ES2269736T3 - Proteccion frente a la hepatitis mediada por abin. - Google Patents
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Abstract
Uso de ABIN, o una variante o fragmento funcional del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF.
Description
Protección frente a la hepatitis mediada por
ABIN.
La presente invención se refiere al uso del
inhibidor de unión A20 de activación a NF-\kappaB
(ABIN) para proteger contra el fallo hepático inducido por TNF
(tumor necrosis factor - factor de necrosis tumoral), tal como la
hepatitis vírica y la enfermedad hepática alcohólica. Más
particularmente, se refiere a la prevención de los efectos tóxicos
de dichas enfermedades, incluyendo la mortalidad, mediante la
sobreexpresión de ABIN.
El fallo hepático agudo es un síndrome clínico
que resulta de la necrosis masiva y apoptosis de las células
hepáticas que lleva a encefalopatía hepática y alteración grave de
la función hepática. Está causada por diferentes tipos de
enfermedades, tales como hepatitis vírica (A, B, C,…), fármacos,
intoxicación, hepatitis autoinmunitaria, etc. Muchos estudios han
mostrado que el TNF desempeña un papel central en la enfermedad del
hígado. El TNF se produce principalmente macrófagos activados pero
también se produce en cantidades más pequeñas por otros varios
tipos de células. El TNF ejerce una variedad de efectos sobre
diferentes tipos de células y está implicado como un mediador
importante en diversos estados fisiológicos y patofisiológicos.
Además, ha quedado claro que el TNF es un mediador importante de
apoptosis (muerte celular programada). El TNF se identificó
originalmente por su capacidad para inducir necrosis hemorrágica de
tumores en ratones. Han fracasado los intentos de utilizar el TNF
para tratamiento anti-cáncer sistémico debido a la
aparición de efectos secundarios graves antes de poder alcanzar la
dosis terapéutica. Uno de los efectos secundarios del tratamiento
con TNF fue un aumento de los niveles séricos de transaminasas y
niveles de bilirrubina, que indica un efecto citotóxico directo del
TNF sobre hepatocitos humanos. Estudios posteriores han mostrado que
el TNF puede estar implicado en hepatitis vírica, enfermedad
hepática alcohólica, y fallo hepático fulminante (Muto et
al., 1988; Bird et al., 1990;
González-Amaro et al., 1994; Diehl et
al., 1994; Larrea et al., 1996). Los niveles séricos de
TNF aumentan claramente en pacientes con hepatitis fulminante (Muto
et al., 1988). Además, se encontró que los niveles séricos
de TNF eran significativamente superiores en los pacientes que
murieron que en los pacientes que sobrevivieron (Bird et
al., 1990).
Se ha sugerido un papel del TNF en la
patogénesis de la infección vírica de la hepatitis crónica B y C.
Ambos virus inducen la expresión de TNF en líneas celulares de
hígado humano y hematoma humano (González-Amaro
et al., 1994). Los pacientes con hepatitis B crónica tienen
niveles de TNF en plasma elevados, y sus células mononucleares de
sangre periférica muestran una producción intensificada de TNF in
vitro. Además, en pacientes infectados con hepatitis B crónica
que se someten a un tratamiento con interferón, se observó un
aumento masivo de la producción espontánea de TNF en células
mononucleares sanguíneas en el momento de la seroconversión
antígena exitosa (Diehl et al., 1994), que sugiere que los
niveles de TNF aumentados pueden estar implicados en el
aclaramiento del virus de hepatitis B. Además, los niveles séricos
de TNF-R1 y TNF-R2 solubles están
significativamente elevados en la infección de hepatitis B crónica.
Los niveles séricos de TNF-R2 soluble se
correlacionan estrechamente con el alcance de la inflamación y
muerte de hepatocitos en el hígado. Durante el tratamiento con
interferón, la respuesta y el aumento de transaminasas se asocian
con un aumento de los niveles séricos de TNF-R2
soluble. Para pacientes con hepatitis C, el tratamiento con
interferón aclara el virus y reduce los niveles de TNF hasta
normales en pacientes que responden (Larrea et al., 1996). De
manera interesante, los niveles de TNF previos al tratamiento eran
superiores en pacientes que no responden comparado con pacientes
que responden (Larrea et al., 1996). Las proteínas de la
hepatitis C interaccionan con el receptor de TNF, aunque no está
claro si esta interacción promueve o previene la apoptosis (Ray
et al., 1998). Recientemente, se ha mostrado una interacción
entre la proteína NS5A del virus de la hepatitis C y las proteínas
TRADD y TRAF2 asociadas al receptor de TNF (Majumder et al.,
2002; Park et al., 2002). Park y sus colaboradores mostraron
que la NS5A alteraba la apoptosis hepática mediada por TNF
previniendo la asociación entre TRADD y FADD. Además, ambos grupos
también mostraron que la NS5A previene la activación de
NF-\kappaB mediada por TRADD y TRAF2.
Los niveles séricos de TNF aumentan en pacientes
con hepatitis alcohólica, y los niveles se correlacionan
inversamente con la supervivencia del paciente. Las concentraciones
de TNF eran significativamente superiores en pacientes que no
sobrevivieron a un episodio de hepatitis alcohólica aguda (Bird
et al., 1990).
Los monocitos aislados a partir de pacientes con
hepatitis alcohólica producían espontáneamente cantidades
superiores de TNF comparado con controles sanos. Los monocitos
derivados a partir de pacientes con hepatitis alcohólica también
producían significativamente más TNF en respuesta al LPS que los
monocitos normales. Se han desarrollado varias hipótesis para
explicar el aumento de los niveles de TNF en pacientes con
exposición al etanol crónica. El consumo de etanol crónico aumenta
la permeabilidad del intestino a productos bacterianos tales como
LPS, induciendo potencialmente la producción de TNF en macrófagos
(McClain, 1991). Además, estudios que investigan el polimorfismo
promotor en pacientes con esteatohepatitis alcohólica indican que
los pacientes con esteatohepatitis alcohólica tenían una mutación
en el promotor de TNF que aumenta su actividad (Grove et
al., 1997). Por tanto los factores genéticos pueden estar
implicados en el aumento de la producción de TNF en pacientes con
hepatitis alcohólica.
Se ha estudiado el papel del TNF en lesiones
hepáticas en varios modelos animales. Utilizando anticuerpos
anti-TNF neutralizantes o ratones "deficientes"
("knockout") para TNF, TNF-R1, o
TNF-R2, se ha vuelto evidente que el TNF activa la
apoptosis y/o necrosis de los hepatocitos in vivo. En
diferentes modelos animales de lesiones hepáticas, el TNF desempeña
un papel central o adicional en la patogénesis de lesiones hepáticas
agudas. En el presente documento se utiliza el modelo
TNF/Galactosamina (GAIN). En este modelo, se administra TNF en
combinación con D-(+)-galactosamina (GaIN), una
hepatotoxina, que bloquea selectivamente la transcripción en los
hepatocitos agotando los nucleótidos uridina (Dekker y Keppler,
1974), induciendo la mortalidad, activación de caspasas y posterior
apoptosis de los hepatocitos (Leist et al., 1995; Van Molle
et al., 1999; Tiegs et al., 1989). Los ratones
deficientes para TNF-R1 son resistentes al
tratamiento con TNF/GaIN, demostrando el papel esencial del
TNF-R1 en este modelo de apoptosis (Leist et
al., 1995). El efecto de sensibilización de GaIN sugiere que el
bloque transcripcional inducido por GaIN inhibe directamente la
síntesis de las proteínas antiapoptóticas. Recientemente, se ha
mostrado que el factor de transcripción de
NF-\kappaB regula la expresión de varias
proteínas anti-apoptóticas.
El NF-\kappaB es un factor de
transcripción esencial que se expresa de manera omnipresente en
todos los tipos de células y cuya actividad se modula por un amplio
intervalo de inductores, incluyendo las citocinas y productos
bacterianos y víricos. Muchos de los genes sensibles al
NF-\kappaB desempeñan un papel clave en la
regulación de las respuestas inflamatorias e inmunitarias. La
desreguralización de la actividad del NF-\kappaB
se observa a menudo en varias enfermedades inflamatorias crónicas
tales como artritis reumatoide, asma y enfermedad inflamatoria del
intestino, así como enfermedades agudas tales como el choque
septicémico. Además, el NF-\kappaB sirve para
proteger contra la apoptosis y ayuda al progreso del ciclo celular.
