ES2215689T3

ES2215689T3 - Conservacion de un sustituto sanguineo de hemoglobina con una envoltura transparente.

Info

Publication number: ES2215689T3
Application number: ES00947161T
Authority: ES
Inventors: Maria S. Gawryl; Robert A. Houtchens; William R. Light
Original assignee: Biopure Corp
Current assignee: Biopure Corp
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: EP1196030B1; CA2373753C; AU760123B2; WO2001001775A1; NZ516470A; EP1196030A1; CA2373753A1; JP2003520774A; US6288027B1; AU6081700A; DE60010704T2; CN1384707A; HK1046082B; HK1046082A1; US7041800B1; MXPA01013195A; WO2001001775A8; US20020128182A1; ATE266314T1; DE60010704D1

Abstract

Un método para conservar un sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado, que comprende mantener el sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado en un envase con envoltorio de película barrera para el oxígeno, en el que el envase comprende un material estratificado transparente que comprende una capa barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina, en el que el estratificado tiene un espesor de entre aproximadamente 0, 0254 y 0, 254 mm, y una permeabilidad al oxígeno inferior a aproximadamente 0, 01 cm3 por 645 cm2 durante 24 horas a una atmósfera y a aproximadamente 23ºC, en el que la capa barrera para el oxígeno comprende un copolímero de etileno y alcohol vinílico.

Description

Conservación de un sustituto sanguíneo de hemoglobina con una envoltura transparente.

Antecedentes de la invención

Existe la necesidad de desarrollar un sustituto de la sangre para tratar o prevenir hipoxia derivada de pérdida de sangre (por ejemplo, de hemorragias agudas o durante operaciones quirúrgicas), derivada de anemia (por ejemplo, anemia perniciosa o anemia falciforme), o derivada de un choque (por ejemplo, choque por deficiencia de volumen, choque anafiláctico, choque séptico o choque alérgico).

El uso de sangre y fracciones de sangre tanto en estos usos, como un sustituto de sangre presenta multitud de desventajas. Por ejemplo, el uso de sangre íntegra a menudo va acompañado por el riesgo de transmisión de virus que producen hepatitis y virus que producen SIDA lo que puede complicar la recuperación del paciente u originar la mortalidad del paciente. Además, el uso de sangre íntegra requiere la determinación del grupo sanguíneo y pruebas de compatibilidad cruzada para evitar problemas inmunohematológicos e incompatibilidad entre donadores.

La hemoglobina humana, como un sustituto de sangre, tiene actividad osmótica y la capacidad de transportar y transferir oxígeno, pero tiene la desventaja de que se elimina rápidamente de la circulación por vía renal y a través de las paredes vasculares, dando lugar a un tiempo de vida muy corto y, por lo tanto, típicamente, no satisfactorio. Además, la hemoglobina humana se contamina también frecuentemente con niveles tóxicos de endotoxinas, bacterias y/o virus.

La hemoglobina no humana tiene las mismas deficiencias que la hemoglobina humana. Además, la hemoglobina procedente de fuentes no humanas se contamina también típicamente con proteínas, tales como anticuerpos, lo que podría causar una respuesta del sistema inmunológico en el receptor.

Anteriormente, se han utilizado al menos cuatro de otros tipos de sustitutos de sangre, incluyendo compuestos perfluoroquímicos, compuestos análogos a la hemoglobina sintetizados, hemoglobina encapsulada en liposomas, y hemoglobina químicamente modificada. Sin embargo, muchos de estos sustitutos de sangre tienen típicamente tiempos de retención intravascular cortos, siendo retirados por el sistema circulatorio como sustancias extrañas o alojándose en el hígado, bazo y otros tejidos. También, muchos de estos sustitutos de sangre han sido biológicamente incompatibles con sistemas vivos.

De este modo, a pesar de los recientes progresos en la preparación de sustitutos de sangre a base de hemoglobina, ha continuado existiendo la necesidad de desarrollar un sustituto de sangre que tenga niveles de contaminantes, tales como endotoxinas, bacterias, virus, fosfolípidos y proteínas diferentes a la hemoglobina, que sean suficientemente bajos para evitar generalmente una respuesta del sistema inmunológico y cualquier efecto toxicológico derivado de una infusión del sustituto de sangre. Además, el sustituto de sangre debe ser capaz de transportar y transferir cantidades adecuadas de oxígeno a los tejidos en condiciones ambientales, y debe tener un buen tiempo de retención intravascular.

Además, se prefiere que el sustituto de sangre 1) tenga una actividad oncótica generalmente equivalente a la de la sangre íntegra, 2) pueda ser transfundido a la mayoría de los receptores sin realizar pruebas de compatibilidad cruzada o ensayos de sensibilidad, y 3) pueda ser almacenado con cantidades mínimas de refrigeración durante largos períodos de tiempo.

El sustituto de sangre, se envasa típicamente en un envoltorio de estratificado de láminas metálicas que tiene buenas propiedades de barrera para O_{2} y la humedad. Los estratificados de láminas metálicas son típicamente opacos, no permitiendo, de este modo, una inspección visual del producto ni una inspección de la integridad del envase primario. Además, un envoltorio opaco requiere el uso de una segunda etiqueta en el exterior de dicho envoltorio.

En el pasado, los estratificados transparentes que contienen silicio con buenas propiedades de barrera para el oxígeno y la humedad no han sido útiles en equipos de envasado automático debido a que la tensión soportada por el material causaba su rotura o, por otra parte, o la pérdida de las propiedades de barrera.

Sumario de la invención

La presente invención trata de un método para conservar un sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada que comprende mantener un sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado en un envase con envoltorio de película barrera para el oxígeno, en el que el envase con envoltorio comprende un material estratificado transparente que comprende una capa barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina, en el que el estratificado tiene un espesor de entre 0,0254 y 0,254 mm y una permeabilidad al oxígeno de menos de 0,01 cm^{3} por 645 cm^{2} durante 24 horas a 1 atmósfera y a temperatura ambiente (aproximadamente 23ºC), en el que la capa barrera para el oxígeno comprende un copolímero de etileno y alcohol vinílico. En una realización, el método comprende mantener el sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada en un envoltorio de película barrera para el oxígeno que comprende un material estratificado transparente que tiene un espesor de entre 0,254 y 0,127 mm.

La presente invención trata también de un sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada conservado, que comprende un sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado y un envase con envoltorio de película barrera para el oxígeno transparente. En una realización, el material estratificado transparente comprende una capa barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina, teniendo dicha capa barrera para el oxígeno una permeabilidad al oxígeno inferior a 0,01 cm^{3} por 645 cm^{2} durante 24 horas a 1 atmósfera y a temperatura ambiente (aproximadamente 23º) y en el que la capa barrera para el oxígeno comprende un copolímero de etileno y alcohol vinílico. El sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado está cerrado herméticamente dentro del envase con envoltorio, con lo que se conserva dicho sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada en un ambiente que está sustancialmente libre de oxígeno.

En una realización de la presente invención, el material estratificado transparente se usa en combinación con material estratificado de láminas en el envasado automático. En una realización, se ha usado una máquina de envasado automático fabricada por Tiromat (Avon, MA).

