KR100823676B1 - 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 유도체 및 이를 함유하는 항진균제 - Google Patents

제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 유도체 및 이를 함유하는 항진균제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 제니스테인 유도체, 키타사토스포라 키퍼낸시스 속 균주로부터 상기 화합물을 생산하는 방법, 상기 화합물을 포함하는 항진균용 조성물 및 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341 균주 (기탁번호: KCCM-10710P)에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 항진균 효과가 우수하고 독성이 적어 항진균제로 유용하게 사용할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112007032197137-pat00028
상기 식에서 R은 수소 또는
Figure 112007032197137-pat00029
이다.
제니스테인, 진균, 항진균, 키타사토스포라 키퍼낸시스, 6-데옥시-탈로오스

Description

제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 유도체 및 이를 함유하는 항진균제{Genistein 7-α-L-6-deoxy-talopyranoside derivatives and anti-fungal composition containing the same}
도 1은 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드를 얻기 위한 HPLC 크로마토그램.
도 2는 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드를 얻기 위한 HPLC 크로마토그램.
도 3은 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드의 1H NMR 스펙트럼.
도 4는 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드의 13C NMR 스펙트럼.
도 5는 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드의 1H NMR 스펙트럼.
도 6은 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드의 13C NMR 스펙트럼.
도 7은 L-람노우즈-TMS 유도체의 GC 크로마토그램.
도 8은 L-퓨코즈-TMS 유도체의 GC 크로마토그램.
도 9는 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 및 제니스테 인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드의 당의 TMS 유도체의 GC 크로마토그램.
도 10은 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 및 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드의 당의 TMS 유도체의 1H -1H 코지 스펙트럼.
본 발명은 하기 화학식 1의 제니스테인 유도체, 제조 방법, 이를 포함하는 항진균용 조성물 및 이 화합물을 분리할 수 있는 키타사토스포라 키퍼낸시스 속 균주에 관한 것이다.
Figure 112007032197137-pat00030
상기 식에서 R은 수소 또는
Figure 112007032197137-pat00031
이다.
진균은 사람에게 식품과 항생제를 공급하는 이익을 주는 반면, 피부사상균증을 비롯한 전신성 진균 감염증으로 사람의 생명을 위협하기도 한다.
사람과 동물에 있어서 진균감염성 질병은 감염된 조직의 위치에 따라서 크게 전신성 진균증과 표피성 진균증의 두 가지로 나눌 수 있다. 그 중에서 전신성 진균증은 건강한 사람에게는 전혀 질병을 일으키지 않지만 면역력이 약한 사람에게는 기회감염으로 유발되는 질병으로, 그 종류로는 크립토코커스증 (cryptococcosis), 칸디다증 (candidasis), 아스퍼질러스증 (aspergillosis) 등이 있다.
크립토코커스증은 크립토코커스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans)의 감염으로 발병되며 후천성면역부전증 (AIDS) 환자와 같이 면역력이 떨어진 환자에게서 피부를 비롯한 인체의 모든 부위에 감염되고, 특히 뇌와 수막에 감염되어 뇌수막염, 뇌농양 및 뇌종양을 일으킨다.
칸디다증은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)로 인한 진균증이며 최초로 아구창 환자에게서 분리되었고 여성의 경우 질염을 일으키고 유아의 경우 기저귀 발진을 유발한다.
아스퍼질러스증은 아스퍼질러스속 진균들에 의해 유발되는 질병을 통칭하는 말로 알레르기 기관지폐 아스퍼질러스증 (ABPA; Allergic bronchopulmonary aspergillosis), 진균종 (aspergilloma) 및 침습성 폐 아스퍼질러스증 (IPA; invasive pulmonary aspergillosis) 등이 있다. 아스퍼질러스속 진균들은 자연의 도처에 존재하며 포자를 공기 중으로 확산시키고 그 공기를 흡입한 사람에게 감염된다. 그리고 이들은 인체의 피부, 눈 및 폐 등 다양한 부위에서 서식 가능하며, 경우에 따라 척수나 뇌에서도 서식한다. 아스퍼질러스증의 발병에는 숙주의 상태가 크게 좌우하는데 일반적으로 골수이식, 화학치료, HIV 감염 또는 AIDS, 장기이식의 거부반응을 막기 위한 약물 등의 복용으로 인해 면역기능이 약화된 사람에게서 발병한다. 주요 치료 약물로는 이트라코나졸 (itraconazole) 과 암포테리신 B (amphotericin B) 등이 사용되고 있다.
