ES2269192T3 - Enodiinos antifungicos. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto sustancialmente puro que tiene la fórmula: en la que R1 es un grupo hidroxilo o un resto que se puede remplazar por un grupo hidroxilo en una reacción de hidrólisis; cada R2 es, independientemente, H o un resto hidrocarbonado monovalente que contiene entre 1 y 4 átomos de carbono, ambos incluidos; R3 es un anillo pirrol, furano o tiofeno; y X es un número entero entre 4 y 10, ambos incluidos.
Description
Enodiínos antifúngicos.
La invención se refiere a compuestos útiles para
inhibir infecciones fúngicas.
Las infecciones fúngicas (micosis) pueden
contribuir y complicar muchas enfermedades, incluyendo enfermedades
pulmonares y enfermedades del tracto respiratorio. El número de
casos de infecciones fúngicas oportunistas ha aumentado,
particularmente en pacientes inmunocomprometidos, tales como
aquellos con SIDA, aquellos que están experimentando quimioterapia,
y aquellos que están experimentando terapia para prevenir el rechazo
de injertos después de una cirugía de transplante de órganos.
En animales, las infecciones fúngicas pueden ser
cutáneas, subcutáneas o sistémicas. Las micosis superficiales
incluyen tiña del cuero cabelludo, tiña del cuerpo, tiña de los
pies, onicomicosis (por ejemplo, hongo en las uñas),
perionicomicosis, tiña versicolor, candidiasis bucal, y otras
candidiasis tales como las vaginales, del tracto respiratorio,
biliares, esofágicas, y del tracto urinario. Las micosis sistémicas
incluyen candidiasis sistémicas y mucocutáneas, criptococcosis,
aspergilosis, mucormicosis, paracoccidiomicosis, blastomicosis de
Norteamérica, histoplasmo-
sis, coccidiomicosis y esporotricosis.
sis, coccidiomicosis y esporotricosis.
Las plantas también son susceptibles a
infecciones fúngicas. Las enfermedades de las plantas están causadas
por una miríada de patógenos fúngicos invasivos que se incluyen
dentro de muchos géneros, por ejemplo: hongos que dan lugar a
pudrición blanda (por ejemplo, Rhizopus spp.), enfermedad de
las hojas (por ejemplo, Taphrina spp.), moho polvoriento (por
ejemplo, Sphaerotheca spp.), manchas foliares (por ejemplo,
Fulvia spp.), roya (por ejemplo, Alternaria spp.),
tizón (por ejemplo, Magnaporthe spp.), pudrición negra (por
ejemplo, Guignardia spp.), sarna (por ejemplo, Venturia
spp.), marchitamiento (por ejemplo, Fusarium spp.),
herrumbre (por ejemplo, Puccinia spp.), hongos del carbón
(por ejemplo, Ustilago spp.) y cancros (por ejemplo,
Rhizoctonia spp.).
Los ejemplos de organismos patógenos incluyen
dermatofitos (por ejemplo, Microsporum canis, M.
gypseum, M. distortum, M. audouinii, M.
ferrugineum, M. rivalieri, M. fulvum, M.
cookei, M. vanbreuiseghemii, M. persicolor,
Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, T.
mengninii, T. nanum, T. schoenleinii, T.
tonsurans, T. verrucosum, T. soudanense, T.
violaceum, T. yaoundei, T. gourvilii, T.
simii, T. ajelloi, Hendersonula toruloidea),
levaduras (por ejemplo, Candida albicans, C.
tropicalis), Torulopsis glabrata, Epidermophyton
floccosum, Malassezia furfur (Pityropsporon
orbiculare, P. ovale), Cryptococcus neoformans,
Aspergillus fumigatus y otros Aspergillus spp.,
Zygomycetes (por ejemplo, Rhizopus, Mucor),
Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces
dermatitidis, Histoplasma capsulatum,
Coccidioides immitis, y Sporothrix schenckii.
Coccidioides immitis, y Sporothrix schenckii.
Towers et al. Plant and Medica Nº 3 1985
pág. 225-229 describe las propiedades antibióticas
de la thiarubrina A, un poliíno de ditiaciclohexadieno de origen
natural. Glazunova et al., Antibiotiki Vol. Nº 9 1967 pág.
767-771 describe la actividad antibacteriana y
antifúngica de ciertos acetilenos. El documento
US-A-3475462 describe una cetona
acetilénica conjugada que se puede usar como parasiticida.
En un aspecto, la invención presenta un
compuesto sustancialmente puro que tiene la fórmula:
(I)R_{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
(C(R_{2})_{2})_{X} --- C_{2}H_{2} ---
C_{4} ---
R_{3}
en la que R_{1} es un grupo
hidroxilo o un resto que se puede remplazar por un grupo hidroxilo
en una reacción de hidrólisis; cada R_{2} es, independientemente,
H o un resto hidrocarbonado monovalente que contiene entre 1 y 4
átomos de carbono, ambos incluidos; R_{3} es un anillo pirrol,
furano o tiofeno; y X es un número entero entre 4 y 10, ambos
incluidos. En todos los compuestos de la invención (Compuestos
I-V), la suma de los carbonos de los restos R_{2}
es preferiblemente menor de 15. Más preferiblemente, la suma de los
carbonos de los restos R_{2} es menor de 9, y mucho más
preferiblemente, menor de 5. Mucho más preferiblemente cada R_{2}
es H o, como alternativa, cada R_{2} es, independientemente, H,
CH_{3} o C_{2}H_{5}. En otras realizaciones preferidas,
R_{3} es un anillo furano, y X es un número entero entre 5 y 7,
ambos incluidos. Los compuestos reivindicados son capaces de inhibir
el crecimiento de una célula fúngica (por ejemplo, especies de
Candida o un dermatofito). Los compuestos de la invención se pueden
mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable para producir
una composición farmacéutica. En un ejemplo preferido, la
composición se formula para aplicación
tópica.
\newpage
En otro aspecto, la invención presenta un
compuesto sustancialmente puro que tiene la fórmula:
(II)R_{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} --- (CH_{2})_{X}
--- (C_{2}H_{2}) --- C_{4} ---
R_{3}
en la que R_{1} es OH, NH_{3},
OCH_{3}, u OC_{2}H_{5;} R_{3} es un anillo pirrol, furano o
tiofeno; y X es un número entero entre 5 y 7, ambos incluidos. En
compuestos preferidos, R_{1} es OH y/o R_{3} es un anillo
furano. Estos compuestos también se pueden proporcionar como
composiciones farmacéuticamente aceptables y se pueden usar para
inhibir el crecimiento de células fúngicas, por ejemplo, para tratar
infecciones fúngicas en plantas y animales, incluyendo seres
humanos. Preferiblemente, el compuesto inhibe el crecimiento de
células fúngicas en al menos un 25%, más preferiblemente en al menos
un 50%, y con mucho más preferiblemente en al menos un 90%,
determinado por un ensayo convencional descrito en este
documento.