Las ventajas de esta invención son numerosas. Una ventaja es que la hemoglobina almacenada según los métodos de esta invención tiene un mayor grado de pureza y una duración de almacenamiento más prolongada. Los envoltorios con buenas propiedades barrera proporcionan un nivel añadido de calidad de producto incluso cuando se emplea un envase primario con buenas propiedades barrera. Además, los envoltorios transparentes con buenas propiedades barrera de la presente invención proporcionan propiedades de barrera para el vapor de agua y el oxígeno extremadamente buenas a pesar de no tener una capa de saran (poli(cloruro de vinilo), PVDC). El PVDC tiene problemas de gestión de residuos médicos debido que se generan productos clorados tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos y ácido clorhídrico durante la incineración. Los envoltorios transparentes permiten ver la etiqueta del envase primario. Por lo tanto, normalmente no se requiere una segunda etiqueta sobre el envoltorio. Además, se pueden evaluar también la inspección de la calidad del producto y la integridad del envase primario. Además, como se demostró la primera vez en esta memoria, se puede usar un equipo automático con estratificados barreras para el oxígeno transparentes, lo que permite producir números muy elevados de envases en un corto período de tiempo con muy poca mano de obra y son las pérdidas de las propiedades de barrera. El sustituto de sangre permanece estable a temperatura ambiente durante períodos de dos años o más, siendo esto una mejora significativa respecto a los métodos anteriores.

Los documentos US-A-5091452, EP-A-080831778, DE-A-3.915.252, DE-A-29605214, GB-A-2.107.191 y GB-A-7.121.615 corresponden a la técnica anterior a esta solicitud.

Descripción detallada de la invención

Las características y otros detalles de la presente invención se describirán ahora y destacarán más particularmente en las reivindicaciones. Las características principales de esta invención se pueden emplear en diversas realizaciones sin salirse del alcance de la presente invención.

La invención se refiere a un método para conservar la estabilidad de un sustituto de sangre a base de hemoglobina que comprende mantener el sustituto de sangre a base de hemoglobina en una atmósfera sustancialmente libre de oxígeno. Este método se puede realizar manteniendo el sustituto de sangre en un recipiente impermeable al oxígeno, tal como un envase primario barrera para el oxígeno, un envoltorio de película barrera para el oxígeno (por ejemplo, una bolsa), un recipiente de vidrio (por ejemplo, un vial) o un recipiente de acero. Cuando el envase primario es una película barrera para el oxígeno, el recipiente se pueden fabricar de una variedad de materiales, incluyendo películas polímeras (por ejemplo, un poliéster esencialmente impermeable al oxígeno, un copolímero de etileno y alcohol vinílico (EVOH), o nilón), y sus estratificados. Cuando el recipiente comprende un envoltorio barrera para el oxigeno, dicho envoltorio se puede fabricar de una variedad de materiales, incluyendo películas polímeras (por ejemplo, un poliéster esencialmente impermeable al oxígeno, un copolímero de etileno y alcohol vinílico (EVOH), o nilón) y estratificados, tales como un estratificado transparente (por ejemplo, un estratificado que contiene óxido de silicio o EVOH) o un estratificado de láminas metálicas (por ejemplo un estratificado de láminas de plata o de aluminio).

Cuando el envoltorio es una película, tal como una película de poliéster, se puede hacer que dicha película sea esencialmente impermeable al oxígeno mediante una variedad de métodos adecuados. En una realización, la película según se fabrica es esencialmente impermeable al oxígeno. De manera alternativa, cuando el material polímero no es suficientemente impermeable al oxígeno como para cumplir las especificaciones deseadas, la película se puede estratificar o tratar de otro modo para reducir o eliminar la permeabilidad al oxígeno.

En una realización preferida, se emplea un estratificado transparente para al menos un lado del envoltorio. En una realización, al menos una capa del estratificado transparente es una barrera para el oxígeno. La capa barrera para el oxígeno tiene preferiblemente un espesor entre 2,54 x 10^{-3} y 0,025 mm. Tanto para el envase primario como para el envoltorio, el estratificado contienen típicamente una o más capas polímeras. El polímero puede ser de una variedad de materiales polímeros que incluyen, por ejemplo, una capa de poliéster (por ejemplo, un poliéster de calibre 48), nilón o una capa de poliolefina, tal como polietileno, acetato de etilenvinilo, o polipropileno, o sus copolímeros.

Los envoltorios de la invención pueden tener una variedad de estructuras, incluyendo, viales, cilindros, cajas, etc. En una realización preferida, el recipiente está en forma de una bolsa. Se puede formar una bolsa adecuada uniendo continuamente una o más (por ejemplo, dos) hojas en su perímetro o sus perímetros para formar una estructura impermeable al oxígeno, herméticamente cerrada, que tiene un centro rellenable. La forma de la bolsa puede ser la encontrada normalmente en esa técnica. En el caso de estratificados que comprenden poliolefinas, tales como polietileno o polipropileno, lineales de baja densidad, de baja densidad, de densidad media o alta, y sus copolímeros, el perímetro de la bolsa se une o sella usando calor. Estará dentro de las especificaciones de la técnica determinar la temperatura apropiada para generar una estructura impermeable al oxígeno y/o a la humedad herméticamente cerrada.

Los recipientes tienen preferiblemente una permeabilidad al oxígeno inferior a aproximadamente 0,01 cm^{3} por 645 cm^{2}, por 24 horas, por atmósfera a temperatura ambiente, preferiblemente inferior a 0,005 cm^{3} por 6,45 cm^{2} en estas condiciones. Recipientes que cumplen estos criterios incluyen, por ejemplo, recipientes plásticos con un envoltorio, tal como recipientes de estratificado con buenas propiedades barrera con un envoltorio compuesto, por ejemplo, de poliolefina, tales como polipropileno, un copolímero de etileno y alcohol vinílico y otra capa de poliolefina tal como estratificado de polietileno lineal de baja densidad. En una realización, el estratificado comprende polipropileno, EVOH y copolímero de polipropileno de espesores de 0,046, 0,030 y 0,076 mm, respectivamente. La permeabilidad al oxigeno del estratificado con buenas propiedades barrera es de 0,00153 cm^{3} por 645 cm^{2} por atmósfera por día a 25ºC, a una humedad relativa (HR) de 100%/50% (dentro/fuera) y la transmisión de vapor de agua es aproximadamente 0,354 mg por 645 cm^{2} por atm por día (25ºC, 100%/50% de HR). Estas bolsas de plástico con envoltorio de película de material compuesto se sellan usando un aparato de sellado Tiromat (Avon, Massachusetts). En una realización, el envoltorio comprende dos hojas de material estratificado transparente. En otra realización, una hoja del envase con envoltorio comprende un material estratificado de láminas y otra hoja comprende un material estratificado transparente. En otra realización, la hoja inferior del envase con envoltorio es un estratificado de láminas y se forma de manera que quede definida al menos una forma de recipiente o cámara en el estratificado de láminas. El sustituto de sangre a base de hemoglobina, en un envase primario, luego se coloca dentro de las cámaras de la lámina, con la etiqueta mirando hacia arriba. La lámina y el sustituto de sangre a base de hemoglobina en el envase primario luego se purgan con nitrógeno y se hace vacío, y luego el estratificado transparente se sella con calor a la capa inferior de estratificado de láminas, creando un sustituto de sangre a base de hemoglobina con envoltorio.

En una realización preferida, el sustituto de sangre se envasa bajo una atmósfera que está sustancialmente libre de oxígeno. Ejemplos de atmósferas adecuadas incluyen nitrógeno, argón y helio.

Como se definió en esta memoria, un sustituto de sangre es una composición portadora de oxígeno a base de hemoglobina para usar en seres humanos, mamíferos y otros vertebrados, que es capaz de transportar y transferir oxígeno a órganos y tejidos vitales, al menos, y que puede mantener una presión oncótica intravascular suficiente. Un vertebrado es como se define clásicamente, incluyendo seres humanos, o cualquier otro animal vertebrado que use sangre en un sistema circulatorio para transferir oxígeno los tejidos. Además, la definición de sistema circulatorio es como se define clásicamente, consistiendo en corazón, arterias, venas y microcirculación incluyendo estructuras vasculares más pequeñas tales como capilares.