최근에 항암화학요법이나 장기이식 후의 면역억제제 투여로 인한 면역저하 환자나 AIDS 환자의 증가와 함께 전신성 진균 감염증의 발병률이 많이 증가하고 있고, 그 중요성도 나날이 커지고 있다. 실제로 암이나 AIDS에 걸린 경우 환자가 사망하는 원인은 병 그 자체보다는 장기나 혈액의 진균 감염 때문이다. 또한, 진균 감염의 원인균도 점차 다양해지고 있으므로, 앞으로 더 많은 종류의 진균이 침습성 감염증을 유발할 것으로 예측되고 있다.
한편, 식물에 있어서도 진균 감염의 폐해가 심각하여 식물병원성 곰팡이들이 많은 농작물에 해를 끼쳐 그 생산성을 현저히 떨어뜨리고 있는 실정이다. 그러나 현재까지 임상적으로 사용되는 효과적인 저독성의 항진균제와 미생물 농약의 개발은 미흡한 실정이다.
현재 임상적으로 사용되는 항진균제로는 암포테리신 B 외에는 아졸 계열 (azole)의 합성물질이 대부분 사용되고 있다. 그러나 이런 항진균제들은 사용시 부작용이 심하게 나타나는 단점이 있다. 따라서 저독성 항진균제의 개발이 새로이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 항진균 효과가 우수한 제니스테인 유도체와 약학적으로 허 용 가능한 그의 염, 생산 방법, 그의 용도 및 이 화합물을 분리할 수 있는 키타사토스포라 키퍼낸시스 속 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 하기 화학식 1의 제니스테인 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 키타사토스포라 키퍼낸시스 속 균주로부터 분리함으로써 상기 화합물을 생산하는 방법, 상기 화합물을 포함하는 항진균용 조성물 및 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341 (Kitasatospora kifunensis MJM-341) 균주 (기탁번호: KCCM-10710P, 기탁일: 2005.11.21)를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 우선, 하기 화학식 1의 제니스테인 유도체와 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112007032197137-pat00032
상기 식에서 R은 수소 또는
Figure 112007032197137-pat00033
이다.
바람직하게는 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1a의 제니스테인 4',7- 다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 (genistein 4',7-di-α-L-6-deoxy-talopyranoside) 및 화학식 1b의 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 (genistein 7-α-L-6-deoxy-talopyranoside)이다.
Figure 112007032197137-pat00034
Figure 112007032197137-pat00035
상기 구조식 중, 당 부분은 용매와 온도 등의 주변 환경에 따라서 의자 형태 (chair form) 중에서 1C4 구조 (conformation)와 4C1 구조가 서로 전환될 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 토양에서 분리한 방선균인 키타사토스포라 키퍼낸시스 속 균주로부터 분리하여 구조 결정된 화합물로서, 생리 활성 물질로서 6-데옥시-탈로오스 (6-deoxy-talose)를 포함하고 있는 최초의 이소플라보노이드 (isoflavonoid)이다.
상기 화학식 1의 화합물은 상기 방선균으로부터 분리하는 방법 이외에 화학적 합성을 통해서도 수득할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 제니스테인 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 염기 (base)에 의해 형성된 염기 부가염이 유용하다. 상기 염기로는, 알칼리 금속 (alkali metal) 등이 포함된 무기 염기 (inorganic base)를 사용하거나 또는 염기성 (basicity)이 강한 아민 (amine) 등과 같은 유기 염기 (organic base)를 사용할 수 있다. 무기 염기가 사용되는 염으로는 나트륨 염 (sodium salt), 칼륨 염 (potassium salt), 칼슘 염 (calcium salt), 마그네슘 염 (magnesium salt) 등의 부가염이 가능하고, 유기 염기가 사용되는 염으로는 에탄올아민 염, 프로판올아민 염, 암모늄 염, 또는 일반적인 테트라알킬아민 염 등의 부가염이 유용하다.