Los compuestos de la invención, además de ser
útiles para tratar infecciones fúngicas, se pueden usar para
prevenir infecciones fúngicas.
Los compuestos preferidos dentro de la fórmula
(II) tienen la fórmula:
en la que X es un número entero
entre 5 y 7, ambos incluidos. Estos compuestos se pueden aislar de
un cultivo líquido de Anarrhinum. Un método preferido incluye
las etapas de (a) poner en contacto un cultivo líquido de
Anarrhinum con un inhibidor de la metilación del ADN; (b)
después de al menos tres días, poner en contacto el cultivo, o un
subcultivo del mismo, con un elicitor; y (c) extraer el compuesto
del cultivo en contacto con el elicitor, o un subcultivo del mismo.
El método también puede incluir, entre la etapa (a) y la etapa (b),
la etapa de subcultivar el cultivo. Preferiblemente, el cultivo
líquido se subcultiva al menos dos veces. Como alternativa, estos
compuestos se pueden preparar por las etapas de (a) iniciar un
cultivo de callo de una siembra de Anarrhinum; (b) cultivar
el cultivo de callo iniciado; (c) iniciar un cultivo líquido a
partir del cultivo de callo, (d) poner en contacto el cultivo
líquido con un inhibidor de la metilación del ADN; (e) subcultivar
el cultivo líquido en contacto con el inhibidor de la metilación del
ADN; (f) poner en contacto el subcultivo con un elicitor; y (g)
extraer el compuesto del cultivo en contacto con el elicitor, o un
subcultivo del mismo. Ni la etapa del inhibidor de la metilación del
ADN ni la etapa del elicitor es necesaria para que el cultivo
líquido de Anarrhinum produzca los compuestos de la
invención, la inclusión de estas etapas aumentará su
rendimiento.
En otro aspecto, la invención presenta un
compuesto sustancialmente puro que tiene la fórmula:
(IV)R_{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
(C(R_{2})_{2})_{X} --- CHOH ---
(C_{2}H_{2}) --- C_{4} --- C_{2}H_{2} ---
CH_{3}
en la que R_{1} es un grupo
hidroxilo o un resto que se puede remplazar por un grupo hidroxilo
en una reacción de hidrólisis; cada R_{2} es, independientemente,
H o un resto hidrocarbonado monovalente que contiene entre 1 y 4
átomos de carbono, ambos incluidos; y X es un número entero entre 3
y 9, ambos incluidos. Estos compuestos son útiles para inhibir el
crecimiento de células fúngicas, por ejemplo, para el tratamiento o
prevención de infecciones fúngicas en plantas y animales, incluyendo
seres
humanos.
En otro aspecto, la invención presenta un
compuesto sustancialmente puro que tiene la fórmula:
(V)R_{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
(C(R_{2})_{2})_{X} --- (C_{2}H_{2})
--- CH_{2} --- C_{4} --- C_{2}H_{2} ---
CH_{3}
en la que R_{1} es un grupo
hidroxilo o un resto que se puede remplazar por un grupo hidroxilo
en una reacción de hidrólisis; cada R_{2} es, independientemente,
H o un resto hidrocarbonado monovalente que contiene entre 1 y 4
átomos de carbono, ambos incluidos; y X es un número entero entre 3
y 9, ambos incluidos. Estos compuestos son útiles para inhibir el
crecimiento de células fúngicas, por ejemplo, para el tratamiento o
prevención de infecciones fúngicas en plantas y animales, incluyendo
seres
humanos.
Los compuestos de la invención muestran una
amplia actividad antifúngica y una elevada actividad específica, y
son por tanto útiles para el tratamiento o prevención de infecciones
fúngicas tanto en plantas como en animales, incluyendo animales y
plantas vivos, y productos vegetales (por ejemplo, trigo o forraje).
Los animales incluyen mamíferos, particularmente seres humanos, así
como animales domésticos criados para alimentación o como mascotas,
tales como caballos, vacas, ovejas, aves de corral, peces, cerdos,
gatos, perros y animales de zoo. Las plantas incluyen árboles,
cultivos, pastos, y plantas de flor.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las
realizaciones preferidas de la misma y de las reivindicaciones.
La Fig. 1 es una ilustración esquemática que
muestra la estructura de los Compuestos 1-7.
La Fig. 2 es una ilustración esquemática que
muestra un método de síntesis de los Compuestos 1, 5 y 7.
Se han aislado nuevos compuestos antifúngicos de
cultivos de plantas tratados en orden con un inhibidor de la
metilación y un elicitor. Estos y compuestos relacionados, que se
pueden preparar usando técnicas de síntesis orgánica convencional,
son útiles para la prevención o tratamiento de infecciones
fúngicas.
En los compuestos de la fórmula I:
(I)R_{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
(C(R_{2})_{2})_{X} --- C_{2}H_{2} ---
C_{4} ---
R_{3}
el resto preferido del R_{2} es
H, como se ejemplifica en este documento por los compuestos
1-7 (Fig. 1). Como alternativa, uno o más restos
R_{2} se pueden remplazar por restos hidrocarbonados tales como
grupos metilo, etilo, propilo o butilo (o una combinación de los
mismos), sin pérdida sustancial de actividad antifúngica.
Preferiblemente, la suma de los carbonos en los restos R_{2} es
menor de 15, más preferiblemente menor de 9, y más preferiblemente
menor
de 5.
de 5.
En compuestos preferidos, tales como los
compuestos 1-3, 5 y 7, R_{3} es un anillo furano.
Usando métodos convencionales de síntesis química, este anillo se
puede reemplazar por un anillo pirrol o tiofeno; como la estructura
terciaria y la distribución de carga de los tres anillos es similar,
los compuestos que tienen estos últimos anillos probablemente
también tienen actividad antifúngica.
La variable X indica la longitud de una
estructura de carbono saturada. La actividad antifúngica de los
compuestos reivindicados cambia en parte en base a la longitud de
esta estructura. Por ejemplo, los Compuestos 1, 5 y 7 (X=7) tuvieron
la mayor actividad anti-Candida, seguidos por el
Compuesto 3 (X=6), y luego el Compuesto 2 (X=5). Preferiblemente, X
es un número entero entre 5 y 7, ambos incluidos, aunque cadenas de
carbono más largas (X=8-10) pueden conservar o
aumentar la actividad antifúngica.
