ES2268894T3 - Agonistas y antagonistas de receptores de benzodiazepina de tipo periferico. - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para inducir una respuesta hipertrófica en miocitos cardiacos que comprende poner en contacto dichos miocitos con una cantidad eficaz de un agonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP), en el que dicho agonista es un compuesto orgánico seleccionado del grupo que consiste en benzodiazepinas, carboxamidas de isoquinolina, imidazopiridinas, 2-aril-3- indolacetamidas, y pirrolobenzoxazepinas.

Description

Agonistas y antagonistas de receptores de benzodiazepina de tipo periférico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de agonistas y antagonistas de los receptores de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP). Más particularmente, la invención se refiere al uso de agonistas y antagonistas de RBTP en el diagnóstico y tratamiento de la hipertrofia cardiaca y otros estados circulatorios.

Antecedentes de la invención

En respuesta a los estímulos hormonales, fisiológicos, hemodinámicos y patológicos, las células del músculo ventricular adultas pueden adaptarse a aumentos de cargas de trabajo mediante la activación de un proceso hipertrófico. Este proceso se caracteriza por un aumento del contenido en proteína contráctil de las células del músculo cardiaco sin una respuesta proliferativa debido a que el cardiomiocito adulto esta diferenciado en el extremo y ha perdido su capacidad para dividirse. Por lo tanto, el crecimiento cardiaco durante el proceso hipertrófico resulta en primer lugar de un aumento en el contenido de proteína por cardiomiocito individual, con poco o ningún cambio en el número de células. La adquisición del fenotipo hipertrófico cardiaco depende en parte de la activación del programa del gen del músculo cardiaco.

Además de la inducción de componentes específicos de la proteína contráctil, la hipertrofia ventricular también se caracteriza por alteraciones en la expresión de ciertas proteínas no contráctiles, tales como el péptido natriurético auricular (ANP, también denominado ANF). Durante el desarrollo embrionario, el gen del ANP se expresa tanto en la aurícula como en el ventrículo. Sin embargo, poco después del nacimiento la expresión del ANP se regula por disminución en el ventrículo y la expresión se confina principalmente en la aurícula. Tras la inducción de la hipertrofia, el ANP vuelve a expresarse en el ventrículo. Por lo tanto, la expresión de ANP puede considerarse un marcador de proteína no contráctil de la hipertrofia ventricular cardiaca.

La hipertrofia ventricular es inicialmente un mecanismo compensatorio mediante el cual el corazón intenta contrarrestar los efectos de condiciones tales como sobrecarga de presión, pérdida de tejido contráctil, obstrucción del flujo sanguíneo, o aumento de la demanda periférica de flujo sanguíneo, todos los cuales pueden generarse por una variedad de estímulos fisiológicos y patológicos. En algunas circunstancias, tales como lesión o deterioro funcional del corazón, se desea una respuesta hipertrófica normalmente a corto plazo, compensada. De manera similar, a menudo se observa hipertrofia cardiaca, por ejemplo, de ventrículo izquierdo (hipertrofia fisiológica) en algunos atletas sumamente entrenados, sin ninguna complicación cardiovascular aparente. Sin embargo, en algunas circunstancias la respuesta hipertrófica puede contribuir eventualmente a la disfunción cardiaca. Estas circunstancias incluyen, pero no se limitan a, hipertrofia excesiva, hipertrofia prolongada, o hipertrofia que se produce en el contexto de factores tóxicos o concentraciones tóxicas de factores que, cuando se combinan con la respuesta hipertrófica de los miocitos cardiacos, da como resultado una disfunción mecánica, disfunción de la conducción eléctrica, pérdida de elasticidad de la pared cardiaca, o estimulación de la fibrosis. En estos casos la hipertrofia se denomina hipertrofia descompensada, y se considera deseable un antagonismo de la hipertrofia cardiaca. Una vez que se consigue la transición de hipertrofia de compensada a descompensada, la progresión hasta un fenotipo de insuficiencia cardiaca terminal a menudo sigue rápidamente.

La insuficiencia cardiaca afecta a aproximadamente cinco millones de americanos. Los nuevos casos de insuficiencia cardiaca son de alrededor de 400.000 cada año. La patofisiología de la insuficiencia cardiaca congestiva es más bien compleja. En general, la insuficiencia cardiaca congestiva es un síndrome caracterizado por una disfunción del ventrículo izquierdo, reducción de la tolerancia al ejercicio, empeoramiento de la calidad de vida, y acortamiento marcado de la esperanza de vida. La disminución de la contractilidad del ventrículo izquierdo conduce a una reducción del gasto cardiaco con una vasoconstricción consecuente sistémica arterial y venosa. Esta vasoconstricción, que provoca el ciclo vicioso de reducciones adicionales del volumen sistólico seguido de un aumento de la elevación de la resistencia vascular, parece estar mediado, en parte, por el sistema renino-angiotensínico. Numerosas etiologías contribuyen al desarrollo de ICC, incluyendo enfermedades principales de, o ataques de, el propio miocardio, defectos cardiacos, hipertensión, inflamación, nefropatía y enfermedad vascular. Estos estados conducen a la hipertrofia y remodelado de los ventrículos cardiacos que, si no se controla, reducen en último caso el rendimiento mecánico del corazón. Las fuerzas asociadas con la incapacidad del corazón de bombear sangre conducen finalmente a la liberación en la circulación de neurohormonas tales como catecolaminas, renino-angiotensina, aldosterona, endotelina y factores relacionados. Se ha demostrado que las elevaciones de los niveles en plasma de muchas de estas neurohormonas circulantes pueden tener un impacto perjudicial en el desenlace de pacientes con ICC. Se cree que la producción local de estos factores neurohormonales en el corazón contribuye de manera central a la enfermedad. Por lo tanto, una estrategia terapéutica importante ha sido bloquear este eje neurohormonal que contribuye a la patogénesis de la
enfermedad.

Factores que se sabe que contribuyen de manera central a la patofisiología de la cardiopatía se biosintetizan en el propio corazón. Estos factores se producen en miocitos cardiacos, fibroblastos, células del músculo liso y endoteliales, y células inflamatorias asociadas con el miocardio. Por ejemplo, se ha mostrado que el corazón contiene su propio sistema renino-angiotensínico. Se cree que el bloqueo del sistema renino-angiotensínico cardiaco contribuye significativamente a la eficacia terapéutica de la clase terapéutica de agentes conocidos como inhibidores de la enzima de conversión de la angiotensina (ACE).

El corazón también produce otros factores que incluyen, pero no se limitan a, endotelinas, bradiquinina, adrenomedulina, factor de necrosis tumoral, factores del crecimiento transformantes, y péptidos natriuréticos. Aunque hay enfoques terapéuticos de éxito basados en la modulación de estos factores secundarios, hay una necesidad de concebir estrategias diferentes que modulen directamente la respuesta hipertrófica cardiaca.

Por lo tanto, hay un gran interés en intentar entender los mecanismos que inducen y controla la hipertrofia ventricular y de hecho examinar la transición de hipertrofia de compensada a descompensada. Hay varios estímulos fisiológicos que inducirán una respuesta hipertrófica en los miocitos aislados tales como endotelina-1, TGF-\beta y angiotensina II. Adicionalmente, la fenilefrina agonista adrenérgia \alpha es un inductor potente y bien caracterizado de la hipertrofia en cardiomiocitos aislados.

En el transcurso de nuestros estudios genómicos funcionales, se encontró que el gen de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP) se expresaba de manera diferencial en los corazones de varios modelos de rata con insuficiencia cardiaca. Los receptores de benzodiazepina de tipo periférico representan un subconjunto de la familia de receptores de benzodiazepina distinguido por su localización fuera del sistema nervioso central (SNC). Se ha publicado una revisión de RBTP, que incluye la estructura molecular, propiedades biológicas y posibles funciones fisiológicas por Zisterer y Williams, Gen Pharmac 29, 305-314 (1997).

Los ligandos de RBTP se han conocido durante muchos años y se conocen ampliamente los efectos antidepresores del SNC de los agonistas de RBTP (por ejemplo, Valium). Se ha encontrado que el tono vagal disminuye tras la administración por vía intravenosa de diazepam (Adinoff et al., Psychiatry Research 41: 89-97 [1992]). Hay evidencias del control del tono vagal cardiaco por receptores de benzodiazepina (DiMicco, Neuropharmacology 26: 553-559 [1987]). Se ha descrito que los ligandos de RBTP Ro5.4864 y PK 11195, pero no el diazepam, disminuyen la función cardiaca en un modelo de corazón de rata que trabaja aislada (Edoute et al., Pharmacology 46: 224-230 [1993]). También se ha informado de que Ro5-4864 aumenta el flujo coronario en un corazón de rata Langendorf perfundido aislada sin afectar a la frecuencia cardiaca ni a la contractilidad del ventrículo izquierdo. El PK 11195 no antagonizó este efecto vasodilatador (Grupp et al., Eur. J. Pharm. 143: 143-147 [1987]). En una preparación de corazón de rata aislada, el diazepam indujo un efecto inotrópico negativo transitorio seguido de una respuesta inotrópica positiva. La inotropía positiva fue antagonizada por PK 11195. (Leeuwin et al., Eur. J. Pharm. 299: 149-152 [1996]). El diazepam aumentó la fuerza contráctil en el corazón de rata Langendorf (Leeuwin et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 326: 5-12 [1993]). Se ha mostrado que Ro5-4864 tiene un pequeño (20%)efecto de disminución de la amplitud de contracción (efecto inotrópico negativo) de las filamentos auriculares humanos que no fue antagonizado por PK 11195 (Shany et al., Eur. J. Pharm. 253: 231-236 [1994]). En una preparación de corazón de cobaya, Ro5-4864 disminuyó la duración de la contractilidad y potencial de acción intracelular. El diazepam fue menos eficaz y el clonazepam ineficaz. Los efectos de Ro5-4864 fueron revertidos por PK 11195 pero no por un antagonista específico del RB del SNC. (Mestre et al., Life Sciences 35: 953-962 [1984]). Se demostró la presencia de sitios de unión a RBTP en los corazones de perros y seres humanos in vivo mediante tomografía de emisión de positrones usando [^{11}C]-PK 11195. (Charmonneau et al., Circulation 73: 476-483 [1986]). También se ha notificado que Ro5-4862 y dipiridamol pueden completar la unión de [^{3}H]diazepam al tejido cardiaco. El diazepam potencia las acciones de la adenosina sobre el músculo liso y cardiaco aislado y la acción vasodilatadora coronaria de la adenosina en perros. Hay evidencias de que el diazepam puede estar actuando de una manera similar al dipiridamol inhibiendo la captación de adenosina (Davies y Huston, Eur. J. Pharm. 73: 209-211 [1981]).