또한, 본 발명에서는 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항진균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341 균주 (기탁번호: KCCM-10710P)의 추출물을 포함하는 항진균용 조성물을 제공한다.
이때 상기 추출물은 본 발명의 화학식 1의 화합물을 활성 성분으로 포함한다.
상기 화학식 1의 화합물은 일반 세균에 대한 저해활성은 없으면서 사람에게 진균감염을 일으키는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 크립토코커스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans)와 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger)뿐만 아니라, 식물 병원성 진균인 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)에도 강한 항 진균 활성을 나타냄을 확인할 수 있다 (표 4 참조).
반면에, 상기 화학식 1의 화합물은 사람의 간세포인 헵지투세포 (HepG2 cell)에 대해서는 세포 독성을 나타내지 않는 특성이 있음을 확인하였으며 (표 5 참조), 이는 본 발명의 화합물이 현재 항진균제로서 임상에서 사용되고 있는 암포테리신 B보다 세포에 대한 독성이 현저히 낮으므로 우수한 항진균제로서의 가능성이 크다는 사실을 입증하는 것이다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물은 전술한 바와 같이 식물성 병원성 진균인 라이족토니아 솔라니에 대해서도 강한 항진균 활성을 나타내므로 동물에 대한 투여뿐만 아니라 식물에 대하여 투여 가능하다. 따라서 본 발명의 항진균용 조성물은 병원성 진균 방제용 농약으로도 사용 가능하다.
본 발명은 비독성, 불활성, 제약상 적합한 부형제 이외에, 본 발명에 따른 1종 이상의 화합물을 함유하거나, 또는 본 발명에 따른 1종 이상의 유효 화합물로 이루어지는 제약 조성물 및 상기 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 수용성 또는 유성 현탁액, 조제 분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 (elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다.
비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용 가능한 희석제 (diluent)나 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매로는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있으며, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장 내의 온도에서는 액체가 되어 직장 내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 것으로서 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터 또는 폴리에틸렌글리콜 등과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.
본 발명의 조성물을 사용하여 질병을 치료하는 경우, 활성 성분인 화학식 1의 화합물의 용량은 환자의 나이, 체중, 일반적 건강 상태, 성, 식사, 투여시간, 배설 속도, 약물 병용, 치료하는 동안의 질병의 정도 등에 따라 다르지만, 질병에 따라 0.01~140mg/체중kg 까지를 매일 사용할 수 있으며, 환자당 1일 기준으로 0.5mg~7g까지 사용할 수 있다.
한편, 한가지 제형을 결정짓기 위해 담체 물질과 혼합하는 본 발명의 화합물의 양은 투여 경로별 방식과 치료하는 환자에 따라 달라진다. 예를 들어, 사람에게 경구 투여를 목적으로 하는 제형은 전체 조성 중에서 5~95 중량%를 차지하는 담체 물질들과 0.5mg~5g의 활성성분을 함유하게 되고, 사람에게 비경구 투여를 목적 으로 하는 제형은 전체 조성 중에서 5~99%를 차지하는 담체 물질들과 0.1mg~2.5g의 활성성분을 함유하게 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 신규한 제니스테인 유도체는 최소저해농도 측정 결과 많은 병원성 진균에 대해서 기존의 이트라코나졸에 비하여 강한 항진균 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 사람의 간세포에 대해서는 세포 독성을 나타내지 않는 특성도 있었다.
본 발명에서는 또한, 키타사토스포라 키퍼낸시스 속 균주, 바람직하게는 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341 균주로부터 상기 화합물을 분리함으로써 생산하는 방법을 제공한다.
상기 화합물을 분리하는 방법은 구체적으로 하기와 같다.
