la cantidad de la especie de 80 kDa secretada por los transformantes de las cepas 1260 y 1309 fue de \sim2 \mug por ml de medio de cultivo. Este valor se determinó comparando la señal de western a 80 kDa con la de la muestra del lisado de células de levadura que contiene la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3), lo que permite sugerir que la región ORF0657nH comprende al menos 50% de la proteína total. El título combinado de la especie restante de la región ORF0657n se determinó en aproximadamente 50 \mug por ml de medio de cultivo.
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Ejemplo 11 Expresión Intracelular de las regiones ORFQ657nH (SEC ID NO: 3) en S. cerevisiae
Por medio de la expresión intracelular de SEC ID NO: 3 en S. cerevisiae se obtuvo una producción de muy alto nivel de una proteína de tamaño discreto. La expresión se logró usando una secuencia de ácidos nucleicos codificadora optimizada para levadura.
A partir de pUnkCR1 se amplificó el ADN que codifica la región ORF0657nH con cocones optimizados para la expresión en levadura (SEC ID NO: 32) (Ejemplo 7), usando los siguientes cebadores sentido y antisentido, respectivamente: (SEC ID NO: 100) 5'GGGGGGATCC CACAAAACAA ATG GCT GAA GAA GAA ACT GGT ACT GGT GG3', y (SEC ID NO: 101) 5'GGG GGG GGATCC TTAAGA CTT AGC CTT GTT TTC TTG AGT3', con sitios de restricción BamHI de flanqueo (subrayados). El cebador sentido contiene una secuencia líder 5' no traducida y un codón ATG, y el cebador antisentido contiene TAA como codón de terminación.
El producto de 1,7 kb resultante se aisló sobre gel y se clonó en un vector TOPO TA pCR2.1 (INVITROGEN CORPORATION; Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante, para construir el plásmido pCR_iUCS-2.4. Seguidamente, se determinó la secuencia de ADN del inserto a partir de dos clones independientes: pCR_iUCS2.2 y pCR_iUCS2.4. Se encontró un único error de PCR en cada uno de los insertos, localizados en diferentes fragmentos HindIII de cada plásmido. Se obtuvo un plásmido con la secuencia correcta intercambiando el fragmento HindIII de 1,3 kb de pCR_iUC-S2.2 con la secuencia correcta, por el correspondiente fragmento de pCR_iUC-S2.4.
El fragmento de 1,3 kb de pCR_iUC-S2.2 y el fragmento de 4,3 kb de pCR_iUC-S2.4 se aislaron sobre gel y se ligaron. Se seleccionó un clon con los fragmentos deseados, pCR_iUC-S, y por secuenciación de ADN se verificaron la orientación apropiada y la secuencia de nucleótidos. Subsiguientemente, se sub-clonó el fragmento BamHI de 1,7 kb en pGAL110 (Fig. 5A) para construir piUC-S(-).
Se utilizó ADN plasmídico de piUC-S(-) para transformar las cepas 1260 y 1309 de S. cerevisiae a prototrofia de leucina (Leu^{+}) aplicando un protocolo de transformación de esferoplastos (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75:1929-33, 1978). Los transformantes se seleccionaron sobre medio de agar sintético exento de leucina y que contuvo sorbitol 1 M. Las capas superior e inferior de medio de agra sintético exento de leucina y con sorbitol 1 M se obtuvieron en REMEL, Lenexa, KS (nº de catálogo 09459 y 92155, respectivamente). Se obtuvieron aislados Leu^{+} clónicos por cultivo seriado sobre placas sin Leu SD (KD MEDICAL, Columbia, MD).
En múltiples transformantes se analizó la producción de la región ORF0657nH usando las condiciones de fermentación descritas en el Ejemplo 9. En los lisados celulares se analizó la producción de la región ORF0657nH por análisis de transferencia de western o por análisis de geles SDS-PAGE teñidos con azul Coomassie.
Para el análisis de transferencia de western, las muestras se sometieron a electroforesis sobre geles Tris-HCl Criterion en gradiente 4-15% (BIO-RAD, Hercules, CA) en tampón 1X Tris glicina SDS (BIORAD), bajo condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se sometieron a electro-transferencia sobre filtros de membrana PVDF de 0,2 micrómetros. Las proteínas se inmuno-detectaron por transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal contra ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 3), 2H2B8, como anticuerpo primario, y anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El Mab 2H2B8 se ha descrito en el Ejemplo 9. Los filtros se procesaron usando el kit de Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN ELMER, Wellesley, MA).
Para el análisis de expresión de ORF0657nH de levadura recombinante (codificado por SEC ID NO: 32) por medio de tinción Coomassie de geles SDS-PAGE, las muestras se sometieron a electroforesis sobre geles Tris-HCl Criterion en gradiente 4-15% (BIO-RAD) en tampón 1X Tris glicina SDS (BIORAD), bajo condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se tiñeron con Coomassie Bio-Safe, una tinción G250 de Coomassie (BIO-RAD), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las muestras de lisado de células de levadura sometidas a electroforesis contuvieron 0,5 y 1,25 \mug de proteína total de levadura celular, respectivamente, para la transferencia de western y la tinción con Coomassie. Como estándar cuantitativo para la tinción con Coomassie, se usó BSA purificado (100X, NEW ENGLAND BIOLABS, Beverly, MA). Se utilizó la región ORF0657n recombinante y de longitud completa de E. coli, purificada (SEC ID NO: 28) como estándar cuantitativo para los ensayos de western. Como estándar cualitativo, se empleó en ambas evaluaciones un lisado celular del cultivo de E. coli que produjo la región ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo), inducido para producir ORF0657nH.
