ES2267856T3 - Catalisis enzimatica en presencia de liquidos ionicos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la reacción de sustancias en presencia de enzimas como catalizadores, en un medio de reacción que comprende por lo menos un líquido iónico, estando seleccionadas las enzimas entre el conjunto de las oxidorreductasas, lipasas, galactosidasas, glicosidasas, liasas, y enzimas de la clase EC 6.
Description
Catálisis enzimática en presencia de líquidos
iónicos.
El invento se refiere a unas composiciones que
comprenden una enzima así como líquidos iónicos, así como a un
procedimiento para la realización de reacciones catalizadas por
enzimas en presencia de líquidos iónicos.
Las enzimas han ocupado como biocatalizadores,
entretanto, un puesto fijo para reacciones a las escalas de
laboratorio e industrial. No obstante, a pesar de todos los éxitos
en el caso de reacciones enzimáticas siguen apareciendo todavía
problemas, tales como por ejemplo
- -
- bajas productividades a causa de unas solubilidades demasiado pequeñas de los productos de partida;
- -
- bajos rendimientos en el caso de reacciones en equilibrio;
- -
- insuficiente selectividad en el caso de reacciones regio- o estéreo-selectivas;
- -
- inhibición de los productos;
- -
- aparición de reacciones secundarias (reacciones paralelas y secuenciales).
Se conocen ciertos enfoques para resolver estos
problemas mediante adición de disolventes orgánicos (G. Carrea, S.
Riva, Angew. Chem. 2000, 112, 2312; J. M. S. Cabral, M. R.
Aires-Barros, H. Pinheiro, D. M. F. Prazeres, J.
Biotechnol. 1997, 59, 133; M. N. Gupta, Eur. J. Biochem. 1992, 203,
25), mediante adición de sales (A. M. Blinkorsky, Y. L.
Khmelnitzky, J. S. Dordick, J. Am. Chem. Soc. -1999, 116, 2697) o
mediante realización de la reacción en microemulsiones (B. Orlich,
R. Schomäcker 1999, 65, 357-362). Con frecuencia,
sin embargo, las mejorías conseguidas de esta manera no son
significativas y no justifican el gasto adicional, o la actividad
enzimática disminuye grandemente en estas condiciones (G. Carrea, S.
Riva, Angew. Chem. 2000, 112, 2312).
Los líquidos iónicos son sales que funden a
bajas temperaturas (<100ºC), que constituyen una nueva clase de
disolventes con carácter iónico, no molecular. Aún cuando ya desde
1914 se conocen unos primeros representantes, tan sólo en los
últimos 15 años se están investigando intensamente líquidos iónicos
como disolventes para reacciones químicas. Los líquidos iónicos no
poseen ninguna presión de vapor medible. Esto, desde el punto de
vista de técnica de procedimientos, es una gran ventaja, puesto que
de esta manera es posible la separación por destilación de una
mezcla de reacción como un método efectivo para la separación de
productos. No aparecen los conocidos problemas por causa de la
formación de azeótropos entre disolventes y productos. Los líquidos
iónicos son estables térmicamente a unas temperaturas hasta por
encima de 200ºC. Mediante elección apropiada de un catión y de un
anión es posible un ajuste escalonado de la polaridad, y por
consiguiente una adaptación de las propiedades de solubilidad. La
amplitud de banda se extiende en tal caso desde líquidos iónicos
miscibles con agua, pasando por los que no son miscibles con agua,
hasta llegar a los que forman dos fases incluso con disolventes
orgánicos. El aprovechamiento conveniente de las extraordinarias
propiedades de solubilidad es la clave para el empleo con éxito de
los líquidos iónicos como una nueva clase de disolventes.
Se pudieron emplear ya con éxito líquidos
iónicos como nuevos medios en la catálisis en dos fases o como un
medio para la extracción de líquido - líquido (P. Wasserscheid, W.
Keim, Angew. Chem. 2000, 12, 3926).
Sorprendentemente, se comprobó conforme al
invento, en el caso de la reacción de los más diferentes productos
de partida con diversas enzimas, en presencia de líquidos iónicos,
una fuerte elevación del rendimiento y de la selectividad, que
constituye una manifiesta mejoría en comparación con el estado
conocido de la técnica. No se comprobaron repercusiones
desventajosas del líquido iónico sobre la estabilidad de las
enzimas, e incluso en algún caso individual se encontró un efecto
estabilizador.
Esto es inesperado y sorprendente, si se
considera la naturaleza iónica de los líquidos iónicos y las fuertes
interacciones, que son posibles de esta manera, entre el líquido
iónico y la enzima con sus grupos asimismo carga-
dos.
dos.
Asimismo, se encontró que se pueden emplear
líquidos iónicos como disolventes concomitantes
(co-disolventes) para el mejoramiento de la
solubilidad de los productos de partida (eductos) y de los
productos.
Alston y colaboradores divulgan en Book of
Abstracts, 217^{th} ACS National Meeting, Anaheim, Calif.,
21-25 de Marzo (1999) BIOT-131,
publicador: American Chemical Society, Washington D. C., la reacción
de subtilisina y quimiotripsina (en cada caso enzimas de la clase
EC 3.4) en el seno de tetrafluoroborato de
1-butil-3-metil-imidazo-
lio.
lio.
Cull y colaboradores describen en Biotechnol.
Bioeng. (2000), 69(2), 227-233, la
biotransformación, catalizada mediante Rhodococcus R312 (EC.
3.3.2.8), de 1,3-diciano-benceno en
el seno de hexafluorofosfato de
1-butil-3-metil-imidazolio.
