ES2269975T3 - Uso de compuestos de bajo peso molecular para preparar un medicamento util para tratar enfermedades mediadas por p53 mutante. - Google Patents

Abstract

El uso de un compuesto distinto del 9-(azabiciclo [2, 2, 2]octano-3-ona)6-cloro-9H-purina que tiene la capacidad de restablecer la función inductora de apoptosis de las proteínas p53 mutantes, compuesto que se selecciona a partir de compuestos que tienen una estructura según la fórmula I (Ver fórmula) en la que: R1 es hidrógeno o un grupo metileno, que puede tener un doble enlace, como se indica por la línea discontinua, o un enlace simple y unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo sustituido con una amina, hacia un átomo de nitrógeno contenido en la estructura en anillo de una purina, 8-azapurina, o o un residuobenzimidazol, y; A es un resto que contiene oxígeno, que consiste bien en un átomo de oxígeno unido por un doble enlace, como se indica por la línea discontínua, o bien un grupo benzoiloxi, con la condición de que cuando A es un grupo benzoiloxi, entonces R1 es hidrógeno, con la condición adicional de que cuando A es un átomo de oxígeno unido por un doble enlace, R1 no es un hidrógeno para la preparación de un medicamento para tratar enfermedades mediadas por p53 mutante.

Description

Uso de compuestos de bajo peso molecular para preparar un medicamento útil para tratar enfermedades mediadas por p53 mutante.

Campo del invento

El presente invento se refiere a compuestos de bajo peso molecular, que son capaces de restablecer la función inductora de apoptosis del p53 mutante. Los compuestos usados según el invento son análogos a los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1, respectivamente, descritos en el documento de patente WO 02/24692 A1, el contenido del cual es considerado que está comprendido en el estado de la técnica bajo el número A.54(3) EPC. Más particularmente, el presente invento se refiere al uso de tales compuestos para preparar composiciones farmacéuticas útiles para tratar enfermedades mediadas por p53 mutante, tales como por ejemplo cáncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades del corazón.

Antecedentes

La diana más común para mutaciones en tumores es el gen p53. El hecho de que alrededor de la mitad de todos los tumores humanos llevan mutaciones en este gen es sólido testimonio en lo que se refiere a su papel crítico como supresor de tumores. P53 detiene el ciclo celular y/o desencadena apoptosis en respuesta a diversos estímulos de estrés, incluyendo daño a ADN, hipoxia, y activación oncogénica (Ko y Prives, 1996; Sherr, 1998). Tras la activación, p53 inicia las respuestas biológicas dependientes de p53 a través de la transativación transcripcional de genes diana específicos que llevan los motivos de unión al ADN de p53. Además, la proteína p53 multivalente puede promover apoptosis a través de la represión a través de ciertos genes que carecen de los sitios de unión de p53, así como también los mecanismos independientes de la transcripción (Bennett y otros, 1998; Gottlieb y Oren, 1993; Ko y Prives, 1996). Los análisis de un gran número de genes p53 mutantes en tumores humanos han revelado una fuerte selección para las mutaciones que inactivan la función de unión a ADN específica de p53; la mayoría de mutaciones en tumores son mutaciones puntuales agrupadas en el dominio central de p53 (residuos 94-292) que albergan la actividad de unión a ADN específica (Beroud y Soussi, 1998).

Tanto la inducción de arresto del ciclo celular como la apoptosis inducidas por p53 podrían estar implicadas en la supresión de tumores mediada por p53. Mientras que el arresto en ciclo celular inducido por p53 podría posiblemente ser revertido de diferentes modos, la muerte celular inducida por p53 tendría la ventaja de ser irreversible. Hay sin duda evidencia a partir de modelos animales in vivo (Symonds y otros, 1994) y tumores humanos (Bardeesy y otros, 1995) que indican que la apoptosis dependiente de p53 juega un papel principal en la eliminación de tumores emergentes, particularmente en respuesta a la señalización oncogénica. Por otro lado, la capacidad de p53 para inducir apoptosis determina con frecuencia la eficacia de la terapia del cáncer (Lowe y otros, 1994). Tomando en cuenta el hecho que más del 50% de tumores humanos llevan mutaciones en p53, parece altamente deseable restablecer la función de la supresión del crecimiento de tumores mediada por p53 silvestre. La ventaja de esta aproximación es que permitirá la eliminación selectiva de células tumorales que llevan p53 mutante. Las células tumorales son particularmente sensibles a la reactivación de p53, supuestamente por dos principales razones. Primero, las células tumorales son sensibilizadas frente a apoptosis debido a la activación oncogénica (revisado en (Evan y Littlewood, 1998)). Segundo, las proteínas p53 mutantes tienden a acumularse a niveles elevados en las células tumorales. Por lo tanto, el restablecimiento de la función silvestre al abundante y presumiblemente "activado" p53 mutante debería desencadenar una respuesta apoptótica masiva en células tumorales ya sensibilizadas, mientras que las células normales que expresan niveles bajos o indetectables de p53 no deberían afectarse. La viabilidad de la reactivación de p53 como una estrategia anticancerígena es apoyada por el hecho que un amplio intervalo de proteínas p53 mutantes son susceptibles a reactivación. Una estrategia terapéutica basada en rescatar la apoptosis inducida por p53 debería ser por tanto potente así como ampliamente aplicable.

Tomados juntos, estos hallazgos sugieren con fuerza que el restablecimiento farmacológico de la función p53 resultaría en la eliminación de células tumorales. Por consiguiente, existe la necesidad dentro de este campo de identificar sustancias y métodos que permitirán tal restablecimiento de la función p53.

Para el propósito anteriormente definido, se ha demostrado que p53 es una proteína de unión a ADN específica, que actúa como un activador transcripcional de genes que controlan el crecimiento celular y muerte. Así, la capacidad de la proteína p53 para inducir apoptosis es dependiente de su función de unión al ADN específica. Las proteínas p53 mutantes que llevan sustituciones aminoacídicas en el dominio central de p53, que abole la unión a ADN específica, son incapaces de inducir apoptosis en las células. Por lo tanto, para obtener tales sustancias y métodos como se definen anteriormente, la reactivación de la unión al ADN específica de p53 es esencial para desencadenar la apoptosis dependiente de p53 en tumores durante los estados patológicos.

Sumario del invento

El presente invento está dirigido al uso de compuestos, que corresponden a las fórmulas generales I y II, respectivamente, y el compuesto 2-etilén-4(3 H)-quinazolinona, que son capaces de reactivar la función de inducción de apoptosis de las proteínas p53 mutantes, para preparar un medicamento útil para tratar las enfermedades mediadas por p53 mutante. Los compuestos de fórmula I y II son análogos a los compuesto PRIMA-1 y MIRA-I, respectivamente, descritos en el documento de patente 02/24692 A1. La reactivación es proporcionada mediante el restablecimiento de la actividad de unión al ADN específica de secuencia y la función de transactivación transcripcional a las proteínas mutantes p53, y la modulación de los epítopos dependientes de conformación de la proteína p53. Consecuentemente, las sustancias según el invento serán usadas en las composiciones farmacéuticas y los métodos para el tratamiento de pacientes que adolecen de diversos tipos de enfermedades mediadas por p53 mutantes, tales como cáncer.

Ejemplos de otras enfermedades medidas por p53 mutantes son por ejemplo las enfermedades autoinmunes, tales como por ejemplo artritis reumatoide y síndrome de Sjogren, y enfermedades del corazón tales como cardiomiopatía idiopática hereditaria.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 A-B muestra las estructuras moleculares de los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1.

Figura 2 A-C ilustra la supresión del crecimiento de células tumorales que expresan p53 mutantes mediante sustancias MIRA-1 y PRIMA-1.

La Figura 3 A, B y C ilustra como las sustancias PRIMA-1 y MIRA-1 inducen apoptosis en células de tumores humanos en una manera dependiente de p53 mutante.

La Figura 4 A-C describe como los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 conservan la conformación silvestre de la proteína p53.

La Figura 5 describe como las sustancias PRIMA-1 y MIRA-1 son capaces de conservar la unión a ADN específica de secuencia de la proteína p53 silvestre tras la inactivación por calor.

La Figura 6 A-B ilustra que las sustancias PRIMA-1 y MIRA-1 restablecen la conformación silvestre a la proteína p53 mutante en las células.