Aunque hay informes de diversos efectos del diazepam y sus derivados en la función cardiaca, estos efectos se han atribuido a sus efectos antidepresores en la disminución del tono vagal y no mediante efectos directos sobre la función de los cardiomiocitos.

Hay una necesidad de identificación de factores endógenos y exógenos que provoquen o inhiban el fenotipo hipertrófico ventricular. Específicamente, hay una necesidad de identificar factores que sean terapéuticos o instrumentales en la identificación de factores terapéuticos eficaces en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca o como agentes preventivos para el tratamiento de pacientes con alto riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de agonistas y antagonistas de receptores de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP), tales como ligandos de RBTP, para inducir o inhibir la hipertrofia cardiaca. En particular, la invención se refiere al uso de antagonistas de RBTP en la fabricación de una composición para la prevención o tratamiento de hipertrofia cardiaca descompensada y eventualmente, insuficiencia cardiaca. La invención también se refiere al uso de agonistas de los RBTP en el control de estados que demandan un aumento del flujo sanguíneo o gasto cardiaco, incluyendo, pero sin limitarse a, lesión o deterioro funcional del corazón, aumento de la demanda debido a ejercicio físico por los atletas o por aquellos que necesitan ayuda suplementaria para mejorar el rendimiento cardiaco como resultado de una discapacidad, existencia de derivaciones auriculoventriculares (A-V), una predisposición adquirida o heredada a la disfunción de la proteína contráctil cardiaca, etc.

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En un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para inducir una respuesta hipertrófica en miocitos cardiacos poniendo en contacto los miocitos con una cantidad eficaz de un agonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para reducir la respuesta hipertrófica de miocitos cardiacos poniendo en contacto los miocitos con una cantidad eficaz de un antagonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP).

Aún en otro aspecto, la invención se refiere a la fabricación de una composición para el tratamiento (incluyendo la prevención) de la hipertrofia cardiaca que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de RBTP. La hipertrofia cardiaca que va a tratarse es preferiblemente hipertrofia descompensada, y el tratamiento preferido es la intervención temprana usada para prevenir, revertir o ralentizar la progresión de este estado.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la fabricación de una composición para inducir hipertrofia cardiaca compensada que comprende una cantidad eficaz de un agonista de RBTP. Este enfoque se usa normalmente en una situación en la que un aumento del flujo sanguíneo o de la presión sería beneficioso sin temor a consecuencias adversas, tal como insuficiencia cardiaca congestiva o descompensación. Por lo tanto los agonistas de RBTP son particularmente útiles en el tratamiento (incluyendo la prevención) de estados en los que se desea un mecanismo compensatorio, normalmente a corto plazo, para responder a factores tales como sobrecarga de la presión, pérdida de función o tejido contráctil, obstrucción del flujo sanguíneo, o aumento de la demanda periférica de flujo sanguíneo o gasto cardiaco.

Todavía en un aspecto adicional, la invención se refiere a un método de selección de antagonistas de RBTP poniendo en contacto un miocito cardiaco de fenotipo hipertrófico con una molécula candidato, y monitorizando la reducción de la hipertrofia.

En un aspecto diferente, la invención se refiere a la fabricación de una composición para la prevención de hipertrofia cardiaca descompensada que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de RBTP. En una realización preferida, se evita la progresión de hipertrofia cardiaca compensada en hipertrofia cardiaca descompensada.

En otro aspecto, la invención se refiere a la fabricación de una composición para el tratamiento (incluyendo la prevención) de insuficiencia cardiaca que comprende una cantidad eficaz de un antagonista de RBTP. La insuficiencia cardiaca puede ser insuficiencia cardiaca congestiva debida a isquemia, exposición a toxina o droga, infección, metabolismo alterado, predisposición genética a la función contráctil alterada, u otra causa.

Los agonistas y antagonistas de RBTP se seleccionan de las clases químicas de benzodiazepinas, carboxamidas de isoquinolina, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas, y pirrolobenzoxazepinas. Un agonista particularmente preferido es Ro5-4864, mientras que un antagonista particularmente preferido es PK 11195.

Los agonistas o antagonistas de RBTP pueden administrarse por vía oral, mediante administración por vía intravenosa o subcutánea, o mediante infusión directa en la vasculatura coronaria, espacio pericadiaco, o tejido cardiaco, de manera aguda o crónica o recurrente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el análisis de inmunotransferencia de ARN de ANP y BNP en ratas con HVI. Se sacrificaron ratas con ligadura aórtica y control con operación simulada a las 10 semanas y 20 semanas tras la cirugía. Se extrajo ARN del ventrículo izquierdo de cada animal y se sondeó con inmunotransferencia de tipo Northern (Northern blot) para determinar transcriptos de ANP y BNP usando sondas de oligonucleótidos específicos.

La figura 2 muestra ADN amplificado mediante PCR a partir de 96 clones aleatorios de ventrículo izquierdo de rata. El producto de PCR (el 10% del total) a partir de 96 clones se cargó sobre un gel de agarosa al 1,0% y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio.

La figura 3 muestra un análisis de micromatriz de 96 clones expresados en el corazón de rata. Se imprimieron clones seleccionados aleatoriamente a partir de una biblioteca de ADNc de ventrículo izquierdo de rata sobre una micromatriz y se hibridaron con ADNc de ventrículo izquierdo de rata marcado con Cy5. La intensidad de cada sonda se expresa en pseudo-color según la escala mostrada. Los puntos en blanco resultaron de la carencia de ADN de inserto que podía amplificarse por PCR del clon correspondiente.

La figura 4 muestra los datos de expresión diferencial de genes representativos obtenidos a través de modelos de enfermedad de la presente invención y se determinaron mediante análisis de micromatriz. Se encontró que estos genes expresados diferencialmente de modelos de enfermedad representativos (ID del clon números P0204_E06, P0237_E02, P0248_011, P0228_H09, P0246_H10, P0237_B09, P0207_C03, P0214_A11, P0182_F08, P0219_H09, P0242_B03, P0268_G09) correspondían a genes humanos que codificaban para 1-8U, factores estimulantes de la prostaciclina, osf-2, ARNm de tejido específico, proteína G de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, OSF-1, gas-1, YMP, BTG2, homólogo del factor estimulante de la célula pre-B (SDF1a), receptor de benzodiazepina periférico (RBTP)y ligando celular de la anexina II (p11), respectivamente.

La figura 5 muestra los datos de alineación que comparan el ADNc que codifica para el gen del receptor de benzodiazepina de tipo periférico (P0268) de rata expresado diferencialmente con ADNc correspondiente a RBTP (SEQ ID Nos: 1 y 2).

La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de RBTP humana (SEQ ID NO: 3).

La figura 7 muestra el efecto del antagonista PK 11195 RBTP y agonista Ro5-4864 de RBTP sobre la síntesis de proteínas y síntesis de ANP en cardiomiocitos de rata neonatal.

La figura 8 muestra el efecto de PK 11195 sobre el Ro5-4864 indujo un aumento en la síntesis de ANP y proteínas en cardiomiocitos de rata neonatal.

La figura 9 muestra el efecto de Ro5-4864 sobre la actividad de la luciferasa en cardiomiocitos de rata neonatal.

La figura 10A muestra una fotografía representativa de los cultivos de control y tratados tras 24 horas de cultivo. Las figuras 10B y 10C muestran los mismos cultivos tras 96 horas de cultivo.

La figura 11 muestra la estructura química de ligandos de RBTP seleccionados, incluyendo el agonista Ro5-4864 y el antagonista PK 11195 de RBTP.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado con el que se entienden comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & sons (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4ª ed., J. Wiley & sons (Nueva York, NY 1992), proporcionan a un experto en la técnica una guía general a muchos términos usados en la presente solicitud.

Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

Los términos "receptor de benzodiazepina de tipo periférico", "RBTP", y "polipéptido RBTP", tanto si se usan en singular como en plural, se usan de manera intercambiable, y abarcan cualquier polipéptido RBTP de secuencia nativa. Tales polipéptidos RBTP pueden aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como una diversidad de tipos de tejidos humanos y no humanos, o prepararse mediante métodos recombinantes y/o sintéticos. Todos los polipéptidos de este tipo están específicamente dentro del alcance de la definición, independientemente de su modo de preparación, e incluyen variantes de los mismos. Por lo tanto, los términos "receptor de benzodiazepina de tipo periférico", "RBTP" y "polipéptido RBTP", tanto si se usan en singular como en plural, se refieren a los polipéptidos del receptor que se unen a moléculas de benzodiazepina pero son distintos de los asociados con los receptores de benzodiazepina centrales, y que tienen la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido respectivo derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos RBTP pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes y/o sintéticos. El término "RBTP" abarca específicamente formas truncadas o secretadas que se producen en la naturaleza (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), así como variantes que se producen en la naturaleza (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativo), y variantes alélicas que se producen en la naturaleza. Los RBTP representan un subconjunto de la familia de receptores de benzodiazepina que se localiza fuera del sistema nervioso central. Kruger et al., en: GABA and Benzodiazepine Receptor Subtypes, Biggio and Costa eds. págs. 1-14 (1990) notificaron la purificación, clonación y expresión de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico. Se ha clonado posteriormente el ADNc de un polipéptido RBTP de 18 kDa, identificado originalmente en el tejido cardiaco, a partir de diversas fuentes, tales como glándula suprarrenal de rata (Sprengel et al., J. Biol. Chem. 264: 20.415-20.421 [1989]); glándula suprarrenal bovina (Parola et al., J. Biol. Chem. 266: 14.082-14.087 [1991]); una línea celular de linfoma (Riond et al., Eur. J. Biochem. 195: 305-311 [1991]); y una línea celular de tumor Leydig de ratón (Garnier et al., Mol. Pharmac. 45: 201-211 [1993]). Esta proteína de 169 aminoácidos tiene aproximadamente un 80% de homología entre especies. Diversas células transfectadas con estos ADNc mostraron características de unión para los ligandos Ro5-4864 y PK 11195 de RBTP. Se ha sugerido que el RBTP es un complejo multimérico en el que el sitio de unión de PK 11195 está en la subunidad de 18 kDa, y la expresión de la unión de benzodiazepina requiere otra subunidad, denominada VDAC. Además, la proteína de 110 kDa, asociada con el RBTP, también se ha identificado tentativamente como un componente adicional del RBTP. (Véase, por ejemplo, Zisterer y Williams, citado anteriormente). Todos estos polipéptidos, solos, o en cualquier combinación funcional, están específicamente dentro de la definición de "RBTP". SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de RBTP
humano.