Para producir la región ORF0657nH (SEC ID NO: 4 más una cola de histidinas en el extremo carboxilo) en E. coli, el cultivo productor se cultivó durante la noche en caldo LB que contuvo 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Al día siguiente, se usaron 500 \mul del cultivo de la noche anterior para inocular 5,0 ml de caldo LB más 50 \mug por ml de kanamicina. El cultivo se sometió a 37ºC durante aproximadamente 3 horas, hasta una DO_{600} de 0,6. La expresión se indujo con IPTG 1 mM durante 3,5 horas a 37ºC. Se cosecharon las células y los aglomerados celulares se conservaron a -80ºC. El lisado de E. coli se preparó usando el Reactivo de Extracción de Proteína Bugbuster (NOVAGEN, Madison, WI), siguiendo el protocolo del fabricante. Para calcular el tamaño de la proteína, se procesaron en paralelo estándares pre-teñidos entre 10 y 250 kDa con los lisados (BIO-RAD).
A partir del análisis inicial, se seleccionó un transformante de la cepa de levadura 1260, designado 1-1, como el mejor productor de la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3). En las Figuras 7A y 7B se muestra un ejemplo de la producción de la región ORF0657nH después de 72 horas de fermentación en medio complejo YEHDG en matraces de agitación. La proteína principal detectada por tinción Coomassie (A) o por medio de anticuerpo (B) fue de \sim85 kDa (véanse las pistas 5, 6 y 7), y co-migró con el ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo; pista 2) de E. coli. El PM tanto del ORF0657n expresado por E. coli como del ORF0657n expresado por la levadura fue mayor que el tamaño predicho en el sistema de electroforesis sobre gel de los inventores. La detección de la proteína de \sim85 kDa fue específica; no se observó detección en un lisado celular de un transformante que contuvo el vector pGAL110 solo (pista 3). Se produjo una cantidad significativamente mayor de región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) comparada con la región ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO:28 exenta de la cola de histidinas en el extremo carboxilo); compárense las pistas 5, 6 y 7 con la pista 4. El transformante que contuvo ORF0657n de longitud completa se fermentó al mismo tiempo que el transformante que contuvo la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3), bajo condiciones idénticas. Se observó escasa evidencia de degradación de la región ORF0657nH madura, expresada por la levadura.
Para evaluar la estabilidad de la proteína, una muestra de un lisado celular del transformante 1-1, que había sido congelada durante varios días y subsiguientemente descongelada, se incluyó en el gel (Figura 7, pista 7). Se puede observar que la integridad y la cantidad de esta muestra son similares a las muestras recientes (pistas 5 y 6). La ausencia de degradación y la estabilidad de la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) se confirmaron por transferencia de western usando un anticuerpo policlonal de cabra generado contra el ORF0657n de longitud completa de E. coli (SEC ID NO: 28) (no se muestran los datos).
Un cálculo de la cantidad de región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) de la transferencia de western y del gel Coomassie fue de \sim360 \mug por ml de medio YEHD, y el % de proteína total se estimó en \sim50. La cantidad producida en medio definido fue de 225 \mug/ml de medio de cultivo, y el % de proteína total también fue de \sim50. La cantidad de región ORF0657nH (SEC ID NO: 3), comparada con la cantidad de región ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 28 sin cola de histidinas en el extremo carboxilo) fue superior (350 frente a 10 \mug/ml, respectivamente) y, así mismo, el % de proteína total fue mayor (50 frente a 2,0).
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Ejemplo 12 Expresión Intracelular de la Región ORFP657nG (SEC ID NO: 44) en S. cerevisiae
La expresión intracelular de los polipéptidos relacionados con ORF0657n se evaluó en el siguiente ejemplo, usando una construcción de ADN que codifica la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44). ORF0657nG (SEC ID NO: 44) es una versión truncada de SEC ID NO: 2, que carece de la secuencia de señal amino-terminal. SEC ID NO: 44 conserva la metionina N-terminal y los aminoácidos 42-645 de SEC ID NO: 2.
A partir de pUnkCR1 (Ejemplo 7) se amplificó ADN optimizado para levadura que codifica la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44), utilizando los siguientes cebadores sentido y antisentido, respectivamente, 5'GGGGGGATCCCAC
AAAACAAATGGCTGAAGAAACTGGTGG3' (sec id no: 102) y 5'GGGGGGGATCCTTAGTTCTTTCTCTTTCT
TGG3' (SEC ID NO: 103), con sitios de restricción BamHI de flanqueo. El cebador sentido contiene una secuencia líder 5' no traducida y un codón ATG, y el cebador antisentido contiene TAA como codón de terminación. El producto de 1,8 kb resultante se aisló sobre gel y se clonó en el vector TOPO TA pCR2.1, siguiendo las instrucciones del fabricante (INVITROGEN CORPORATION, Carlsbad, CA), para construir el plásmido pCR_iUC-L4. El análisis de secuencia de ADN confirmó que se produjo una única deleción en el extremo 5'.