Erbeldinger y colaboradores divulgan en
Biotechnol. Prog. (2000), 16(6), 1131-1133 la
síntesis de Z-aspartamo en una reacción, catalizada
mediante termolisina (EC. 3.4), de
carbobenzoxi-L-aspartato y del
hidrocloruro del éster metílico de
L-fenil-alanina en el seno de
hexafluorofosfato de
1-butil-3-metil-imidazolio.
Lau y colaboradores divulgan en ORG. LETT.
(2000), 2(26), 4189-4191 reacciones
catalizadas por la lipasa de Candida antarctica (EC. 3.1.1) en el
seno de tetrafluoroborato de
1-butil-3-metil-imidazolio.
El invento se refiere a un procedimiento para la
reacción de sustancias (productos de partida o eductos) en
presencia de enzimas como catalizadores, en un medio de reacción que
comprende líquidos iónicos.
El líquido iónico puede ser en este caso
miscible con agua o no miscible con agua. Asimismo es posible una
realización de la reacción en una, dos o más fases.
En el caso de los líquidos iónicos se trata de
compuestos de la fórmula general
[A]_{n}{}^{+}[Y]^{n-},
realizándose
que
n es = 1 ó 2 y
el anión [Y]^{n-} se selecciona entre
el conjunto que consiste en tetrafluoroborato
([BF_{4}]^{-}), tetracloroborato
([Bcl_{4}]^{-}),
hexafluorofosfato ([PF_{6}]^{-}), hexafluoroantimoniato ([SbF_{6}]^{-}), hexafluoroarseniato ([AsF_{6}]^{-}), tetracloroaluminato
([AlCl_{4}]^{-}), triclorozincato ([ZnCl_{3}]^{-}), diclorocuprato, sulfato ([SO_{4}]^{2-}), carbonato ([CO_{3})^{2-}), fluorosulfonato, ([R'-COO]^{-}), [R'-SO_{3}]^{-} o [(R'-SO_{2})_{2}N]^{-}, y
hexafluorofosfato ([PF_{6}]^{-}), hexafluoroantimoniato ([SbF_{6}]^{-}), hexafluoroarseniato ([AsF_{6}]^{-}), tetracloroaluminato
([AlCl_{4}]^{-}), triclorozincato ([ZnCl_{3}]^{-}), diclorocuprato, sulfato ([SO_{4}]^{2-}), carbonato ([CO_{3})^{2-}), fluorosulfonato, ([R'-COO]^{-}), [R'-SO_{3}]^{-} o [(R'-SO_{2})_{2}N]^{-}, y
R' es un radical alquilo alifático o alicíclico
lineal o ramificado, que contiene de 1 a 12 átomos de carbono, o un
radical arilo C_{5}-C_{18},
(aril-C_{5}-C_{18})-alquilo
C_{1}-C_{6} o (alquil
C_{1}-C_{6})-arilo
C_{5}-C_{18}, que puede estar sustituido con
átomos de halógeno,
el catión [A]^{+} se selecciona
entre
- -
- cationes de amonio cuaternarios de la fórmula general
[NR^{1}R^{2}R^{3}R]^{+},
- -
- cationes de fosfonio de la fórmula general
[PR^{1}R^{2}R^{3}R]^{+},
- -
- cationes de imidazolio de la fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
pudiendo el núcleo de imidazol
estar sustituido con por lo menos un grupo, que está seleccionado
entre grupos alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi
C_{1}-C_{6}, amino-alquilo
C_{1}-C_{6}, arilo
C_{5}-C_{12} o (aril
C_{5}-C_{12})-alquilo
C_{1}-C_{6}.
- -
- cationes de piridinio de la fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
pudiendo el núcleo de piridina
estar sustituido con por lo menos un grupo, que está seleccionado
entre grupos alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi
C_{1}-C_{6}, amino-alquilo
C_{1}-C_{6}, arilo
C_{5}-C_{12} o (aril
C_{5}-C_{12})-alquilo
C_{1}-C_{6},
\newpage
- -
- cationes de pirazolio de la fórmula general
pudiendo el núcleo de pirazol estar
sustituido con por lo menos un grupo, que está seleccionado entre
grupos alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi
C_{1}-C_{6}, amino-alquilo
C_{1}-C_{6}, arilo
C_{5}-C_{12} o (aril
C_{5}-C_{12})-alquilo
C_{1}-C_{6},
- -
- y cationes de triazolio de la fórmula general
pudiendo el núcleo de triazol estar
sustituido con por lo menos un grupo, que está seleccionado entre
grupos alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi
C_{1}-C_{6}, amino-alquilo
C_{1}-C_{6}, arilo
C_{5}-C_{12} o (aril
C_{5}-C_{12})-alquilo
C_{1}-C_{6},
y los radicales R^{1}, R^{2} y R^{3} se
seleccionan, independientemente unos de otros, entre el conjunto
que consiste en
- -
- hidrógeno,
- -
- grupos alquilo alifáticos o alicíclicos, saturados o insaturados, lineales o ramificados, con 1 a 20 átomos de carbono;
- -
- grupos heteroarilo o heteroaril-alquilo C_{1}-C_{8} con 3 a 8 átomos de carbono en el radical heteroarilo y con por lo menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S, que pueden estar sustituidos con por lo menos un grupo seleccionado entre grupos alquilo C_{1}-C_{8} y/o átomos de halógeno;
- -
- grupos arilo o aril-alquilo C_{1}-C_{8} con 5 a 12 átomos de carbono en el radical arilo, que pueden estar sustituidos con por lo menos un grupo alquilo C_{1}-C_{6} y/o un átomo de halógeno.
En un aspecto adicional, el invento se refiere a
una composición que comprende una enzima así como por lo menos uno
de los líquidos iónicos arriba definidos. Estas composiciones pueden
servir como punto de partida para la realización de las reacciones
catalizadas enzimáticamente, que antes se han mencionado.