우선, 방선균 키타사토스포라 키퍼낸시스 속 균주, 바람직하게는 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341 균주를 지에스에스 배지 (GSS 배지; 가용성 전분 10g, 글루코오스 20g, 대두박 25g, 비프 추출물 1g, 효모 추출물 4g, NaCl 2g, K2HPO4 0.25g, CaCO3 2g, 증류수 1L, pH 7.2) 또는 이를 변형하여 탄소원으로 가용성 전분, 글루코오스 (glucose), 대두박, 사카로오스 (saccharose) 및 대두분 (soybean meal)을 1g~30g/L을 사용하고, 질소원으로 효모 추출물, 비프 추출물 및 박토-펩톤을 1g~10g/L, 무기 염류로 NaCl, K2HPO4, CaCO3를 0.1g~5g/L 까지 포함하는 배지 등에서 6~8일 동안, 25~34℃, 100~350rpm 조건으로 배양한다.
그런 다음, 배양액을 원심분리하여 배양상등액 (supernatant)만을 취하여 부탄올로 추출하거나 다이아이온 에치피 20 (Diaion HP-20) 수지에 흡착하여 활성물질을 분리한다.
활성층을 감압 농축하여 역상 실리카겔 칼럼 크로마토그라피 (RP-18 open column chromatography)를 수행하고, 최종적으로 역상 에이치피엘씨 (RP-18 HPLC)를 수행한다.
상기 화학식 1a의 순수한 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 및 화학식 1b의 순수한 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드는 물이 포함된 아세토나이트릴 (aqueous acetonitrile)을 이동상으로 한 RP-18 HPLC 조건에서 분리 정제한다.
제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드는 도 1의 HPLC 크로마토그램에서 28분에서 32분 사이의 피크에서 분리된 물질이다. 그리고, 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드는 도 2의 HPLC 크로마토그램에서 28분에서 40분 사이의 피크에서 분리된 물질이다.
한편, 본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물을 분리하여 생산할 수 있는 방선균 키타사토스포라 키퍼낸시스 속 균주를 제공한다.
본 발명의 미생물은 토양으로부터 분리되었으며, 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 키타사토스포라 키퍼낸시스와 99%의 상동성을 보임을 확인하였다. 이에, 본 발명의 균주를 "키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341"이라 명명하고, 2005년 11월 21일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였 다 (기탁번호: KCCM-10710P).
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 토양 세균의 분리 및 검색
대한민국 경기도 북부의 토양을 취하여 생리식염수에 현탁한 다음 베넷 (Bennet's) 배지 (글루코오스 10g, 효모 추출물 1g, 박토-펩톤 2g, 비프 추출물 1g, 증류수 1L)에 도말하여 28℃에서 두 달 동안 배양하면서 단일 콜로니를 분리하였으며, 이를 20% 글리세롤 (glycerol) 용액에 현탁하여 -70℃에서 저온 보관하였다.
분리된 각 균주를 GSS 배지 (가용성 전분 10g, 글루코오스 20g, 대두박 25g, 비프 추출물 1g, 효모 추출물 4g, NaCl 2g, K2HPO4 0.25g, CaCO3 2g, 증류수 1L, pH 7.2)에서 7일 동안 200rpm으로 진탕 배양한 배양액을 항세균 시험 (antibacterial test)과 항진균 시험 (antifungal test)을 실시하여 항진균 활성이 뛰어난 방선균 키타사토스포라 키펀낸시스 MJM-341을 선발하여 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과 [한국농미생물자원센타 (KACC), 경기도 수원시 농업진흥청 내] 키타사토스포라 키퍼낸시스와 99%의 상동성이 있으며 서열번호 1의 염기서열을 가짐을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 상기에서 분리한 균주를 "키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM- 341"이라 명명하고, 2005년 11월 21일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다 (기탁번호: KCCM-10710P).
실시예 2. 항진균 물질의 분리정제
상기의 방선균 키타사토스포라 키펀낸시스 MJM-341을 GSS 배지에서 7일 동안 32℃ 온도에서 200rpm으로 40리터를 진탕 배양하였다.
배양액을 원심분리하여 배양 상등액만을 취하여 부탄올로 추출하였으며, 부탄올 층을 감압 농축하여 역상 실리카겔 칼럼 크로마토그라피 (RP-18 open column chromatography)를 수행하였고, 최종적으로 역상 에이치피엘씨 (RP-18 HPLC)를 수행하여 상기 화학식 1a의 순수한 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 및 화학식 1b의 순수한 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드를 분리 정제하였다.