Un sustituto de sangre de la invención tiene preferiblemente niveles de endotoxinas, fosfolípidos, proteínas externas y otros contaminantes que no ocasionarán una respuesta significativa del sistema inmunológico y que no son tóxicos para el receptor. Preferiblemente, un sustituto de sangre es ultrapuro. Ultrapuro, como se define en esta invención, significa que contiene menos de 0,5 UE/ml de endotoxina, menos de 3,3 nmoles/ml de fosfolípidos y niveles de pequeños a no detectables de proteínas diferentes a la hemoglobina, tal como albúmina sérica o anticuerpos.

El término "endotoxina" se refiere a los lipopolisacáridos unidos a las células, producidos como una parte de la capa externa de paredes celulares bacterianas gram-negativas, los cuales son tóxicos en muchas condiciones. Cuando se inyectan en animales, las endotoxinas pueden causar fiebre, diarrea, choque hemorrágico, y otros daños en los tejidos. La unidad de endotoxina (UE) ha sido definida por la United States Pharmacopeial Convention de 1983, página 3014, como la actividad contenida en 0,1 nanogramos de lote estándar de referencia de EE.UU. EC-5. Un vial de EC-5 contiene 10.000 UE. Ejemplos de medios adecuados para determinar concentraciones de endotoxinas en un sustituto de sangre incluyen el método "Kinetic/Turbidimetric Limuus Amebocytic Lysate (LAL) 5000 Methodology" desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts.

La hemoglobina polimerizada estable, como se define en esta memoria, es una composición portadora de oxígeno a base de hemoglobina en la cual no aumenta o disminuye sustancialmente la distribución de pesos moleculares y/o el contenido de metemoglobina durante períodos de almacenamiento a temperaturas de almacenamiento adecuadas, para períodos de tiempo de dos años o más, y preferiblemente períodos de dos años o más, cuando se almacena en un medio ambiente con bajo contenido de oxígeno. Temperaturas de almacenamiento adecuadas para un almacenamiento de un año o más están comprendidas entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 40ºC. El intervalo de temperaturas de almacenamiento preferidas es entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 25ºC.

Un medio ambiente con bajo contenido en oxígeno adecuado, o un medio ambiente que está sustancialmente libre de oxígeno, se define como la cantidad acumulativa de oxígeno en contacto con el sustituto de sangre, durante un periodo de almacenamiento de al menos aproximadamente dos meses, preferiblemente al menos aproximadamente un año, o más preferiblemente al menos aproximadamente dos años, que dará lugar a una concentración de metemoglobina inferior a aproximadamente 15% en peso en el sustituto de sangre. La cantidad acumulativa de oxígeno incluye infiltración de oxígeno dentro del envase del sustituto de sangre y el contenido de oxígeno original del sustituto de sangre y el envase.

Durante todo este método, desde la recogida de glóbulos rojos (GR) hasta la polimerización de la hemoglobina, la solución de sangre, los GR y la hemoglobina se mantienen en condiciones suficientes para minimizar el crecimiento microbiano, o la carga biológica, tales como mantener la temperatura a un valor inferior a aproximadamente 20ºC y superior a 0ºC. Preferiblemente, la temperatura se mantiene a un valor de aproximadamente 15ºC o inferior. Mas preferiblemente, la temperatura se mantiene a un valor de 10 \pm 2ºC.

En este método, las partes de los componentes para el procedimiento para preparar un sustituto de sangre estable a base de hemoglobina polimerizada se depuran lo suficiente para producir un producto estéril. Estéril es como se define en la técnica, específicamente, que la solución cumpla los requisitos de United States Pharmacopeia para la esterilidad proporcionados en el documento USP XXII, Sección 71, páginas 1483-1488. Además, las partes de los componentes que están expuestas a la corriente del procedimiento, se fabrican o revisten usualmente con un material que no reaccionará con la corriente del procedimiento o contaminará dicha corriente. Dichos materiales pueden incluir acero inoxidable y otras aleaciones de acero, tales como Inconel.

Fuentes de GR adecuadas incluyen, sangre humana, sangre bovina, sangre ovina, sangre porcina, sangre procedente de otros animales vertebrados y hemoglobina producida transgénicamente, tal como la Hb transgénica descrita en BIO/TECHNOLOGY, 12: 55-59 (1994).

La sangre se puede recoger de donadores vivos o recientemente sacrificados. En las Patentes de EE.UU. Nº 5.084.558 y 5.296.465, expedidas a Rausch et al., se describe un método para recoger sangre íntegra bovina. Es preferible recoger la sangre de forma esterilizada.

En la recogida o inmediatamente después de ésta, la sangre se mezcla con al menos un anticoagulante para evitar que se produzca una coagulación importante de la sangre. Anticoagulantes adecuados para la sangre son los conocidos clásicamente en la técnica e incluyen, por ejemplo, citrato sódico, ácido etilendiaminotetraacético y heparina. Cuando se mezcla con la sangre, el anticoagulante puede estar en forma sólida, tal como un polvo, o en una solución acuosa.

Se entiende que la fuente de solución de sangre puede proceder de una muestra recién recogida o de una muestra antigua, tal como sangre de un ser humano fallecido procedente de un banco de sangre. Además, la solución de sangre podría haber sido previamente mantenida en estado congelado y/o líquido. Se prefiere que la solución de sangre no esté congelada antes de usarla en este método.

En otra realización, antes de introducir anticoagulantes en la solución de sangre, se evalúan los niveles de antibióticos en dicha solución de sangre, tal como penicilina. Los niveles de antibióticos se determinan para proporcionar cierta garantía de que la muestra de sangre no está cargada con un organismo infeccioso, verificando que el donador de la muestra de sangre no estaba siendo tratado con un antibiótico. Ejemplos de ensayos adecuados para determinar antibióticos incluyen un kit de ensayo para penicilina (Difco, Detroit, MI) que emplea un método titulado "Rapid Detection of Penicillin in Milk". Se prefiere a que las soluciones de sangre contengan un nivel de penicilina inferior o igual a aproximadamente 0,008 unidades/ml. De manera alternativa, se puede usar un programa de tratamiento de rebaños para controlar la ausencia de enfermedades en el ganado o de tratamiento antibiótico.

Preferiblemente, la solución de sangre se cuela antes o durante la etapa de anticoagulación, por ejemplo, filtrando, para retirar agregados y partículas, grandes. Un tamiz de malla 600 es un ejemplo de un colador adecuado.

Los GR en la solución de sangre se lavan luego por medios adecuados, tales como mediante filtración por diálisis o mediante una combinación de etapas discretas de dilución y concentración con al menos una solución, tal como una solución isotónica, para separar los GR de las proteínas plasmáticas extracelulares, tal como albúminas séricas o anticuerpos (por ejemplo, inmunoglobulinas (IgG)). Se entiende que los GR se pueden lavar en un modo de alimentación continuo o en tandas.

Soluciones isotónicas aceptables son las conocidas en la técnica e incluyen soluciones, tales como una solución de citrato/solución salina, que tiene un pH y una osmolaridad que no causa la ruptura de las membranas celulares de los GR y que desplaza la parte del plasma de la sangre íntegra. Una solución isotónica preferida tiene un pH neutro y una osmolaridad entre aproximadamente 285-315 mOsm. En una realización preferida, la solución isotónica esta compuesta de una solución acuosa de dihidrato de citrato sódico (6,0 g/l) y de cloruro sódico (8,0 g/l).

