ES2266808T3

ES2266808T3 - Vendajes para heridas que comprenden hidrogeles hidratados y enzimas.

Info

Publication number: ES2266808T3
Application number: ES03718951T
Authority: ES
Inventors: Paul James Davis; Andrew John Austin
Original assignee: Insense Ltd
Current assignee: Insense Ltd
Priority date: 2002-04-24
Filing date: 2003-04-23
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2023-04-23
Also published as: ATE329628T1; ES2502486T3; US20060034816A1; DK1496951T3; EP1496951A1; US7731954B2; JP2005533534A; CA2483214A1; DE60306134D1; DE60306134T2; PT1496951E; AU2003222985A1; AU2003222985B2; JP4475959B2; EP1496951B1; CA2483214C; WO2003090800A1; EP1693073A2; EP1693073A3; PT1693073E

Abstract

Un vendaje cutáneo cerrado herméticamente en un envase, donde el vendaje comprende enzima oxidorreductasa en estado hidratado.

Description

Vendajes para heridas que comprenden hidrogeles hidratados y enzimas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a vendajes cutáneos para aplicación a una parte del cuerpo de un ser humano o de un animal para el tratamiento de la piel, y se refiere particularmente (pero no exclusivamente) a vendajes para heridas para tratamiento de piel dañada, particularmente lesiones cutáneas, es decir, cualquier interrupción en la superficie de la piel, ya sea causada por herida o enfermedad, incluyendo úlceras cutáneas, quemaduras, cortes, pinchazos, laceraciones, traumas por golpes, lesiones por acné, diviesos, etc.

Antecedentes de la invención

Las heridas se infectan con frecuencia. Los vendajes para heridas pueden contener sustancias antisépticas, y la protección física que proporcionan previene el ingreso de más microbios infecciosos, aunque esta exclusión microbiana rara vez es absoluta. Las sustancias antisépticas que lleva la almohadilla del vendaje normalmente no son muy eficaces, posiblemente porque no se difunden fácilmente en la herida a una tasa rápida. Es más, las sustancias más eficaces, los antibióticos, no están disponibles para uso rutinario, por causa de los problemas siempre presentes de la aparición de resistencia a los fármacos.

El peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) es una sustancia anti-microbiana conocida con muchas ventajas. Se produce de forma natural en el cuerpo por los leucocitos como parte de las actividades de defensa inmune en respuesta a la infección. No existen mecanismos conocidos de evasión microbiana por los cuales los microbios puedan escapar a sus efectos y tiene un tiempo de vida corto, descomponiéndose muy rápidamente en agua y oxígeno en los tejidos. Por lo tanto no se acumula a niveles peligrosos. Cuando se aplica por vía tópica (por ejemplo para tratar acné), su eficacia se potencia por el hecho de que penetra fácilmente en la superficie de la piel para alcanzar los sitios de infección subyacentes.

Puesto que el peróxido de hidrógeno es tan beneficioso, se ha usado durante muchos años como una sustancia anti-microbiana para limpiar heridas de todo tipo y como un antiséptico general biológicamente compatible. En particular, se han usado las pomadas que contienen peróxido de hidrógeno, por ejemplo, para el tratamiento de úlceras en las piernas, úlceras por presión, heridas leves e infección. Existen, sin embargo, problemas asociados con el uso de peróxido de hidrógeno. La solución de peróxido de hidrógeno es muy inestable y se oxida fácilmente a agua y oxígeno; además, el peróxido de hidrógeno a altas concentraciones puede dañar la piel normal y las células responsables de la curación en el lecho de la herida. Es muy difícil o incluso imposible usar peróxido de hidrógeno como parte de un vendaje para heridas pre-dosificado: su inestabilidad haría un producto con un periodo de caducidad tremendamente corto, y ni siquiera la dosificación en el punto de aplicación proporcionaría un suministro sostenido durante un periodo prolongado de forma útil. Cuando se usa en el tratamiento de heridas (como se ha descrito en la British Pharmacopoeia, por ejemplo) se necesitan concentraciones muy altas (típicamente el 3%) para conseguir un efecto anti-microbiano potente durante un intervalo de tiempo muy corto. Incluso este tipo de estallidos cortos puede ser eficaz, por causa de la gran eficacia del peróxido de hidrógeno, pero existe la desventaja adicional de que dichas altas concentraciones pueden ser relativamente dañinas para las células huésped y pueden dificultar el proceso curativo. Por esta razón, el uso de peróxido de hidrógeno tiende a restringirse a una limpieza y esterilización iniciales de las heridas. Incluso así, es una sustancia de defensa natural, producida por las propias células del cuerpo (a concentraciones más bajas) y está cada vez más reconocida como una molécula mensajera intercelular e intracelular, implicada en la señalización y regulación molecular célula a célula. Indudablemente, el peróxido de hidrógeno es una molécula potencialmente muy beneficiosa, si puede usarse a las concentraciones correctas y en el periodo de tiempo apropiado.

El documento US4576817 propone un vendaje para heridas fibroso y bacteriostático que incorpora enzimas secas tales como glucosa oxidasa y lactoperoxidasa para generar por ejemplo peróxido de hidrógeno e hipoyodito en contacto con el suero.

El documento WO 01/28600 describe un vendaje para heridas que incluye glucosa oxidasa seca, lactoperoxidasa seca y sal de yoduro en una matriz polimérica. La glucosa oxidasa cataliza una reacción de oxidación de la glucosa presente en los fluidos corporales del sitio de una herida para generar peróxido de hidrógeno. La acción de la lactoperoxidasa sobre el peróxido de hidrógeno y el yoduro genera yodo elemental, que es un agente anti-infeccioso potente.

La curación eficaz de heridas se promueve por varios factores, incluyendo un ambiente húmedo y la retirada de las exudaciones de la herida mediante absorción. Se han usado a menudo materiales secos super-absorbentes para obtener el beneficio de la retirada de las exudaciones, puesto que estas sustancias toman y mantienen fácilmente los fluidos que exudan de las heridas, con gran eficacia. Sin embargo, un material absorbente seco de alta eficacia, puede conducir a una falta de humedad poco útil, y un vendaje para heridas construido a partir de dicho material no funcionaría bien con sistemas enzimáticos anti-microbianos, al menos no hasta que el vendaje se haya humedecido totalmente por el fluido de la herida.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un vendaje cutáneo cerrado herméticamente en envases, donde el vendaje comprende enzima oxidorreductasa y opcionalmente enzima peroxidasa, donde la(s) enzima(s) están presentes en estado hidratado. La(s) enzima(s) están por tanto en estado hidratado en el vendaje antes del uso del vendaje, es decir, antes de la aplicación del vendaje a la piel.

Proporcionando la(s) enzima(s) en estado hidratado, la enzima está presente en estado activo y húmedo en el vendaje y puede empezar a funcionar inmediatamente cuando se pone en contacto con el sustrato apropiado en el uso del vendaje. Esto contrasta con vendajes de la técnica anterior donde las enzimas están en estado seco y requieren hidratación inicial en el uso, retrasando por tanto el funcionamiento de la enzima y los efectos anti-microbianos consiguientes. El estado hidratado de la enzima permite también que se formule en un hidrogel húmedo u otro material de vendaje húmedo de tal manera que el vendaje pueda proporcionar humedad a una herida seca.

El vendaje se usa situando sobre la piel de un ser humano o animal, por ejemplo sobre una herida o una región de la piel a tratar para fines cosméticos o terapéuticos, por ejemplo para el tratamiento de acné u otras afecciones cutáneas. La enzima oxidorreductasa cataliza una reacción de un sustrato apropiado con oxígeno para producir peróxido de hidrógeno. El sustrato puede estar presente de forma natural en los fluidos corporales y/o puede suministrarse por separado y/o incorporarse en el vendaje. Las enzimas oxidorreductasas adecuadas para uso en la invención y los sustratos correspondientes (que están presentes en la sangre y en los fluidos tisulares) incluyen los
siguientes:

Enzima	Sustrato
Glucosa oxidasa	\beta-D glucosa
Hexosa oxidasa	Hexosa
Colesterol oxidasa	Colesterol
Galactosa oxidasa	D-galactosa
Piranosa oxidasa	Piranosa
Colina oxidasa	Colina
Piruvato oxidasa	Piruvato
Glicolato oxidasa	Glicolato
Aminoácido oxidasa	Aminoácido

La enzima oxidorreductasa preferida actualmente es la glucosa oxidasa. Esta cataliza la reacción del sustrato \beta-D-glucosa para dar peróxido de hidrógeno y ácido glucónico.

Puede usarse una mezcla de enzimas oxidorreductasas.

Si la reacción se produce sobre o en las inmediaciones de la piel, el peróxido de hidrógeno producido de este modo puede tener un efecto antibacteriano localizado.

Como alternativa o adicionalmente, el peróxido de hidrógeno generado de esta manera puede usarse en una disposición de dos etapas, con el peróxido de hidrógeno experimentando una reacción catalizada por una enzima peroxidasa para producir diversas especies incluyendo intermediarios reactivos a oxígeno que tienen propiedades anti-microbianas y que pueden, por lo tanto, ayudar a promover la curación de la herida. Para dichas realizaciones, el vendaje incluye una enzima peroxidasa, preferiblemente presente en estado hidratado. Como una posibilidad adicional, el peróxido de hidrógeno puede reaccionar directamente de manera no catalizada con sustancias tales como iones de yoduro para generar yodo molecular.

Las enzimas peroxidasa útiles en la invención incluyen lactoperoxidasa, peroxidasa de rábano rusticano, yoduro peroxidasa, cloruro peroxidasa, y mieloperoxidasa, prefiriéndose actualmente la lactoperoxidasa.

Puede usarse una mezcla de enzimas peroxidasa.

Las especies activas producidas por la acción de una peroxidasa son difíciles de definir, y dependerán hasta cierto punto de la peroxidasa particular en cuestión. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano rusticano funciona de forma muy diferente a la lactoperoxidasa. La química detallada se complica por el hecho de que los productos son tan reactivos que rápidamente originan otros, productos asociados que son también muy reactivos. Se cree que los radicales hidroxilo, los singletes de oxígeno y los superóxidos se producen, justamente como en las reacciones de "estallido oxidativo" identificadas en leucocitos neutrófilos y macrófagos del cuerpo humano, y en la bien conocida reacción de "Fenton", basada en los efectos catalíticos de los iones férricos.

El vendaje incluye una fuente de agua de modo que la enzima o enzimas estén presentes en estado hidratado. El vendaje puede estar en forma de, por ejemplo, un vendaje de algodón húmedo, o puede incluir un material estructurado en mecha con ingredientes húmedos. Preferiblemente, sin embargo, el vendaje incluye uno o más geles basados en agua o acuosos, también denominados hidrogeles hidratados. Dichos geles pueden estar formados de diversos materiales y pueden contener diversos reactivos, como se describirá a continuación.