제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드는 도 1의 HPLC 크로마토그램에서 28분에서 32분 사이의 피크에서 분리된 물질 (3.3mg)이며, 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드는 도 2의 HPLC 크로마토그램에서 28분에서 40분 사이의 피크에서 분리된 물질 (19.2mg)이다.
실시예 3. 화합물의 구조 결정
상기의 순수분리한 물질의 구조를 분석하기 위하여 프로톤 엔엠알 (1H NMR), 카본 엔엠알 (13C-NMR), 이차원 엔엠알 (2D-NMR), 분자량 (FAB-Mass) 자료를 종합하여 상기 화학식 1a와 화학식 1b와 같은 구조를 결정하였다.
정제된 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드의 화학구조 규명을 위하여 DMSO-d 6 를 용매로 하여 500MHz와 125MHz에서 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1H COSY, HMQC, HMBC를 측정하였다. 표 1에서 보는 바와 같이 1H-NMR에서 6.50ppm, 6.77ppm에서의 두 개의 올레핀성 메틴 (methine), 1,4-위치가 치환된 (1,4-disubstituted) 벤젠 고리, 5.70ppm, 5.54 ppm의 두 개의 아노머 프로톤 (anomeric proton), 3.53~3.83ppm에서 당 유래의 하이드록실화 메틴 (hydroxylated methine), 1.05 ppm의 2개의 메틸, 8.46 ppm에서 교환가능한 프로톤 (exchangeable proton)이 관측되었다. 13C-NMR에서는 179.9ppm의 카보닐 탄소, 161.0ppm (x2), 156.9ppm, 155.7ppm, 123.8ppm, 121.9ppm, 105.8ppm의 7개의 4급 탄소, 116.0ppm, 129.9ppm의 두 개의 이중 결합성 탄소, 98.5ppm, 98.4ppm의 두 개의 아노머 탄소, 72ppm~64ppm에서 8개의 하이드록실화 메틴 탄소, 16.3ppm, 16.4ppm의 두 개의 메틸 탄소가 관측되어, 본 화합물은 이소플라보놀 부분 (isoflavonol moiety)과 두 개의 당 (sugar)으로 구성된 플라보노이드 배당체임을 알 수 있었다. 13C-NMR, HMQC 및 HMBC 데이터를 근거로 하여 구조 분석한 결과 아클리콘 (aglycone)은 제니스테인 이었으며, 당은 1.05ppm의 메틸의 존재와 TMS 유도체화를 통한 GC 분석과 NMR 해석 결과 6-데옥시-탈로오스 (6-deoxy-talose)임을 알 수 있었다. 두 개의 6-데옥시-탈로오스가 아글리콘에 연결된 위치는 HMBC 결과로부터 각각 아클리콘의 7번과 4'번 탄소에 O-글리코실레이션 (glycosylation)으로 연결되어 있음을 확인하였다. 따라서 당이 두 개 결합된 화합물의 화학 구조는 화학식 1a에 나타난 바와 같이 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드로 결정되었다 (도 3, 도 4, 표 1, 표 2 참조).
당이 한 개 결합된 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드도 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드와 동일한 방법으로 구조 결정을 하였다 (도 5, 도 6, 표 1, 표 2 참조).
또한, 당의 13C-NMR의 화학적 이동 (chemical shift) 값이 L-람노우즈 보다는 6-데옥시-탈로오스의 값에 가까우며 후술하는 실시예 4에서의 당 결정 실험으로 본 화합물에 포함되어 있는 당이 α-L-6-데옥시-탈로오스임을 최종적으로 결정하였다 (표 3 참조).
Figure 112006005741759-pat00009
화합물의 물리화학적인 특성
제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드
분자식 C27H30O13Na C21H20O9Na
분자량 (FAB-MS m/z) 585.1510 (M+ Na) 439.1017 (M+ Na)
IR υmax(KBr) cm-1 3404, 2135, 1654, 1050 3415, 2120, 1647, 1050
UV (MeOH) λmax 203(19269), 260(15505) 203(11416), 261(12583)
[α]D 25 -41.0°(c 0.1, MeOH) -16.8°(c 0.1, MeOH)
녹는점 (melting point) 148~153 147~150
Figure 112006005741759-pat00010
본 물질에 포함되어 있는 당의 입체구조에 따른 결정은 실시예 4에서 실시하였다.
