ES2252023T3

ES2252023T3 - Conservacion de un sustituto de la sangre de hemoglobina con una sobreenvoltura transparente.

Info

Publication number: ES2252023T3
Application number: ES00945285T
Authority: ES
Inventors: Maria S. Gawryl; Robert A. Houtchens; William R. Light
Original assignee: Biopure Corp
Current assignee: Biopure Corp
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: EP1196128B1; HK1043302B; CN1256076C; EP1196128A1; DE60023700D1; US7041799B1; US6610832B1; JP2003506113A; NZ516471A; WO2001001921A1; DE60023700T2; CA2374033A1; AU761834C; AU761834B2; US20060160724A1; CN1861036A; ATE308295T1; HK1043302A1; AU5925400A; CN1367676A

Abstract

Un método para conservar un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada, que comprende mantener un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada que está contenido en un envase primario; el método se caracteriza por una sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno que incluye un material laminado transparente y un material laminado de hoja metálica que juntos forman una cámara, donde el material laminado transparente incluye una capa de óxido de silicio y donde el envase primario y el sustituto de la sangre contenido en el mismo, se sellan dentro de la cámara entre el material laminado de hoja metálica y el material laminado transparente de la sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno.

Description

Conservación de un sustituto de la sangre de hemoglobina con una sobreenvoltura transparente.

Antecedentes de la invención

Existe la necesidad de sustitutos de la sangre para tratar o prevenir la hipoxia que resulta de la pérdida de sangre (por ejemplo, debida a una hemorragia aguda o durante las operaciones quirúrgicas), que resulta de la anemia (por ejemplo, anemia perniciosa o anemia drepanocítica), o que resulta de un shock (por ejemplo, shock hipovolémico, shock anafiláctico, shock séptico o shock alérgico).

El uso de sangre y fracciones sanguíneas en estas situaciones como un sustituto de la sangre, está lleno de desventajas. Por ejemplo, el uso de sangre entera a menudo va acompañado del riesgo de transmisión de virus que producen hepatitis y de virus que producen SIDA, que pueden complicar la recuperación del paciente o producir la muerte del paciente. Adicionalmente, el uso de sangre entera requiere la determinación del grupo sanguíneo y pruebas cruzadas para evitar problemas inmunohematológicos e incompatibilidades con el donante.

La hemoglobina humana, como un sustituto de la sangre, tiene actividad osmótica y la capacidad de transportar y transferir oxígeno, pero tiene la desventaja de una rápida eliminación de la circulación por la vía renal y a través de las paredes vasculares, dando como resultado una semivida muy corta y por tanto, una semivida típicamente insatisfactoria. Además, la hemoglobina humana está también frecuentemente contaminada con niveles tóxicos de endotoxinas, bacterias y/o virus.

La hemoglobina no humana adolece de las mismas deficiencias que la hemoglobina humana. Además, la hemoglobina de fuentes no humanas está también típicamente contaminada con proteínas, tales como anticuerpos, que podrían causar una respuesta del sistema inmunitario del receptor.

Previamente, se han utilizado al menos otros cuatro tipos de sustitutos de la sangre, incluyendo perfluorocompuestos químicos, análogos de hemoglobina sintetizados, hemoglobina encapsulada en liposomas, y hemoglobina modificada químicamente. Sin embargo, muchos de estos sustitutos de la sangre tienen típicamente tiempos de retención intravasculares cortos, siendo eliminados por el sistema circulatorio como sustancias extrañas o alojados en el hígado, bazo, y otros tejidos. También, muchos de estos sustitutos de la sangre han sido biológicamente incompatibles con los sistemas vivos.

Por tanto, a pesar de los recientes avances en la preparación de sustitutos de la sangre basados en hemoglobina, permanece la necesidad de un sustituto de la sangre que tenga niveles de contaminantes, tales como endotoxinas, bacterias, virus, fosfolípidos y proteínas no hemoglobínicas, que sean suficientemente bajos para evitar de forma general una respuesta del sistema inmunitario y los efectos toxicológicos que resultan de una perfusión del sustituto de la sangre. Además, el sustituto de la sangre debe ser capaz también de transportar y transferir cantidades adecuadas de oxígeno a los tejidos en condiciones ambientales y debe tener un tiempo de retención intravascular
bueno.

Además, es preferible que el sustituto de la sangre 1) tenga una actividad oncótica generalmente equivalente a la de la sangre entera, 2) pueda ser transfundido a la mayoría de los receptores sin pruebas cruzadas ni ensayos de sensibilidad, y 3) se pueda conservar con cantidades mínimas de refrigeración durante largos periodos.

El sustituto de la sangre se empaqueta habitualmente en una sobreenvoltura de laminado de hoja metálica que tiene altas propiedades de barrera para el O_{2} y la humedad. Los laminados de hoja metálica son típicamente opacos, de modo que no permiten la inspección visual del producto ni la inspección de la integridad del envase primario. Además, una sobreenvoltura opaca requiere el uso de una segunda etiqueta sobre la parte exterior de la envoltura.

El documento US-A-5.691.452 describe un método para conservar un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada y un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado, como se reivindica en el preámbulo de las reivindicaciones 1 y 2, respectivamente. La presente invención se caracteriza por las particularidades de las porciones que caracterizan estas reivindicaciones.

En el pasado, los laminados que contienen silicio transparente con altas propiedades de barrera para el oxígeno y la humedad no han sido útiles en el equipo de empaquetado automático debido a que la fuerza que se ejerce sobre el material hacía que éste se rompiera o perdiera de otra forma sus propiedades de barrera.

La presente invención se refiere a un método para conservar un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada. El método comprende mantener un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada empaquetado, en un envase con sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno en el que el envase comprende un material laminado de hoja metálica y un material laminado transparente. En una realización, la sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno tiene una permeabilidad al oxígeno menor que aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 645 centímetros cuadrados, a lo largo de 24 horas a una atmósfera y a temperatura ambiente. La temperatura ambiente se define como aproximadamente 23ºC. Al menos una cara de la sobreenvoltura comprende un material laminado transparente y al menos otra cara de la sobreenvoltura comprende un material laminado de hoja metálica. La sobreenvoltura forma al menos una cámara. El sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada empaquetado se coloca en las cámaras de dicha hoja metálica. El material laminado transparente se puede sellar entonces por calor al laminado de hoja metálica que comprende las cámaras que contienen el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada empaquetado, conteniendo de este modo el sustituto de la sangre empaquetado dentro de la sobreenvoltura.

La presente invención se refiere también en general a un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado. El sustituto de la sangre conservado de la presente invención comprende un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada empaquetado y un envase con sobreenvoltura de película-barrera del oxígeno. En una realización, la sobreenvoltura de película-barrera del oxígeno del sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado, comprende un material laminado transparente que tiene una permeabilidad al oxígeno menor que aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 645 centímetros cuadrados, a lo largo de 24 horas a una atmósfera y a temperatura ambiente. El sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada empaquetado se sella dentro de dicha sobreenvoltura de película-barrera del oxígeno, conservando de este modo el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada en un ambiente que está sustancialmente libre de oxígeno. Al menos una cara u hoja de la sobreenvoltura comprende un material laminado transparente y al menos otra cara de la sobreenvoltura comprende un material laminado de hoja metálica. La sobreenvoltura se produce moldeando el material laminado de hoja metálica para definir al menos una cámara. El sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada empaquetado se coloca entonces en las cámaras de dicha hoja metálica. El material laminado transparente se sella entonces por calor al laminado de hoja metálica que contiene dicho sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada, formando el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado, de la presente invención.

En una realización de la presente invención, el material laminado transparente se usa en combinación con el material laminado de hoja metálica en la operación de empaquetado automático. En una realización, se ha utilizado una máquina de empaquetado automático fabricada por Tiromat (Avon, MA).

Las ventajas de esta invención son numerosas. Una ventaja es la de que la hemoglobina almacenada según los métodos de esta invención tiene un mayor grado de pureza y una semivida más larga. Las sobreenvolturas de alta barrera, proporcionan un nivel adicional de calidad del producto incluso cuando se emplea un empaquetado primario de barrera alta. Además, las sobreenvolturas transparentes de barrera alta de la presente invención proporcionan propiedades de barrera de oxígeno y de vapor de agua extremadamente altas pero no tienen capa de Saran [poli(cloruro de vinilideno), PVDC]. El PVDC tiene un problema médico de residuos porque durante la incineración se generan productos clorados tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos y ácido clorhídrico. Las sobreenvolturas que comprenden al menos una cara, región o lado transparente, según la presente invención, permiten que se pueda ver la etiqueta del empaquetado primario. Por tanto, habitualmente no se requiere una segunda etiqueta en la sobreenvoltura. En adición, se pueden evaluar también la inspección de calidad del producto y la integridad del envase primario. Además, como se demuestra por primera vez aquí, se puede utilizar un equipo automatizado con los laminados de barrera de oxígeno transparentes, permitiendo la producción de grandes cantidades de envases con altas propiedades de barrera de oxígeno en un periodo de tiempo corto con muy poca mano de obra y sin la pérdida de las propiedades de barrera. El sustituto de la sangre permanece estable a temperatura ambiente durante periodos de dos años o más, una mejora importante con relación a los métodos anteriores.

Descripción detallada de la invención

Las características y otros detalles del procedimiento de la invención serán descritos ahora de forma más particular y serán expuestos en las reivindicaciones. Se debe entender que las realizaciones preferidas de la invención se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características básicas de esta invención se pueden emplear en diferentes realizaciones sin separarse del alcance de la presente invención.

La invención se refiere en un aspecto, a un método para preservar la estabilidad de un sustituto de la sangre de hemoglobina que comprende mantener el sustituto de la sangre de hemoglobina en una atmósfera sustancialmente libre de oxígeno. Este método puede llevarse a cabo manteniendo el sustituto de la sangre en un recipiente impermeable al oxígeno, tal como un envase primario de barrera del oxígeno, una sobreenvoltura de película-barrera del oxígeno (por ejemplo, una bolsa), un recipiente de vidrio (por ejemplo, un vial) o un recipiente de acero. Cuando el envase primario es una película-barrera del oxígeno, el recipiente puede ser fabricado a partir de una variedad de materiales, incluyendo películas poliméricas (por ejemplo, un poliéster esencialmente impermeable al oxígeno, alcohol etilen-vinílico (EVOH), o nilón), y sus laminados. Cuando el recipiente es una sobreenvoltura de barrera del oxígeno, el recipiente puede ser fabricado a partir de una variedad de materiales, incluyendo películas poliméricas (por ejemplo, un poliéster esencialmente impermeable al oxígeno, alcohol etilen-vinílico (EVOH), o nilón), y laminados, tales como un laminado transparente (por ejemplo, óxido de silicio o laminado que contiene EVOH) o un laminado de hoja metálica (por ejemplo, un laminado de hoja de plata o aluminio) o una combinación de laminado transparente y laminado de hoja metálica.

Cuando la sobreenvoltura es una película, tal como una película de poliéster, la película se puede volver esencialmente impermeable al oxígeno mediante una variedad de métodos adecuados. En una realización, la película que se fabrica es esencialmente impermeable al oxígeno. Alternativamente, cuando el material polimérico no es suficientemente impermeable al oxígeno para cumplir las especificaciones deseadas, se puede laminar la película o tratar de otro modo para reducir o eliminar la permeabilidad al oxígeno.

Se emplea un laminado transparente para al menos una cara de la sobreenvoltura. Al menos una capa del laminado transparente comprende dióxido de silicio. La capa de barrera del oxígeno preferiblemente tiene un espesor entre aproximadamente 100 y aproximadamente 2000 \ring{A}. Tanto para el envase primario como para la sobreenvoltura, el laminado contiene típicamente una o más capas poliméricas. El polímero puede ser una variedad de materiales poliméricos que incluyen, por ejemplo, una capa de poliéster (por ejemplo un poliéster de 48 galgas), nilón o una capa de poliolefina, tal como polietileno, acetato de etilen-vinilo, o polipropileno o sus copolímeros.