Un hidrogel hidratado proporciona una fuente de agua para hidratar la enzima o enzimas, promoviendo la reacción rápida y la consiguiente liberación de las sustancias anti-microbianas. El gel puede también actuar para absorber agua y otros materiales exudados a partir de un sitio de la herida, permitiendo al vendaje realizar una función valiosa y útil retirando dichos materiales del un sitio de la herida. El hidrogel hidratado proporciona también una fuente de humedad, que puede funcionar para mantener la enzima o enzimas en el vendaje en estado hidratado, y puede actuar en uso para mantener un sitio de la herida húmedo, ayudando a la curación.

El gel, o cada gel hidratado comprende convenientemente material polimérico hidrófilo. Los materiales poliméricos hidrófilos adecuados incluyen poliacrilatos y metacrilatos, por ejemplo, como los suministrados por First Water Ltd en forma de hidrogeles en propiedad incluyendo poli-ácido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfónico (poliAMPS) o sales del mismo (por ejemplo, como las descritas en el documento WO 01/96422), polisacáridos, por ejemplo gomas de polisacáridos, particularmente goma de xantano (por ejemplo disponible con la Marca Comercial Keltrol), diversos azúcares, poli-ácidos carboxílicos (por ejemplo disponibles con la Marca Comercial Gantrez AN-169 BF de ISP Europe), poli(metil vinil éter del anhídrico co-maléico) (por ejemplo disponible con la Marca Comercial Gantrez AN 139, que tiene un peso molecular en el intervalo de 20.000 a 40.000), polivinil pirrolidona (por ejemplo en forma de calidades disponibles en el mercado conocidas como PVP K-30 y PVP K-90), óxido de polietileno (por ejemplo disponible con la Marca Comercial Polyox WSR-301), poli-alcohol vinílico (por ejemplo disponible con la Marca Comercial Elvanol), polímero poliacrílico reticulado (por ejemplo disponible con la Marca Comercial Carbopol EZ-1), celulosas y celulosas modificadas incluyendo hidroxipropil celulosa (por ejemplo disponible con la Marca Comercial Klucel EEF), carboximetil celulosa sódica (por ejemplo disponible con la Marca Comercial Cellulose Gum 7LF) e hidroximetil celulosa (por ejemplo disponible con la Marca Comercial Natrosol 250 LR).

Pueden usarse en un gel mezclas de materiales poliméricos hidrófilos.

En un hidrogel hidratado de un material polimérico hidrófilo, el material polimérico hidrófilo se presenta deseablemente a la concentración de al menos el 1%, preferiblemente al menos el 2%, más preferiblemente al menos el 5%, posiblemente al menos el 10%, en peso en base al peso total del gel.

Usando un gel que comprende una concentración relativamente alta (al menos el 2% en peso) de un material polimérico hidrófilo, el gel puede funcionar de forma particularmente eficaz para captar el agua en uso del vendaje, por ejemplo, de exudados de suero mientras está en contacto con una herida. Puesto que el gel es un sistema acuoso, el uso del vendaje no tiene el efecto de inducir una humedad global sobre la herida que no sería deseable. Esto es porque la presión de vapor de agua se mantiene en el ambiente sellado alrededor de la piel en uso del vendaje. El gel funciona por tanto como una entidad absorbente para la retirada de la humedad, por ejemplo de la exudación de la herida, que puede proporcionar un trasfondo útil de nivel de humedad.

La capacidad de captación de agua de un hidrogel hidratado, incluyendo un gel a alta concentración, permite al vendaje ayudar en la curación de la herida retirando cantidades considerables de exudaciones, hinchándose a medida que lo hace. Usando un gel previamente hidratado, formulado cuidadosamente, se previene que la herida alcance un estado poco útil de humedad. La hidratación previa asegura también la formación rápida de un interfaz líquido entre el vendaje y la herida, previniendo de este modo la adhesión, que de otra manera impediría la fácil retirada del vendaje cuando tiene que sustituirse. Una buen interfaz líquido entre la herida y el vendaje es también importante para permitir a los productos anti-microbianos de las enzimas entrar en la herida por toda la superficie disponible.

El gel, o cada gel puede contener diversos reactivos, incluyendo uno o más de los siguientes:

una o más enzimas oxidorreductasa;

una o más enzimas peroxidasa;

sustrato para la enzima oxidorreductasa (a describir a continuación);

una fuente de iones yoduro (a describir a continuación);

glicerol (que actúa como humectante y humidificante) típicamente en una cantidad de hasta el 20% en peso del peso del gel.

En particular, la enzima o enzimas pueden estar presentes en uno o más hidrogeles hidratados.

Por ejemplo, una de las enzimas, la enzima oxidorreductasa o la enzima peroxidasa, puede estar presente en un gel, por ejemplo un gel de material polimérico hidrófilo de alta concentración acuosa. Como una posibilidad adicional, las dos enzimas pueden estar presentes en un gel, por ejemplo tal como un gel de alta concentración. Una opción más es que cada enzima esté presente en un gel respectivo, por ejemplo un gel hidrófilo de alta concentración acuosa.

\newpage

Como una posibilidad adicional, el vendaje puede incluir un único hidrogel hidratado (por ejemplo de poliAMPS), que no contenga enzimas pero que posiblemente contenga un sustrato para la enzima oxidorreductasa (por ejemplo una fuente de glucosa para glucosa oxidasa), que contenga adicionalmente o como alternativa, un suministro de iones yoduro (por ejemplo en forma de una o más sales de yoduro) y que contenga opcionalmente glicerol.

El gel, o cada gel puede estar reticulado. Por ejemplo, el gel puede comprender un gel de alginato, por ejemplo formado de manera conocida a partir de ácido algínico reticulado, por ejemplo mediante el uso de cloruro cálcico. Los geles reticulados forman una matriz-trampa de biopolímeros que puede retener la enzima dentro del gel si el grado de reticulado es suficientemente estrecho, previniendo de este modo la liberación de la enzima dentro del lecho de la herida en uso del vendaje. El gel puede estar en forma de de perlas microencapsuladas, perlas, placas o hilos extruidos, etc.

El hidrogel hidratado, particularmente un gel reticulado, puede verterse alrededor de una estructura mecánica de refuerzo, tal como una lámina de gasa de algodón o una malla flexible inerte, por ejemplo para proporcionar una capa o placa de hidrogel estructuralmente reforzado.

El hidrogel hidratado puede estar como alternativa, en forma de un gel no reticulado reductor de cizalla, por ejemplo de gomas adecuadas tales como goma de xantano (disponible con la Marca Comercial Keltrol), en este caso preferiblemente sin una estructura de refuerzo mecánico. Dichas gomas son líquidas cuando se someten al estrés de cizallamiento (por ejemplo cuando se vierten o se estrujan a través de un inyector) pero son sólidas cuando están estáticas. Por tanto, el gen puede estar en forma de un componente vertible, facilitando la producción de geles en el vendaje. Dicho gel reductor de cizalla puede usarse también en combinación con un gel preformado reforzado mecánicamente, como se ha descrito anteriormente.

El gel absorbente de agua puede utilizar una concentración aumentada de sustancia hidrófila, que puede ser el auténtico material polimérico formador del gel, por ejemplo polisacárido, él mismo o una sustancia adicional añadida a la mezcla para el único fin de absorber agua. Un ejemplo de este tipo de mezcla funcional es la formada mediante una combinación de alginato reticulado a aproximadamente el 2% en peso y goma de xantano a aproximadamente el 5-10% en peso, en base al peso total del gel. Una versión particularmente preferida es la del hidrogel polimérico unido covalentemente tal como poliAMPS, que absorbe el agua fuertemente, siendo capaz de captar volúmenes muy grandes de agua o de soluciones acuosas.

La enzima o enzimas pueden estar presentes en un gel en varias formas posibles, incluyendo en solución como moléculas libres. Para mejorar la eficacia de retención de la enzima en el gen, las enzimas pueden estar conjugadas químicamente entre sí, conjugadas químicamente a otras moléculas (por ejemplo polietilenimina) o incorporadas en un soporte sólido, tal como perlas.

Pueden usarse geles de diferentes tipos, por ejemplo alginato reticulado y reductor de cizalla, en un único vendaje. Se han obtenido buenos resultados con un gel reductor de cizalla cerca de la piel, en uso, y un gel reticulado reforzado estructuralmente alejado de la piel.

La enzima o enzimas pueden inmovilizarse de modo que se prevenga su liberación dentro de una herida, donde tendrían el potencial para desencadenar respuestas alérgicas no deseadas (que generalmente se obtienen a partir de fuentes no humanas, por ejemplo con la glucosa oxidasa más disponible en el mercado, que se obtiene a partir del hongo Aspergillus niger y con la lactoperoxidasa que se extrae típicamente a partir de leche de vaca), y que podrían ser también susceptibles a degradación mediante el efecto de las proteasas presentes en una herida.

Una enzima puede inmovilizarse de manera conocida, por ejemplo enlazándose de forma irreversible a un soporte sólido tal como una partícula, perla, o fibra, por ejemplo de celulosa, de sílice, polímero, etc., usando procedimientos de acoplamiento conocidos por los especialistas en la técnica. La incorporación de una enzima en un gel de alginato reticulado como se ha descrito anteriormente, en forma perlas microencapsuladas, placas, o hilos extruidos, tiene también el efecto de inmovilizar las enzimas. También son apropiadas técnicas de encapsulación conocidas que usan poliamida.

En realizaciones que usan la enzima oxidorreductasa y la enzima peroxidasa, las dos enzimas pueden situarse en hidrogeles hidratados diferentes, con la enzima oxidorreductasa situada en un primer gel hidratado y la peroxidasa situada en un segundo gel hidratado. El primer y segundo geles hidratados pueden situarse en diferentes regiones del vendaje según se requiera. El vendaje tiene deseablemente una construcción estratificada en capas, por ejemplo que comprenda una capa superior (externa) de un gel y una capa inferior (interna) de otro gel.

Por ejemplo, el primer gel (con la enzima oxidorreductasa) puede situarse en las inmediaciones de las partes externas del vendaje, es decir, alejada de la piel en uso, donde los niveles de oxígeno son los más altos, con el segundo gel (con la enzima peroxidasa) situándose en las inmediaciones de las partes internas del vendaje, es decir, adyacente a la piel en uso, de modo que las especies anti-microbianas (al menos alguna de las cuales tienen una vida muy corta debido a su reactividad extrema) producidas de este modo, estén cerca de la piel y no se suministren antes de que alcancen el sitio de acción deseado. En este caso, el vendaje tiene por tanto una construcción en capas estratificada, que comprende una capa superior (externa) del primer gel y una capa inferior (interna) del segundo gel. Sin embargo, los experimentos sugieren que la situación relativa de las dos enzimas no es crítica.