La Figura 7 A-B ilustra como las sustancias MIRA-1 y PRIMA-1 reactivan la proteína p53 mutante para la unión de ADN específica.

La Figura 8 ilustra la correlación entre la capacidad de los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 para restablecer la unión de ADN específica y la función inductora de apoptosis del p53 mutante.

La Figura 9 A-C muestra como PRIMA-1 y MIRA-1 restablecen la función de transactivación de la transcripción al mutante p53 en las células.

La Figura 10 A-C muestra como PRIMA-1 Y MIRA-1 transactiva la expresión de genes diana p53 en una manera dependiente de p53 mutante.

La Figura 11 ilustra la actividad antitumoral de PRIMA-1 in vivo.

La Figura 12 A-B ilustra la supresión del crecimiento en células tumorales que expresan el mutante p53 por sustancias MIRA-1 y PRIMA-1.

Definiciones

En la presente solicitud, se usan los siguientes términos:

Como se describe aquí, los términos "sustancia T" o "compuesto T" ambos se refieren a compuestos según la fórmula I a continuación, excepto para 9-(azabiciclo [2,2,2]octano-3-ona)-6-cloro-9H-purina (también referido como PRIMA-2), compuestos que son nuevos análogos de PRIMA-1:

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1

en la que:

R1 es hidrógeno o un grupo metilo, que puede tener un doble enlace, como se indica por la línea de puntos, o un enlace único y unido al átomo de nitrógeno un grupo fenilo sustituido por amina, un átomo de nitrógeno contenido en la estructura de anillo de una purina, 8-azapurina, o un residuo benzimidazol, y;

A es un resto que contiene oxígeno, que consiste bien en un átomo de oxígeno que tiene un doble enlace, como se indica por la línea de puntos, o un grupo benzoiloxi, con la condición de que cuando A sea un grupo benzoiloxi, entonces R1 sea un hidrógeno.

El grupo fenilo de la estructura de anillo que contiene nitrógeno de R1, y el grupo benzoiloxi de A puede opcionalmente estar sustituido, tal como por ejemplo con halógeno, metilo, metoxi, amino y/o halometilo que contenga de 1-3 átomos de halógeno.

Como se describe aquí, los términos "sustancia G" o "compuesto G" ambos se refieren a compuestos según la fórmula II a continuación, compuestos que son nuevos análogos de MIRA-1:

2

en la que:

R2 es elegido del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, o bencilo.

El grupo bencilo de R2, puede estar opcionalmente sustituido, tal como por ejemplo con halógeno, metilo, metoxi, amino y/o halometilo que contenga de 1-3 átomos halógenos.

El término halógeno o halo se refiere a átomos fluoruro, cloruro, bromuro o yoduro, de los cuales cloruro es generalmente preferido. Un compuesto del invento puede estar en la forma libre, por ejemplo, forma anfotérica, o en sales, por ejemplo, formas de sales de adición ácida o aniónicas. Un compuesto en la forma libre puede ser convertido en la forma salina en una manera conocida en la técnica y viceversa.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I (en la forma de productos hidrosolubles, o liposolubles o dispersibles) incluyen las sales inocuas convencionales o las sales de amino cuaternarias de estos compuestos, que están formadas, por ejemplo, a partir de ácidos orgánicos o inorgánicos o bases. Ejemplos de tales sales de adición ácidas incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canfosulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, y undecanoato. Las sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio y de potasio, sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y de magnesio, sales con bases orgánicas tales como sales diciclohexilaminas, N-metil-D-glucamina, y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, y así sucesivamente. También, los grupos básicos que contienen nitrógenos puede ser hechos cuaternarios con tales agentes como haluros de alquilo inferiores, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo, y butilo; sulfatos de dialquilo como dimetil, dietil, dibutil; y diamil sulfatos, haluros de cadena larga tales como cloruros bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquilo como bencilo y fenetilbromuros y otros.

Un "derivado" es una sustancia modificada variando la estructura química de las sustancias originales G y/o T. Tales derivados de las sustancias pueden implicar la inserción, deleción o sustitución de uno o más grupos funcionales sin alterar fundamentalmente la actividad esencial de la sustancia.

Un "resto funcional" significa una molécula no derivada de la sustancia G y/o T, por ejemplo un marcaje, un fármaco, o una molécula vehículo.

El término "marcaje" como se usa aquí significa un resto, que ha sido unido, bien covalentemente o no covalentemente, a la sustancia presente para proporcionar una señal detectable. Así, tal "marcaje" puede ser detectado por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Por ejemplo, etiquetas útiles incluyen 32-P, tinciones fluorescentes, reactivos de densidad electrónica, enzimas (por ejemplo, como se usan comúnmente en un ELISA), biotina, dioxigenina, o haptenos y proteínas para los que antisueros o anticuerpos monoclonales están disponibles (por ejemplo, la sustancia de la fórmula puede ser hecha detectable, por ejemplo, incorporando un radiomarcaje en una sustancia o usada para detectar anticuerpos generados específicamente frente a la sustancia).

El término "anticuerpo" se refiere a una sustancia polipeptídica codificada por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas que se unen específicamente y reconocen un analito (antígeno).

Descripción detallada del invento

Consecuentemente, el presente invento se refiere al uso de sustancias G y T capaces de restablecer la conformación de tipo silvestre y la unión a ADN específica de secuencia, transactivación transcripcional, y funciones inductoras de apoptosis del mutante p53 para preparar un medicamento para tratar enfermedades mediadas por p53 mutante. Las sustancias T son análogas de 2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo [2,2,2]octano-3-ona (PRIMA-1), que se muestran en la Figura 1 B para comparación. Las sustancias G son análogas de 1-(propoximetil)-maleimida (MIRA-1), que se muestran en la Figura 1 A para comparación. Así, se ha de entender que dichas sustancias no necesitan ser idénticas a las estructuras de fórmula I y II, pero pueden incluir variaciones, siempre que la actividad de las mismas se conserve. Así, dicha sustancia puede también ser un derivado de las estructuras de fórmula I y II. También se ha de entender que en la presente solicitud, el p53 humano es particularmente preferido, aún cuando las moléculas p53 de otros orígenes pueden también ser contempladas.

Así, aunque el documento de patente WO 93/24525 sugería que la secuencia aminoacídica derivada de la proteína p53 humana puede ser útil en el tratamiento de trastornos que incluyen una sobreexpresión de p53, el presente invento es el primero en especificar que los compuestos G y T de bajo peso molecular son capaces de ejercer tal efecto mediante la reactivación de la función inductora de apoptosis de la proteína mutante p53.

Más específicamente, la sustancia según el invento es capaz de proporcionar dicha reactivación de la función inductora de apoptosis de p53 mediante el restablecimiento de la actividad de unión a ADN específica de secuencia al p53 mutante (defectivo). Así, aún cuando el documento de patente WO 95/19367 sugería que la unión de p53 a los sitios de unión de ADN pueden influir en la expresión de los genes reguladores de la apoptosis, la reactivación de la función inductora de apoptosis del mutante p53 por las sustancias G y T no ha sido nunca identificada previamente al presente invento.

Ejemplos preferidos del compuesto T son 2-(adenina-9-metilen)-3-quinuclidinona, 2-metilen-3-quinuclidinona, 2-(-2-amino-3-cloro-5-trifluorometilo-1-metilanilina)-3-quinuclidinona, 2-(6-trifluorometil-4-clorobenzimidazol- 1-metilen)3-quinuclidinona, 2-(6-metoxipurina-9-metilen)3-quinuclidinona, 2-(8-azaadenina-9-metilen)-3-quinuclidinona, 1-azabiciclo [2,2,2]oct-3-ilbenzoato, 2-(5,6-dimetil-benzimidazol-1-metilen)-3-quinuclidinona, 2-(8-azaadenina-7-metilen)3-quinuclidinona, 2-(ácido 7-metilen-1,3-dimetil-úrico)-3-quinuclidinona, 2-(2,6-dicloro-9-metilenpurina)-3-quinuclidinona.