El primer indicio de que la activación del
NF-\kappaB puede modular las respuestas de los
hepatocitos con relación a las lesiones hepáticas fue el hallazgo
de que los ratones deficientes que carecen de la subunidad
p65/Rel-A del NF-\kappaB no eran
viables debido a la apoptosis de los hepatocitos masiva durante la
embriogénesis (Beg et al., 1995). Informes recientes de
varios laboratorios han demostrado ahora que la activación del
NF-\kappaB regula la proliferación y apoptosis de
hepatocitos in vivo e in vitro. En ratas sometidas a
hepatectomía parcial, la inhibición de la activación del
NF-\kappaB alteró la posterior regeneración del
hígado y activó la apoptosis de los hepatocitos (limuro et
al., 1998). Estos hallazgos sugieren un papel crítico de la
activación del NF-\kappaB en hepatocitos tras un
estimulo mitogénico, aunque no está claro el mecanismo por el cual
la inhibición de la activación del NF-\kappaB
bloquea bloqueó la proliferación. La apoptosis puede haber
resultado a partir de un bloqueo del ciclo celular o a partir de la
sensibilidad al TNF producido tras la hepatectomía parcial. Un papel
esencial de la activación del NF-\kappaB durante
la proliferación de los hepatocitos también se apoya en el hallazgo
de que la inhibición de la actividad del
NF-\kappaB dio como resultado la apoptosis en una
línea celular de hepatocitos murinos que crecían exponencialmente
(Bellas et al., 1997). Sin embargo, otros estudios sobre
cultivos de hepatocitos de rata confluentes han demostrado que la
inhibición del NF-\kappaB por sí misma no dio como
resultado la muerte celular (Xu et al.; 1998). En estas
células, la inhibición del NF-\kappaB convirtió la
respuesta hepatocelular al estímulo mitogénico del TNF de la
proliferación a una de apoptosis (Xu et al., 1998). El
mecanismo por el cual la inactivación del
NF-\kappaB activó provocó la apoptosis inducida
por TNF en estos estudios implicó la activación de la cascada de
caspasa, y pudo prevenirse la muerte celular mediante la inhibición
de la caspasa o NO (Xu et al., 1998).
El(los) producto(s)
génico(s) dependiente(s) del
NF-\kappaB que protege(n) los hepatocitos
contra lesiones inducidas por TNF permanece(n) sin
identificarse. Genes candidatos posibles son iNOS e
interleucina-6, dado que se regulan por
NF-\kappaB y sus productos génicos pueden tener
efectos hepatoprotectores. También falta por determinar si la
activación de NF-\kappaB inhibe la hepatotoxicidad
de agentes perjudiciales diferentes del TNF. En la línea celular de
hepatoma Hep G2, el tratamiento con una concentración no tóxica del
generador superóxido menadiona protegió contra dosis tóxicas
posteriores de menadiona o H_{2}O_{2} mediante un mecanismo
dependiente de NF-\kappaB (Chen y Cederbaum,
1997). Sin embargo, estudios en una línea celular de hepatocitos de
rata demostraron que, aunque el H_{2}O_{2} y el cobre indujeron
la activación del NF-\kappaB y causaron la
apoptosis en concentraciones tóxicas, la inhibición de la actividad
del NF-\kappaB no sensibilizó las células frente a
la muerte a partir de H_{2}O_{2} o cobre (Xu et al.,
1998). La activación del NF-\kappaB puede
estimular por tanto un mecanismo de defensa específico para la ruta
de la muerte por el TNF.
La posibilidad de que la activación del
NF-\kappaB en hepatocitos sea protectora tras
lesiones hepáticas apunta a la complejidad de acontecimientos tras
la activación global del NF-\kappaB en todos los
tipos de células en el hígado. Tras un estímulo tóxico, se sabe que
la activación del NF-\kappaB en macrófagos
hepáticos da como resultado la producción de productos
perjudiciales tales como citocinas y productos intermedios de
oxígeno reactivos. Por tanto la inhibición de la activación del
NF-\kappaB hepático se vio como un tratamiento
potencial para las lesiones hepáticas. Ahora parece que la
señalización del NF-\kappaB representa un objetivo
terapéutico problemático, ya que la inhibición general de la
activación del NF-\kappaB hepático puede llevar a
efectos tanto beneficiosos como perjudiciales.
Recientemente, se ha producido un progreso
considerable entendiendo los detalles de las rutas de señalización
que regulan y median la activación del NF-\kappaB
en respuesta al TNF e IL-1. Estas citocinas actúan
uniéndose a receptores de superficie celular específicos, que a su
vez inician el reclutamiento de varias proteínas adaptadoras
específicas, y la activación de un complejo de cinasa que fosforila
el inhibidor del NF-\kappaB I\kappaB. Éste
último retiene al NF-\kappaB en el citoplasma en
una forma dimérica inactiva. Una vez fosforilado, el I\kappaB se
marca para la ubiquitinación y posterior degradación por el
proteasoma, permitiendo la translocación nuclear del
NF-\kappaB. Aunque se han estudiado bien miembros
de la familia del I\kappaB como inhibidores directos del
NF-\kappaB, se han notificado varias otras
proteínas que regulan negativamente la expresión génica dependiente
del NF-\kappaB. Se ha mostrado previamente que la
proteína "dedo de zinc" A20 es un potente inhibidor de la
activación NF-\kappaB en respuesta al TNF,
IL-1, LPS y CD-40 (publicado en
Beyaert et al., 2000). Además, A20 también ejerce una
función anti-apoptótica en varias líneas celulares.
La A20 solo se expresa con la activación del
NF-\kappaB, y está implicada en la regulación de
respuesta negativa de la activación del
NF-\kappaB. Recientemente se mostró que los
ratones deficientes en A20 son defectuosos en la terminación de la
activación del NF-\kappaB, llevando a respuestas
inflamatorias fuertes y caquexia (Lee et al., 2000). Los
mecanismos subyacentes responsables de la inhibición de la
expresión génica dependiente del NF-\kappaB por la
A20 todavía no están claros. La A20 interacciona con el complejo de
cinasa I\kappaB, así como con TRAF2 y TRAF6, que son parte de la
cascada de activación de la cinasa I\kappaB iniciada por el TNF e
IL-1/LPS, respectivamente. Además, recientemente se
aislaron tres proteínas de unión A20 novedosas (ABIN,
ABIN-2 y ABIN-3). Con sobreexpresión
en líneas celulares, se mostró que estas proteínas inhiben la
expresión génica dependiente del NF-\kappaB en
respuesta al TNF o IL-1 (Beyaert et al.,
2000; Heyninck et al., 1999; Van Huffel et al., 2001,
Van Huffel et al., no publicado; documento AJ320534).
La presente invención se refiere al sorprendente
hallazgo de que la sobreexpresión de ABIN previene la hepatitis
letal inducida por TNF en ratones.
Figura 1: Efecto del AdABIN sobre la degradación
estimulada por TNF/GaIN de I\kappaB (panel superior) y unión al
ADN del NF-\kappaB (panel inferior) in
vivo. Se inyectaron (i.v.) a los ratones 2,5 x 10^{9} ufp de
Ad-ABIN, Ad-I\kappaB^{s} (=
superrepresor de I\kappaB), o AdRR5 (= control de virus vacío), y
tres días después se expusieron mediante inyección a una dosis
letal de TNF (0,3 \mug)/GaIN (20 mg) diluidos en PBS. PBS como tal
sirvió de control. A diferentes tiempos después del tratamiento con
TNF/GaIN, se mató a los ratones y se prepararon homogeneizados de
hígado. Se analizó la expresión de I\kappaB\alpha mediante
SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo
anti-I\kappaB\alpha policlonal (panel superior).
Se analizó la unión al ADN del NF-\kappaB
incubando 10 \mug de extracto nuclear con sondas radiomarcadas y
se corrió en un gel natural. Se reveló la unión del
NF-\kappaB a la sonda de ADN mediante exposición
en una película de rayos X (panel inferior).
Figura 2: Efecto del AdABIN sobre la muerte
celular mediada por TNF in vitro. Se cultivaron células BWTG3
infectadas con AdABIN, AdRR5 o con infección fingida en placas de
96 pocillos y se estimularon con una disolución en serie de TNFm en
ausencia (superior) o presencia de CHX (inferior) durante 8 horas.
Se analizó la muerte celular con incubación con MTT.
Figura 3: Efecto del AdABIN sobre la caída de la
temperatura corporal inducida por TNF/GaIN en ratones. Se
inyectaron (i.v.) a los ratones 2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n = 8) o
AdRR5 (=control) (n=9) y tres días después se expusieron con 0,3
\mug de TNF + 20 mg de GAIN. Se midió la temperatura (ºC) cada
hora hasta las 18 horas tras la exposición.
Figura 4: Efecto del AdABIN sobre la mortalidad
inducida por TNF/GaIN. Se inyectaron (i.v.) a los ratones
2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n = 8) o AdRR5 (=control) (n=9) y 3 días
después se expusieron con 0,3 \mug de TNF + 20 mg de GAIN. Se
midió la mortalidad durante un periodo de 72 h (no se produjeron más
muertes).
Figura 5: Efecto del AdABIN sobre la liberación
en suero de la alanina aminotransferasa inducida por TNF/GaIN. Los
ratones infectados con AdABIN o AdRR5, expuestos con una dosis letal
de TNF/GaIN se sangraron 8 horas tras la inyección. Se preparó el
suero y se midieron los valores de ALT séricos (en U/l).