Algunos tipos de vendajes deseablemente incluyen una capa de material barrera en el interfaz con la piel en uso, por ejemplo adyacente al segundo gel (con la enzima peroxidasa) en la disposición anterior, para prevenir la entrada no deseada en el vendaje de catalasa de la piel, por ejemplo del fluido de la herida o de microbios que habiten en el área. La entrada de catalasa en el vendaje no es deseable puesto que la enzima podría competir con la peroxidasa para reaccionar con el peróxido de hidrógeno, reduciendo por tanto la eficacia. Los materiales barrera adecuados incluyen, por ejemplo una lámina o membrana semipermeable con un límite de peso molecular relativamente bajo que sea permeable a las especies anti-microbianas producidas por la peroxidasa peroxidativa pero impermeable a la catalasa. Los materiales adecuados son conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen una película de acetato de celulosa tal como la usada para fabricar membranas de diálisis con un límite de peso molecular de aproximadamente 15 kD.

Como se ha mencionado anteriormente, el vendaje incluye deseablemente una fuente o sustrato para la enzima oxidorreductasa, por ejemplo glucosa para la glucosa oxidasa. Preferiblemente la glucosa está en forma de material puro de calidad farmacéutica. La glucosa puede suministrarse también en forma de miel que proporciona de forma natural otros beneficios tales como factores curativos y anti-microbianos. El sustrato se separa físicamente de la enzima oxidorreductasa antes del uso del vendaje, para prevenir una reacción prematura, aunque puesto que se requiere oxígeno para la reacción y puesto que el suministro de este oxígeno es limitado, solamente puede producirse una pequeña reacción. Esto se describirá a continuación. El sustrato puede contenerse dentro de un recinto de un material de membrana semipermeable, por ejemplo material tal como los usados como membranas de diálisis, por ejemplo acetato de celulosa (que se conoce también a menudo como "visking tubing"), o dentro de una placa de gel o de una almohadilla, por ejemplo de agarosa. Dicha placa o almohadilla de gel se vierte deseablemente alrededor de una estructura de refuerzo mecánico, tal como una lámina de gasa de algodón, etc., como se ha descrito anteriormente. El sustrato puede estar convenientemente en forma de un gel reductor de cizalla, por ejemplo de una goma adecuada tal como goma de xantano como se ha descrito anteriormente, preferiblemente sin una estructura de refuerzo mecánico, para una producción vertible. El sustrato, como alternativa puede estar presente en un gel hidratado, por ejemplo de material polimérico hidrófilo como se ha descrito anteriormente. El sustrato, por ejemplo, glucosa, típicamente está presente en una cantidad de hasta aproximadamente el 25% en peso del peso del vendaje.

Es útil equilibrar las cantidades relativas de enzima y sustrato de modo que haya un exceso de peróxido de hidrógeno que, aunque menos potente que los productos de la acción de la lactoperoxidasa, pueda actuar a mayor distancia que las especies más reactivas. También se cree que el peróxido de hidrógeno puede estimular la formación de nuevos vasos sanguíneos en la herida en recuperación (angiogénesis, o crecimiento neovascular), estimular la proliferación de células de formación de nuevo tejido y activar enzimas (proteasas) responsables de ayudar a la reformación del tejido en desarrollo.

El sustrato, por ejemplo glucosa, puede estar presente en diversas formas incluyendo disuelto dentro de una estructura de hidrogel hidratado, presente como un sólido de disolución lenta, o encapsulado dentro de otra estructura para liberación lenta.

En la realización de un vendaje de construcción en capas, como se ha mencionado anteriormente, la fuente de sustrato puede situarse (en uso del vendaje) intercalada entre la capa superior del primer gel que contiene la enzima oxidorreductasa, y la capa inferior del segundo gel que contiene la enzima peroxidasa. En este caso, la enzima oxidorreductasa puede incluirse opcionalmente también en el segundo gel para oxidar el sustrato que puede difundir fácilmente hacia el segundo gel. Dicha oxidación depende de la presencia de oxígeno, cuyo suministro está restringido en esta situación, con la reacción de oxidación siendo proporcional al oxígeno disponible.

En otra disposición alternativa, la enzima peroxidasa y el sustrato están ambos presentes en el segundo gel hidratado. En este caso, el primer gel hidratado (con la enzima oxidorreductasa) se sitúa deseablemente sobre y/o a continuación del segundo gel en una disposición en capas.

Otra opción más es tener una estructura de 4 capas, con una capa superior (alejada de la piel) de un primer gel hidratado que cubre a una capa de sustrato que cubre a una capa más de primer gel hidratado, que a su vez cubre a una capa de segundo gel hidratado en el fondo (adyacente a la piel en uso).

Proporcionando un exceso de sustrato, de modo que el vendaje sea capaz de funcionar en uso para generar especies anti-microbianas durante un periodo de tiempo prolongado, típicamente al menos 2 días, donde los geles hidratados que contienen el sustrato o los geles se formulan para retardar el flujo de sustrato a las enzimas, por ejemplo, mediante puentes de hidrógeno extensivos para dificultar la difusión a través de o a partir del hidrogel en que se suministraban originalmente.

La eficacia anti-microbiana del sistema puede potenciarse adicionalmente mediante la inclusión de iones yoduro, que pueden oxidarse a yodo elemental (que es un potente agente anti-microbiano conocido, por ejemplo, como se describe en el documento WO 01/28600) mediante la acción de peróxido de hidrógeno, con o sin efecto catalítico. Por tanto, el vendaje incluye deseablemente un suministro de iones yoduro (por ejemplo yoduro potásico o yoduro sódico). Como el yoduro es también relativamente tóxico para las células huéspedes en la herida (por ejemplo células epiteliales, queratinocitos, leucocitos) no sería ventajoso generar yoduro de forma continua a una alta concentración a lo largo del tiempo en el que la formulación está en uso en contacto con la piel. Por tanto, en una realización preferida, el suministro de iones yoduro, por ejemplo sal de yoduro, se proporciona en una forma de liberación relativamente rápida, en el gel sustrato o en una membrana o gasa adicional u otra capa adecuada. De esta manera, el peróxido de hidrógeno producido inicialmente, en una primera fase de actividad, se consume sustancialmente en una reacción que genera yoduro, exponiendo a la piel (por ejemplo, herida) a una oleada de yoduro, cuya duración puede controlarse mediante la cantidad, tasa de liberación y posición del suministro de yoduro. Dicha oleada de yodo, puede ser muy útil ayudando a liberar rápidamente a una herida de la carga microbiana, y su duración relativamente corta permite la curación minimizando el daño a las células en crecimiento y a su actividad reparadora. Una vez que se ha consumido el yoduro, el sistema revierte automáticamente en una fase de actividad subsiguiente, a la producción de peróxido de hidrógeno y a las especies reactivas a oxígeno relacionadas (ROS), que mantiene la esterilidad y mata a las bacterias invasoras cerca de la piel, por ejemplo en la superficie de la herida. En otras realizaciones, sin embargo, puede ser deseable que la fuente de iones yoduro sea tal que proporcione, en uso, un flujo de yodo sostenido (y/o ácido hipoyódico) para liberarlo dentro de la herida, además (y en proporción) al peróxido de hidrógeno. El suministro de yoduro puede situarse como alternativa con la fuente de sustrato para la enzima oxidorreductasa, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo en un gel hidratado. El yoduro puede estar presente en diversas formas, incluyendo disuelto dentro de una estructura de gel hidratado, presente como un sólido de disolución lenta, o encapsulado dentro de otra estructura para liberación lenta. La sal de yoduro, puede estar presente, por ejemplo, en una cantidad de hasta aproximadamente el 2% en peso. Sin embargo, incluso en ausencia de yoduro, aún se forman los intermediarios anti-microbianos activos, como se ha descrito anteriormente.

En realizaciones en que la enzima o enzimas no están presentes en uno o más geles hidratados, la enzima o enzimas se unen convenientemente de forma irreversible a un vehículo inerte o un soporte. El soporte comprende adecuadamente una gasa por ejemplo de material tejido tal como algodón o alguna otra forma apropiada de celulosa, etc. El soporte puede activarse de manera conocida de modo que sea capaz de reaccionar con la proteína (enzima) para formar enlaces imina estables, de modo que la enzima se mantenga sobre el soporte. La enzima unida puede revestirse opcionalmente con un agente conservante, por ejemplo poli-alcohol vinílico (PVA) por ejemplo al 5%, sacarosa por ejemplo al 10%, gelatina por ejemplo al 2% y/o glicerol, para ayudar a mantener la actividad de la enzima. El vendaje se diseña de modo que la enzima o enzimas estén presentes en el vendaje en estado hidratado.

Los geles reticulados covalentemente, tales como poliAMPS, pueden fabricarse fácilmente para excluir las moléculas de enzima mientras son permeables al peróxido de hidrógeno y al yodo. En los geles de esta naturaleza, la enzima o enzimas pueden incorporarse dosificándolas sobre la superficie superior de un hidrogel que contiene sustrato como una solución acuosa, y permitiendo al líquido empaparse en el gel. Aunque el agua penetra en el gel, las moléculas de enzima se retienen en la superficie superior. Si la solución de enzima contiene PVA (por ejemplo al 6% p/v), la mezcla de enzima/PVA forma una fina membrana hidratada a medida que el agua penetra dentro del gel. Además, la matriz de PVA estabiliza la enzima con la que se asocia.

Se ha descubierto que los vendajes de acuerdo con la invención actúan como trasportadores eficaces de oxígeno de la atmósfera ambiental hasta un sitio de la herida, lo que tiene beneficios para la curación de las heridas. En particular, la tasa de oxígeno trasportado a través de un vendaje de acuerdo con la invención, es mayor que la de un vendaje similar sin enzima oxidorreductasa. La razón para esto, y los beneficios resultantes, se describen a continuación.

Cuando se aplica un vendaje convencional a la superficie de una herida, el suministro de oxígeno de la atmósfera generalmente se inhibe y la herida se ve privada relativamente de oxígeno (hipóxica o incluso anóxica). La hipoxia, o peor, la anoxia son estados que se encuentran frecuentemente, que se conoce son muy malos para la curación de las heridas, porque las células responsables de la curación (queratinocitos y células epiteliales) y los leucocitos que combaten la infección y controlan el proceso, necesitan todos oxígeno para crecer. Los leucocitos fagocíticos necesitan gran cantidad de oxígeno para realizar su bioquímica de "estallido respiratorio", con la que matan a las bacterias. El colágeno es esencial para la reconstrucción de los tejidos dañados, y para crear nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis), que necesita fibras de colágeno sobre las que construir las paredes de los capilares. La síntesis de colágeno solamente puede tener lugar cuando las enzimas hidroxilasa pueden hidroxilar la lisina y la prolina, para dar hidroxilisina e hidroxiprolina, las cuales son esenciales para la construcción de bloques de colágeno. Las enzimas hidrolasa necesitan un suministro de oxígeno abundante para su eficaz funcionamiento. Por estas razones, se reconoce ampliamente que las heridas deben estar bien oxigenadas si se quieren curar eficazmente, y se reivindica frecuentemente que el suministro de oxígeno puede ser el factor limitante en la curación de las heridas. Se cree que un fallo en la curación está causado a veces por la falta del oxígeno adecuado, es más, una alta tensión de oxígeno en una herida inhibe el crecimiento de bacterias anaeróbicas patógenas, que también son responsables de la producción de mal olor.