Correspondientemente, las composiciones conformes al invento pueden
contener, junto a la enzima (biocatalizador), también los productos
de partida (substratos) que se han de hacer reaccionar y, en el caso
de llevarse a cabo precedentemente la reacción, evidentemente
también los productos de reacción que se han formado por medio de la
reacción enzimática.
Un aspecto todavía adicional es por consiguiente
el uso de líquidos iónicos, en particular de los líquidos iónicos
arriba definidos, como medio de reacción o como parte componente del
medio de reacción en la biocatálisis, es decir la realización de
reacciones catalizadas enzimáticamente en presencia de
substratos.
En una forma de realización especial del
invento, los grupos alquil-, aril-, arilalquil- y
alquilaril-sulfonatos (anión [Y]) pueden estar
sustituidos con átomos de halógeno, en particular de flúor, cloro o
bromo. Son especialmente preferidos los alquil- y los antes
mencionados aril-sulfonatos, fluorados, en
particular los perfluorados, tales como el
trifluorometano-sulfonato (triflato). Como
representantes no halogenados han de mencionarse los grupos
metano-sulfonato, benceno-sulfonato
y tolueno-sulfonato, así como todos los otros grupos
lábiles de sulfonatos, que se conocen en el estado de la
técnica.
En otra forma adicional de realización del
invento, los grupos alquil-, aril-, arilalquil- y
alquilaril-carboxilatos pueden estar sustituidos
con átomos de halógeno, en particular de flúor, cloro o bromo. Son
especialmente preferidos los alquil- y los antes mencionados
aril-carboxilatos fluorados, en particular los
perfluorados, tales como el
trifluorometano-carboxilato (trifluoroacetato;
CF_{3}COO^{-}). Como representantes no halogenados, han de
mencionarse los grupos de acetato y benzoato así como todos los
otros grupos lábiles de carboxilatos que se conocen en el estado de
la técnica.
En formas preferidas de realización del invento,
los grupos alquilo C_{1}-C_{6}, mencionados en
conexión con los sustituyentes, pueden ser reemplazados, en cada
caso independientemente unos de otros, por grupos alquilo
C_{2}-C_{4}. Asimismo los grupos alcoxi
C_{1}-C_{6}, mencionados en conexión con los
sustituyentes. pueden ser reemplazados, en cada caso
independientemente unos de otros, por grupos alcoxi
C_{2}-C_{4}. En una alternativa adicional del
invento, los grupos arilo C_{5}-C_{12},
mencionados en conexión con los sustituyentes, pueden ser
reemplazados, en cada caso independientemente unos de otros, por
grupos arilo C_{6}-C_{10}, y los grupos
heteroarilo C_{3}-C_{8} pueden ser reemplazados,
en cada caso independientemente unos de otros, por grupos
heteroarilo C_{3}-C_{6}. Los átomos de halógeno,
con los que pueden estar sustituidos los grupos alquilo, alcoxi y
arilo, están seleccionados entre los de flúor, cloro, bromo y yodo,
de manera preferida los de flúor, cloro y bromo.
En una forma preferida de realización, el
radical R' es un radical alquilo alifático o alicíclico, lineal o
ramificado, que contiene de 1 a 8 átomos de carbono, o un radical
arilo C_{6}-C_{10}, (aril
C_{6}-C_{10})-alquilo
C_{1}-C_{4} o (alquil
C_{1}-C_{4})-arilo
C_{6}-C_{10}, que puede estar sustituido con
átomos de halógeno.
Los cationes [A] están seleccionados, por
ejemplo, entre
trimetil-fenil-amonio,
metil-trioctil-amonio,
tetrabutil-fosfonio,
3-butil-1-metil-imidazolio,
3-etil-1-metil-imidazolio,
N-butil-piridinio,
N-etil-piridinio,
dietil-pirazolio,
1-etil-3-metil-imidazolio,
1-butil-3-metil-imidazolio,
1-hexil-3-metil-imidazolio,
1-octil-3-metil-imidazolio,
1-decil-3-metil-imidazolio,
1-butil-4-metil-piridinio,
1-butil-3-metil-piridinio,
1-butil-2-metil-piridinio,
1-butil-piridinio,
butil-metil-imidazolio,
nonil-metil-imidazolio,
butil-metil-imidazolio,
hexil-metil-imidazolio,
octil-metil-imidazolio,
4-metil-butil-piridinio,
trietil-amonio,
trietil-metil-amonio,
butil-metil-piridinio,
propil-amonio,
metil-metil-imidazolio,
etil-metil-imidazolio,
butil-metil-imidazolio y
butil-metil-imidazolio.
Los líquidos iónicos, así como su preparación,
se conocen en el estado de la técnica. Para la síntesis de líquidos
iónicos con iones de hexafluorofosfato, tetrafluoroborato,
bis(trifluorometilsulfonil)amiduro,
perfluoroalquilsulfonato y
perfluoro-alquilcarboxilato, en primer lugar, por
reacción de una amina NR_{1}R_{2}R_{3}, de un fosfano
PR^{1}R^{2}R^{3}, de un derivado de imidazol de la fórmula
general
R^{1}R^{2+}N=CR^{3}-R^{5}-R^{3}C=N^{+}R^{1}R^{2}
o de un derivado de piridinio de la fórmula general
R^{1}R^{2}N=CR^{3}R^{4+}, con un cloruro de alquilo,
bromuro de alquilo o yoduro de alquilo, se forma y aísla la
correspondiente sal halogenuro [Catión]^{+}X^{-} (F.H.
Hurley, T.P. Wier, Jr., J. Electrochem. Soc. 1951, 98,
207-212: J.S. Wilkes, J.A. Levisky, R.A. Wilson,
C.L. Hussey, Inorg. Chem. 1982, 21, 1263-1264;
A.A.K. Abdul-Sada, P.W. Ambler, P.K.G. Hodgson, K.R.
