ES2269736T3 - Proteccion frente a la hepatitis mediada por abin. - Google Patents

Abstract

Uso de ABIN, o una variante o fragmento funcional del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF.

Description

Protección frente a la hepatitis mediada por ABIN.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso del inhibidor de unión A20 de activación a NF-\kappaB (ABIN) para proteger contra el fallo hepático inducido por TNF (tumor necrosis factor - factor de necrosis tumoral), tal como la hepatitis vírica y la enfermedad hepática alcohólica. Más particularmente, se refiere a la prevención de los efectos tóxicos de dichas enfermedades, incluyendo la mortalidad, mediante la sobreexpresión de ABIN.

Antecedentes de la invención

El fallo hepático agudo es un síndrome clínico que resulta de la necrosis masiva y apoptosis de las células hepáticas que lleva a encefalopatía hepática y alteración grave de la función hepática. Está causada por diferentes tipos de enfermedades, tales como hepatitis vírica (A, B, C,…), fármacos, intoxicación, hepatitis autoinmunitaria, etc. Muchos estudios han mostrado que el TNF desempeña un papel central en la enfermedad del hígado. El TNF se produce principalmente macrófagos activados pero también se produce en cantidades más pequeñas por otros varios tipos de células. El TNF ejerce una variedad de efectos sobre diferentes tipos de células y está implicado como un mediador importante en diversos estados fisiológicos y patofisiológicos. Además, ha quedado claro que el TNF es un mediador importante de apoptosis (muerte celular programada). El TNF se identificó originalmente por su capacidad para inducir necrosis hemorrágica de tumores en ratones. Han fracasado los intentos de utilizar el TNF para tratamiento anti-cáncer sistémico debido a la aparición de efectos secundarios graves antes de poder alcanzar la dosis terapéutica. Uno de los efectos secundarios del tratamiento con TNF fue un aumento de los niveles séricos de transaminasas y niveles de bilirrubina, que indica un efecto citotóxico directo del TNF sobre hepatocitos humanos. Estudios posteriores han mostrado que el TNF puede estar implicado en hepatitis vírica, enfermedad hepática alcohólica, y fallo hepático fulminante (Muto et al., 1988; Bird et al., 1990; González-Amaro et al., 1994; Diehl et al., 1994; Larrea et al., 1996). Los niveles séricos de TNF aumentan claramente en pacientes con hepatitis fulminante (Muto et al., 1988). Además, se encontró que los niveles séricos de TNF eran significativamente superiores en los pacientes que murieron que en los pacientes que sobrevivieron (Bird et al., 1990).

Se ha sugerido un papel del TNF en la patogénesis de la infección vírica de la hepatitis crónica B y C. Ambos virus inducen la expresión de TNF en líneas celulares de hígado humano y hematoma humano (González-Amaro et al., 1994). Los pacientes con hepatitis B crónica tienen niveles de TNF en plasma elevados, y sus células mononucleares de sangre periférica muestran una producción intensificada de TNF in vitro. Además, en pacientes infectados con hepatitis B crónica que se someten a un tratamiento con interferón, se observó un aumento masivo de la producción espontánea de TNF en células mononucleares sanguíneas en el momento de la seroconversión antígena exitosa (Diehl et al., 1994), que sugiere que los niveles de TNF aumentados pueden estar implicados en el aclaramiento del virus de hepatitis B. Además, los niveles séricos de TNF-R1 y TNF-R2 solubles están significativamente elevados en la infección de hepatitis B crónica. Los niveles séricos de TNF-R2 soluble se correlacionan estrechamente con el alcance de la inflamación y muerte de hepatocitos en el hígado. Durante el tratamiento con interferón, la respuesta y el aumento de transaminasas se asocian con un aumento de los niveles séricos de TNF-R2 soluble. Para pacientes con hepatitis C, el tratamiento con interferón aclara el virus y reduce los niveles de TNF hasta normales en pacientes que responden (Larrea et al., 1996). De manera interesante, los niveles de TNF previos al tratamiento eran superiores en pacientes que no responden comparado con pacientes que responden (Larrea et al., 1996). Las proteínas de la hepatitis C interaccionan con el receptor de TNF, aunque no está claro si esta interacción promueve o previene la apoptosis (Ray et al., 1998). Recientemente, se ha mostrado una interacción entre la proteína NS5A del virus de la hepatitis C y las proteínas TRADD y TRAF2 asociadas al receptor de TNF (Majumder et al., 2002; Park et al., 2002). Park y sus colaboradores mostraron que la NS5A alteraba la apoptosis hepática mediada por TNF previniendo la asociación entre TRADD y FADD. Además, ambos grupos también mostraron que la NS5A previene la activación de NF-\kappaB mediada por TRADD y TRAF2.

Los niveles séricos de TNF aumentan en pacientes con hepatitis alcohólica, y los niveles se correlacionan inversamente con la supervivencia del paciente. Las concentraciones de TNF eran significativamente superiores en pacientes que no sobrevivieron a un episodio de hepatitis alcohólica aguda (Bird et al., 1990).

Los monocitos aislados a partir de pacientes con hepatitis alcohólica producían espontáneamente cantidades superiores de TNF comparado con controles sanos. Los monocitos derivados a partir de pacientes con hepatitis alcohólica también producían significativamente más TNF en respuesta al LPS que los monocitos normales. Se han desarrollado varias hipótesis para explicar el aumento de los niveles de TNF en pacientes con exposición al etanol crónica. El consumo de etanol crónico aumenta la permeabilidad del intestino a productos bacterianos tales como LPS, induciendo potencialmente la producción de TNF en macrófagos (McClain, 1991). Además, estudios que investigan el polimorfismo promotor en pacientes con esteatohepatitis alcohólica indican que los pacientes con esteatohepatitis alcohólica tenían una mutación en el promotor de TNF que aumenta su actividad (Grove et al., 1997). Por tanto los factores genéticos pueden estar implicados en el aumento de la producción de TNF en pacientes con hepatitis alcohólica.

Se ha estudiado el papel del TNF en lesiones hepáticas en varios modelos animales. Utilizando anticuerpos anti-TNF neutralizantes o ratones "deficientes" ("knockout") para TNF, TNF-R1, o TNF-R2, se ha vuelto evidente que el TNF activa la apoptosis y/o necrosis de los hepatocitos in vivo. En diferentes modelos animales de lesiones hepáticas, el TNF desempeña un papel central o adicional en la patogénesis de lesiones hepáticas agudas. En el presente documento se utiliza el modelo TNF/Galactosamina (GAIN). En este modelo, se administra TNF en combinación con D-(+)-galactosamina (GaIN), una hepatotoxina, que bloquea selectivamente la transcripción en los hepatocitos agotando los nucleótidos uridina (Dekker y Keppler, 1974), induciendo la mortalidad, activación de caspasas y posterior apoptosis de los hepatocitos (Leist et al., 1995; Van Molle et al., 1999; Tiegs et al., 1989). Los ratones deficientes para TNF-R1 son resistentes al tratamiento con TNF/GaIN, demostrando el papel esencial del TNF-R1 en este modelo de apoptosis (Leist et al., 1995). El efecto de sensibilización de GaIN sugiere que el bloque transcripcional inducido por GaIN inhibe directamente la síntesis de las proteínas antiapoptóticas. Recientemente, se ha mostrado que el factor de transcripción de NF-\kappaB regula la expresión de varias proteínas anti-apoptóticas.