El agua que se puede usar en el método de la invención incluye agua destilada, agua desionizada, agua para inyección (WFI del inglés water-for-injection) y agua con bajo contenido en pirógenos (LPW del inglés low pyrogen water). El WFI, que se prefiere, es agua desionizada, destilada que cumple las Especificaciones Farmacológicas de EE.UU. para el agua para inyección. El WFI se describe adicionalmente en Pharmaceutical Engineering, 11, 15-23 (1991). El LPW, que se prefiere, es agua desionizada que contiene menos de 0,002 UE/ml.

Se prefiere filtrar la solución isotónica antes de añadirla a la solución de sangre. Ejemplos de filtros adecuados incluyen una membrana de ultrafiltración Millipore de 10.000 Daltons, tal como un filtro Millipore Cat # CDUF 050 G1 o un filtro hueco A/G Technology de 10.000 Daltons (Cat # UFP-10-C-85).

En una realización preferida, los GR en la solución de sangre se lavan mediante filtración por diálisis. Filtros de diálisis adecuados incluyen membranas microporosas con tamaños de poros que separarán los GR de componentes de la solución de sangre sustancialmente más pequeños, tal como un filtro de 0,1 \mum a 0,5 \mum (por ejemplo, un filtro de fibras huecas de 0,2 \mum, cartucho de microfiltración Microgon Krosflo II). Simultáneamente, se añade una solución isotónica filtrada continuamente (o en tandas) como aportación a un ritmo igual al ritmo (o volumen) de pérdida de filtrado a través del filtro de diálisis. Durante el lavado de GR, los componentes de la solución de sangre que tienen un diámetro significativamente más pequeños que los GR, o son fluidos tales como el plasma, pasan a través de las paredes del filtro de diálisis en el filtrado. Los GR, las plaquetas y los cuerpos más grandes de la solución de sangre diluida, tal como glóbulos blancos, son retenidos y mezclados con la solución isotónica, la cual se añade de forma continua o en tandas para formar una solución de sangre dializada.

En una realización más preferida, el volumen de solución de sangre en el tanque de filtración por diálisis se diluye inicialmente añadiendo un volumen de una solución isotónica filtrada al tanque de filtración por diálisis. Preferiblemente, el volumen de solución isotónica añadida es aproximadamente igual al volumen inicial de la solución de sangre.

En una realización alterativa, los GR se lavan a través de una serie de etapas de dilución y concentración secuenciales (o de secuencia inversa), en las que la solución de sangre se diluye añadiendo al menos una solución isotónica, y se concentra haciéndola fluir a través de un filtro, con lo que se forma una solución de sangre dializada.

El lavado de GR se completa cuando el nivel de proteínas plasmáticas que contaminan los GR se ha reducido de forma sustancial (típicamente al menos aproximadamente 90%). Típicamente, el lavado de los GR se completa cuando el volumen de filtrado drenado a través del filtro de diálisis 34 es igual a aproximadamente el 300%, o más, del volumen de solución de sangre contenido en el tanque de filtración por diálisis antes de diluir la solución de sangre con solución isotónica filtrada. Un lavado de GR adicional puede separar adicionalmente proteínas plasmáticas extracelulares de los GR. Por ejemplo, una filtración por diálisis con 6 volúmenes de solución isotónica puede retirar al menos aproximadamente 99% de IgG de la solución de sangre.

La solución de sangre dializada luego se somete a medios para separar los GR en dicha solución de sangre dializada de los glóbulos blancos y plaquetas, tales como mediante centrifugación.

Se entiende que se pueden emplear otros métodos conocidos generalmente en la técnica para separar los GR de otros componentes de la sangre. Por ejemplo, mediante sedimentación, en la que el método de separación no causa la ruptura de las membranas celulares de una cantidad significativa de los GR, tal como menos de aproximadamente el 30% de los GR, antes de separar los GR de los otros componentes de la sangre.

Después de la separación de los GR, dichos GR se someten a lisis usando medios para lisar GR para liberar la hemoglobina de los GR para formar una solución que contiene hemoglobina. Los medios de lisis pueden usar diversos métodos de lisis, tales como lisis mecánica, lisis química, lisis hipotónica u otros métodos de lisis conocidos, los cuales liberaran la hemoglobina sin dañar de forma significativa la capacidad de dicha hemoglobina para transportar y liberar oxígeno.

En todavía otra realización, se puede tratar hemoglobina recombinantemente producida, tal como la hemoglobina recombinantemente producida descrita en Nature, 356: 258-260 (1992) en el método de la invención en lugar de GR. Las células de bacterias que contienen la hemoglobina se lavan y se separan de contaminantes como se describió anteriormente. Estas células de bacterias luego se rompen mecánicamente por medios conocidos en la técnica, tales como un molino de bolas, para liberar hemoglobina de las células y para formar una fase de células lisadas. Esta fase de células lisadas luego se trata como la fase de GR lisados.

Después de la lisis, la fase de GR lisados se somete luego a ultrafiltración para retirar los desechos celulares más grandes, tales como proteínas con un peso molecular superior a aproximadamente 100.000 Daltons. Generalmente, los desechos celulares incluyen todos los componentes celulares enteros y fragmentados excepto la Hb, proteínas celulares más pequeñas, electrólitos, coenzimas y compuestos intermedios matabólicos orgánicos. Untrafiltros aceptables incluyen, por ejemplo, filtros de 100.000 Daltons preparados por Millipore (Cat # CDUF 050 H1) y preparados por A/G Technology (Needham, MA.; Modelo Nº UFP100E55).

Se prefiere que la ultrafiltración continúe hasta que la concentración de Hb en la fase de GR lisados sea inferior a 8 gramos/litro (g/l) para maximizar la producción de hemoglobina disponible para la polimerización. Se pueden emplear otros métodos para separar Hb de la fase de GR lisados, incluyendo sedimentación, centrifugación o microfiltración. EL ultrafiltrado de Hb se puede someter luego a ultrafiltración para retirar los desechos celulares más pequeños, tales como electrólitos, coenzimas, compuestos intermedios metabólicos y proteínas con un peso molecular inferior a aproximadamente 30.000 Daltons, y agua del ultrafiltrado de Hb. Ultrafiltros adecuados incluyen un ultrafiltro de 30.000 Daltons (Millipore Cat # CDUF 050 T1 y/o Armicon, # 540 430).

La solución concentrada de Hb se puede introducir luego en una o más columnas cromatográficas paralelas para separar adicionalmente la hemoglobina mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de otros contaminantes tales como anticuerpos, endotoxinas, fosfolípidos, y enzimas y virus. Ejemplos de medios adecuados incluyen, medios de intercambio aniónico, medios de intercambio catiónico, medios de interacción hidrófoba y medios de afinidad. En una realización preferida, las columnas cromatográficas contienen un medio de intercambio aniónico adecuado para separar Hb de proteínas diferentes a la hemoglobina. Medios de intercambio aniónico adecuados incluyen, por ejemplo, sílice, alúmina, gel de titania, dextrano reticulado, agarosa o un resto derivatizado, tal como una poliacrilamida, un poli(hidroxietil-metacrilato) o un estireno-divinilbenceno, que ha sido derivatizado con una funcionalidad química catiónica, tal como un grupo dietilaminoetilo o aminoetilo cuaternario. Un experto aceptable en la técnica puede determinar fácilmente un medio de intercambio aniónico adecuado y los correspondientes eluyentes para la absorción y desorción selectiva de Hb en comparación con otras proteínas y contaminantes, que probablemente se encuentren en una fase de GR lisados.