Más preferiblemente, la sustancia T tienen la estructura de la siguiente fórmula general I'

3

en la que

R1 es un grupo metileno unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo sustituido por amina, un átomo de nitrógeno contenido en la estructura en anillo de una purina, 8-azapurina, o un residuo benzimidazol, y, más preferiblemente R1 es un grupo metileno unido a un átomo de nitrógeno contenido en la estructura en anillo de una purina, 8-azapurina, o un residuo benzimidazol.

Ejemplos particularmente preferidos del compuesto T son dados en la Tabla a continuación junto con los datos de actividad (IC50, \muM):

4

5

Los compuestos anteriormente listados particularmente preferidos exhiben una actividad específica hacia el p53 mutante similar o mayor que la de PRIMA-1.

Ejemplos preferidos del compuesto G son los siguientes: N-benzilmaleimida, N-metilmaleimida y maleimida.

Los datos de actividad para los dos compuestos G más preferidos son listados en la Tabla a continuación. En dicha Tabla, los datos de actividad para otro compuesto preferido, 2-etilen-4(3 H)-quinazolinona, que exhiben una actividad similar, como ejemplos de compuestos T y G más preferidos son también incluidos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

6

Los compuestos anteriormente listados particularmente preferidos exhiben una actividad específica hacia el p53 mutante similar o mayor que la de PRIMA-1.

En una realización preferida del invento, la sustancia es acoplada a un resto funcional, que potencia el efecto reactivador de p53 de dicha sustancia. Como se menciona anteriormente, tal resto puede ser por ejemplo un marcaje, un fármaco, o una molécula vehículo. En una realización, preferida, el resto funcional es una molécula vehículo acoplada a la presente sustancia. En una realización alternativa, el resto funcional es una molécula reactivadora de p53.

Así, en una realización, la presente sustancia está acoplada a un marcaje, proporcionando una señal detectable. Una amplia variedad de marcajes y técnicas de conjugación son ampliamente conocidas y documentadas tanto en la bibliografía científica como de patentes. Marcajes adecuados incluyen diversos radiomarcajes, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares.

El documento de patente WO 95/17213 se refiere a moléculas de unión al mismo ADN al que se une p53, de tal modo que la transcripción del mismo puede ser activada. Así, aunque se refiere a la activación de la transcripción de genes regulados por p53, el documento WO 95/17213 soluciona otro problema que el del presente invento mediante el uso de diferentes moléculas.

El documento de patente WO 97/14794 y una publicación por Foster y otros (1999) también se refiere al problema de cómo activar la actividad de unión al ADN específica de secuencia del p53 latente. Para obtener esto, se usa un fragmento del dominio regulador C-terminal de p53 o compuestos de bajo peso molecular. Sin embargo, el dominio regulador C-terminal (documento de patente WO 97/14794) fue usado para activar la proteína p53 silvestre pero no la mutante, como describe el presente invento. Por otro lado, los compuestos sintéticos de bajo peso molecular que tienen un farmacóforo diferente del descrito en Foster y otros (1999) forman la base del presente invento.

Consecuentemente, los compuestos de bajo peso molecular han sido identificados que pueden ser usados para reactivar la función inductora de apoptosis de p53. El restablecimiento de la función p53 puede ser lograda en células vivas tras el tratamiento de las células con las sustancias en medio de cultivo tisular. Además, se ha encontrado que las sustancias G y T son capaces de reactivar la actividad de unión al ADN específica de secuencia de p53. Las sustancias G y T se muestra que restablecen la unión al ADN de p53 in vitro y la función de transactivación de p53 en células vivas.

Los compuestos del invento pueden así ser usados para tratar cánceres mediados por p53 mutante, y en virtud de su capacidad para restablecer la función inductora de apoptosis de p53, se cree también que pueden ser útiles en tratar otras enfermedades mediadas por p53 mutante, tales como, por ejemplo enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide y síndrome de Sjorgren (por ejemplo Yamanishi Y. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(15): 10025-30 (2002), Inazuka M y otros, Rheumatology, 39 (3): 262-6 (2000), Firestein G.S. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 30; 94(20): 10895-900 (1997), y Tapinos N.I. y otros Artritis Rheum. 42 (7): 1466-72 (1999)), y enfermedades tales como cardiomiopatía idiopática hereditaria (por ejemplo Gudkova A.Ya. y otros en la identificación de mutaciones del superesor de tumores TP53 en pacientes con cardiomiopatía idiopática familiar. Resumen en el Congreso Internacional de la Sociedad Europea de Patología, Mayo 19-21, 2002, Baveno, Lago Maggiore, Italia.

Una composición farmacéutica para usar de acuerdo con el invento, puede comprender, además de una de las sustancias activas anteriores, un excipiente, tampón o estabilizador farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro material bien conocido por aquellos con experiencia en la técnica y apropiada para la aplicación deseada. Tales materiales deberían ser inocuos y no deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. Ejemplos de las técnicas y protocolos para este fin puede encontrarse por ejemplo en Remingtonis Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol. A. (ed.) 1980.

La composición según el invento puede ser preparada para cualquier ruta de administración, por ejemplo, oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, o intraperitoneal. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la ruta de administración. Para una administración parenteral, una disolución acuosa parenteralmente aceptable es empleada, que es libre de pirógenos y tiene el pH, isotonicidad y estabilidad requeridos. Aquellos con experiencia en la técnica son bien capaces de preparar disoluciones adecuadas y numerosos métodos están descritos en la bibliografía (para una breve revisión de métodos de suministro del fármaco, véase Langer, Sciences 249: 1527-1533 (1990)). Conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos pueden ser incluidos según se requiera. Los niveles de dosificación pueden ser determinados por aquellos con experiencia en la técnica, teniendo en cuenta el trastorno que ha de ser tratado, la condición del paciente individual, el sitio de suministro, el método de administración y otros factores. Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden ser encontrados en Remingtonis Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. (ed.) 1980.

En otra realización, la composición según el invento comprende además uno o más reactivadores de p53 adicionales.

Finalmente, el presente invento también se refiere a métodos para el tratamiento médico en el que se usan las sustancias según el invento.

Descripción detallada de los dibujos

La Figura 1 muestra las formulas estructurales de 1-(propoximetil)-maleimida (A) y 2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo [2,2,2]octan-3-ona(B).

La Figura 2 ilustra como las sustancias MIRA-1 y PRIMA-1 suprimieron el crecimiento de células que expresaban el mutante p53 pero no afectaron el crecimiento de células que carecen de la expresión de p53. Más específicamente, la Figura 2A muestra como compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 suprimen el crecimiento de células Saos-2 His-273 que expresan el mutante p53. Por el contrario, el efecto del tratamiento de células Saos-2 que carecen de la expresión de p53 fue más bien menor. La gráfica ilustra la diferencia entre la viabilidad de las células tratadas por los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 en presencia y ausencia del mutante p53, expresada como el porcentaje de reducción del reactivo de proliferación celular WST-1 en comparación con las células sin tratar. El grado de reducción de WST-1, que refleja un número de células vivas, fue medido por un lector de placas a \lambda490 nm de acuerdo con el fabricante (Roche). La supresión del crecimiento fue calculada como una diferencia en absorbancia a \lambda490 nm entre células sin tratar y células tratadas y expresada en un porcentaje de testigo sin tratar. La supresión del crecimiento = 100% x (testigo_{absorbancia} - tratadas_{absorbancia})/testigo_{absorbancia}. Dos compuestos fueron identificados, compuesto MIRA-1 y PRIMA-1, que suprimió el crecimiento de las células que expresan el mutante p53 pero que no afectaron el crecimiento de células que carecen de la expresión de p53. La Figura 2B muestra que PRIMA-1 suprime el crecimiento de 3 líneas celulares que expresan mutantes His-273 e His-175 de p53 bajo el control del promotor dependiente de doxiciclina. En estas tres líneas celulares PRIMA-1 muestra el efecto de supresión del crecimiento sobre células en una manera dependiente del mutante p53. La Figura 2C muestra las curvas de crecimiento de células Saos-2-His-273 tratadas con PRIMA-1 en ausencia o presencia del mutante p53. La Figura 2D muestra que los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 suprimen predominantemente el crecimiento de células que expresan el mutante p53. La capacidad de los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 para suprimir el crecimiento fue ensayado usando 16 líneas celulares con diferentes status de p53: células que no expresan p53 (p53 null), células que expresan p53 silvestre y células que expresan diferentes proteínas p53 mutantes. El procedimiento experimental fue como se describe en la Figura 2A. Las diferencias en viabilidad fueron estadísticamente significativas según un ensayo t independiente.