El NF-\kappaB es un factor de transcripción esencial que se expresa de manera omnipresente en todos los tipos de células y cuya actividad se modula por un amplio intervalo de inductores, incluyendo las citocinas y productos bacterianos y víricos. Muchos de los genes sensibles al NF-\kappaB desempeñan un papel clave en la regulación de las respuestas inflamatorias e inmunitarias. La desreguralización de la actividad del NF-\kappaB se observa a menudo en varias enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, asma y enfermedad inflamatoria del intestino, así como enfermedades agudas tales como el choque septicémico. Además, el NF-\kappaB sirve para proteger contra la apoptosis y ayuda al progreso del ciclo celular. El primer indicio de que la activación del NF-\kappaB puede modular las respuestas de los hepatocitos con relación a las lesiones hepáticas fue el hallazgo de que los ratones deficientes que carecen de la subunidad p65/Rel-A del NF-\kappaB no eran viables debido a la apoptosis de los hepatocitos masiva durante la embriogénesis (Beg et al., 1995). Informes recientes de varios laboratorios han demostrado ahora que la activación del NF-\kappaB regula la proliferación y apoptosis de hepatocitos in vivo e in vitro. En ratas sometidas a hepatectomía parcial, la inhibición de la activación del NF-\kappaB alteró la posterior regeneración del hígado y activó la apoptosis de los hepatocitos (limuro et al., 1998). Estos hallazgos sugieren un papel crítico de la activación del NF-\kappaB en hepatocitos tras un estimulo mitogénico, aunque no está claro el mecanismo por el cual la inhibición de la activación del NF-\kappaB bloquea bloqueó la proliferación. La apoptosis puede haber resultado a partir de un bloqueo del ciclo celular o a partir de la sensibilidad al TNF producido tras la hepatectomía parcial. Un papel esencial de la activación del NF-\kappaB durante la proliferación de los hepatocitos también se apoya en el hallazgo de que la inhibición de la actividad del NF-\kappaB dio como resultado la apoptosis en una línea celular de hepatocitos murinos que crecían exponencialmente (Bellas et al., 1997). Sin embargo, otros estudios sobre cultivos de hepatocitos de rata confluentes han demostrado que la inhibición del NF-\kappaB por sí misma no dio como resultado la muerte celular (Xu et al.; 1998). En estas células, la inhibición del NF-\kappaB convirtió la respuesta hepatocelular al estímulo mitogénico del TNF de la proliferación a una de apoptosis (Xu et al., 1998). El mecanismo por el cual la inactivación del NF-\kappaB activó provocó la apoptosis inducida por TNF en estos estudios implicó la activación de la cascada de caspasa, y pudo prevenirse la muerte celular mediante la inhibición de la caspasa o NO (Xu et al., 1998).

El(los) producto(s) génico(s) dependiente(s) del NF-\kappaB que protege(n) los hepatocitos contra lesiones inducidas por TNF permanece(n) sin identificarse. Genes candidatos posibles son iNOS e interleucina-6, dado que se regulan por NF-\kappaB y sus productos génicos pueden tener efectos hepatoprotectores. También falta por determinar si la activación de NF-\kappaB inhibe la hepatotoxicidad de agentes perjudiciales diferentes del TNF. En la línea celular de hepatoma Hep G2, el tratamiento con una concentración no tóxica del generador superóxido menadiona protegió contra dosis tóxicas posteriores de menadiona o H_{2}O_{2} mediante un mecanismo dependiente de NF-\kappaB (Chen y Cederbaum, 1997). Sin embargo, estudios en una línea celular de hepatocitos de rata demostraron que, aunque el H_{2}O_{2} y el cobre indujeron la activación del NF-\kappaB y causaron la apoptosis en concentraciones tóxicas, la inhibición de la actividad del NF-\kappaB no sensibilizó las células frente a la muerte a partir de H_{2}O_{2} o cobre (Xu et al., 1998). La activación del NF-\kappaB puede estimular por tanto un mecanismo de defensa específico para la ruta de la muerte por el TNF.

La posibilidad de que la activación del NF-\kappaB en hepatocitos sea protectora tras lesiones hepáticas apunta a la complejidad de acontecimientos tras la activación global del NF-\kappaB en todos los tipos de células en el hígado. Tras un estímulo tóxico, se sabe que la activación del NF-\kappaB en macrófagos hepáticos da como resultado la producción de productos perjudiciales tales como citocinas y productos intermedios de oxígeno reactivos. Por tanto la inhibición de la activación del NF-\kappaB hepático se vio como un tratamiento potencial para las lesiones hepáticas. Ahora parece que la señalización del NF-\kappaB representa un objetivo terapéutico problemático, ya que la inhibición general de la activación del NF-\kappaB hepático puede llevar a efectos tanto beneficiosos como perjudiciales.

Recientemente, se ha producido un progreso considerable entendiendo los detalles de las rutas de señalización que regulan y median la activación del NF-\kappaB en respuesta al TNF e IL-1. Estas citocinas actúan uniéndose a receptores de superficie celular específicos, que a su vez inician el reclutamiento de varias proteínas adaptadoras específicas, y la activación de un complejo de cinasa que fosforila el inhibidor del NF-\kappaB I\kappaB. Éste último retiene al NF-\kappaB en el citoplasma en una forma dimérica inactiva. Una vez fosforilado, el I\kappaB se marca para la ubiquitinación y posterior degradación por el proteasoma, permitiendo la translocación nuclear del NF-\kappaB. Aunque se han estudiado bien miembros de la familia del I\kappaB como inhibidores directos del NF-\kappaB, se han notificado varias otras proteínas que regulan negativamente la expresión génica dependiente del NF-\kappaB. Se ha mostrado previamente que la proteína "dedo de zinc" A20 es un potente inhibidor de la activación NF-\kappaB en respuesta al TNF, IL-1, LPS y CD-40 (publicado en Beyaert et al., 2000). Además, A20 también ejerce una función anti-apoptótica en varias líneas celulares. La A20 solo se expresa con la activación del NF-\kappaB, y está implicada en la regulación de respuesta negativa de la activación del NF-\kappaB. Recientemente se mostró que los ratones deficientes en A20 son defectuosos en la terminación de la activación del NF-\kappaB, llevando a respuestas inflamatorias fuertes y caquexia (Lee et al., 2000). Los mecanismos subyacentes responsables de la inhibición de la expresión génica dependiente del NF-\kappaB por la A20 todavía no están claros. La A20 interacciona con el complejo de cinasa I\kappaB, así como con TRAF2 y TRAF6, que son parte de la cascada de activación de la cinasa I\kappaB iniciada por el TNF e IL-1/LPS, respectivamente. Además, recientemente se aislaron tres proteínas de unión A20 novedosas (ABIN, ABIN-2 y ABIN-3). Con sobreexpresión en líneas celulares, se mostró que estas proteínas inhiben la expresión génica dependiente del NF-\kappaB en respuesta al TNF o IL-1 (Beyaert et al., 2000; Heyninck et al., 1999; Van Huffel et al., 2001, Van Huffel et al., no publicado; documento AJ320534).