Seddon, N.J. Stewart, documento de solicitud de patente
internacional WO-A-95/21871), R.H.
Dubois, M.J. Zaworotko, P.S. White, Inorg. Chem. 1989, 28,
2019-2020; J.F. Knifton, J. Mol. Catal. 1987, 43,
65-78; C.P.M. Lacroix, F.H.M. Dekker, A.G. Talma,
J.W.F. Settz, documento de solicitud de patente europea
EP-A-0989134). Partiendo de la sal
halogenuro [A]^{+}X^{-} formada y aislada, se conocen dos
diferentes vías para la síntesis de líquidos iónicos con iones de
hexafluorofosfato, tetrafluoroborato,
bis(trifluorometilsulfonil)amiduro,
perfluoroalquil-sulfonato y
perfluoroalquilcarboxilato. Por una parte, la sal halogenuro se hace
reaccionar por adición de una sal metálica MY (mediando
precipitación o separación de la sal MX o del producto
[A]^{+}[Y]^{-} a partir del disolvente que
en cada caso se utiliza) - representando [Y]^{-} un ion de
hexafluorofosfato, tetrafluoroborato,
bis(trifluorometilsulfonil)amiduro,
perfluoroalquilsulfonato y perfluoroalquilcarboxilato, y
representando M^{+} un catión de un metal alcalino (J.S. Wilkes,
M.J. Zaworotko, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1992,
965-967; Y. Chauvin, L. Mussmann, H. Olivier,
Angew. Chem. 1995, 107, 2941-2949; P.A.Z. Suarez,,
J.E.L. Dullius, S. Einloft, R.F. de Souza, J. Dupont, Polyhedron,
1996, 15, 1217-1219; P. Bonhöte, A.-P. Dias, N.
Papageorgiu, K. Kalyanasundaram, M. Grätzel, Inorg. Chem. 1996, 35,
1168-1178; C.M. Gordon, J.D. Holbrey, A.R. Kennedy,
K.R. Seddon, J. Mater. Chem. 1998, 8, 2627-2638;
P.A.Z. Suarez, S. Einloft, J.E.L. Dullius, R.F. de Souza, J. Dupont,
J. Chim. Phys. 1998, 95, 1626-1639; A.J.
Carmichael, C. Hardacre, J.D. Holbrey, M. Nieuwenhuyzen, K.R.
Seddon, Anal. Chem. 1999, 71, 4572-4574; J.D.
Holbrey, K.R. Seddon, J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1999,
2133-2140). Por otra parte, mediante adición de un
ácido fuerte H^{+} [Y]^{-} el ion de halogenuro es
desalojado mediando liberación de H^{+} X^{-} e intercambiado
por [Y]^{-} - representando [Y]^{-} aquí un ion de
hexafluorofosfato, tetrafluoroborato,
bis(trifluorometilsulfonil)amiduro,
perfluoroalquil-sulfonato y
perfluoroalquilcarboxilato (J. Fuller, R.T. Carlin, H.C. de Long,
D. Haworth, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994,
299-300). Sin embargo, de manera especialmente
ventajosa, se pueden preparar líquidos iónicos exentos de
halogenuros de acuerdo con el procedimiento descrito en el
documento EP-A-1182196.
En una forma de realización del procedimiento
conforme al invento, el líquido iónico se emplea como único medio
de reacción, es decir libre de otros disolventes. La proporción del
líquido iónico en el medio de reacción puede estar sin embargo
situada también entre 0,1 a 99,9 por ciento en volumen, de manera
preferida entre 5 y 75 por ciento en volumen, de manera todavía más
preferida entre 15 ó 50 y 75 por ciento en volumen, referida a la
cantidad total del medio de reacción.
El medio de reacción puede contener,
adicionalmente al líquido iónico, todavía otro disolvente más. Éste
se puede seleccionar entre el conjunto que consiste en agua,
soluciones tamponadoras (pH de 2 a 10, de manera preferida de 5 a
8) y disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos, que se pueden
emplear, son miscibles con agua o no miscibles con agua. A modo de
ejemplo se han de mencionar como disolventes orgánicos
metil-terc.-butil-éter, tolueno, hexano, heptano,
terc.-butanol, glicoles y poli(alquilenglicoles). Por lo
demás, entran en cuestión sin embargo fundamentalmente todos los
disolventes habituales, que son conocidos a partir del sector de la
catálisis con
enzimas.
enzimas.
Como enzimas entran en cuestión fundamentalmente
todas las enzimas de las clases EC de 1 a 6. Se recomienda la
clasificación de enzimas del "Nomenclature Committee of the
International Union of Biochemistry and Molecular Biology"
(IUBMB). La enzima o bien se presenta disuelta homogéneamente, pero
se puede emplear asimismo como una suspensión o como un material
inmovilizado sobre un soporte inerte.
Conforme al invento, se encontró que la
presencia de líquidos iónicos en el medio de reacción en el caso de
reacciones catalizadas enzimáticamente, conduce a una mejoría de la
solubilidad de los substratos (biocompatibilidad), a una mejoría de
la actividad de las enzimas, a una mejoría de la selectividad, a una
disminución de la inhibición de los productos, a la represión de
reacciones secundarias (reacciones paralelas y secuenciales) y/o a
una elevación de la estabilidad de las enzimas. Los Ejemplos
demuestran que se pueden emplear enzimas de diferentes clases,
ofreciendo el empleo de líquidos iónicos unas ventajas
significativas, tales como por ejemplo una elevación de la
actividad en el caso de la formiato-deshidrogenasa,
una manifiesta elevación del rendimiento en el caso de reacciones
con la galactosidasa, una elevación de la enantioselectividad en el
caso de las lipasas y una mejoría de la solubilidad de los
productos de partida en el caso de productos de partida
hidrófobos.