La Figura 3 ilustra la inducción de apoptosis por PRIMA-1 y MIRA-1 dependiente de p53 en la línea celular Saos-2-His-273. Más específicamente, la Figura 3A muestra como los inhibidores de caspasas suprimen la inducción de muerte celular por los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 en las células Saos-2-His-273. La inducción de apoptosis fue determinada por análisis de FACS de células fijadas con etanol teñidas con yoduro de propidio (PI) como porcentaje de una población subG1. Los inhibidores de caspasas A-DEVD-FMK y BOC-D-FMK (Enzyme Systems Products, CA) fueron añadidos a células Saos-2-His-273 hechas crecer en ausencia de doxiciclina a una concentración 5 \mug/ml previamente al tratamiento con los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 (25 \muM y 100 \muM respectivamente). El porcentaje de células muertas en cultivos no tratados y en testigos tratados con inhibidores de caspasas fue sustraído. La Figura 3B presenta una tinción TUNEL de células Saos-2-His-273 tratadas con PRIMA-1 a una concentración de 25 \muM durante 48 h. La tinción Hoechst fue usada para teñir núcleos celulares. La Figura 3C muestra la inducción de apoptosis por compuesto PRIMA-1 y MIRA-1 en células Saos-2 y Saos-2-His-273. El porcentaje de células apoptóticas fue medido por análisis FACS como fue descrito en la Figura A. Panel superior: apoptosis fue inducida en células Saos-2-His-273 que expresaban p53 (sin doxiciclina) tras 48 horas de tratamiento con 10 \muM de MIRA-1, pero no en células Saos-2 p53-null con las sustancias PRIMA-1 (50, 75 y 125 \muM) y MIRA-1 (10 \muM). Panel inferior, apoptosis fue inducida por PRIMA-1 (50, 75 y 125 \muM) en células Saos-2-His-273 que expresan p53 mutante, mientras que en ausencia de expresión de p53 en células Saos-2 PRIMA-1 fue mucho menos eficaz.

La Figura 4 muestra como los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 estabilizan la conformación nativa (silvestre) de p53 usando ELISA. Más específicamente, la Figura 4A ilustra como los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 conservan el epítopo PAb1620 dependiente de conformación tras inactivación por calor de proteínas p53 mediante incubación durante 30 min a 37ºC. Panel superior, GST-proteína p53 silvestre; panel medio, GST-proteína p53 mutante His-175; panel inferior, GST-proteína p53 mutante Gln-248. Las preparaciones proteicas fueron calentadas tanto en presencia como en ausencia de PRIMA-1 y MIRA-1 y analizadas en ELISA. La absorbancia de las muestras testigo incubadas en hielo fue tomada como 100%. La Figura 4B muestra como los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 impiden el desplegamiento (o desnaturalización) de las proteínas p53 medido como presencia de epítopo PAb240 en proteínas p53 tras calentamiento a 37ºC. Panel superior, GST-proteína p53 silvestre; panel inferior, GST-proteína p53 mutante His-175. La Figura 4C muestra que PRIMA-1 y MIRA-1 no afectan al epítopo DO1 independiente de conformación. No se observaron cambios en el epítopo DO-1 tras incubación de proteína p53 a 37ºC. Panel superior, GST-proteína p53 silvestre; panel inferior, GST-proteína p53 mutante Gln-248.

La Figura 5 ilustra la conservación de la unión a ADN específica de GST-proteína p53 silvestre por las sustancias PRIMA-1 y F. El ensayo de desplazamiento de banda realizado esencialmente como se describió antes (Selinova y otros, 1996). La proteína GST-p53 silvestre fue inactivada mediante incubación de 30 min a 37ºC en presencia o ausencia de sustancias PRIMA-1 y MIRA-1 y después ensayadas en lo que se refiere a su unión al ADN. En los carriles 1 y 2, se añadieron PRIMA-1 y anticuerpo monoclonal PAb421. Carril 3, inactivación de unión al ADN de wtp53 mediante calentamiento. Carriles 4-7 y 8-11, restablecimiento de la unión al ADN específica mediante incubación con concentraciones crecientes de compuestos MIRA-1 y PRIMA-1, respectivamente.

La Figura 6 muestra el restablecimiento del epítopo PAb1620 de p53 silvestre en células SKOV-His-175 que expresan el mutante His-175 p53. El anticuerpo monoclonal de ratón PAb1620 fue usado para detectar una conformación silvestre de p53 mientras que la tinción con un anticuerpo policlonal de conejo p53 muestra un nivel general de p53. Los núcleos celulares fueron teñidos con Hoechst. Figura 6A, presencia del epítopo PAb 1620 tras el tratamiento con PRIMA-1. Figura 6B, restablecimiento del epítopo PAB 1620 tras incubación con MIRA-1.

La Figura 7 muestra el restablecimiento de la unión de ADN específica de la proteína GST- p53 mutante His-175 por los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1. Figura 7A Carriles 1-3, GST-p53 mutante His-175 es incapaz de unir ADN. Carriles 4-6 y carriles 7-9, restablecimiento de la unión a ADN específica de p53 mutante mediante incubación con concentraciones crecientes (45 ng, 450 ng, y 18 \mug) de los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1, respectivamente. El anticuerpo PAb421 fue añadido a todas las mezclas de reacción. Figura 7B, compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 son capaces de restablecer la unión de ADN específica de secuencia de p53 mutante Trp-282 endógeno en extractos celulares a partir de las células BL-60 de linfoma de Burkitt, como se detectó mediante un ensayo de desplazamiento de banda. Carril 1, el p53 mutante Trp-282 endógeno en extractos celulares de células BL-60 de linfoma de Burkitt no une ADN. Carriles 2 y 9, los anticuerpos monoclonales PAb421 y/o PAb 1801 no restablecen la unión del ADN del p53 mutante Trp-282. La incubación con concentraciones crecientes (90 ng, 900 ng, y 18 \mug) del compuesto MIRA-1 (carriles 3-5 y 10-12) o compuesto PRIMA-1 (carriles 6-8 y 13-15) restablecieron la unión al ADN de la proteína p53 mutante Trp282. El anticuerpo monoclonal PAb421 fue añadido a las mezclas de reacción en los carriles 2-8; PAb 1801 fue añadido a las mezclas de reacción en los carriles 9-15.

La Figura 8 ilustra la correlación entre la capacidad de los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 para restablecer la unión al ADN específica y la función inductora de apoptosis del mutante p53. Más específicamente, la función inductora de apoptosis de la proteína p53 mutante Phe-176 en las células de carcinoma renal KRC/Y no fue restablecida por los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1, al contrario que la proteína p53 mutante His-273 en las células Saos-2-His-273, como se midió por análisis de FACS. El porcentaje de células apoptóticas fue detectado mediante análisis FACS como se describió en la Figura 3A. La apoptosis fue inducida en las células Saos-2His-273 que expresaban p53 (sin doxiciclina) tras 48 horas de tratamiento con las sustancias PRIMA-1 y MIRA-1, pero no en células KRC/Y o en células Saos-2 p53 null.

\newpage

La Figura 9 demuestra que el restablecimiento de la actividad de transactivación transcripcional al p53 mutante por PRIMA-1 y MIRA-1. Figura 9A, PRIMA-1 y MIRA-1 indujeron el reportero lacZ sensible a p53 silvestre en células A-431 que llevan el p53 mutante His-273. Figura 9B, activación dependiente de p53 mutante del reportero EGFP sensible a p53 silvestre en células SKOV-His-175 tratadas con PRIMA-1. Sólo células cultivadas en ausencia de doxiciclina (que expresan p53 mutante) mostraron expresión de EGFP. Figura 9C, reportero EGFP sensible a p53 silvestre inducido por MIRA-1 en células SKOV-His-175.