실시예 4. 화합물의 당 결정
또한, 배당체의 골격 (aglycon)에 붙어 있는 당을 결정하기 위하여 분리한 물질을 산 가수분해하여 당을 골격에서 분리한 다음 티엠에스 (TMS; trimethylsilane)로 유도체화 하여 가스 크로마토그라피 (Gas chromatography, GC)로 분석하였으며 동일 실험을 3번 반복하였다. 그 결과 아래의 GC 크로마토그램 (GC-chromatogram)에서처럼 상기의 물질에 포함된 당의 머무름 시간 (retention time)은 16.873분 이었으며 L-람노우즈 (L-rhamnose)는 16.109분이었고 L-퓨코즈 (L-fucose)는 17.532 이었으므로, 상기의 물질에 포함된 당이 L-람노우즈도 아니며 L-퓨코즈도 아님을 확인하였다 (도 7, 도 8, 도 9 참조). 최종적으로 본 물질에 결합되어 있는 당의 TMS 유도체를 1H-NMR과 프로톤-프로톤 코지 스펙트럼 (1H-1H-COSY spectrum)을 통하여 커플링 콘스턴트 값 (coupling constant)과 결합을 확인하여 당 부분이 6-데옥시-탈로오스임을 확인하였다 (도 10 참조).
전술한 바와 같이, 상기 당 부분은 용매와 온도 등의 주변 환경에 따라서 의자 형태 중에서 1C4 구조와 4C1 구조가 서로 전환될 수 있다.
(1) 당의 L-형 결정
상기 물질의 당 부분의 정확한 입체구조 (absolute configuration)는 선광도 (optical rotation, [α]D, Jasco DIP-1000, Japan, 메탄올에 녹여서 측정)로 결정하였다. 알려진 L-6-데옥시-탈로피라노사이드의 선광도 값은 -13.7°(c. 0.15)으로 음의 값을 가지며, 본 물질의 선광도 값도 -16.8°(c. 0.1, Methanol)로써 음의 값을 가짐으로 L-형 (L-form)으로 결정하였다 (참고문헌; Shibuya N, Amanto K, Azuma JI, Nishihara T, Kitamura Y, Noguchi T, Koga T. 6-Deoxy-D-talan and 6-Deoxy-L-talan. The Journal of Biological Chemistry 266: 16318-16323, 1991).
(2) 당의 아노머 ( anomer )의 결정(α, β형의 결정)
당의 아노머의 구조 결정은 하기 화학식 2에서와 같이 TMS화 된 당의 커플링 상수 (coupling constant) 값이 J H -1, H-2 (2.3Hz)로써 작으므로 α형으로 결정하였다.
Figure 112006005741759-pat00011
실시예 5. 화합물의 항진균 활성
상기의 방선균 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341에서 분리한 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 및 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드를 크립토코커스 네오포만스, 칸디다 알비칸스, 아스퍼질러스 나이거, 트리코파이톤 멘타그로파이트스 (Trichophyton mentagrophytes) 및 라이족토니아 솔라니와 같은 다양한 진균에 대한 항진균 활성을 엠아이씨 (MIC; minimal inhibition concentration; 최소저해농도) 값으로 측정하였다.
측정 방법은 위의 시험 균주를 RPMI 1640 배지 [L-글루타민은 포함되나 바이카보네이트 (bicarbonate)는 포함되지 않음. Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.] 에서 24시간 배양한 후 96-웰 (well) 시험관 (바닥이 둥근 시험관, round-bottom microtitration plates)에 0.5×103 to 2.5×103 cells/㎖의 농도로 분주한다. 그 후 시험에 사용할 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 및 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드를 각각 1㎍/㎖ 에서 30㎍/㎖의 농도 범위로 대조군을 제외한 시험관에 넣고 35℃에서 48시간 배양한 후에 가시광선 범위에서 스펙트로미터를 사용하여 성장 유무를 확인할 수 있다. 최소 저해농도 (MIC) 값은 약제가 포함되지 않은 시험관과 비교해서 80% 성장을 하지 못한 농도로 정하였다.