Conforme al invento, la enzima se puede emplear,
en común con la cantidad total del líquido iónico o con una parte
de la misma, múltiples veces o en reactores que funcionan de un modo
continuo.
Las enzimas pueden estar seleccionadas entre la
clase de las oxidorreductasas para la oxidación y la reducción
regio- y estéreo-selectivas, entre la clase de las
glicosidasas para la síntesis de oligosacáridos, entre la clase de
las lipasas para la obtención de productos ópticamente activos
(entre otros, alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos) entre la
clase de las liasas para la síntesis e hidrolasas.
El procedimiento conforme al invento se puede
llevar a cabo a unas temperaturas de -10ºC a 130ºC, de manera
preferida en un intervalo de temperaturas de 10ºC a 80ºC, de manera
especialmente preferida en un intervalo de temperaturas de 20ºC a
40ºC.
El procedimiento se puede llevar a cabo en una
manera monofásica o en un sistema de reacción multifásico.
A continuación, se deben explicar a modo de
ejemplo algunos efectos, que se pueden conseguir mediante la
utilización de líquidos iónicos como medio de reacción o como parte
componente de medios de reacción para reacciones enzimáticas. Así,
para la reducción enzimática de cetonas se pueden emplear, entre
otras, alcohol-deshidrogenasas procedentes de
diferentes fuentes. La solubilidad de cetonas hidrófobas se puede
mejorar mediante adición de disolventes orgánicos; esto, sin
embargo, conduce por regla general a una disminución de la actividad
de las enzimas y de la estabilidad (W. Hummel, Biochem. Eng.
Biotechnol. 1997, 58, 145; A. Liese, T. Zelinski, M.-R. Kula, H.
Kierkele, M. Karutz, U. Kragl, C. Wandrey, J. Mol. Cat. B 1998, 4,
91). De una manera análoga, se le pueden añadir al medio de
reacción líquidos iónicos miscibles con agua, con el fin de aumentar
la solubilidad de los productos de partida. Para la
formiato-deshidrogenasa, que se emplea para la
regeneración de cofactores, se observa, en el mismo intervalo de
concentraciones del líquido iónico, una elevación de la velocidad de
reacción en comparación con la de un sistema puramente acuoso
(compárese el Ejemplo 1). No se observó ninguna desactivación de la
enzima ni siquiera en el caso de un prolongado período de tiempo de
acción del líquido iónico. Por consiguiente, los líquidos iónicos
ofrecen una valiosa posibilidad de elevar la productividad de
reacciones enzimáticas mediante un aumento de la concentración de
los productos de partida. Esto es especialmente interesante para
productos de partida desde mal hasta muy mal solubles, tales como
cetonas aromáticas o
esteroides.
esteroides.
Desde hace aproximadamente 20 años se usan
glicosidasas no solamente para el desdoblamiento de enlaces entre
sacáridos, sino también para la síntesis de di- y
oligo-sacáridos. A pesar de muchos experimentos,
mediante una activación por regla general cara de los productos de
partida, o un empleo de disolventes miscibles con agua (que conduce
a una estabilidad disminuida de la enzima), se han conseguido
incluso en los trabajos más recientes unos rendimientos hasta de
como máximo 31% (J.H. Yoon, J.S. Rhee, Carbohydr. Res. 2000, 327,
377; M.J. Hernalz, D.H.G. Crout, J. Mol. Cat. B 2000, 10, 403). En
el caso de estas reacciones, el problema principal es la hidrólisis
secundaria, que se inicia inmediatamente, del producto, la cual es
catalizada por la misma enzima. Sorprendentemente, esta hidrólisis
secundaria es reprimida casi totalmente en presencia de líquidos
iónicos con una actividad por lo demás igual de la enzima. Para el
ejemplo de la síntesis, catalizada por la
\beta-galactosidasa, de
N-acetil-lactosamina, que es un
importante eslabón componente para oligosacáridos
farmacológicamente relevantes, se pudo mostrar que la presencia de
líquidos iónicos aumenta el rendimiento, en el caso de utilizarse
lactosa como donante barato, hasta más de un 55%!. Sin la adición de
líquidos iónicos se alcanza como máximo un 30%; no obstante, la
concentración del producto disminuye rápidamente mediante la
hidrólisis secundaria a valores <10%. Puesto que en presencia de
líquidos iónicos no se produce la hidrólisis secundaria del
producto, se establece una realización simplificada de la reacción,
puesto que no es necesario vigilar la reacción e interrumpirla al
alcanzarse un máximo del rendimiento del producto. La galactosidasa
es muy estable en presencia de líquidos iónicos, y se puede emplear
repetidamente después de una separación mediante ultrafiltración,
sin que se modifiquen el rendimiento que se puede conseguir ni la
velocidad de formación de productos.
Ofrecen ventajas los líquidos iónicos también en
el caso de la hidrólisis inversa la para la síntesis de di- y
oligo-sacáridos. En este caso, por regla general, se
utilizan altas concentraciones de los productos de partida junto
con aditivos - la mayor parte de las veces disolventes orgánicos -
para disminuir la actividad del agua. Los líquidos iónicos ofrecen
aquí en particular la ventaja de la muy buena capacidad de
disolución para hidratos de carbono. En el caso de la síntesis
enzimática de lactosa, en comparación con la bibliografía, se pudo
aumentar el rendimiento en un factor de 2 así como se pudo disminuir
el tiempo de reacción en el factor de 5 (K. Ajisaka. H. Fujimoto,
H. Nishida, Carbohydr. Res. 180, 35-42 (1988).
El empleo de lipasas en presencia de disolventes
orgánicos en una realización mono- o bi-fásica de la
reacción constituye un estado de la técnica (G. Carrea, S. Riva,
Angew. Chem. 2000, 112, 2312, U.T. Bornscheuer, R.J. Kazlauskas,
Hydrolases in Organic Synthesis - Regio- and stereoselective
biotransformations [Hidrolasas en síntesis orgánicas -
biotransformaciones regio- y estéreo-selectivas],
Wiley-VCH, Weinheim, 1999; A. Liese, K. Seelbach,
C. Wandrey, Industrial Biotransformations Wiley-VCH,
Weinheim, 2000; M. C. Parker, S. A. Brown, L. Robertson, N. J.