El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica mediada por un RBTP mediante la prevención de la unión de un agonista al RBTP, bloqueando así la actividad biológica del agonista mediada por el RBTP. De una manera similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica mediada por un RBTP, y cambia específicamente la función o expresión de un RBTP, o la eficacia de la señalización mediante un RBTP, aumentando así una actividad biológica ya existente o desencadenando una nueva actividad biológica.

"Activo" o "actividad" significa una propiedad biológica y/o inmunológica cualitativa. En el contexto de la presente invención, una actividad biológica preferida de un antagonista es la capacidad de reducir in vitro la hipertrofia mostrada por miocitos cardiacos en respuesta a un tratamiento con un agonista. Incluso más preferiblemente, un antagonista es biológicamente activo, si puede tratar (incluyendo prevenir) in vivo una cardiopatía, por ejemplo, hipertrofia cardiaca. Un agonista preferido de la presente invención podrá inducir hipertrofia cardiaca in vitro, y/o hipertrofia cardiaca compensada in vivo.

"Cardiopatía" incluye insuficiencia cardiaca congestiva, miocarditis, cardiomiopatía congestiva dilatada, cardiomiopatía hipertrófica, cardiomiopatía restrictiva, valvulopatía mitral, valvulopatía aórtica, valvulopatía tricúspide, angina de pecho, infarto de miocardio, arritmia cardiaca, hipertensión pulmonar, hipertensión arterial, hipertensión renovascular, arteriosclerosis, aterosclerosis, cardiopatía isquémica aguda o crónica, y tumores cardiacos, genes heredados o rasgos que disponen o predisponen a una función contráctil alterada, solos o en combinación con otras lesiones o estímulos, junto con cualquier enfermedad o trastorno que se refiera al sistema cardiovascular y trastornos relacionados, así como síntomas indicativos de, o relacionados con, cardiopatía y trastornos relacionados.

Tal como se usa en el presente documento, "insuficiencia cardiaca" se refiere a una anomalía de la función cardiaca en la que el corazón no bombea sangre a la frecuencia necesaria para los requisitos de los tejidos metabolizantes. La insuficiencia cardiaca puede estar provocada por una cantidad de factores, incluyendo formas isquémica, congénita, reumática, o idiopática.

Tal como se usa en el presente documento, "insuficiencia cardiaca congestiva" se refiere a un síndrome caracterizado por la disfunción del ventrículo izquierdo, reducción de la tolerancia al ejercicio, empeoramiento de la calidad de vida, o acortamiento marcado de la esperanza de vida. La disminución de la contractilidad del ventrículo izquierdo conduce a una reducción del gasto cardiaco con vasoconstricción consecuente sistémica arterial y venosa. Esta vasoconstricción, que parece estar mediada, en parte, por el sistema renino-angiotensínico, provoca el ciclo vicioso de reducciones adicionales de volumen sistólico seguido de un aumento de la elevación de la resistencia
vascular.

Tal como se usa en el presente documento, "infarto" se refiere a un área de necrosis resultante de una insuficiencia de aporte sanguíneo. "Infarto de miocardio" se refiere a necrosis de miocardio resultante de la insuficiencia de aporte sanguíneo coronario.

Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en las que el objeto es evitar o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico indeseado, tal como el desarrollo de hipertrofia cardiaca, la transición de hipertrofia compensada a hipertrofia no compensada, etc. Para los fines de esta invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la enfermedad, retraso o retardo de la progresión de la enfermedad, mejora o mitigación del estado de la enfermedad, y remisión (tanto si es parcial como total), tanto si es detectable como no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el estado o trastorno, así como aquellos propensos a tener el estado o trastorno o aquellos en los que debe evitarse el estado o trastorno. Si el estado que va a tratarse es la hipertrofia, puede ser de cualquier causa, incluyendo causas idiopáticas, cardiotrópicas, o miotrópicas, causas heredadas, o como resultado de isquemia o ataques isquémicos tales como infarto de miocardio. Normalmente, el tratamiento se realiza para detener o ralentizar la progresión de la hipertrofia, especialmente después de producirse un daño cardiaco, tal como isquemia. Preferiblemente, para el tratamiento de infartos de miocardio, el(los) agente(s) se administran inmediatamente tras el infarto de miocardio, para evitar o reducir la lesión. Cuando el objetivo es inducir hipertrofia compensada, el tratamiento es normalmente a plazo relativamente corto, y se monitoriza cuidadosamente la aparición y progresión de la hipertrofia. "Tratamiento" incluye pautas de tratamiento que incluyen la administración tanto de agonistas como de antagonistas en diversas fases de la enfermedad o estados que van a tratarse, así como tratamiento de combinación con los agonistas y/o antagonistas de RBTP de la presente invención y otros agentes
terapéuticos.

Administración "crónica" se refiere a la administración del(de los) agente(s) de una manera continua como opuesto de una manera aguda, de modo que se mantenga el efecto deseado, por ejemplo, antihipertrófico inicial, durante un periodo de tiempo extendido.

Administración "intermitente" es un tratamiento que no se realiza de manera consecutiva sin interrupción, sino que más bien es de naturaleza cíclica.

Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.

"Mamífero", para los fines del tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de deporte o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero en el presente documento es un ser humano.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para efectuar los resultados clínicos benéficos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad eficaz de un agonista o antagonista de RBTP (incluyendo ligandos de RBTP) es una cantidad que es suficiente para efectuar el tratamiento adecuado, tal como se definió anteriormente en el presente documento.

II.Modos de llevar a cabo la invención A. Ligandos de RBTP

Se conocen ligandos sintéticos de RBTP y están bien caracterizados. Tales ligandos sintéticos incluyen benzodiazepinas, tales como, por ejemplo, Ro5-4864 y Clonazepam; carboxamidas de isoquinolina, por ejemplo, PK 11195 [1-(2-clorofenil)-N-metil-N-(1-metilpropil)-3-isoquinolina] y PK 14105 carboxamida de [(2-fluoro-5-nitro-fenil)-N-metil-N-(1-metilpropil)-3-isoquinolina]; imidazopiridinas, por ejemplo, Alpidem y Zolpidem; y 2-aril-3-indolacetamidas, por ejemplo, FGIN-1-27; y pirrolobenzoxazepinas, por ejemplo, NF 182. Las estructuras químicas de algunos ligandos de RBTP sintéticos seleccionados se muestran en la figura 11. También se conocen bien ligandos de RBTP sintéticos adicionales en la técnica, y se tratan, por ejemplo, por Zister y Williams, citado anteriormente; Anzini et al., J. Med. Chem. 4275-84 (1996); Cappelli et al., J. Med. Chem. 2910-21 (1997) (análogos conformacionalmente limitados de Ro5-4864); el documento WO 96/32383 [derivados de (2-fenil-pirimidin-4-il)(oxi o amino)acetamida]; el documento FR 2.678.269 [derivados de 1-(4-clorofenil)-2-(1-piperidinil)etanol]; el documento EP 524.846 [derivados de 2-(1-piperidinil)-2-(6-(3,4-quinolin-2(1H)-ona))etanol]; el documento FR 2.669.926 (derivados de fenilurea); los documentos US 5.128.338 y EP 446.141 [derivados de imidazo(1,2-c)quinozalina]; el documento US 5.026.711 (derivados del ácido aminoquinolina o naftiridina-3-carboxílico 4 sustituidos); los documentos US 4.808.599 y EP 248.734 (derivados de carboxamida de benzotiofeno o benzofurano); y el documento EP 210.084 (derivados de amida o carbamato de iso(quinolina y quinazolina).

Los ligandos preferidos muestran una alta selectividad por RBTP, con respecto a los receptores de benzodiazepina presentes en el cerebro (RBC) o GABA. En los experimentos de unión competitiva, la diferencia en la afinidad de unión es de al menos 10 veces, más preferiblemente al menos 100 veces, lo más preferiblemente al menos 1000 veces.

Los ligandos de RBTP incluyen agonista y antagonista de RBTP. Los agonistas de RBTP representativos incluyen benzodiazepinas, por ejemplo, Ro5-4864 y sus derivados, mientras que los antagonistas de RBTP representativos incluyen carboxamidas de isoquinolina, por ejemplo, PK 11195 y PK 14105 (un derivado de nitrofenilo de PK 11195), y derivados adicionales.

B. Selección de nuevos antagonistas y agonistas de RBTP a. Identificar nuevos ligandos de RBTP

La primera etapa en la identificación de nuevos ligandos del RBTP (ya sean agonistas o antagonistas), es la selección in vitro para identificar compuestos que se unen selectivamente al receptor de tipo periférico. La unión al receptor puede probarse usando receptores de tipo periférico y derivados del cerebro aislados de sus respectivas fuentes nativas, o producidos mediante tecnología del ADN recombinante y/o síntesis química. La afinidad de unión de los compuestos candidato puede probarse mediante la unión directa (véase, por ejemplo, Schoemaker et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 285: 61-69 [1983]) o mediante unión indirecta, por ejemplo, competitiva. En los experimentos de unión competitiva, se usa normalmente la concentración de un compuesto necesaria para desplazar el 50% de otro compuesto unido al receptor (CI_{50}) como medida de la afinidad de unión. El otro ligando puede ser cualquier compuesto que se sabe que se une a RBTP con una alta afinidad y selectividad, por ejemplo, PK 11195 o Ro5-4864.