Se obtuvo un clon con la secuencia correcta intercambiando el fragmento HindIII-HindIII de 1,3 kb de pCR_iUC-S2.2 que contuvo la secuencia correcta (véase el Ejemplo 11) por el correspondiente fragmento de pCR_iUC-L4. Se aislaron sobre gel y se ligaron el fragmento de 1,3 kb de pCR_iUCS2.2 y el fragmento de 4,4 kb de pCR_iUC-L4. Se seleccionó un clon con los fragmentos deseados, pCR_iUC-L, y por secuenciación de ADN se verificaron la orientación adecuada y la secuencia de nucleótidos. Subsiguientemente, el fragmento de 1,8 kb BamHI se sub-clonó en pGAL110 para construir piUC-L(-) y se verificó la secuencia de ADN.
Se usó ADN plasmídico de piUC_L(-) para transformar la cepa 1260 de S. cerevisiae a prototrofia de leucina (Leu^{+}), según se ha descrito en el Ejemplo 9.En diversos transformantes de levadura se analizó la producción intracelular de la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44), usando las condiciones de fermentación y disrupción celular descritas en el Ejemplo 11. En 0,25-0,5 \mug de proteína de lisado celular se analizó la producción de la región ORF0657nG por análisis de transferencia de western, según se ha descrito en el Ejemplo 11. Se utilizó la región ORF0657nH de E. coli purificada (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo) como estándar cuantitativo, y se usó un lisado celular del cultivo de E. coli que produjo la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44 con cola de histidinas en el extremo carboxilo), inducido para producir la región ORF0657nG, como estándar cualitativo. Las muestras se sometieron a electroforesis sobre geles Tris-HCl Criterion en gradiente 4-15% (BIO-RAD, Hercules, CA) en tampón 1X Tris glicina SDS (BIO-RAD), bajo condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se sometieron a electro-transferencia sobre filtros de membrana PVDF de 0,2 micrómetros (BIO-RAD).
Las proteínas se inmuno-detectaron por transferencia de western, usando un anticuerpo policlonal contra
ORF0657n de longitud completa, purificado, producido en E. coli (SEC ID NO: 28, exento de la cola de histidinas en el extremo carboxilo) como anticuerpo primario, y anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El anticuerpo policlonal se generó por inmunización con la región ORF0657n de longitud completa, producida por E. coli (SEC ID NO: 28). Los filtros se procesaron usando el kit de Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN ELMER, Wellesley, MA).
Von fines comparativos, se clonó una región ORF0657nG (SEC ID NO: 44 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo) en un vector de expresión de E. coli, según se ha descrito en el Ejemplo 1, y se expresó. La producir la región ORF0657nG en E. coli, el cultivo de producción se cultivó durante la noche en caldo LB que contuvo 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Al día siguiente, se usaron 500 \mul del cultivo de la noche anterior para inocular 5,0 ml de caldo LB más 50 \mug por ml de kanamicina. El cultivo se desarrolló a 37ºC durante aproximadamente 3 horas, hasta una DO_{600} de 0,6. La expresión se indujo con IPTG 1 mM durante 3,5 horas a 37ºC. Se cosecharon las células y los aglomerados celulares se conservaron a -80ºC. El lisado de E. coli se preparó usando Reactivo de Extracción de Proteína Bugbuster, siguiendo las instrucciones del fabricante (NOVAGEN, Madison, WI). Para calcular el tamaño de la proteína, se procesaron en paralelo estándares pre-teñidos de entre 10 y 250 kDa (BIO-RAD) con los lisados.
A partir del análisis inicial, se seleccionó un transformante de la cepa de levadura 1260, designado iUC-L3, como buen productor de región ORF0657nG después de 72 horas de fermentación en medio complejo YEHDG en tubos de cultivo, tal como ha descrito en el Ejemplo 11. La proteína principal detectada con tinción de Coomassie o por medio del anticuerpo tuvo \sim85 kDa y co-migró con la región ORF0657nG expresada en E. coli (SEC ID NO: 44 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo). El PM tanto de la región ORF0657nG expresada en E. coli como de la región ORF0657nG expresada por la levadura fue mayor que el tamaño predicho en el sistema de electroforesis sobre gel de los inventores. La detección de la proteína de \sim85 kDa fue específica; no se observó detección en un lisado celular de un transformante que contuvo el vector pGAL110 solo. El título promedio de ORF0657nG, determinado a partir de 3 ensayos de transferencia de western, fue de 30 \mug/ml de medio YEHDG, y se calculó que el % de proteína total fue 10,0 (véase el Ejemplo 13 siguiente).
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Ejemplo 13 La Eliminación de la Señal de Clasificación de la Pared Celular Aumenta la Expresión Intracelular
Se examinó el efecto de eliminar la región codificadora C-terminal de sortasa celular carboxílica de ORF0657n de forma individual, y en combinación con la retirada de la región de señal N-terminal, usando los genes de ORF0657n optimizados a nivel de codones SEC ID NOs: 31, 32 y 45. La SEC ID NO: 31 codifica la región ORF0657n de longitud completa. La SEC ID NO: 32 codifica la región ORF0657nH, que carece tanto de una secuencia de señal N-terminal como de la región de clasificación de pared celular C-terminal. La SEC ID NO: 45 codifica la región ORF0657nG que carece solamente de la secuencia de péptido señal.
Un transformante que expresa la región ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas en el extremo carboxilo; transformante rUnkCI), uno que expresa la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3, transformante 1-1), y uno que expresa la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44; transformante iUC-L3) se fermentaron, se prepararon y analizaron lisados celulares, según se ha descrito en el Ejemplo 11. En la Figura 9 se muestra una transferencia de western representativa. La cantidad de lisado celular de proteína cargada en el gel a partir de los diferentes transformantes no fue igual, con el fin de compensar los diferentes niveles de expresión de las tres construcciones que codifican regiones ORF0657n. En cada caso, se cargaron al menos dos cantidades diferentes de lisado celular de proteína de cada transformante que contuvo ORF0657n.