La presente invención se refiere al sorprendente hallazgo de que la sobreexpresión de ABIN previene la hepatitis letal inducida por TNF en ratones.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Efecto del AdABIN sobre la degradación estimulada por TNF/GaIN de I\kappaB (panel superior) y unión al ADN del NF-\kappaB (panel inferior) in vivo. Se inyectaron (i.v.) a los ratones 2,5 x 10^{9} ufp de Ad-ABIN, Ad-I\kappaB^{s} (= superrepresor de I\kappaB), o AdRR5 (= control de virus vacío), y tres días después se expusieron mediante inyección a una dosis letal de TNF (0,3 \mug)/GaIN (20 mg) diluidos en PBS. PBS como tal sirvió de control. A diferentes tiempos después del tratamiento con TNF/GaIN, se mató a los ratones y se prepararon homogeneizados de hígado. Se analizó la expresión de I\kappaB\alpha mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-I\kappaB\alpha policlonal (panel superior). Se analizó la unión al ADN del NF-\kappaB incubando 10 \mug de extracto nuclear con sondas radiomarcadas y se corrió en un gel natural. Se reveló la unión del NF-\kappaB a la sonda de ADN mediante exposición en una película de rayos X (panel inferior).

Figura 2: Efecto del AdABIN sobre la muerte celular mediada por TNF in vitro. Se cultivaron células BWTG3 infectadas con AdABIN, AdRR5 o con infección fingida en placas de 96 pocillos y se estimularon con una disolución en serie de TNFm en ausencia (superior) o presencia de CHX (inferior) durante 8 horas. Se analizó la muerte celular con incubación con MTT.

Figura 3: Efecto del AdABIN sobre la caída de la temperatura corporal inducida por TNF/GaIN en ratones. Se inyectaron (i.v.) a los ratones 2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n = 8) o AdRR5 (=control) (n=9) y tres días después se expusieron con 0,3 \mug de TNF + 20 mg de GAIN. Se midió la temperatura (ºC) cada hora hasta las 18 horas tras la exposición.

Figura 4: Efecto del AdABIN sobre la mortalidad inducida por TNF/GaIN. Se inyectaron (i.v.) a los ratones 2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n = 8) o AdRR5 (=control) (n=9) y 3 días después se expusieron con 0,3 \mug de TNF + 20 mg de GAIN. Se midió la mortalidad durante un periodo de 72 h (no se produjeron más muertes).

Figura 5: Efecto del AdABIN sobre la liberación en suero de la alanina aminotransferasa inducida por TNF/GaIN. Los ratones infectados con AdABIN o AdRR5, expuestos con una dosis letal de TNF/GaIN se sangraron 8 horas tras la inyección. Se preparó el suero y se midieron los valores de ALT séricos (en U/l).

Figura 6: Efecto del AdABIN sobre la fragmentación del ADN inducida por el TNF/GaIN en el hígado. Se aislaron los hígados de ratones infectados con AdABIN o AdRR5 8 horas después de una exposición con una dosis letal de TNF/GaIN. Se midió la fragmentación del ADN mediante ELISA, y se expresó como % de ratones control (AdRR5).

Figura 7: Efecto de AdABIN sobre la actividad de la caspasa inducida por TNF/GaIN en homogeneizados de hígado. Se trataron ratones infectados con AdABIN o AdRR5 (n=5 cada uno) con TNF + GaiN durante 8 horas. Se sometieron a prueba 30 \mug de homogeneizado de hígado para determinar su actividad proteolítica en Ac-DEVD.AMC. Se expresó la actividad proteolítica como el aumento de fluorescencia de AMC en función del tiempo (\DeltaF/min).

Figura 8: Efecto del AdABIN sobre la escisión de la caspasa-3 inducida por TNF/GaIN en homogeneizados de hígado. Se dejaron sin tratar (n=4) o se inyectaron (n=5) ratones infectados con AdABIN o AdRR5, con TNF + GAIN durante 8 horas. Se prepararon homogeneizados de hígado, se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE al 15%, y se realizó inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-caspasa-3 policlonal. La pro-caspasa-3 inactiva así como la subunidad de p20 de la caspasa-3 que se libera proteolíticamente se indican mediante una flecha.

Figura 9: comparación del AdABIN y AdI\kappaBs sobre la mortalidad inducida por TNF/GaIN. Se inyectaron (i.v.) a ratones 2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n=5), AdI\kappaBs (n=5) o AdRR5 (=control) (n=9) y 3 días después se expusieron con 0,3 \mug de TNF + 20 mg de GaIN. Se midió la mortalidad a lo largo de un periodo de 7 días.

Figura 10: efecto del AdABIN sobre la mortalidad inducida por anti-Fas. Se inyectaron (i.v.) a ratones 2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n = 3) o AdRR5 (=control) (n=3) y 3 días después se expusieron con 10 \mug de anti-Fas. Se midió la mortalidad sobre un periodo de 5 horas.

Figura 11: efecto del AdABIN sobre la mortalidad inducida por TNF/ActD. Se inyectaron (i.v.) a ratones 2,5.10^{9} ufp de AdABIN (n = 5) o AdRR5 (=control) (n=5) y 3 días después se expusieron con 0,3 \mug TNF + 20 \mug de ActD (actinomicina D). Se midió la mortalidad a lo largo de un periodo de 35 horas.

Descripción detallada de la invención

Un primer aspecto de la invención es el uso de ABIN, tal como se representa en la SEQ ID Nº 2, o un fragmento o variante funcional de la misma para la preparación de un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF. El término "ABIN" se refiere a ABIN, ABIN-2 y ABIN-3 tal como se describe en Beyaert et al., 2000; Heyninck et al., 1999; Van Huffel et al., 2001, Van Huffel et al. (no publicado; documento AJ320534) y el documento WO 99/57133. Más específicamente, el término ABIN se refiere a cualquier polipéptido que comprende la(s) secuencia(s) de aminoácidos consenso tal como se representa(n) en la SEQ ID Nº 4 y/o SEQ ID Nº 5 que también se describen en el documento WO 99/57133 que se incorpora en el presente documento como referencia. Un segundo aspecto de la invención es el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica para ABIN, tal como se representa en la SEQ ID Nº 1, o para un fragmento o variante funcional de la misma, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF. Un fragmento funcional del ABIN es un polipéptido que todavía puede interaccionar con la proteína A20 y/o puede modular la activación del NF-\kappaB. Preferiblemente, dicha modulación es una inhibición de la activación del NF-\kappaB. Fragmentos funcionales son, como ejemplos no limitativos, fragmentos que comprenden al menos los aminoácidos 420-647 de la SEQ ID Nº 2, preferiblemente al menos los aminoácidos 390-647, más preferiblemente al menos 54-647 (SEQ ID Nº 3). Preferencialmente dicho fragmento consiste esencialmente en al menos los aminoácidos 420-647 de la SEQ ID Nº 2, preferiblemente al menos los aminoácidos 390-647, más preferiblemente al menos 54-647 (SEQ ID Nº 3). Las variantes son polipéptidos con al menos el 65% de identidad a nivel de aminoácidos, preferiblemente el 70% de identidad, tal como se mide mediante BLAST (Altschul et al., 1997). Las variantes tienen características comunes, tales como la actividad biológica, reactividad inmunológica, conformación etc. Como ejemplos no limitativos, se consideran como variantes, proteína alfa Naf1 (documento AJ011895), proteína beta Naf1 (documento AJ011896) y la proteína lanzadera nuclear asociada al virión (documento AY012155).