Por estas razones, ciertos vendajes secundarios, como Tegaderm de 3M Healthcare Ltd u OpSite de Smith &Nephew (Tegaderm y OpSite son Marcas Comerciales), se fabrican a partir de una película fina de poliuretano revestida en una cara con una capa adhesiva. Estos se comercializan como relativamente permeables al oxígeno (y al vapor de agua), por causa de su particular estructura molecular y su fina sección transversal. Esto es un efecto puramente pasivo, y la eficacia de la permeabilidad al oxígeno es inversamente proporcional al grosor de la película.

Los hidrogeles no son muy permeables al oxígeno, puesto que están constituidos principalmente de agua, y el oxígeno no es muy soluble en agua. Su permeabilidad al oxígeno será también inversamente proporcional al grosor del vendaje. Hasta la llegada de esta invención, la única manera de aumentar el nivel de oxígeno a una herida era administrar oxígeno al paciente, aumentando la cantidad en la sangre (por ejemplo haciendo respirar al paciente aire enriquecido con oxígeno o situando al paciente en un ambiente de oxígeno hiperbárico tal como el disponible en una cámara de compresión), o aplicando oxígeno gaseoso a la propia herida.

Como se ha indicado anteriormente, los vendajes de acuerdo con la invención tienen la capacidad para transportar oxígeno eficazmente de la atmósfera ambiental fuera de la herida, al interior del lecho de la herida, especialmente en casos en el que el vendaje incluye una capa de enzima oxidorreductasa, por ejemplo glucosa oxidasa, en la superficie externa, en contacto con la atmósfera ambiental. El oxígeno de la atmósfera ambiental se convierte en peróxido de hidrógeno (catalizado por la enzima oxidorreductasa). El peróxido de hidrógeno es mucho más soluble en agua que el oxígeno molecular, así que el trasporte del peróxido de hidrógeno a través del vendaje (típicamente a través de uno o más hidrogeles hidratados) es generalmente mucho más eficaz y rápido que el del oxígeno molecular. El peróxido de hidrógeno se difunde por tanto rápidamente a través del vendaje. Cuando el peróxido de hidrógeno se encuentra con la catalasa (que está presente de forma natural en una herida, o que puede incluirse como un componente del vendaje), se descompone en oxígeno y agua. De esta manera, el oxígeno se trasporta a través del vendaje en forma de peróxido de hidrógeno mucho más eficazmente que el trasporte de oxígeno molecular. Los experimentos han demostrado que la tasa de trasporte de oxígeno puede ser más del doble en vendajes de acuerdo con la invención en comparación con vendajes similares sin enzima oxidorreductasa. Los niveles aumentados de oxígeno resultantes potencian el proceso curativo, como se ha descrito anteriormente.

El vendaje convenientemente incluye, o se usa con, un revestimiento o capa externa para adherir el vendaje a la piel de un sujeto ser humano o animal (de manera conocida). Al menos parte del revestimiento debe ser material permeable al oxígeno para permitir al oxígeno del ambiente pasar a través del revestimiento y entrar en el cuerpo del vendaje en uso, donde se requiere como cosustrato de la reacción catalizada por oxidorreductasa. El material permeable al oxígeno puede estar en forma de una "ventana" colocada dentro de un revestimiento que de otra forma sería relativamente impermeable al oxígeno, por ejemplo, de un material posiblemente más robusto.

Opcionalmente el revestimiento incluye una ventana (o una ventana adicional) e o a través de la que puedan verse medios indicadores por ejemplo una lámina indicadora o una estructura similar que indica (por ejemplo mediante un cambio de color) cuando se activa la química del vendaje. Puede proporcionarse un indicador adicional, que indique (por ejemplo, mediante un cambio de color) cuando se ha terminado la química del vendaje.

Una opción útil adicional es proporcionar enzima catalasa inmovilizada en la superficie interna del revestimiento (fijada al adhesivo de la misma). Esto funcionará rápidamente para descomponer cualquier exceso de peróxido de hidrógeno que pudiera escapar del área de una herida. Esta característica evitará daños potenciales del peróxido de hidrógeno en áreas de piel normal, sin dañar.

El vendaje puede suministrarse como un sistema de partes múltiples, con diferentes elementos envasados por separado, para reunirse y usar por el usuario final de acuerdo con instrucciones suministradas. En particular, en realizaciones que incluyen una fuente de sustrato, por ejemplo glucosa, esta puede suministrarse envasándola por separado de los otros componentes, particularmente de la enzima oxidorreductasa para evitar una reacción de oxidación prematura. Como alternativa, el vendaje puede ser plegable. Una realización típica de esta clase comprende una disposición lineal de placas o paneles unidos que incluyen una placa del primer gel hidratado, una placa del segundo gel hidratado y una placa de sustrato. Con las placas adyacentes unidas por una parte en gozne respectiva. El material de barrera hidrofóbica, por ejemplo una cera, se impregna deseablemente en las partes de gozne para evitar la difusión lateral. Se han obtenido buenos resultados con una realización que comprende, secuencialmente, una placa de sustrato, una placa de segundo hidrogel hidratado (que contiene enzima peroxidasa) y una placa de primer hidrogel hidratado (que contiene enzima oxidorreductasa) con placas adyacentes unidas por una parte en gozne plegable respectiva. Para preparar dicho vendaje para uso, las dos placas externas se pliegan, para que la placa de sustrato cubra a la placa del segundo gel y la placa del primer gel cubra a la placa de sustrato, formando de este modo una disposición en capas como se ha descrito anteriormente. La disposición en capas resultante se coloca sobre la piel, por ejemplo sobre una herida, con la placa del segundo gel en contacto con la piel, y puede mantenerse en su sitio, por ejemplo mediante el uso de un revestimiento adhesivo.

Pueden contenerse uno o más componentes del vendaje dentro de un recinto tal como un sobrecito o una bolsa de material barrera que sea permeable al oxígeno, agua y peróxido de hidrógeno, pero que evite la migración no deseada de materiales. Dicho recinto tiene el efecto, entre otros, de evitar la captación en el vendaje de sustancias del sitio de una herida, que posiblemente interfieran tales como catalasa, iones de hierro, etc. El recinto puede también evitar la migración no deseada de enzima(s) dentro de la herida. Un material barrera adecuado incluye por ejemplo una lámina o membrana semipermeable, por ejemplo de acetato de celulosa o éster de celulosa, tal como una que sea permeable solamente a las moléculas de peso molecular de menos de, digamos, 350 Da (posiblemente con un límite de peso molecular nominal de 500 Da, pero con un límite real de menos de 350 Da). Las membranas adecuadas incluyen membrana de acetato de celulosa de código Z368024 suministrada por Sigma, membrana de éster de celulosa Spectrum SpectraPor código 131054 suministrada por NBS Biologicals y, actualmente preferida particularmente para un vendaje antiacné, poliuretano, por ejemplo una película de Tegaderm de 3M (Spectrum, SpectraPor y Tegaderm son Marcas Comerciales).

Los componentes del vendaje que absorben el agua, pueden aplicarse fácilmente a la herida o al sitio de infección, especialmente cuando se formulan de forma práctica o fluida. Existen muchas formulaciones posibles que consiguen este efecto, y estas pueden determinarse fácilmente mediante experimentación sencilla. Dichas formulaciones pueden aplicarse con facilidad y conveniencia particulares a partir de tubos de compresión, o tubos similares a jeringuillas (con un pistón) con un inyector de aproximadamente 3 mm de diámetro. Puede ser particularmente útil suministrar los componentes en un ensamblaje sencillo de dos o más tubos, como se requiere en la formulación particular en uso, de modo que la mezcla deseada de geles pueda expelerse en un sitio particular con una sola acción. Dichas disposiciones de múltiples tubos se conocen bien y se usan frecuentemente en la industria para otras aplicaciones. Esta disposición satisface perfecta y convenientemente la necesidad de mantener los geles separados entre sí hasta el momento de uso. También se ha descubierto que uno o más de los componentes pueden aplicarse desde un recipiente presurizado, de modo que el gel se aplique en forma de espuma, pulverizado o incluso aerosol. Dentro de las directrices que se dan en este documento, la formulación que proporciona las propiedades físicas particulares (viscosidad, etc), requeridas para este tipo de suministro puede determinarse fácilmente mediante experimentación sencilla. Pueden usarse geles plásticos prácticos a partir de tubos o geles de suministro a presión en combinación con placas estructuradas para dar un ensamblaje apropiado de los ingredientes básicos.

Los vendajes de construcciones en capas comprenden geles reductores de cizalla pueden producirse fácilmente, por ejemplo por un usuario final, vertiendo o dejando caer los geles uno encima de otro, en el orden apropiado para producir un ensamblaje en capas deseado de los geles. De este modo, los geles componentes del vendaje pueden suministrarse en recipientes separados, por ejemplo tubos o frascos, o posiblemente una jarra de múltiples compartimientos. Los diferentes geles pueden estar codificados por colores con un látex coloreado apropiadamente para facilitar la identificación. Los geles pueden aplicarse directamente a la piel de un usuario. Puede no requerirse un revestimiento o capa externa con dichas realizaciones.

Los vendajes de acuerdo con la invención (o componentes de los mismos) se suministran adecuadamente en envases estériles cerrados herméticamente e impermeables al agua, por ejemplo bolsas laminadas de papel de aluminio.

Los vendajes de acuerdo con la invención pueden fabricarse en un intervalo de varios tamaños y formas diferentes para el tratamiento de áreas de la piel, por ejemplo heridas de diferentes tamaños y formas. Las cantidades apropiadas de enzimas, y sustratos, y yoduro si estuviera presente, para un vendaje particular, puede determinarse fácilmente mediante experimentación.

La invención se describirá adicionalmente, a modo de ilustración en los siguientes Ejemplos con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

Las Figuras 1 a 6 son ilustraciones en corte esquemáticas de 6 realizaciones diferentes de vendajes para heridas de acuerdo con la invención.

Descripción detallada de las realizaciones

Haciendo referencia a las figuras, las Figuras 1 a 4 ilustran de forma esquemática diversas realizaciones diferentes de vendajes para heridas de acuerdo con la invención. En todas estas figuras, un elemento rayado en cruz representa un sobrecito de membrana semipermeable, por ejemplo acetato de celulosa o una placa de gel que contiene una solución acuosa de glucosa y yoduro potásico; un elemento rayado con líneas en negrita, que se extiende de la parte superior izquierda a la parte inferior izquierda representa una placa de hidrogel hidratado que contiene glucosa oxidasa atrapada dentro del gel; y un elemento rayado con líneas en negrita que se extienden de la parte superior derecha a la parte inferior izquierda representa una placa de hidrogel hidratado que contiene lactoperoxidasa atrapada dentro del gel.