La Figura 10 demuestra la inducción de los genes diana de p53 p21 y MDM-2. La Figura 10A muestra la inducción de p21 y MDM-2 endógena en células H1299-His-175 con 25 \muM de PRIMA-1 o con 10 mM de MIRA-1. La expresión de proteínas fue analizada usando Western blot. La Figura 10B, muestra que los genes diana de p53 en las células H1299-His-175 son inducidos por PRIMA-1 sólo en presencia del p53 mutante. La Figura 10C muestra la inducción de genes diana p53 en células de carcinoma de colon SW480 tratadas con PRIMA-1 que llevan p53 mutante His-273/Ser-309. PRIMA-1 no indujo los mismo genes diana de p53 en las células de carcinoma de colon HCT-116 que llevaban p53 silvestre.

La Figura 11 describe una actividad antitumoral de PRIMA-1. Los ratones SCID fueron inyectados con células Saos-2-His-273. La inyección intravenosa (20 a 100 mg/kg) o intratumoral (20 mg/kg) con PRIMA-1 comenzó 3 días tras la inyección de células y continuó durante 3 días consecutivos dos veces al día. El volumen de los tumores fueron medidos una vez cada tres días durante dos meses.

La Figura 12 ilustra como MIRA-1 (Figura 12A) y PRIMA-1 (Figura 12B) suprimió el crecimiento de células que expresan el mutante p53 pero no afectó las células sin expresión de p53. El procedimiento experimental fue como se describió en la Figura 2A.

Experimental

A continuación, el presente invento será descrito en más detalle por medio de ejemplos que no pretenden limitar el alcance del invento en modo alguno. Todas las referencias dadas a continuación y aparte en la presente especificación son de este modo incluidas aquí mediante referencia.

Materiales y métodos Plásmidos

Los plásmidos que codifican la proteína de fusión GST-p53 silvestre humano y las proteínas GST- p53 mutantes humanos His175 fueron descritas anteriormente (Selivanova y otros, 1996). El plásmido p53-EGFP contiene 13 sitios de unión al ADN consenso de p53 sintéticos enfrente de la secuencia codificante EGFP. Los experimentos de transfecciones transitorias fueron realizados con Lipofectamina 2000 según las recomendaciones del fabricante (Invitrogen^{TM} Life Technologies, Groningen, Holanda).

Librería química

Una librería de compuestos de bajo peso molecular fue obtenida del Instituto Nacional de Cáncer (NCI), Bethesda, USA. Para más información, veáse el sitio web http://dtp.nci.nih.gov.

Cribado de la librería química y ensayos de supresión del crecimiento

La línea celular Saos-2-His-273 establemente transfectada con una construcción que permite la expresión del p53 mutante His-273 en una manera dependiente de tetraciclina fue usada para el cribado (Selivanova y otros, 1997). La expresión de p53 fue inhibida mediante incubación de células con doxiciclina (5 \mug/ml). Las células fueron hechas crecer en placas de 96 pocillos a una densidad de 3000 células por pocillo con o sin doxiciclina y tratadas con 25 \muM de los compuestos de la librería NCI de compuestos de bajo peso molecular (LMW). Tras 48 horas de incubación el reactivo WST-1 de proliferación celular (Roche) fue añadido a las células. El grado de reducción de WST-1, que refleja viabilidad celular, fue medido mediante un lector de placas a \lambda 490 nm según el fabricante (Roche).

Análisis por FACS

Las células fueron colocadas en placas de 12 pocillos a una densidad de 30000/cm^{2} y tratadas con compuestos. Tras 48h de incubación las células fueron recogidas mediante tripsinización, fijadas con etanol 70%, tratadas con RNasa A (0,25 mg/ml) y teñidas con yoduro de propidio (0,02 mg/ml). Las muestras fueron analizadas en un FACScan de Becton Dickinson. Los datos fueron analizados con el software CellQuest, versión 3.2.1.

Ensayo de formación de colonias

Las células fueron tratadas con los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 y sembradas en placas a 500 células por placa. Las colonias fueron teñidas con Giemsa y contadas 14 días tras la siembra.

Ensayos de luciferasa

Los ensayo de transactivación usando construcciones promotoras sensibles a p53 unidas al gen reportero de luciferasa (PG-luc) fueron realizados por el sistema Dual Luciferase Reporter Assay (Promega) según el fabricante. La línea celular Saos-2-His273 transfectada de modo estable con el plásmido reportero de luciferasa PG-luc (2 mg) fue tratado con compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 a la concentración de 50 y 10 \muM, respectivamente. Una actividad luciferasa fue ensayada 1; 3,5 y 15 horas post tratamiento.

Ensayos de unión al ADN

Las proteínas GST-p53 fueron preparadas como está descrito (Selivanova y otros, 1997). Ensayos de desplazamiento de bandas fueron realizados en tampón de unión que contenía HEPES 100 mM pH 7,5, KCl 50 mM, BSA 1 mg/ml, Tritón X-100 0,1%, MgCl_{2} 2 mM y DTT 1 mM esencialmente como en (Selivanova y otros, 1996).

ELISA

20 ng de GST-wtp53, GST-mtp53-175 y GST-mtp53-248 fueron calentados a 37ºC durante 30 min o mantenidos en hielo. El procedimiento fue realizado con o sin compuestos ensayados. Los análisis ELISA fueron hechos como se describe por (Foster y otros, 1999). Brevemente, tras el tratamiento, las muestras fueron diluidas con tampón de recubrimiento (KCl 150 mM, HEPES 25 mM) suplementado con DTT 10 mM. La mezcla completa fue aplicada a placas de ELISA (MaxiSorp, Nunc) e incubadas a +4ºC durante 35 min. Los pocillos fueron lavados con tampón de recubrimiento. Los pocillos fueron bloqueados con leche desnatada al 5% en PBS incubando a +4ºC durante 1h. Los pocillos fueron lavados dos veces con PBS seguidos por la adición de anticuerpos primarios de ratón (PAb 1620 o PAb 240) diluidos 1:250 en tampón de recubrimiento. Las muestras fueron incubadas a +4C durante 30 min. Los pocillos fueron lavados dos veces con PBS. Tras eso, un anticuerpo secundario (anti-ratón, conjugados con peroxidasa de rábano) fue incubado con muestras a +4ºC durante 30 min. Las placas fueron después lavadas 5 veces con PBS y un sustrato peroxidasa fue añadido. Una absorbancia a \lambda 405 nm fue monitorizada mediante un lector de
ELISA.

Una tinción TUNEL, inmunotinción, tinción lacZ, preparación de extractos celulares, ELISA con extractos celulares y transferencia Western fueron realizadas según los procedimientos estándar.

Experimentos in vivo

Todos los estudios animales fueron aprobados por el comité ético animal local y el cuidado animal fue de acuerdo con las directrices institucionales. Para evaluar la toxicidad, 12 ratones SCID (peso medio 25 g) fueron divididos en 4 grupos. Tres grupos recibieron diariamente inyecciones i.v. de 1, 10 y 100 mg/kg de PRIMA-1 en PBS durante 5 días. Los animales testigos fueron inyectados con PBS. Los autores midieron los pesos de los ratones durante 1 mes tras la última inyección. Para evaluar la actividad antitumoral de PRIMA-1, 12 ratones SCID fueron inoculados con 1 x 10^{6} células Saos-2-His-273 en 90% Matrigel (Becton Dickinson, Le Pont-De-Claix, Francia) subcutáneamente y unilateralmente en los costados derechos. Tras 3 días los ratones fueron divididos en 4 grupos. Dos grupos recibieron inyecciones i.v de PRIMA-1 a una dosis bien de 20 o de 100 mg/kg, un grupo recibió inyecciones intratumorales de PRIMA-1 a una dosis de 20 mg/kg, y el último grupo fue usado como un testigo. Las inyecciones fueron realizadas dos veces al día durante 3 días. El volumen tumoral fue medido durante 2 meses.

Resultados y discusión La supresión del crecimiento por compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 depende en la expresión del p53 mutante

Según el presente invento, la librería NCI de compuestos de bajo peso molecular ha sido cribada para compuestos que pueden suprimir el crecimiento de células tumorales humanas en una manera dependiente de p53 mutante.