Un grupo preferido de compuestos tiene la
fórmula:
(II)R_{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} --- (CH_{2})_{X}
--- (C_{2}H_{2}) --- C_{4} ---
R_{3}
en la que R_{1} es OH, NH_{2},
OCH_{3}, o OC_{2}H_{5}, R_{2} es un anillo pirrol, furano o
tiofeno; y X es un número entero entre 5 y 7, ambos incluidos.
Incluso más preferiblemente, R_{1} es OH, R_{2} es un anillo
furano. Los compuestos dentro de esta fórmula (por ejemplo, los
compuestos 1-3, 5 y 7) tienen una estructura
hidrocarbonada que está sin
sustituir.
La producción aumentada de compuestos
purificados de fórmulas III, IV y V se indujo en cultivos de células
y tejidos vegetales siguiendo dos tratamientos por orden:
tratamiento con un inhibidor de la metilación del ADN y tratamiento
con un elicitor. El tratamiento con un inhibidor de la metilación
del ADN se proporciona a una siembra no germinada, a una siembra en
germinación, a un cultivo de explante o de tejido, o a un cultivo
líquido. También se consideran tratamientos sucesivos con un
inhibidor de la metilación del ADN. Por ejemplo, la invención abarca
un método que incluye tratar una siembra no germinada con un
inhibidor de la metilación del ADN (primer tratamiento), germinar la
siembra tratada, hacer crecer un callo de tejido obtenido de la
siembra germinada, inducir la suspensión del callo, y tratar un
subcultivo de suspensión líquida con un inhibidor de la metilación
del ADN (segundo tratamiento). Se use un tratamiento único o
tratamientos sucesivos, finalmente se obtiene un cultivo líquido de
las células o el tejido vegetal tratado con el inhibidor de la
metilación del ADN.
\newpage
El tratamiento con un inhibidor de la metilación
del ADN afecta a la producción de metabolitos secundarios por las
células vegetales tratadas. En parte, el efecto sobre las células
vegetales tratadas es un efecto temporal inducido por estrés. Lo que
es más importante, el tratamiento también afecta a la producción de
metabolitos secundarios de subcultivos obtenidos de la siembra no
germinada tratada, de la siembra en germinación, del cultivo del
explante o el tejido, o del cultivo líquido. El efecto del
tratamiento con el inhibidor de la metilación del ADN es
epigenéticamente estable respecto a la alteración de la expresión de
metabolismo secundario.
De acuerdo con los métodos de la invención, el
tratamiento con un inhibidor de la metilación del ADN generalmente
se combina con un tratamiento del cultivo líquido obtenido con un
elicitor. El tratamiento con un elicitor también estimula o promueve
la producción de metabolitos secundarios. La elicitación de un
cultivo celular o tisular vegetal generalmente se realiza cuando se
establece el cultivo líquido de la planta y puede hacerse crecer
hasta niveles suficientes para posibilitar el aislamiento de los
compuestos de la invención. Habitualmente, el cultivo tratado con un
inhibidor de la metilación del ADN se subcultiva (para retirar el
inhibidor de la metilación del ADN residual) antes de ponerlo en
contacto con elicitor.
Los compuestos de la invención se pueden
sintetizar fácilmente usando métodos convencionales de síntesis
orgánica. A continuación se proporciona un ejemplo de síntesis de
los compuestos 1, 5 y 7 (Fig. 2).
Etapa
1
Se disolvió tetrabromuro de carbono (20 mmoles)
en diclorometano anhidro (200 ml), y se mantuvo a 20ºC en atmósfera
de argón. Se añadió trifenilfosfina (20 mmoles) en diclorometano (20
ml) gota a gota. Después de 15 de agitación, el matraz de reacción
se mantuvo a -60ºC, seguido por la adición de furaldehído (10
mmoles) y trietilamina (10 mmoles) en diclorometano (100 ml). La
mezcla de reacción se llevó a temperatura ambiente, y se añadieron
dos volúmenes de éter. El precipitado se filtró, y se secó el
filtrado. El material en bruto se purificó por cromatografía en
columna de gel de Si (rendimiento >50%).
Etapa
2
Se mantuvo
2-(2,2-dibromo-vinil)-furano
(4 mmoles) en tetrahidrofurano (40 ml) en atmósfera de argón y se
enfrió hasta -100ºC. Se añadió hexametil disilano sódico (4,8
mmoles, solución 1 M) en tetrahidrofurano gota a gota al matraz de
reacción y se agitó durante 10 minutos. Después se añadió una
solución acuosa y saturada de cloruro amónico, y la mezcla de
reacción se llevó a temperatura ambiente. Se usó éter para extraer
el producto de la solución acuosa. El disolvente orgánico se retiró
mediante un cultivador rotatorio, y el residuo en bruto se usó para
la siguiente reacción en la Etapa 6 (a continuación).
Etapa
3
Se disolvió éster monometílico del ácido
azelaico (20 mmoles) en tetrahidrofurano (10 ml) y se mantuvo en
atmósfera de argón a -10ºC. Se añadió trietilamina (30 mmoles) gota
a gota al matraz de reacción, seguido por la adición de
cloroformiato de etilo (25 mmoles). La solución se agitó durante 20
minutos, y se añadió borohidruro sódico (60 mmoles) en una porción.
Se añadió metanol (40 ml) gota a gota y el matraz de reacción se
mantuvo a 0ºC durante 40 minutos. Se añadió agua (20 ml) y se retiró
el disolvente orgánico mediante un cultivador rotatorio. El residuo
se puso en agua y acetato de etilo para el reparto. Se recogió la
capa orgánica y se secó para obtener éster metílico del ácido
9-hidroxi-nonanoico de pureza
adecuada para su uso en la etapa 4. El rendimiento es
>90%.
>90%.
Etapa
4
Se trató éster metílico del ácido
9-hidroxi-nonanoico (7 g) en
diclorometano con dicromato de piridinio (35 g) y se agitó a
temperatura ambiente durante 12 horas. Se filtró el dicromato de
piridinio, y el filtrado orgánico se lavó con agua. Se añadió hexano
(volumen 3X) a la solución, y la capa orgánica se recogió y se secó
para obtener el producto en bruto. El producto se purificó por
cromatografía en columna de gel de Si para obtener \sim5 g de
producto.
\newpage
Etapa
5
Se añadió n-butillitio (750
\mul, 2 M) a metilsulfóxido (6 ml) en atmósfera argón a
temperatura ambiente. La solución se agitó durante media hora, y se
añadió bromuro de
(3-trimetilsilil-2-propinil)-trifenilfosfonio
(1 mmol) en metilsulfóxido y se agitó durante una hora. Se añadió
éster metílico del ácido
9-oxo-nonaoico en metilsulfóxido a
la mezcla de la reacción y se agitó durante 4,5 horas. La mezcla de
la reacción se vertió sobre agua helada y se extrajo tres veces con
acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron y se secaron
para obtener la mezcla en bruto, que se purificó adicionalmente por
cromatografía en columna de gel de Si. El producto contenía isómeros
trans y cis en una proporción de aproximadamente
8:2.