Figura 6: Efecto del AdABIN sobre la
fragmentación del ADN inducida por el TNF/GaIN en el hígado. Se
aislaron los hígados de ratones infectados con AdABIN o AdRR5 8
horas después de una exposición con una dosis letal de TNF/GaIN. Se
midió la fragmentación del ADN mediante ELISA, y se expresó como %
de ratones control (AdRR5).
Figura 7: Efecto de AdABIN sobre la actividad de
la caspasa inducida por TNF/GaIN en homogeneizados de hígado. Se
trataron ratones infectados con AdABIN o AdRR5 (n=5 cada uno) con
TNF + GaiN durante 8 horas. Se sometieron a prueba 30 \mug de
homogeneizado de hígado para determinar su actividad proteolítica en
Ac-DEVD.AMC. Se expresó la actividad proteolítica
como el aumento de fluorescencia de AMC en función del tiempo
(\DeltaF/min).
Figura 8: Efecto del AdABIN sobre la escisión de
la caspasa-3 inducida por TNF/GaIN en homogeneizados
de hígado. Se dejaron sin tratar (n=4) o se inyectaron (n=5)
ratones infectados con AdABIN o AdRR5, con TNF + GAIN durante 8
horas. Se prepararon homogeneizados de hígado, se separaron las
proteínas mediante SDS-PAGE al 15%, y se realizó
inmunotransferencia utilizando un anticuerpo
anti-caspasa-3 policlonal. La
pro-caspasa-3 inactiva así como la
subunidad de p20 de la caspasa-3 que se libera
proteolíticamente se indican mediante una flecha.
Figura 9: comparación del AdABIN y AdI\kappaBs
sobre la mortalidad inducida por TNF/GaIN. Se inyectaron (i.v.) a
ratones 2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n=5), AdI\kappaBs (n=5) o
AdRR5 (=control) (n=9) y 3 días después se expusieron con 0,3
\mug de TNF + 20 mg de GaIN. Se midió la mortalidad a lo largo de
un periodo de 7 días.
Figura 10: efecto del AdABIN sobre la mortalidad
inducida por anti-Fas. Se inyectaron (i.v.) a
ratones 2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n = 3) o AdRR5 (=control) (n=3)
y 3 días después se expusieron con 10 \mug de
anti-Fas. Se midió la mortalidad sobre un periodo
de 5 horas.
Figura 11: efecto del AdABIN sobre la mortalidad
inducida por TNF/ActD. Se inyectaron (i.v.) a ratones 2,5.10^{9}
ufp de AdABIN (n = 5) o AdRR5 (=control) (n=5) y 3 días después se
expusieron con 0,3 \mug TNF + 20 \mug de ActD (actinomicina D).
Se midió la mortalidad a lo largo de un periodo de 35 horas.
Un primer aspecto de la invención es el uso de
ABIN, tal como se representa en la SEQ ID Nº 2, o un fragmento o
variante funcional de la misma para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF. El término
"ABIN" se refiere a ABIN, ABIN-2 y
ABIN-3 tal como se describe en Beyaert et
al., 2000; Heyninck et al., 1999; Van Huffel et
al., 2001, Van Huffel et al. (no publicado; documento
AJ320534) y el documento WO 99/57133. Más específicamente, el
término ABIN se refiere a cualquier polipéptido que comprende
la(s) secuencia(s) de aminoácidos consenso tal como se
representa(n) en la SEQ ID Nº 4 y/o SEQ ID Nº 5 que también
se describen en el documento WO 99/57133 que se incorpora en el
presente documento como referencia. Un segundo aspecto de la
invención es el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica
para ABIN, tal como se representa en la SEQ ID Nº 1, o para un
fragmento o variante funcional de la misma, para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por
TNF. Un fragmento funcional del ABIN es un polipéptido que todavía
puede interaccionar con la proteína A20 y/o puede modular la
activación del NF-\kappaB. Preferiblemente, dicha
modulación es una inhibición de la activación del
NF-\kappaB. Fragmentos funcionales son, como
ejemplos no limitativos, fragmentos que comprenden al menos los
aminoácidos 420-647 de la SEQ ID Nº 2,
preferiblemente al menos los aminoácidos 390-647,
más preferiblemente al menos 54-647 (SEQ ID Nº 3).
Preferencialmente dicho fragmento consiste esencialmente en al menos
los aminoácidos 420-647 de la SEQ ID Nº 2,
preferiblemente al menos los aminoácidos 390-647,
más preferiblemente al menos 54-647 (SEQ ID Nº 3).
Las variantes son polipéptidos con al menos el 65% de identidad a
nivel de aminoácidos, preferiblemente el 70% de identidad, tal como
se mide mediante BLAST (Altschul et al., 1997). Las variantes
tienen características comunes, tales como la actividad biológica,
reactividad inmunológica, conformación etc. Como ejemplos no
limitativos, se consideran como variantes, proteína alfa Naf1
(documento AJ011895), proteína beta Naf1 (documento AJ011896) y la
proteína lanzadera nuclear asociada al virión (documento
AY012155).
Un aspecto adicional es el uso de la
fitohemaglutinina (PHA), un compuesto que induce ABIN (Gupta et
al., 2000), para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de fallo hepático inducido por TNF.
Dicho fallo hepático inducido por TNF es, como
ejemplo no limitativo, hepatitis vírica tal como la hepatitis A, B
o C, hepatitis fulminante y/o enfermedad hepática alcohólica. En
caso de utilizar un ácido nucleico, se pretende preferiblemente que
dicho medicamento administre dicho ácido nucleico en la célula, en
un tratamiento de terapia génica. Se conocen bien un gran número de
métodos de administración por los expertos en la técnica.
Preferiblemente, se administran los ácidos nucleicos para usos de
terapia génica in vivo o ex vivo. Sistemas de
administración de vector no vírico incluyen plásmidos de ADN, ácido
nucleico desnudo, y ácido nucleico como complejado con un vehículo
de administración tal como un liposoma. Sistemas de administración
de vector vírico incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas o
bien episomales o bien integrados tras la administración a la
célula. Los métodos de administración no víricos de ácidos nucleicos
incluyen lipofección, microinyección, biolísticos, virosomas,
liposomas, inmunoliposomas, policatión o lípido: ácidos nucleicos
conjugados, ADN desnudo, viriones artificiales, y captación de ADN
potenciada por agente. La lipofección se describe en, por ejemplo,
la patente de los EE.UU. número 5.049.386, patente de los EE.UU.
número 4.946.787; y patente de los EE.UU. número 4.897.355 y los
reactivos de la lipofección se venden comercialmente (por ejemplo,
Transfectam™ y Lipofectin ™). Lípidos catiónicos o neutros
adecuados para la lipofección de reconocimiento del receptor eficaz
de polinucleótidos incluyen los de Flegner, documento WO 91/17424,
documento WO 91/16024. Puede ser administración a células
(administración ex vivo) o a tejidos diana (administración
in vivo). La preparación de complejos lípido:ácido nucleico,
incluyendo liposomas diana tales como complejos inmunolípidos, se
conoce bien por el experto en la técnica (véase, por ejemplo,
Crystal, 1995; Blaese et al., 1995; Behr, 1994; Remy et
al., 1994; Gao y Huang, 1995; patentes de los EE.UU. números
4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728,
4.774.085, 4.837.028, y 4.946.787). El uso de sistemas basados en
virus de ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos se
aprovecha de los procedimientos sumamente evolucionados para
seleccionar como diana con un virus células específicas en el cuerpo
y transfiriendo la carga vírica al núcleo. Los vectores víricos
pueden administrarse directamente a los pacientes (in vivo) o
pueden utilizarse para tratar células in vitro y administrar
las células modificadas a los pacientes (ex vivo). Los
sistemas basados en virus convencionales para la administración de
ácidos nucleicos pueden incluir vectores retrovirales, lentivirus,
adenovirales, adeno-asociados y virus de herpes
simple para la transferencia génica. Los vectores víricos son
actualmente el método más eficaz y versátil de transferencia génica
en células y tejidos diana. La integración en el genoma huésped es
posible con los métodos de transferencia génica con retrovirus,
lentivirus, y virus adeno-asociados, a menudo dando
como resultado la expresión a largo plazo del transgen insertado.
Adicionalmente, se han observado eficacias de transducción altas en
muchos tipos diferentes de células y tejidos diana.