Turner, Chem. Commun. 1998, 2247). No obstante, hasta ahora la
enzima se separaba de un modo convencional por filtración, y la
solución de reacción se separaba convencionalmente por destilación,
y el disolvente se devolvía. El empleo de líquidos iónicos permite
la separación directa por destilación de los reaccionantes a partir
de la mezcla de reacción, incluso en presencia de la enzima, por lo
que se establece un modo de procedimiento simplificado. Este modo
de procedimiento, cuando los reaccionantes poseen una
correspondiente volatilidad, no está limitado a lipasas. En el caso
de la investigación de diferentes lipasas para el desdoblamiento de
racematos en presencia de líquidos iónicos, se comprobó, de un modo
sorprendente en múltiples casos, que la velocidad de reacción y la
enantioselectividad en parte se mejoran manifiestamente, en algún
caso individual en un factor de 5. Como comparación, sirve la
reacción en el seno de terc.-butil-metil-éter, que
también se emplea en procesos industriales como disolvente para
reacciones catalizadas por lipasas.
Los resultados muestran que los líquidos iónicos
ofrecen ventajas como medio de reacción para reacciones enzimáticas
en comparación con las condiciones, que se han consagrado como
estado de la técnica, y se pueden usar como disolventes
biocompatibles con el fin de influir deliberadamente sobre las
reacciones.
El invento es descrito con mayor detalle
mediante los siguientes Ejemplos, pero sin quedarse limitado a
éstos.
Para la descripción de componentes utilizados en
los Ejemplos, se utilizaron las siguientes abreviaturas:
terc.-Butil-metil-éter | tBME | MTBE |
Butil-metil-imidazolio PF_{6}^{-} | BMlm^{+} | PF_{6}^{-} |
Nonil-metil-imidazolio PF_{6}^{-} | NMlm^{+} | PF_{6}^{-} |
Butil-metil-imidazolio BF_{4}^{-} | BMlm^{+} | BF_{4}^{-} |
Hexil-metil-imidazolio BF_{4}^{-} | HMlm^{+} | BF_{4}^{-} |
Octil-metil-imidazolio BF_{4}^{-} | OMlm^{+} | BF_{4}^{-} |
4-Metil-butil-piridinio BF_{4}^{-} | 4-MBPy^{+} | BF_{4}^{-} |
Trietil-amonio - metilsulfato | Et_{3}NH^{+} | MeSO_{4}^{-} |
Trietil-metil-amonio - metilsulfato | Et_{3}NMe^{+} | MeSO_{4}^{-} |
Butil-metil-piridinio BF_{4}^{-} | BMPy^{+} | BF_{4}^{-} |
Propil-amonio - nitrato | PrNH_{3}^{+} | NO_{3}^{-} |
Metil-metil-imidazolio - metilsulfato | MMlm^{+} | MeSO_{4}^{-} |
Etil-metil-imidazolio - benzoato | EMlm^{+} | PhCO_{2}^{-} |
Butil-metil-imidazolio - trifluorometanosulfonato | BMlm^{+} | CF_{3}SO_{3}^{-} (= triflato) |
Bis-(trifluorometilsulfonil)-imidato de butil-metil-imidazolio | BMlm^{+} | (CF_{3}SO_{2})_{2}N- |
Como reacción de ensayo para la determinación de
la actividad de la enzima sirve la oxidación catalizada por FDH de
ácido fórmico para dar dióxido de carbono, mediando reducción del
dinucleótido de nicotinamidoadenina (NAD^{+} para dar NADH +
H^{+}). En el ensayo enzimático se detecta el aumento de NADH en
el curso del tiempo a 25ºC por vía fotométrica a una longitud de
onda de 340 nm.
Composición del sistema de ensayo de la enzima:
1 ml de una solución tamponadora (50 mM de hidrocloruro de
trietanol-amina, 1 mM de ditiotreitol, ácido
clorhídrico) de pH 7 se mezcla con 1 ml de una solución acuosa de
formiato de sodio (2,4 M) y 0,1 ml de una solución de la enzima (0,7
mg/ml, 8,4 U). La solución de la enzima contiene ya el cofactor NAD
(6 mM).
Con el fin de ensayar la influencia de líquidos
iónicos solubles en agua sobre la actividad de la enzima, el
volumen de la solución tamponadora en el sistema de ensayo se reduce
en escalones de 25% en volumen y se reemplaza por el líquido
iónico.
Líquido iónico | 25% en vol | 50% en vol | 75% en vol |
MMlm^{+} MeSO_{4}^{-} | \pm | + | + |
Se investiga la influencia de líquidos iónicos
sobre la evolución de la transgalactosilación catalizada por
\beta-Gal, partiendo de lactosa y de
N-acetil-glucosamina. Para esto se registran
y comparan las evoluciones de las concentraciones en función del
tiempo de esta síntesis, en presencia y en ausencia de líquidos
iónicos.
Por cada serie de ensayos se formulan
paralelamente 10 reacciones en tubitos de ensayo para GC con una
capacidad de 1 ml. En el intervalo de 10 minutos, las reacciones se
detienen por ebullición durante 10 minutos a 100ºC, la solución de
reacción se filtra (con el filtro de jeringa Minisart RC 4 de
Sartorius) y se determina por cromatografía la concentración de los
componentes de reacción en este momento (columna intercambiadora de
cationes Aminex HPX-87H de la entidad BioRad con una
correspondiente columna preliminar, 0,006 M de ácido sulfúrico como
eluyente con un caudal de 0,8 ml/min y con una temperatura de la
columna de 65ºC. La detección se efectúa mediante luz UV a 208 nm y
mediante el índice de refracción).