En una realización específica, con el fin de identificar ligandos novedosos, se clona el ADN que codifica para la secuencia de longitud completa del receptor de benzodiazepina periférico humano (GenBAnk M36035) en un vector de expresión que contiene un marcador que puede seleccionarse. El vector se usa para transfectar células huésped recombinantes, por ejemplo células de mamífero, por ejemplo, la línea celular de riñón embrionario humano (HEK-293). Tras varias tandas de selección se identifican líneas estables que expresan RBTP mediante inmunotransferencia de tipo Western (Western blot) usando la inmunoreactividad hacia una etiqueta de epítopo que está diseñada mediante ingeniería genética dentro del gen de RBTP. Se preparan fracciones de membrana a partir de las líneas celulares que expresan de manera estable a granel y se almacenan congeladas para la selección de alto rendimiento (HTP - high throughput). La autentificación de las fracciones de membrana que contienen RBTP se consigue mediante la reproducción de los coeficientes de unión de ligandos radiomarcados conocidos (tales como [3H]Ro5-4864). La selección de ligandos novedosos se realiza en virtud de su capacidad para competir eficazmente con [3H]Ro5-4864 en ensayos de unión competitiva. Los coeficientes de unión pueden determinarse de cualquier manera conocida, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard.

b. Distinguir entre ligandos que actúan como agonistas y antagonistas, respectivamente

La segunda etapa es distinguir entre agonistas y antagonistas de RBTP. Esto puede realizarse en experimentos in vitro o in vivo, monitorizando la respuesta de una célula tras la unión del ligando al receptor. Un agonista producirá una respuesta celular, que da como resultado un aumento de o una nueva actividad o la inhibición de una actividad celular que ya existe. En cambio, un antagonista no tendrá ningún efecto sobre la respuesta celular, más bien tendrá el efecto de evitar la unión de agonistas al los mismos sitios del receptor. Puede desearse seleccionar antagonistas de una manera que la lectura sea funcional para encontrar moléculas que activen el receptor sin afectar al(a los) sitio(s) de unión del(de los) ligando(s) nativo(s). Los antagonistas pueden seleccionarse de una manera similar.

Por ejemplo, los siguientes métodos son adecuados para identificar antagonistas y agonistas del RBTP:

1. Respuesta intrópica de corazones de rata aislada

Se perfunden corazones usando un aparato Langendorff y se mide la contracción como la presión del ventrículo izquierdo. Se inserta un globo de látex lleno de agua en el ventrículo izquierdo midiendo las oscilaciones de la fuerza del latido del corazón. Esto se cuantifica mediante la unión a un transductor de presión Gould Statham (P23ID) mediante medición continua. Tras el equilibrado, comienzan los experimentos mediante la administración del compuesto de prueba al corazón perfundido. Se expresa la respuesta inotrópica como porcentaje del cambio en la fuerza contráctil, medida cuando se observó o bien el máximo aumento o bien la máxima disminución, en comparación con la fuerza inmediatamente antes de la administración del compuesto de prueba. Los agonistas del RBTP inducirán una respuesta inotrópica positiva, mientras que los antagonistas del RBTP inducirán una respuesta inotrópica negativa.

2. Respuesta inotrópica de los filamentos del músculo auricular

Se ejercitan los filamentos del músculo de la aurícula derecha de los corazones humanos (cuando están disponibles) antes de conectar a los pacientes a una circulación extracorporal. Se dejan emerger los filamentos en un baño de tejido que contiene tampón de Krebs-Heinseleit oxigenado y se estimulan con 1,5 Hz mediante dos electrodos de platino con pulsos de onda rectangular de 10 ms de duración, 15 V por encima del umbral. Se toman muestras de los parámetros de contracción cada 5 minutos de estimulación durante no más de 90 minutos tras la recogida del tejido. Los agonistas del RBTP tendrán una respuesta inotrópica negativa, mientras que los antagonistas del RBTP tendrán una respuesta inotrópica positiva.

3. Un enfoque similar puede tomarse usando filamentos auriculares de cobaya.

4. Usando la ecocardiografía es posible medir la función cardiaca en ratas in vivo tras la administración de posibles agonistas y antagonistas de RBTP.

5. La monitorización del tono vagal, según se determina mediante cuantificación de la amplitud de la arritmia sinusal respiratoria, puede usarse para identificar agonistas de RBTP en un modelo animal adecuado. En este caso puede esperarse que un agonista de RBTP disminuya el tono vagal.

6. También pueden identificarse agonistas y antagonistas en selecciones de cultivos de tejidos in vitro para agonistas y antagonistas de RBTP. La incubación de cardiomiocitos de rata con agonistas de RBTP estimula la síntesis de ANP y proteínas. Los antagonistas pueden identificarse basándose en su capacidad para invalidar un efecto conocido de un agonista.

C. Composiciones que comprenden ligandos de RBTP

Los ligandos (agonistas o antagonistas) de RBTP pueden administrarse a un paciente en dosis terapéuticamente eficaces para tratar (incluyendo prevenir) una enfermedad específicamente circulatoria, por ejemplo cardiopatía, tal como, hipertrofia cardiaca. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a esa cantidad de compuestos suficiente para dar como resultado el tratamiento deseado.

Puede determinarse la toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren compuestos que muestran índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado al diseñar un sistema de administración que dirige tales compuestos al sitio del tejido afectado como diana con el fin de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, así, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivos celulares y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosis para su uso en seres humanos. La dosis de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro del intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración usada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de los ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de prueba, que consigue la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) según se determina en el cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con precisión dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución. Una dosis diaria normal para un agonista o antagonista de RBTP de la presente invención podría oscilar desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente, de manera preferible aproximadamente de 10 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día.

Las composiciones farmacéuticas para su uso según la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Por lo tanto, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para su administración mediante inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o de la nariz) o para administración por vía oral, bucal, parenteral o rectal.

Para la administración por vía oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); productos de relleno (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para su administración por vía oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua y otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampón, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes según sea apropiado.

Las preparaciones para la administración por vía oral pueden formularse adecuadamente para proporcionar una liberación controlada del principio activo. Para la administración por vía bucal las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formulados de una manera convencional.

Para su administración mediante inhalación, los compuestos para su uso según la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverizador de aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbón y otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Los compuestos pueden formularse para su administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases de múltiples dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógeno, antes de su uso. Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios convencionales tales como mantequilla de cacao y otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también pueden formularse como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de actuación duradera pueden administrase mediante la implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como sal moderadamente soluble.

Si se desea, las composiciones pueden presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas farmacéuticas unitarias que contienen el principio activo. Por ejemplo, el envase puede comprender lámina de metal o plástico, tal como un envase de blister. El envase o dispositivo dispensador puede acompañarse de instrucciones para la administración.

Si se administra un agonista o antagonista conjuntamente con otro agonista o antagonista, o con otro agente que tiene actividad biológica similar, los diferentes principios activos pueden formularse juntos en un vehículo excipiente apropiado para formar una composición farmacéutica. Los antagonistas de RBTP de la presente invención pueden, por ejemplo, combinarse o administrarse conjuntamente de otra forma con otros agentes terapéuticos usados en el tratamiento de hipertrofia cardiaca o estados o síntomas cardiacos asociados, incluyendo inhibidores de ACE, inhibidores de CT-1, hGHG, IGF-1, endotelina, factor inhibidor de leucocitos (LIF), factor inductor de diferenciación (DIF, factor D), inhibidor de LPL derivado de melanoma (MLPLI), péptidos natriuréticos, por ejemplo, péptido natriurético cerebral (BNP) y péptido natriurético auricular (ANP).

Ejemplo 1 Expresión diferencial de RBTP en diversos modelos de enfermedad cardiaca 1. Modelo in vivo de hipertrofia cardiaca

Se produjeron ratas con hipertrofia ventricular izquierda (HVI) esencialmente tal como se describe en Schunkert et al., 1990, citado anteriormente. La hipertrofia ventricular izquierda (HVI) se indujo mediante una sobrecarga de presión como resultado de la constricción de la aorta ascendente. Se colocó una grapa de acero inoxidable de diámetro interno de 0,6 mm en la aorta de ratas destetadas anestesiadas. Se sometieron animales control a toracotomía como operación fingida. Los animales se recuperaron de la cirugía y aparecieron sanos hasta 20 semanas, cuando fallecieron varios animales probablemente debido a insuficiencia cardiaca, que normalmente se produce en este punto (Schunkert et al., 1990, citado anteriormente). Se sacrificaron los animales y se examinaron los corazones 10 semanas y 20 semanas tras la operación. Fue evidente hipertrofia en ambos puntos de tiempo tal como se determinó mediante cambios en el peso y el espesor del ventrículo izquierdo (tabla 1), similar a los hallazgos de otros. Se sacrificaron las ratas con ligadura aórtica y los animales control operados de manera fingida y se midieron el peso del corazón, el peso del ventrículo izquierdo (VI), el espesor del ventrículo izquierdo y el peso del VI/peso corporal. Hubo 6 animales por grupo. Los datos se expresan como la media con las desviaciones estándar entre paréntesis.

TABLA 1

1

Las ratas con HVI se examinaron para determinar la expresión de ARNm de ANP que, según los datos publicados (Schunkert et al., 1995, citado anteriormente) debe aumentar en los animales enfermos. Se extrajo ARNm del ventrículo izquierdo de cada animal y se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Northern (figura 1). Los transcritos de ANP estaban significativamente elevados (5 veces) a las 10 semanas y 20 semanas con respecto a lo normal. Se examinaron los niveles de ARNm para determinar BNP (figura 1), \alpha-actina cardiaca (no mostrado) y cadena pesada de \beta-miosina (no mostrado) mediante inmunotransferencia de tipo Northern y, tal como se esperaba, estos también estaban elevados en los animales enfermos. Se trataron con sonda las inmunotransferencias para atestiguar los transcritos de ciclofilina para igual carga de ARNm. Estos datos físicos y moleculares confirman que las ratas con ligadura estaban sobrecargadas de presión y respondían con hipertrofia cardiaca. Se preparó ARNm poli A+ a partir de cada uno de los animales, tal como se describe en el presente documento, para la evaluación de los genes expresados diferencialmente en el estado de enfermedad, utilizando análisis de micromatriz en una realización preferida. En la figura 4, se facilita un resumen de los hallazgos del análisis de micromatriz y se describe en detalle a continuación.