Un aspecto adicional es el uso de la fitohemaglutinina (PHA), un compuesto que induce ABIN (Gupta et al., 2000), para la preparación de un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF.

Dicho fallo hepático inducido por TNF es, como ejemplo no limitativo, hepatitis vírica tal como la hepatitis A, B o C, hepatitis fulminante y/o enfermedad hepática alcohólica. En caso de utilizar un ácido nucleico, se pretende preferiblemente que dicho medicamento administre dicho ácido nucleico en la célula, en un tratamiento de terapia génica. Se conocen bien un gran número de métodos de administración por los expertos en la técnica. Preferiblemente, se administran los ácidos nucleicos para usos de terapia génica in vivo o ex vivo. Sistemas de administración de vector no vírico incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo, y ácido nucleico como complejado con un vehículo de administración tal como un liposoma. Sistemas de administración de vector vírico incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas o bien episomales o bien integrados tras la administración a la célula. Los métodos de administración no víricos de ácidos nucleicos incluyen lipofección, microinyección, biolísticos, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o lípido: ácidos nucleicos conjugados, ADN desnudo, viriones artificiales, y captación de ADN potenciada por agente. La lipofección se describe en, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.049.386, patente de los EE.UU. número 4.946.787; y patente de los EE.UU. número 4.897.355 y los reactivos de la lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin ™). Lípidos catiónicos o neutros adecuados para la lipofección de reconocimiento del receptor eficaz de polinucleótidos incluyen los de Flegner, documento WO 91/17424, documento WO 91/16024. Puede ser administración a células (administración ex vivo) o a tejidos diana (administración in vivo). La preparación de complejos lípido:ácido nucleico, incluyendo liposomas diana tales como complejos inmunolípidos, se conoce bien por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Crystal, 1995; Blaese et al., 1995; Behr, 1994; Remy et al., 1994; Gao y Huang, 1995; patentes de los EE.UU. números 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, y 4.946.787). El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos se aprovecha de los procedimientos sumamente evolucionados para seleccionar como diana con un virus células específicas en el cuerpo y transfiriendo la carga vírica al núcleo. Los vectores víricos pueden administrarse directamente a los pacientes (in vivo) o pueden utilizarse para tratar células in vitro y administrar las células modificadas a los pacientes (ex vivo). Los sistemas basados en virus convencionales para la administración de ácidos nucleicos pueden incluir vectores retrovirales, lentivirus, adenovirales, adeno-asociados y virus de herpes simple para la transferencia génica. Los vectores víricos son actualmente el método más eficaz y versátil de transferencia génica en células y tejidos diana. La integración en el genoma huésped es posible con los métodos de transferencia génica con retrovirus, lentivirus, y virus adeno-asociados, a menudo dando como resultado la expresión a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, se han observado eficacias de transducción altas en muchos tipos diferentes de células y tejidos diana.

En casos en los que se prefiere la expresión transitoria de ácidos nucleicos, se utilizan tradicionalmente sistemas basados en adenovirus, incluyendo vectores adenovirales deficientes en la replicación. Los vectores basados en adenovirus son capaces de eficacia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren la división celular. Con tales vectores, se han obtenido altos títulos y niveles de expresión. Este vector puede producirse en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. También se utilizan vectores de virus adeno-asociados ("AAV", "Adeno-associated virus"), incluyendo vectores de virus adeno-asociados recombinantes para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, por ejemplo, patente de los EE.UU. número 4.797.368; documento WO 93/24641; Kotin, 1994; Muzyczka. La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, incluyendo la patente de los EE.UU. número 5.173.414; Hermonat & Muzyczka, 1984; Samulski et al., 1989).

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Pueden administrarse vectores de terapia génica in vivo mediante la administración a un paciente individual, tradicionalmente mediante administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, o intracraneal) o aplicación tópica. Alternativamente, pueden administrarse los vectores a células ex vivo, tales como células extirpadas y cultivadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de donante universal, seguido de la reimplantanción de las células en un paciente, normalmente tras la selección de las células que incorporaron el vector. Los expertos en la técnica conocen bien la transfección celular ex vivo para diagnósticos, investigación, o terapia génica (por ejemplo, mediante nueva infusión de las células transfectadas en el organismo huésped). En una realización preferida, se aíslan las células a partir del organismo sujeto, se transfectan con un ácido nucleico (gen o ADNc), y se reinfunden de nuevo en el organismo sujeto (por ejemplo, paciente). Los expertos en la técnica conocen bien diversos tipos de células adecuados para la transfección ex vivo (véase, por ejemplo, Freshney et al., 1994) y las referencias citadas en dicho documento para una discusión de cómo aislar y cultivar células de pacientes).