Los círculos rellenos representan perlas microencapsuladas de gel de alginato (típicamente de aproximadamente 2 mm de diámetro) que contienen glucosa oxidasa atrapada en su interior. Como alternativa, podrían usarse otros geles (por ejemplo agarosa) o polímeros para formar las perlas microencapsuladas. La glucosa es capaz de difundir dentro de estas perlas y el peróxido de hidrógeno es capaz de difundir hacia fuera.

Los círculos vacíos representan perlas microencapsuladas de gel de alginato (típicamente de aproximadamente 2 mm de diámetro) que contienen lactoperoxidasa atrapada en su interior. Como alternativa, podrían usarse otros geles (por ejemplo agarosa) o polímeros para formar las perlas microencapsuladas. El peróxido de hidrógeno es capaz de difundir dentro de estas perlas y las especies reactivas a oxígeno son capaces de difundir hacia fuera.

Los círculos sombreados representan perlas microencapsuladas de gel de alginato (típicamente de aproximadamente 2 mm de diámetro) que contienen glucosa y yoduro potásico atrapados en su interior. Como alternativa, podrían usarse otros geles (por ejemplo agarosa) o polímeros para formar las perlas microencapsuladas. La glucosa es capaz de difundir fuera de estas perlas.

La Figura 1 ilustra una realización preferida de vendaje para heridas de acuerdo con la invención. El vendaje es de construcción en capas y comprende una capa externa o revestimiento 10 en forma de tirita autoadhesiva permeable al oxígeno, adecuada para adherirse a la piel 12 de un sujeto, para cubrir una herida 14. El revestimiento 10 encierra una capa superior que comprende una primera almohadilla húmeda 16 con la glucosa oxidasa inmovilizada, una capa intermedia que comprende una solución de glucosa y yoduro potásico en un sobrecito semipermeable de placa de gel 18 y una capa inferior que comprende una segunda almohadilla húmeda 20 con lactoperoxidasa inmovilizada. Por debajo de la almohadilla 20 hay una lámina 22 de gasa, para entrar en contacto con la herida 14. Las almohadillas y los sobrecitos pueden ser generalmente como se describen a continuación.

\newpage

El vendaje se suministra inicialmente como un sistema de partes múltiples, con los componentes individuales envasados por separado en respectivos envases estériles cerrados herméticamente. Cuando se requiere su uso, los componentes del vendaje se retiran de los envases y se aplican a una herida de manera apropiada y para producir el vendaje final como se ha mostrado.

La Figura 2 ilustra otra realización preferida de vendaje para heridas, generalmente similar a la Figura 1, con componentes similares identificados por números de referencia similares. En esta realización, la capa superior comprende una primera almohadilla húmeda 24 con perlas de alginato cálcico que contienen glucosa oxidasa atrapada en su interior. La capa intermedia comprende una almohadilla 26 con perlas de gel que contienen glucosa y yoduro potásico. La capa inferior comprende una segunda almohadilla húmeda 28 con perlas de alginato cálcico que contienen lactoperoxidasa atrapada en su interior.

La Figura 3 ilustra una realización adicional generalmente similar, pero que comprende una capa superior en forma de una almohadilla 30 con las perlas de gel que contienen glucosa y yoduro potásico, y una capa inferior que comprende una almohadilla húmeda (o una placa de gel) 32 con perlas de alginato cálcico que contienen glucosa oxidasa atrapada en su interior y perlas de alginato cálcico que contienen lactoperoxidasa atrapada en su interior.

La Figura 4 es una variante de la Figura 3 en la que la capa superior comprende un sobrecito semipermeable o una placa de gel 34 que contiene glucosa y yoduro potásico.

Ejemplos Construcción de perlas microencapsuladas de glucosa oxidasa y lactoperoxidasa

La enzima, lactoperoxidasa (LPO) (de Sigma, Nº de cat. L2005) o glucosa oxidasa (GOX) (de Boehringer Mannheim, Nº de cat. 105147) se disuelve en agua pura a la cantidad de 1 \mug/ml (LPO) o 10 mg/ml (GOX). Se prepara una solución de ácido algínico (Manucol DM (Manucol DM es una Marca Comercial) de C P Kelco) (1 gramo por 100 ml de agua) a temperatura elevada y después se enfría. La solución de la enzima se mezcla con el ácido algínico enfriado a la cantidad apropiada. La solución resultante de ácido algínico/enzima se bombea después a través de una bomba peristáltica en el interior de un tubo que conduce a un inyector de salida formado convenientemente con una pipeta pasteur de cristal, convencional de laboratorio, situada sobre un baño de fijación de solución de cloruro cálcico (10% p/v). El flujo de la bomba y la altura del inyector de salida se ajustan de modo que la corriente de ácido algínico/enzima que fluye al exterior forme gotas separadas a medida que entra en la solución de cloruro cálcico. Cada gota comienza rápidamente a solidificar a medida que el calcio comienza a reticular las moléculas de ácido algínico y, 10 minutos después del suministro de la última gota, se completa el proceso de fijación. Todas las perlas microencapsuladas recién formadas se retiran de la solución de cloruro cálcico vertiendo todo a través de un tamiz de tamaño de malla apropiado. El cloruro cálcico residual se retira aclarando con agua pura. Las perlas microencapsuladas se almacenan en agua o en recipientes herméticos al agua, o en una solución de tampón fisiológico tal como solución salina tamponada con fosfato. Como alternativa, pueden colocarse en glicerol o soluciones de glicerol en agua para disminuir el contenido de agua retenida. Sean cuales sean las condiciones de almacenamiento usadas, no deben permitir el secado o endurecimiento en ausencia de agua o glicerol.

Construcción de perlas microencapsuladas de glucosa

Se sigue el procedimiento descrito anteriormente, excepto que no se añaden enzimas y se incluye la glucosa a una cantidad de 12,5 mg por 100 ml tanto en agua pura como el baño de fijación de cloruro cálcico. Las perlas de gel se lavan con solución de glucosa sin calcio, permitiendo la retirada del exceso de calcio sin agotar la glucosa.

Preparación de una almohadilla que contiene perlas microencapsuladas de enzima

Se colocan hilas de algodón de tamaño apropiado sobre una superficie apropiada a través de la cual pueda fluir el agua (por ejemplo una malla de plástico). Se vierte una suspensión de perlas microencapsuladas de enzimas sobre las hilas de algodón, de tal manera que las perlas microencapsuladas queden atrapadas en el interior de la pelusa elevada del tejido, a medida que fluye el agua con la suspensión. Se coloca después un segundo pedazo de hila sobre el primero, para intercalar las perlas microencapsuladas de enzima entre las dos capas del tejido. Pueden usarse adhesivos punzadas o grapas para fijar la capa superior a la capa inferior. El exceso de fluido se drena, pero no se permite secar a la almohadilla.

La cantidad de perlas microencapsuladas que contiene cada almohadilla debe determinarse en base a que cada almohadilla de oxidasa debe llevar aproximadamente 100 mg de GOX, y cada almohadilla de peroxidasa debe llevar aproximadamente 10 mg de LPO.

Preparación de una almohadilla que contiene perlas de glucosa y yoduro

Se usa el procedimiento descrito anteriormente con perlas microencapsuladas que contienen glucosa para preparar una almohadilla que contiene glucosa atrapada en su interior, excepto que se incluye una etapa más al final del proceso, en la que la almohadilla se empapa en una solución de yoduro potásico (10 mM).

Preparación de un sobrecito que contiene glucosa/yoduro

La glucosa se disuelve en una solución acuosa de yoduro potásico 5 mM a la cantidad de 12,5 g/ml. Esta solución se coloca después en una bolsa de diálisis (colocada previamente en agua hirviendo durante 10 minutos, y aclarada minuciosamente) con un área accesible de aproximadamente 40x20 mm, y se cierra herméticamente.

Demostración de la actividad oxidativa de un vendaje compuesto ensamblado

Se prepara una solución de acuosa de agarosa al 1%, con yoduro potásico añadido a una concentración de 10 mM y almidón soluble a una concentración del 1% p/v. La solución se funde y se dispensa en una placa de petri para formar una capa continua de aproximadamente 5 mm de grosor, y se permite la fijación. Una vez fijado, se dispone sobre la superficie una almohadilla de peroxidasa como se ha descrito anteriormente, seguida de una almohadilla o sobrecito de glucosa como se ha descrito anteriormente dispuesta sobre esta, y finalmente una almohadilla de glucosa oxidasa como se ha descrito anteriormente se dispone sobre ambas para formar una pila de tres capas. El desarrollo de un color azul dentro del agar de almidón indica la actividad oxidativa del vendaje compuesto.

Uso del vendaje compuesto ensamblado como tratamiento para heridas

Las almohadillas o sobrecitos preparados para este fin como se ha descrito anteriormente, se cierran herméticamente en bolsitas adecuadas y se someten a irradiación de gamma para asegurar la esterilidad microbiológica, usando técnicas conocidas y usadas de forma rutinaria en la industria.

En primer lugar, la herida se cubre con una fina lámina de gasa estéril. Después se añaden las tres capas de almohadillas estériles en forma de una pila gruesa, con la almohadilla de peroxidasa primero, seguida de la almohadilla o sobrecito de glucosa y en último lugar la almohadilla de glucosa oxidasa. Las almohadillas se cortan en un tamaño que cubre exactamente la herida abierta. Finalmente, el vendaje compuesto se mantiene en su sitio preferiblemente mediante una película adhesiva, tal como "tirita adhesiva" normal o cinta quirúrgica "Micropore".

Otras realizaciones

Las enzimas pueden inmovilizarse sobre diversos tipos de partículas o fibras, usando procedimientos de acoplamiento conocidos por los especialistas en la técnica. Las partículas pueden fabricarse de celulosa, sílice o diversos polímeros inofensivos. Puede usarse el alginato en formas diferentes a perlas microencapsuladas, tales como placas o hilos extruidos, usando todavía calcio como agente fijador. Las microcápsulas, tales como las fabricadas mediante técnicas conocidas con poliamida, pueden usarse para encapsular cada uno de los componentes.

Los componentes adicionales del vendaje se prepararon de la siguiente forma.