Las sobreenvolturas de la presente invención pueden ser de una variedad de formas, incluyendo viales, cilindros, cajas, etc. En una realización preferida, el recipiente tiene la forma de una bolsa. Una bolsa adecuada se puede formar uniendo de forma continua una o más (por ejemplo, dos) hojas en su perímetro para formar una construcción herméticamente cerrada, impermeable al oxígeno que tiene un centro que se puede llenar. La forma de la bolsa puede ser una de las que se encuentran rutinariamente en la técnica. En el caso de los laminados que comprenden poliolefinas, tales como polietileno o polipropileno lineales de baja densidad, media o alta densidad y sus copolímeros, el perímetro de la bolsa se enlaza o se sella usando calor. Los expertos en la técnica pueden determinar la temperatura apropiada para generar una construcción herméticamente cerrada, impermeable al oxígeno y/o a la humedad.

La presente invención se refiere a un método para conservar un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada y a los sustitutos de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservados. El método de la presente invención comprende mantener el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada en una sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno, en la que al menos una cara de la sobreenvoltura comprende un material laminado transparente y en la que al menos otra cara de la sobreenvoltura comprende un material laminado de hoja metálica. En una realización de la presente invención, la sobreenvoltura se produce formando al menos una cámara en el material laminado de hoja metálica y poniendo el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada en dichas cámaras, donde la hemoglobina está contenida dentro de un envase primario. El material laminado transparente se sella entonces por calor sobre el material laminado de hoja metálica que contiene las cámaras y dicho sustituto de la sangre de hemoglobina. En una realización de la presente invención, el material laminado transparente comprende una película de poliéster recubierta con óxido de silicio. En otra realización de la presente invención, el sustituto de la sangre de hemoglobina se mantiene en atmósfera de nitrógeno, argón o helio.

El sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado, de la presente invención, comprende un sustituto de hemoglobina desoxigenada y un empaquetado de una sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno en la que al menos una cara de la sobreenvoltura comprende un material laminado transparente y en la que al menos otra cara de la sobreenvoltura comprende un material laminado de hoja metálica. En una realización de la presente invención, el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado, comprende un material laminado transparente que comprende una película de poliéster recubierta con óxido de silicio. En otra realización, el sustituto de la sangre conservado, se mantiene en atmósfera de nitrógeno, argón o helio. En otra realización más de la presente invención, la sobreenvoltura del sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado, se produce formando al menos una cámara en el material laminado de hoja metálica. El sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada se pone en las cámaras de dicha hoja metálica en la que el sustituto de hemoglobina desoxigenada está contenido en un envase primario. El material laminado transparente se sella entonces por calor con el material laminado de hoja metálica que tiene las cámaras y que contiene dicho sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada.

Los recipientes tienen preferiblemente una permeabilidad al oxígeno menor que aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 645 centímetros cuadrados, a lo largo de 24 horas, a una atmósfera y a temperatura ambiente, preferiblemente menor que aproximadamente 0,001 centímetros cúbicos por 6,45 centímetros cuadrados, en estas condiciones. En una realización, los recipientes incluyen, por ejemplo, recipientes de plástico con una sobreenvoltura, tal como un material de alta barrera construido a partir de un laminado de poliéster (PET)/óxido de silicio (SiO_{2})/polietileno. En una realización, la capa de óxido de silicio tiene un espesor de aproximadamente 100-2000 \ring{A}. La capa de polietileno tiene un espesor de aproximadamente 0,013 a aproximadamente 0,254 milímetros, preferiblemente de aproximadamente 0,0508 milímetros. En una realización, la permeabilidad al oxígeno es menor que aproximadamente 0,005 centímetros cúbicos por 645 centímetros cuadrados, por atmósfera, por día (25ºC y 100%/50% interior/exterior de humedad relativa (RH)), y la transmisión de vapor de agua es aproximadamente 0,18 mg por 645 centímetros cuadrados por atm-día (25ºC y 100%/50% RH).

Estas bolsas de plástico sobreenvueltas con una película compuesta polimérica se sellan utilizando un aparato de sellado Tiromat (Avon, Massachusetts). En una realización, la hoja del fondo de la sobreenvoltura es una hoja metálica y se forma de tal modo que al menos se hace una forma de concavidad o cámara en el laminado de hoja metálica. El sustituto de la sangre de hemoglobina, en un envase primario se coloca entonces sobre la hoja metálica, con la etiqueta mirando hacia arriba, en las cámaras. La hoja metálica y el sustituto de la sangre de hemoglobina en un envase primario, se purgan entonces con nitrógeno y se hace el vacío. Entonces el laminado transparente se sella con calor a la capa de laminado de hoja metálica del fondo.

En una realización preferida, el sustituto de la sangre se empaqueta en una atmósfera que está sustancialmente libre de oxigeno. Los ejemplos de atmósferas adecuadas incluyen nitrógeno, argón y helio.

Como se define aquí, un sustituto de la sangre es una composición portadora de oxígeno basada en hemoglobina para uso en los seres humanos, mamíferos y otros vertebrados, que es capaz de transportar y transferir oxígeno a los órganos y tejidos vitales, como mínimo, y que puede mantener una presión oncótica intravascular suficiente. Un vertebrado es como se define clásicamente, incluyendo los seres humanos, o cualquier otro animal vertebrado, que utiliza la sangre en un sistema circulatorio para transferir oxígeno a los tejidos. Adicionalmente, la definición de sistema circulatorio es como se define clásicamente, y consiste en el corazón, las arterias, las venas y la microcirculación que incluye estructuras vasculares más pequeñas tales como los capilares.

Un sustituto de la sangre de la invención tiene preferiblemente niveles de endotoxinas, fosfolípidos, proteínas extrañas y otros contaminantes que no producirán una respuesta significativa del sistema inmunitario y que no son tóxicos para el receptor. Preferiblemente, un sustituto de la sangre es ultrapuro. Ultrapuro, como se define aquí, significa que contiene menos de 0,5 EU/ml de endotoxina, menos de 3,3 nmoles/ml de fosfolípidos y niveles bajos o no detectables de proteínas no hemoglobínicas, tales como seroalbúmina o anticuerpos.

El término "endotoxina" se refiere a los lipopolisacáridos unidos a las células, producidos como una parte de la capa exterior de las paredes celulares de bacterias gram-negativas, que son tóxicos en muchas condiciones. Cuando se inyectan a los animales, las endotoxinas pueden causar fiebre, diarrea, shock hemorrágico, y otros daños tisulares. La unidad de endotoxina (EU) ha sido definida por la Convención de la Farmacopea de Estados Unidos de 1983, página 3014, como la actividad contenida en 0,1 nanogramos del estándar de referencia de Estados Unidos lote EC-5. Un vial de EC-5 contiene 10.000 EU. Los ejemplos de medios adecuados para determinar las concentraciones de endotoxina en un sustituto de la sangre incluyen el método "Metodología cinética/turbidimétrica de Lisado de Limulus Amebocítico (LAL) 5000" desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachussetts.

La hemoglobina polimerizada estable, como se define aquí, es una composición portadora de oxígeno basada en hemoglobina que no aumenta ni disminuye sustancialmente la distribución del peso molecular ni el contenido de metahemoglobina durante los periodos de almacenaje a temperaturas adecuadas de almacenaje durante periodos de dos años o más, y preferiblemente durante periodos de dos años o más, cuando se mantiene en un ambiente bajo en oxígeno. Las temperaturas de almacenaje adecuadas para almacenaje de un año o más están entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 40ºC. El intervalo preferido de temperatura de almacenaje está entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 25ºC.

Un ambiente bajo en oxígeno adecuado, o un ambiente que está sustancialmente libre de oxígeno, se define como la cantidad acumulativa de oxígeno en contacto con el sustituto de la sangre, a lo largo de un periodo de almacenaje de al menos dos meses aproximadamente, preferiblemente al menos aproximadamente un año, o más preferiblemente al menos aproximadamente dos años, lo que producirá una concentración de metahemoglobina menor que aproximadamente 15% en peso del sustituto de la sangre. La cantidad acumulativa de oxígeno incluye la infiltración de oxígeno al empaquetado del sustituto de la sangre y el contenido de oxígeno original del sustituto de la sangre y del empaquetado.

A lo largo de este método, desde la recogida de los glóbulos rojos (RBC) hasta la polimerización de la hemoglobina, la solución de sangre, los RBC y la hemoglobina, se mantienen en condiciones suficientes para minimizar el crecimiento microbiano, o la carga microbiana (bioburden), tales como manteniendo la temperatura por debajo de aproximadamente 20ºC y por encima de 0ºC. Preferiblemente, la temperatura se mantiene a una temperatura de aproximadamente 15ºC o inferior. Más preferiblemente, la temperatura se mantiene a 10 \pm 2ºC.

En este método, para producir un producto estéril, se sanitizan de forma suficiente las porciones de los componentes del proceso para preparar un sustituto de la sangre de hemoglobina polimerizada estable. Estéril es como se define en la técnica, específicamente, que la solución cumple los requerimientos de la Farmacopea de los Estados Unidos para esterilidad que se dan en la USP XXII, Section 71, páginas 1483-1488. Además, las porciones de los componentes que están expuestas al desarrollo del proceso, usualmente están fabricadas o revestidas con un material que no reacciona ni contamina el desarrollo del proceso. Tales materiales pueden incluir acero inoxidable y otras aleaciones de acero, tal como Inconel.

Las fuentes adecuadas de los RBC incluyen sangre humana, sangre bovina, sangre ovina, sangre porcina, sangre de otros vertebrados y hemoglobina producida transgénicamente, tal como la Hb transgénica descrita en BIO/
TECHNOLOGY, 12: 55-59 (1994).

La sangre se puede recoger de donantes vivos o recientemente sacrificados. Un método para recoger la sangre entera bovina está descrito en las patentes de Estados Unidos números 5.084.558 y 5.296.465, emitidas para Rausch et al. Es preferible que la sangre sea recogida en condiciones higiénicas.

Inmediatamente o casi inmediatamente después de la recogida, se mezcla la sangre con al menos un anticoagulante para evitar una coagulación significativa de la sangre. Los anticoagulantes adecuados para la sangre son como se conocen clásicamente en la técnica e incluyen, por ejemplo, citrato de sodio, ácido etilendiaminotetraacético y heparina. Cuando se mezcla con la sangre, el anticoagulante puede estar en una forma sólida, tal como un polvo, o en una solución acuosa.

Se entiende que la fuente de la solución de sangre, puede ser una muestra recientemente recogida o una muestra vieja, tal como una muestra de sangre humana caducada procedente de un banco de sangre. Además, la solución de sangre puede haberse mantenido previamente congelada y/o en estado líquido. Es preferible que para uso en este método, la solución de sangre no haya sido previamente congelada.

En otra realización, antes de exponer la solución de sangre a los anticoagulantes, se analizan en la solución de sangre los niveles de antibióticos, tales como penicilina. Los niveles de antibióticos se determinan para proporcionar un grado de seguridad de que la muestra de sangre no está contaminada con un organismo infeccioso mediante la verificación de que el donante de la muestra de sangre no estaba siendo tratado con un antibiótico. Los ejemplos de ensayos adecuados para los antibióticos incluyen un kit para ensayo de la penicilina (Difco, Detroit, MI) que emplea un método titulado "Detección rápida de penicilina en la leche". Es preferible que las soluciones de sangre contengan un nivel de penicilina inferior o igual a aproximadamente 0,008 unidades/ml. Alternativamente, se puede utilizar un programa de gestión asociado para verificar la carencia de una enfermedad o tratamiento con antibióticos en el ganado.

Preferiblemente, la solución de la sangre se filtra antes o durante la etapa de anticoagulación, por ejemplo filtrando para separar los agregados y partículas grandes. Un tamiz de 600 mallas es un ejemplo de un filtro adecuado.