En una realización adicional la invención proporciona un método para la producción o fabricación de un medicamento o una composición farmacéutica que comprende ABIN o un fragmento funcional o variante del mismo y posteriormente además mezclar dicho polipéptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La administración de dicha composición farmacéutica puede ser por medio de administración oral, inhalada o parenteral. Puede administrarse el principio activo sólo o preferiblemente formulado como una composición farmacéutica. Una dosis unitaria contendrá normalmente de 0,01 a 50 mg por ejemplo de 0,01 a 10 mg, o de 0,05 a 2 mg de compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las dosis unitarias se administrarán normalmente una vez o más de una vez al día, por ejemplo, 2, 3, ó 4 veces al día, más normalmente de 1 a 3 veces al día, de forma que la dosis diaria total está normalmente en el intervalo de 0,0001 a 1 mg/kg; así una dosis diaria total adecuada para un adulto de 70 kg es de 0,01 a 50 mg, por ejemplo de 0,01 a 10 mg o más normalmente de 0,05 a 10 mg. Se prefiere enormemente que el compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administre en la forma de composición de dosis unitaria, tal como una composición de dosis unitaria oral, parenteral, o inhalada. Tales composiciones se preparan mediante mezclado y se adaptan adecuadamente para administración oral, inhalada o parenteral, y como tal pueden estar en la forma de comprimidos, cápsulas, preparaciones líquidas orales, polvos, gránulos, pastillas para chupar, polvos reconstituibles, disoluciones inyectables y para infusión o suspensiones o supositorios o aerosoles. Los comprimidos y cápsulas para administración oral se presentan normalmente en una dosis unitaria, y contienen excipientes convencionales tales como agentes de unión, cargas, diluyentes, agentes de preparación de comprimidos, lubricantes, desintegrantes, colorantes, aromatizantes, y agentes humectantes. Los comprimidos pueden recubrirse según métodos bien conocidos en la técnica. Cargas adecuadas para la utilización incluyen celulosa, manitol, lactosa y otros agentes similares. Desintegrantes adecuados incluyen almidón, polivinilpirrolidona y derivados del almidón tales como almidón glicolato de sodio. Lubricantes adecuados incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio. Agentes humectantes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen sulfato de laurilo y sodio. Estas composiciones orales sólidas pueden prepararse mediante métodos convencionales de combinación, carga, compresión o similares. Pueden utilizarse operaciones de combinación repetidas para distribuir el principio activo por todas esas composiciones empleando grandes cantidades de cargas. Tales operaciones son, por supuesto, convencionales en la técnica. Las preparaciones líquidas orales pueden estar en la forma de, por ejemplo, suspensiones, disoluciones, emulsiones, jarabes, o elixires acuosos o aceitosos, o pueden presentarse como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de utilizarse. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, jarabe, metilcelulosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas, agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitano, o acacia; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo, aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres aceitosos tales como ésteres de glicerina, propilenglicol, o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico, y si se desea aromatizantes y agentes colorantes convencionales. Las formulaciones orales también incluyen formulaciones de liberación sostenida convencionales, tales como gránulos o comprimidos que tienen un recubrimiento entérico. Preferiblemente, las composiciones para inhalación se presentan para la administración a las vías respiratorias como un rapé o un aerosol o disolución para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solo o en combinación con un vehículo inerte tal como lactosa. En tal caso las partículas de principio activo tienen adecuadamente diámetros inferiores a 50 micras, preferiblemente inferiores a 10 micras, por ejemplo entre 1 y 5 micras, tal como entre 2 y 5 micras. Una dosis inhalada favorecida estará en el intervalo de 0,05 a 2 mg, por ejemplo de 0,05 a 0,5 mg, de 0,1 a 1 mg o de 0,5 a 2 mg. Para administración parenteral, se preparan formas de dosis unitarias fluidas que contienen un compuesto de la presente invención y un vehículo estéril. El principio activo, dependiendo del vehículo y de la concentración, puede o bien suspenderse o bien disolverse. Las disoluciones parenterales se preparan normalmente disolviendo el compuesto en un vehículo y esterilizando con filtro antes de cargarlo en un vial o ampolla adecuados y sellar. De manera ventajosa, también se disuelven en el vehículo adyuvantes tales como un anestésico local, conservantes y agentes de tamponamiento. Para aumentar la estabilidad, puede congelarse la composición después de cargarse en el vial y eliminar el agua a vacío. Las suspensiones parenterales se preparan sustancialmente de la misma manera excepto que el compuesto se suspende en el vehículo en vez de disolverse y se esteriliza mediante exposición a óxido de etileno antes de suspenderlo en el vehículo estéril. De manera ventajosa, se incluye un tensioactivo o agente humectante en la composición para facilitar la distribución uniforme del principio activo. Si es apropiado, pueden incluirse pequeñas cantidades de broncodilatadores por ejemplo aminas simpatomiméticas tales como isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina y efedrina; derivados de la xantina tales como teofilina y aminofilina y corticosteroides tales como prednisolona y estimulantes suprarrenales tales como ACTH. Tal como es la práctica común, las composiciones se acompañarán normalmente de instrucciones de uso escritas o impresas en el tratamiento médico concernido.

Con respecto a la transducción de la proteína con ABIN o fragmentos de ABIN en las células diana, se ha mostrado que una serie de dominios de proteína pequeños, denominados dominios de transducción de proteína (DTP), atraviesan las membranas biológicas eficazmente y con independencia de los transportadores o receptores específicos, y provocan el suministro de péptidos y proteínas a las células. Por ejemplo, la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) puede suministrar proteínas biológicamente activas in vivo. De manera similar, la tercera hélice alfa del hemeodominio Antennapedia, y la proteína VP22 del virus del herpes simple provocan la administración a las células de péptidos y proteínas unidas covalentemente (publicado en Ford et al., 2001). La administración de proteínas basada en un vehículo de péptido anfipático corto, Pep-1, es eficaz para administrar una variedad de péptidos y proteínas en varias líneas celulares en una forma biológica completamente activa, sin la necesidad de acoplamiento covalente químico previo (Morris et al., 2001). La capacidad de las proteínas VP22 quiméricas de extenderse a partir de la célula transducida primaria a las células vecinas puede mejorar los enfoques de la terapia génica (Zender et al., 2002).

También puede administrarse la proteína a través de los liposomas. Los liposomas se han usado como vehículos de administración de fármacos y terapia génica y se ha demostrado que tienen un potencial sustancial para seleccionar como diana tipos de células específicas del hígado. Por tanto, la utilización de liposomas puede mejorar la eficacia de selección de dianas en el tratamiento de una variedad de enfermedades del hígado (Wu y Zerm, 1999).

Definiciones

Secuencia de nucleótidos tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, o bien ribonucleótidos o bien desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, este término incluye ADN de cadena doble y sencilla y ARN. También incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, metilación, sustituciones de "caperuza" ("caps") de uno o más de los nucleótidos que se producen de manera natural con un análogo. Sobreexpresión tal como se utiliza en el presente documento significa que las células transformadas producen más de la proteína sobreexpresada que el control no transformado, cuando se mantienen en las mismas condiciones. Preferiblemente, la sobreexpresión se obtiene colocando la secuencia codificante en sentido de 3' de un promotor constitutivo.

Secuencia codificante es una secuencia de nucleótidos, que se transcribe en ARNm y/o se traduce en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de comienzo de traducción en el extremo terminal 5' y un codón de terminación de traducción en el extremo terminal 3'. Un secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes o ADN genómico, mientras que los intrones también pueden estar presentes en ciertas circunstancias.

Proteína A20 (A20') se refiere a la proteína dedo de zinc inducida por TNF, descrita por Dixit et al., 1990; Opipari et al., 1990 y Tewari et al., 1995, o un fragmento activo de la misma, tal como la parte que contiene el dedo de zinc (aminoácidos 387-790 de A20 humana, aminoácidos 369-775 de A20 murina).

Los términos proteína y polipéptido tal como se usan en esta solicitud son intercambiables. Polipéptido se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica de la molécula. Este término también incluye modificaciones tras la traducción del polipéptido, tal como glucosilación, fosforilación, y acetilación.

Superrepresor I\kappaB (I\kappaB^{s}) se refiere a una forma mutante no degradable de I\kappaB-\alpha, con mutaciones S32A y S36A, que bloquea NF-\kappaB en un complejo de proteína citosólico, evitando su acción nuclear.

Ejemplos Ejemplo 1 Generación del adenovirus ABIN

Se amplificó mediante PCR el ADNc de ABIN murino, unido por el extremo N-terminal a un E-tag, con cebadores directo (5'cgggatccgccatgggtgcgccggtgcc3') e inverso (5'ccccaagcttaaatgacccactgcagcc3') que contenían los sitios de restricción para BamHI y HindIII, respectivamente. El fragmento resultante se clonó en un vector lanzadera pLpA.CMV abierto BamHI y HindIII (Gomez-Foix et al., 1992), y se transfectó conjuntamente con pJM17 (McGrory et al., 1988) mediante precipitación conjunta con ADN/fosfato de calcio en células de la retina 911. La recombinación in vivo del vector lanzadera que expresa el transgen ABIN con la estructura principal de pJM17 dio como resultado la producción de un adenovirus con E1 eliminado deficiente en la replicación de tipo 5 (AdABIN). De modo similar se generó un virus control (AdRR5), que no expresa un transgen. Tras la recombinación, se aislaron las placas recombinantes, se verificó el ADN extraído mediante PCR, y se confirmó la expresión del transgen correcto por medio de inmunotransferencia tipo Western. Se prepararon reservas de virus de alto título en células HEK 293 y se purificaron mediante bandeo por CsCI único. Se determinó el título de unidad infecciosa en un ensayo en placa que se realizó sobre células HEK 293 confluentes con diferentes diluciones de virus. Se contaron las placas de células lisadas y se calcularon como unidades formadoras de placa (ufp) por ml de reserva de virus.