Composición de la mezcla de reacción: 0,05 ml de
una solución tamponadora (65 mM de KH_{2}PO_{4}, 195 mM de
K_{2}HPO_{4}) de pH 7,3, se mezclan con 0,5 ml de una solución
de N-acetil-glucosamina (GlcNAc 600
mM o bien 1,2 M en una solución tamponadora), 0,25 ml de una
solución de lactosa (250 mM en una solución tamponadora) y 0,2 ml
de una solución de enzima (10 mg/ml en una solución
tamponadora).
Por intercambio de una solución tamponadora por
un líquido iónico en las soluciones de substratos, se aumenta
escalonadamente la proporción del líquido iónico en el medio de
reacción. De esta manera se establecen las siguientes soluciones de
substratos:
- a)
- 0,50 ml de una solución de N-acetil-glucosamina (600 mM en una solución 1:4 de MMIm^{+} MeSO_{4}^{-} : tampón)
- b)
- 0,50 ml de una solución de N-acetil-glucosamina (600 mM en una solución 1:4 de MMIm^{+} MeSO_{4}^{-} : tampón)
- 0,25 ml de una solución de lactosa (250 mM en una solución 1:4 de MMIm^{+} MeSO_{4}^{-} : tampón)
- c)
- 0,50 ml de una solución de N-acetil-glucosamina (1,2 M en una solución 1:2 de MMIm^{+} MeSO_{4}^{-} : tampón)
- 0,25 ml de una solución de lactosa (250 mM en una solución 1:2 de MMIm^{+} MeSO_{4}^{-} : tampón)
- d)
- 0,50 ml de una solución de N-acetilglucosamina (600 mM en una solución 1:4 de BMIm^{+} H_{2}PO_{4}^{-}/Cl^{-} : tampón)
Medio de | Proporción | Relación de | Rendimiento [%] | Rendimiento [%] |
reacción | [% en vol] | lactosa/GlcNAc | después de 60 min | después de 100 min |
Tampón de fosfato | 1 : 2,4 | 5 | 3 | |
MMIm^{+} | \hskip0.2cm a) 12,5 | 1 : 2,4 | 40 | 40 |
MeSO_{4}^{-} | \hskip0.3cm b) 18,75 | 1 : 2,4 | 44 | 43 |
c) 25 | 1 : 4,8 | 49 | 55 (90 min) | |
BMIm^{+} | \hskip0.2cm d) 12,5 | 1:2,4 | 39 | 30 |
H_{2}PO_{4}^{-}/Cl^{-} |
4,4 ml de un líquido iónico correspondiente a la
Tabla 3 o de terc.-butil-metil-éter se
mezclan con 122 \mul de acetato de vinilo y 54 \mul de
1-fenil-etanol, de manera tal que se
obtiene una solución de substrato con aproximadamente 0,1 mol/l de
1-fenil-etanol y 0,3 mol/l de
acetato de vinilo. En cada caso 1 mg de una lipasa liofilizada
(>120 U/mg) se reúne con 0,4 ml de una solución de substrato, se
mezcla a fondo y se incuba en un sacudidor térmico a 24ºC mediando
ligero sacudimiento durante 3-4 d (días).
Para el tratamiento, 100 \mul de la tanda de
reacción se reúnen con 1 ml de una mezcla de
n-hexano e isopropanol (97,5/2,5 v/v) y se mezclan
a fondo. Este extracto en hexano/isopropanol se emplea para la
determinación de las concentraciones y de las relaciones de
enantiómeros de 1-fenil-etanol y
acetato de 1-fenil-etilo mediante
una HPLC (cromatografía en fase líquida de alto rendimiento). A
partir de estas concentraciones se calcularon el grado de
conversión y el exceso enantiomérico (véase la Tabla 3).
- Columna:
- Columna de protección Nucleosil C-18 5 \mum; 10 ml, 4,6 mm ID (diámetro interno); columna precursora de Chiracel OJ: 250 mm, 4,6 mm ID; columna de separación Chiracel OJ; 250 mm, 4,6 mm ID
- Eluyente:
- isocrático;
- \quad
- 96,5% (v/v) de n-hexano
- \quad
- 3,0% (v/v) de isopropanol
- \quad
- 0,5% (v/v) de etanol
- Caudal:
- 1 ml/min
- Temperatura:
- 38ºC
- Detección:
- Detector de UV (205 nm).
Líquido iónico/disolvente | Grado de conversión | Exceso enantiomérico |
NMI^{+} PF_{6}^{-} | \pm | + |
BMIm^{+} BF_{4}^{-} | + | + |
HMIm^{+} BF_{4}^{-} | \pm | + |
OMIm^{+} BF_{4} | + | + |
4-MBP^{+} BF_{4} | + | + |
BMIm^{+} CF_{3}SO_{3}^{-} | + | + |
BMIm^{+} (CF_{3}SO_{2})_{2}N^{-} | + | + |
En cada caso 5 mg de una lipasa liofilizada
(>30 U/mg) se mezclan con 0,4 ml de una solución de substrato,
igual a como en el Ejemplo 3. El modo de trabajo ulterior
corresponde al descrito en el Ejemplo 3.