Los RBC de la solución de la sangre se lavan entonces por medios adecuados, tales como por diafiltración, o por una combinación de etapas discretas de dilución y concentración con al menos una solución, tal como una solución isotónica, para separar los RBC de las proteínas plasmáticas extracelulares, tales como seroalbúminas o anticuerpos (por ejemplo, inmunoglobulinas (IgG)). Se entiende que los RBC se pueden lavar en lotes o en un modo de alimentación continua.

Las soluciones isotónicas adecuadas son tal como se las conoce en la técnica e incluyen soluciones, tal como una solución citrato/salina, que tienen un pH y osmolaridad que no rompe las membranas celulares de los RBC y que desplaza la porción plasmática de la sangre entera. Una solución isotónica preferida tiene un pH neutro y una osmolaridad entre aproximadamente 285-315 mOsm. En una realización preferida, la solución isotónica se compone de una solución acuosa de citrato de sodio dihidratado (6,0 g/l) y de cloruro de sodio (8,0 g/l).

El agua que se puede usar en el método de la invención incluye agua destilada, agua desionizada, agua para inyección (WFI) y/o agua baja en pirógenos (LPW). El agua para inyección, que se prefiere, es agua desionizada o destilada que cumple las especificaciones de la Farmacopea de Estados Unidos para el agua para inyección. El agua para inyección, está descrita también en Pharmaceutical Engineering 11, 15-23 (1991). El agua baja en pirógenos, que se prefiere, es agua desionizada que contiene menos de 0,002 EU/ml.

Es preferible que la solución isotónica sea filtrada antes de ser añadida a la solución de la sangre. Los ejemplos de filtros adecuados incluyen una membrana de ultrafiltración de 10.000 dalton de Millipore, tal como un filtro Millipore Cat # CDUF G1 o fibra hueca de A/G Technology, de 10.000 dalton (Cat # UFP-10-C-85).

En una realización preferida, los RBC de la solución de la sangre se lavan por diafiltración. Los diafiltros adecuados incluyen membranas microporosas con tamaños de poro que separarán los RBC de los componentes de la solución de la sangre sustancialmente más pequeños, tales como un filtro de 0,1 \mum a 0,5 \mum (por ejemplo, un filtro de fibra hueca de 0,2 \mum, cartucho de microfiltración Microgon Krosflo II). Concurrentemente, se añade de forma continua (o en lotes) una solución isotónica filtrada como composición aparte, a un ritmo igual al ritmo (o volumen) de pérdida del filtrado a través del diafiltro. Durante el lavado de los RBC, los componentes de la solución de la sangre que son significativamente más pequeños en diámetro que los RBC, o que son fluidos tal como el plasma, pasan a través de las paredes del diafiltro al filtrado. Los RBC, las plaquetas y los cuerpos más grandes de la solución de la sangre diluida, tales como los glóbulos blancos, se retienen y se mezclan con la solución isotónica, que se añade de forma continua o en lotes para formar una solución de sangre dializada.

En una realización más preferida, el volumen de la solución de sangre en el tanque de diafiltración se diluye inicialmente por la adición de un volumen de una solución isotónica filtrada al tanque de diafiltración. Preferiblemente, el volumen de la solución isotónica añadido es aproximadamente igual al volumen inicial de la solución de la sangre.

En una realización alternativa, los RBC se lavan a través de una serie de etapas secuenciales (o secuenciales inversas) de dilución y concentración, en las que la solución de sangre se diluye al añadir al menos una solución isotónica, y se concentra haciendo fluir a través de un filtro, formando de este modo una solución de sangre dializada.

El lavado de los RBC se completa cuando el nivel de las proteínas plasmáticas que contaminan los RBC ha sido reducido sustancialmente (típicamente al menos aproximadamente 90%). Típicamente, el lavado de los RBC se completa cuando el volumen de filtrado drenado desde el diafiltro 34 es igual aproximadamente al 300% o más del volumen de la solución de sangre contenida en el tanque de diafiltración antes de diluir la solución de sangre con la solución isotónica filtrada. Un lavado adicional de los RBC puede separar además las proteínas plasmáticas extracelulares de los RBC. Por ejemplo, la diafiltración con 6 volúmenes de solución isotónica puede separar al menos aproximadamente 99% de IgG de la solución de la sangre.

La solución de sangre dializada se expone después a medios para separar los RBC en la solución de sangre dializada de los glóbulos blancos y las plaquetas, tal como por centrifugación.

Se entiende que se pueden emplear otros medios generalmente conocidos en la técnica para separar los RBC de otros componentes de la sangre. Por ejemplo, la sedimentación, en la que el método de separación no rompe las membranas celulares de una cantidad importante de los RBC, tal como menos de aproximadamente el 30% de los RBC, antes de la separación de los RBC de los otros componentes de la sangre.

Después de la separación de los RBC, los RBC se lisan por medios para lisar los RBC para liberar la hemoglobina de los RBC para formar una solución que contiene hemoglobina. Los medios de lisis pueden usar diferentes métodos de lisis, tales como lisis mecánica, lisis química, lisis hipotónica u otros métodos de lisis conocidos que liberan la hemoglobina sin dañar de forma significativa la capacidad de la Hb para transportar y liberar oxígeno.

En otra realización más, la hemoglobina producida recombinantemente, tal como la hemoglobina producida recombinantemente descrita en Nature, 356: 258-260 (1992) puede ser procesada por el método de la invención en lugar de los RBC. Las células bacterianas que contienen la hemoglobina se lavan y se separan de los contaminantes como se ha descrito antes. Estas células bacterianas se rompen entonces mecánicamente por medios conocidos en la técnica, tales como un molino de bolas, para liberar la hemoglobina de las células y formar una fase celular lisada. Esta fase celular lisada es procesada después como la fase de los RBC lisados.

A continuación de la lisis, la fase de los RBC lisados es ultrafiltrada después para separar los residuos celulares más grandes, tales como las proteínas con un peso molecular por encima de aproximadamente 100.000 dalton. Generalmente, los residuos celulares incluyen todos los componentes celulares enteros y fragmentados con la excepción de Hb, proteínas celulares más pequeñas, electrólitos, coenzimas e intermedios metabólicos orgánicos. Los ultrafiltros aceptables incluyen, por ejemplo, filtros de 100.000 dalton fabricados por Millipore (Cat # CDUF 050 E1) y fabricados por A/G Technology (Needharn, MA; modelo Nº UFP100E55).

Es preferible que la ultrafiltración continúe hasta que la concentración de Hb en la fase de los RBC lisados sea menor que 8 gramos/litro (g/l) para maximizar el rendimiento de hemoglobina disponible para polimerización. Se pueden emplear otros métodos para separar la Hb de la fase de los RBC lisados, incluyendo sedimentación, centrifugación o microfiltración. El ultrafiltrado de Hb, se puede ultrafiltrar después para separar los residuos celulares más pequeños, tales como electrólitos, coenzimas, intermedios metabólicos y proteínas menores que aproximadamente 30.000 dalton de peso molecular, y agua del ultrafiltrado de Hb. Los ultrafiltros adecuados incluyen un ultrafiltro de 30.000 dalton (Millipore Cat # CDUF 050 T1 y/o Amicon, # 540 430).

La solución de Hb concentrada se puede añadir entonces a una o más columnas cromatográficas paralelas para separar adicionalmente la hemoglobina por cromatografía de líquidos de alta resolución de otros contaminantes tales como anticuerpos, endotoxinas, fosfolípidos y enzimas y virus. Los ejemplos de medios adecuados incluyen medios de intercambio aniónico, medios de intercambio catiónico, medios de interacción hidrófoba y medios de afinidad. En una realización preferida, las columnas cromatográficas contienen un medio de intercambio aniónico adecuado para separar la Hb de las proteínas no hemoglobínicas. Los medios de intercambio aniónico adecuados incluyen, por ejemplo, sílice, alúmina, gel de óxido de titanio, dextrano reticulado, agarosa o un resto derivatizado, tal como una poliacrilamida, un metacrilato de polihidroxietilo o un estireno-divinilbenceno, que sido derivatizado con una función química catiónica, tal como dietilaminoetilo o un grupo de aminoetilo cuaternario. Un medio de intercambio aniónico adecuado y los correspondientes eluyentes para la absorción y desorción selectiva de Hb en comparación con otras proteínas y contaminantes, que están probablemente en una fase de RBC lisados, se pueden determinar fácilmente por un experto en la técnica.

En una realización más preferida, se usa un método para formar un medio de intercambio aniónico a partir de gel de sílice, que se trata hidrotérmicamente para aumentar el tamaño del poro, se expone a \gamma-glicidoxi-propilsilano para formar grupos epóxidos activos y después se expone a C_{3}H_{7}(CH_{3})NCl para formar un medio de intercambio aniónico con amonio cuaternario. Este método está descrito en el Journal of Chromatography, 120: 321-333 (1976), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Las columnas cromatográficas en primer lugar son pre-tratadas haciendo fluir por ellas un primer eluyente que facilita la unión de la Hb. Entonces se inyecta al medio de las columnas la solución de Hb concentrada. Después de inyectar la solución de Hb concentrada, se lavan sucesivamente las columnas cromatográficas con diferentes eluyentes para producir un eluato de Hb separado, purificado.

En una realización preferida, se utiliza un gradiente de pH en las columnas cromatográficas para separar de la Hb los contaminantes proteínicos, tales como la enzima anhidrasa carbónica, fosfolípidos, anticuerpos y endotoxinas. Cada uno de una serie de tampones que tienen diferentes valores de pH, se añaden secuencialmente para crear un gradiente de pH dentro del medio en la columna cromatográfica. Es preferible que los tampones sean filtrados, por ejemplo con una membrana de despirogenación de 10.000 dalton. Los tampones usados para separar la Hb deben tener una fuerza iónica baja de modo que la elución de la Hb y los contaminantes no hemoglobínicos es generalmente dependiente del pH y no significativamente dependiente de la fuerza iónica. Típicamente, los tampones con una concentración iónica de aproximadamente 50 mM, o menos, tienen fuerzas iónicas bajas adecuadas.

El primer tampón transporta la solución de Hb concentrada al medio en las columnas cromatográficas y facilita la unión de la Hb al medio. El segundo tampón ajusta entonces el pH dentro de las columnas para eluir los componentes no hemoglobínicos contaminantes mientras que se mantiene la Hb unida al medio. Con el tercer tampón se eluye entonces la Hb. Se recoge entonces el eluato de Hb. Es preferible que el eluato de Hb se pase a través de un filtro estéril. Los filtros estériles adecuados incluyen filtros de 0,22 \mum, tales como un filtro Sartorius Sartobran Cat # 5232507.

\newpage

En una realización preferida, el primer 3% a 4% del eluato de Hb y el último 3% a 4% del eluato de Hb son desechados directamente para asegurar la pureza del eluato de Hb.

Cuando se tienen que reutilizar las columnas cromatográficas, las proteínas no hemoglobínicas contaminantes y las endotoxinas, que permanecen en las columnas, se eluyen entonces con un cuarto tampón.

El uso de gradientes de pH para separar la Hb de los contaminantes no hemoglobínicos está descrito además en la patente de Estados Unidos 5.691.452, presentada el 7 de junio de 1995, que se incorpora aquí como referencia.

En una realización preferida, el primer tampón es una solución de tris-hidroximetil-aminometano (Tris) (concentración aproximadamente 20 mM; pH de aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4). El segundo tampón es una mezcla del primer tampón y un tercer tampón, teniendo el segundo tampón un pH de aproximadamente 8,2 a aproximadamente 8,6. El tercer tampón es una solución Tris (concentración aproximadamente 50 mM; pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5). El cuarto tampón es una solución NaCl/Tris (concentraciones aproximadamente 1,0 M para NaCl y aproximadamente 20 mM para Tris; pH de aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4, preferiblemente aproximadamente 8,9-9,1). Es especialmente preferido que el pH del segundo tampón esté entre aproximadamente 8,2 y aproximadamente 8,4.

Típicamente, los tampones usados están a una temperatura entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 50ºC. Preferiblemente, la temperatura del tampón es aproximadamente 12,4 \pm 1,0ºC durante el uso. Además los tampones se almacenan típicamente a una temperatura de aproximadamente 9ºC a aproximadamente 11ºC.