Ejemplo 2 Expresión de ABIN in vitro con la infección con AdABIN

Se probó AdABIN para determinar la expresión del transgén en la línea celular de hepatoma BWTG3 (Szpirer y Szpirer, 1975). Se realizó la infección con AdABIN con una multiplicidad de infección (mdi) de 100:1. Se incubaron las células con virus en un volumen mínimo de medio libre de suero durante 2 horas, tras lo cual se añadió medio que contenía suero para la incubación durante la noche. Para controlar la expresión de ABIN, se lisaron las células 24 horas tras la infección y se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos anti-E-tag acoplados a HRP (Amersham). La infección con AdABIN dio como resultado una clara expresión de ABIN (datos no mostrados).

Se analizó la eficacia de la infección y el patrón de expresión subcelular de ABIN mediante inmunofluorescencia. En este caso, se dividieron las células y se sembraron sobre cubreobjetos 24 horas tras la infección. Otras 24 horas después, se lavaron las células, se fijaron con metanol al 100% a -20ºC durante 10 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras bloquear con BSA al 0,5% durante 30 minutos, se incubaron las células con una dilución de 1/3000 de anticuerpo monoclonal anti-E-tag (Amersham) durante 90 minutos y con una dilución de 1/600 de anticuerpo de cabra anti-IgG murina Alexa Fluor 488 (Molecular probes) durante 90 minutos. Tras la tinción del núcleo con DAPI, se montaron los cubreobjetos con Vectashield (Vector Laboratories), y se analizaron con un microscopio Leica DM-IL. Esto reveló que la eficacia de la infección fue de más del 90%, y que ABIN estaba localizado exclusivamente en el citoplasma (datos no mostrados).

Ejemplo 3 Inhibición in vitro de la expresión genética dependiente de NF-\kappaB inducida por TNF por AdABIN

Para analizar el efecto de ABIN sobre la expresión genética dependiente de NF-\kappaB, se transfectaron células con pNFconluc 24 horas tras la infección. Éste último lleva un gen notificador de luciferasa que está precedido por un promotor mínimo y tres sitios de unión a NF-\kappaB (Kimura et al., 1986). Se realizó la transfección usando el reactivo de transfección FuGene según las instrucciones del fabricante (Roche biochemicals). Se usó una razón de 6:1 de FuGene:ADN, y se preincubaron muestras de FuGene:ADN durante 45 min antes de la adición a las células durante 24 horas en medio completo nuevo. Se sembraron las células sobre placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 horas. Luego o bien se dejaron las células sin tratar o bien se estimularon con 1000 UI/ml de TNF. Seis horas después, se lisaron todas las células en 100 \mul de tampón de lisis (Tris-fosfato 25 mM pH 7,8, DTT 2 mM, CDTA 2 mM, glicerol al 10% y Triton X-100 al 1%). Se analizaron las actividades de Luc y Gal tal como se describió anteriormente (De Valck et al., 1996). Se normalizaron los valores de Luc para los valores de Gal con el fin de corregir las diferencias en la eficacia de transfección (representado como luc/gal). La infección por AdABIN evitó la expresión de la luciferasa dependiente de NF-\kappaB en respuesta a TNF, mientras que la infección por AdRR5 no tuvo ningún efecto.

La observación de que los niveles de I\kappaB no cambiaron con la expresión de ABIN sugiere que ABIN no afecta a la translocación nuclear del dímero NF-\kappaB. Para analizar el efecto de ABIN sobre la presencia de NF-\kappaB nuclear y la unión a sonda de ADN específica de NF-\kappaB, se dejaron las células sin tratar o se trataron durante 30 min con 1000 UI/ml de TNFm 24 h tras la infección. Se lavaron las células dos veces con PBS, se rascaron de la placa y se centrifugaron durante 30 seg a 12.000 x g para recoger las células.

Ejemplo 4 ABIN no inhibe significativamente la muerte celular mediada por TNF

Para investigar si ABIN tenía un efecto sobre la muerte celular mediada por TNF, se incubaron células BWTG3 infectadas con AdABIN, AdRR5 o con infección fingida con TNF, o combinaciones de TNF y cicloheximida (CHX). Más específicamente, 24 horas tras la infección, se sembraron las células en placas de 96 pocillos con una densidad de 4 x 10^{4} células por pocillos. Otras 24 horas después, se estimularon las células con diluciones de TNFm sólo, o con una combinación de diluciones de TNF y una concentración constante (10 \mug/ml) de CHX. Se observó microscópicamente la muerte celular, y se cuantificó incubando las células con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Tada et al., 1986). Tras la disolución de los cristales formados, se determinó la absorbancia en un lector inmunológico (Biorad) a una longitud de onda de 595 nm, con 655 nm como longitud de onda de referencia. TNF solo no tuvo ningún efecto citotóxico sobre las células BWTG3, mientras que el tratamiento con TNF + CHX provocó la muerte celular mediante apoptosis. La infección con AdABIN sólo proporcionó una protección limitada frente a dosis bajas de TNF, mientras que no había ninguna protección con dosis superiores de TNF (figura 2).

Ejemplo 5 Expresión de ABIN en el hígado de ratones infectados con AdABIN

Se probó AdABIN para determinar la expresión del transgén y su actividad biológica in vivo inyectando ratones C57BU6 con 2,5 x 10^{9} ufp de AdABIN dentro de la vena de la cola. 1-6 días tras la infección, se sacrificaron los ratones y se aislaron los hígados. Se cortó un tercio del hígado en trozos pequeños y se homogeneizaron haciendo rebotar en tampón de lisis (NP-40 al 1%, NaCl 200 mM, Tris-Cl 10 mM pH 7,5, EDTA 5 mM, glicerol 10%) complementado con aprotinina 0,1 mM, PMSF 1 mM, y glutatión 1 mM. Tras 20 minutos de incubación en hielo, se centrifugaron los homogeneizados durante 30 min a la velocidad máxima en una centrífuga de mesa a 4ºC. Se determinaron las concentraciones de proteína mediante análisis Bradford (Biorad). Se sometieron 50 \mug de proteína a SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-E-tag acoplado a HRP (Amersham). Se revelaron las señales mediante ECL (Amersham). La expresión de ABIN fue máxima 3 días tras la infección y permaneció alta durante al menos 6 días (datos no mostrados).