En una realización más preferida, se usa un método para formar un medio de intercambio aniónico a partir de gel de sílice, el cual se trata hidrotérmicamente para aumentar el tamaño de los poros, se expone a \gamma-glicidoxi-propilsilano para formar grupos epoxídicos activos, y luego se expone a C_{3}H_{7}(CH_{3})NCl para formar un medio de intercambio aniónico de amonio cuaternario. Este método se describe en la Journal of Chromatography, 120:321-333 (1976).

Las columnas cromatográficas primero se tratan previamente lavándolas abundantemente con un primer eluyente que facilita la unión de la Hb. Luego se inyecta la solución concentrada de Hb en el medio en las columnas. Después de inyectar la solución concentrada de Hb, las columnas cromatográficas se lavan luego sucesivamente con diferentes eluyentes para producir un eluato de Hb purificada, separada.

En una realización preferida, se usa un gradiente de pH en columnas cromatográficas para separar los contaminantes de proteínas, tales como la enzima anhidrasa carbónica, fosfolípidos, anticuerpos y endotoxinas de la Hb. Cada serie de tampones que tienen diferentes valores de pH, se introduce secuencialmente para crear un gradiente de pH dentro del medio en la columna cromatográfica. Se prefiere que los tampones se filtren, tal como con una membrana de despirogenización de 10.000 Daltons. Los tampones usados para separar Hb han de tener una baja fuerza iónica de manera que la elución de Hb y de contaminantes diferentes a la hemoglobina dependa generalmente del pH y no dependa de forma significativa de la fuerza iónica. Típicamente, los tampones con una concentración iónica de aproximadamente 50 mM, o inferior, tienen fuerzas iónicas bajas adecuadas.

El primer tampón transporta la solución concentrada de Hb dentro del medio en las columnas cromatográficas y facilita la unión de la Hb al medio. Con el segundo tampón se ajusta luego el pH dentro de las columnas para eluir los componentes contaminantes diferentes a la hemoglobina mientras se mantiene la unión de la Hb al medio. Luego, con el tercer tampón se eluye la Hb. Después, se recoge el eluato de Hb. Se prefiere que el eluato de Hb se pase a través de un filtro estéril. Filtros estériles adecuados incluyen filtros de 0,22 \mum, tal como un filtro Sartorius Sartobran Cat # 5232507 G1PH.

En una realización preferida, se desechan el primer 3% a 4% del eluato de Hb y el último 3% a 4% del eluato para garantizar la pureza del eluato de Hb.

Cuando se van a reutilizar las columnas cromatográficas, entonces se eluyen las proteínas contaminantes diferentes a la hemoglobina y las endotoxinas, que permanecen en las columnas, usando un cuarto tampón.

En la Patente de EE.UU. Nº 5.691.452, archivada el 7 de Junio de 1995, se describe el uso de gradientes de pH para separar Hb de contaminantes diferentes a la hemoglobina.

En una realización preferida, el primer tampón es una solución de tris-hidroximetil-aminometano (Tris) (concentración de aproximadamente 20 mM; pH de aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4). El segundo tampón es una mezcla del primer tampón y del tercer tampón, teniendo dicho segundo tampón un pH de aproximadamente 8,2 a aproximadamente 8,6. El tercer tampón es una solución Tris (concentración de aproximadamente 50 mM; pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5). El cuarto tampón es una solución de NaCl/Tris (concentraciones de aproximadamente 1,0 M de NaCl y aproximadamente 20 mM de Tris; pH de aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4, preferiblemente aproximadamente 8,9-9,1). Particularmente, se prefiere que el pH del segundo tampón esté entre valores de aproximadamente 8,2 y aproximadamente 8,4.

Típicamente, los tampones usados están a una temperatura entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 50ºC. Preferiblemente, la temperatura del tampón es aproximadamente 12,4 \pm 1,0ºC durante su uso. Además, los tampones se almacenan típicamente a una temperatura de aproximadamente 9ºC a aproximadamente 11ºC.

Después, el eluato de Hb se desoxigena preferiblemente antes de la polimerización para formar una solución de Hb desoxigenada (en adelante desoxi-Hb) por medios con los que se desoxigena sustancialmente la Hb sin reducir de forma significativa la capacidad de dicha Hb en el eluato de Hb para transportar y liberar oxígeno, tal como ocurriría de la desnaturalización de la formación de hemoglobina oxidada (metHb).

En una realización, el eluato de Hb se desoxigena mediante transferencia de gases de un gas inerte a través de una membrana de fases. Dichos gases inertes incluyen, por ejemplo, nitrógeno, argón y helio. Se entiende que se pueden usar otros medios para desoxigenar una solución de hemoglobina, los cuales son conocidos en la técnica, para desoxigenar el eluato de Hb. Dichos otros medios, pueden incluir, por ejemplo, burbujeo con nitrógeno del eluato de Hb, eliminación química con agentes reductores tales como N-acetil-L-cisteína (NAC), cisteína, ditionito o ascorbato sódico, o fotólisis por luz.

Después de la elución desde la columna cromatográfica, el eluato de Hb se concentra preferiblemente para mejorar la eficiencia del procedimiento. El eluato de Hb se hace recircular a través de un ultrafiltro para concentrar dicho eluato de Hb para formar una solución concentrada de Hb. Ultrafiltros adecuados incluyen, por ejemplo, ultrafiltros de 30.000 Daltons o menos (por ejemplo, Millipore Helicon, Cat # CDUF050G1 o Amicon Cat # 540430). Típicamente, la concentración del eluato de Hb se completa cuando dicha concentración de Hb está entre aproximadamente 100 y aproximadamente 120 g/l. Mientras se concentra el eluato de Hb, la temperatura de dicho eluato se mantiene preferiblemente a un valor de aproximadamente 8-12ºC.

Luego se añade tampón a la solución de Hb, el cual está preferiblemente concentrado, para ajustar la fuerza iónica de la solución de Hb con el fin de mejorar la desoxigenación de la Hb. Se prefiere ajustar la fuerza iónica a valores entre aproximadamente 150 meq/l y aproximadamente 200 meq/l para reducir la afinidad al oxígeno de la Hb en la solución de Hb. Tampones adecuados incluyen tampones con un pH que no ocasionará una desnaturalización significativa de la proteína de Hb pero que tendrán una fuerza iónica suficientemente alta para promover la desoxigenación de la Hb. Ejemplos de tampones adecuados incluyen soluciones salinas con un intervalo de pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,9. Un tampón preferido es una solución acuosa de NaCl 1,0 M, Tris 20 mM, con un pH de aproximadamente 8,9.

Preferiblemente, la solución de Hb tamponada resultante se hace recircular luego a través del ultrafiltro, para concentrar nuevamente la solución de Hb con el fin de mejorar la eficiencia del procedimiento. En una realización preferida, la etapa concentración se completa cuando la concentración de Hb es de aproximadamente 100 g/l a aproximadamente 120 g/l.

Durante la desoxigenación, la solución de Hb se hace recircular a través de una membrana de transferencia de fases adecuada. Membranas de transferencia de fases apropiadas incluyen, por ejemplo, un microfiltro de fibras huecas de polipropileno de 0,05 \mum (por ejemplo, Hoechst-Celanese Cat # 5PCM-107). Simultáneamente, se hace pasar en sentido contrario un flujo de un gas inerte a través de la membrana de transferencia de fases. Gases inertes adecuados incluyen por ejemplo, nitrógeno, argón y helio. De este modo, mediante el intercambio de gases a través de la membrana de transferencia de fases se retira oxígeno de la solución de Hb.

La desoxigenación continúa hasta que la pO_{2} de la solución de Hb se reduce a un nivel en el que el contenido de Hb oxigenada (oxihemoglobina o HbO_{2}) en la solución de Hb es aproximadamente 20% o inferior. En una realización preferida, el contenido de HbO_{2} en la solución de Hb es aproximadamente 10% o inferior.