2. Modelo in vivo de miocarditis viral

En otro ejemplo representativo, se utilizó un modelo in vivo de enfermedad cardiaca, específicamente, miocarditis viral dentro del contexto de la presente invención. La infección por CVB3 en ratones da como resultado progresión de enfermedad miocárdica, que se utilizó como un modelo para el examen de la patogénesis de la miocarditis humana inducida por virus. El virus es perjudicial directamente para las células miocárdicas pronto tras la inyección durante el periodo preinflamatorio, tal como se determina mediante evaluación citológica mediante microscopio electrónico y óptico (Arola et al., J. Med. Virol. 47:251-259 (1995); Chow et al., Lab. Invest. 64:55-64 (1991); McManus et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 68:159-169 (1993); Melnick et al., J. Expert. Med. 93:247-266 (1951)). Comenzando el día dos tras la infección, son evidentes lesiones citopáticas en los miocitos ventriculares, caracterizadas por cambios vacuolares en las células, bandas de contracción y necrosis por coagulación (McManus et al., citado anteriormente). Para el día 5 tras la infección, esta lesión miocárdica se volvió oscura por infiltrados inflamatorios, calcificación celular y edema tisular.

Los ratones A/J (H-2º) (Jackson Laboratories, Bar Harbor Maine) tenían cuatro semanas de edad cuando se recibieron en la Unidad de Cuidados Animales del Hospital de St. Paul, Universidad de British Columbia. Se aclimataron los ratones durante una semana en una sala de contención del riesgo biológico de nivel 2 de la Unidad de Cuidados Animales del Hospital de St. Paul antes del inicio del tratamiento. Cualquier ratón que muriese de manera natural durante el transcurso de la enfermedad no se incluyó en los grupos de ratones que iban a utilizarse para la extracción de ARN. Los ratones se sacrificaron mediante narcosis con CO_{2}.

El Dr. Charles J. Gauntt (Universidad de Texas, San Antonio, Texas) proporcionó amablemente CVB3 miocárdico y se almacenó a -80ºC. El virus se propagó en células HeLa (Colección Americana de Cultivos Tisulares Tipo, Rockville, MD) y se tituló de manera rutinaria antes del comienzo de los experimentos utilizando el método de ensayo de placas de lisis, con modificaciones tal como se describió previamente (Anderson et al., J. Virol. 70:4632-4645 (1996)).

Se infectaron ratones A/J adolescentes con 1 x 10^{5} ufp de CVB3 miocárdico o de manera fingida con PBS y se sacrificaron en los días 3, 9 y 30 tras la infección. Se sacrificaron de diez a quince ratones por grupo (infectados con CVB3 o inyectados de manera fingida) por punto de tiempo (días 3, 9 y 30) y se extirpó el músculo cardiaco. Tras un lavado en solución salina tamponada con fosfato estéril, se extirpó una pequeña parte del vértice del corazón y se fijó en paraformaldehído al 4%. El resto del corazón se congeló de manera ultrarrápida en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC para el futuro aislamiento de ARN.

Se fijaron secciones del corazón en paraformaldehído al 4% tamponado con DPBS nuevo durante la noche a 4ºC. El tejido fijado se deshidrató en alcoholes gradados, se aclaró en xileno, se incluyó en parafina y se seccionó para las tinciones con hematoxilina y eosina y tricrómica de Masson. También se prepararon secciones en serie para la hibridación in situ y se tiñeron con marcado de extremos libres. La extensión y gravedad de la lesión inducida por el virus (incluyendo necrosis por coagulación, necrosis en bandas de contracción y efectos citopáticos), inflamación, y fibrosis tisular y calcificación se evaluaron y puntuaron tal como se describió previamente (Chow et al., citado anteriormente).

La hibridación in situ para la localización del ARN viral de CVB3 se llevó a cabo tal como se describió previamente (Anderson et al., citado anteriormente; Hohenadl et al., Mol. Cell. Probes 5:11-20 (1991). Brevemente, se incubaron secciones de tejido durante la noche en mezcla de hibridación que contenía ribosondas específicas de cadena de CVB3, marcadas con digoxigenina. El lavado tras la hibridación estuvo seguido por bloqueo con suero de cordero normal al 2%. Se desarrolló un anticuerpo policlonal anti-digoxigenina de oveja conjugado con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim PO, Laval, Canadá) en azul de nitrotetrazolio-BCIP [5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato de toluidinio] Sigma Fast (Sigma Chemical Co.). Los cortes se contratiñeron en carmalum nuevo y se examinaron para determinar el producto de reacción mediante microscopía óptica. Se preparó ARNm poli A+ a partir de cada uno de los animales, tal como se describe en el presente documento, para la evaluación de genes expresados diferencialmente en los estados de enfermedad, utilizando análisis de micromatriz en una realización preferida. En la figura 4, se facilita un resumen de los hallazgos del análisis de micromatriz y se describe en detalle a continuación.

3. Modelo in vivo de infarto de miocardio a. Infarto de miocardio del ventrículo izquierdo

Aún en otro ejemplo representativo, se utilizó un modelo de enfermedad cardiaca, específicamente, infarto de miocardio del ventrículo izquierdo, dentro del contexto de la presente invención. El modelo de infarto de miocardio (IM) de rata utilizado se describe por Pfeffer et al., Circ. Res. 57:84-95 (1985).

Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de 7-10 semanas de edad con quetamina (80 mg/kg, i.p.) y xilazina (10 mg/kg, i.p.). Se afeitaron el tórax y el abdomen, tras lo cual se frotaron las zonas con povidona yodada y alcohol isopropílico al 70% un mínimo de tres veces, comenzando en la línea de incisión y continuando en un movimiento circular avanzando hacia la periferia. Las ratas se intubaron y se situaron en un respirador con aire ambiente a una velocidad de 55 respiraciones/min. Se realizó una toracotomía izquierda entre la cuarta y la quinta costilla, tras lo cual se exteriorizó el corazón y se ligó la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD, "left anterior descending") con sutura de seda. Se empleó la misma intervención quirúrgica para las ratas operadas de forma fingida, sin embargo, la sutura se pasó a través de la pared ventricular izquierda y no se ocluyó la LAD.

Tras la intervención quirúrgica, se reestableció rápidamente la presión negativa en el tórax y la herida se cerró con una sutura en bolsa de tabaco utilizando material de sutura no absorbible 3-0. Se proporcionó butorfanol (0,1 mg/kg, s.c.) tras la cirugía como analgésico profiláctico. Las ratas se extubaron cuando recuperaron su reflejo nauseoso y se les permitió recuperarse en una cámara caliente.

El setenta y cinco por ciento de las ratas tuvieron grandes infartos en sus paredes libres del ventrículo izquierdo y la tasa de mortalidad perioperatoria es de aproximadamente el 50%, que es comparable a los datos publicados. Aumenta el peso del corazón como porcentaje del peso corporal 3-4 semanas después del infarto (véase la tabla).

TABLA 2

2

Se recogió tejido 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas y 16 semanas tras la cirugía. Se recogió sangre el día antes de la cirugía y el día antes del sacrificio para la medición del nivel plasmático de ANP. En el día de la necropsia, se dividió el corazón transversalmente en dos mitades de modo que se biseccionó la zona infartada. Una mitad del corazón se utilizó para la evaluación histológica y la otra para el análisis de micromatriz de ARNm. Se preparó ARNm poli A+ a partir de cada uno de los animales, tal como se describe en el presente documento, para la evaluación de genes expresados diferencialmente en los estados de enfermedad, utilizando análisis de micromatriz en una realización preferida. En la figura 4, se facilita un resumen de los hallazgos del análisis de micromatriz y se describe en detalle a continuación.

b. Infarto de miocardio del tabique

En otro ejemplo representativo, se obtuvo tejido del tabique de corazones de rata enfermas obtenidos a través del modelo de IM de rata del ventrículo izquierdo de Pfeffer et al., tal como se describió anteriormente. Se preparó ARNm poli A+ a partir de cada uno de estos tabiques, tal como se describe en el presente documento, para la evaluación de genes expresados diferencialmente en los estados de enfermedad, utilizando análisis de micromatriz en una realización preferida. En la figura 4, se facilita un resumen de los hallazgos del análisis de micromatriz y se describe en detalle a continuación.

4. Preparación de bibliotecas de ADNc normalizadas para análisis de micromatriz

Para capturar tantos genes diferentes como sea posible sin la necesidad de incluir tales genes, puede escogerse aleatoriamente clones de una biblioteca de ADNc, dando como resultado la selección redundante de genes expresados con alta y moderada abundancia. Se estima que el 50% de todos los transcritos en una célula derivan de 400 genes (Bishop et al., Nature 250(463):199-204 (1974)). Por tanto, la elección aleatoria de 20.000 clones de ADNc representaría casi la mitad del número de diferentes genes y pueden subrepresentarse escasos transcritos.

Sin embargo, puede escogerse aleatoriamente un mayor número de clones diferentes para el análisis de micromatriz si se normalizan en primer lugar las bibliotecas de ADNc producidas a partir de los modelos de la presente invención. Se han desarrollado métodos para construir bibliotecas que llevan la frecuencia de todos los clones hasta casi la equivalencia (Soares et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(20):9228-32 (1994); Bonaldo et al., Genome Res. 6(9):791-806 (1996)) minimizando así la elección redundante de clones prevalentes. Además, la selección de clones a partir de una biblioteca normalizada también aumenta la posibilidad de escoger clones de transcritos
escasos.

Siguiendo el método de (Bonaldo et al., citado anteriormente), se generó una versión normalizada de una biblioteca de ADNc a partir de tejido, células o sangre normales (por ejemplo, el ventrículo izquierdo de una rata normal). En una realización particular, se purificó ARN poli A+ a partir de las muestras de tejido proporcionadas por los modelos de enfermedad in vivo descritos anteriormente. Se generó en primer lugar una biblioteca de ADNc clonado direccionalmente mediante métodos convencionales. Brevemente, se generó ADNc de cadena doble mediante el cebado de la síntesis de la primera cadena para transcripción inversa utilizando cebadores de oligo dT que contienen un sitio de restricción Not I. Tras la síntesis de la segunda hebra, se añadieron adaptadores Xba I al extremo 5' del ADNc y se seleccionó el tamaño del ADNc para > 500 pb y se ligó en los sitios de restricción correspondientes del vector fagémido pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA).