Ejemplo 6 Inhibición in vivo de la activación de NF-\kappaB inducida por TNF/GaIN por AdABIN y por Ad-I\kappaB^{s}

Para analizar el efecto de AdABIN sobre la activación de NF-\kappaB inducida por TNF/GaIN en el hígado, se probó el efecto de la infección por AdABIN sobre la degradación de I\kappaB\alpha inducida por TNF/GaIN mediante inmunotransferencia de tipo Western. En paralelo, también se analizaron las mismas muestras en un ensayo de retardo en gel ("gel shift") para determinar la presencia de NF-\kappaB activo en extractos de células nucleares del hígado. Se inyectaron a los ratones (i.v.) 2,5 x 10^{9} ufp de Ad-ABIN, Ad-I\kappaB^{s} (= superrepresor de I\kappaB), o AdRR5 (= control de virus vacío), y se expusieron tras tres días mediante inyección con una dosis letal de TNF (0,3 \mug)/GaIN (20 mg) diluida en PBS. El PBS como tal sirvió como control. En diversos momentos tras el tratamiento con TNF/GaIN, se mataron los ratones y se prepararon homogeneizados de hígado. Se analizó la expresión de I\kappaB\alpha mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-I\kappaB\alpha policlonal (Santa Cruz) (figura 1, panel superior). I\kappaB\alpha estaba casi completamente degradado tras 0,5 h de tratamiento con TNF/GaIN, y reapareció tras 1,5 h. Esta reaparición se debe lo más probablemente a la síntesis de novo de I\kappaB\alpha en respuesta a TNF. Eran visibles señales de I\kappaB\alpha fuertes en los ratones infectados con AdI\kappaBs, en los que la expresión del transgén enmascaraba la expresión del gen endógeno. De la manera más importante, en el caso de animales infectados con AdABIN, la degradación de I\kappaB\alpha se retrasó fuertemente comparado con ratones control de AdRR5. Estos resultados demuestran que ABIN inhibe la activación de NF-\kappaB en el hígado de ratones infectados con AdABIN. Se analizó adicionalmente la activación de NF-\kappaB en un ensayo de retardo en gel de extractos de células nucleares de hígado murino. Se homogeneizaron trozos de hígado murino haciéndolos rebotar en 1 ml de tampón de dilatación (Hepes 10 mM pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, glicerol al 5%, EDTA 0,5 mM pH 7,5, EGTA 0,1 mM pH 7,5, Pefablock 2 mM, DTT 0,5 mM, aprotinina 0,15 UI/ml). Tras 15 min de incubación en hielo, se añadieron 65 \mul de una disolución de NP-40 al 10%, seguido de centrifugación velocidad máxima en una centrifugadora eppendorff durante 15 min. Volvió a suspenderse el sedimento en 100 \mul de tampón de extracción nuclear (Hepes 20 mM pH 7,5, NP-40 al 1%, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 400 mM, KCl 10 mM, glicerol al 20%, EDTA 0,5 mM pH 7,5, EGTA 0,1 mM pH 7,5, Pefabloc 2 mM, DTT 0,5 mM, aprotinina 0,15 UI/ml). Tras la centrifugación durante 15 min a velocidad máxima en una centrífuga eppendorff, se almacenaron los sobrenadantes a -70 hasta su uso. Se incubaron 10 \mul de lisado nuclear a temperatura ambiente durante 30 min con una sonda de ADN específica de NF-\kappaB marcada con ^{32}P (agctagaggggasctttccgagagg) en el siguiente tampón: Ficoll 400 al 4%, Hepes 20 mM pH 7,5, KCl 60 mM, DTT 2 mM, poli d(I-C) 100 \mug/ml, BSA acetilado 1 mg/ml.

Entonces se hicieron pasar los extractos sobre un gel de poliacrilamida nativo al 4%. Se visualizó la radiactividad mediante exposición a películas de rayos X. Esto mostró que AdABIN así como AdI\kappaB^{s} evitaban fuertemente la translocación nuclear inducida por TNF/GaIN y la unión al ADN de NF-\kappaB (figura 1, panel inferior). A partir de esto, puede concluirse que la infección adenoviral con AdABIN o AdI\kappaB\alpha inhibe la activación de NF-\kappaB inducida por NF-\kappaB TNF/GaIN en el hígado del ratón.

Ejemplo 7 Inhibición de hepatitis letal inducida por TNFIGaIN por ABIN

Para analizar el efecto de ABIN sobre la letalidad inducida por TNF/GaIN, se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) a ratones C57BL/6 2,5 x 10^{9} ufp de AdABIN (n=8) o AdRR5 (n=9). Tres días después, todos los ratones recibieron una dosis letal de TNF/GaIN. A cada hora, se midió la temperatura corporal y se evaluó la letalidad. Los ratones control mostraron una caída drástica de la temperatura corporal tan sólo 6 horas tras la inyección (figura 3), mientras que los ratones que expresaban ABIN mostraron una temperatura corporal normal a lo largo de todo el experimento (analizados hasta 18 días tras la inyección). De manera más importante, mientras que todos los ratones control murieron a lo largo de un periodo de 36 horas, los ratones que expresaban ABIN sobrevivieron y no mostraron ningún signo de enfermedad (figura 4).

Para analizar el efecto de ABIN sobre la toxicidad hepática, se inyectó a los ratones AdABIN (n=5) o AdRR5 (n=5) tal como se describió anteriormente, seguido tras tres días de inyección de una dosis letal de TNF/GaIN. En el momento en el que los ratones AdRR5 mostraron una fuerte disminución de la temperatura corporal, se sacrificaron los animales para estudios de histología y bioquímica. Se recogió sangre de ratones AdRR5 y AdABIN, y se prepararon los hígados para análisis adicionales. Se determinó la concentración de alanina aminotransferasa (ALT) en la sangre tras la inyección de TNF/GaIN usando un kit enzimático/colorimétrico (Sigma), y sirvió como parámetro para la necrosis hepática (Reutter et al., 1968). Se tomó sangre del plexo retro-orbital con anestesia con éter ligera y se dejó coagular durante 30 min a 3,7ºC y 1 h a 4ºC, seguido de centrifugación a 16.000 x g. Se almacenó el suero a -20ºC. Los niveles de ALT disminuyeron significativamente en ratones infectados con AdABIN cuando se compararon con ratones control (figura 5). Se analizaron la fragmentación de ADN y la activación de caspasa como parámetros para la apoptosis. Se midió la fragmentación de ADN mediante determinación inmunoquímica de fragmentos de ADN complejados con histonas en una placa de microtítulo (Salgame et al. 1997). Brevemente, se recubrieron las placas con un Ab dirigido frente a la histona H2B. Tras el bloqueo, se añadieron homogeneizados de hígado y se administró un Ab de detección biotinilado específico para la subpartícula de nucleosoma de las histonas H2A, H2B, y ADN. Se realizó la detección con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Sanvertech, Boechout, Bélgica) y sustrato (Sigma). Se ajustaron las señales obtenidas a partir de ratones tratados con TNF/GaIN al 100%. Estos experimentos muestran que la fragmentación de ADN inducida por TNF/GaIN se reduce significativamente en animales infectados con AdABIN (figura 6). Se reveló la activación de caspasa mediante hidrólisis de Ac-DEVD-amc al incubar con extractos de células hepáticas. Brevemente, se incubaron 30 \mug de homogeneizado de hígado en 200 ul de tampón sistema libre de células (Hepes 10 mM pH 7,5, manitol 220 mM, sacarosa 68 mM, NaCl 2 mM, MgCl_{2} 2 mM, KH_{2}PO_{4} 2,5 mM, DTT 10 mM) en presencia de 50 \muM de Ac-DEVD-amc (Peptide Institute; Osaka, Japón), durante 60 min a 30 grados. Se monitorizó la liberación de 7-amino-4-metilcumarina (AMC) durante 60 min en un fluorómetro (CytoFluor; PerSeptive Biosystems; Cambridge MA, EE.UU.) con una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 409 nm. Los datos se expresan como aumento de la fluorescencia en función del tiempo (\DeltaF/min). La hidrólisis de Ac-DEVD-AMC al incubar con homogeneizados de hígado de los ratones tratados con TNF/GaIN se redujo significativamente en animales infectados con AdABIN (figura 7). De manera similar, también se demostró la inhibición de la activación de caspasa inducida por TNF/GaIN con la infección con AdABIN mediante la inhibición de la maduración proteolítica de caspasa-3, tal como se reveló mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos policlonales específicos de caspasa-3 (figura 8).