Preparación de una almohadilla que contiene enzima

Se corta gasa de algodón tejido en varias piezas de aproximadamente 100 mm por 100 mm y cada pieza se dispone en un recipiente adecuado respectivo de fondo plano. Se prepara ácido algínico al 1% p/v (también denominado "alginato", por ejemplo Manucol DM (Manucol DM es una Marca Comercial), de CP Kelco) disolviendo el gel en una solución acuosa calentada apropiada. Después de enfriar, se añade la enzima al alginato, para dar una concentración final de 5 \mug/ml de glucosa oxidasa (GOX, de Boehringer Mannheim, Nº de cat.: 105147) o 10 \mug/ml de lactoperoxidasa (LPO, de Sigma, Nº de cat.: L2005). Se preparan 10 ml de cada solución de enzima-alginato, y se vierten uniformemente sobre las almohadillas de gasa de algodón individuales. El gel se fija mediante la adición de un exceso de cloruro cálcico al 10% p/v (CaCl_{2}) y se le permite reposar durante 10 minutos. Las almohadillas se lavan después 2 veces durante 5 minutos cada una, en exceso de agua destilada/desionizada para retirar el CaCl_{2}. Las almohadillas pueden después almacenarse en un ambiente húmedo para evitar el secado.

Preparación de una almohadilla que contiene glucosa

Se corta gasa de algodón tejido flexible a aproximadamente 100 mm por 100 mm y se dispone en un recipiente adecuado de fondo plano. Se disuelven agarosa al 1% p/v y glucosa al 40% p/v en una solución acuosa apropiada y se vierten sobre la gasa mientras aún estén fundidas. Se permite al gel fijar mediante enfriado. La almohadilla de gel puede almacenarse después en un ambiente húmedo para evitar el secado. Para producir una almohadilla que contiene glucosa y yoduro potásico, se sigue un procedimiento similar, pero después de que se han disuelto la glucosa y la agarosa, se añade yoduro potásico (KI) hasta una concentración final de 10 mM. La solución se puede verter después, se le permite fijar y se almacena como anteriormente.

Demostración de las propiedades anti-microbianas de un vendaje compuesto ensamblado Ejemplo 1

Usando prácticas convencionales, se prepara una placa de crecimiento microbiano de agarosa al 1,5%, pero con la glucosa sustituida por fructosa como la única fuente de carbono. Las placas están típicamente en la región de 5 mm de grosor. Se extendió Pseudomonas aeruginosa sobre la superficie de la placa como un "cesped". Se colocó una almohadilla que contenía LPO-alginato (preparada como se ha descrito inmediatamente anteriormente) de aproximadamente 20 mm^{2} sobre la superficie de la placa. Situado directamente sobre esta almohadilla está una almohadilla de 20 mm^{2} que contiene glucosa-agar (preparada como se ha descrito inmediatamente anteriormente) (con o sin KI). Finalmente, se dispuso una almohadilla de 20 mm^{2} que contenía GOX-alginato (preparada como se ha descrito inmediatamente anteriormente) sobre la almohadilla de glucosa-agar. Se pudo observar claramente una zona de aclaramiento alrededor de la pila de almohadillas después de 24 horas, demostrando la producción y difusión de especies anti-microbianas activas, evitando el crecimiento de la bacteria aplicada. La retirada de cualquiera de las 3 almohadillas (experimentos de control) no da como resultado ninguna zona de aclaramiento alrededor de la pila de almohadillas, demostrando que las dos enzimas y la glucosa necesitan estar presentes para que la cascada funcione de forma eficaz.

Ejemplo 2

Como alternativa, para demostrar la producción de especies oxidativas reactivas mediante el sistema de enzimas apiladas, se vierte una placa de agar al 1% p/v, que incluye almidón soluble al 1% (por ejemplo ARCOS Nº de cat: 177132500) y KI 10 mM. Se permite a la placa fijarse mediante enfriado. La almohadilla de LPO-alginato, seguida de la almohadilla de glucosa-agar y finalmente la almohadilla de GOX-alginato se pueden apilar después como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. La producción de las especies reactivas oxidativas puede visualizarse después mediante el cromógeno coloreado de azul intenso producido por la interacción bien documentada del yodo elemental (las especies oxidativas oxidan el yoduro a yodo) y el almidón. Esta coloración puede observarse claramente después de 5 minutos, con la intensidad y la extensión creciendo con el tiempo. Después de 30 minutos, la intensidad de color ha crecido hasta un azul intenso indicando formación continua del producto. Esto demuestra que se producen las dos especies oxidativas y yodo, las cuales ayudan en la actividad anti-microbiana del vendaje compuesto.

Ejemplo 3

Una variante del Ejemplo 2 es incluir un nivel bajo de GOX (0,25 \mug/ml) en la almohadilla de LPO-alginato, para promover una producción inicial de especies oxidativas reactivas. Esto utiliza el oxígeno disponible en el gel, y se inicia por la glucosa que difunde en la almohadilla LPO-alginato. Esta reacción está limitada, debido a la disponibilidad de oxígeno y cesará cuando se agote el oxígeno. Para demostrar la producción de especies oxidativas reactivas mediante el sistema de enzima apiladas, se vierte una placa de agar al 1% p/v, que incluye almidón soluble al 1% (por ejemplo ARCOS Nº de cat: 177132500) y KI 10 mM. Se permite a la placa fijarse mediante enfriado. La almohadilla de LPO y GOX-alginato combinados, seguida por la almohadilla de glucosa-agar y finalmente la almohadilla de GOX-alginato pueden apilarse después como se ha descrito anteriormente. La producción acelerada de las especies oxidativas reactivas puede visualizarse después mediante el cromógeno coloreado de azul intenso producido por la interacción bien documentada de yodo elemental (las especies oxidativas oxidan el yoduro a yodo) y el almidón. Esta coloración puede observarse claramente después de sólo 1 minuto, con la intensidad y la extensión creciendo con el tiempo. La coloración disminuirá de forma apreciable después de 15 minutos si no se usa la almohadilla superior de GOX-alginato. Si se usa la almohadilla de GOX-alginato como se ha descrito anteriormente, la coloración continuará fuertemente, como se ha visto en el Ejemplo 2 anteriormente. Después de 30 minutos, la intensidad de color se ha vuelto un azul subido, indicando formación continua del producto. Esto demuestra que se producen las dos especies oxidativas y yodo, las cuales ayudan en la actividad anti-microbiana del vendaje
compuesto.

Se realizó trabajo adicional usando concentraciones relativamente altas de geles de goma de xantano.

Preparación de geles de goma de xantano/alginato que contienen enzima

Se prepararon una serie de soluciones de goma de xantano (Keltrol) a diferentes concentraciones (5%, 10% y 20% en peso) disolviendo cantidades apropiadas de Keltrol en agua destilada/desionizada a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC). Se prepararon también una serie de soluciones de ácido algínico (Manucol DM (Manucol DM es una Marca Comercial) de CP Kelco) a diferentes concentraciones (2% y 4% en peso) disolviendo cantidades apropiadas de Manucol DM en agua destilada/desionizada a una temperatura elevada apropiada. Se enfriaron las soluciones de ácido algínico resultantes.

Se prepararon una serie de geles de goma de xantano/alginato que incluían los dos materiales en diferentes proporciones mezclando las soluciones en cantidades apropiadas hasta que se obtuvo una mezcla homogénea. Por ejemplo, se prepararon geles que contenían una proporción de peso de goma de xantano con alginato de 5:1 (por ejemplo mezclando cantidades iguales de soluciones al 5% y al 1% o al 10% y al 2%), 5:2, 10:1, etc, según se requería.

Se prepararon geles que contenían la enzima mediante la adición de la cantidad apropiada de glucosa oxidasa (GOX) o lactoperoxidasa (LPO) a las muestras de gel. La solución de enzimas puede añadirse a una solución de goma de xantano o de alginato antes de mezclar, o a una solución de goma de xantano/alginato después de mezclar. Los experimentos se realizaron usando LPO de Sigma (número de catálogo L2005) disuelta en agua pura a una cantidad de 1 \mug/ml y GOX de Boehringer Mannheim (número de catálogo 105147) disuelta en agua pura a una cantidad de 10 \mug/ml.

Construcción de almohadillas reticuladas de goma de xantano/gel de alginato apoyadas en una gasa de algodón

Se preparó una mezcla de gel de goma de xantano al 10% y ácido algínico al 2%, mezclando volúmenes iguales de solución madre de goma de xantano al 20% y solución de ácido algínico al 4%, preparadas como se ha descrito anteriormente. Se añadieron LPO y GOX a muestras diferentes de esta mezcla de gel para producir un gel que contenía LPO y un gel que contenía GOX. Los niveles de enzima pueden modificarse de acuerdo con el nivel requerido de actividad. En este caso, los niveles de enzima usados fueron de 100 \mug/ml para LPO y 50 \mug/ml para GOX.

Se alisaron aproximadamente 5 ml de gel que contenía LPO sobre una tira de gasa de algodón de aproximadamente 40 mm x 50 mm. Se situó una segunda capa de gasa de tamaño similar sobre el gel de LPO con una ligera presión para asegurar una distribución uniforme del gel. Se dispensaron después aproximadamente 5 ml de gel que contenía GOX sobre la superficie superior de la segunda capa de gasa de algodón, con una tercera capa de gasa de tamaño similar aplicada sobre el gel que contenía GOX, de nuevo con una ligera presión para asegurar una distribución uniforme del gel que contenía GOX. Esto produjo una almohadilla o una placa de construcción intercalada que comprendía tres láminas de gasa de algodón separadas respectivamente, por una capa de gel que contenía LPO y una capa de gel que contenía GOX.

Las almohadillas resultantes se situaron en un baño de solución de cloruro cálcico (al 10% p/v) durante 10 minutos. Las almohadillas se retiraron del baño y se lavaron para retirar el cloruro cálcico residual mediante dos lavados de 10 minutos en agua destilada/desionizada. El exceso de agua se retiró secando las almohadillas durante varios minutos en un tejido absorbente.

Demostración de la actividad de la almohadilla del gel de goma de xantano/alginato reticulada Ejemplo 4

Se usó la reacción del complejo almidón/yodo para visualizar la producción enzimática de especies oxidativas reactivas (ROS) del interior de la almohadilla de gel de alginato/goma de xantano reticulada, preparada como se ha descrito anteriormente. En presencia de ROS, el yoduro se oxida para producir yodo elemental, que forma complejos con almidón para producir un cromógeno de azul intenso.

Los experimentos se realizaron usando una placa de agar al 1% p/v que incluía almidón soluble al 1% (ARCOS número de catálogo 177132500) y yoduro potásico 10 mM. Se situó una rebanada de la almohadilla de goma de xantano/alginato como se ha descrito anteriormente (aproximadamente 20 mm x 10 mm x 4 mm) sobre la placa de almidón/yoduro, con la capa de GOX en la parte superior. Sobre esta se situó una almohadilla de gel que comprendía glucosa al 40% en agar al 1% para iniciar la reacción. Después de aproximadamente 30 minutos, la almohadilla inferior se había vuelto amarilla, indicando claramente la producción de yodo elemental (el yodo está presente debido a la difusión de la bandeja al gel). Después de aproximadamente 1 hora, era visible una mancha azul debajo de la almohadilla, indicando la presencia de ROS dentro de la placa de almidón/yoduro. 24 horas después del inicio, una gran área de la placa se había vuelto azul, indicando la producción continuada de ROS.