하기 표 4에 나타난 바와 같이 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 및 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드가 무좀을 일으키는 트리코파이톤 멘타그로파이트스에 대해서는 항진균활성을 보이지 않으나, 그 외의 전신성 진균 감염증을 일으키는 크립토코커스 네오포만스, 칸디다 알비칸스, 아스퍼질러스 나이거와 식물병원성 진균인 라이족토니아 솔라니에 대해서는 강한 항진균 활성을 보임을 알 수 있었다.
화합물의 항진균 활성 (MIC 값)
시험 균주 이트라코나졸 (㎍/㎖) 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드(㎍/㎖) 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 (㎍/㎖)
칸디다 알비칸스 > 100 6.24 12.5
크립토코커스 네오포만스 < 0.1 3.13 6.25
아스퍼질러스 나이거 > 100 1.57 3.25
트리코파이톤 멘타그로파이트스 < 0.1 > 100 > 100
라이족토니아 솔라니 - 5.24 7.45
실시예 6. 화합물의 간세포에 대한 세포 독성
상기의 방선균 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341에서 분리한 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 및 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드를 간세포인 HepG2 세포에 대해서 세포 독성을 테스트하였다.
96-웰 플레이트에 웰당 1×104개의 HepG2 세포를 100㎕첨가하고 37℃, CO2 배양기에서 12시간 배양한 다음, 검사할 화합물을 100㎕ 첨가하였다. 72시간 추가 배양한 다음 증식된 세포수를 MTT 검색법 (promega, USA)으로 사용 제품의 지침서에 따라 측정하였다.
하기 표 5에 나타난 바와 같이 간세포에 대해서 50%의 치사값을 보이는 농도 (CC50)가 100㎍/㎖이므로 세포 독성이 없었다. 따라서 무독성의 임상용 항진균 치료제로 개발할 수 있는 가능성이 있음이 예상된다.
화합물의 간세포에 대한 세포 독성
암포테리신 B 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드
CC50 (50% 치사 농도) 1.56 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖ 100 ㎍/㎖
한편, 본 발명의 바람직한 실시예는 예시의 목적을 위한 것으로, 당업자라면 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상과 범위를 통해 다양한 수정, 변경, 대체 및 부가가 가능할 것이며, 이러한 수정 및 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제니스테인 유도체는 많은 병원성 진균들에 대해서는 기존의 이트라코나졸에 비하여 월등한 항진균 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 독성 실험 결과 안정한 물질로 판단되어 본 발명의 제니스테인 유도체는 항진균제로 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1의 제니스테인 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염:
    [화학식 1]
    Figure 112007032197137-pat00036
    상기 식에서 R은 수소 또는
    Figure 112007032197137-pat00037
    이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1a의 제니스테인 4',7-다이-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 또는 화학식 1b의 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드인 것을 특징으로 하는 제니스테인 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염:
    [화학식 1a]
    Figure 112007032197137-pat00038
    [화학식 1b]
    Figure 112007032197137-pat00039
    .
  3. 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341 균주 (기탁번호: KCCM-10710P)로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물의 생산 방법.
  4. 제 1 항의 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 포함하는 항진균용 조성물.
  5. 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM-341 균주 (기탁번호: KCCM-10710P)의 추출물을 포함하는 항진균용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 추출물은 하기 화학식 1a 및 화학식 1b로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물:
    [화학식 1a]
    Figure 112007032197137-pat00040
    [화학식 1b]
    Figure 112007032197137-pat00041
    .
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물은 동물 또는 식물에 투여되는 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 진균은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 크립토코커스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 및 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 중에서 선택되는 병원성 진균인 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물.
  9. 서열번호 1에 나타낸 16s rRNA를 가지는 키타사토스포라 키퍼낸시스 MJM 341 (기탁번호: KCCM-10710P).
KR1020060007672A 2005-11-25 2006-01-25 제니스테인 7-α-L-6-데옥시-탈로피라노사이드 유도체 및 이를 함유하는 항진균제 KR100823676B1 (ko)

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