ES2269084T3 - Procedimiento de purificacion de 1,3 propanodiol a partir de un medio de fermentacion. - Google Patents

Procedimiento de purificacion de 1,3 propanodiol a partir de un medio de fermentacion. Download PDF

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Abstract

Procedimiento de purificación de 1, 3 propanodiol a partir de un medio de fermentación de un microorganismo productor de 1, 3 propanodiol, que comprende 1, 3 propanodiol y coproductos de la fermentación constituidos como mínimo por glicerol, caracterizado porque se procederá a: a) separar el microorganismo productor de 1, 3 propanodiol de los otros componentes del medio de fermentación de manera que se obtiene una solución acuosa clarificada, b) pasar dicha solución acuosa clarificada sobre una resina de intercambio de cationes, de manera que se obtenga como mínimo una fracción que comprende 1, 3 propanodiol purificado, y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la fermentación, c) recuperar el 1, 3 propanodiol.

Description

Procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol a partir de un medio de fermentación.
La presente invención se refiere a un procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol a partir de un medio de fermentación, que comprende 1,3 propanodiol y coproductos de la fermentación.
La presente invención se refiere, de manera más específica, a un procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol por cromatografía sobre resina catiónica de una solución acuosa clarificada procedente de dicho medio de fermentación, para obtener como mínimo una fracción que comprende 1,3 propanodiol purificado, y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la fermentación.
En el sentido de la presente invención, se comprende por "solución acuosa clarificada" la solución acuosa obtenida después de la eliminación de los microorganismos productores del 1,3 propanodiol del medio de fermentación.
Se comprende igualmente por "coproductos de la fermentación" los productos que resultan de un metabolismo secundario tales como, en especial, el glicerol, o el sustrato no convertido tal como, por ejemplo, glucosa o glicerol, o incluso residuos diversos procedentes de los elementos nutritivos del medio de fermentación o que proceden del metabolismo bacteriano, tales como ácido acético, etanol, o 2.3 butanodiol.
La presente invención se refiere, más particularmente todavía a un procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol por cromatografía, que utiliza una resina catiónica cuyo catión se escoge ventajosamente entre el grupo constituido por lantano, plomo, cinc, hierro y aluminio.
La presente invención se refiere finalmente a un tratamiento, por microorganismos que convierten de manera específica el glicerol en 1,3 propanodiol, de dicha solución acuosa clarificada y/o fracciones que comprenden, respectivamente, glicerol y/o una mezcla de glicerol y de 1,3 propanodiol, obtenidos por la separación cromatográfica.
Los métodos de purificación del 1,3 propanodiol a partir del medio de fermentación, conocidos en general en el estado de la técnica, se basan principalmente en la sucesión de etapas que consisten en extraer el 1,3 propanodiol de dicho medio de fermentación mediante disolventes orgánicos y/o efectuar su destilación.
Las técnicas de destilación convencionales habitualmente utilizadas en estos procedimientos de purificación requieren una aportación de energía importante que repercute en el coste del producto final purificado de este modo. En efecto, la temperatura de destilación del 1,3 propanodiol es de 214ºC.
MALINOWSKI (por ejemplo, en su artículo Biotechnology Techniques, 1999, 13, páginas 127-130) ha propuesto un procedimiento de extracción líquido-líquido por disolventes orgánicos del 1,3 propanodiol, a partir de soluciones acuosas diluidas que lo contienen.
No obstante, este procedimiento de purificación requiere la manipulación de grandes cantidades de disolventes de tipo pentanol (hasta nonanol), o hexanal (hasta decanal) y presenta sobre todo una reducida eficacia de extracción y de separación del 1,3 propanodiol.
MALINOWSKI reconoce, por otra parte, la necesidad de recurrir a un método alternativo de mayor rendimiento, ya que el 1,3 propanodiol presenta un carácter demasiado hidrofílico.
Se ha propuesto igualmente como alternativa por BROEKHUIS y otros en Ind. Eng. Chim. Res., 1994, 33, páginas 3230-3237, recurrir a compuestos químicos de tipo formaldehído o acetaldehído para formar un derivado dioxolano del 1,3 propanodiol, lo que permite entonces su extracción por un disolvente.
No obstante, si bien el procedimiento consume menos energía, el coste de los componentes químicos utilizados hace el procedimiento de extracción y de purificación impracticable, puesto que es necesario además regenerar el 1,3 propanodiol a partir de su derivado dioxolano.
De la misma manera, los procedimientos de formación de complejo del 1,3 propanodiol con organoboratos propuestos por BROEKHUIS y otros en Ind. Eng. Chim. Res., 1996, 35, paginas 1206-1214, requieren importantes medios de regeneración del 1,3 propanodiol, lo que hace sus procedimientos de extracción no viables económicamente.
De todo lo anterior, resulta por lo tanto que existe una necesidad no satisfecha de disponer de un procedimiento simple de realizar, que permite purificar el 1,3 propanodiol a partir del medio de fermentación de un microorganismo productor de 1,3. propanodiol.
Con la preocupación de desarrollar un procedimiento que permita responder mejor que los existentes en las limitaciones de la práctica, la sociedad solicitante ha comprobado que una purificación eficaz de 1,3 propanodiol a partir de dicho medio de fermentación se podía realizar utilizando un medio que consiste en realizar una separación cromatográfica específica de componentes del medio de fermentación.