A partir de la biblioteca de ADNc total, se generó una biblioteca normalizada tal como se detalla en otras partes (Bonaldo et al., citado anteriormente) y descrito brevemente en el presente documento. El vector fagémido pCR2.1 contiene un origen de replicación F1. Por tanto, la biblioteca de ADNc puede propagarse como fago de cadena sencilla con un virus auxiliar apropiado. Se extrajo el ADN circular de cadena sencilla de la biblioteca de fago y sirve como ADN "probador" en la etapa de la hibridación de normalización. El otro componente de la hibridación, el ADN "conductor", se generó a partir de la biblioteca mediante amplificación por PCR utilizando un conjunto de cebadores específicos para la región del vector, que flanquea los insertos clonados. El ADN probador (50 ng) y el ADN conductor (0,5 \mug) purificados se combinaron en NaCl 120 mM, formamida al 50%, Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 5 mM y SDS al 1%. Se incluyó un par de oligonucleótidos (10 \mug de cada uno), correspondiente a la secuencia de poliligador (misma cadena que el ADN probador) que está presente en el producto de PCR, en la reacción de hibridación para bloquear el apareamiento de secuencias específicas de vector que son comunes entre el ADN probador y conductor.

La mezcla de reacción, bajo aceite, se calentó 3 min. a 80ºC y se realizó la hibridación a 30ºC durante 24 h (C_{0}t calculado de 5). Se purificaron círculos de cadena sencilla a partir de la mezcla de reacción mediante cromatografía de hidroxiapatita (HAP), se convirtieron en ADN de doble cadena, y se sometieron a electroporación en bacterias para producir una biblioteca de ADNc normalizada representativa de genes expresados en el ventrículo izquierdo de rata. Para evaluar la eficacia del protocolo de normalización, se evaluó la frecuencia de unos cuantos clones (ANP, BNP, actina y miosina) tanto en la biblioteca de partida como en la biblioteca normalizada. La frecuencia de ADN abundantes (actina y miosina) se redujo y es aproximadamente equivalente a clones de ADNc más escasos (ANP y BNP). Se determinó la frecuencia de clones en las dos bibliotecas con técnicas de selección habituales inmovilizando colonias sobre membranas de nylon e hibridando con sondas de ADN radiomarcadas.

Ciertos genes, no expresados en un tejido normal y que aparecen en un tejido enfermo, pueden estar ausentes de la biblioteca de ADNc normalizada generada a partir de tejido normal. Para obtener clones específicos de la enfermedad para incluirlos en la micromatriz, puede repetirse la estrategia de normalización expuesta anteriormente utilizando tejido enfermo obtenido del modelo de enfermedad apropiado. Sin embargo, la mayor parte de los genes se expresan comúnmente entre tejido normal y enfermo, el análisis por micromatriz del tejido enfermo y normal puede introducir una redundancia significativa. En una realización preferida, se reduce la redundancia de clones, aún se obtienen ADNc que se expresan específicamente, así como están sustancialmente elevados, en tejido enfermo. Para obtener ADNc específicos de enfermedad, puede prepararse una biblioteca de sustracción utilizando protocolos similares a los utilizados para generar bibliotecas normalizadas. De nuevo, se utiliza el método de Bonaldo et al., citado anteriormente, descrito brevemente en el presente documento.

Para preparar una biblioteca de sustracción, se genera un biblioteca de ADNc total a partir del tejido obtenido del modelo de enfermedad (por ejemplo, ventrículo izquierdo tomado de una rata hipertrófica (con ligadura aórtica de 10 semanas). La biblioteca de ADNc se clona direccionalmente en un vector pCR2.1 y ADN conductor de cadena sencilla derivado tal como se describió anteriormente para la normalización de la biblioteca. El ADN conductor se genera mediante amplificación por PCR de insertos clonados a partir de la biblioteca de ADNc total preparada a partir del ventrículo izquierdo de rata normal. Se produce hibridación entre secuencias, que son comunes para los corazones normales y enfermos. Para esta librería de sustracción, la reacción se conduce más completamente (C_{0t} calculado de 27) que la normalización utilizando más conductor (1,5 \mug frente a 0,5 \mug) y un tiempo de hibridación más prolongado (48 h frente a 24 h). La purificación de círculos de cadena sencilla monohibridados mediante cromatografía HAP (de hidroxiapatita), la conversión a ADN de doble cadena y la electroporación en bacterias produce una biblioteca de ADNc de sustracción enriquecida para genes que se expresan en corazones de ratas enfermas. Para probar que la biblioteca es realmente de sustracción, se realiza la hibridación de colonias con sondas para ANP, BNP, actina y miosina. La biblioteca de sustracción tiene una alta frecuencia de clones de ANP y BNP puesto que están significativamente elevados en el corazón de rata hipertrófico. Los clones de actina y miosina están ausentes ya que se expresan igualmente en ventrículo izquierdo normal y enfermo.

En el uso de una biblioteca normalizada a modo de ejemplo dentro del contexto de la presente invención, de dos bibliotecas de ADNc de ventrículo izquierdo de rata, se eligen 30.000 clones para análisis de micromatriz. Se toman 25.000 clones de la biblioteca normalizada generada a partir de ratas normales, y 5.000 de la biblioteca de sustracción preparada a partir de ratas hipertróficas. La biblioteca de sustracción debe ser menos compleja (es decir, menos clones únicos) que la biblioteca normalizada, por tanto, necesitan elegirse menos clones. Si, tal como se estima, sólo aproximadamente el 1% de todos los 20.000 genes son únicos para el estado de enfermedad, entonces la complejidad sería sólo de aproximadamente 200, eligiendo así 5.000 produciría probablemente un representante de cada uno.

Preferiblemente, se incluye en la micromatriz con los 30.000 genes no identificados un conjunto de clones conocidos. Se aislaron los clones de rata para la lista de genes mediante amplificación por PCR a partir de bibliotecas de ADNc utilizando pares de cebadores específicos. Estos clones conocidos se incluyeron porque representan genes de particular interés y ayudan a evaluar la sensibilidad de la metodología de micromatriz. De hecho, puede incluirse cualquier gen de interés particular en tales micromatrices. A modo de ejemplo, ANP, BNP, endotelina, cadena pesada de \beta-miosina y \alpha-actina son genes que cambian los niveles de expresión en el modelo de HVI, y por tanto, sirven como controles positivos útiles en el modelo in vivo puesto como ejemplo en el presente documento.

5. Producción de micromatriz a partir de ADN modelo

El ADN de alta calidad es importante para el proceso de impresión de la micromatriz. Se generó ADN mediante amplificación por PCR del inserto de ADNc de los clones. Se utilizaron generalmente 10.000 clones por matriz. De hecho, es preferible utilizar un método robusto de preparación de molde, preferiblemente realizado en placas de 96 pocillos.

Se estableció un protocolo en placa de microtitulación para amplificación por PCR de ADN para la impresión en micromatrices para su uso en una realización preferida de la presente invención. Específicamente, se sintetizaron cebadores de PCR que amplifican el ADN de inserto a partir del vector pCR2.1, que se utilizó para la construcción de la biblioteca. Tras 30 ciclos de amplificación, cada producto de PCR se pasó sobre una columna de filtración en gel para eliminar las sales y cebadores no incorporados. Para mantener la robustez, las columnas se rellenaron en placas de filtración de 96 pocillos y el manejo de líquido se realizó de manera robótica. El rendimiento, por reacción de PCR, es generalmente de 2 - 5 \mug, suficiente ADN para imprimir varios cientos de chip. La figura 2 muestra un gel que contiene productos de PCR purificados procedentes de una única placa de 96 clones de ADNc de rata. En algunas muestras, no se produjo ADN amplificado (por ejemplo, nº 37 y nº 44) y, en algunos casos, el tamaño del producto indicó que el plásmido carecía de un inserto (por ejemplo, nº 49 y nº 61).

Para probar la calidad del ADN que se preparó mediante este método de PCR, se produjeron 96 muestras purificadas a partir de una única placa de microtitulación como una micromatriz. Utilizando manejador de líquidos robótico (Biomek 2000, Beckman), se añadió una alícuota de 85 \mul de mezcla de reacción de PCR en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de 0,2 ml, de pared delgada. La mezcla de reacción contenía 0,2 mM de cada dNTP, 1,25 unidades de Taq polimerasa y tampón Taq 1X (Boehringer Mannheim). Los cebadores, 1 \mum cada uno, son de las regiones del vector que flanquean el sitio de clonación de pCR2.1 e incluyen una amina primaria en 5' con un ligador de 6 carbonos para facilitar la unión del producto de ADN a la superficie de vidrio del chip de micromatriz. Se añadió a cada pocillo 1,0 \mul de cultivo bacteriano de clones de ADNc individuales. Las condiciones de la PCR son: 95ºC para desnaturalizar, luego 30 ciclos de 95º, 30 seg. / 65ºC, 40 seg. / 72ºC, 1 min. 30 seg., y una extensión final de 72ºC, 5 min. utilizando un termociclador MJResearch PTC 100.

Los productos de PCR se purificaron mediante filtración en gel sobre Sephacryl 400 (Sigma). Brevemente, se cargaron 400 \mul de Sephacryl 400 con hinchamiento previo en cada pocillo de una placa de filtración de 96 pocillos (PallBiosupport) y se centrifugaron en una placa de recogida a 800 g durante 1 min. Los pocillos se lavaron 5 veces con 0,2x SSC. Se cargaron las mezclas de reacción de PCR en la columna y se recogió el ADN purificado (de flujo a su través) a 800 g durante 1 min. Se secaron las muestras a 5ºC durante la noche y se analizaron mediante matriz.

Se sintetizaron pares de sondas fluorescentes mediante transcripción inversa de ARN poli A+ utilizando, por separado, Cy3-dCTP y Cy5-dCTP (Amersham). En 16,5 \mul, se desnaturalizaron 1 \mug de ARN poli A+ y 2 \mug de oligo dT de 21 meros a 65ºC, 5 min. y se hibridaron a 25ºC, 10 min. La transcripción inversa se realizó durante 2 horas a 37ºC con Superscript RT (Life Technologies, Gaithesburg, MD) en tampón 1x, 10 unidades de bloque de ARNasa, 500 \muM de cada dATP/dGTP/dTTP, dCTP 280 \muM, Cy5 o Cy3-dCTP 40 \muM y 200 unidades de RT. El ARN se degrada en NaOH 0,1 N, 65ºC durante 10 min. Se purificó el ADNc marcado mediante filtración sucesiva con columnas de centrifugación Chroma Spin 30 (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se secaron las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad utilizando un Speed-Vac cubierto. Se aplicaron las sondas al chip de prueba para hibridación y se recogen los datos esencialmente tal como se describe en Schena, et al., citado anteriormente. La intensidad de la señal de hibridación en cada elemento reflejó el nivel de expresión del ARNm para cada gen en el ventrículo de rata. Se almacenaron los datos de señal digitalizada y se prepararon para el análisis. Los datos de este experimento se presentan en la figura 3.