En la Figura 9 se muestran resultados típicos, que demuestran que la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) se expresó significativamente mejor que la región ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 28 exenta de la cola de histidinas en el extremo carboxilo), o la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44). Se detectó una señal sustancial con sólo 50 y 100 ng de proteína de lisado celular productor de la región ORF0657nH, tal como se muestra en las pistas 11 y 12. Por el contrario, se usaron 1,0 y 2,0 \mug de proteína de lisado celular del productor de la región ORF9657nC, pistas 7 y 8k, respectivamente. Se detectó una buena señal para la región ORF0657nG con menor proteína; se cargaron 250 y 500 ng de proteína, tal como se muestra en las pistas 14 y 15.
La Tabla 4 muestra una comparación del título promedio de cada una de las tres ORF y el % de proteína total determinado a partir de tres transferencias de western independientes. Se prepararon lisados celulares frescos para cada transferencia de western. Los promedios incluyen los resultados de dos fermentaciones independientes. La cantidad de ORF0657n específico se determinó en relación con el estándar ORF0657nH de E. coli purificado (SEC ID NO: 4 más una cola de histidinas en el extremo carboxilo).
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TABLA 4
9
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La eliminación de la secuencia del péptido señal potenció el % y el título de proteína total 2,5 a 3 veces, según se determina comparando la expresión de la región ORF0657n de longitud completa (SEC ID NO: 28 sin la cola de histidinas en el extremo carboxilo) y la región ORF0657nG (SEC ID NO: 44). La eliminación tanto del péptido señal como de la secuencia de clasificación de la pared celular potenció la expresión en 8-14 veces, en comparación con la eliminación de solamente la secuencia de péptido señal (compárense las regiones G y H), y potenció la expresión entre 20 y 42,5 veces en comparación con la proteína de longitud completa (regiones C frente a H). La magnitud del aumento de expresión tras la eliminación de la secuencia de clasificación de pared celular fue inesperada.
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Ejemplo 14 Expresión Intracelular de la Región ORFP657nI en S. cerevisiae
A partir de pUnkCR1 (Ejemplo 7) se amplificó ADN que codifica la región ORF0657nI, con codones optimizados para la expresión en levadura (SEC ID NO: 33), utilizando los siguientes cebadores sentido y antisentido, respectivamente: 5'CTCCGGATCCCACAAAACAAAATGGCTGAAGAAACTGGT3' (SEC ID NO: 104), y 5'GCTGCCGGGATCCTTATGGGGCTTAGATGGGGTAG3' (SEC ID NO: 105), con sitios de restricción BamHI de flanqueo (subrayados). El cebador sentido contiene una secuencia líder 5' no traducida y un codón ATG, y el cebador antisentido contiene TAA como codón de terminación. El producto resultante, de 1,3 kb, se aisló sobre gel y se clonó en pGAL110 (Fig. 5A) para construir piUC-I (Fig. 5B), y se verificó la secuencia de ADN.
Se utilizó el ADN plasmídico de piUC-I para transformar la cepa 1260 de S. cerevisiae a prototrofia de leucina (Leu^{+}), según se ha descrito en el Ejemplo 9. En tres transformantes Leu^{+} se analizó la producción intracelular de la región ORF0657nI (SEC ID NO: 1) usando la condiciones a pequeña escala para la fermentación (cultivos de 5,0 ml), según se ha descrito en el Ejemplo 9.
La producción se comparó con la de la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3), producida por el transformante 1-1 de S. cerevisiae (véase el Ejemplo 11). Se prepararon lisados celulares según se describe en ejemplo 9, y se analizó en 100 y 200 ng de la proteína del lisado celular de levadura la producción de ORF0657nI y ORF0657nH por análisis de la transferencia de western semicuantitativa, según se ha descrito en el Ejemplo 11. Como estándar cuantitativo se utilizó ORF0657nH purificado de E. coli (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo). Las muestras se sometieron a electroforesis sobre geles Tris-HCl Criterion en gradiente 4-15% (BIO-RAD, Hercules, CA) en tampón 1X Tris glicina SDS (BIORAD), bajo condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se sometieron a electro-transferencia sobre filtros de membrana PVDF de 0,2 micrómetros (BIO-RAD). Se procedió a la inmuno-detección de las proteínas por transferencia de western, usando un anticuerpo policlonal contra ORF0657n de E. coli de longitud completa (SEC ID NO: 28) como anticuerpo primario, y anticuerpo completo unido por peroxidasa de rábano picante a IgG anti-ratón de cabra (H+L) (ZYMED LABORATORIES, San Francisco Sur, CA) como anticuerpo secundario. El anticuerpo policlonal se generó por inmunización con la región ORF0657n de longitud completa, producida por
E. coli (SEC ID NO: 28). Los filtros se procesaron usando el kit de Reactivo de Quimioluminiscencia Plus WESTERN LIGHTNING® (PERKIN ELMER, Wellesley, MA). Para calcular el tamaño de proteína, se procesaron en paralelo estándares pre-teñidos de entre 10 y 250 kDa (BIO-RAD) con los lisados.