En casos en los que se prefiere la expresión
transitoria de ácidos nucleicos, se utilizan tradicionalmente
sistemas basados en adenovirus, incluyendo vectores adenovirales
deficientes en la replicación. Los vectores basados en adenovirus
son capaces de eficacia de transducción muy alta en muchos tipos de
células y no requieren la división celular. Con tales vectores, se
han obtenido altos títulos y niveles de expresión. Este vector
puede producirse en grandes cantidades en un sistema relativamente
simple. También se utilizan vectores de virus
adeno-asociados ("AAV",
"Adeno-associated virus"), incluyendo vectores
de virus adeno-asociados recombinantes para
transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la
producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para
procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo
(véase, por ejemplo, patente de los EE.UU. número 4.797.368;
documento WO 93/24641; Kotin, 1994; Muzyczka. La construcción de
vectores de AAV recombinantes se describe en varias publicaciones,
incluyendo la patente de los EE.UU. número 5.173.414; Hermonat
& Muzyczka, 1984; Samulski et al., 1989).
\newpage
Pueden administrarse vectores de terapia génica
in vivo mediante la administración a un paciente individual,
tradicionalmente mediante administración sistémica (por ejemplo,
infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, o
intracraneal) o aplicación tópica. Alternativamente, pueden
administrarse los vectores a células ex vivo, tales como
células extirpadas y cultivadas de un paciente individual (por
ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o
células madre hematopoyéticas de donante universal, seguido de la
reimplantanción de las células en un paciente, normalmente tras la
selección de las células que incorporaron el vector. Los expertos
en la técnica conocen bien la transfección celular ex vivo
para diagnósticos, investigación, o terapia génica (por ejemplo,
mediante nueva infusión de las células transfectadas en el organismo
huésped). En una realización preferida, se aíslan las células a
partir del organismo sujeto, se transfectan con un ácido nucleico
(gen o ADNc), y se reinfunden de nuevo en el organismo sujeto (por
ejemplo, paciente). Los expertos en la técnica conocen bien
diversos tipos de células adecuados para la transfección ex
vivo (véase, por ejemplo, Freshney et al., 1994) y las
referencias citadas en dicho documento para una discusión de cómo
aislar y cultivar células de pacientes).
En una realización adicional la invención
proporciona un método para la producción o fabricación de un
medicamento o una composición farmacéutica que comprende ABIN o un
fragmento funcional o variante del mismo y posteriormente además
mezclar dicho polipéptido con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
La administración de dicha composición
farmacéutica puede ser por medio de administración oral, inhalada o
parenteral. Puede administrarse el principio activo sólo o
preferiblemente formulado como una composición farmacéutica. Una
dosis unitaria contendrá normalmente de 0,01 a 50 mg por ejemplo de
0,01 a 10 mg, o de 0,05 a 2 mg de compuesto o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo. Las dosis unitarias se
administrarán normalmente una vez o más de una vez al día, por
ejemplo, 2, 3, ó 4 veces al día, más normalmente de 1 a 3 veces al
día, de forma que la dosis diaria total está normalmente en el
intervalo de 0,0001 a 1 mg/kg; así una dosis diaria total adecuada
para un adulto de 70 kg es de 0,01 a 50 mg, por ejemplo de 0,01 a
10 mg o más normalmente de 0,05 a 10 mg. Se prefiere enormemente
que el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se
administre en la forma de composición de dosis unitaria, tal como
una composición de dosis unitaria oral, parenteral, o inhalada.
Tales composiciones se preparan mediante mezclado y se adaptan
adecuadamente para administración oral, inhalada o parenteral, y
como tal pueden estar en la forma de comprimidos, cápsulas,
preparaciones líquidas orales, polvos, gránulos, pastillas para
chupar, polvos reconstituibles, disoluciones inyectables y para
infusión o suspensiones o supositorios o aerosoles. Los comprimidos
y cápsulas para administración oral se presentan normalmente en una
dosis unitaria, y contienen excipientes convencionales tales como
agentes de unión, cargas, diluyentes, agentes de preparación de
comprimidos, lubricantes, desintegrantes, colorantes,
aromatizantes, y agentes humectantes. Los comprimidos pueden
recubrirse según métodos bien conocidos en la técnica. Cargas
adecuadas para la utilización incluyen celulosa, manitol, lactosa y
otros agentes similares. Desintegrantes adecuados incluyen almidón,
polivinilpirrolidona y derivados del almidón tales como almidón
glicolato de sodio. Lubricantes adecuados incluyen, por ejemplo,
estearato de magnesio. Agentes humectantes farmacéuticamente
aceptables adecuados incluyen sulfato de laurilo y sodio. Estas
composiciones orales sólidas pueden prepararse mediante métodos
convencionales de combinación, carga, compresión o similares. Pueden
utilizarse operaciones de combinación repetidas para distribuir el
principio activo por todas esas composiciones empleando grandes
cantidades de cargas. Tales operaciones son, por supuesto,
convencionales en la técnica. Las preparaciones líquidas orales
pueden estar en la forma de, por ejemplo, suspensiones,
disoluciones, emulsiones, jarabes, o elixires acuosos o aceitosos,
o pueden presentarse como un producto seco para reconstitución con
agua u otro vehículo adecuado antes de utilizarse. Tales
preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales
tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, jarabe,
metilcelulosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa,
gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas,
agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de
sorbitano, o acacia; vehículos no acuosos (que pueden incluir
aceites comestibles), por ejemplo, aceite de almendra, aceite de
coco fraccionado, ésteres aceitosos tales como ésteres de
glicerina, propilenglicol, o alcohol etílico; conservantes, por
ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o
ácido sórbico, y si se desea aromatizantes y agentes colorantes
convencionales. Las formulaciones orales también incluyen
formulaciones de liberación sostenida convencionales, tales como
gránulos o comprimidos que tienen un recubrimiento entérico.
Preferiblemente, las composiciones para inhalación se presentan para
la administración a las vías respiratorias como un rapé o un
aerosol o disolución para un nebulizador, o como un polvo microfino
para insuflación, solo o en combinación con un vehículo inerte tal
como lactosa. En tal caso las partículas de principio activo tienen
adecuadamente diámetros inferiores a 50 micras, preferiblemente
inferiores a 10 micras, por ejemplo entre 1 y 5 micras, tal como
entre 2 y 5 micras. Una dosis inhalada favorecida estará en el
intervalo de 0,05 a 2 mg, por ejemplo de 0,05 a 0,5 mg, de 0,1 a 1
mg o de 0,5 a 2 mg. Para administración parenteral, se preparan
formas de dosis unitarias fluidas que contienen un compuesto de la
presente invención y un vehículo estéril. El principio activo,
dependiendo del vehículo y de la concentración, puede o bien
suspenderse o bien disolverse. Las disoluciones parenterales se
preparan normalmente disolviendo el compuesto en un vehículo y
esterilizando con filtro antes de cargarlo en un vial o ampolla
adecuados y sellar. De manera ventajosa, también se disuelven en el
vehículo adyuvantes tales como un anestésico local, conservantes y
agentes de tamponamiento. Para aumentar la estabilidad, puede
congelarse la composición después de cargarse en el vial y eliminar
el agua a vacío. Las suspensiones parenterales se preparan
sustancialmente de la misma manera excepto que el compuesto se
suspende en el vehículo en vez de disolverse y se esteriliza
mediante exposición a óxido de etileno antes de suspenderlo en el
vehículo estéril. De manera ventajosa, se incluye un tensioactivo o
agente humectante en la composición para facilitar la distribución
uniforme del principio activo. Si es apropiado, pueden incluirse
pequeñas cantidades de broncodilatadores por ejemplo aminas
simpatomiméticas tales como isoprenalina, isoetarina, salbutamol,
fenilefrina y efedrina; derivados de la xantina tales como teofilina
y aminofilina y corticosteroides tales como prednisolona y
estimulantes suprarrenales tales como ACTH. Tal como es la práctica
común, las composiciones se acompañarán normalmente de
instrucciones de uso escritas o impresas en el tratamiento médico
concernido.
Con respecto a la transducción de la proteína
con ABIN o fragmentos de ABIN en las células diana, se ha mostrado
que una serie de dominios de proteína pequeños, denominados dominios
de transducción de proteína (DTP), atraviesan las membranas
biológicas eficazmente y con independencia de los transportadores o
receptores específicos, y provocan el suministro de péptidos y
proteínas a las células. Por ejemplo, la proteína TAT del virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH-1) puede
suministrar proteínas biológicamente activas in vivo. De
manera similar, la tercera hélice alfa del hemeodominio
Antennapedia, y la proteína VP22 del virus del herpes simple
provocan la administración a las células de péptidos y proteínas
unidas covalentemente (publicado en Ford et al., 2001). La
administración de proteínas basada en un vehículo de péptido
anfipático corto, Pep-1, es eficaz para administrar
una variedad de péptidos y proteínas en varias líneas celulares en
una forma biológica completamente activa, sin la necesidad de
acoplamiento covalente químico previo (Morris et al., 2001).
La capacidad de las proteínas VP22 quiméricas de extenderse a
partir de la célula transducida primaria a las células vecinas
puede mejorar los enfoques de la terapia génica (Zender et
al., 2002).