La línea celular Saos-2-His-273 transfectada de modo estable con la construcción que permite la expresión del p53 mutante His-273 en una manera dependiente de tetraciclina fue usada para el cribado (Selivanova y otros, 1997). Las células fueron hechas crecer en placas de 96 pocillos a una densidad de 3000 células por pocillo con o sin doxiciclina. El tratamiento fue hecho a una concentración de 25 \muM de cada compuesto químico de la librería NCI de compuestos de bajo peso molecular (LMW). Tras 48 horas de incubación el reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche) fue añadido a las células. El grado de reducción de WST-1, que es proporcional a la viabilidad celular, fue medido por un lector de placas a \lambda 490 nm según el fabricante (Roche). Dos compuestos fueron identificados que eran capaces de suprimir el crecimiento de células Saos-2-His-273 que expresan p53, pero no afectaron el crecimiento de células Saos-2 que no expresaban el p53 mutante (Fig. 1A).

La capacidad de los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 para suprimir el crecimiento de células que expresan el p53 mutante fue evaluado adicionalmente usando un ensayo de formación de colonias. Las células Saos-2 O Saos-2-His-273 fueron tratadas con diferentes dosis de los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 y sembradas en placas. Las células fueron teñidas con Giemsa y se contó la aparición de colonias tras 14 días. Como se muestra en la Tabla II, el tratamiento con 5 mM de los compuestos MIRA-1 redujo dramáticamente el número de colonias formadas por las células Saos-2 que expresan His-273 (15% de testigo sin tratar), pero fue menos eficaz para inhibir las células Saos-2
que carecen de p53 (48% de inhibición). El tratamiento con el compuesto PRIMA-1 fue inhibitorio en una manera dependiente de p53 mutante a dosis superiores, alrededor de 50-100 \muM.

A continuación los autores ensayaron la capacidad de los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 para suprimir el crecimiento de las células tumorales en una manera dependiente de p53 mutante usando series de líneas celulares tumorales humanas con diferentes status de p53 (p53 null, p53 silvestre, p53 mutante). Las líneas celulares humanas fueron como sigue. P53 null: osteosarcoma Saos-2, leucemia mieloide aguda K562, y leucemia promielocítica HL60. Las células que expresan p53 silvestre: fibroblastos humanos normales NHF, línea celular de carcinoma cervical HeLa (lleva la proteína HPV E6, que conduce a la degradación de p53), osteosarcoma U2OS, y línea celular linfoblastoide IARC 171 positiva para EBV. Líneas celulares que expresan p53 mutante: líneas BL41 de linfoma de Burkitt (p53 mutante Gln-248); DG75 (His-283), Raji (Gln-213, His-243), Ramos (Asp-254); BJAB (Arg-193), y Saos-2-His-273, SKOV-His-175, SKOV-His-273 y H1299-His-175 que expresan p53 mutantes bajo el control del promotor dependiente de doxiciclina. Además, se usó la línea de linfoma de células T J3D p53 null de ratón. Como se puede observar en la Tabla I, los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 suprimieron el crecimiento de las células que expresaban p53 mutante más eficazmente que las células que contenían p53 null y p53 silvestre. Los datos a partir de estos experimentos fueron resumidos en una gráfica mostrada en la Figura 2B. Las diferencias en las respuestas entre los grupos de líneas celulares (p53 null, p53 silvestre y p53 mutante) fueron estadísticamente significativos como se verificó por un ensayo de t independiente.

Como se muestra en la Figura 2C, PRIMA-1 inhibió completamente el crecimiento de las células Saos-2-His que expresaban el mutante p53. En ausencia de la expresión del mutante, PRIMA-1 sólo causo una reducción menor en la tasa de crecimiento.

Restablecimiento de la función inductora de apoptosis al p53 mutante por los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1

Para tratar la cuestión de si la supresión del crecimiento inducida por los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 tiene lugar debido a la inducción de apoptosis, los autores ensayaron si los inhibidores de caspasas pueden inhibir la supresión del crecimiento inducida por MIRA-1 y PRIMA-1 tiene lugar debido a la inducción de apoptosis, los autores ensayaron si los inhibidores de caspasas pueden inhibir la supresión del crecimiento inducida por MIRA-1 y PRIMA-1. Las células Saos-2-His 273 fueron tratadas con compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 en presencia o ausencia de inhibidores de caspasas Z-DEVD-FMK y BOC-D-FMK (Enzyme Systems Products, CA). La inducción de la muerte celular fue determinada por análisis de FACS de células fijadas en etanol teñidas con yoduro de propidio (PI) como porcentaje de población sub-G1. Como es evidente a partir de la Figura 2A, los inhibidores de caspasas suprimieron la muerte celular inducida por compuestos PRIMA-1 y MIRA-1. Por lo tanto los autores concluyen que los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 pueden inducir apoptosis. Además, la morfología apoptótica fue detectada en células Saos-2-His-273 teñidas con la tinción Hoechst tras el tratamiento con el compuesto PRIMA-1. La tinción TUNEL de las células Saos-2-His-273 tratadas con el compuesto PRIMA-1 también confirmó la inducción de apoptosis (datos no mostrados). También observaron una diferencia en las cinéticas de la inducción de apoptosis por compuestos PRIMA-1 y MIRA1: mientras que la apoptosis inducida por PRIMA-1 fue evidente tras 48 horas de tratamiento, el compuesto MIRA-1 indujo muerte celular mucho más rápida, dentro de 6-12 horas tras el tratamiento (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 desencadenaron rutas apoptóticas diferentes.

Los autores examinaron si la apoptosis inducida por los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 es dependiente de p53 usando células Saos-2-His-273 crecidas en presencia o ausencia de doxiciclina. Como se muestra en la Figura 3B, la inducción de apoptosis por los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 tuvo lugar sólo en presencia de la expresión de p53. Tomados juntos, estos resultados indican claramente que la supresión del crecimiento por los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 está mediada por un p53 mutante y no es debida a toxicidad celular inespecífica.

Modulación de la conformación del dominio central de p53 por los compuestos y PRIMA-1

Para obtener una visión más clara del mecanismo molecular de la reactivación del p53 mutante mediada por los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1, los autores ensayaron si la conformación de p53 fue afectada por estos compuestos. Se ha mostrado que las mutaciones puntuales en p53 resultan en la desestabilización de la conformación nativa del dominio central de p53, dando como resultado la pérdida del epítopo dependiente de la conformación específica silvestre para el anticuerpo monoclonal PAb 1620 y la aparición de un nuevo epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal PAb240 (Cho y otros, 1994). Además, la desnaturalización por calor del p53 de tipo silvestre tiene un efecto similar. Por lo tanto, se examinó si los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 pueden estabilizar la conformación nativa (silvestre) de p53. Los resultados presentados en la Figura 4A demuestran que los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 conservan el epítopo dependiente de conformación para el anticuerpo PAb 1620 de las proteínas p53 silvestre y mutante recombinantes calentadas durante 30 min. a 37ºC. Para la proteína GST-wtp53 la diferencia entre las muestras tratadas y sin tratar en el epítopo PAb 1620 restante tras el tratamiento con el compuesto PRIMA-1 ha alcanzado significancia estadística a p= 0,05 (n=5) según un ensayo de t en paralelo. De modo importante, los resultados presentados en la Figura 4B demuestran que los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 son capaces de impedir el desplegamiento de las proteínas p53 medidas como aparición del epítopo PAb240 en proteínas p53 tras el calentamiento a 37ºC. Según un ensayo t paralelo la diferencia en la aparición del epítopo PAb240 entre las muestras testigo y las tratadas con PRIMA-1 para las proteínas GST-wtp53 y GST p53 mutante-His 175 alcanzaron significancia estadística a p= 0,01 y p= 0,1, respectivamente. La Figura 4C muestra que el epítopo no conformacional en el extremo N- terminal de p53 reconocido por el anticuerpo DO-1 no está afectado por la incubación con los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1. Así, los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 son capaces de conservar la conformación nativa de las proteínas p53 mutantes.