Haciendo referencia a la figura 3, se detectaron las señales positivas de la mayoría de los elementos que contenían ADN. Se incluyó una serie de elementos de ADN de control en cada chip para garantizar la sistematicidad en el marcado y la hibridación entre experimentos y para ayudar al equilibrio de la señal cuando se utilizan dos canales de fluorescencia. Para cada elemento hibridado con sondas marcadas dobles, se determinó la intensidad absoluta y relativa de la señal. Los resultados de estos y otros experimentos indican que estos métodos para la producción de ADN molde y sondas de ADNc marcadas son adecuados para la generación de micromatrices de alta calidad dentro de una realización preferida de los métodos de la presente invención. La evaluación de decenas de miles de genes para la expresión genera una gran cantidad de datos que pueden manipularse mediante paquetes de software disponibles comercialmente que facilitan el manejo de este tipo y cantidad de datos. Los datos de expresión pueden almacenarse, analizarse y clasificarse a partir de cada experimento utilizando este software. Además, puede seguirse la pista de la expresión de cada clon de experimento en experimento utilizando metodologías conocidas.

6. Detección de genes expresados diferencialmente utilizando análisis de micromatriz

Utilizando el ADNc obtenido a partir del modelo de hipertrofia cardiaca in vivo, el modelo de miocarditis viral in vivo, el modelo de infarto de miocardio del ventrículo izquierdo in vivo y el modelo de infarto de miocardio del tabique in vivo representativos, se construyeron micromatrices y se trataron con sonda tal como se describió anteriormente.

La figura 4 proporciona un resumen detallado de las características de doce genes de enfermedad expresados diferencialmente. Los datos de expresión proporcionados se refieren al gen homólogo expresado en los modelos in vivo descritos anteriormente, y muestran los datos de expresión diferencial de genes representativos obtenidos a través de los modelos de enfermedad de la presente invención y determinados mediante análisis de micromatriz.

Específicamente, la figura 4 proporciona el número de identificación de clon para el gen del modelo expresado diferencialmente. Tal como se trata en detalle a continuación, se encontró que aquellos genes expresados diferencialmente del modelo de enfermedad representativo corresponden a los genes humanos que codifican para 1-8U, factor estimulante de prostaciclina, osf-2, ARNm específico de tejido, proteína 6 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, OSF-1, gas-1, YMP, BTG-2, homólogo del factor estimulante de células pre-B (SDF1a), receptor de benzodiazepina periférico (RBTP) y ligando celular de anexina II (p11). Tal como se describió en detalle anteriormente, se aplicaron las sondas a las micromatrices para hibridación y se recogieron los datos esencialmente tal como se describe en Schena et al., citado anteriormente. La intensidad de la señal de hibridación en cada elemento reflejó el nivel de expresión del ARNm para cada gen. Para cada elemento hibridado con sondas marcadas dobles, se determina la intensidad absoluta y relativa de la señal, que se traduce en los niveles de expresión relativos de los genes sujeto. Los datos numéricos proporcionados en la figura 4 reflejan el nivel de expresión relativo del gen en el estado de enfermedad comparado con el nivel de expresión del gen en el estado normal, sin enfermedad, en los cinco modelos de estado de enfermedad representativos definidos anteriormente y tal como se determina mediante análisis de micromatriz. Específicamente, los datos mostrados en la figura 4 proporcionan un múltiplo positivo o negativo del nivel de expresión del gen en el estado de enfermedad, comparado con el estado normal en los modelos
representativos.

Los datos se notifican como valores de expresión diferencial indicando los números positivos de genes expresados en niveles superiores en el tenido enfermo con respecto al tejido normal e indicando los valores negativos una expresión inferior en la enfermedad. Los datos son los valores medios de múltiples experimentos realizados con matrices de ADN separadas (n=4 para IM de ventrículo izquierdo y tabique, n=2 para miocarditis viral, y n=2 para HVI): se generaron sondas de matriz a partir de ARN recogido de múltiples animales (n=4 para IM; n=10-15 para miocarditis y n=3 para HVI).

Los datos también reflejan los niveles de expresión de genes en ciertos modelos de enfermedad sobre varios puntos de tiempo. Por ejemplo, la expresión génica en el modelo de infarto de miocardio se comparó a las 2, 4, 8, 12 y 16 semanas para los genes representativos en el estado de enfermedad frente al estado normal. De hecho, tal experimentación proporciona datos valiosos con respecto a la relación de los niveles de expresión génica en estados de enfermedad y proporciona importantes oportunidades con respecto al tratamiento, diagnóstico y modulación de los genes de estado de enfermedad expresados diferencialmente, tal como se trata en detalle más adelante.

Se encontró que del uno al dos por ciento de los clones sometidos a ensayo con micromatrices se expresan diferencialmente. Pueden utilizarse chip secundarios para hibridaciones más extensas, incluyendo el examen de los animales individuales, y la evaluación más completa de los puntos de tiempo. En una realización preferida, se analizaron con micromatriz los clones que puntúan de manera reproducible en análisis de micromatriz para estar al menos dos veces elevados o disminuidos, en chips secundarios separados y se determinaron sus niveles de expresión. Sin embargo, se entiende que los genes expresados diferencialmente que muestran un cambio inferior a aproximadamente dos veces en la expresión, por ejemplo menos de una, media, un cuarto, o un cambio superior a aproximadamente dos veces en la expresión, por ejemplo superior a tres, cinco, diez, veinte, cien veces o mil veces, están dentro del alcance de la presente invención.

7. Identificación de genes humanos expresados diferencialmente

Se secuenciaron los clones expresados diferencialmente obtenidos a partir del análisis de micromatriz del ADN obtenido a partir de los modelos de enfermedad descritos anteriormente y se compararon con bases de datos de secuencias de genes humanos conocidos para determinar coincidencias con genes humanos conocidos. La figura 5 muestra datos de alineación que comparan el ADNc que codifica para el gen P0268 de rata expresado diferencialmente con ADNc humano correspondiente a RBTP (SEQ ID NOs: 1 y 2). La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de RBTP humano.

Ejemplo 2 Efecto de un agonista o antagonista de RBTP sobre la hipertrofia cardiaca en un modelo de cardiomiocitos de rata nenonatal 1. Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares de rata neonatal

Se aislaron cardiomiocitos ventriculares de rata neonatal a partir de crías de rata de uno o dos días de edad usando los siguientes reactivos y procedimiento de aislamiento:

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Reactivos

Tampón de disociación: CBFHH (solución de Hanks libre de calcio y bicarbonato con Hepest, pH 7,5)

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NaCl 137 mM; KCl 5,36 mM; MgSO_{4} x 7 H_{2}O 0,81 mM;

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dextrosa 5,55 mM; KH_{2}PO_{4} x 7 H_{2}O 0,34 mM; Hepese 20 mM;

\bullet

penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 \mug/ml

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Tripsina al 0,1% / DNasa II o I al 0,001% en tampón de disociación.

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DNasa II-sigma (V, EC3.1, 1,22.1, bazo bovino, filtro (0,2 \mum).

\bullet

Tripsina-1: 250 de Difco Lab, número de catálogo 0152-13-1, Lote: 89568 JK

Medio libre de suero: DMEM21/COON'S F12 + 1 mg/ml de DBA + 1X P/S.

Medio de cultivo: DMEM21/COON'S F12 + SBF al 10% + 1X P/S.

Aislamiento

\bullet

Hacer girar las crías en una pequeña cantidad de etanol al 75%, decapitarlas y abrir el tórax, aislar el corazón y cortar para sacar el ventrículo en el surco AV y retirarlo rápidamente para pasarlo a un tubo de 50 ml que contiene 30 ml de CBFHH + 0,3 ml de heparina (1000 U/ml).

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Transferir los corazones a una placa de Petri de 100 mm, lavar con CBFHH dos veces, recortar el ventrículo y cortar el ventrículo en 6-8 partes.

\bullet

Transferir los tejidos cardiacos con pipetas de 10 ml de punta ancha en tubos de 50 ml. Añadir 10 ml de CBFHH con tripsina al 0,1% + DNasa II al 0,001%.

\bullet

Sacudir durante 10 minutos (no sobredigerir las células).

\bullet

Pipetear suavemente el tejido 10X.

\bullet

Dejar depositarse el tejido, luego descartar el sobrenadante (principalmente residuo celular).

\bullet

Repetir el procedimiento de disociación y recoger el sobrenadante en un tubo de 50 ml que contiene 7 ml de SBF a temperatura ambiente (el sobrenadante contiene células aisladas). La disociación total requiere 12-16X.

\bullet

Recoger todos los sobrenadantes y centrifugar el sedimento a 1000 rpm durante 5-6 minutos a temperatura ambiente.

\bullet

Lavar el sedimento una vez con DMEM 21 / COON'S F12 + SBF al 10% + DNasa al 0,001%, asegurarse de que el sedimento se suspende bien.

\bullet

Filtrar las células con un filtro de células (70 \muM), sedimentar las células de nuevo.

\bullet

Añadir 40 ml de medio de cultivo al sedimento (aislado a partir de aproximadamente 20 ventrículos).

\bullet

Precolocar las células sobre placas en placas de 100 mm - 10 ml/placa, durante 30-45 minutos a 37ºC.

\bullet

Recoger el sobrenadante a partir de la placa precolocada (los que no son miocitos ya se han unido a la placa pero los miocitos todavía están en suspensión).

\bullet

Lavar la placa con 10 ml de medio de cultivo. Golpear la placa vacía 10 veces para separar los miocitos que puedan estar pegados a la placa. Repetir este procedimiento 4 veces.

\bullet

Contar las células y determinar la viabilidad.

\bullet

Sembrar las células en placas recubiertas de fibronectina con una densidad de 0,1 millones de células / cm^{2} en medio de cultivo y devolverlas al incubador durante la noche.

\bullet

Al día siguiente, cambiar a medio libre de suero durante 24 horas.

\bullet

Realizar las incubaciones experimentales.