También puede administrarse la proteína a través
de los liposomas. Los liposomas se han usado como vehículos de
administración de fármacos y terapia génica y se ha demostrado que
tienen un potencial sustancial para seleccionar como diana tipos de
células específicas del hígado. Por tanto, la utilización de
liposomas puede mejorar la eficacia de selección de dianas en el
tratamiento de una variedad de enfermedades del hígado (Wu y Zerm,
1999).
Secuencia de nucleótidos tal como se
utiliza en el presente documento se refiere a una forma polimérica
de nucleótidos de cualquier longitud, o bien ribonucleótidos o bien
desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la
estructura primaria de la molécula. Por tanto, este término incluye
ADN de cadena doble y sencilla y ARN. También incluye tipos
conocidos de modificaciones, por ejemplo, metilación, sustituciones
de "caperuza" ("caps") de uno o más de los nucleótidos
que se producen de manera natural con un análogo.
Sobreexpresión tal como se utiliza en el presente documento
significa que las células transformadas producen más de la proteína
sobreexpresada que el control no transformado, cuando se mantienen
en las mismas condiciones. Preferiblemente, la sobreexpresión se
obtiene colocando la secuencia codificante en sentido de 3' de un
promotor constitutivo.
Secuencia codificante es una secuencia de
nucleótidos, que se transcribe en ARNm y/o se traduce en un
polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias
reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se
determinan por un codón de comienzo de traducción en el extremo
terminal 5' y un codón de terminación de traducción en el extremo
terminal 3'. Un secuencia codificante puede incluir, pero no se
limita a ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes o ADN
genómico, mientras que los intrones también pueden estar presentes
en ciertas circunstancias.
Proteína A20 (A20') se refiere a la
proteína dedo de zinc inducida por TNF, descrita por Dixit et
al., 1990; Opipari et al., 1990 y Tewari et al.,
1995, o un fragmento activo de la misma, tal como la parte que
contiene el dedo de zinc (aminoácidos 387-790 de
A20 humana, aminoácidos 369-775 de A20 murina).
Los términos proteína y polipéptido tal
como se usan en esta solicitud son intercambiables.
Polipéptido se refiere a un polímero de aminoácidos y no se
refiere a una longitud específica de la molécula. Este término
también incluye modificaciones tras la traducción del polipéptido,
tal como glucosilación, fosforilación, y acetilación.
Superrepresor I\kappaB
(I\kappaB^{s}) se refiere a una forma mutante no degradable de
I\kappaB-\alpha, con mutaciones S32A y S36A,
que bloquea NF-\kappaB en un complejo de proteína
citosólico, evitando su acción nuclear.
Se amplificó mediante PCR el ADNc de ABIN
murino, unido por el extremo N-terminal a un
E-tag, con cebadores directo
(5'cgggatccgccatgggtgcgccggtgcc3') e inverso
(5'ccccaagcttaaatgacccactgcagcc3') que contenían los sitios de
restricción para BamHI y HindIII, respectivamente. El fragmento
resultante se clonó en un vector lanzadera pLpA.CMV abierto BamHI y
HindIII (Gomez-Foix et al., 1992), y se
transfectó conjuntamente con pJM17 (McGrory et al., 1988)
mediante precipitación conjunta con ADN/fosfato de calcio en células
de la retina 911. La recombinación in vivo del vector
lanzadera que expresa el transgen ABIN con la estructura principal
de pJM17 dio como resultado la producción de un adenovirus con E1
eliminado deficiente en la replicación de tipo 5 (AdABIN). De modo
similar se generó un virus control (AdRR5), que no expresa un
transgen. Tras la recombinación, se aislaron las placas
recombinantes, se verificó el ADN extraído mediante PCR, y se
confirmó la expresión del transgen correcto por medio de
inmunotransferencia tipo Western. Se prepararon reservas de virus de
alto título en células HEK 293 y se purificaron mediante bandeo por
CsCI único. Se determinó el título de unidad infecciosa en un
ensayo en placa que se realizó sobre células HEK 293 confluentes con
diferentes diluciones de virus. Se contaron las placas de células
lisadas y se calcularon como unidades formadoras de placa (ufp) por
ml de reserva de virus.
Se probó AdABIN para determinar la expresión del
transgén en la línea celular de hepatoma BWTG3 (Szpirer y Szpirer,
1975). Se realizó la infección con AdABIN con una multiplicidad de
infección (mdi) de 100:1. Se incubaron las células con virus en un
volumen mínimo de medio libre de suero durante 2 horas, tras lo cual
se añadió medio que contenía suero para la incubación durante la
noche. Para controlar la expresión de ABIN, se lisaron las células
24 horas tras la infección y se analizaron mediante
SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos
anti-E-tag acoplados a HRP
(Amersham). La infección con AdABIN dio como resultado una clara
expresión de ABIN (datos no mostrados).
Se analizó la eficacia de la infección y el
patrón de expresión subcelular de ABIN mediante inmunofluorescencia.
En este caso, se dividieron las células y se sembraron sobre
cubreobjetos 24 horas tras la infección. Otras 24 horas después, se
lavaron las células, se fijaron con metanol al 100% a -20ºC durante
10 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al
1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras bloquear con BSA
al 0,5% durante 30 minutos, se incubaron las células con una
dilución de 1/3000 de anticuerpo monoclonal
anti-E-tag (Amersham) durante 90
minutos y con una dilución de 1/600 de anticuerpo de cabra
anti-IgG murina Alexa Fluor 488 (Molecular probes)
durante 90 minutos. Tras la tinción del núcleo con DAPI, se montaron
los cubreobjetos con Vectashield (Vector Laboratories), y se
analizaron con un microscopio Leica DM-IL. Esto
reveló que la eficacia de la infección fue de más del 90%, y que
ABIN estaba localizado exclusivamente en el citoplasma (datos no
mostrados).
Para analizar el efecto de ABIN sobre la
expresión genética dependiente de NF-\kappaB, se
transfectaron células con pNFconluc 24 horas tras la infección.
Éste último lleva un gen notificador de luciferasa que está
precedido por un promotor mínimo y tres sitios de unión a
NF-\kappaB (Kimura et al., 1986). Se
realizó la transfección usando el reactivo de transfección FuGene
según las instrucciones del fabricante (Roche biochemicals). Se usó
una razón de 6:1 de FuGene:ADN, y se preincubaron muestras de
FuGene:ADN durante 45 min antes de la adición a las células durante
24 horas en medio completo nuevo. Se sembraron las células sobre
placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 horas. Luego o bien
se dejaron las células sin tratar o bien se estimularon con 1000
UI/ml de TNF. Seis horas después, se lisaron todas las células en
100 \mul de tampón de lisis (Tris-fosfato 25 mM
pH 7,8, DTT 2 mM, CDTA 2 mM, glicerol al 10% y Triton
X-100 al 1%). Se analizaron las actividades de Luc
y Gal tal como se describió anteriormente (De Valck et al.,
1996). Se normalizaron los valores de Luc para los valores de Gal
con el fin de corregir las diferencias en la eficacia de
transfección (representado como luc/gal). La infección por AdABIN
evitó la expresión de la luciferasa dependiente de
NF-\kappaB en respuesta a TNF, mientras que la
infección por AdRR5 no tuvo ningún efecto.
La observación de que los niveles de I\kappaB
no cambiaron con la expresión de ABIN sugiere que ABIN no afecta a
la translocación nuclear del dímero NF-\kappaB.
Para analizar el efecto de ABIN sobre la presencia de
NF-\kappaB nuclear y la unión a sonda de ADN
específica de NF-\kappaB, se dejaron las células
sin tratar o se trataron durante 30 min con 1000 UI/ml de TNFm 24 h
tras la infección. Se lavaron las células dos veces con PBS, se
rascaron de la placa y se centrifugaron durante 30 seg a 12.000 x g
para recoger las células.
Para investigar si ABIN tenía un efecto sobre la
muerte celular mediada por TNF, se incubaron células BWTG3
infectadas con AdABIN, AdRR5 o con infección fingida con TNF, o
combinaciones de TNF y cicloheximida (CHX). Más específicamente, 24
horas tras la infección, se sembraron las células en placas de 96
pocillos con una densidad de 4 x 10^{4} células por pocillos.
Otras 24 horas después, se estimularon las células con diluciones
de TNFm sólo, o con una combinación de diluciones de TNF y una
concentración constante (10 \mug/ml) de CHX. Se observó
microscópicamente la muerte celular, y se cuantificó incubando las
células con bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) (Tada et al., 1986). Tras la disolución de los
cristales formados, se determinó la absorbancia en un lector
inmunológico (Biorad) a una longitud de onda de 595 nm, con 655 nm
como longitud de onda de referencia. TNF solo no tuvo ningún efecto
citotóxico sobre las células BWTG3, mientras que el tratamiento con
TNF + CHX provocó la muerte celular mediante apoptosis. La
infección con AdABIN sólo proporcionó una protección limitada
frente a dosis bajas de TNF, mientras que no había ninguna
protección con dosis superiores de TNF (figura 2).