Restablecimiento de la conformación p53 silvestre in vitro y en células vivas

Para ensayar si PRIMA-1 puede convertir el p53 mutante en la conformación p53 silvestre, los autores usaron los anticuerpos específicos de conformación PAb 1620 y PAb240. El tratamiento de la proteína GST-p53 silvestre con PRIMA-1 tuvo como resultado un aumento en un 40% en la fracción PAb1620+ y una disminución correspondiente en la fracción PAb240+, mientras que la fracción DO-1+ permaneció inalterada. Alrededor de un 40% de aumento en la fracción PAb 1620+ y una reducción de -20% en la fracción PAb 240+ se observaron en experimentos similares con MIRA-1. Se midió la fracción de pAb 1620+ p53 en extractos proteicos de células SKOV-His-175 tratadas con PRIMA-1 usando ELISA. Tras el tratamiento con 150 \muM de PRIMA-1, la fracción Pab1620+ alcanzó 146 \pm 18% (el valor para células sin tratar se estableció como 100%), mientras que la fracción DO-1 fue 88 \pm 9%. Esto demuestra que PRIMA-1 puede estabilizar el p53 mutante en una conformación silvestre, tanto in vitro como en células vivas.

Además, la inmunotinción con PAb 1620 demostró la capacidad de PRIMA-1 para convertir el p53 mutante a la conformación silvestre en células vivas. Como se muestra en la Figura 6A, el tratamiento de las células SKOV-His-175 con PRIMA-1 tuvo como resultado la aparición de p53 PAb 1620 positivas en células y una disminución concomitante en los niveles totales de p53 según la tinción con anticuerpos policlonales anti-p53. Un efecto similar fue observado para células tratadas con MIRA-1 (Figura 6B).

Los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 pueden restablecer la unión a ADN específica de secuencia de las proteínas p53 mutantes

A continuación los autores trataron la cuestión de si el restablecimiento de la función inductora de apoptosis de las proteínas p53 mutantes por los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 opera a través de la actividad de unión a ADN específica de p53. ¿Restablecen los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 la unión a ADN específica de p53? Los autores investigaron la unión a ADN de las proteínas p53 en presencia o ausencia de los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 en en ensayo de desplazamiento de banda, como se describió anteriormente (Selivanova y otros, 1996; Selivanova y otros, 1997). Los resultados presentados en la Figura 5A demuestran que los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 son capaces de restablecer la unión a ADN específica de la proteína GST-p53 silvestre inactivada mediante incubación a 37ºC durante 30 min. Por otro lado, los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 fueron capaces de restablecer la unión a ADN específica de la proteína GST-p53 mutante His-175, como se muestra en la Figura 5B. La sustitución de una arginina en posición 175 causa un gran desplegamiento del dominio central de unión a ADN de p53. Por lo tanto, el restablecimiento de la unión a ADN de este mutante fue observado como una tarea excepcionalmente difícil. El restablecimiento de la unión a ADN del p53 mutante His-175 demuestra una elevada potencia de los compuestos identificados. Puesto que el mutante His-175 se mostró que gana una función oncogénica, este resultado parece ser de particular importancia. Los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 fueron también capaces de restablecer la unión a ADN específica de secuencia de la p53 mutante Trp-282 endógena en extractos celulares de células BL-60 de linfoma de Burkitt, como se muestra en la Figura 6B.

Los autores ensayaron la capacidad de los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 para restablecer las propiedades de unión a ADN específicas de una amplia serie de p53 mutantes en puntos calientes, usando extractos celulares de líneas celulares de tumores humanos que llevan diferentes p53 mutantes como una fuente para proteína p53 endógena. El compuesto PRIMA-1 restableció la unión a ADN específica de 13 de 15 proteínas p53 mutantes ensayadas en ensayos de desplazamiento de bandas, independientemente de la unión a ADN residual (véase la Tabla III). El compuesto MIRA-1 restableció la unión a ADN de 3 de un total de 14 proteínas p53 mutantes (Tabla III). Así, los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 no solo fueron capaces de restablecer la unión al ADN de las proteínas p53 mutantes recombinantes, sino que también reactivaron la unión al ADN de un número de proteínas p53 mutantes endógenas en extractos celulares. La única excepción para el compuesto PRIMA-1 fue el mutante Phe-176, que no fue reactivado por ninguno de los dos compuestos.

Tomando en consideración estos resultados de que los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 no son capaces de restablecer la unión a ADN específica de la proteína p53 mutante Phe-176 in KRC/Y, los autores ensayaron si la función inductora de apoptosis de este mutante podría ser reactivada por compuestos MIRA-1 y PRIMA-1. Las células KRC/Y fueron tratadas con concentraciones 50 \muM y 75 \muM de los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1, respectivamente, y el porcentaje de células muertas fue medido mediante análisis de FACS como se describe a continuación. Como se demuestra en la Figura 5, la inducción de apoptosis en células KRC/Y fue mucho menos prominente comparado con las células Saos-2-His-273. De hecho, la respuesta de las células KRC/Y al tratamiento fue comparable con la de las células Saos-2 que no expresan p53. Así, parece que el defecto causado por la sustitución del residuo Cys en posición 176 es irreversible. La sustitución de este residuo Cys abole la unión de un átomo de Zn que mantiene unidos los bucles de unión a ADN del dominio central p53. Por lo tanto, el desplegamiento de esta proteína p53 mutante es probablemente demasiado amplio como para ser restablecido.

La apoptosis inducida por PRIMA-1 depende de la función transactivadora de p53

Para verificar adicionalmente que PRIMA-1 ejerce su efecto a través de la transactivación transcripcional mediada por p53 y la síntesis proteica de novo, los autores ensayaron el efecto de la cicloheximida en la inhibición del crecimiento/apoptosis inducida por PRIMA-1. El pretratamiento de las células SKOV-His-175 con cicloheximida antes de la adición de PRIMA-1 causó un aumento de 4 veces en la supervivencia celular según el ensayo de proliferación WST-1. El tratamiento con cicloheximida hizo a las células SKOV-His-175 también resistentes a MIRA-1, resultando en un aumento de unas 4 veces en la supervivencia celular. Por otro lado, se ha encontrado que la viabilidad de las células SKOV que llevan el p53 mutante His-175-22/23 que tiene un dominio de transactivación inactivo fue al menos dos veces tan alto como el de las células SKOV-His-175 tras el tratamiento con PRIMA-1. Además, las células SKOV-His-175 fueron al menos 3 veces más sensibles al tratamiento con MIRA-1 en comparación con las células SKOV-His-175-22/23. Tomados juntos, estos resultados proporcionan una evidencia convincente de que la transactivación transcripcional por p53 es crítica para muerte celular inducida por PRIMA-1 y MIRA-1.

Compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 pueden restablecer la función de transactivación transcripcional del p53 mutante en células vivas

Habiendo establecido que los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 pueden reactivar la unión a ADN específica del p53 mutante in vitro, los autores han abordado la cuestión de si los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 pueden restablecer la función de transactivación transcripcional de la función p53 mutante en células vivas. Las células saos-2-His-273 que llevan un gen reportero de PG-luciferasa sensible a p53 fueron tratadas con los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 y la actividad luciferasa fue medida usando el sistema Dual Luciferase reporter Assay System (Promega) según el fabricante. Como se muestra en la Tabla IV, los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 estimularon la transcripción del gen luciferasa 1,5-2 veces. De modo interesante, las cinéticas de la inducción de la expresión del gen luciferasa difirió entre los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1. Mientras que los compuestos Mira-1 estimularon la expresión luciferasa 2 veces tras 3,5 horas, se logró una inducción de 2 veces por los compuestos PRIMA-1 tras sólo 15 horas de tratamiento. Las cinéticas de inducción de la expresión del gen luciferasa correlaciona con la inducción rápida y lenta de apoptosis por los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1, respectivamente.

El tratamiento de células A431 que llevan p53 mutante His-273 endógeno y un reportero lacZ sensible a p53 transfectado con 50 \muM de PRIMA-1 durante 20 horas tuvo como resultado la aparición de las células positivas para lacZ mientras que las células sin tratar fueron negativas (Figura 9A). Resultados similares fueron obtenidos tras el tratamiento con 5 \muM de MIRA-1 durante 12 horas.

Los autores también transfectaron de modo transitorio células SKOV-His-175 con un reportero EGFP sensible a p53. La Figura 9B muestra una inducción fuerte de la expresión de EGFP en células SKOV-His-175 que expresan el p53 mutante tras tratamiento con PRIMA-1 durante 24 horas. Por el contrario, las células SKOV-His-175 hechas crecer en presencia de doxiciclina (p53 apagado) no expresaron niveles detectables de EGFP. La inducción de EDGP fue también observado en las células tratadas con 5 \muM de MIRA-1 durante 24 horas (Figura 9C).