El eluato de Hb se desoxigena entonces preferiblemente antes de la polimerización para formar una solución de Hb desoxigenada (de aquí en adelante desoxi-Hb) por medios que sustancialmente desoxigenan la Hb sin reducir significativamente la capacidad de la Hb en el eluato de Hb para transportar y liberar oxígeno, tal como podría ocurrir por la desnaturalización de la formación de hemoglobina oxidada (metHb).

En una realización, el eluato de Hb se desoxigena por intercambio gaseoso de un gas inerte a través de una membrana de fase. Tales gases inertes incluyen, por ejemplo, nitrógeno, argón y helio. Por supuesto que otros medios para desoxigenar una solución de hemoglobina, que son conocidos en la técnica, se pueden usar para desoxigenar el eluato de Hb. Dichos otros medios pueden incluir, por ejemplo, rociado con nitrógeno del eluato de Hb, captación química con agentes reductores tales como N-acetil-L-cisteína (NAC), cisteína, ditionito o ascorbato de sodio, o fotolisis por la luz.

Después de la elución de la columna cromatográfica, el eluato de Hb se concentra preferiblemente para mejorar la eficiencia del proceso. El eluato de Hb se recircula a través de un ultrafiltro para concentrar el eluato de Hb para formar una solución de Hb concentrada. Los ultrafiltros adecuados incluyen por ejemplo, ultrafiltros de 30.000 dalton o menos (por ejemplo, Millipore Helicon, Cat # CDUF050G1 o Amicon Cat # 540430). Típicamente, la concentración del eluato de Hb se completa cuando la concentración de Hb está entre aproximadamente 100 y aproximadamente 120 g/l. Mientras se realiza la concentración del eluato de Hb, la temperatura del eluato de Hb, se mantiene preferiblemente a aproximadamente 8-12ºC.

Entonces se añade el tampón a la solución de Hb, que está preferiblemente concentrada, para ajustar la fuerza iónica de la solución de Hb para mejorar la desoxigenación de la Hb. Es preferible que la fuerza iónica se ajuste entre aproximadamente 150 meq/l y aproximadamente 200 meq/l para reducir la afinidad por el oxígeno de la Hb en la solución de Hb. Los tampones adecuados incluyen tampones con un pH que no producirá una desnaturalización significativa de la proteína Hb pero tendrá una fuerza iónica suficientemente alta para favorecer la desoxigenación de la Hb. Los ejemplos de tampones adecuados incluyen soluciones salinas con un intervalo de pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,9. Un tampón preferido es una solución acuosa de NaCl 1,0 M, Tris 20 mM con un pH de aproximadamente 8,9.

Preferiblemente, la solución de Hb tamponada resultante, se recircula entonces a través del ultrafiltro, para concentrar de nuevo la solución de Hb para mejorar la eficiencia del proceso. En una realización preferida, la concentración es completa cuando la concentración de Hb es de aproximadamente 100 g/l a aproximadamente 120 g/l.

Durante la desoxigenación, se circula la solución de Hb a través de una membrana de transferencia de fase adecuada. Las membranas de transferencia de fase apropiadas incluyen, por ejemplo, un microfiltro de fibra hueca de polipropileno de 0,05 \mum (por ejemplo, Hoechst-Celanese Cat # 5PCM-107). Concurrentemente, se pasa un contraflujo de un gas inerte a través de la membrana de transferencia de fase. Los gases inertes adecuados incluyen, por ejemplo, nitrógeno, argón y helio. El intercambio de gas se hace a través de la membrana de transferencia de fase, con lo que se elimina el oxígeno de la solución de Hb.

La desoxigenación continúa hasta que la pO_{2} de la solución de Hb se reduce hasta un nivel en el que el contenido de Hb oxigenada (oxihemoglobina o HbO_{2}) en la solución de Hb es aproximadamente 20% o menos. En una realización preferida, el contenido de HbO_{2} en la solución de Hb es aproximadamente 10% o menos.

Durante la desoxigenación, la temperatura de la solución de Hb se mantiene típicamente a un nivel que equilibrará el ritmo de desoxigenación frente al ritmo de formación de metahemoglobina. La temperatura se mantiene para limitar el contenido de metahemoglobina a menos del 20%. Una temperatura óptima dará como resultado menos de aproximadamente 5% de contenido de metahemoglobina, y preferiblemente menos de aproximadamente 2,5% de contenido de metahemoglobina, mientras continúa la desoxigenación de la solución de Hb. Típicamente, durante la desoxigenación, la temperatura de la solución de Hb se mantiene entre aproximadamente 19ºC y aproximadamente 31ºC. Durante la desoxigenación, y posteriormente a lo largo de las restantes etapas del método de la invención, la Hb se mantiene en un ambiente bajo en oxígeno para minimizar la absorción de oxígeno por la Hb y para mantener el contenido de HbO_{2} menor que aproximadamente 20%, preferiblemente menor que aproximadamente 10%.

La Hb desoxigenada se equilibra entonces preferiblemente con un tampón de almacenaje de bajo contenido en oxígeno, que contiene un compuesto de sulfhidrilo, para formar una desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Los compuestos de sulfhidrilo adecuados incluyen agentes reductores no tóxicos, tales como N-acetil-L-cisteína (NAC), D,L-cisteína, \gamma-glutamil-cisteína, glutatión, 2,3-dimercapto-1-propanol, 1,4-butanoditiol, tioglicolato, y otros compuestos de sulfhidrilo biológicamente compatibles. El contenido de oxígeno de un tampón de almacenaje de bajo contenido en oxígeno debe ser lo suficientemente bajo para no reducir significativamente la concentración de compuesto de sulfhidrilo en el tampón y para limitar el contenido de oxihemoglobina en la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación hasta aproximadamente 20% o menos, preferiblemente menos de aproximadamente 10%. Típicamente, el tampón de almacenaje tiene una pO_{2} menor que aproximadamente 6,67 kPa.

En una realización preferida, el tampón de almacenaje debe tener un pH adecuado para equilibrar la polimerización de Hb y la formación de metahemoglobina, típicamente entre aproximadamente 7,6 y aproximadamente 7,9.

La cantidad de un compuesto de sulfhidrilo mezclado con la desoxi-Hb es una cantidad suficientemente alta para aumentar la reticulación intramolecular de la Hb durante la polimerización y suficientemente baja para no disminuir significativamente la reticulación intermolecular de las moléculas de Hb, debida a una alta fuerza iónica. Típicamente, se necesita aproximadamente un mol de grupos funcionales sulfhidrilo (-SH) para estabilizar la oxidación de entre aproximadamente 0,25 moles a aproximadamente 5 moles de desoxi-Hb.

En una realización preferida, el tampón de almacenaje contiene tampón de fosfato de sodio aproximadamente 25-35 mM (pH 7,7-7,8) y contiene una cantidad tal de NAC que la concentración de NAC en la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación está entre aproximadamente 0,003% y aproximadamente 0,3%, en peso. Más preferiblemente, la concentración de NAC en la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación está entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,2%, en peso.

Preferiblemente, el tampón de almacenaje se filtra antes de mezclarlo con la desoxi-Hb, por ejemplo a través de una membrana de ultrafiltración de 10.000 dalton (Millipore Helicon Cat # CDUF050G1 o A/G Technology Maxcell Cat # UFP-10-C-75).

En una realización, la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación pasa entonces a través de un filtro opcional. Los filtros adecuados incluyen un prefiltro de polipropileno de 0,2 \mum y un microfiltro estéril de 0,5 \mum (Pall Profile II, Cat # ABIY00527 o Gelman Supor). La desoxi-Hb se mantiene en una atmósfera sustancialmente libre de oxígeno. Esto se puede conseguir, por ejemplo, purgando y blanqueando el aparato del proceso con un gas inerte, tal como nitrógeno, antes y después de llenar con la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación.

Opcionalmente, antes de transferir la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación a la polimerización, se añade al reactor de polimerización, una cantidad apropiada de agua. En una realización una cantidad apropiada de agua es aquella cantidad que daría como resultado una solución con una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 gramos de Hb por litro, cuando se añade al reactor de polimerización la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Preferiblemente, el agua ha sido agotada de oxígeno.

Una vez que la pO_{2} del agua en la etapa de polimerización se reduce hasta un nivel suficiente para limitar el contenido de HbO_{2} a aproximadamente 20%, típicamente menos de aproximadamente 6,67 kPa, se blanquea el reactor de polimerización con un gas inerte, tal como nitrógeno. La desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación se transfiere entonces al reactor de polimerización, que se blanquea de forma concurrente con un caudal apropiado de un gas inerte.

La temperatura de la solución de desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación en el reactor de polimerización se eleva hasta una temperatura que optimiza la polimerización de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación cuando se pone en contacto con un agente reticulante. Típicamente, la temperatura de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación es de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 45ºC, y preferiblemente de aproximadamente 41ºC a aproximadamente 43ºC a lo largo de la polimerización. Un ejemplo de un medio de intercambio de calor aceptable para calentar el reactor de polimerización es un sistema de calentamiento con camisa que se calienta introduciendo etilenglicol caliente a través de la camisa.

La desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación se expone entonces a un agente reticulante adecuado a una temperatura suficiente para polimerizar la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación para formar una solución de hemoglobina polimerizada (poli(Hb)) a lo largo de un periodo de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 6 horas.

Los ejemplos de agentes reticulantes adecuados incluyen agentes polifuncionales que reticularán las proteínas de Hb, tales como glutaraldehído, succindialdehído, formas activadas de polioxietileno y dextrano, \alpha-hidroxi-aldehídos, tales como glicolaldehído, éster N-maleimido-6-aminocaproil-(2'-nitro,4'-ácido sulfónico)-fenílico, éster de ácido m-maleimidobenzoico y N-hidroxisuccinimida, 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo, (4-yodoacetil)aminobenzoato de sulfosuccinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo, hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, N,N''-fenilen-dimaleimida, y los compuestos que pertenecen a la clase de bis-imidato, la clase de acil-diazida o la clase de dihaluro de arilo, entre otros.

Una cantidad adecuada de un agente reticulante es aquella cantidad que permitirá la reticulación intramolecular para estabilizar la Hb y también la reticulación intermolecular para formar polímeros de Hb, para aumentar de este modo la retención intravascular. Típicamente, una cantidad adecuada de un agente reticulante es aquella cantidad en la que la relación molar del agente reticulante a la Hb está por encima de aproximadamente 2:1. Preferiblemente, la relación molar del agente reticulante a la Hb está entre aproximadamente 20:1 a 40:1.

Preferiblemente, la polimerización se realiza en un tampón con un pH entre aproximadamente 7,6 a aproximadamente 7,9, que tiene una concentración de cloruro menor o igual a aproximadamente 35 mmolar.

En una realización preferida, una cantidad adecuada del agente reticulante se añade a la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y después se mezcla por medios de mezclado con bajo cizallamiento. Un medio de mezclado con bajo cizallamiento adecuado incluye un mezclador estático. Un mezclador estático adecuado es, por ejemplo, un mezclador estático "Kenics" obtenido de Chemineer, Inc.

En una realización, la recirculación de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y del agente reticulante a través del mezclador estático produce condiciones de caudal turbulento generalmente con mezcla uniforme del agente reticulante con la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación, reduciendo de este modo el potencial para formar bolsas de desoxi-Hb que contienen altas concentraciones del agente reticulante. En general, la mezcla uniforme del agente reticulante y la desoxi-Hb reduce la formación de polímeros de Hb de alto peso molecular, esto es, polímeros que pesan más de 500.000 dalton, y permite también un mezclado más rápido del agente reticulante y la desoxi-Hb durante la polimerización. Además, se producirá una reticulación intramolecular de la Hb significativa durante la polimerización de Hb debido a la presencia de un compuesto de sulfhidrilo, preferiblemente NAC. Aunque no se conoce el mecanismo exacto de la interacción del compuesto de sulfhidrilo con el glutaraldehído y/o la Hb, se supone que el compuesto de sulfhidrilo afecta a la unión química de la Hb y el agente reticulante de una manera que inhibe parcialmente al menos la formación de los polímeros de Hb de alto peso molecular y preferiblemente forma la Hb tetramérica estabilizada.