Se probó AdABIN para determinar la expresión del
transgén y su actividad biológica in vivo inyectando ratones
C57BU6 con 2,5 x 10^{9} ufp de AdABIN dentro de la vena de la
cola. 1-6 días tras la infección, se sacrificaron
los ratones y se aislaron los hígados. Se cortó un tercio del hígado
en trozos pequeños y se homogeneizaron haciendo rebotar en tampón
de lisis (NP-40 al 1%, NaCl 200 mM,
Tris-Cl 10 mM pH 7,5, EDTA 5 mM, glicerol 10%)
complementado con aprotinina 0,1 mM, PMSF 1 mM, y glutatión 1 mM.
Tras 20 minutos de incubación en hielo, se centrifugaron los
homogeneizados durante 30 min a la velocidad máxima en una
centrífuga de mesa a 4ºC. Se determinaron las concentraciones de
proteína mediante análisis Bradford (Biorad). Se sometieron 50
\mug de proteína a SDS-PAGE e inmunotransferencia
con anticuerpo anti-E-tag acoplado a
HRP (Amersham). Se revelaron las señales mediante ECL (Amersham).
La expresión de ABIN fue máxima 3 días tras la infección y
permaneció alta durante al menos 6 días (datos no mostrados).
Para analizar el efecto de AdABIN sobre la
activación de NF-\kappaB inducida por TNF/GaIN en
el hígado, se probó el efecto de la infección por AdABIN sobre la
degradación de I\kappaB\alpha inducida por TNF/GaIN mediante
inmunotransferencia de tipo Western. En paralelo, también se
analizaron las mismas muestras en un ensayo de retardo en gel
("gel shift") para determinar la presencia de
NF-\kappaB activo en extractos de células
nucleares del hígado. Se inyectaron a los ratones (i.v.) 2,5 x
10^{9} ufp de Ad-ABIN,
Ad-I\kappaB^{s} (= superrepresor de I\kappaB),
o AdRR5 (= control de virus vacío), y se expusieron tras tres días
mediante inyección con una dosis letal de TNF (0,3 \mug)/GaIN (20
mg) diluida en PBS. El PBS como tal sirvió como control. En diversos
momentos tras el tratamiento con TNF/GaIN, se mataron los ratones y
se prepararon homogeneizados de hígado. Se analizó la expresión de
I\kappaB\alpha mediante SDS-PAGE e
inmunotransferencia con anticuerpo
anti-I\kappaB\alpha policlonal (Santa Cruz)
(figura 1, panel superior). I\kappaB\alpha estaba casi
completamente degradado tras 0,5 h de tratamiento con TNF/GaIN, y
reapareció tras 1,5 h. Esta reaparición se debe lo más
probablemente a la síntesis de novo de I\kappaB\alpha en
respuesta a TNF. Eran visibles señales de I\kappaB\alpha
fuertes en los ratones infectados con AdI\kappaBs, en los que la
expresión del transgén enmascaraba la expresión del gen endógeno.
De la manera más importante, en el caso de animales infectados con
AdABIN, la degradación de I\kappaB\alpha se retrasó fuertemente
comparado con ratones control de AdRR5. Estos resultados demuestran
que ABIN inhibe la activación de NF-\kappaB en el
hígado de ratones infectados con AdABIN. Se analizó adicionalmente
la activación de NF-\kappaB en un ensayo de
retardo en gel de extractos de células nucleares de hígado murino.
Se homogeneizaron trozos de hígado murino haciéndolos rebotar en 1
ml de tampón de dilatación (Hepes 10 mM pH 7,5, KCl 10 mM,
MgCl_{2} 1 mM, glicerol al 5%, EDTA 0,5 mM pH 7,5, EGTA 0,1 mM pH
7,5, Pefablock 2 mM, DTT 0,5 mM, aprotinina 0,15 UI/ml). Tras 15
min de incubación en hielo, se añadieron 65 \mul de una disolución
de NP-40 al 10%, seguido de centrifugación
velocidad máxima en una centrifugadora eppendorff durante 15 min.
Volvió a suspenderse el sedimento en 100 \mul de tampón de
extracción nuclear (Hepes 20 mM pH 7,5, NP-40 al
1%, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 400 mM, KCl 10 mM, glicerol al 20%, EDTA
0,5 mM pH 7,5, EGTA 0,1 mM pH 7,5, Pefabloc 2 mM, DTT 0,5 mM,
aprotinina 0,15 UI/ml). Tras la centrifugación durante 15 min a
velocidad máxima en una centrífuga eppendorff, se almacenaron los
sobrenadantes a -70 hasta su uso. Se incubaron 10 \mul de lisado
nuclear a temperatura ambiente durante 30 min con una sonda de ADN
específica de NF-\kappaB marcada con ^{32}P
(agctagaggggasctttccgagagg) en el siguiente tampón: Ficoll 400 al
4%, Hepes 20 mM pH 7,5, KCl 60 mM, DTT 2 mM, poli
d(I-C) 100 \mug/ml, BSA acetilado 1
mg/ml.
Entonces se hicieron pasar los extractos sobre
un gel de poliacrilamida nativo al 4%. Se visualizó la radiactividad
mediante exposición a películas de rayos X. Esto mostró que AdABIN
así como AdI\kappaB^{s} evitaban fuertemente la translocación
nuclear inducida por TNF/GaIN y la unión al ADN de
NF-\kappaB (figura 1, panel inferior). A partir
de esto, puede concluirse que la infección adenoviral con AdABIN o
AdI\kappaB\alpha inhibe la activación de
NF-\kappaB inducida por
NF-\kappaB TNF/GaIN en el hígado del ratón.
Para analizar el efecto de ABIN sobre la
letalidad inducida por TNF/GaIN, se inyectaron por vía intravenosa
(i.v.) a ratones C57BL/6 2,5 x 10^{9} ufp de AdABIN (n=8) o AdRR5
(n=9). Tres días después, todos los ratones recibieron una dosis
letal de TNF/GaIN. A cada hora, se midió la temperatura corporal y
se evaluó la letalidad. Los ratones control mostraron una caída
drástica de la temperatura corporal tan sólo 6 horas tras la
inyección (figura 3), mientras que los ratones que expresaban ABIN
mostraron una temperatura corporal normal a lo largo de todo el
experimento (analizados hasta 18 días tras la inyección). De manera
más importante, mientras que todos los ratones control murieron a
lo largo de un periodo de 36 horas, los ratones que expresaban ABIN
sobrevivieron y no mostraron ningún signo de enfermedad (figura
4).
Para analizar el efecto de ABIN sobre la
toxicidad hepática, se inyectó a los ratones AdABIN (n=5) o AdRR5
(n=5) tal como se describió anteriormente, seguido tras tres días de
inyección de una dosis letal de TNF/GaIN. En el momento en el que
los ratones AdRR5 mostraron una fuerte disminución de la temperatura
corporal, se sacrificaron los animales para estudios de histología
y bioquímica. Se recogió sangre de ratones AdRR5 y AdABIN, y se
prepararon los hígados para análisis adicionales. Se determinó la
concentración de alanina aminotransferasa (ALT) en la sangre tras
la inyección de TNF/GaIN usando un kit enzimático/colorimétrico
(Sigma), y sirvió como parámetro para la necrosis hepática (Reutter
et al., 1968). Se tomó sangre del plexo
retro-orbital con anestesia con éter ligera y se
dejó coagular durante 30 min a 3,7ºC y 1 h a 4ºC, seguido de
centrifugación a 16.000 x g. Se almacenó el suero a -20ºC. Los
niveles de ALT disminuyeron significativamente en ratones
infectados con AdABIN cuando se compararon con ratones control
(figura 5). Se analizaron la fragmentación de ADN y la activación
de caspasa como parámetros para la apoptosis. Se midió la
fragmentación de ADN mediante determinación inmunoquímica de
fragmentos de ADN complejados con histonas en una placa de
microtítulo (Salgame et al. 1997). Brevemente, se
recubrieron las placas con un Ab dirigido frente a la histona H2B.
Tras el bloqueo, se añadieron homogeneizados de hígado y se
administró un Ab de detección biotinilado específico para la
subpartícula de nucleosoma de las histonas H2A, H2B, y ADN. Se
realizó la detección con estreptavidina conjugada con fosfatasa
alcalina (Sanvertech, Boechout, Bélgica) y sustrato (Sigma). Se
ajustaron las señales obtenidas a partir de ratones tratados con
TNF/GaIN al 100%. Estos experimentos muestran que la fragmentación
de ADN inducida por TNF/GaIN se reduce significativamente en
animales infectados con AdABIN (figura 6). Se reveló la activación
de caspasa mediante hidrólisis de
Ac-DEVD-amc al incubar con extractos
de células hepáticas. Brevemente, se incubaron 30 \mug de
homogeneizado de hígado en 200 ul de tampón sistema libre de células
(Hepes 10 mM pH 7,5, manitol 220 mM, sacarosa 68 mM, NaCl 2 mM,
MgCl_{2} 2 mM, KH_{2}PO_{4} 2,5 mM, DTT 10 mM) en presencia
de 50 \muM de Ac-DEVD-amc (Peptide
Institute; Osaka, Japón), durante 60 min a 30 grados. Se monitorizó
la liberación de
7-amino-4-metilcumarina
(AMC) durante 60 min en un fluorómetro (CytoFluor; PerSeptive
Biosystems; Cambridge MA, EE.UU.) con una longitud de onda de
excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 409 nm.