Durante la desoxigenación, la temperatura de la solución de Hb se mantiene típicamente a un valor en el que se equilibrará el ritmo de desoxigenación con el ritmo de formación de metemoglobina. Se mantiene la temperatura para limitar el contenido de metemoglobina a un valor inferior a 20%. Una temperatura óptima dará lugar a un contenido de metemoglobina inferior a aproximadamente 5%, y preferiblemente un contenido de metemoglobina inferior a aproximadamente 2,5%, mientras que todavía se desoxigena la solución de Hb. Típicamente, durante la desoxigenación la temperatura de la solución de Hb se mantiene entre aproximadamente 19ºC y aproximadamente 31ºC.

Durante la desoxigenación, y posteriormente durante todas las etapas restantes del método de la invención, la Hb se mantiene en un medio ambiente con bajo contenido en oxígeno para minimizar la absorción de oxígeno por la Hb y mantener un contenido de HbO_{2} inferior a aproximadamente 20%, preferiblemente inferior a aproximadamente 10%.

La Hb desoxigenada, se mantiene luego en equilibrio preferiblemente con un tampón de almacenamiento con un bajo contenido de oxígeno, que contiene un compuesto de sulfidrilo, para formar una desoxi-Hb estabilizada para la oxidación. Compuestos de sulfhidrilo adecuados incluyen agentes reductores no tóxicos, tales como N-acetil-L-cisteína (NAC), D,L-cisteína, \gamma-glutamil-cisteína, glutationa, 2,3-dimercapto-1-propanol, 1,4-butanoditiol, tioglicolato, y otros compuestos de sulfhidrilo biológicamente compatibles. El contenido de oxígeno de un tampón de almacenamiento con bajo contenido en oxígeno deber ser lo suficientemente bajo para no reducir de forma significativa la concentración de compuesto de sulfhidrilo en el tampón y para limitar el contenido de oxihemoglobina en la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación a un valor de aproximadamente 20% o inferior, preferiblemente inferior a aproximadamente 10%. Típicamente, el tampón de almacenamiento tienen una pO_{2} inferior a aproximadamente 50 torr.

En una realización preferida, el tampón de almacenamiento ha de tener un pH adecuado para equilibrar la polimerización de Hb y la formación de metemoglobina, típicamente entre aproximadamente 7,6 y aproximadamente 7,9.

La cantidad de un compuesto de sulfhidrilo mezclada con la desoxi-Hb es una cantidad suficientemente alta para aumentar la reticulación intramolecular de la Hb durante la polimerización y suficientemente baja para no disminuir de forma significativa la reticulación intermolecular de las moléculas de Hb, debido a una alta fuerza iónica. Típicamente, se necesita aproximadamente un mol de grupos funcionales sulfhidrilo (-SH) para estabilizar para la oxidación entre aproximadamente 0,25 moles a aproximadamente 5 moles de desoxi-Hb.

En una realización preferida, el tampón de almacenamiento contiene un tampón de fosfato sódico de aproximadamente 25-35 mM (pH 7,7-7,8) y contiene una cantidad de NAC tal que la concentración de NAC en la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación esté entre aproximadamente 0,003% y aproximadamente 0,3% en peso. Más preferiblemente, la concentración de NAC en la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación está entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,2% en peso.

Preferiblemente, el tampón de almacenamiento se filtra antes de mezclarlo con la desoxi-Hb, tal como a través de una membrana de ultrafiltración de 10.000 Daltons (Millipore Helicon Cat # CDUF050G1 ó A/G Technology Maxcell Cat # UFP-10-C-75).

En una realización, la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación se hace fluir luego a través de un filtro opcional. Filtros adecuados incluyen un prefiltro de polipropileno de 0,2 \mum y un microfiltro estéril de 0,5 \mum (Pall Profile II, Cat # ABIY005Z7 o Gelman Supor). La desoxi-Hb se mantiene bajo una atmósfera sustancialmente libre de oxígeno. Esto se puede realizar, por ejemplo, purgando y rodeando con una atmósfera inerte el aparato del procedimiento con un gas inerte, tal como nitrógeno, antes y después de llenarlo con desoxi-Hb estabilizada para la oxidación.

Opcionalmente, antes de transferir la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación para realizar la polimerización, se añade una cantidad apropiada de agua al reactor de polimerización. En una realización, una cantidad apropiada de agua es la cantidad que daría lugar a una solución con una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 g/l de Hb cuando se añade la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación al reactor de polimerización. Preferiblemente el agua está empobrecida de oxígeno.

Después reducir la pO_{2} del agua en la etapa de polimerización a un nivel suficiente para limitar el contenido de HbO_{2} a un valor de aproximadamente 20%, típicamente menos de aproximadamente 50 torr, el reactor de polimerización se rodea con una atmósfera inerte utilizando un gas inerte, tal como nitrógeno. Luego se introduce la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación en el reactor de polimerización, el cual se rodea simultáneamente con una atmósfera inerte utilizando un flujo apropiado de un gas inerte.

La temperatura de la solución de desoxi-Hb estabilizada para la oxidación en el reactor de polimerización se eleva hasta una temperatura adecuada para optimizar la polimerización de la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación cuando se pone en contacto con un agente de reticulación. Típicamente, la temperatura de la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación es de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 45ºC, y preferiblemente de aproximadamente 41ºC a aproximadamente 43ºC durante toda la polimerización. Un ejemplo de uno medio de transferencia de calor aceptable para calentar el reactor de polimerización es un sistema de calentamiento con camisa calefactora que se calienta dirigiendo etilenglicol caliente a través de la camisa calefactora.

La desoxi-Hb estabilizada para la oxidación se expone luego a un agente de reticulación adecuado a una temperatura suficiente para polimerizar la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación para formar una solución de hemoglobina polimerizada (poli(Hb)) durante un periodo de tiempo de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 6 horas.

Ejemplos de agentes de reticulación adecuados incluyen agentes polifuncionales que reticularán proteínas de Hb, tales como glutaraldehído, succindialdehido, formas activadas de polioxietileno y dextrano, \alpha-hidroxi-aldehídos, tales como glicolaldehído, éster de N-maleimido-6-aminocaproil-(2'-nitro,4'-ácido sulfónico)-fenilo, éster de ácido m-maleimidobenzoico-N-hidroxisuccinimida, 4-(N-ma-leimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, 4-(yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo, 4-(yodoace-til)-aminobenzoato de sulfosuccinimidilo, 4-(p-maleimido-fenil)butirato de succinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)buti-rato de sulfosuccinimidilo, hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, N,N'-fenilendimaleimida y compuestos pertenecientes al tipo de bis-imidato, el tipo de diazida de acilo o el tipo de dihaluro de arilo, entre otros.

Una cantidad adecuada de un agente de reticulación es la cantidad que permitirá que se produzca reticulación intramolecular para estabilizar la Hb y también reticulación intermolecular para formar polímeros de Hb, con lo que aumenta la retención intravascular. Típicamente, una cantidad adecuada de un agente de reticulación es la cantidad en la que la relación molar de agente de reticulación a Hb está en un exceso de aproximadamente 2:1. Preferiblemente, la relación molar de agente de reticulación a Hb está entre aproximadamente 20:1 a 40:1.

Preferiblemente, la polimerización se realiza en un tampón con un pH entre aproximadamente 7,6 a aproximadamente 7,9, que tiene una concentración de cloruro inferior o igual a aproximadamente 35 mmolar.