Etapa
6
Se añadió una solución de metanol (100 \mul)
que contenía cloruro de cobre (I) (0,6 mg), clorhidrato de
hidroxilamina (3 mg), y etilamina (70% en agua, \sim100 \mul) a
éster metílico del ácido
dodec-9-en-11-inoico
(\sim3,2 mg) en metanol, seguido por la adición de
2-bromoetinilfurano (\sim2 mg) en metanol. La
mezcla de reacción se mantuvo a 0ºC durante 20 minutos y se
añadieron agua y éter. La capa orgánica se recogió y se secó. Se
obtuvo una mezcla de los ésteres metílicos de los Compuestos 1 y 5
(\sim1 mg) por cromatografía en capa fina preparativa de gel de Si
(PTLC) en una proporción trans-cis de \sim8:2. Uno
de estos ésteres metílicos es el Compuesto 7.
Etapa
7
La mezcla de los ésteres metílicos del Compuesto
1 y del Compuesto 5 (4,7 mg) de la Etapa 6 se disolvió en
etanol-agua y se añadió a hidróxido potásico 2 N
(400 \mul). La solución se calentó a reflujo durante una hora y se
enfrió a temperatura ambiente. Se añadió una solución de clorhidrato
(800 \mul; 1 N) y la solución se extrajo con acetato de etilo. Se
obtuvo un total de 4 mg de los Compuestos 1 y 5 (proporción
trans:cis de \sim8:2) después de retirar el
disolvente orgánico.
Los especialistas en la técnica reconocerán que
pueden prepararse otros compuestos de la invención usando
variaciones del método precedente, o usando otros métodos
convencionales de síntesis orgánica. Dichos métodos se describen,
por ejemplo, en van Hijfte et al., Tetrahedron lett. 30:
3655; Hauske et al., Tetrahedron Lett. 33: 3715, 1992; y
Grandjean et al., Tetrahedron Lett 35:
3529-3530, 1994, cada uno de los cuales está
incorporado por la presente como referencia.
La invención presenta compuestos capaces de
inhibir el crecimiento, la patogenicidad, o la virulencia de un
patógeno. Por consiguiente, estos compuestos tienen un valor
medicinal o agrícola como fármacos o protectores de plantas.
Ejemplos de hongos patógenos que se pueden inhibir por los
compuestos de la invención son, por ejemplo, C. albicans,
Aspergillus spp., Mucor spp., Rhizopus spp., Fusarium spp.,
Penicillium marneffei, Microsporum spp., Cryptococcis neoformans,
Pneumocystis carinii, y Trichophyton spp.
La invención presenta composiciones
farmacéuticos que incluyen uno o más compuestos de la invención.
Para usos terapéuticos, las composiciones o compuestos se pueden
administrar sistémicamente, por ejemplo, formulados en un tampón
farmacéuticamente aceptable tal como solución salina fisiológico. El
tratamiento se puede conseguir directamente, por ejemplo, tratando
al animal con un compuesto o composición de la invención. Las vías
preferibles de administración incluyen, por ejemplo, la inhalación o
inyección subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, o
intradérmica que proporcionan niveles continuos y sostenidos del
fármaco en el paciente. El tratamiento de pacientes humanos o de
otros animales se realiza usando una cantidad terapéuticamente
eficaz de un compuesto de la invención en un vehículo
fisiológicamente aceptable. Se describen vehículos adecuados y su
formulación, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice
of Pharmacy, (19a ed.) ed. A.R. Gennaro AR., 1995, Mack
Publishing Company, Easton, PA. La cantidad de agente antifúngico a
administrar varía dependiendo de la forma de administración, la
edad y el peso corporal del paciente, y del tipo de enfermedad y de
la extensión de la enfermedad. Generalmente, las cantidades estarán
en el intervalo de las usadas para otros agentes usados en el
tratamiento de enfermedades fúngicas. Un compuesto se administra a
una dosificación que inhibe el crecimiento o supervivencia del
hongo. Por ejemplo, para la administración sistémica, un compuesto
se administra típicamente en un intervalo de 0,1 ng a 10 g/kg
de
peso vivo.
peso vivo.
En un método preferido, se formula uno o más
compuestos de la invención en combinación con un vehículo sólido o
líquido dermatológicamente aceptable. Los vehículos sólidos útiles
incluyen sólidos divididos finamente, tales como talco, arcilla,
celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los vehículos
líquidos útiles incluyen agua, alcoholes, o glicoles (o mezclas de
agua-alcohol/glicol), en los que los presentes
compuestos se pueden disolver o dispersar a niveles eficaces. Se
pueden añadir adyuvantes (tales como fragancias aromatizantes),
tensioactivos, y agentes antimicrobianos adicionales para optimizar
las propiedades para un uso dado. Las composiciones se pueden
aplicar por discos absorbentes, pueden usarse para impregnar
vendajes y otros apósitos, o se pueden pulverizar sobre el área
afectada usando pulverizadores de tipo bomba o de aerosol. Las
composiciones líquidas también se pueden emplear como gotas
oculares, elixires bucales, duchas, etc. Los espesantes tales como
polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácidos
grasos, alcoholes grasos, celulosas modificadas, o materiales
minerales modificados también se pueden emplear con vehículos
líquidos para formar pastas, geles, pomadas, jabones y similares,
que se pueden untar, para la aplicación directa sobre la piel del
usuario.
La concentración total de uno o más compuestos
de la invención en las presentes composiciones se puede variar
ampliamente, y dependerá de factores tales como la compatibilidad
del ingrediente o los ingredientes activos con el vehículo, la
potencia del ingrediente o los ingredientes activos y la afección a
tratar. Generalmente, la concentración del compuesto o los
compuestos de la fórmula en una composición líquida, tal como una
loción, será de aproximadamente el 0,1-25% en peso,
preferiblemente de aproximadamente el 0,5-10% en
peso, y más preferiblemente de aproximadamente el 0,5% al 5% en
peso. La concentración en una composición semisólida o sólida tal
como un gel o un polvo será de aproximadamente el
0,1-5% en peso, y preferiblemente de aproximadamente
el 0,5-2,5%
en peso
en peso
Para usos agrícolas, se pueden usar las
composiciones o los agentes descritos en este documento, por
ejemplo, como productos químicos aplicados como pulverizaciones o
polvos sobre el follaje de las plantas, o en sistemas de irrigación.