Tal como se muestra mediante histología, la hepatitis letal inducida por TNF/GaIN está asociada con una destrucción de tejido total del tejido parenquimatoso, influjo de eritrocitos (hemorragia) en el sitio de la sinusoide y apoptosis y necrosis de los hepatocitos. Además, puede observarse un influjo masivo de macrófagos y neutrófilos en el hígado. Los hígados de ratones tratados previamente con AdABIN muestran una mejor conservación de la integridad del tejido y casi nada de hemorragia. En contraste con la protección completa frente a la letalidad inducida por TNF/GaIN, muerte celular del hepatocito, y hemorragia, la infiltración de glóbulos blancos sólo se redujo parcialmente en la expresión in vivo de ABIN.

Tal como se mencionó anteriormente, la inhibición general de la activación de NF-\kappaB hepático puede conducir a efectos tanto beneficiosos como perjudiciales. De hecho, la administración adenoviral de un superrepresor de I\kappaB\alpha dominante no protege frente a la letalidad inducida por TNF/GaIN. En el mismo experimento, la administración adenoviral de ABIN protegió completamente a los ratones (figura 9). En este momento, no puede facilitarse una explicación clara para el efecto diferente de ABIN y I\kappaB^{s}. Sin embargo, debe mencionarse que ABIN, al contrario que I\kappaB\alpha, inhibe la activación de NF-\kappaB aguas arriba del complejo IKK. Dado que se han mostrado diferencias en la señalización de NF-\kappaB específicas de los estímulos aguas arriba del complejo IKK, no es improbable que la inhibición mediada por ABIN de la expresión génica dependiente de NF-\kappaB se limite a una selección de genes sensibles a NF-\kappaB. Una posible inhibición selectiva de este tipo de los genes dependientes de NF-\kappaB puede desplazar un equilibrio entre las proteínas de protección y sensibilización, lo que puede dar como resultado un efecto protector neto de este inhibidor. Alternativamente, no pueden excluirse los efectos independientes de NF-\kappaB de ABIN en la protección frente a fallo hepático inducido por TNF.

Fas es una molécula de superficie de la célula que señaliza la apoptosis que activa la muerte celular con la unión de un anticuerpo o ligando específico. El tratamiento de ratones con un anticuerpo anti-Fas provoca un fallo hepático fulminante debido a una apoptosis masiva (Ogasawara et al., 1993). Al contrario que TNF/GaIN, anti-Fas no conduce a la activación de NF-\kappaB y una respuesta inflamatoria en el hígado, sino que más bien induce una respuesta apoptótica directa. Para examinar la susceptibilidad de ratones infectados con AdABIN a la letalidad mediada por anti-Fas, se inyectó a los ratones AdRR5 o AdABIN tal como se describió anteriormente, y tres días después se les inyectaron (i.v.) 10 \mug de anti-Fas (Pharmingen). Los ratones tratados previamente tanto con AdRR5 como con AdABIN murieron en un plazo de 3-5 horas tras la administración de anti-Fas (figura 10). Esto demuestra que ABIN no influye significativamente en la ruta de señalización de la apoptosis mediada por Fas. Para investigar adicionalmente si la diferencia en la protección en el fallo hepático inducido por TNF/GaIN frente al inducido por anti-Fas se debe a una diferencia en la implicación del receptor (receptor de TNF frente a Fas) o refleja una diferencia en el papel de los efectos dependientes del gen y la apoptosis, también se analizó el efecto de AdABIN sobre la letalidad inducida por TNF en ratones sensibilizados con actinomicina D. La actinomicina D bloquea la transcripción celular, y sensibiliza a las células frente al efecto apoptótico directo de TNF, sin una contribución de un componente inflamatorio. Por tanto, se inyectó a los ratones AdRR5 o AdABIN tal como se describió anteriormente, y tres días después se les inyectaron (i.v.) 0,3 \mug de TNF y 20 \mug de actinomicina D. Los ratones tratados previamente tanto con AdRR5 como con AdABIN murieron en un plazo de 20-35 horas tras la administración de TNF/ActD (figura 11). Tomados juntos, estos resultados sugieren que la protección mediada por ABIN frente al fallo hepático inducido por TNF/GaIN implica un acontecimiento dependiente de la transcripción.

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<110> Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnol

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<120> Protección frente a hepatitis mediada por ABIN

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<130> RBE/AB2/V091

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<140>

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<141>

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<150> EP01202414.7

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<151> 2001-06-22

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 2812

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (117)..(2060)

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (276)..(2060)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

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<222> (81)..252)

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<400> 1

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1

2

3

4

5

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 647

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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6

7

8

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<210> 3

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<211> 594

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos consenso 1 (documento WO99/57133)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Xaa Xaa Lys Glu Ile Xaa Arg Leu Asn Xaa Xaa Leu Glu Glu}

\sac{Xaa Xaa Ser}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos consenso 2 (documento WO99/57133)

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<400> 5

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\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Xaa Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Phe Xaa Xaa Glu Arg}

\sac{Xaa Asp Arg Glu Arg}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220> -

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador directo: amplificación de ADNc de ABIN murino

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccgc catgggtgcg ccggtgcc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador inverso: amplificación de ADNc de ABIN murino

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccaagctt aaatgaccca ctgcagcc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda de ADN marcada

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctagaggg gasctttccg agagg

\hfill

25

Claims (9)

1. Uso de ABIN, o una variante o fragmento funcional del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho ABIN comprende la secuencia de aminoácidos consenso representada en la SEQ ID Nº 4 y/o SEQ ID Nº 5.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento funcional es un fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se representa en la SEQ ID Nº 3 y que interacciona con la proteína A20.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento funcional es un fragmento que comprende los aminoácidos 420-647 de la SEQ ID Nº 2 y que interacciona con la proteína A20.

5. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha variante se selecciona del grupo que consiste en la proteína alfa Naf1, proteína beta Naf1 y la proteína lanzadera nuclear asociada al virión.

6. Uso de una secuencia de nucleótidos que codifica ABIN, o una variante o fragmento funcional del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF.

7. Uso de la fitohemaglutinina (PHA) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fallo hepático inducido por TNF.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho fallo hepático inducido por TNF es hepatitis vírica, hepatitis fulminante y/o enfermedad hepática alcohólica.

9. Uso según la reivindicación 6, en el que dicho medicamento es un vector de terapia génica.