En una realización preferida, se añade una cantidad adecuada del agente de reticulación a la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación y luego se mezcla con medios para mezclar con baja cizalladura. Un medio de mezclamiento de baja cizalladura adecuado incluye un mezclador estático. Un mezclador estático adecuado es, por ejemplo, un mezclador estático "Kenics" obtenido de Chemineer, Inc.

En una realización, la recirculación de la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación y el agente de reticulación a través del mezclador estático produce unas condiciones de flujo turbulento con las que se consigue un mezclamiento generalmente uniforme del agente de reticulación con la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación, reduciéndose, de este modo, el potencial para formar bolsas desoxi-Hb que contienen altas concentraciones del agente de reticulación. Un mezclamiento generalmente uniforme del agente de reticulación y de la desoxi-Hb reduce la formación de polímeros de Hb de alto peso molecular, es decir polímeros que tienen un peso molecular de más de 500.000 Daltons, y permite también un mezclamiento más rápido del agente de reticulación y de la desoxi-Hb durante la polimerización. Además, se originará una reticulación intramolecular de Hb significativa durante la polimerización de Hb debido a la presencia de un compuesto de sulfhidrilo, preferiblemente NAC. Aunque no se conoce el mecanismo exacto de la interacción del compuesto de sulfhidrilo con glutaraldehído y/o Hb, se supone que el compuesto de sulfhidrilo afecta a la unión química entre la Hb y el agente de reticulación de tal manera que inhibe, al menos parcialmente, la formación de polímeros de de Hb de alto peso molecular y forma preferiblemente Hb tetrámera estabilizada.

Se dice que la poli(Hb) tiene una reticulación intramolecular significativa si una parte sustancial (por ejemplo, al menos aproximadamente 50%) de las moléculas de Hb están unidas químicamente en la poli(Hb), y sólo una pequeña cantidad, tal como menos de aproximadamente 15%, están contenidas dentro de las cadenas de hemoglobina polimerizada de alto peso molecular. Las moléculas de poli(Hb) de alto peso molecular son moléculas, por ejemplo, con un peso molecular superior a aproximadamente 500.000 Daltons.

En una realización preferida, se usa glutaraldehído como el agente de reticulación. Típicamente, se usan aproximadamente 10 a aproximadamente 70 gramos de glutaraldehído por kilogramo de desoxi-Hb estabilizada para la oxidación. Más preferiblemente, se añade glutaraldehído durante un período de cinco horas hasta añadir aproximadamente 29-31 gramos de glutaraldehído por cada kilogramo de desoxi-Hb estabilizada para la oxidación.

Después de la polimerización, la temperatura de la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización se reduce típicamente hasta un valor de aproximadamente 15ºC a aproximadamente 25ºC.

Cuando el agente de reticulación usado no es un aldehído, la poli(Hb) formada es generalmente una poli(Hb) estable. Cuando el agente de reticulación usado es un aldehído, la poli(Hb) formada generalmente no es estable hasta que se mezcla con un agente reductor adecuado para reducir los enlaces menos estables en la poli(HB) para formar enlaces más estables. Ejemplos de agentes reductores adecuados incluyen borohidruro sódico, cianoborohidruro sódico, ditionito sódico, trimetilamina, t-butilamina, morfolina-borano y piridina-borano. Antes de añadir el agente reductor, la solución de poli(Hb) se concentra opcionalmente mediante ultrafiltración hasta que la concentración de la solución de poli(Hb) aumenta a un valor entre aproximadamente 75 y aproximadamente 85 g/l. Un ejemplo de un ultrafiltro adecuado es un filtro de 30.000 Daltons (por ejemplo, Millipore Helicon, Cat # CDUF050LT y Amicon, Cat # 540430).

Luego se ajusta el pH de la solución de poli(Hb) al intervalo de pH alcalinos para conservar el agente reductor y evitar la formación de gas hidrógeno, que puede desnaturalizar la Hb durante la reducción posterior. En una realización, se ajusta el pH a un valor superior a 10. El pH se puede ajustar añadiendo una solución tampón a la solución de poli(Hb) durante o después de la polimerización. La poli(Hb) se purifica típicamente para retirar la hemoglobina no polimerizada. Esto se puede realizar mediante filtración por diálisis o cromatografía en hidroxiapatito (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.691.453, la cual se incorpora en esta memoria como referencia).

Después del ajuste de pH, se añade al menos un agente reductor, preferiblemente una solución de borohidruro sódico, en la etapa de polimerización típicamente durante el ciclo de desoxigenación. Típicamente, se añaden de aproximadamente 5 a aproximadamente 18 moles de agente reductor por mol de tetrámero de Hb (por 64.000 Daltons de Hb) en la poli(Hb). En una realización preferida, por cada nueve litros de solución de poli(Hb) en el subsistema de polimerización 98 se añade un litro de borohidruro sódico 0,25 M a un caudal de 0,1 a 0,12 lpm.

El pH y los electrólitos de la poli(Hb) estable pueden ser entonces restituidos hasta niveles fisiológicos para formar un sustituto de sangre estable a base de hemoglobina polimerizada y, filtrando por diálisis la poli(Hb) estable con una solución de filtración por diálisis que tiene un pH adecuado y niveles de electrólitos fisiológicos. Preferiblemente, la solución de filtración por diálisis es una solución tampón.

Cuando la poli(Hb) se redujo mediante un agente reductor, la solución de filtración por diálisis tiene un pH ácido, preferiblemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6.

Se puede añadir también a la poli(Hb) estable un compuesto de sulfhidrilo que no sea tóxico como un eliminador de oxígeno para mejorar la estabilidad del sustituto de sangre a base de hemoglobina polimerizada acabado. El compuesto de sulfhidrilo se puede añadir como parte de la solución de filtración por diálisis y/o se puede añadir separadamente. Se añade una cantidad de compuesto de sulfhidrilo para establecer una concentración de sulfhidrilo que eliminará el oxígeno para mantener el contenido de metemoglobina en un valor inferior a aproximadamente 15% durante el periodo de almacenamiento. Preferiblemente, el compuesto de sulfhidrilo es NAC. Típicamente, la cantidad de compuesto de sulfhidrilo añadida es una cantidad suficiente para establecer una concentración de sulfhidrilo entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,2% en peso.

En una realización preferida, el sustituto de sangre se envasa en condiciones de manipulación asépticas mientras se mantiene la presión con una atmósfera inerte sustancialmente libre de oxígeno, en el reactor de polimerización y en el aparato de transporte restante.

En la Tabla 1 se proporcionan las especificaciones para un sustituto de sangre estable a base de hemoglobina polimerizada formado mediante el método de la invención.

TABLA I

1

El sustituto de sangre estable luego se almacena en un recipiente de almacenamiento a corto plazo o en recipientes de almacenamiento estériles, teniendo cada uno un medio ambiente con bajo contenido en oxígeno como se describió con detalle anteriormente. El recipiente de almacenamiento ha de ser también suficientemente impermeable al paso de vapor de agua para evitar que se produzca una concentración significativa del sustituto de sangre por evaporación durante el periodo de almacenamiento. Una concentración significativa del sustituto de sangre es la concentración que hace que uno o más parámetros del sustituto de sangre se salga muy fuera de la especificación.

En la Patente de EE.UU. Nº 5.296.465 se describe adicionalmente la síntesis de un sustituto de sangre estable a base de hemoglobina polimerizada, formado según el método de la invención.

Vertebrados que puede recibir el sustituto de sangre, formado mediante los métodos de la invención, incluyen mamíferos, tales como seres humanos, primates no humanos, un perro, un gato, una rata, un caballo o una oveja. Además, vertebrados, que pueden recibir dicho sustituto de sangre, incluyen fetos (vertebrados prenatales), vertebrados post-natales, o vertebrados en el momento del nacimiento.