La poli(Hb) se define como poseedora de una reticulación intramolecular significativa si una porción sustancial (por ejemplo, al menos aproximadamente 50%) de las moléculas de Hb están químicamente unidas en la poli(Hb), y sólo una pequeña cantidad, tal como menos que aproximadamente 15% están contenidas dentro de las cadenas de hemoglobina polimerizada de alto peso molecular. Las moléculas de poli(Hb) de alto peso molecular son moléculas, por ejemplo, con un peso molecular superior a aproximadamente 500.000 dalton.

En una realización preferida, se usa glutaraldehído como el agente reticulante. Típicamente, se usan de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 gramos de glutaraldehído por kilogramo de desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Más preferiblemente, se añade glutaraldehído a lo largo de un periodo de cinco horas hasta que se añadan aproximadamente 29-31 gramos de glutaraldehído por cada kilogramo de desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación.

Después de la polimerización, la temperatura de la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización se reduce típicamente a aproximadamente 15ºC a aproximadamente 25ºC.

Cuando el agente reticulante usado no es un aldehído, la poli(Hb) formada es generalmente una poli(Hb) estable. Cuando el agente reticulante usado es un aldehído, la poli(Hb) formada generalmente no es estable hasta que se mezcla con un agente reductor adecuado para reducir los enlaces menos estables de la poli(Hb) para formar enlaces más estables. Los ejemplos de agentes reductores adecuados incluyen borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, ditionato de sodio, trimetilamina, t-butilamina, morfolin-borano y piridin-borano. Antes de añadir el agente reductor, la solución de poli(Hb) se concentra opcionalmente por ultrafiltración hasta que la concentración de la solución de poli(Hb) aumenta hasta un resultado entre aproximadamente 75 y aproximadamente 85 g/l. Un ejemplo de un ultrafiltro adecuado es un filtro de 30.000 dalton (por ejemplo, Millipore Helicon Cat # CDUF050LT y Amicon Cat # 540430).

El pH de la solución de poli(Hb) se ajusta entonces al intervalo de pH alcalino para preservar al agente reductor y para evitar la formación de gas hidrógeno, que puede desnaturalizar a la Hb durante la reducción subsiguiente. En una realización, el pH se ajusta por encima de 10. El pH se puede ajustar añadiendo una solución tampón a la solución de poli(Hb) durante la polimerización o después de ella. La poli(Hb) se purifica típicamente para separar la hemoglobina no polimerizada. Esto se puede conseguir por diafiltración o por cromatografía con hidroxiapatito (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.691.453, que se incorpora aquí como referencia).

Después del ajuste del pH, se añade al menos un agente reductor, preferiblemente una solución de borohidruro de sodio, a la etapa de polimerización, típicamente a través del bucle de desoxigenación. Típicamente, se añaden de aproximadamente 5 a aproximadamente 18 moles de agente reductor por mol de tetrámero de Hb (por 64.000 dalton de Hb) dentro de la poli(Hb). En una realización preferida, para cada nueve litros de solución de poli(Hb) en el subsistema de
polimerización 98, se añade un litro de solución de borohidruro de sodio 0,25 M a una velocidad de 0,1 a 0,132 lpm.

El pH y los electrólitos de la poli(Hb) estable se puede restablecer entonces hasta niveles fisiológicos para formar un sustituto de la sangre de hemoglobina polimerizada estable, mediante la diafiltración de la poli(Hb) estable con una solución de diafiltración que tiene un pH adecuado y niveles de electrólitos fisiológicos. Preferiblemente, la solución de diafiltración es una solución tampón.

Cuando la poli(Hb) se reduce por un agente reductor, la solución de diafiltración tiene un pH ácido, preferiblemente entre aproximadamente 4 a aproximadamente 6.

Se puede añadir también un compuesto de sulfhidrilo no tóxico a la solución de poli(Hb) estable como un captador de oxígeno para mejorar la estabilidad del sustituto de la sangre de hemoglobina polimerizada final. El compuesto de sulfhidrilo se puede añadir como parte de la solución de diafiltración y/o se puede añadir por separado. Se añade una cantidad de compuesto de sulfhidrilo que establezca una concentración de sulfhidrilo que pueda captar oxígeno para mantener el contenido de metahemoglobina menor que aproximadamente 15% a lo largo del periodo de almacenaje. Preferiblemente, el compuesto de sulfhidrilo es NAC. Típicamente, la cantidad de compuesto de sulfhidrilo añadida es una cantidad suficiente para establecer una concentración de sulfhidrilo entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,2%, en peso.

En una realización preferida, el sustituto de la sangre se empaqueta en condiciones de manipulación asépticas mientras que se mantiene la presión con una atmósfera inerte sustancialmente libre de oxígeno, en el reactor de polimerización y el resto del equipo de transporte.

Las especificaciones para un sustituto de la sangre adecuado de hemoglobina polimerizada estable formado por el método de la invención se proporcionan en la Tabla I.

TABLA I

Parámetro	Resultados
PH (18-22ºC)	Fisiológicamente aceptable
Endotoxina	Fisiológicamente aceptable
Ensayo de esterilidad	Cumple el ensayo
Fosfolípidos^{a}	Fisiológicamente aceptable
Hemoglobina total	10-250 g/l
Metahemoglobina	< 15%
Oxihemoglobina	< 10%
Sodio, Na^{+}	Fisiológicamente aceptable
Potasio, K^{+}
Cloruro, Cl^{-}
Calcio, Ca^{++}
Boro
Glutaraldehído	Fisiológicamente aceptable
N-acetil-L-cisteína	Fisiológicamente aceptable
Peso molecular > 500.000	\leq 15%
Peso molecular \leq 65.000	< 10%
Peso molecular < 32.000	< 5%
Contenido de partículas > 10 \mu	< 12/ml
Contenido de partículas > 25 \mu	< 2/ml
^{a} – medidos en la Hb antes de la polimerización

El sustituto de la sangre estable se conserva entonces en un recipiente de almacenaje a corto plazo o en recipientes de almacenaje estériles, teniendo cada uno un ambiente bajo en oxígeno como se ha descrito antes en detalle. El recipiente de almacenaje debe ser también suficientemente impermeable al paso del vapor de agua para evitar una concentración importante del sustituto de la sangre por evaporación a lo largo del periodo de almacenaje. Una concentración importante del sustituto de la sangre es la concentración que da como resultado que uno o más parámetros del sustituto de la sangre esté fuera de especificaciones por encima.

La síntesis de un sustituto de la sangre de hemoglobina polimerizada estable, formado según el método de la invención, se describe adicionalmente en la patente de Estados Unidos Nº 5.296.465.

Los vertebrados que pueden recibir el sustituto de la sangre, formado por los métodos de la invención incluye los mamíferos, tales como un ser humano, primates no humanos, un perro, un gato, una rata, un caballo o una oveja. Además, los vertebrados que pueden recibir dicho sustituto de la sangre, incluyen los fetos (vertebrados prenatales), vertebrados post-natales, o vertebrados en el momento del nacimiento.

Un sustituto de la sangre de la presente invención puede ser administrado al sistema circulatorio inyectando el sustituto de la sangre directamente y/o indirectamente al sistema circulatorio del vertebrado, por uno o más métodos de inyección. Los ejemplos de métodos de inyección directa incluyen las inyecciones intravasculares, tales como las inyecciones intravenosas e intra-arteriales, y las inyecciones intracardiacas. Los ejemplos de métodos de inyección indirecta incluyen las inyecciones intraperitoneales, inyecciones subcutáneas, de tal modo que el sustituto de la sangre será transportado por el sistema linfático hasta el sistema circulatorio o las inyecciones en la médula ósea por medio de un trocar o catéter. Preferiblemente, el sustituto de la sangre se administra intravenosamente.

El vertebrado a ser tratado puede ser normovolémico, hipervolémico o hipovolémico, antes, durante y/o después de la perfusión del sustituto de la sangre. El sustituto de la sangre se puede dirigir hasta el sistema circulatorio por métodos tales como carga superior y por métodos de intercambio.

Un sustituto de la sangre se puede administrar terapéuticamente, para tratar un tejido hipóxico dentro de un vertebrado que resulta de muchas causas diferentes incluyendo el flujo reducido de los RBC en una porción o en todo el sistema circulatorio, la anemia y el shock. Además, el sustituto de la sangre se puede administrar profilácticamente para evitar el agotamiento de oxígeno del tejido en un vertebrado que podría resultar de una posible o esperada reducción en el flujo de los RBC a un tejido o a todo el sistema circulatorio del vertebrado. Una discusión adicional de la administración de hemoglobina para tratar terapéutica o profilácticamente la hipoxia, particularmente debida a una obstrucción arterial parcial, o a un bloqueo parcial de la microcirculación, y las dosis usadas para ello, se proporciona en la Solicitud de patente de Estados Unidos también en tramitación serial Nº 08/409.337, presentada el 23 de marzo de 1995, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Típicamente, una dosis adecuada o una combinación de dosis de sustituto de la sangre, es una cantidad que cuando está contenida dentro del plasma sanguíneo producirá una concentración de hemoglobina total en la sangre del vertebrado entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 gramos de Hb/dl, o más, si se requiere compensar grandes pérdidas de volumen de sangre.

La invención será ahora descrita adicional y específicamente por los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Síntesis de un sustituto de la sangre de Hb polimerizada estable

Como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.296.465, se recogieron muestras de sangre entera bovina y se mezclaron con un anticoagulante de citrato de sodio para formar una solución de sangre.

Cada muestra de solución de sangre se mantuvo después de la recogida a una temperatura de aproximadamente 2ºC y después se filtró para separar los agregados y partículas grandes con un tamiz de 600 mallas.

Antes de la reunión de las muestras, se analizó el nivel de penicilina en cada muestra de solución de sangre con un kit de ensayo obtenido de Difco, Detroit, Michigan usando el método titulado "Detección rápida de penicilina en la leche" para asegurar que los niveles de penicilina en las soluciones de sangre eran < 0,008 unidades/ml.

Las muestras de solución de sangre se reunieron entonces y se mezclaron con solución acuosa despirogenada de citrato de sodio para formar una solución de citrato de sodio al 0,2% en peso en sangre entera bovina (de aquí en adelante "solución de sangre con citrato de sodio al 0,2%").

La solución de sangre con citrato de sodio al 0,2% se pasó entonces en serie a través de filtros de polipropileno de 800 \mum y 50 \mum para separar los residuos grandes de la solución de sangre de aproximadamente 50 \mum o más de diámetro.

Se lavaron entonces los RBC para separar las proteínas plasmáticas extracelulares, tales como BSA o IgG, de los RBC. Para lavar los RBC contenidos en la solución de la sangre, se diluyó inicialmente el volumen de la solución de sangre en el tanque de diafiltración mediante la adición de un volumen igual de una solución isotónica filtrada al tanque de diafiltración. Se filtró la solución isotónica con una membrana de ultrafiltración de 10.000 dalton de Millipore (Cat # CDUF 050 G1). La solución isotónica estaba compuesta de 6,0 g/l de citrato de sodio dihidratado y 8,0 g/l de cloruro de sodio en agua para inyección (WFI).

La solución de sangre diluida se concentró entonces hasta su volumen original por diafiltración a través de un diafiltro de fibra hueca de 0,2 \mum (cartucho de microfiltración Microgon Krosflo II). Concurrentemente, se añadió de forma continua la solución isotónica filtrada, como composición aparte, a un ritmo igual al ritmo de pérdida del filtrado a través del diafiltro de 0,2 \mum. Durante la diafiltración, los componentes de la solución de sangre diluida que eran significativamente más pequeños en diámetro que los RBC, o que eran fluidos tal como el plasma, pasaron a través de las paredes del diafiltro de 0,2 \mum con el filtrado. Los RBC, las plaquetas y los cuerpos más grandes de la solución de sangre diluida, tales como los glóbulos blancos, se retuvieron con la solución isotónica añadida de forma continua, para formar una solución de sangre dializada.