Líquido iónico/disolvente | Grado de conversión | Exceso enantiomérico |
BMIm^{+} PF_{6}^{-} | + | + |
NMIm^{+} PF_{6}^{-} | + | + |
BMIm^{+} BF_{4}^{-} | \pm | + |
HMIm^{+} BF_{4-} | + | + |
OMIm^{+} BF_{4} | + | \pm |
BMIm^{+} CF_{3}SO_{3}^{-} | + | + |
En cada caso 3 mg de una lipasa liofilizada (400
U/mg) se mezclan con 0,4 ml de una solución de substrato como en el
Ejemplo 3. El modo de trabajo ulterior corresponde al que se
describe en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Líquido iónico/disolvente | Grado de conversión | Exceso enantiomérico |
MIm^{+} PF_{6}^{-} | \pm | + |
4-MBP^{+} BF_{4}^{-} | \pm | + |
BMIm^{+} CF_{3}SO_{3}^{-} | + | + |
BMIm^{+} (CF_{3}SO_{2})_{2}N- | + | + |
En cada caso 5 mg de una lipasa liofilizada
(>20 U/mg) se mezclan con 0,4 ml de una solución de substrato
como en el Ejemplo 3. El modo de trabajo ulterior corresponde al
descrito en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Líquido iónico/disolvente | Grado de conversión | Exceso enantiomérico |
BMIm^{+} PF_{6}^{-} | \pm | + |
BMIm^{+} BF_{4}^{-} | \pm | + |
HMIm^{+} BF_{4}^{-} | \pm | + |
Líquido iónico/disolvente | Grado de conversión | Exceso enantiomérico |
OMIm^{+} BF_{4}^{-} | \pm | + |
4-MBP^{+} BF_{4}^{-} | \pm | + |
BMIm^{+} CF_{3}SO_{3}^{-} | \pm | + |
600 mg de una lipasa liofilizada
(aproximadamente 10 U/mg) se reúnen y mezclan a fondo con 4 ml de un
líquido iónico (BMIm^{+} (CF_{3}SO_{2})_{2}N^{-}),
1,2 ml de acetato de vinilo y 0,7 ml de
1-fenil-etanol. La mezcla de
reacción se incuba durante 40 min a 40ºC.
A continuación, los productos de partida no
convertidos, así como el producto de reacción
1-fenil-acetato, se separan por
destilación (85ºC, 0,06 mbar).
La mezcla de la enzima y del líquido iónico se
enfría, se reúne de nuevo con 1,2 ml de acetato de vinilo y 0,7 ml
de 1-fenil-etanol y de nuevo se
incuba durante 40 min a 40ºC.
Esta secuencia de reacciones de incubación y
separación por destilación se puede repetir múltiples veces, sin
que disminuya la actividad de la lipasa.
100 mmol/l de glucosa, 20 mmol/l de galactosa y
2 mg/ml de galactosidasa se incuban a 35ºC durante 24 h en una
mezcla de agua y MMIm MeSO_{4}. La reacción se detiene por
ebullición durante 10 minutos a 100ºC, la solución de reacción se
filtra (con un filtro de jeringa Minisart RC 4 de Sartorius) y la
concentración de los componentes de reacción en este momento se
determina por cromatografía (columna intercambiadora de cationes
Aminex HPX-87H de la entidad BioRad con una
correspondiente columna preliminar, 0,006 M de ácido sulfúrico como
eluyente, con un caudal de 0,8 ml/min y con una temperatura de la
columna de 65ºC. La detección se efectúa mediante luz UV a 208 nm y
mediante el índice de refracción). La proporción del líquido iónico
es elevada desde 0 a 100 por ciento en volumen. Mediante vestigios
de agua en el líquido iónico y en los productos de partida se
establece un contenido de agua de 0,6% en el caso de 100% de líquido
iónico. Después de 24 horas, el grado de conversión ya no aumenta
adicionalmente. Dependiendo de la proporción de líquido iónico se
obtienen los siguientes rendimientos de lactosa:
Proporción de líquido iónico en % | Rendimiento [%} |
0 | 0 |
10 | 0 |
20 | 0 |
30 | 4 |
40 | 12 |
50 | 15 |
60 | 15 |
70 | 15 |
80 | 16 |
90 | 16 |
100 | 17 |
Claims (12)
1. Procedimiento para la reacción de sustancias
en presencia de enzimas como catalizadores, en un medio de reacción
que comprende por lo menos un líquido iónico, estando seleccionadas
las enzimas entre el conjunto de las oxidorreductasas, lipasas,
galactosidasas, glicosidasas, liasas, y enzimas de la clase EC
6.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la proporción del
líquido iónico en el medio de reacción es de 0,1 a 99,9 por ciento
en volumen.
3. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio
de reacción, adicionalmente al líquido iónico, contiene todavía otro
disolvente adicional.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el otro
disolvente es agua o un disolvente orgánico.
5. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
reacción se lleva a cabo a unas temperaturas de -10ºC a 130ºC.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
reacción se lleva a cabo en una manera monofásica o en un sistema de
reacción multifásico.
7. Composición que comprende una enzima,
seleccionada entre el conjunto formado por las oxidorreductasas,
lipasas, galactosidasas, glicosidasas, liasas, y enzimas de la clase
EC 6, y por lo menos un líquido iónico.
8. Composición de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizada porque el líquido iónico está definido como
en la reivindicación 2.
9. Composición de acuerdo con la reivindicación
7 u 8, caracterizada porque adicionalmente contiene un
substrato.
10. Composición de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque contiene el
líquido iónico como medio de reacción o como parte componente del
medio de reacción.
11. Uso de líquidos iónicos como medio de
reacción o como parte componente del medio de reacción para las
reacciones catalizadas enzimáticamente, estando seleccionadas las
enzimas entre el conjunto formado por las oxidorreductasas, lipasas,
galactosidasas, glicosidasas, liasas, y enzimas de la clase EC
6.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 como
medio de reacción o como parte componente del medio de reacción en
el caso de la hidrólisis inversa para la síntesis de di- u
oligo-sacáridos.
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