Un procedimiento de separación de 1,3 propanodiol por cromatografía a partir de un medio de fermentación a sido propuesto por GÜNZEL y otros (por ejemplo, en DECHEMA BIOTECHNOLOGY Conferences, 1990, 4 pt. B., páginas 713-716), que consiste en utilizar técnicas de adsorción, y en especial una adsorción sobre zeolitas hidrofóbicas tales como silicato 1 o zeolitas NaY desaluminadas, o incluso carbón activado.
No obstante, las capacidades de adsorción del 1,3 propanodiol sobre estos soportes son muy mediocres, y además se lamenta la fijación de ciertos coproductos de la fermentación.
El procedimiento de purificación del 1,3 propanodiol a partir de un medio de fermentación de un microorganismo productor de 1,3 propanodiol, que comprende 1,3 propanodiol y coproductos de fermentación constituidos por lo menos de glicerol, de acuerdo con la invención, se caracteriza por lo tanto por proceder a:
a)
separar el microorganismo productor de 1,3 propanodiol de los otros componentes del medio de fermentación de manera que se obtiene una solución acuosa clarificada,
b)
pasar dicha solución acuosa clarificada sobre una resina de intercambio catiónico, de manera que se obtiene como mínimo una fracción que comprende el 1,3 propanodiol purificado, y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la fermentación,
c)
recuperar el 1,3 propanodiol.
El microorganismo productor del 1,3 propanodiol se escoge dentro del grupo de los microorganismos recombinantes capaces, por ejemplo, de producir 1,3 propanodiol a partir de glucosa, es decir, microorganismos recombinantes del tipo E. Coli o S. cerevisiae tales como se describen en las solicitudes de Patente WO 96/35796 y WO 98/21341.
La solicitante ha observado que estos microorganismos producen mayoritariamente, por una parte, 1,3 propanodiol y, por otra, especialmente glicerol como coproducto de la fermentación. Se encuentra glucosa igualmente de forma eventual en el medio de fermentación, que no se ha consumido por completo, y un poco de ácido acético.
La primera etapa del procedimiento según la presente invención consiste en separar los microorganismos productores de 1,3 propanodiol de los otros componentes del medio de fermentación, de forma que se obtiene una solución acuosa clarificada.
Esta separación se realiza por cualquier técnica conocida por el técnico en la materia y puede consistir en microfiltrado, centrifugación o precipitación de dichos microorganismos por agentes floculantes. Estas técnicas pueden ser igualmente combinadas.
En el procedimiento según la invención, es preferible una técnica de microfiltrado, utilizando una membrana de microfiltrado cuya porosidad está adaptada a las dimensiones de los microorganismos considerados, por ejemplo, membranas TECHSEP de 0,1 \mum de porosidad para microorganismos productores de 1,3 propanodiol del tipo E. coli recombinante.
Se escoge preferentemente hacer pasar la solución acuosa clarificada obtenida de este modo por una columna de carbón activado y desmineralizarla sobre una resina catiónica fuerte y una resina aniónica débilmente básica, o sobre una resina catiónica fuerte y una resina aniónica fuertemente básica, por ejemplo, de tipo acrílico, utilizando las técnicas conocidas de manera general por el técnico en la materia.
Estas etapas permiten eliminar los desperdicios celulares y las proteínas resultantes de la posible lisis de los microorganismos productores de 1,3 propanodiol, y el desalado conduce a la eliminación de la carga mineral del medio de fermentación.
Se puede escoger, a continuación, tratar dicha solución acuosa clarificada por un microorganismo que convierte el glicerol residual en 1,3 propanodiol.
Este microorganismo es escogido entonces entre el grupo constituido por microorganismos de los tipos Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Ilyobacter, Pelobacter o Enterobacter y es preferentemente un Citrobacter o un Clostridium.
En una forma de realización más preferente del procedimiento según la invención, se escoge la utilización de este microorganismo capaz de convertir el glicerol en 1,3 propanodiol en forma libre o inmovilizada, y preferentemente en forma inmovilizada.
Se puede realizar esta inmovilización con ayuda de alginato cálcico, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente USA 5.164.309 para microorganismos del tipo Citrobacter, o utilizar la tecnología desarrollada por la sociedad GENIALAB® BIO TECHNOLOGIE para microorganismos del género Clostridium (comunicación al Congreso ECB9 de Bruselas, Julio 1999, en la sesión Bioencapsulation processes).
Esta etapa de conversión del glicerol residual en 1,3 propanodiol permite, con este hecho, aumentar la concentración de 1,3 propanodiol en la solución clarificada, y por lo tanto disminuir el componente de glicerol de los constituyentes de dicha solución acuosa clarificada, lo que facilita la separación cromatográfica propiamente dicha.
La segunda etapa del procedimiento según la invención consiste en hacer pasar la solución acuosa clarificada sobre una resina de intercambio catiónico.
De manera ventajosa, el catión se escoge dentro del grupo constituido por lantano, plomo, hierro, zinc y aluminio.
Esta etapa es efectuada de forma que se obtenga como mínimo una fracción que comprende 1,3 propanodiol purificado, y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la fermentación.
La forma de realización de esta separación cromatográfica es indiferente. Es posible escoger una separación cromatográfica discontinua, o un procedimiento continuo de separación cromatográfica.
Esta etapa puede ser conducida ventajosamente sobre una resina de intercambio catiónico, fuertemente ácida, del tipo de poliestireno ácido sulfónico, reticulada como mínimo al 4%, preferentemente como mínimo 7%, de divinilbenceno.
La elución será realizada en agua, lo que constituye una característica importante del procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol según la invención, puesto que ningún disolvente orgánico puede ser utilizado para ello. El procedimiento es por lo tanto apropiado y satisface las normas de protección ambientales.
En una primera forma de realización del procedimiento según la invención, se prefiere cargar la resina con un catión escogido entre el grupo constituido por lantano, plomo y hierro.