Durante el lavado de los RBC, la solución de sangre diluida se mantuvo a una temperatura entre aproximadamente 10 a 25ºC con una presión de fluido a la entrada del diafiltro entre aproximadamente 172,4 kPa y aproximadamente 206,8 kPa para mejorar la eficiencia del proceso.

El lavado de los RBC se completó cuando el volumen de filtrado drenado desde el diafiltro fue igual a aproximadamente el 600% del volumen de la solución de sangre antes de diluir con la solución isotónica filtrada.

La solución de sangre dializada se bombeó después de forma continua a un ritmo de aproximadamente 4 lpm a una centrífuga Sharples Super Centrifuge, modelo # AS-16, provista de una barrera de anillo # 28. La centrífuga estaba en funcionamiento a la vez que concurrentemente se alimentaba con la solución de sangre dializada, para separar los RBC de los glóbulos blancos y plaquetas. Durante la operación, la centrífuga se hizo rotar a una velocidad suficiente para separar los RBC a una fase densa de RBC, mientras que se separaba también una porción sustancial de los glóbulos blancos (WBC) y de las plaquetas a una fase ligera de WBC, específicamente aproximadamente 15.000 rpm. Una fracción de la fase de RBC y de la fase de WBC se descargaron por separado y de forma continua desde la centrífuga durante la operación.

Después de la separación de los RBC, se lisaron los RBC para formar una solución que contiene hemoglobina. Se lisó mecánicamente una porción sustancial de los RBC mientras que se descargaban los RBC de la centrífuga. Las membranas celulares de los RBC se rompieron tras impactar sobre la pared de la línea de descarga de la fase de RBC en un ángulo frente al flujo de la fase de RBC fuera de la centrífuga, liberando de este modo la hemoglobina (Hb) de los RBC a la fase de RBC.

La fase de los RBC lisados se hizo fluir entonces a través de la línea de descarga de la fase de RBC a un mezclador estático (Kenics de 1,25 cm con 6 elementos, Chemineer, Inc.). De forma concurrente con la transferencia de la fase de los RBC al mezclador estático, se inyectó también una cantidad igual de agua para inyección al mezclador estático, donde el agua para inyección se mezcló con la fase de los RBC. Los caudales de la fase de los RBC y del agua para inyección hacia el mezclador estático son cada uno de aproximadamente 0,25 lpm.

La mezcla de la fase de los RBC con el agua para inyección en el mezclador estático produjo un coloide de los RBC lisados. El coloide de los RBC lisados se transfirió entonces desde el mezclador estático a una centrífuga Sharples Super Centrifuge (modelo # AS-16, Sharples Division of Alfa-Laval Separation, Inc.) que era adecuada para separar la Hb de los componentes de los RBC no hemoglobínicos. Se hizo rotar la centrífuga a una velocidad suficiente para separar el coloide de los RBC lisados en una fase ligera de Hb y en una fase densa. La fase ligera estaba compuesta de Hb y contenía también componentes no hemoglobínicos con una densidad aproximadamente igual o menor que la densidad de Hb.

La fase de Hb se descargó de manera continua de la centrífuga, a través de un microfiltro de 0,45 \mum Millipore Pellicon Cassette, Cat 3 HVLP 000 C5, a un tanque de espera en preparación para la purificación de la Hb. Las células del estroma celular se devolvieron entonces con lo retenido en el microfiltro al tanque de espera. Durante la microfiltración, la temperatura dentro del tanque de espera se mantuvo a 10ºC o menos. Para mejorar la eficiencia, cuando la presión del fluido en la entrada del microfiltro aumentó desde una presión inicial de aproximadamente 69 kPa a aproximadamente 172 kPa, se completó la microfiltración. Después se transfirió el microfiltrado de Hb desde el microfiltro al tanque del microfiltrado.

Posteriormente, el microfiltrado de Hb se bombeó a través de un ultrafiltro 100.000 Millipore Cat # CDUF 050 H1. Una porción sustancial de la Hb y del agua, contenida en el microfiltrado de Hb, permeó el ultrafiltro de 100.000 dalton para formar un ultrafiltrado de Hb, mientras que los residuos celulares más grandes, tales como proteínas con un peso molecular por encima de aproximadamente 100.000 dalton, se retuvieron y se recircularon de nuevo al tanque del microfiltrado. Concurrentemente, se añadió continuamente agua para inyección al tanque del microfiltrado como compensación de la pérdida de agua en el ultrafiltrado. Generalmente, los residuos celulares incluyen todos los componentes celulares enteros o fragmentados con la excepción de la Hb, proteínas celulares más pequeñas, electrólitos, coenzimas e intermedios metabólicos orgánicos. La ultrafiltración continuó hasta que la concentración de Hb en el tanque del microfiltrado fue inferior a 8 gramos/litro (g/l). Durante la ultrafiltración de la Hb, la temperatura interna del tanque del microfiltrado se mantuvo a aproximadamente 10ºC.

Se transfirió el ultrafiltrado de Hb a un tanque de ultrafiltrado, en el que el ultrafiltrado de Hb fue entonces recirculado a través de un ultrafiltro de 30.000 dalton Millipore Cat CDUF 050 T1 para separar los componentes celulares más pequeños, tales como electrólitos, coenzimas, intermedios metabólicos y proteínas de peso molecular menor que 30.000 dalton, y el agua desde el ultrafiltrado de Hb, formando de este modo una solución de Hb concentrada que contiene aproximadamente 100 g de Hb por litro.

La solución de Hb concentrada se dirigió entonces desde el tanque del ultrafiltrado al medio contenido en columnas cromatográficas paralelas (60,96 cm de largo con un diámetro interior de 20,32 cm) para separar la hemoglobina por cromatografía de líquidos de alta resolución. Las columnas cromatográficas contenían un medio de intercambio aniónico adecuado para separar la Hb de las proteínas no hemoglobínicas. El medio de intercambio aniónico se formó a partir de gel de sílice. El gel de sílice se expuso a \gamma-glicidoxi-propilsilano para formar grupos epóxidos activos y después se expuso a C_{3}H_{7}(CH_{3})NCl para formar un medio de intercambio aniónico con amonio cuaternario. Este método de tratamiento del gel de sílice está descrito en el Journal of Chromatography, 120: 321-333 (1976).

Cada columna fue pre-tratada haciendo fluir por las columnas cromatográficas un primer tampón que facilita la unión de la Hb. Después, se inyectaron 4,52 litros de la solución de Hb concentrada a cada columna cromatográfica. Después de inyectar la solución de Hb concentrada, se lavaron entonces las columnas cromatográficas, pasando sucesivamente tres tampones diferentes a través de las columnas cromatográficas para producir un eluato de Hb, mediante la producción de un gradiente de pH dentro de las columnas. La temperatura de cada tampón durante el uso fue aproximadamente 12,4ºC. Los tampones se pre-filtraron a través de una membrana de ultrafiltración de 10.000 dalton antes de la inyección a las columnas cromatográficas.

El primer tampón, tris-hidroximetil-aminometano (Tris) 20 mM (pH de aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4) transportó la solución de Hb concentrada hasta el medio de las columnas cromatográficas para unir la Hb. El segundo tampón, una mezcla del primer tampón y un tercer tampón, teniendo el segundo tampón un pH de aproximadamente 8,3, ajustó entonces el pH dentro de las columnas cromatográficas para eluir los componentes contaminantes no hemoglobínicos desde las columnas cromatográficas, a la vez que se retiene la Hb. El equilibrio con el segundo tampón continuó durante aproximadamente 30 minutos a un caudal de aproximadamente 3,56 lpm por columna. El eluato del segundo tampón se desechó. Con el tercer tampón, Tris 50 mM (pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5), se eluyó entonces la Hb de las columnas cromatográficas.

El eluato de Hb se pasó entonces a través de un filtro estéril de 0,22 \mu Sartobran Cat # 5232507 G1PH a un tanque en el que se recogió el eluato de Hb. El primer 3% a 4% del eluato de Hb y el último 3% a 4% del eluato de Hb fueron desechados directamente.

El eluato de Hb se usó después si el eluato contenía menos de 0,5 EU/ml de endotoxina y contenía menos de 3,3 nmoles/ml de fosfolípidos. A sesenta litros de eluato ultrapuro, que tenía un concentración de 100 g de Hb por litro, se añadieron 9 litros de NaCl 1,0 M, Tris 20 mM (pH 8,9), formando de este modo una solución de Hb con una fuerza iónica de 160 mM, para reducir la afinidad por el oxígeno de la Hb en la solución de Hb. Se concentró entonces la solución de Hb a 10ºC, mediante la recirculación a través del ultrafiltro, específicamente un filtro de 10.000 dalton Millipore Helicon Cat # CDUF050G1, hasta que la concentración de Hb fue de 110 g/l.

La solución de Hb se desoxigenó entonces hasta que la pO_{2} de la solución de Hb se redujo hasta el nivel en el que el contenido de HbO_{2} fue de aproximadamente 10%, haciendo recircular la solución de Hb a 12 lpm, a través de una membrana de transferencia de fase en microfiltro de polipropileno de 0,05 mm (Hoechst-Celanese Corporation Cat # G-240/40), para formar una solución de Hb desoxigenada (de aquí en adelante desoxi-Hb). Concurrentemente, se dirigió un caudal de nitrógeno gas de 60 lpm a través del lado opuesto de la membrana de transferencia de fase. Durante la desoxigenación, la temperatura de la solución de Hb se mantuvo entre aproximadamente 19ºC y aproximadamente 31ºC.

También durante la desoxigenación, y posteriormente a lo largo del proceso, se mantuvo la Hb en un ambiente bajo en oxígeno para minimizar la absorción de oxígeno por la Hb y para mantener un contenido de Hb oxigenada (oxihemoglobina o HbO_{2}) menor del 10% en la desoxi-Hb.

La desoxi-Hb (60 litros) se filtró después por dialización a través de un ultrafiltro con 180 litros de tampón de almacenaje, que contiene N-acetil-L-cisteína al 0,2% en peso, tampón de fosfato de sodio 33 mM (pH 7,8), que tiene una pO_{2} menor que 6,67 kPa, para formar una desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Antes de ser mezclado con la desoxi-Hb, el tampón de almacenaje fue despirogenado con un filtro despirogenante de 10.000 dalton Millipore Helicon Cat # CDUP050G1.

El tampón de almacenaje se añadió de forma continua a un ritmo aproximadamente equivalente a la pérdida de fluido a través del ultrafiltro. La diafiltración continuó hasta que el volumen de fluido perdido por la diafiltración a través del ultrafiltro fue aproximadamente tres veces el volumen inicial de la desoxi-Hb.

Antes de transferir la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación a un aparato de polimerización, se añadió agua para inyección agotada de oxígeno al reactor de polimerización para purgar de oxígeno el aparato de polimerización para evitar la oxigenación de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. La cantidad de agua para inyección añadida al aparato de polimerización fue una cantidad tal que podría dar como resultado una solución de Hb con una concentración de aproximadamente 40 g de Hb/l, cuando se añadió la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación al reactor de polimerización. Después se recirculó el agua para inyección por todo el aparato de polimerización, para desoxigenar el agua para inyección haciéndola fluir a través de una membrana de transferencia de fase en microfiltro de polipropileno de 0,05 \mum (Hoechst-Celanese Corporation Cat # 5PCM-108, 7,4 m^{2}), frente a un contraflujo de nitrógeno a presión. Los caudales de agua para inyección y de nitrógeno gas, a través de la membrana de transferencia de fase, fueron aproximadamente 18 a 20 lpm y 40 a 60 lpm, respectivamente.

Después se redujo la pO_{2} del agua para inyección en el aparato de polimerización a menos de aproximadamente 266,6 Pa de pO_{2}, se blanqueó el reactor de polimerización con nitrógeno mediante un caudal de aproximadamente 20 lpm de nitrógeno al espacio de cabeza del reactor de polimerización. La desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación se transfirió entonces al reactor de polimerización.