Típicamente, dichos agentes se administran sobre la superficie de la
planta anticipándose al patógeno para prevenir la infección. Las
semillas, bulbos, raíces, tubérculos y bulbos también se tratan para
prevenir un ataque del patógeno después de plantarse controlando los
patógenos que llevan sobre ellos o que existen en la tierra en el
lugar de la plantación. La tierra con la que se plantan vegetales,
plantas ornamentales, arbustos o árboles también se puede tratar
con fumigantes químicos para controlar una diversidad de patógenos
fúngicos. El tratamiento se hace preferiblemente durante varios días
o semanas antes de plantar. Los productos químicos se pueden aplicar
mediante una ruta mecánica, por ejemplo un tractor, o bien mediante
aplicaciones manuales. Además, los compuestos de la invención se
pueden usar como desinfectantes.
En otras aplicaciones médicas, se puede añadir
un compuesto antifúngico a los materiales usados para preparar
dispositivos médicos tales como catéteres, incluyendo, pero sin
limitación, catéteres intravenosos, urinarios, intraperitoneales,
ventriculares, espinales, y de drenaje quirúrgico, para evitar la
colonización y la siembra sistémica por patógenos fúngicos
potenciales. De forma similar, se puede añadir un compuesto
antifúngico a los materiales que constituyen diversas prótesis
quirúrgicas y a dentaduras postizas para evitar la colonización por
patógenos fúngicos y evitar de este modo infecciones invasivas más
graves o la diseminación sistémica de estos patógenos.
La capacidad de una agente de inhibir el
crecimiento fúngico y, de este modo, el transcurso de la infección
por un organismo patogénico se puede demostrar por un experimento
in vitro que mida el crecimiento de ese organismo, o por el
uso de un ensayo de inhibición basado en enzimas o células como
marcador indirecto del crecimiento. La inhibición se describe
preferiblemente por una IC_{50} (la concentración de un compuesto
necesaria para una inhibición del 50%) o como MIC (la concentración
inhibidora mínima, es decir, la concentración más baja del compuesto
que inhibe el crecimiento del organismo). Por tanto, una IC_{50} o
MIC inferior indican que un compuesto tiene una mayor actividad
inhibidora del crecimiento. Un compuesto con una especificidad
aumentada demuestra uno o más de los siguientes casos: inhibición
preferente de una enzima microbiana sobre una enzima correspondiente
o similar en la célula o tejido hospedador; inhibición preferente de
una enzima microbiana sobre otra enzima microbiana; e inhibición
preferente del crecimiento de un microbio sobre el crecimiento de la
célula o el tejido hospedador. En general, un compuesto activo
preferiblemente inhibe el crecimiento, medido por un parámetro dado,
en al menos un 25% (por ejemplo, al menos un 30%, al menos un 40%,
al menos un 50%, o al menos un 65%) cuando se compara con un
organismo que no ha contactado con el compuesto.
Los ejemplos específicos de ensayos
farmacológicos incluyen los que miden la inhibición de lo siguiente:
crecimiento de C. albicans (por ejemplo, ATCC Nº 90028),
quitina sintasa específica de hongos, o glucano sintasa. Ensayos
adicionales miden la eficacia del agente para prolongar la vida de
ratones infectados por una exposición letal a C. albicans
sensible a fluconazol o resistente a fluconazol (véase, por ejemplo,
Lo et al., Cell 90: 939-949, 1997).
Un compuesto preferido es ampliamente eficaz
contra uno o más Candida spp., tales como C. albicans, C.
krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C.
guilliermorulii, C. haemulonii, C. lusitaniae, C. norvegensis, C.
viswanathii, y C. kefyr, así como otras analizadas en
este documento. Un compuesto preferido también es eficaz contra
infecciones fúngicas tales como Aspergillus fumigatus, A. flavus,
A. niger, Histoplasma capsulatum (var. capsulatum), Coccidioides
immitis, Cryptococcus neoformans (var. neoformans, y var.
gattii), C. bidus, C. laurentii, y C. fusarium, así como
organismos mucormicóticos tales como Rhizopus oryzae, R.
micropsorus, R. pusillus, Cunninghamelle bertholletiae,
Saksenaea vasiformis, Mucro circinelloides, M. ramossisimus, Absidia
corymbifera, Apophysomyces elegans, Cokeromyces recurvatus, y
Syncephalastrum racemosum. Los compuestos descritos pueden
mostrar actividad contra más de un tipo de organismo y son, por lo
tanto, particularmente adecuados y eficaces para la administración a
pacientes con más de un tipo de infección (por ejemplo, un paciente
puede tener dos tipos de infecciones fúngicas). Ciertos compuestos
descritos también pueden demostrar aditividad o sinergia cuando se
administran en combinación con otros agentes terapéuticos tales como
azoles (por ejemplo, fluconazol) y anfotericina B. Preferiblemente,
los compuestos se seleccionan según la toxicidad para células de
mamífero (por ejemplo, en las líneas celulares Vero (riñón de mono)
o U937 (monocitos humanos)); se prefieren particularmente
compuestos con una toxicidad baja para células de mamíferos a una
concentración que inhiba el crecimiento fúngico.
Hay numerosos ensayos que se pueden usar para
medir la inhibición del crecimiento de un hongo tal como Candida. En
un ejemplo, se subcultivan cultivos de Candida, por ejemplo C.
albicans cepas DSY1024 y SC5314, C. krusei ATCC 6258, y
C. glabrata ATCC 90030, a partir de soluciones madre
crioconservadas sobre placas de agar dextrosa de Sabouraud. Se
suspenden blastoconidios en medio RPMI-MOPS y se
inoculan (500 cfu/pocillo) en placas de 96 pocillos que contienen
compuestos de ensayo en un volumen final de 100 \mul/pocillo.
Después de 22 horas a 35ºC, se añaden a cada pocillo 25 \mul de
XTT (hidróxido de
(2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazolio),
(100 \mug/ml) con PMS (metil sulfato de fenazina, 5 \muM),
seguido por 2 horas de agitación. El crecimiento se evalúa
espectrofotométricamente midiendo la aparición de una mancha de
formazán soluble a 450 nm usando un lector de microplaca E_{max.}
La validez del ensayo se confirma por la determinación de la
concentración inhibidora mínima (MIC) de C. albicans para
agentes antifúngicos conocidos tales como anfotericina B,
5-flucitosina, fluconazol, nikomicina Z, y polioxina
D.
Los especialistas en la técnica reconocerán que
puede adaptarse fácilmente cualquier ensayo que mida el crecimiento
de cualquier hongo para determinar la inhibición del crecimiento
fúngico por compuestos de la presente invención.