La Figura 11 muestra los resultados de 72 horas de fermentación en medio YEHDG complejo en tubos de cultivo. Tal como se muestra en las pistas 5, 6, 14, 15, 21 y 22, se obtuvo una intensa detección de la región ORF9657nH expresada por levadura (SEC ID NO: 3). Así mismo, se detectó fácilmente una proteína de \sim60 kDa en los transformantes construidos para expresar ORF0657nI (SEC ID NO: 1), tal como se ve en las pistas 7-12 y 16-21. El ORF0657nI expresado en levadura (SEC ID NO: 1) co-migró con ORF0657nI (SEC ID NO: 5 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo) expresado y purificado a partir de E. coli (no se muestran los datos). El PM tanto de la región ORF0657nI expresado en E. coli como de la región ORF0657nI expresado en levadura fue mayor que el tamaño predicho en el sistema de electroforesis sobre gel de los inventores. La proteína de 60 kDa detectada en los transformantes construidos para expresar la región ORF0657nI (SEC ID NO: 1) fue específica; no se detectó ninguna proteína en un lisado celular derivado de un transformante de control del vector (pistas 4 y 13).
La cantidad de región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) y de la región ORF0657nI (SEC ID NO: 1) sobre el gel se calculó a partir de la transferencia de western semicuantitativa, por comparación con una cantidad conocida de ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo). Los títulos y porcentajes de proteína total se calcularon como el valor promedio determinado a partir de los lisados duplicados que contuvieron las dos cantidades diferentes de proteína en el gel. Los títulos volumétricos de la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) determinados a partir de una muestra recién fermentada y de un lisado celular congelado fueron comparables, \sim500 y \sim550 \mug/ml de medio de cultivo, y se produjeron 320 \mug de región ORF0657nI (SEC ID NO: 1) por ml de medio de cultivo (el título para la región ORF0657nI corresponde al transformante 1-1). El porcentaje de proteína total en la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) se estimó en 78% y 80%, respectivamente, en tanto que ORF0657nI (SEC ID NO: 1) comprendió 45% de la proteína total.
De esta forma, la región ORF0657nI se expresó bien en S. cerevisiae, con un título aproximadamente ,5 veces más bajo que el de ORF0657nH (SEC ID NO: 3), y el % de proteína total fue aproximadamente 1,3 veces menor. La correcta expresión de la región ORF0657nI en levadura se confirmó por tinción de Coomassie de un gel SDS-PAGE que contuvo los lisados celulares. La expresión de la región ORF0657nI en medio YEHDG fue mensurable: la producción en matraces de agitación de 125 ml o 2 l fue comparable a la expresión a escala reducida en los tubos de cultivo.
La región ORF0657nI (SEC ID NO: 1) también se expresó bien en medio sin leucina 5X definido (medio descrito en el Ejemplo 9). El título fue sólo \sim1,5 veces menor que el título en el medio complejo YEHDG, en tanto que el % de proteína total fue comparable en ambos medios. La integridad de ORF0657nI fue buena en ambos medios, sin que se detectara una degradación significativa. La producción de ORF0657nI fue mayor a las 72que a las 96 horas tanto en el medio complejo como en el medio sin leucina 5X, cuando se comprobó en fermentaciones llevadas a cabo en matraces de agitación.
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Ejemplo 15 Fermentación a Gran Escala de Cepa de Levadura que Produce ORFP657nH (SEC ID NO: 3)
Se utilizó stock de siembra congelado de la cepa 1-1 de levadura (cepa 1260 transformada con el plásmido piUC-S(-); descrito en el Ejemplo 11) para la fermentación y purificación a gran escala. El vial de stock de siembra se descongeló y se utilizó 1,0 ml para inocular un matraz de Erlenmeyer de 250 ml que contuvo 50 ml de un medio selectivo sin leucina (medio Leu^{-} 5X, Bayne et al., Gene 66(2):235-44, 1988) que contuvo glucosa al 4%. El matraz se incubó a 28ºC, 250 rpm sobre un agitador de rotación. Después de 24 horas (glucosa residual 23,5 g/l), se agregó un volumen de cultivo de 13 ml a un matraz de 2 l que contuvo 977 ml del mismo medio. Nuevamente, el matraz se incubó a 28ºC y se agitó a 250 rpm. Después de 24 horas (glucosa residual 4,04 g/l), el contenido del matraz de 2 l se usó para inocular un reactor de 20 l que contuvo un medio químicamente definido (Oura, Biotechnol. Bioenginner. 16:1197, 1974), que estuvo optimizado pata las cepas empleadas. Este medio contuvo 20 g/l de glucosa, seguidos de 25 g/l de galactosa para la inducción. El reactor se hizo funcionar a 28ºC, 4,7 l/min, 15 psig y 300 rpm. Bajo estas condiciones, se mantuvieron niveles de oxigeno disuelto mayores que 30% de saturación. El crecimiento celular se monitorizó por el consumo de glucosa, densidad óptica (A_{600} nm, cubetas de 1 -cm), peso de células en seco, utilización de galactosa y producción de
etanol. El cultivo se continuó durante 9o horas, alcanzando una A_{600} de 33,9 y un peso de células en seco de 17,5 g/l.
El cultivo se cosechó a través de filtración de flujo tangencial en fibras huecas (AMICON cartucho Hump01-43) utilizando un dispositivo de cosecha AMICON DC-10 (NELLEPORE, Billerica, MA). Se desechó el permeato y se concentraron las células, se sometieron a diafiltración con PBS y se recogieron por centrifugación a 8000 rpm, 4ºC durante 20 minutos, usando un dispositivo Sorvall Evolution RC (rotor SLA-3000). Las células se conservaron a -70ºC.