La polimerización se llevó a cabo en un tampón de fosfato 12 mM con un pH de 7,8, que tiene una concentración de cloruro menor que o igual a aproximadamente 35 mmolar.

La desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y la N-acetil-cisteína se mezclaron posteriormente lentamente con el agente de reticulación glutaraldehído, específicamente 29,4 gramos de glutaraldehído por cada kilogramo de Hb a lo largo de un periodo de cinco horas, mientras se calienta a 40ºC y se recircula la solución de Hb a través de un mezclador estático Kenics de 1,25 cm con 6 elementos (Chemineer, Inc.), para formar una solución de Hb polimerizada (poli(Hb)).

La recirculación de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y del glutaraldehído a través del mezclador estático produjo condiciones de caudal turbulento, generalmente con mezcla uniforme del glutaraldehído con la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación, reduciendo de este modo el potencial para formar bolsas de desoxi-Hb que contienen altas concentraciones de glutaraldehído. En general, la mezcla uniforme del glutaraldehído y la desoxi-Hb redujo la formación de poli(Hb) de alto peso molecular (que tiene un peso molecular por encima de 500.000 dalton) y también permitió una mezcla más rápida de glutaraldehído y desoxi-Hb durante la polimerización.

Además, se produjo una reticulación intramolecular de la Hb significativa durante la polimerización de la Hb como un efecto de la presencia de N-acetil-cisteína en la polimerización de la Hb.

Después de la polimerización, la temperatura de la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización se redujo a una temperatura entre aproximadamente 15ºC a aproximadamente 25ºC.

La solución de poli(Hb) se concentró después recirculando la solución de poli(Hb) a través del ultrafiltro hasta que la concentración de poli(Hb) se aumentó hasta aproximadamente 85 g/l. Un ultrafiltro adecuado es un filtro de 30.000 dalton (por ejemplo, Millipore Helicon, Cat # CDUF050LT).

Subsiguientemente, la solución de poli(Hb) se mezcló entonces con 66,75 g de borohidruro de sodio y se recirculó de nuevo a través del mezclador estático. Específicamente, por cada nueve litros de solución de poli(Hb), se añadió un litro de solución de borohidruro de sodio 0,25 M a un ritmo de 0,1 a 0,12 lpm.

Antes de añadir el borohidruro de sodio a la solución de poli(Hb), se alcalinizó el pH de la solución de poli(Hb) ajustando el pH a un pH de aproximadamente 10 para preservar el borohidruro de sodio y para evitar la formación de hidrógeno gas. El pH de la solución de poli(Hb) se ajustó por diafiltración de la solución de poli(Hb) con aproximadamente 215 litros de tampón de borato de sodio 12 mM desoxigenado y despirogenado, que tiene un pH de aproximadamente 10,4 a aproximadamente 10,6. La solución de poli(Hb) se filtró por dialización haciendo recircular la solución de poli(Hb) del reactor de polimerización a través de un ultrafiltro de 30 kD. Se añadió el tampón de borato de sodio a la solución de poli(Hb) a un ritmo equivalente al ritmo de pérdida de fluido a través del ultrafiltro de la diafiltración. Se continuó la diafiltración hasta que el volumen de pérdida de fluido a través del ultrafiltro de la diafiltración fue aproximadamente tres veces el volumen inicial de la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización.

Después del ajuste de pH, se añadió solución de borohidruro de sodio al reactor de polimerización para reducir los enlaces en la solución de poli(Hb) a los enlaces y a la forma de poli(Hb) estable en solución. Durante la adición de borohidruro de sodio, se recirculó de forma continua la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización a través del mezclador estático y la membrana de transferencia de fase en microfiltro de polipropileno de 0,05 mm para separar el oxígeno e hidrógeno disueltos. El caudal a través de un mezclador estático proporcionó también condiciones de caudal turbulento de borohidruro de sodio que de forma rápida y efectiva mezclaron el borohidruro de sodio con la solución de poli(Hb). Los caudales de la solución de poli(Hb) y del nitrógeno gas a través de la membrana de transferencia de fase de 0,05 mm estuvieron entre aproximadamente 2,0 a 4,0 lpm y aproximadamente 12 a 18 lpm, respectivamente. Después de completar la adición del borohidruro de sodio, continuó la reducción en el reactor de polimerización a la vez que un agitador contenido en el mismo, rotaba a aproximadamente 75 rotaciones por minuto.

Aproximadamente una hora después de la adición del borohidruro de sodio, la solución de poli(Hb) estable se recirculó desde el reactor de polimerización a través de un ultrafiltro de 30.000 dalton hasta que la concentración de la solución de poli(Hb) estable fue de 110 g/l. Después de la concentración, el pH y los electrólitos de la solución de poli(Hb) estable se restablecieron hasta niveles fisiológicos para formar un sustituto de la sangre de Hb polimerizada estable, mediante la diafiltración de la solución de poli(Hb) estable a través de un ultrafiltro de 30.000 dalton, con un tampón de pH bajo, desoxigenado, filtrado, que contiene lactato de sodio 27 mM, NAC 12 mM, NaCl 115 mM, KCl 4 mM, y CaCl_{2} 1,36 mM en agua para inyección, (pH 5,0). Se continuó la diafiltración hasta que el volumen de pérdida de fluido a lo largo de la diafiltración a través del ultrafiltro fue de aproximadamente 6 veces el volumen de pre-diafiltración del producto Hb concentrado.

Una vez que el pH y los electrólitos se restablecieron hasta niveles fisiológicos, el sustituto de la sangre de Hb polimerizada estable se diluyó entonces a una concentración de 5,0 g/dl añadiendo el tampón de pH bajo, desoxigenado, filtrado, al reactor de polimerización. El sustituto de la sangre diluido se filtró entonces por dialización recirculando desde el reactor de polimerización a través del mezclador estático y un filtro de purificación de 100.000 dalton frente a un tampón desoxigenado, filtrado que contiene lactato de sodio 27 mM, NAC 12 mM, NaCl 115 mM, KCl 4 mM, y CaCl_{2} 1,36 mM en agua para inyección, (pH 7,8). Se continuó la diafiltración hasta que el sustituto de la sangre contenía aproximadamente menos del 10% o igual al 10% de las especies tetraméricas modificadas y tetraméricas sin modificar por GPC cuando se realiza en condiciones de disociación.

El filtrado de purificación se llevó a cabo en condiciones de presión transmembranal baja con una línea de permeado restringida. Después de la separación de cantidades sustanciales de Hb tetramérica modificada y Hb tetramérica sin modificar, la recirculación del sustituto de la sangre continuó a través del ultrafiltro de 30.000 dalton hasta que la concentración del sustituto de la sangre fue de aproximadamente 130 g/l.

Se almacenó entonces el sustituto de la sangre estable en un recipiente adecuado que tiene un ambiente bajo en oxígeno y una infiltración de oxígeno baja.

Ejemplo 2

Almacenaje del sustituto de la sangre de hemoglobina: sobreenvoltura en lámina

El sustituto de la sangre de hemoglobina, como se prepara en el ejemplo 1, empaquetado en un envase de Stericon de 600 ml, fue sobreenvuelto en un envase de laminado de hoja metálica (KAPAK 50303, denominado a continuación "hoja metálica"), envase Cryovac BYV200 o envase Cryovac P640B. El KAPAK 50303 es un envase de laminado de hoja metálica en el que la capa de hoja metálica es hoja de aluminio. El Cryovac BYV200 es un laminado que contiene una capa de 0,015 milímetros de alcohol polivinílico recubierta con Saran por los dos lados. La permeabilidad al oxígeno de estos dos laminados es menor que 0,02 cc por 645 centímetros cuadrados, por 24 horas, por atm, a 22ºC y 0% de humedad. El Cryovac P640B es un material laminado que comprende una capa de 0,015 milímetros de nilón orientada biaxialmente, recubierta con Saran, un adhesivo y una capa sellante de polietileno lineal de baja densidad. La permeabilidad al oxígeno del material es aproximadamente 8 a 15 cc por 645 centímetros cuadrados, por 24 horas, por atm, a 22ºC y 0% de humedad. Los sustitutos de la sangre empaquetados se mantuvieron a temperatura ambiente durante aproximadamente 418 días con muestreo periódico de la concentración y/o de los niveles de N-acetil-L-cisteína (NAC), bis-N-acetil-L-cisteína (NAC_{2}), Hb total (THb), hemoglobina oxigenada (HbO_{2}) y metahemoglobina (metHb). Los resultados se indican en la Tabla II.

TABLA II Datos de estabilidad de las sobreenvolturas

Día	Sobreenvoltura	NAC (%)	NAC_{2} (%)	THb (g/dl)	HbO_{2} (%)	metHb (%)
0	Hoja metálica	0,1515	0,008	10,7	4,1	\sim0,2
0	BYV200	0,1586	0,0139	10,7	8,8	\sim0,3
0	P640B	0,1274	0,0829	11,7	5,7	1,1
43	Hoja metálica	0,1688	0,0155	11,3	3,3	\sim0,3
43	BYV200	0,1509	0,0365	11,1	2,7	0,3
43	P640B	0,0507	0,1927	11,2	5,6	6,2
117	Hoja metálica	0,1721	0,0136	11,7	2,6	0,0
117	BYV200	0,1433	0,0238	11,9	3,0	0,1
117	P640B	0,0022	0,2355	12,5	12,7	30,7
180	Hoja metálica	0,1818	0,0108	12,1	2,9	\sim0,1

TABLA II (continuación)

Día	Sobreenvoltura	NAC (%)	NAC_{2} (%)	THb (g/dl)	HbO_{2} (%)	metHb (%)
180	BYV200	0,1674	0,0327	12,5	2,5	0,2
180	P640B	N.D.	0,2259	12,8	18,2	49,6
418	Hoja metálica	0,15	0,05	11,6	4,5	1,2
418	BYV200	0,17	0,04	11,8	3,7	0,5
418	P640B	N.D.	0,19	12,0	\sim1,3	92,3

El experimento anterior se repitió esencialmente cuando un sustituto de la sangre de hemoglobina fue sobreenvuelto en un envase de laminado de hoja metálica (KAPAK 50303). Los sustitutos de la sangre empaquetados se mantuvieron a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 meses con muestreo periódico de la concentración y/o de los niveles de N-acetil-L-cisteína (NAC), bis-N-acetil-L-cisteína (NAC_{2}), Hb total (THb), hemoglobina oxigenada (HbO_{2}) y metahemoglobina (metHb). Los resultados se indican en la Tabla III.

TABLA III Datos de estabilidad en la sobreenvoltura de hoja metálica

Mes	NAC (%)	NAC_{2} (%)	THb (g/dl)	HbO_{2} (%)	metHb (%)
0	0,16	0,04	13,1	4	3
3	0,13	0,04	13,4	3	2
6	0,14	0,03	13,3	3	2
9	0,15	0,03	13,2	4	2
12	0,13	0,06	13,3	5	2
18	0,14	0,05	13,2	3	2
24	0,14	0,02	13,3	3	2

Ejemplo 3

Almacenaje del sustituto de la sangre de hemoglobina: envase primario

El sustituto de la sangre de hemoglobina, como se prepara en el ejemplo 1, se empaquetó en un envase primario de barrera del oxígeno (E-13135 y E13242, American National Can). La construcción del envase primario se ha discutido con detalle anteriormente. El envase primario es un material laminado que comprende una capa de polietileno de densidad media, una capa de alcohol etilenvinílico/nilón, y una capa sellante de polietileno lineal de baja densidad.