2. Monitorización de la hipertrofia

Cuando los cardiomiocitos experimentan hipertrofia pueden monitorizarse diversos parámetros bioquímicos. Hay un aumento en la síntesis de proteína y la síntesis del péptido natriurético auricular (ANP) y una regulación por aumento del gen de cadena pesada de la \beta-miosina. Se usaron estos tres parámetros para evaluar los efectos de los ligandos del receptor de benzodiazepina periférico (RBTP) sobre cardiomiocitos de rata neonatal.

Se evalúa la síntesis de proteína incluyendo aminoácidos radiomarcados en los medios de incubación experimentales (es decir, [^{3}H]fenilalanina) al final de la incubación se lava la monocapa celular con solución salina tamponada con fosfato, se fija con TCA al 10% y se lisa con NaOH 0,25 N. Entonces se evalúa el lisado celular total para determinar el contenido en tritio mediante espectrometría de centelleo.

Se evalúa el contenido en ANP de los sobrenadantes del cultivo celular mediante un ensayo de ELISA de competición que se basa en la capacidad del ANP en la muestra para competir eficazmente con una cantidad habitual de [^{125}I]ANP para la unión al receptor.

Para monitorizar la expresión de \beta-CHM, se construyó un plásmido indicador de luciferasa promotor del \beta-CHM. Se insertó este plásmido en los cultivos de cardiomiocitos mediante transfección mediada por liposoma y se determinó la actividad de luciferasa en los lisados celulares tras la incubación. La cantidad de actividad luciferasa es directamente proporcional al nivel de transcripción del gen \beta-CHM.

Cuando los miocardiocitos experimentan hipertrofia, su morfología cambia bastante drásticamente. Las células se vuelven más largas y más extendidas de modo que otra técnica empleada para monitorizar los efectos hipertróficos sobre los cardiomiocitos es evaluar su morfología y documentarla mediante fotografía.

3. Resultados

a. Se cultivaron cardiomiocitos de rata neonatal en placas de 24 pocillos durante 24 horas en medio libre de suero. Entonces se retiró el medio y se sustituyó con medio de cultivo experimental que contenía [^{3}H]fenilalanina (10 \muCi/ml) y o bien el agonista Ro5-4864 de RBTP (RBI, MA, EE.UU.) en un intervalo de concentración de 10^{-12} - 10^{-8} M, o bien el antagonista PK 11195 de RBTP (RBI, MA, EE.UU.) en un intervalo de concentración de 10-^{12} - 10^{-8} M. Las incubaciones control recibieron sólo medio que contenía [^{3}H]fenilalanina (10 \muCi/ml). Se devolvieron los cultivos celulares al incubador durante 48 horas más de incubación, tiempo tras el cual se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares para un análisis de ANP y se prepararon las monocapas celulares para una evaluación de la incorporación de tritio. La figura 7 muestra que el antagonista PK 11195 de RBTP no tuvo efectos sobre la síntesis de proteína (según se evalúa mediante incorporación de fenilalanina radiomarcada) ni la síntesis de ANP (según se evalúa mediante un ELISA de unión de competición). Sin embargo, a concentraciones superiores o iguales a 10^{-11} M, el agonista Ro5-4864 de RBTP provocó un aumento de tres veces en la síntesis de proteína y un aumento de cinco veces en la síntesis de ANP. Los datos se expresan como la media +/- desviaciones estándar de muestras de cuadrupletes.

b. Se cultivaron cardiomiocitos de rata neonatal en placas de 24 pocillos durante 24 horas en medio libre de suero. Entonces se retiró el medio y se sustituyó con medio de cultivo experimental que contenía [^{3}H]fenilalanina (10 \muCi/ml) y o bien el agonista Ro5-4864 de RBTP (RBI, MA, EE.UU.) en un intervalo de concentración de 10^{-12} - 10^{-8} M, o bien el antagonista PK 11195 de RBTP (RBI, MA, EE.UU.) en una concentración de 10^{-10} M. Las incubaciones control recibieron sólo medio que contenía [^{3}H]fenilalanina (10 \muCi/ml). Se devolvieron los cultivos celulares al incubador durante 48 horas más de incubación, tiempo tras el cual se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares para un análisis de ANP y se prepararon las monocapas celulares para una evaluación de la incorporación de tritio. La figura 8 muestra que PK 11195 10^{-10} M evitó el aumento en la síntesis de ANP y proteína inducido por Ro5-4864 en concentraciones de Ro5-4864 de 10^{-12} - 10^{-10} M. Sin embargo, a concentraciones superiores (10^{-11} - 10^{-8} M) Ro5-4864 pudo superar el efecto inhibidor de PK 11195 e hizo que volviese el aumento inducido por agonista de la síntesis de ANP y proteína incluso en presencia de PK 11195 10^{-10} M. Los datos se expresan como la media +/- desviaciones estándar de muestras de cuadrupletes.

c. Se cultivaron cardiomiocitos neonatales en placas de 6 pocillos durante la noche tras el aislamiento. Entonces se transfectaron las monocapas celulares con plásmido indicador de luciferasa promotor del \beta-CHM y un plásmido control para ayudar a la normalización de los datos (pSEAP2 Clontech Corp) usando la administración de plásmido mediada por lipofectamina liposoma. Tras la recuperación de la transfección, se trataron los cultivos celulares durante 24 horas en presencia y ausencia del agonista Ro5-4864 de RBTP a 10^{-12} M, 10^{-11} M y 10^{-10} M. Entonces se recogieron los sobrenadantes del cultivo para determinar la actividad de SEAP y se prepararon lisados celulares para el ensayo de luciferasa. Tras la normalización de los datos para corregir la eficiencia de la transfección entre los cultivos, la figura 9 muestra que a una concentración superior, o igual, a 10^{-11} M, el Ro5-4864 provocó un aumento de tres veces en la actividad luciferasa que refleja un aumento de tres veces en la actividad transcripcional del promotor \beta-CHM. Los datos se expresan como la media +/- desviaciones estándar de muestras triplicadas.

d. Se cultivaron cardiomiocitos neonatales en placas de 6 pocillos durante la noche tras el aislamiento. Entonces se mantuvieron los cultivos en medio libre de suero en presencia y ausencia de Ro5-4864 10^{-10} M. La figura 10A muestra una fotografía representativa de los cultivos control y tratados tras 24 horas de cultivo y muestra claramente un tamaño celular mayor de los cardiomiocitos que recibieron Ro5-4864. Las figuras 10B y 10C muestran los mismos cultivos tras 96 horas de cultivo y las diferencias entre el control y los tratados son bastante llamativas. Los cultivos tratados son mucho mayores y adherentes a la matriz extracelular mientras que los cultivos control en el mismo punto de tiempo son pequeños y redondeados y comienzan a desintegrarse.

4. Conclusiones

El agonista Ro5-4864 de RBTP induce una fuerte respuesta hipertrófica según se evalúa mediante un aumento de tres a cinco veces en la síntesis de proteína, síntesis de ANP, transcripción del gen de \beta-MHC indicador y mediante evaluación morfológica. Este efecto hipertrófico puede revertirse mediante incubación conjunta de Ro5-4864 con el antagonista PK 11195 de RBTP.

Claims (20)

1. Un método in vitro para inducir una respuesta hipertrófica en miocitos cardiacos que comprende poner en contacto dichos miocitos con una cantidad eficaz de un agonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP), en el que dicho agonista es un compuesto orgánico seleccionado del grupo que consiste en benzodiazepinas, carboxamidas de isoquinolina, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas, y pirrolobenzoxazepinas.

2. Método in vitro para una inhibición parcial o completa de una respuesta hipertrófica de miocitos cardiacos que comprende poner en contacto dichos miocitos con una cantidad eficaz de un antagonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP), en el que dicho antagonista es un compuesto orgánico seleccionado del grupo que consiste en benzodiazepinas, carboxamidas de isoquinolina, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas, y pirrolobenzoxazepinas.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho RBTP es humano.

4. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que :

(a)

dicho agonista es Ro5-4864, y/o

(b)

dicho antagonista es carboxamida de 1-(2-clorofenil)-N-metil-(1-metilpropil)-3-isoquinolina (PK 11195).

5. Uso de un antagonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP) seleccionado del grupo que consiste en benzodiazepinas, carboxamidas de isoquinolina, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas, y pirrolobenzoxazepinas para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de hipertrofia cardiaca en un paciente.

6. Uso de un agonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP) seleccionado del grupo que consiste en benzodiazepinas, carboxamidas de isoquinolina, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas, y pirrolobenzoxazepinas para la preparación de una composición farmacéutica para la inducción de una hipertrofia cardiaca en un paciente cuyo corazón está sometido a un aumento de carga de trabajo.

7. El uso de la reivindicación 5 ó 6, en el que dicho paciente es un mamífero.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que dicho paciente es un humano.

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que:

(a)

dicho antagonista es carboxamida de 1-(2-clorofenil)-N-metil-(1-metilpropil)-3-isoquinolina (PK 11195), y/o

(b)

dicho agonista es Ro5-4864.

10. Uso de un agonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP) seleccionado del grupo que consiste en benzodiazepinas, carboxamidas de isoquinolina, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas, y pirrolobenzoxazepinas para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que dicho paciente necesita un aumento de gasto cardiaco.

12. El uso de la reivindicación 10, en el que a dicho paciente se le ha diagnosticado isquemia.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que dicha isquemia es isquemia periférica.

14. El uso de la reivindicación 10, en el que el corazón de dicho paciente se ha dañado.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que dicho paciente tiene una derivación auriculoventricular (A-V).

16. Un método in vitro para seleccionar un antagonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP) que comprende poner en contacto un miocito cardiaco de fenotipo hipertrófico con una molécula candidato y monitorizar una reducción de la hipertrofia.

17. Uso de un antagonista de un receptor de benzodiazepina de tipo periférico (RBTP) seleccionado del grupo que consiste en benzodiazepinas, carboxamidas de isoquinolina, imidazopiridinas, 2-aril-3-indolacetamidas, y pirrolobenzoxazepinas para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una insuficiencia cardiaca.

18. El uso de la reivindicación 17, en el que dicha insuficiencia cardiaca se caracteriza por una hipertrofia cardiaca descompensada.

19. El uso de la reivindicación 17 ó 18, en el que dicho tratamiento es la prevención de una insuficiencia cardiaca.

20. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que dicha insuficiencia cardiaca es una insuficiencia cardiaca congestiva.