Para evaluar la producción de ORF0657nH por parte de la cepa 1-1 en la fermentación a gran escala, se prepararon lisados celulares de 10 unidades de DO_{600} del cultivo cosechado, y se evaluaron según se detalla en el Ejemplo 1 (no se muestran los resultados). Igualmente, se evaluó la producción de ORF0657nH a partir de una fermentación en matraz de agitación (72 horas, medio YEHDG complejo). Los resultados de un análisis de transferencia de western (llevado a cabo según se ha descrito en el Ejemplo 11) demostraron que la proteína producida por la fermentación a gran escala co-migró con el ORF0657nH producido en la fermentación en matraz de agitación (no se muestran los resultados). El título de ORF0657nH de la fermentación a gran escala (20 l) se estimó en 739 \mug por ml, y se calculó que el porcentaje de proteína total fue de 55%, en comparación con 732 \mug/ml y 58% de proteína total para el matraz de agitación (usando el procedimiento semicuantitativo de western descrito en el Ejemplo 11). Estos resultados ponen de manifiesto la posibilidad de aumentar la producción de ORF0657n en levadura.
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Ejemplo 16 Inmunidad de Protección de los Polipéptidos relacionados con QRF0657n Producidos en Levadura
Se evaluó la capacidad para conferir inmunidad de protección de los polipéptidos relacionados con ORF0657n producidos en levadura, expresando un polipéptido de SEC ID NO: en levadura. Como controles se usaron ORF0657nC de longitud completa (SEC ID NO: 28), ORF0657nH (SEC ID NO: 4 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo) y ORF0657nI (SEC ID NO: 5 con una cola de histidinas en el extremo carboxilo), expresados en E. coli, así como adyuvante solo.
Se obtuvo un polipéptido relacionado con ORF0657n de SEC ID NO: 3 a partir de levadura y se usó en un modelo animal para proporcionar inmunidad de protección. El polipéptido de SEC ID NO: 3 se expresó de la forma descrita en el Ejemplo 11.
Células congeladas de S. cerevisiae recombinante que expresan ORF0657nH (SEC ID NO: 3) se resuspendieron a 5 ml por gramo de peso húmedo de células en MOPS 0,2 M, pH 7,0, con inhibidores de proteasa (exento de EDTA). Se preparo un lisado mediante cuatro pasajes a través de un microfluidizador a 95,2 Mpa (Microfluidics Modelo 110S). El lisado se clarificó por centrifugación (10.000 X g, 20 minutos, 2-8ºC), seguida de filtración gruesa (pre-filtro de fibra de vidrio, Millipore) y filtración fina (acetato de celulosa, 0,2 \mum, Whatman).
El Lisado Clarificado se fraccionó en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (Pharmacia HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR, fase móvil: MOPS 0,2 M, pH 7,0). Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE con detección de Coomassie y transferencia de western, usando antisuero específico para la proteína ORF0657n (preparado contra ORF0657n de longitud completa, SEC ID NO: 28). Se combinaron las fracciones que contuvieron el producto.
El Producto de SEC se sometió a filtración estéril a través de acetato de celulosa 0,2 \mum, bajo condiciones asépticas. La pureza del Producto Filtrado con Esterilidad fue \geq o superior, y 94% por SDS-PAGE y transferencia de western. El Producto de Filtración Estéril se formuló a 0,2 mg/ml con AHP y Timerosal.
La capacidad de los polipéptidos relacionados con ORF0657n producidos en levadura para conferir inmunidad de protección se ilustra en la Figura 10. ORF0657nH (SEC ID NO: 3) expresado en levadura ofreció una inmunidad de protección equivalente a las de los polipéptidos expresados en E. coli.
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Ejemplo 17 Respuesta Anamnésica en Primates No Humanos
Tres grupos de monos Rhesus se inmunizaron con polipéptido relacionado con ORF0657n producido por levadura (ORF0657nH, SEC ID NO: 3) o polipéptido relacionado con ORF0657 expresado en E. coli (ORF0657n de longitud completa, SEC ID NO: 28), formulados con o sin AHP. Los monos del grupo de vacuna recibieron 50 mcg de polipéptidos relacionados con ORF0657n por vía intramuscular.
Como se muestra en la Figura 12, los animales del grupo de vacuna respondieron, después de una única dosis, con un aumento de 3 a 6 veces de la media geométrica de los títulos, frente a títulos previos modestos, lo que sugiere la existencia de una respuesta anamnésica. Por el contrario, la media geométrica de títulos correspondientes a los animales del grupo de control se mantuvo inalterada (dentro de la variabilidad del ensayo con anticuerpo). Después de una segunda dosis de vacuna, la media geométrica de los títulos posteriores a la dosis uno en los grupos de vacuna y de control variaron muy poco en comparación con los títulos posteriores a la dosis.
Para observar el desarrollo de respuestas de anticuerpo después de sólo una dosis, el grupo que recibió la región ORF0657nH (SEC ID NO: 3) expresada en levadura fue sometido a un seguimiento de 3 meses (última fecha estudiada). Los títulos de anticuerpo siguieron aumentando después de 9 días, alcanzando niveles que no fueron superados incluso después de 2 ó 3 dosis de vacuna.