Se infectan ratones inmunocompetentes (ICR,
Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) con una cepa
patogénica (por ejemplo, cepa Nº 64) de C. albicans que es
sensible a fluconazol. Después de 24 horas, la diseminación de la
infección se ha demostrado por recuentos de colonias orgánicas
(riñón, bazo e hígado) mayores de 10^{5} unidades formadoras de
colonias (CFU). El tratamiento se comienza 24 horas después de la
infección con una dosificación diaria durante 10 días. Los ratones
de control sin tratar habitualmente mueren después de
aproximadamente 16 días. Después de 30 días el porcentaje de
supervivencia en el grupo tratado con fluconazol (40 mg por kg de
peso vivo, dos veces al día) es de aproximadamente el 30%. Además de
medir la viabilidad del animal, se puede medir la carga fúngica de
los órganos (en CFU).
En un experimento similar usando un aislado
clínico resistente a fluconazol (por ejemplo, C. albicans
UTR-14), el porcentaje de supervivencia después de
20 días del grupo tratado con fluconazol (40 mg por kg de peso vivo
p.o.) (dos veces al día)) y en el grupo no tratado es habitualmente
del 0%.
Los compuestos de la invención se pueden ensayar
en combinación con agentes antifúngicos conocidos (por ejemplo,
anfotericina B y fluconazol) usando cualquiera de los ensayos
precedentes. Los compuestos que, en combinación con agentes
antifúngicos conocidos, son compuestos particularmente útiles, ya
que se pueden incorporar en un régimen para tratar o prevenir
infecciones fúngicas.
Los siguientes ejemplos son para ilustrar la
invención. No pretenden limitar la invención en ningún modo.
Se preparó un cultivo de células vegetales de
A. bellidifolium (Scrophulariaceae) usando semillas de
A. bellidifolium. Las semillas se esterilizaron por una
inmersión de 15 minutos en Domestos al 5% (cloro activo al 0,25%).
Las semillas estériles se colocaron en un medio de germinación de
semillas (B83 modificado según la receta B5 de Gamborg), + sacarosa
(1%), sin hormonas, y B83 + propiconazol (10 mg/l)). Después de la
germinación y el crecimiento apropiado de las raíces/brotes, las
plántulas estériles se cortaron en trozos pequeños de
aproximadamente 5 mm y se colocaron en un medio solidificado de
inducción de callo B50 (modificado según la receta B5 de Gamborg
para contener ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D) (1 mg/l), quinetina (0,1 mg/l), agua de coco
(100 ml/l), sacarosa (2%)). Después de la producción del callo el
material se usó para iniciar cultivos en suspensión.
Para establecer cultivos en suspensión, se
colocaron porciones de explantes de plántulas + callo en B88,
modificado según la receta B5 de Gamborg (Gamborg et al.,
Exp. Cell. Res. 50: 151-158, 1968) para contener
2,4-D (1 mg/l), quinetina (0,1 mg/l), agua de coco
(100 ml/l) + sacarosa al 3%. Los medios de suspensión se repusieron
a intervalos de 14 días. Después de 3 meses, el cultivo en
suspensión líquido establecido se mantuvo rutinariamente en un
matraz cónico de 250 ml, transfiriendo 28 ml de cultivo de
suspensión de 14 días a 100 ml de medio B88 fresco. EL cultivo se
incubó a 25ºC en oscuridad continua y se agitó a 140 rpm.
Se inoculó un matraz cónico de 2 l que contenía
750 ml de medio de producción B49 (Gamborg B5, sacarosa al 5%, sin
hormonas) con 256 ml de cultivo de suspensión de 14 días. Después
del crecimiento durante 7 días, se añadieron jasmonato de metilo
esterilizado por filtración (250 \muM de concentración final) y
una preparación de Candida albicans esterilizada en autoclave
(concentración final de 50 mg/l). Los cultivos celulares se
recogieron por filtración al vacío después de otros 6 días. La
preparación de C. albicans se obtuvo haciendo crecer un
cultivo de ATCC 28516 en medios YEPD (extracto de levadura al 1%,
peptona de levadura al 2%, glucosa al 2%) hasta una densidad celular
máxima y esterilizando en autoclave todo el cultivo de levaduras
antes de la adición a cultivos vegetales.
Se hicieron recrecimientos posteriores usando el
material que había experimentado varias rondas de periodos cortos de
almacenamiento en frío mediante los que se colocaron 140 ml de
cultivos de 3 días en un matraz plano de cultivo tisular de 600 ml
con tapa con ventilación, y después se almacenaron a 15ºC durante 91
días. Después se retiró el cultivo y se colocó en un matraz cónico
de 250 ml remplazándose los medios a intervalos de 14 días hasta que
el cultivo se pudo mantener de forma rutinaria transfiriendo 40 ml
de cultivo de 14 días a 100 ml de medio B88 fresco. Después de la
recolección, las células separadas se secaron por congelación antes
de la extracción.
La biomasa celular secada por congelación (41 g)
de 6 litros de cultivo celular
AB-03499-T2 (A.
bellidifolium) se descongeló y se lavó bien con agua, después se
secó. Esto se extrajo con 2 litros de cloruro de metileno/metanol
1:1. El extracto seco (2,8 g) se absorbió y se fraccionó en una
columna Diaion HP-20® (d.i. 2,5 cm, 25 cm
profundidad) y se eluyó con H_{2}O, MeOH en H_{2}O, MeOH y
acetona para producir las fracciones A1, A2, A3 y A4,
respectivamente. El análisis de HPLC mostró que la mayoría de los
derivados de acetileno se encontraron en la fracción A3 (columna
Nova-pak HR C-18 (3,9 x 300 mm),
gradiente de CH_{3}CN al 20% (HCOOH al 0,1%) a CH_{3}CN al 100%
(HCOOH al 0,1%) en 14 minutos). La fracción A3 se subfraccionó por
cromatografía en columna por gravedad (C-18 en fase
inversa) usando como sistema disolvente MeOH al 40% para producir el
Compuesto 1 (50 mg), Compuesto 2 (6 mg), Compuesto 3 (5 mg) y una
mezcla compleja (7 mg) que se purificó adicionalmente por
cromatografía en columna con gel de sílice en fase normal usando una
mezcla de hexanos y acetona (5:1) para producir el Compuesto 4 (3
mg) y el Compuesto 5 (2 mg).
- Compuesto 1.
- UV: 247, 260, 289, 308,328; Fórmula molecular: C_{18}H_{20}O_{3}. ESMS: m/z 283 [M-H]^{-} en modo negativo, m/z 307 [M+Na]^{+} en modo positivo, en Hewlett Packard; HRFABMS: m/z 284,1419 (calc. 284,1412) [M]^{+}, m/z 307,1297 (calc. 307,1311) [M+Na]^{+},en Finnigan MAT95Q, a m/\Deltam= 4.000 usando la definición del valle de porcentaje 10. La matriz era alcohol 3-nitrobencílico.