Los datos se expresan como aumento de la fluorescencia en función
del tiempo (\DeltaF/min). La hidrólisis de
Ac-DEVD-AMC al incubar con
homogeneizados de hígado de los ratones tratados con TNF/GaIN se
redujo significativamente en animales infectados con AdABIN (figura
7). De manera similar, también se demostró la inhibición de la
activación de caspasa inducida por TNF/GaIN con la infección con
AdABIN mediante la inhibición de la maduración proteolítica de
caspasa-3, tal como se reveló mediante
SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos
policlonales específicos de caspasa-3 (figura
8).
Tal como se muestra mediante histología, la
hepatitis letal inducida por TNF/GaIN está asociada con una
destrucción de tejido total del tejido parenquimatoso, influjo de
eritrocitos (hemorragia) en el sitio de la sinusoide y apoptosis y
necrosis de los hepatocitos. Además, puede observarse un influjo
masivo de macrófagos y neutrófilos en el hígado. Los hígados de
ratones tratados previamente con AdABIN muestran una mejor
conservación de la integridad del tejido y casi nada de hemorragia.
En contraste con la protección completa frente a la letalidad
inducida por TNF/GaIN, muerte celular del hepatocito, y hemorragia,
la infiltración de glóbulos blancos sólo se redujo parcialmente en
la expresión in vivo de ABIN.
Tal como se mencionó anteriormente, la
inhibición general de la activación de NF-\kappaB
hepático puede conducir a efectos tanto beneficiosos como
perjudiciales. De hecho, la administración adenoviral de un
superrepresor de I\kappaB\alpha dominante no protege frente a
la letalidad inducida por TNF/GaIN. En el mismo experimento, la
administración adenoviral de ABIN protegió completamente a los
ratones (figura 9). En este momento, no puede facilitarse una
explicación clara para el efecto diferente de ABIN y
I\kappaB^{s}. Sin embargo, debe mencionarse que ABIN, al
contrario que I\kappaB\alpha, inhibe la activación de
NF-\kappaB aguas arriba del complejo IKK. Dado que
se han mostrado diferencias en la señalización de
NF-\kappaB específicas de los estímulos aguas
arriba del complejo IKK, no es improbable que la inhibición mediada
por ABIN de la expresión génica dependiente de
NF-\kappaB se limite a una selección de genes
sensibles a NF-\kappaB. Una posible inhibición
selectiva de este tipo de los genes dependientes de
NF-\kappaB puede desplazar un equilibrio entre las
proteínas de protección y sensibilización, lo que puede dar como
resultado un efecto protector neto de este inhibidor.
Alternativamente, no pueden excluirse los efectos independientes de
NF-\kappaB de ABIN en la protección frente a fallo
hepático inducido por TNF.
Fas es una molécula de superficie de la célula
que señaliza la apoptosis que activa la muerte celular con la unión
de un anticuerpo o ligando específico. El tratamiento de ratones con
un anticuerpo anti-Fas provoca un fallo hepático
fulminante debido a una apoptosis masiva (Ogasawara et al.,
1993). Al contrario que TNF/GaIN, anti-Fas no
conduce a la activación de NF-\kappaB y una
respuesta inflamatoria en el hígado, sino que más bien induce una
respuesta apoptótica directa. Para examinar la susceptibilidad de
ratones infectados con AdABIN a la letalidad mediada por
anti-Fas, se inyectó a los ratones AdRR5 o AdABIN
tal como se describió anteriormente, y tres días después se les
inyectaron (i.v.) 10 \mug de anti-Fas
(Pharmingen). Los ratones tratados previamente tanto con AdRR5 como
con AdABIN murieron en un plazo de 3-5 horas tras la
administración de anti-Fas (figura 10). Esto
demuestra que ABIN no influye significativamente en la ruta de
señalización de la apoptosis mediada por Fas. Para investigar
adicionalmente si la diferencia en la protección en el fallo
hepático inducido por TNF/GaIN frente al inducido por
anti-Fas se debe a una diferencia en la implicación
del receptor (receptor de TNF frente a Fas) o refleja una
diferencia en el papel de los efectos dependientes del gen y la
apoptosis, también se analizó el efecto de AdABIN sobre la
letalidad inducida por TNF en ratones sensibilizados con
actinomicina D. La actinomicina D bloquea la transcripción celular,
y sensibiliza a las células frente al efecto apoptótico directo de
TNF, sin una contribución de un componente inflamatorio. Por tanto,
se inyectó a los ratones AdRR5 o AdABIN tal como se describió
anteriormente, y tres días después se les inyectaron (i.v.) 0,3
\mug de TNF y 20 \mug de actinomicina D. Los ratones tratados
previamente tanto con AdRR5 como con AdABIN murieron en un plazo de
20-35 horas tras la administración de TNF/ActD
(figura 11). Tomados juntos, estos resultados sugieren que la
protección mediada por ABIN frente al fallo hepático inducido por
TNF/GaIN implica un acontecimiento dependiente de la
transcripción.
- Altschul, S.F., Madden, T.L.,
Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z.,
Miller, W. y Lipman, D.J. (1997) Nucleic
Acids Res 25, 3389-3402.
- Arvelo, M.B., Cooper, J.T.,
Longo, C., Daniel, S., Grey, S.T.,
Mahiou, J., Czismadia, E.,
Abu-Jawdeh, G., y Ferran, C.,
(2002) Hepatology 35, 535-543.
- Beg, A. A., Sha, W. C.,
Bronson, R. T., Ghosh, S., y Baltimore, D.
(1995) Nature 376, 167-170.
- Behr, J. P. (1994)
Bioconjugate Chem. 5, 382-389.
- Bellas, R. E., FitzGerald, M.
J., Fausto, N., y Sonenshein, G. E. (1997)
American Journal of Pathology 151,
891-896.
- Beyaert, R., Heyninck, K., y
Van Huffel, S. (2000) Biochem Pharmacol
60(8), 1143-1151.
- Bird, G., Sheron, N.,
Goka, A., Alexander, G., y Williams, R.
(1990) Ann Intern Med 112, 917-20.
- Blaese, R. M., Culver, K. M.,
Miller, A. D., Carter, C. S., Fleisher, T.,
Clerici, M., Shearer, G., Chang, L.,
Tolstoshev, P., et al. (1995) Cancer Gene
Ther. 2, 291-197.
- Chen, Q., y Cederbaum, A.
(1997) Molecular Pharmacology 52,
648-657.
- Crystal, (1995) Science
270, 404-410.
- Decker, K., y Keppler, D.
(1974) Rev. Physiol. Biochem. Phannacol. 71,
77-106.
- De Valck, D., Heyninck, K.,
Van Criekinge, W., Contreras, R., Beyaert, R.,
y Fiers, W. (1996) Febs Letters 384 (1),
61-64.
- Diehl, A., Yin, M.,
Fleckenstein, J., Yang, S., Lin, H.,
Brenner, D. A., Westwick, J., Bagby, G., y S,
N. (1994) Am J Physiol 267 (Gastrointest. Liver
Physiol. 30), G552-G561.
- Dixit V.M., Green, S.,
Sarma, V., Holzman, L.B., Wolf, F.W.,
O'Rourke, K., Ward, P.A., Prochownik, E.V. y
Marks, R.M. (1990) J Biol Chem 265,
2973-2978.
- Freshney et al., Culture of
Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3ª ed.
1994)
- Ford, K.G., Souberbielle, B.E.,
darling, D., y Farzanch, F. (2001) Gene
Ther. 8, 1-4.
- Gao, X. y Huang, L.
(1995) Gene Therapy 2, 710 - 722
- Gomez-Foix, A.,
Coats, W., Baque, S., Alam, T., Gerard,
R., y Newgard, C. (1992) Journal of Biological
Chemistry 267, 25129.
- González-Amaro, R.,
Garcia-Monzon, C.,
Garcia-Buey, L.,
Moreno-Otero, R., Alonso, J.,
Yague, E., Pivel, J., Lopez- Cabrera, M.,
Fernandez-Ruiz, E., y
Sanchez-Madrid, F. (1994) Journal
of Experimental Medicine 179, 841-848.
- Grove, J., Daly, A. K.,
Bassendine, M. F., y Day, C. (1997)
Hepatology 26, 143-146.
- Gupta, K., Ott, D., Hope,
T.J., Siliciano, R.F. y Boecke, J.D. (2000)
J Virol 74, 11811-11824.