La sociedad solicitante ha comprobado que la elección de esos cationes permite asegurar una separación eficaz de los componentes de dicha solución clarificada, tal como se indicará a continuación a modo de ejemplo, con una elución de la fracción que comprende exclusivamente el 1,3 propanodiol en las primeras fracciones de la cromatografía.
En un segundo modo de realización del procedimiento según la invención, se escoge un catión en el grupo constituido por el zinc y el aluminio.
La sociedad solicitante ha comprobado que esta separación cromatográfica conduce a la eliminación de todos los coproductos de fermentación del 1,3 propanodiol en las primeras fracciones de elución, lo que autoriza la salida de dicho 1,3 propanodiol en las últimas fracciones cromatográficas.
La sociedad solicitante recomienda, en esta etapa de realización del procedimiento según la invención, reunir las fracciones eventuales que contienen glicerol como coproducto de la fermentación, y someterlas a un tratamiento por los microorganismos capaces de convertir el glicerol en 1,3 propanodiol, de manera que se obtiene una fracción enriquecida en 1,3 propanodiol.
A continuación, es posible reunir esta fracción enriquecida de este modo en 1,3 propanodiol con las fracciones de 1,3 propanodiol purificado obtenidas a nivel de la etapa de separación cromatográfica que se han mencionado anteriormente.
No obstante, es preferible reinyectar dicha fracción enriquecida en 1,3 propanodiol más arriba de la separación cromatográfica para completar la purificación, en caso necesario.
La última etapa del procedimiento según la invención consiste en reunir todas las fracciones cromatográficas que contienen 1,3 propanodiol.
Otras características y ventajas de la invención aparecerán en la lectura de los ejemplos siguientes, que, no obstante, solamente tienen carácter ilustrativo y no limitativo.
Ejemplo 1
Un medio de fermentación que comprende 90,5 g/l de 1,3 propanodiol, 28,7 g/l de glicerol, obtenido por fermentación de E. coli recombinante que produce 1,3 propanodiol a partir de glucosa en condiciones tales como las que se describen en la solicitud de Patente WO 96/35796, es sometido a microfiltrado sobre membrana TECHSEP de porosidad 0,1 \mum a efectos de eliminar las células.
La fermentación será interrumpida, en este caso cuando la totalidad de la glucosa introducida ha sido consumida por el microorganismo.
La solución acuosa clarificada, obtenida de este modo encierra algunos desperdicios celulares y una carga iónica de 70 meq/l.
Se ha procedido al paso sobre columna de carbón activado para eliminar las proteínas, seguido de una etapa de desmineralización para eliminar los iones residuales del medio de fermentación que todavía se encuentran presentes, y ello, por paso sobre resina catiónica fuerte y después sobre resina débilmente básica de tipo acrílico.
La solución clarificada desproteinizada de este modo y desalada presenta un contenido de materia seca de 12% en peso.
Esta solución es sometida a continuación a una separación cromatográfica sobre resina de intercambio de cationes PCR 732 PUROLITE constituida por polestileno ácido sulfónico reticulado por 7% de divinilbenceno, en el que el catión es lantano.
Siendo esta resina inicialmente una resina en forma H, se procede a la substitución del catión por percolación de la resina con una solución de cloruro de lantano a 200 g/l, hasta que más del 98% de la capacidad de la columna se encuentre en forma de lantano, lo que se determina por el seguimiento del pH de la solución en la salida de la columna.
350 ml de esta resina se colocan entonces en una columna de 2 m de altura, por una sección de 15 mm.
Se introducen 2,3 ml de la solución clarificada desproteinizada y desalada en dicha columna. La elución se realiza con agua introducida con un caudal de 3 ml/min.
La temperatura del sistema se fija a 65ºC.
La detección de los componentes de las fracciones recogidas en la salida de la columna se realiza por utilización de un detector refractométrico R401 comercializado por la sociedad WATERS, relacionado con una tabla de trazado y su análisis se realiza por HPLC en columna BCX6 en forma de calcio a 6% de DVB comercializado por la sociedad BIORAD, acoplado a un detector refractométrico.
Se obtiene una primera fracción de 39 ml que contiene el 1,3 propanodiol a una concentración de 2,0 g/l (es decir, un rendimiento de 31,9%, porcentaje expresado con relación a la cantidad en peso de los compuestos eluídos por dicha columna).
Las otras dos fracciones contienen respectivamente:
-
51 ml de una mezcla de glicerol a 0,8 g/l y de 1,3 propanodiol a 2,7 g/l (es decir un rendimiento de 57,9%).
-
50 ml de glicerol a 0,5 g/l (es decir un rendimiento de 8,5%).
Estas dos fracciones han sido recogidas, y a continuación sometidas a un tratamiento mediante Clostridium butyricum NRRL B-1024 inmovilizados en forma LENTIKATS®, facilitado por la sociedad GENIALAB TECHNOLOGIE.
La conversión total del glicerol ha sido conducida, permitiendo reunir todas las fracciones que contienen 1,3 propanodiol en una solución de alta pureza.
Ejemplo 2
La separación cromatográfica ha sido realizada en las mismas condiciones operativas que en el ejemplo 1, pero con una resina catiónica cuyo catión es el plomo.
Se obtiene una primera fracción de 48 ml que contiene el 1,3 propanodiol con una concentración de 3,0 g/l (es decir, un rendimiento del 47%, porcentaje expresado con relación a la cantidad en peso de los compuestos eluídos de dicha columna).
Las otras dos fracciones contienen, respectivamente:
-
54 ml de una mezcla de glicerol a 0,7 g/l y de 1,3 propanodiol a 1,4 g/l (es decir un rendimiento de 37,5%),
-
70 ml de glicerol a 0,5 g/l (es decir un rendimiento del 11%).
La conversión total de glicerol ha sido conducida por los Clostridium butyricum NRRL B-1024 inmovilizados en forma LENTIKATS®, permitiendo reunir todas las fracciones que contienen 1,3 propanodiol en una solución de alta pureza.