Datos RMN: véase la Tabla 1 (para
protones en un instrumento de Unidad Varian).
- Compuesto 2.
- ESMS m/z: 279 [M+Na]^{+} (calc. para C_{16}H_{16}O_{3}Na [279]).
- Compuesto 3.
- Goma amorfa: UV (MeOH_{max} nm: 213, 247, 260, 290, 308, y 328; ^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN: Tabla 1; ESMS m/z: 293 [M+Na]^{+} (calc. para C_{17}H_{18}O_{3}Na [293]).
- Compuesto 4.
- Goma amorfa: UV (MeOH_{max} nm: 213, 247, 260, 290, 308, y 328; ^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN: Tabla 1; ESMS m/z: 295 [M+Na]^{+} (calc. para C_{18}H_{24}O_{2}Na [295]).
- Compuesto 5.
- Goma amorfa: UV (MeOH_{max} nm: 213, 247, 260, 290, 308, y 328; ^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN: Tabla 1; ESMS m/z: 307 [M+Na]^{+} (calc. para C_{18}H_{20}O_{3}Na [307]).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se preparó un cultivo de células vegetales de
A. corsicum (Scrophulariaceae) usando semillas de
A. corsicum. Las semillas se esterilizaron por inmersión de
30 minutos en Klorin al 30% + Tween 20 seguido de H_{2}O_{2} al
3% durante 3 minutos. Las semillas estériles se colocaron en un
medio de germinación de semillas (B83 modificado según la receta B5
de Gamborg, + sacarosa (1%), sin hormonas, y B83 + propiconazol (10
mg/l)). Después de la germinación y el crecimiento adecuado de las
raíces/brotes, las plántulas estériles se cortaron en trozos
pequeños de aproximadamente 5 mm y se colocaron en un medio
solidificado de inducción de callos B50 (modificado según la receta
B5 de Gamborg para contener 2,4-D (1 mg/l),
quinetina (0,1 mg/l), agua de coco (100 ml/l), sacarosa (2%)). El
callo se estableció dos meses después del comienzo.
Para establecer cultivos en suspensión, se
colocaron porciones del callo establecido en B105, modificado según
la receta B5 de Gamborg para contener 2,4-D (1
mg/l), quinetina (0,1 mg/l), agua de coco (100 ml/l), glutamina
(1,46 mg/l)+ sacarosa al 3%. El medio de suspensión se repuso a
intervalos de 14 días. Después de 2 meses, el cultivo en suspensión
establecido se mantuvo rutinariamente en un matraz cónico de 250 ml,
transfiriendo 40 ml de cultivo en suspensión de 14 días a 100 ml de
medio B105 fresco. El cultivo se incubó a 25ºC en oscuridad continua
y se agitó a 140 rpm.
El cultivo se preparó para la producción de
muestras del siguiente modo: Se tomó una alícuota de 40 ml de la
suspensión en el día 0, y se transfirió a un matraz de 100 ml. En el
día tres, se añadió un solución estéril de
5-azacitidina (5-AC) en agua a una
concentración final de 3 x 10^{-5} M, y la mezcla resultante se
incubó durante 11 días. El cultivo de 40 ml tratado con
5-AC se subcultivó después dos veces antes de
transferirse a una mayor escala para manipulación adicional.
Se inoculó un matraz cónico de 500 ml que
contenía 190 ml de medio de producción B49 (B5 de Gamborg, sacarosa
al 5%, sin hormonas) con 70 ml de cultivo de suspensión de 14 días.
Después de 7 días de crecimiento, se añadieron jasmonato de metilo
esterilizado por filtración (250 \muM de concentración final) y
una preparación de Candida albicans esterilizada en autoclave
(concentración final de 50 mg/l). Los cultivos celulares se
recogieron por filtración al vacío después de otros 6 días. La
preparación de C. albicans se obtuvo haciendo crecer un
cultivo de ATCC 28516 en medios YEPD (extracto de levadura al 1%,
peptona de levadura al 2%, glucosa al 2%) hasta una densidad
celular máxima y por esterilizando en autoclave dos veces todo el
cultivo de levaduras antes de la adición a los cultivos
vegetales.
Después de la recolección, las células separadas
se secaron por congelación antes de la extracción.
LP416E8
(AC-05081-T4-3) era
un extracto orgánico de un cultivo de células vegetales manipulado
de A. corsicum. Este extracto fue sujeto de fraccionamiento
dirigido por bioactividad porque mostró actividad antifúngica en una
selección contra la cepa de C. albicans DSY1024 con un
cuádruple "knock-out" y resistencia a múltiples
fármacos (MDR). La IC_{50} del extracto original para LP416E8 fue
de 3,2 \mug/ml contra este organismo.
La biomasa celular en bruto de un cultivo de 20
litros se filtró y se lavó con agua destilada. La biomasa seca (393
g) se mezcló con 2 litros de diclorometano y metanol (1:1), y se
agitó durante 1,5 horas. La biomasa se retiró por filtración. El
procedimiento de extracción se repitió tres veces. El extracto
orgánico seco (19,7 g) se obtuvo retirando el disolvente en vacío en
un evaporador rotatorio.
El extracto seco (19,0 g) se mezcló con una
resina de poliestireno HP-20®, y después se aplicó a
una columna de resina de poliestireno HP-20® (2000
ml), que se había equilibrado con agua destilada al 100%. La columna
se eluyó con un sistema disolvente de gradiente por etapas con
fracciones de 2 litros de concentraciones crecientes de acetonitrilo
en agua (25%, 40%, 60%, 70%, 80%). Después se eluyó secuencialmente
la columna con porciones de 2 litros de metanol, acetona y
diclorometano. El disolvente se retiró de cada fracción al vacío.
Las fracciones, con pesos dados entre paréntesis, se designaron en
orden de elución, A1 (9,33 g), A2 (1,55 g), A3 (0,40 g), A4 (0,49
g), A5 (0,32 g), A6 (0,60 g), A7 (2,38 g), y A8 (0,67 g). La
fracción activa A6 (0,60 g) se fraccionó adicionalmente por
cromatografía en columna Sephadex LH-20®, se eluyó
con hexano-diclorometano (1:1) y después se lavó con
metanol para dar las fracciones; B1 (8 mg), B2 (78 mg), B3 (104 mg),
B4 (12 mg), B5 (4 mg), B6 (26 mg) y B7 (0,7 mg). La fracción B4 se
identificó como el Compuesto 1. La fracción B3 se pasó a través de
otra columna Sephadex LH-20® eluida con el mismo
sistema disolvente y se recogieron 26 fracciones. Las fracciones
C22, C23 y C24 se combinaron para producir un total de 13 mg
idénticos al Compuesto 1 por TLC y ^{1}HRMN.