Como confirmación final de que PRIMA-1 y MIRA-1 pueden rescatar la transactivación transcripcional del p53 mutante, se examinó si PRIMA-1 o MIRA-1 eran capaces de inducir dos genes p53 diana clásicos, p21 y MDM2. El tratamiento de células H1299-His-175 expresando el p53 mutante bien con PRIMA-1 o MIRA-1 tuvo como resultado una sólida inducción tanto de MDM2 como de p21 (Figura 10A). De modo importante, el tratamiento con, el compuesto PRIMA-1 o MIRA-1 en las mismas células en ausencia de expresión del p53 mutante no causó ninguna inducción de MDM2 ni de p21 (Figura 10B). Además, ambos reactivos químicos indujeron MDM2 y p21 en células de carcinoma de colon SW480 que llevan el p53 endógeno His-273 (Figura 10C), pero no causaron ningún cambio significativo de los niveles proteicos de MDM2 Y p21 en células de carcinoma de colon HCT116 que llevan el p53 silvestre.

La estimulación de la función transactivación transcripcional por los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 correlacionó con los datos obtenidos en experimentos de desplazamiento de bandas y demostró que los compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 pueden trabajar tanto in vitro como in vivo como reactivadores de la unión de ADN específica y funciones de transactivación de p53.

Toxicidad y actividad antitumoral de PRIMA-1 in vivo

Las inyecciones intravenosas de PRIMA-1 en ratones no causaron ningún cambio obvio en el comportamiento del peso comparado con animales testigo sin tratar. El peso promedio de ratones testigo sin tratar fue de 20 \pm 0,6 g (media \pm DE, n=3) y el peso promedio de los ratones tratados con PRIMA-1 a la dosis más alta usada de 100 mg/kg fue de 20 \pm 0,2 g tras un mes de observación. Para evaluar el efecto de PRIMA-1 en xenotransplantes de tumores humanos, se inocularon ratones con células Saos-2-His-273 que expresan el p53 mutante. Los animales recibieron inyecciones intratumorales (20 mg/kg) o intravenosas (20 ó 100 mg/kg) de PRIMA-1 dos veces al día durante tres días. En el grupo testigo sin tratar, el volumen tumoral promedio tras 59 días fue 555,7 \pm 284 mm^{3} (media \pm DE, n=3). A este tiempo, los ratones que recibieron inyecciones intravenosas de PRIMA-1 a una dosis de 100 mg/kg tuvieron un volumen tumoral promedio de 11,7 \pm 8 mm^{3}, y los ratones tratados con 20 mg/kg de PRIMA-1 i.v. tuvieron un volumen tumoral promedio de 53 \pm 48,5 mm^{3} (Fig. 5). Los ratones que recibieron inyecciones intratumorales de 20 mg/kg de PRIMA-1 tuvieron un volumen tumoral promedio de 5,3 \pm 2,7 mm^{3}. Las diferencias en volumen tumoral entre los ratones testigo sin tratar y los animales tratados con PRIMA-1 son todos estadísticamente significativos (P = 0,041 para inyecciones intratumorales de 20 mg/kg, P = 0,066 para una inyección intravenosa de 20 mg/kg, y P= 0,045 para una inyección intravenosa de 100 mg/kg, según el ensayo t paralelo para el período de observación entero). Así, PRIMA-1 tuvo una actividad antitumoral in vivo en este modelo de tumor animal.

Identificación de análogos estructurales de compuestos MIRA-1 y PRIMA-1 del presente invento que son capaces de suprimir específicamente el crecimiento de las células que expresan el p53 mutante

Para identificar los grupos activos de los compuestos PRIMA-1 y MIRA-1 de reactivación de p53 se ensayaron una serie de análogos estructurales de compuestos MIRA-1 y PRIMA-1. Las células Saos-2-His-273 de osteosarcoma y H1299-His-175 de células de adenocarcinoma de pulmón hechas crecer en presencia (p53 null) o ausencia (expresión de mutante p53) de doxiciclina se pusieron en placas sobre placas de ELISA a una densidad de 3000 células por pocillo. Tras 12h las células fueron tratadas con análogos e incubadas con compuestos durante 48 h. Después el reactivo de proliferación celular WST-1 fue añadido a cada pocillo y la supervivencia celular fue estimada leyendo la absorbancia a 450 nm por un lector de ELISA. El efecto de los análogos estructurales sobre el crecimiento celular fue ensayado usando diferentes concentraciones de los compuestos, oscilando desde 0,1; 1; 5; 10 y 25 \muM. Después de que se generaran las curvas de inhibición del crecimiento basadas en una función racional Y = (b+cx)/1+ax usando el software Microcal Origin. Los coeficientes (a,b,c) de la ecuación fueron determinados empleando el algoritmo Levenberg-Marquardt. Los valores IC50 fueron calculados a partir de la ecuación tomando Y=50% de la inhibición del crecimiento.

La especificidad de cada compuestos fue determinada mediante el cálculo de la relación IC50 p53 null/IC50 mtp53. Las relaciones igual o menores de 1 indican una actividad no específica. Los compuestos que no mostraron ningún efecto a las concentraciones hasta 25 \muM fueron consideradas inactivas.

Así, los análogos de MIRA-1 y PRIMA-1 fueron capaces de restablecer la función supresora del crecimiento de los tres mutantes p53 de puntos calientes más comunes a una concentración más baja que los compuestos originales e independientemente de los antecedentes genéticos.

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Claims (6)

1. El uso de un compuesto distinto del 9-(azabiciclo [2,2,2]octano-3-ona)6-cloro-9H-purina que tiene la capacidad de restablecer la función inductora de apoptosis de las proteínas p53 mutantes, compuesto que se selecciona a partir de compuestos que tienen una estructura según la fórmula I

7

en la que:

R1 es hidrógeno o un grupo metileno, que puede tener un doble enlace, como se indica por la línea discontinua, o un enlace simple y unido al átomo de nitrógeno de un grupo fenilo sustituido con una amina, hacia un átomo de nitrógeno contenido en la estructura en anillo de una purina, 8-azapurina, o un residuo benzimidazol, y;

A es un resto que contiene oxígeno, que consiste bien en un átomo de oxígeno unido por un doble enlace, como se indica por la línea discontínua, o bien un grupo benzoiloxi, con la condición de que cuando A es un grupo benzoiloxi, entonces R1 es hidrógeno, con la condición adicional de que cuando A es un átomo de oxígeno unido por un doble enlace, R1 no es un hidrógeno para la preparación de un medicamento para tratar enfermedades mediadas por p53 mutante.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el compuesto es seleccionado de 1-(adenina-9-metilén)-3-quinuclidinona, 2-metilén-3-quinuclidinona, 2-(-2-amino-3-cloro-5-trifluorometil-1-metilanilina)-3-quinuclidinona, 2-(6-trifluorometil-4-clorobenzimidazol-1-metilén)-3-quinuclidinona, 2-(6-metoxipurina-9-metilén)-3-quinuclidinona, 2-(8-azaadenina-9-metilén)-3-quinuclidinona, 1-azabiciclo [2,2,2,]oct-3-il-benzoato, 2-(5,6-dimetil-benzimidazol-1-metilén)-3-quinuclidinona, 2-(8-azaadenina-7- metilén)-3-quinuclidinona, 2-(ácido 7-metilén-1,3-dimetilúrico)-3-quinuclidinona, ó 2-(2,6-dicloro-9-metilénpurina)-3-quinuclidinona.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto es seleccionado de los compuestos que tienen la estructura de la fórmula general I'

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en la que R1 es un grupo metileno unido al nitrógeno, átomo de un grupo fenilo sustituido por amina, un átomo de nitrógeno contenido en la estructura en anillo de una purina, 8-azapurina, o residuo benzimidazol, y, más preferiblemente R1 es un grupo metileno unido a un átomo de nitrógeno contenido en la estructura en anillo de una purina, 8-azapurina, o residuo benzimidazol.

4. El uso de 2-etilén-4(3H)-quinazolinona que tiene la capacidad de restablecer la función inductora de apoptosis de las proteínas p53 mutantes para la preparación de un medicamento para tratar las enfermedades mediadas por p53 mutantes.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, junto con un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptables.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la enfermedad mediada por p53 mutante es cáncer.