Claims (8)

1. Procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol a partir de un medio de fermentación de un microorganismo productor de 1,3 propanodiol, que comprende 1,3 propanodiol y coproductos de la fermentación constituidos como mínimo por glicerol, caracterizado porque se procederá a:
a)
separar el microorganismo productor de 1,3 propanodiol de los otros componentes del medio de fermentación de manera que se obtiene una solución acuosa clarificada,
b)
pasar dicha solución acuosa clarificada sobre una resina de intercambio de cationes, de manera que se obtenga como mínimo una fracción que comprende 1,3 propanodiol purificado, y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la fermentación,
c)
recuperar el 1,3 propanodiol.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el catión de la resina de intercambio de cationes es escogido entre el grupo constituido por lantano, plomo, hierro, zinc y aluminio.
3. Procedimiento según una u otra de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la solución acuosa clarificada es pasada sobre una columna de carbón activado y es desmineralizada por una resina catiónica fuerte y una resina aniónica débilmente básica, o sobre una resina catiónica fuerte y una resina aniónica fuertemente básica.
4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la solución acuosa clarificada es tratada con un microorganismo que convierte el glicerol en 1,3 propanodiol.
5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las fracciones de cromatografía de la etapa b), que comprenden especialmente glicerol como coproducto de la fermentación, son tratadas con un microorganismo que convierte el glicerol en 1,3 propanodiol.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado porque las fracciones tratadas de este modo son reintroducidas más arriba de la etapa de separación cromatográfica.
7.Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el microorganismo que convierte el glicerol en 1,3 propanodiol es escogido en el grupo constituido por los microorganismos de los géneros Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Ilyobacter, Pelobacter o Enterobacter, y es preferentemente un Citrobacter o un Clostridium.
8. Procedimiento, según la reivindicación 7, caracterizado porque el microorganismo que convierte el glicerol en 1,3 propanodiol es utilizado en forma libre o inmovilizada, y preferentemente en forma
inmovilizada.
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