Las fracciones C6 a C9 se fraccionaron
adicionalmente para obtener el Compuesto 4 y el Compuesto 6. Cada
una se aplicó primero a placas de TLC preparativa de gel de sílice.
Las placas se desarrollaron dos veces con
n-hexano-EtOAc (3:1). La banda de Rf
más alto, visualizado por irradiación con luz UV, de cada placa
(fracciones C6D1, C7D1, C8D1 y C9D1) se retiró y se extrajo con
acetona. Se combinaron cuatro extractos orgánicos y se concentraron
para producir el Compuesto 5 (\sim4 mg), identificado por datos de
RMN y MS (Tabla 1).
Las bandas Rf en el tercer lugar más alto de las
placas de TLC preparativa anteriores para las fracciones C8 y C9 se
retiraron y se extrajeron con acetona. Los dos extractos orgánicos
se combinaron para producir el Compuesto 6 (\sim3 mg) identificado
por datos de RMN y MS (Tabla 1).
Se disolvieron 3,3 mg del Compuesto 1 en 1 ml de
MeOH, y se añadió el exceso de
trimetilsilil-diazometano (\sim0,3 ml) a la
solución. La mezcla de reacción se mantuvo sin agitar durante 5
horas a temperatura ambiente. El solvente y el exceso de reactivo se
retiraron con una corriente de nitrógeno. El residuo se disolvió en
hexano y se aplicó a una PTLC de gel de sílice, desarrollada con
hexano-EtOAc (3:1). La banda principal con Rf
\sim0,9 se retiró y se extrajo con acetona. La acetona se retiró
con una corriente de nitrógeno, y se obtuvieron 2,5 mg del Compuesto
7 (el éster metílico del Compuesto 1) (Tabla 1).
Usando el ensayo de crecimiento fúngico descrito
en este documento, se ensayó el Compuesto 1 para su capacidad de
inhibir el crecimiento de C. albicans, C. kefyr, C. tropicalis,
C. krusei, y C. glabrata. Los valores de MIC e IC_{50} se
presentan en la Tabla 2. El crecimiento de todas las cepas
ensayadas, incluyendo el de las cepas de C. albicans
93-1226 y UTR-14, que son
resistentes a fluconazol, se inhibió a valores de IC_{50} de 0,35
a 42 ng/ml.
También se ensayó la actividad
anti-crecimiento celular del Compuesto 1 en otras
cepas fúngicas, así como en cepas bacterianas y en células de
mamífero cultivadas (Tabla 3). El crecimiento fúngico se inhibió con
valores de IC_{50} en el intervalo de 180 ng/ml a 100 mg/ml. El
crecimiento de células bacterianas y el crecimiento de células de
mamífero se inhibieron a concentraciones sustancialmente mayores de
Compuesto 1.
Usando el ensayo general de crecimiento celular
descrito en este documento, se ensayaron los Compuestos
2-7 para su capacidad de inhibir el crecimiento de
las cepas DSY1024 y SC5314 de de C. albicans. Los
resultados se presentan en la Tabla 4. Cada compuesto inhibió el
crecimiento de la cepa DSY1024, que tiene cuatro mutaciones
MDR, y por tanto se espera que sea más sensible a los inhibidores
del crecimiento. Los Compuestos 2, 6 y 7 también fueron capaces de
inhibir el crecimiento de la cepa SC5314.
Los compuestos de la invención también son
eficaces contra dermatofitos. El ensayo se realizó usando un método
de microdilución basado en el protocolo antifúngico NCCLS M27A. Los
compuestos a ensayar se prepararon en DMSO y se diluyeron a la
concentración apropiada en medio RPMI 1640 (el medio de crecimiento
de dermatofitos). Se preparó un inóculo de cada organismo de ensayo
a partir de placas de agar harina de avena para contener
0,5-2,5 X 10^{3} conidios/ml. Se añadieron cien
microlitros del inóculo a cada pocillo de una placa de
microtitulación de 96 pocillos que contenía 4 \mul de un compuesto
de ensayo y 96 \mul de RPMI 1640. Se usó terbinafina (vendido con
el nombre comercial Lamisil®) como control positivo. Las placas se
incubaron durante cuatro días a 35ºC, y se determinó la MIC por
inspección visual. Los datos se resumen en la siguiente tabla.
Claims (20)
1. Un compuesto sustancialmente puro que tiene
la fórmula:
R_{1} ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}} ---
(C(R_{2})_{2})_{X} --- C_{2}H_{2} ---
C_{4} ---
R_{3}en la que R_{1} es un grupo
hidroxilo o un resto que se puede remplazar por un grupo hidroxilo
en una reacción de hidrólisis; cada R_{2} es, independientemente,
H o un resto hidrocarbonado monovalente que contiene entre 1 y 4
átomos de carbono, ambos incluidos; R_{3} es un anillo pirrol,
furano o tiofeno; y X es un número entero entre 4 y 10, ambos
incluidos.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que cada R_{2} es H.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que cada R_{2} es, independientemente, H, CH_{3} o
C_{2}H_{5}.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que la suma de los átomos de carbono en los restos R_{2} es menor
de 15.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en el
que la suma de los átomos de carbono en los restos R_{2} es menor
de 9.
6. El compuesto de la reivindicación 5, en el
que la suma de los átomos de carbono en los restos R_{2} es menor
de 5.
7. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que R_{3} es un anillo furano.
8. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que X es un número entero entre
5 y 7, ambos incluidos.
9. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, para su uso como inhibidor del
crecimiento de Candida albicans.
10. Una composición farmacéutica que comprende
un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 9.
11. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que R_{1} es OH, NH_{2}, OCH_{3} o
OC_{2}H_{5}, R_{3} es un anillo pirrol, furano o tiofeno, y X
es un número entero entre 5 y 7, ambos incluidos.
12. El compuesto de la reivindicación 11, en el
que R_{1} es OH.
13. El compuesto de la reivindicación 11, en el
que R_{3} es un anillo furano.
14. Uso de un compuesto de acuerdo con
cualquiera de la reivindicaciones 1 a 13, en la fabricación de una
composición para inhibir el crecimiento de una célula fúngica.
15. El uso de la reivindicación 14, en el que la
célula fúngica es una célula de Candida albicans.
16. El uso de la reivindicación 15, en el que el
compuesto inhibe el crecimiento de la célula de Candida
albicans en al menos un 90%.
17. Un método para inhibir el desarrollo de una
infección fúngica en una planta, comprendiendo dicho método la etapa
de poner en contacto el organismo con un compuesto de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
18. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13 para tratar una infección
fúngica.
19. El compuesto de la reivindicación 18, en el
que dicho hongo es un dermatofito.
20. Uso de un compuesto de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en la fabricación de un
medicamento para tratar una infección fúngica.
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