Estas observaciones sugieren que una dosis de la vacuna puede desencadenar respuestas sustanciales y duraderas de anticuerpo subsiguientes a la estimulación natural del sistema inmunológico debida, probablemente, a la exposición ambiental a S. aureus. El estudio de los títulos de anticuerpo preexistentes en el ser humano demostró la presencia de modestos títulos de anticuerpo contra ORF0657n en todas las muestras analizadas (no se muestran los datos).
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<110> Merck & Co, Inc,
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<120> POLIPÉPTIDOS PARA INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNE PROTECTORA CONTRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS
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<130> 21669YPCT
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<150> 60/489, 840
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<151> 24-07-2003
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<150> 60/520, 115
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<151> 14-11-2003
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<160> 107
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<170> FastSEQ para windows versión 4.0
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<210> 1
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<211> 446
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nl con metionina en el extremo amino
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<400> 1
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10
1001
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<210> 2
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<211> 645
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<212> PRT
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<213> S. aureus
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<400> 2
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11
12
13
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<210> 3
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<211> 569
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH con metionina en el extremo amino
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<400> 3
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14
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<210> 4
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<211> 570
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH con metionina-glicina en el extremo amino
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<400> 4
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16
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<210> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH con metionina-glicina en el extremo amino
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<400> 5
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18
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<211> 576
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<213> Secuencia Artificial
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<223> ORF0657nH
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<223> ORF0657nH
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> ORF0657nH
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<400> 9
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<400> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> ORF0657nH
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<400> 11
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29
30
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<210> 12
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<211> 566
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<212> PRT
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<220>
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31
32
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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33
34
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<211> 568
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36
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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38
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40
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42
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44
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46
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<211> 568
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<211> 576
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<212> PRT
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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54
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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58
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<211> 568
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
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59
60
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<211> 570
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<212>PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
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<400> 27
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61
62
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<211> 654
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SEC ID Nº: 2 modificada para contener una glicina después de la metionina del extremo amino una carboxil His-T
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
63
64
65
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<211> 1962
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<212>ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657n de longitud completa + Carboxil Marcador - His
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<400> 29
66
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<210> 30
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<211> 1737
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH + Carboxyl Marcadr - His
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<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
67
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1941
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica SEC ID Nº: 28 sin un Carboxil Marcador - His y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
68
69
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 3 y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
70
\newpage
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<210> 33
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<211> 1341
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 1 y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
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<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
71
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<210> 34
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<211> 1710
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\newpage
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<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
72
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<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\newpage
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<400> 35
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73
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<210> 36
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<211> 1710
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\newpage
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<400> 36
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74
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<211> 1710
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\newpage
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<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
75
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<211> 1710
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\newpage
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<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
76
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<211> 1710
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\newpage
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<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
77
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<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\newpage
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<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\newpage
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<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 481
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nl+
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<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
80
81
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 42 y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
82
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 605
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ORF0657nG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
83
84
85
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1818
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 44 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
86
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la SEC ID Nº: 7 que contiene metionina en el extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
87
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la región SEC ID Nº: 17 l+, optimizada a nivel de codón para la expresión en levadura, y codifica un codón de iniciación de metionina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
88
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la región SEC ID Nº: 17 l, optimizada a nivel de codón para la expresión en levadura, y codifica un codón de iniciación de metionina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
89
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1938
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica ORF0657n de longitud completa que contiene la SEC ID Nº: 17 modificada para contener una glicina después de la metionina del extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levadura
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
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90
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<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codificada la SEC ID Nº: 20, tiene codones optimizados para la expresión en levadura, codifica un codón de iniciación de metionina
\newpage
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<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la región SEC ID Nº: 20 l+, optimizada a nivel de codón para la expresión en levadura, y codifica un codón de iniciación de metionina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
92
93
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la región SEC ID Nº: 20I, optimizada a nivel de codón para la expresión en levadura, y codifica un codón de iniciación de metionina
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
94
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1938
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica ORF0657n de longitud completa que contiene la SEC ID Nº: 20 modificada para contener una glicina después de la metionina del extremo amino y tiene codones optimizados para la expresión en levaduras
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<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 565
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> ORF0657nH
\newpage
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<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
96
97
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
98
99
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
100
101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
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<222> 247
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<223> Unknown
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<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
102
103
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
104
105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 567
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
106
107
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
108
109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
110
111
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
112
113
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 566
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ORF0657nH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
114
115
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His-Tag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggccgtcg ttttac
\hfill
16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggaaacag ctatgac
\hfill
17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaccggtttt ccatggggaa caaacagcaa aaagaattt
\hfill
39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accggtttct cgaggttttt acgttttcta ggtaatac
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
117
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
118
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
119
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
120
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
121
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
122
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
123
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
124
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
125
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
126
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
127
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
128
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
129
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
130
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
131
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
132
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
133
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
134
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
135
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
136
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
137
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
138
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
139
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
140
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero de ORF0657n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\hskip1cm
141
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttaaagctt atgtcacttt ctcttgtatc g
\hfill
31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgataagctt gctcaatggt tctcttcctc
\hfill
30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaccggtttg gatcccacaa aacaaaatgg gtaacaagca acaaaaggaa ttc
\hfill
53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaccggtttg gatccttagt tctttctctt tcttggcaag ac
\hfill
42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctgaagaaa ctggtggtac caac
\hfill
24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcacggatc cttaagactt agccttgttt tcttgagtgt tc
\hfill
42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggggatcc cacaaaacaa aatggctgaa gaaactggtg g
\hfill
41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggggggat ccttaagact tagccttgtt ttcttgagt
\hfill
39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggggatcc cacaaaacaa aatggctgaa gaaactggtg g
\hfill
41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggggatc cttagttctt tctctttctt gg
\hfill
32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctccggatcc cacaaaacaa aatggctgaa gaaactggt
\hfill
39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctgccggga tccttatggg gttggcttag atggggta
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 644
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
142
143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 644
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. aureus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
144
145

Claims (31)

1. Un inmunógeno polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 1, en el que dicho polipéptido confiere inmunidad de protección contra S. aureus, y en el que si una o más regiones polipeptídicas adicionales están presentes, estas regiones adicionales no proporcionan un extremo carboxilo terminal que contenga los aminoácidos 609-645 de SEC ID NO: 2.
2. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 3, o a un fragmento de la misma, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90% a SEC ID NO: 1.
3. El polipéptido según la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 94% a SEC ID NO: 3, o a un fragmento de la misma, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 94% a SEC ID NO: 1.
4. El polipéptido según la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido consiste en una secuencia idéntica en al menos 94% a SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 42.
5. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 42, o difiere de dichas secuencias en hasta 25 alteraciones de aminoácidos.
6. El polipéptido según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 42, o difiere de dichas secuencias en hasta 10 alteraciones de aminoácidos.
7. El polipéptido según la reivindicación 6, en el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 42, o difiere de dichas secuencias en hasta 5 alteraciones de aminoácidos.
8. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 42.
9. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 1, 3, 7, 17, 20 ó 42, y hasta 20 aminoácidos adicionales.
10. El polipéptido según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 7, 17 ó 20.
11. El polipéptido según cualquier reivindicación anterior, exento de la totalidad o de la mayor parte de los restantes polipéptidos a los que el polipéptido se encuentra asociado de manera natural.
12. Un inmunógeno consistente en los polipéptidos según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho inmunógeno consiste en dicha secuencia de aminoácidos y una o múltiples regiones o restos adicionales, unidos covalentemente con dicha secuencia en el extremo carboxi o amino terminal, en el que cada región o resto se selecciona de manera independiente de una región o resto que tiene al menos una de las propiedades siguientes: potencia la respuesta inmunitaria, facilita la purificación, o facilita la estabilidad del polipéptido.
13. Una composición capaz de inducir una respuesta inmunitaria de protección en un paciente, que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva del inmunógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. La composición según la reivindicación 13, en el que dicha composición comprende, adicionalmente, un adyuvante.
15. Un ácido nucleico que comprende un gen recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno polipeptídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
16. El ácido nucleico según la reivindicación 15, en el que el gen recombinante no codifica una secuencia que codifique un péptido señal celular, y no codifica una secuencia de señal de clasificación de pared celular.
17. El ácido nucleico según la reivindicación 16, en el que dicho gen recombinante contiene uno o múltiples codones optimizados para la expresión en una levadura.
18. El ácido nucleico según la reivindicación 17, en el que dicha secuencia nucleotídica está optimizada a nivel de codones en al menos 50% para la expresión en levadura.
19. El ácido nucleico según la reivindicación 16, en el que dicha secuencia nucleotídica se selecciona del grupo consistente en: SEC ID NO: 30; SEC ID NO: 31; SEC ID NO: 32; SEC ID NO: 33; SEC ID NO: 34; SEC ID NO: 35; SEC ID NO: 36; SEC ID NO: 37; SEC ID NO: 38; SEC ID NO: 39; SEC ID NO: 40; SEC ID NO:41; SEC ID NO: 46; SEC ID NO: 47; SEC ID NO: 48; SEC ID NO: 49; SEC ID NO: 50; SEC ID NO: 51; SEC ID NO: 52 y SEC ID NO: 53.
20. El ácido nucleico según la reivindicación 15 ó 19, en el que dicho ácido nucleico es un vector de expresión.
21. Una célula recombinante que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20.
22. Un procedimiento para preparar un polipéptido de S. aureus que ofrece inmunidad de protección, que comprende las etapas de:
(a)
cultivar la célula recombinante de la reivindicación 21 bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y
(b)
purificar dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicha célula recombinante es un S. cerevisiae.
24. Un inmunógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para utilizar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano mediante una terapia.
25. El inmunógeno según la reivindicación 24, para ofrecer inmunidad de protección contra S. aureus.
26. El inmunógeno según la reivindicación 25, en el que dicho paciente es un ser humano.
27. El inmunógeno según la reivindicación 25, en el que dicho paciente recibe tratamiento profiláctico contra una infección de S. aureus.
28. El inmunógeno según la reivindicación 24, para inducir una respuesta anamnésica.
29. El inmunógeno según la reivindicación 28, en el que dicha respuesta anamnésica da como resultado un aumento de al menos 3 veces del título geométrico con respecto al título preexistente, en un plazo de 3 días.
30. Uso de un inmunógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la fabricación de un medicamento para ser usado en un procedimiento según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29.
31. Un inmunógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en combinación con inmunógenos adicionales seleccionados de: uno o múltiples inmunógenos de S. aureus adicionales; uno o múltiples inmunógenos dirigidos contra uno o múltiples organismos Staphylococcus adicionales; y uno o múltiples inmunógenos dirigidos contra otros organismos infecciosos.
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