Ejemplo 5

Se realizaron dos experimentos similares usando una disposición generalmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4 pero con la almohadilla de glucosa a continuación de la almohadilla de alginato/goma de xantano reticulada. Se realizaron dos experimentos, con las almohadillas de gel de alginato/goma de xantano en diferentes orientaciones, en un caso con la capa de GOX en la parte superior, y en otro caso con la capa de LPO en la parte superior.

Con la almohadilla posicionada con la capa de GOX en la parte inferior, próxima a la almohadilla de glucosa, después de aproximadamente 1 hora, pudo observarse una mancha azul debajo de la almohadilla. Con el otro experimento, con la capa de LPO en la parte inferior, cerca de la capa de glucosa, después de 2 horas, pudo observarse una mancha azul debajo de la almohadilla. Esto demuestra que incluso con una disposición que usa una almohadilla con enzimas en una secuencia que no es la óptima puede producirse ROS en cantidad suficiente para producir un efecto oxidativo en la placa indicadora.

En los dos experimentos, la coloración amarilla se observó en ambos geles, en las capas de LPO, demostrando la presencia de producción de yodo. Después de 24 horas, en los dos casos, la mayor parte de la placa de almidón/yoduro se había vuelto azul, demostrando de nuevo la producción de ROS.

Demostración de la absorbencia de humedad de un gel de goma de xantano

Se preparó una preparación de Keltrol al 10% en peso en agua como se ha descrito anteriormente. Se añadieron 1,06 g del gel al 10% a 10,22 g de agua destilada/desionizada, se mantuvo a 21ºC y se cerró herméticamente para minimizar los efectos de evaporación. Se retiró el agua por decantación y se pesó para evaluar el grado de absorbencia.

Después de 15 minutos quedaban 8,34 g de agua; después de 45 minutos, quedaban 7,56 g; después de 2 horas, quedaban 6,51 g; después de 18 horas, quedaban 2,1 g.

Este experimento demuestra que el gel Keltrol al 10% es capaz de absorber al menos 8 veces su peso en agua.

Demostración de la absorbencia de humedad de una mezcla de gel de goma de xantano/alginato reticulada

Se preparó una mezcla de Keltrol al 5% en peso y ácido algínico al 1% en peso como se ha descrito anteriormente. Se vertieron dos capas de gel entre dos capas de gasa de algodón para producir una almohadilla que estaba reticulada usando una solución de cloruro cálcico al 10% y se lavaron dos veces durante 10 minutos en agua, como se ha descrito anteriormente. La almohadilla se secó usando un papel de tejido absorbente.

Se pesó un pedazo de la almohadilla de 10 mm x 10 mm x 3 mm para establecer el peso inicial (0,28 g). Se añadió a la almohadilla 1 ml de agua. La almohadilla se retiró y se pesó después varias veces para evaluar el aumento de peso (debido a la absorción de agua). Después de 1 hora, el peso de la almohadilla era 0,37 g; después de 2 horas 0,44 g; después de 3 horas 0,49 g y después de 6 horas 0,5 g.

Este experimento demuestra que el gel de goma de xantano/alginato reticulado aún es capaz de absorber agua. En comparación con el Ejemplo anterior que usaba Keltrol al 10%, el uso de un porcentaje inferior de Keltrol y de alginato reticulado da como resultado una menor capacidad de absorción de agua.

Los geles de goma de xantano/alginato reticulados preparados como se ha descrito anteriormente se usaron en la producción de un vendaje para heridas de acuerdo con la invención, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Dichos geles se usaron junto con un sobrecito que contenía glucosa/yoduro preparado como se ha escrito anteriormente. En particular, la glucosa se disolvió en una solución acuosa 5 mM de yoduro potásico a la cantidad de 12,5 g por 100 ml. La solución se situó en una bolsa de diálisis (situada previamente en agua hirviendo durante 10 minutos y aclarada minuciosamente) con un área accesible de aproximadamente 40 x 120 mm y se cerró herméticamente.

Los componentes se ensamblaron para formar un vendaje de la construcción mostrada en la Figura 1. El vendaje es una construcción en capas que comprende una capa o revestimiento externo 10 en forma de una tirita autoadhesiva permeable al oxígeno, adecuada para adherirse a la piel 12 de un sujeto para cubrir una herida. El revestimiento 10 encierra una capa superior que comprende una almohadilla de gel de goma de xantano/alginato reticulado que contiene glucosa oxidasa, preparado como se ha descrito anteriormente; una capa intermedia que comprende una solución de glucosa y yoduro potásico en un sobrecito semipermeable 18, preparado como se ha descrito anteriormente; y una capa inferior que comprende una placa de gel de goma de xantano/alginato reticulado que comprende lactoperoxidasa, preparado como se ha descrito anteriormente. Por debajo de la almohadilla 20 hay una lámina 22 de gasa, para entrar en contacto con la herida 14.

El vendaje se suministra inicialmente como un sistema de partes múltiples, con los componentes individuales envasados por separado en envases cerrados herméticamente, estériles respectivos. Cuando se requiere su uso, los componentes del vendaje se retiran de los envases y se aplican a una herida de forma apropiada para producir el vendaje final como se muestra.

La Figura 5 ilustra esquemáticamente una realización adicional de un vendaje de acuerdo con la invención. Se prefiere actualmente esta forma de vendaje. El vendaje tiene unas dimensiones principales de 100 mm x 100 mm, en forma de un cuadrado.

El vendaje ilustrado comprende una placa de hidrogel hidratado y suave 50 constituida de poliAMPS (como se describe en el documento WO 01/96422) suministrado por First Water Ltd). El hidrogel contiene hasta un 23% de glucosa (que actúa como un sustrato para la enzima oxidorreductasa) y sales de yoduro, por ejemplo yoduro potásico al 1,6% p/v (que son un precursor de yodo). El hidrogel puede contener también hasta un 20% p/v de glicerol (que actúa como humectante y humidificante). La placa de hidrogel 50 forma la capa inferior del vendaje.

El vendaje comprende también una capa superior constituida por una gasa tejida de celulosa 52 a la que se une de forma irreversible (covalentemente) la glucosa oxidasa y la lactoperoxidasa. La gasa 52 se prepara de la siguiente forma.

La gasa se corta en una forma y tamaño adecuados (un cuadrado de 100 mm x 100 mm) y se lava en agua para retirar cualquier soluto o partícula. Se retira el exceso de fluido. La gasa se empapa después en una solución de metaperyodato sódico 10 mM durante 60 minutos a 25ºC. Después de esta etapa de oxidación, cuando se han formado grupos aldehído reactivos, la gasa se lava exhaustivamente en agua para retirar el peryodato. Después de la etapa de lavado, la gasa se empapa en una solución de glucosa oxidasa (Biocatalysts - Código G638P), a 100 \mug de polvo por ml de hidrogenocarbonato sódico 50 mM a pH 9,0. Esto es equivalente a 7000 U/ml. Se incorpora también lactoperoxidasa (DMV International) a 100 \mul de polvo por ml de hidrogenocarbonato sódico 50 mM a pH 9,0. Estas dosis pueden reducirse, puesto que representan una cantidad excesiva de actividad. Se deja reaccionar a la gasa con la solución de enzimas durante 4 horas a aproximadamente 20ºC, después de las que la gasa se retira y se lava exhaustivamente entre una solución de baja fuerza iónica (agua desionizada) y un tampón de alta fuerza iónica (NaH_{2}CO_{3} 50 mM, pH 9,0 + NaCl 1 M) para retirar la enzima de unión débil. La gasa se reviste después con un conservante, por ejemplo PVA al 5%, sacarosa al 10% o gelatina al 2%, y se seca a temperatura ambiente (aproximadamente 21ºC) o, preferiblemente, a 40ºC.

Las capas inferior y superior se ensamblan entre si en una atmósfera de nitrógeno (para evitar la reacción prematura), y se envasan juntas cerrándolas herméticamente en una bolsa o recinto impermeable al oxígeno, por ejemplo bolsas hechas de papel de aluminio laminado como las suministradas por Sigma (código Z184407). La interacción de la glucosa en el gel con la glucosa oxidasa inmovilizada se limita por la tasa a la que la glucosa puede difundir dentro de la capa de la enzima inmovilizada. Este retraso es suficiente para permitir que las dos capas se ensamblen entre sí en presencia de oxígeno, y después se coloquen en un envase sin oxígeno, antes de que pueda tener lugar cualquier reacción importante. Una vez que se excluye el oxígeno del producto ensamblado, la reacción se detiene de todos modos, y solamente puede retomarse cuando el suministro de oxígeno se renueva (por ejemplo cuando el producto se retira del envase para uso sobre una herida). Esta privación de oxígeno dentro del envase evita que la glucosa se use en una producción de peróxido prematura. Las enzimas, aunque inicialmente en forma seca en la gasa en ensamblaje, se vuelven hidratadas con agua del hidrogel 52 y se mantienen en estado hidratado mediante agua de la placa de hidrogel 52 mientras estén cerradas herméticamente en la bolsa o recinto antes del
uso.

En uso, el vendaje se retira de la bolsa o recinto y se coloca sobre la piel de un paciente sobre el sitio de una herida, mostrado esquemáticamente en 54, con la capa inferior de hidrogel 50 en contacto con la piel. Un revestimiento permeable al oxígeno y permeable a la humedad 56 (que puede o no formar parte del vendaje), se sitúa sobre la parte superior 52 y se adhiere a la piel alrededor del sitio de la herida por medio de un adhesivo adecuado proporcionado en la parte inferior de la capa superpuesta 56. De esta manera, el vendaje se mantiene en posición sobre la piel, cubriendo el sitio de la herida.

La glucosa oxidasa en la capa superior (que está en estado hidratado) cataliza la reacción de la glucosa en la capa inferior con el oxígeno que pasa a través de la capa superpuesta 56 de los alrededores, produciendo peróxido de hidrógeno como se ha descrito anteriormente. El peróxido de hidrógeno tiene los mismos efectos anti-microbianos beneficiosos, como se ha descrito anteriormente. El peróxido de hidrógeno también experimenta una reacción adicional catalizada por la lactoperoxidasa para producir diversas especies con propiedades anti-microbianas, como se ha descrito anteriormente. Además, las sales de yoduro en la capa inferior reaccionan para producir yodo elemental y posiblemente también ácido hipoyodoso, un potente agente anti-microbiano más, como se ha descrito anteriormente. El vendaje por tanto tiene varios mecanismos muy eficaces para la producción in situ de agentes anti-microbianos que pueden ser muy eficaces promoviendo la curación de las heridas.