Ejemplo 4

Almacenaje del sustituto de la sangre de hemoglobina: sobreenvoltura transparente

El sustituto de la sangre de hemoglobina, como se prepara en el ejemplo 1, empaquetado en un envase primario, fue sobreenvuelto en un envase laminado transparente construido de laminado de poliéster (PET)/Oxido de silicio (SiO_{2})/polietileno (fabricado por Rollprint, Addison, IL) y un laminado de hoja metálica usando la máquina de empaquetado automático Tiromat. La construcción de los recipientes se ha discutido con detalle anteriormente. La permeabilidad al oxígeno del material es aproximadamente 0,0005 cc por 645 centímetros cuadrados, por atm, por día (25ºC, 100%/50% RH). Los sustitutos de la sangre empaquetados se mantuvieron a 40ºC y 100%/60% RH durante aproximadamente 12 meses y se midieron la concentración y/o los niveles de N-acetil-L-cisteína (NAC), bis-N-acetil-L-cisteína (NAC_{2}), Hb total (THb), hemoglobina oxigenada (HbO_{2}) y metahemoglobina (metHb). Los resultados se indican en la Tabla IV. El mantenimiento de las muestras a la elevada temperatura de 40ºC durante 12 meses tiene el efecto del almacenaje durante 24 meses a 23ºC.

TABLA IV Datos de estabilidad acelerada en las sobreenvolturas transparentes de SiO_{2}

Mes	NAC (%)	NAC_{2} (%)	THb (g/dl)	HbO_{2} (%)	metHb (%)
0	0,15	0,12	13,4	2,4	0,8
3	0,12	0,06	13,2	1,9	0,7
6	0,11	0,03	13,4	2,1	0,9
9	0,13	0,03	13,5	2,3	0,8
12	0,11	0,04	13,5	1,9	0,8

El experimento anterior de almacenaje se repitió con un material diferente de laminado transparente, que comprende óxido de silicio depositado sobre poliéster, fabricado por Perfecseal (Philadelphia, PA). La permeabilidad al oxígeno del material es aproximadamente 0,01375 cc por 645 centímetros cuadrados, por atm, por día (25ºC, 100%/50% RH). Los resultados se indican en la Tabla V.

TABLA V Datos de estabilidad acelerada en la sobreenvoltura transparente II de SiO_{2}

Mes	NAC (%)	NAC_{2} (%)	THb (g/dl)	HbO_{2} (%)	metHb (%)
0	0,15	0,02	13,35	2,4	0,8
3	0,11	0,06	13,3	3,0	1,8
6	0,07	0,09	13,2	3,0	2,4
9	0,1	0,13	13,4	3,3	3,8
12	0,07	0,12	13,5	5,2	4,8

Ejemplo 5

Análisis de hemoglobina polimerizada

La concentración de endotoxina en el producto de hemoglobina se determina por el método "Kinetic/Turbidimetric LAL 500 Methodology" desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachussetts, J. Levin et al., J. Lab. Clin. Med. 75: 903-911 (1970). Se utilizaron diferentes métodos para analizar cualquier traza de estroma, por ejemplo, un ensayo de precipitación, inmunotransferencia, y ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para una proteína o glucolípido específico de la membrana celular conocidos por los expertos en la técnica.

El recuento de partículas se determinó por el método "Particulate Matter in Injections: Large Volume Injections for Single Dose Infusions", U.S. Pharmacopeia 22: 1596, 1990.

Para determinar la concentración de glutaraldehído, se derivatizó una muestra representativa de 400 ml del producto de hemoglobina con dinitrofenilhidrazina y después se inyectó una alícuota de 100 ml de la solución derivatizada a una columna YMC AQ-303 ODS a 27ºC a un caudal de 1 ml/min, junto con un gradiente. El gradiente consiste en dos fases móviles, ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en agua y TFA al 0,08% en acetonitrilo. El flujo del gradiente consistió en una constante de 60% del TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 6,0 minutos, un gradiente lineal hasta el 85% del TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 12 minutos, un gradiente lineal hasta el 100% del TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 4 minutos, mantener a 100% el TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 2 minutos y reequilibrar al 45% del TFA al 0,1% en agua. La detección en ultravioleta se midió a 360 nm.

Para determinar la concentración de NAC, se diluyó una alícuota del producto de hemoglobina 1:100 con fosfato de sodio desgasificado en agua y se inyectaron 50 ml a una columna YMC AQ-303 ODS con un gradiente. Los tampones del gradiente consistieron en una solución de fosfato de sodio en agua y una mezcla de acetonitrilo al 80% en agua con TFA al 0,05%. El flujo del gradiente consistió en 100% de fosfato de sodio en agua durante 15 minutos, después un gradiente lineal hasta el 100% de la mezcla de acetonitrilo al 80% y TFA al 0,05% a lo largo de 5 minutos, con una parada durante 5 minutos. El sistema se reequilibró entonces al 100% de fosfato de sodio durante 20 minutos.

El análisis de los fosfolípidos se hizo por un método basado en los procedimientos contenidos en las dos publicaciones siguientes: Kolarovic et al., "A Comparison of Extraction Methods for the Isolation of Phospholipids from Biological Sources", Anal. Biochem., 156: 244-250, 1986 y Duck-Chong, C. G., "A Rapid Sensitive Method for Determinig Phospholipid Phosphorus Involving Digestion With Magnesium Nitrate", Lipids, 14: 492-497, 1979.

Se determinó la osmolaridad por análisis en un osmómetro Advanced Cryomatic Osmometer, modelo # 3C2, Advanced Instruments, Inc., Needham, Massachusetts.

Las concentraciones de hemoglobina total, metahemoglobina y oxihemoglobina se determinaron en un Co-Oximeter Model #482, de Instrumentation Laboratory, Lexington, Massachusetts.

Las concentraciones de Na^{+}, K^{+}, Cl^{-}, Ca^{++}, pO_{2} se determinaron mediante un Novastat Profile 4, Nova Biomedical Corporation, Waltham, Massachusetts.

La constante de unión del oxígeno, P_{50}, se determinó por un Hemox-Analizer, TCS Corporation, Southhampton,Pennsylvania.

La temperatura y el pH se determinaron por métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica.

El peso molecular (M.W.) se determinó realizando una cromatografía de permeación en gel (GPC) de los productos de hemoglobina en condiciones de disociación. Se analizó por distribución del peso molecular una muestra representativa del producto de hemoglobina. Se diluyó el producto de hemoglobina a 4 mg/ml dentro de una fase móvil de Bis-Tris 50 mM (pH 6,5), MgCl_{2} 750 mM, y EDTA 0,1 mM. Este tampón sirve para disociar el tetrámero de Hb en dímeros, que no han sido reticulados a otros dímeros de Hb por medio de reticulaciones intramoleculares o intermoleculares, a partir de la poli(Hb). Se inyectó la muestra diluida a una columna TosoHaas G3000SW. El caudal fue de 0,5 ml/min y la detección ultravioleta se registró a 280 nm.

Los resultados de los ensayos anteriores sobre sustitutos de la sangre de Hb veterinarios (OXYGLOBIN™) y humanos, formados según el método de esta invención, se resumen en las tablas VI y VII respectivamente.

TABLA VI

Parámetro	Resultados
PH (18-22ºC)	PH fisiológicamente aceptable
Endotoxina	< 0,5 EU/ml
Ensayo de esterilidad	Cumple el ensayo
Fosfolípidos^{a}	<3,3 nm/ml
Hemoglobina total	12,0-14,0 g/dl
Metahemoglobina	< 15%
Oxihemoglobina	< 10%
Sodio, Na^{+}	145-160 mM
Potasio, K^{+}	3,5-5,5 mM
Cloruro, Cl^{-}	105-120 mM
Calcio, Ca^{++}	0,5-1,5 mM
Boro	<10 ppm
Osmolalidad	290-310 mOsm
Glutaraldehído	< 3,5 \mug/ml
N-acetil-L-cisteína	< 0,2%
Peso molecular > 500.000	< 15%
Tetrámero sin modificar	< 5%
Contenido de partículas > 10 \mu	< 12/ml
Contenido de partículas > 25 \mu	< 2/ml
^{a} medidos en la Hb antes de la polimerización

TABLA VII

Parámetro	Resultados
PH (18-22ºC)	PH fisiológicamente aceptable
Endotoxina	< 0,5 EU/ml
Ensayo de esterilidad	Cumple el ensayo
Fosfolípidos^{a}	<3,3 nm/ml
Hemoglobina total	12,0-14,0 g/dl
Metahemoglobina	< 15%
Oxihemoglobina	< 10%
Sodio, Na^{+}	145-160 mM
Potasio, K^{+}	3,5-5,5 mM
Cloruro, Cl^{-}	105-120 mM
Calcio, Ca^{++}	0,5-1,5 mM
Boro	<10 ppm
Osmolalidad	290-310 mOsm
Glutaraldehído	< 3,5 \mug/ml
N-acetil-L-cisteína	\leq 0,2%
Peso molecular > 500.000	\leq 15%
Peso molecular \leq 65.000	< 10%
Peso molecular < 32.000	< 5%
Contenido de partículas > 10 \mu	< 12/ml
Contenido de partículas > 25 \mu	< 2/ml
^{a} medidos en la Hb antes de la polimerización

Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de encontrar sin utilizar más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita aquí. Estos y todos los demás equivalentes de este tipo se pretende que sean englobados por las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Un método para conservar un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada, que comprende mantener un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada que está contenido en un envase primario; el método se caracteriza por una sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno que incluye un material laminado transparente y un material laminado de hoja metálica que juntos forman una cámara, donde el material laminado transparente incluye una capa de óxido de silicio y donde el envase primario y el sustituto de la sangre contenido en el mismo, se sellan dentro de la cámara entre el material laminado de hoja metálica y el material laminado transparente de la sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno.

2. Un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado, que comprende:

un sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada contenido dentro de un envase primario; y que se caracteriza por:

un envase de sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno que incluye un material laminado transparente y un material laminado de hoja metálica que juntos forman una cámara, donde el material laminado transparente incluye una capa de dióxido de silicio y donde el envase primario y el sustituto de la sangre contenido en el mismo, se sellan dentro de la cámara entre el material laminado de hoja metálica y el material laminado transparente, conservando de este modo el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada en un ambiente que está sustancialmente libre de oxígeno.

3. El método de la reivindicación 1 o el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 2, en el que el material laminado transparente incluye además una capa de poliéster.

4. El método o el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 3, en el que el material laminado transparente incluye además una capa de polímero lineal de baja densidad.

5. El método o el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 4, en el que el polímero lineal de baja densidad se selecciona del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, y sus copolímeros.

6. El método o el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 5, en el que el polímero lineal de baja densidad es un polietileno lineal de baja densidad.

7. El método o el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 6, en el que el material laminado transparente y el material laminado de hoja metálica están unidos de forma continua en un perímetro de la sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno.

8. El método o el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 7, en el que la sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno tiene una permeabilidad al oxígeno menor que aproximadamente 0,01 cc por 645 cm^{2}, por 24 horas, por atmósfera, a 23ºC.

9. El método o el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 8, en el que la sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno tiene una permeabilidad al oxígeno menor que aproximadamente 0,0005 cc por 645 cm^{2}, por 24 horas, por atmósfera, a 25ºC.

10. El método o el sustituto de la sangre de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 9, en el que la capa de óxido de silicio tiene un espesor en un intervalo entre aproximadamente 100\ring{A} y aproximadamente 2000 \ring{A}, y opcionalmente

en el que la capa de polietileno tiene un espesor entre aproximadamente 0,013 y aproximadamente 0,254 milímetros, en cuyo caso, también opcionalmente,

en el que la capa de polietileno tiene un espesor de aproximadamente 0,0508 milímetros, en cuyo caso, también opcionalmente,

en el que la permeabilidad al oxígeno de la sobreenvoltura de película-barrera de oxígeno es menor que aproximadamente 0,0005 cc por 645 cm^{2}, por 24 horas, por atmósfera, a 25ºC y 100%/50% de humedad relativa interior/exterior, en cuyo caso, también otra vez opcionalmente,

en el que el material laminado transparente tiene una permeabilidad al oxígeno de aproximadamente 0,0005 cc por 645 cm^{2}, por 24 horas, por atmósfera, por día, a 25ºC y 100%/50% de humedad relativa interior/exterior, en cuyo caso, también otra vez opcionalmente,

en el que el sustituto de la sangre de hemoglobina, se mantiene en una atmósfera de nitrógeno, argón o helio.