- Hermonat, y Muzyczka,
(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,
6466-6470.
- Heyninck, K., De Valck, D.,
Vanden Berghe, W., Van Criekinge, W.,
Contreras, R., Fiers, W., Haegeman, G., y
Beyaert, R. (1999) J Cell Biol 145(7),
1471-1482.
- limuro, Y., Nishiura, T.,
Hellerbrand, C., Behms, K. E., Schoonoven, R.,
Grisham, J. W., y Brenner, D. A. (1998)
Journal of Clinical Investigation 101,
802-811.
- Kimura, A., Israel, A., Le
Bail, O., y Kourilsky, P. (1986) Cell 44,
261.
- Kotin, R. M. (1994) Human
Gene Therapy 5, 793-801.
- Larrea, E., Garcia, N.,
Qian, C., Civeira, M., y Prieto, J.
(1996) Hepatology 23, 210-217.
- Lee, E. G., Boone, D. L.,
Chai, S., Libby, S. L., Chien, M.,
Lodolce, J. P., y Ma, A. (2000) Science
289, 2350-2354.
- Leist, M., Gantner, F.,
Jilg, S., y Wendel, A. (1995) Journal of
Immunology 154, 1307-1316.
- Majumder, M., Ghosh, A.K.,
Steele, R., Zhou, X.Y., Philips, N.J.,
Ray, R., y Ray, R.B. (2002) Virology
294, 94-105.
- McClain, C. (1991)
Hepatology 14, 394-396.
- McGrory, W., Bautista, D., y
Graham, F. (1988) Virology 163, 614.
- Morris, M.C., Depolier, J.,
Mery, J., Heitz, F., Divita, G. (2001)
Nat. Biotechnol. 19, 1173-1176.
- Muto, Y.,
Nouri-Aria, K., Meager, A.,
Alexander, G., Eddleston, A., y Williams, R.
(1988) Lancet 2, 72-74.
- Ogasawara, J.,
Watanabe-Fukunaga, R., Adachi, M.,
Matsuzawa, A., Kasugai, T., Kitamura, Y.,
Itoh, N., Suda, T., y Nagata, S. (1993)
Nature 364, 806-809.
- Opipari, A.W., Boguski, M.S. y
Dixit, V.M. (1990) J Biol Chem 265,
14705-14708.
- Park, K.-J., Cho, S.-H.,
Lee, S.Y., Hwang, S.B., y Lai, M.M.C.
(2002) J. Biol. Chem. 277,
13122-13128.
- Ray, R. B., Meyer, K.,
Steele, R., Shrivastava, A., Aggarwal, B. B., y
Ray, R. (1998) Journal of Biological Chemistry
273, 2256-2259.
- Remy, J.S., Seerlin, C.,
Vierling, P. y Behr, J. P. (1994)
Bioconjugate Chem. 5, 647-654.
- Reutter, W., Lesch, R.,
Keppler, D., y Decker, K. (1968)
Naturwissenschaften 55, 497.
- Salgame, P., Varadhachary, A.
S., Primiano, L. L., Fincke, J. E., Muller, S.,
y Monestier, M. (1997) Nucleic Acids Research
25, 680.
- Samulski, R. J., Chang, L. S. y
Shenk, T. (1989) J. Virol. 63,
3822-3828.
- Szpirer, C., y Szpirer, J.
(1975) Differentiation 4(2),
85-91.
- Tada, H., Shiho, O.,
Kuroshima, K., Koyama, M., y Tsukamoto, K.
(1986) J Immunol Methods 6,
157-165.
- Tewari, M., Wolf, F.W.,
Seldin, M.F., O'Shea, K.S., Dixit, V.M. y
Turka, L.A. (1995) J Immunol 154,
1699-1706.
- Tiegs, G., Wolter, M., y
Wendel, A. (1989) Biochem Pharmacol 38,
627-631.
- Van Huffel, S., Delaei, F.,
Heyninck, K., De Valck, D., y Beyaert, R.
(2001) Journal of Biological Chemistry 276,
30216-30223.
- Van Molle, W., Denecker, G.,
Rodriguez, I., Brouckaert, P., Vandenabeele,
P., y Libert, C. (1999) Journal of Immunology
163, 5235-5241.
- Wu, J, y Zern, M.A.
(1999) Front. Biosci. 4,
D520-D527.
- Xu, Y., Bialik, S.,
Jones, B. E., limuro, Y., Kitsis, R.,
Srinivasan, A., Brenner, D. A., y Czaja, M.
(1998) American Journal of Physiology 275,
C1058-C1066.
- Zender, L., Kuhnel, F.,
Kock, R., Manns, M., Kubicka, S. (2002)
Cancer Gene Ther. 9, 489-496.
<110> Vlaams Interuniversitair Instituut
voor Biotechnol
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Protección frente a hepatitis
mediada por ABIN
\vskip0.400000\baselineskip
<130> RBE/AB2/V091
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP01202414.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-06-22
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2812
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (117)..(2060)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (276)..(2060)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (81)..252)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 647
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de aminoácidos consenso 1 (documento
WO99/57133)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Xaa Xaa Lys Glu Ile Xaa Arg Leu Asn Xaa
Xaa Leu Glu Glu}
\sac{Xaa Xaa Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de aminoácidos consenso 2 (documento
WO99/57133)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Xaa Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp
Phe Xaa Xaa Glu Arg}
\sac{Xaa Asp Arg Glu Arg}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> -
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador directo: amplificación de ADNc de ABIN
murino
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatccgc catgggtgcg ccggtgcc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador inverso: amplificación de ADNc de ABIN
murino
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccaagctt aaatgaccca ctgcagcc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda de ADN marcada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctagaggg gasctttccg agagg
\hfill25
Claims (9)
1. Uso de ABIN, o una variante o
fragmento funcional del mismo, para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF.
2. Uso según la reivindicación 1, en el
que dicho ABIN comprende la secuencia de aminoácidos consenso
representada en la SEQ ID Nº 4 y/o SEQ ID Nº 5.
3. Uso según la reivindicación 1, en el
que dicho fragmento funcional es un fragmento que comprende la
secuencia de aminoácidos tal como se representa en la SEQ ID Nº 3 y
que interacciona con la proteína A20.
4. Uso según la reivindicación 1, en el
que dicho fragmento funcional es un fragmento que comprende los
aminoácidos 420-647 de la SEQ ID Nº 2 y que
interacciona con la proteína A20.
5. Uso según la reivindicación 1, en el
que dicha variante se selecciona del grupo que consiste en la
proteína alfa Naf1, proteína beta Naf1 y la proteína lanzadera
nuclear asociada al virión.
6. Uso de una secuencia de nucleótidos
que codifica ABIN, o una variante o fragmento funcional del mismo
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fallo
hepático inducido por TNF.
7. Uso de la fitohemaglutinina (PHA)
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fallo
hepático inducido por TNF.
8. Uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho fallo hepático inducido por
TNF es hepatitis vírica, hepatitis fulminante y/o enfermedad
hepática alcohólica.
9. Uso según la reivindicación 6, en el
que dicho medicamento es un vector de terapia génica.
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|---|---|---|---|
| EP01202414 | 2001-06-22 | ||
| EP01202414 | 2001-06-22 |
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| WO2004101745A2 (en) * | 2003-05-08 | 2004-11-25 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | NOVEL REGULATORY MECHANISMS OF NF-kappaB |
| KR20060090714A (ko) | 2003-09-24 | 2006-08-14 | 앵스띠뛰 파스퇴르 | Ｎｅｍｏ 올리고머화를 차단하기 위한 펩티드에 의한ｎｆ―ｋａｐｐａｂ 활성의 선택적 억제 |
| WO2006029981A1 (en) * | 2004-09-13 | 2006-03-23 | Vib Vzw | Abin-mediated protection against lung inflammatory disease |
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Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4235871A (en) * | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
| US4186183A (en) * | 1978-03-29 | 1980-01-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis |
| US4261975A (en) * | 1979-09-19 | 1981-04-14 | Merck & Co., Inc. | Viral liposome particle |
| US4485054A (en) * | 1982-10-04 | 1984-11-27 | Lipoderm Pharmaceuticals Limited | Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV) |
| US4501728A (en) * | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
| US4946787A (en) * | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US5049386A (en) * | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4897355A (en) * | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US4774085A (en) * | 1985-07-09 | 1988-09-27 | 501 Board of Regents, Univ. of Texas | Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators |
| US4837028A (en) * | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| WO1991017424A1 (en) | 1990-05-03 | 1991-11-14 | Vical, Inc. | Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes |
| US5173414A (en) * | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
| UA71889C2 (uk) | 1996-04-02 | 2005-01-17 | Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд. | Модулятори зв'язаного з рецептором tnf фактора (traf), їх одержання та застосування |
| WO1999057133A2 (en) * | 1998-05-06 | 1999-11-11 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Inhibitors of nf-kb activation |
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