Además, el hidrogel de la capa inferior es altamente absorbente de fluidos, permitiendo la captación de altos volúmenes de exudaciones de la herida. El fluido exudado de la herida, incluyendo las bacterias potencialmente perjudiciales, pueden absorberse de este modo dentro del vendaje y pueden eliminarse por las especies anti-microbianas generadas en su interior. El vendaje puede ser de este modo auto-esterilizante. El hidrogel es también capaz de donar fluido, allá donde la herida lo requiera, permitiendo por tanto que el sitio de la herida se mantenga húmedo en todo momento ayudando al proceso curativo.

En una modificación de la Figura 5 descrita anteriormente, no está presente lactoperoxidasa. En este caso, aunque el peróxido de hidrógeno producido por la reacción catalizada por la glucosa oxidasa no experimenta la reacción catalizada por lactoperoxidasa, no obstante cantidades útiles del peróxido de hidrógeno experimentan de forma espontánea una reacción no catalizada con los iones de yoduro para generar yodo molecular, y se obtienen de igual manera efectos anti-microbianos valiosos.

La Figura 6 ilustra esquemáticamente una realización adicional de vendaje de acuerdo con la invención. Esta forma de vendaje es la más preferida actualmente. El vendaje tiene dimensiones principales de 100 mm x 100 mm en forma de cuadrado.

El vendaje para heridas antibacteriano y anti-fúngico ilustrado comprende una placa 60 de hidrogel que contiene glucosa como la capa inferior del vendaje. Vertida sobre la superficie superior de la placa 60 hay una película 62 de PVA (poli-alcohol vinílico) que incorpora la glucosa oxidasa.

La capa inferior de hidrogel 60 se formuló para incluir los siguientes reactivos en peso: AMPS de sodio al 20% (ácido 2-acrilamido-2-metilpropanosulfónico), sal sódica (Lubrizol, código 2405)), glucosa al 20% (Fisher, calidad analítica), glicerol al 10% (Fisher, calidad analítica), agua desionizada al 50%, diacrilato de polietilenglicol 400 al 0,1% (UCB Chemicals) y fotoiniciador al 0,1% (1-hidroxiciclohexilfenil cetona (Aldrich)). La mezcla se dispensó en bandejas de vertido hasta una profundidad de 2-3 mm. El hidrogel se filtró después, mediante irradiación en una lámpara de ultravioleta, durante hasta 60 segundos y a una tasa de energía de aproximadamente 100 mW/cm^{2}. Se permitió después al hidrogel enfriar a 30ºC o por debajo.

La película de PVA 62 que contenía la enzima, se preparó disolviendo PVA de alto peso molecular (124.000 - 186.000 de pm, Aldrich) en agua calentando la mezcla. El PVA se incorporó hasta una concentración final del 6% p/v. Una vez disuelta, la solución se permitió enfriar a 30º o por debajo, antes de añadir la enzima (glucosa oxidasa (GOX, Biocatalysts G638P)), a una concentración de 100 \mug/\mul (polvo secado por congelación por volumen). Se añadieron después 50 a 100 \mul de la mezcla PVA/GOX a una superficie de 20 mm^{2} del hidrogel enfriado, y se permitió la fijación. Se formó una fina película después de aproximadamente 30 minutos. Para evitar la activación enzimática, la adición de la solución de PVA/GOX al hidrogel de glucosa puede realizarse en una atmósfera sin oxígeno (por ejemplo en nitrógeno). Cuando la capa 62 entra en contacto con el hidrogel 60, la mayor parte del agua de la película se arrastra dentro del hidrogel, dejando el PVA como una membrana húmeda que contiene la enzima en estado hidratado. En la película permanece agua suficiente para que el PVA se hidrate y permanezca flexible.

El vendaje resultante se almacena en una bolsa impermeable al oxígeno por ejemplo, hecha de bolsas de papel de aluminio laminado como las suministradas por Sigma (código Z183407), La interacción de la glucosa en el gel con la glucosa oxidasa inmovilizada se limita mediante la tasa a la que la glucosa puede difundir de la capa de enzima inmovilizada. Este retraso es suficiente para permitir que las dos capas se ensamblen juntas en presencia de oxígeno y después se sitúen en el envase sin oxígeno, antes de que pueda tener lugar cualquier reacción importante. Una vez que el oxígeno se excluye del producto ensamblado, la reacción se detiene de todos modos, y solamente puede retomarse cuando el suministro de oxígeno se renueva (por ejemplo cuando el producto se retira del envase para uso sobre una herida). Esta privación de oxígeno dentro del envase evita que la glucosa se use en la producción prematura de peróxido. Esta enzima se mantiene en estado hidratado mientras esté cerrada herméticamente en la bolsa o recinto antes del uso.

En uso, el vendaje se retira de la bolsa o recinto y se sitúa sobre la piel de un paciente sobre el sitio de una herida, mostrado esquemáticamente en 64, con la capa de hidrogel inferior 60 en contacto con la piel. Un recubrimiento o capa superpuesta 66 permeable al oxígeno y permeable a la humedad (que puede o no formar parte del vendaje) se coloca sobre la película 62 y se adhiere a la piel alrededor del sitio de la herida por medio de un adhesivo adecuado proporcionado en la cara inferior de la capa superpuesta 66. De esta manera, el vendaje se mantiene en posición sobre la piel, cubriendo el sitio de la herida.

La glucosa oxidasa en la película 62 (que está en estado hidratado) cataliza la reacción de la glucosa en la capa inferior con el oxígeno que pasa a través de la capa superpuesta 66 de los alrededores, produciendo peróxido de hidrógeno como se ha descrito anteriormente. El peróxido de hidrógeno tiene efectos anti-microbianos beneficiosos, como se ha descrito anteriormente, y el oxígeno liberado cuando se descompone por la catalasa endógena ayuda al procedimiento curativo apoyando el metabolismo celular, potenciando la hidroxilación de aminoácidos e inhibiendo el crecimiento de bacterias anaeróbicas.

Para demostrar la generación de especies oxidativas, se usó una placa indicadora constituida por almidón al 1% (Aldrich), yoduro potásico 100 mM (Fisher) y agar al 1% (Sigma). El vendaje que comprendía hidrogel 60 con una película de PVA/GOX 62 se situó sobre la placa indicadora, al aire, con el GOX activándose de este modo a través del oxígeno disponible. El peróxido de hidrógeno se produce en cantidad suficiente para ser capaz de difundir a través del hidrogel y alcanzar la placa indicadora debajo. El poder oxidativo del peróxido de hidrógeno oxida después el yoduro a yodo, que forma complejos con el almidón para formar un complejo de color azul oscuro intenso. Retirando el vendaje de hidrogel activado y situándolo en una nueva placa indicadora a intervalos de 24 horas, se puede demostrar la liberación sostenida de peróxido de hidrógeno durante un periodo de al menos 5 días.

Además, para demostrar adicionalmente la estabilidad de la enzima GOX en la película de PVA, el film se retiró de un hidrogel después de 4 días de uso, y se colocó en un hidrogel fresco de glucosa de 20 mm^{2}, y se colocó sobre una placa indicadora. Después de 24 horas, el complejo de color azul intenso de almidón/yoduro fue claramente visible, indicando que la actividad enzimática aún estaba presente en la película de PVA.

Para demostrar la actividad de GOX localizada en un hidrogel sin glucosa, se produjo una película de PVA/GOX como se ha descrito anteriormente. El hidrogel se situó sobre un lecho de gasa de algodón saturada con PBS (solución salina tamponada con fosfato), y se dejó hinchar lentamente durante 24 horas. El hidrogel se cortó entonces en dos rebanadas, a través del plano horizontal, y se bañó en una solución de almidón al 1% + yoduro potásico 100 mM + glucosa al 1% p/v + EDTA 5 mM + lactoperoxidasa 50 \mug/ml. Muy rápidamente, se puede localizar la presencia de GOX, mediante la detección de peróxido de hidrógeno. La actividad de GOX se localiza claramente en la película de PVA y la superficie de contacto del hidrogel donde se vertió la película de PVA. Por debajo de esto, no hubo generación de color, mostrando que GOX no es móvil en el hidrogel AMPS, incluso en un estado hinchado.

La placa de hidrogel 60 es altamente absorbente de fluidos, y por tanto tiene las propiedades y beneficios descritos anteriormente en conexión con la realización de la Figura 5.

Claims

1. Un vendaje cutáneo cerrado herméticamente en un envase, donde el vendaje comprende enzima oxidorreductasa en estado hidratado.

2. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 1, donde la enzima oxidorreductasa comprende glucosa oxidasa.

3. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el vendaje comprende además una enzima peroxidasa presente en estado hidratado.

4. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 3, donde la enzima peroxidasa comprende lactoperoxidasa.

5. Un vendaje con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el vendaje incluye uno o más hidrogeles hidratados.

6. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 5, donde el gel comprende un material polimérico hidrófilo.

7. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, donde la enzima o enzimas están presentes en uno o más hidrogeles hidratados.

8. Un vendaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enzima o enzimas se sitúan sobre un soporte inerte.

9. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 8, donde el soporte inerte comprende una gasa tejida de algodón o celulosa a la que se unen la enzima o enzimas de forma irreversible.

10. Un vendaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el vendaje es de construcción en capas.

11. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 10, donde el vendaje comprende una capa superior, alejada de la piel en uso, que incluye la enzima oxidorreductasa.

12. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 11, donde el vendaje comprende una capa inferior, por debajo de la capa inferior en uso, que incluye una fuente de sustrato para la enzima oxidorreductasa.

13. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 12, donde la capa inferior incluye además un suministro de iones yoduro.

14. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende una capa inferior en forma de un gel hidratado y una capa superior en forma de un soporte inerte que lleva enzima oxidorreductasa y, opcionalmente, enzima peroxidasa.

15. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 11, donde el hidrogel contiene una fuente de sustrato para la enzima oxidorreductasa.

16. Un vendaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye una capa de material barrera en el interfaz con la piel en uso.

17. Un vendaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye una fuente de sustrato para la enzima oxidorreductasa.

18. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 17, donde el sustrato se sitúa en un hidrogel hidratado.

19. Un vendaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye además un suministro de yoduro.

20. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 19, donde el suministro de yoduro se sitúa en un hidrogel hidratado.

21. Un vendaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye un revestimiento o capa externa para adherir el vendaje a la piel de un sujeto ser humano o animal.

22. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 21, donde el revestimiento incluye una ventana en o a través de la que, puedan observarse medios indicadores que indican cuando está activa la química del vendaje.

23. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, donde la enzima catalasa inmovilizada se proporciona en la superficie interna del revestimiento.

24. Un vendaje de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en forma de un sistema de partes múltiples, con diferentes elementos envasados por separado.

25. Un vendaje de acuerdo con la reivindicación 24, donde la enzima oxidorreductasa y una fuente de sustrato para la enzima oxidorreductasa están en envases separados.