Se puede administrar un sustituto de sangre de la presente invención en el sistema circulatorio inyectando dicho sustituto de sangre directamente o indirectamente en el sistema circulatorio del vertebrado, mediante uno o más métodos de inyección. Ejemplos de métodos de inyección directos incluyen inyecciones intravasculares, tales como inyecciones intravenosas e intrarteriales, e inyecciones intracardíacas. Ejemplos de métodos de inyecciones indirectos incluyen inyecciones intraperitoneales, inyecciones subcutáneas, de manera que el sustituto de sangre será transportado por el sistema linfático al interior del sistema circulatorio o inyecciones en el tuétano de los huesos por medio de un "trocar" o catéter. Preferiblemente, el sustituto de sangre se administra por vía intravenosa.

El vertebrado que se trata puede ser normovolémico, hipervolémico o hipovolémico antes, durante y/o después de la infusión del sustituto de sangre. El sustituto de sangre se puede introducir en el sistema circulatorio por métodos tales como carga superior o de métodos de intercambio.

Se puede administrar terapéuticamente un sustituto de sangre para tratar tejido hipóxico en un vertebrado producido por muchas causas diferentes incluyendo flujo de GR reducido en una parte del sistema circulatorio o en todo el sistema circulatorio, anemia y choque. Además, el sustituto de sangre se pueda administrar profilácticamente para evitar el empobrecimiento de oxígeno en el tejido del vertebrado, lo que podría ser causado por una reducción posible o esperada en el flujo de GR hacia un tejido o en todo el sistema circulatorio del vertebrado. En la solicitud de Patente de EE.UU. pendiente de trámite Nº de Serie 08/409.337, archivada el 23 de Marzo de 1995, la cual se incorpora en esta memoria en su totalidad como referencia, se proporciona una discusión adicional sobre la administración de hemoglobina para tratar terapéutica o profilácticamente hipoxia, particularmente debido a una obstrucción parcial de arterias o a un bloqueo parcial de la microcirculación, y las dosis usadas en esos casos.

Típicamente, una dosis o combinación de dosis del sustituto de sangre adecuada, es una cantidad que cuando está contenida dentro del plasma sanguíneo dará lugar a una concentración total de hemoglobina en la sangre del vertebrado entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 gramos de Hb/dl, o más, si se requiere para compensar pérdidas de sangre de gran volumen.

La invención se describirá ahora adicional y específicamente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Síntesis de sustituto de sangre estable a base de hemoglobina polimerizada

Como se describió en la Patente de EE.UU. Nº 5.296.465, se recogieron muestras de sangre íntegra de bovinos, y se mezclaron con un anticoagulante de citrato sódico para formar una solución de sangre.

Cada muestra de solución de sangre se mantuvo después de la recogida a una temperatura de aproximadamente 2ºC y luego se coló para retirar agregados y partículas grandes con un tamiz de malla 600.

Antes de reunirlas, se analizó el nivel de penicilina en cada muestra de solución de sangre con un kit de análisis comprado a Difco, Detroit, Michigan que usaba el método titulado "Rapid Detection of Penicillin in Milk" para asegurarse de que los niveles de penicilina en las soluciones de sangre eran < 0,008 unidades/ml.

Luego se reunieron las muestras de solución de sangre y se mezclaron con solución acuosa de citrato sódico despirogenada para formar una solución de citrato sódico en sangre íntegra de bovino al 0,2% en peso (en adelante "solución de citrato sódico en sangre al 0,2%").

La solución de citrato sódico en sangre al 0,2% se hizo pasar luego, a través de filtros, en serie, de polipropileno de 800 \mum y 50 \mum para retirar los desechos grandes de la solución de sangre de un diámetro de aproximadamente 50 \mum o más.

Después, se lavaron los GR para separar las proteínas plasmáticas extracelulares, tales como BSA o IgG, de los GR. Para lavar los GR contenidos en la solución de sangre, se diluyó inicialmente el volumen de solución de sangre en el tanque de filtración por diálisis añadiendo un volumen igual de una solución isotónica filtrada a dicho tanque de filtración por diálisis. La solución isotónica se filtró con una membrana de ultrafiltración de 10.000 Daltons Millipore (Cat# CDUF 050 G1). La solución isotónica estaba compuesta de 6,0 g/l de dihidrato de citrato sódico y 8,0 g/l de cloruro sódico en agua para inyección (WFI).

La solución de sangre diluida se concentró luego hasta volver a su volumen original mediante filtración por diálisis a través de un filtro de diálisis de fibras huecas de 0,2 \mum (cartucho de microfiltración Microgon Krosflo II). Simultáneamente, se añadió continuamente solución isotónica filtrada, como apotación, a una velocidad igual a la velocidad de la pérdida de filtrado a través del filtro de diálisis de 0,2 \mum. Durante la filtración por diálisis, los componentes de la solución de sangre diluida que tenían un diámetro significativamente más pequeño de los GR, o que son fluidos tales como el plasma, pasaron a través de las paredes del filtro de diálisis de 0,2 \mum con el filtrado. Los GR, las plaquetas y los cuerpos más grandes de la solución de sangre diluida, tales como glóbulos blancos, quedaron retenidos con la solución isotónica añadida continuamente para formar una solución de sangre dializada.

Durante el lavado de GR, la solución de sangre diluida se mantuvo a una temperatura entre aproximadamente 10 a 25ºC con una presión de fluido a la entrada del filtro de diálisis entre aproximadamente 172,37 kPa y aproximadamente 206,84 kPa para mejorar la eficiencia del procedimiento.

El lavado de GR se completó cuando el volumen de filtrado drenado desde el filtro de diálisis era igual a aproximadamente 600% del volumen de solución de sangre antes de diluirla con solución isotónica filtrada.

La solución de sangre dializada luego se bombeó continuamente a un caudal de aproximadamente 4 lpm hacia una Super Centrífuga Sharples, Modelo # AS-16, fijada con un cierre en forma de anillo de #28. La centrífuga se dejaba operar mientras era alimentada simultáneamente con solución de sangre dializada, para separar los GR de los glóbulos blancos y las plaquetas. Durante la operación, la centrífuga giraba a una velocidad suficiente para separar los GR en una fase pesada de GR, separándose también mientras una parte sustancial de los glóbulos blancos (GB) y plaquetas en una fase ligera de GB, específicamente aproximadamente 15.000 rpm. Se descargaron separada y continuamente una fracción de la fase de GR y de la fase de GB de la centrífuga durante la operación.

Después de separar los GR, dichos GR se lisaron para formar una solución que contiene hemoglobina. Una parte sustancial de los GR se lisaban mecánicamente a medida que dichos GR se descargaban de la centrífuga. Las membranas celulares de los GR se rompían al impactar con la pared del conducto de descarga de la fase GR a cierto ángulo con respecto al flujo de la fase de GR que sale de la centrífuga, con lo que se liberaba la hemoglobina (Hb) procedente de los GR en la Fase de GR.

La fase de GR lisados se hizo fluir luego a través del conducto de descarga de fase de GR hacia el interior de un mezclador estático (Kenics 1,27 cm con 6 elementos, Chemineer, Inc.). Simultáneamente a la transferencia de la fase de GR al mezclador estático, se inyectó también una cantidad igual de WFI en el mezclador estático, en el que el WFI se mezcló con la fase de GR. Los caudales de la fase de GR y del WFI en el mezclador estático son cada uno de aproximadamente 0,25 lpm.

Al mezclar la fase de GR con WFI en el mezclador estático se produjo un coloide de GR lisados. El coloide de GR lisados se transfirió luego desde el mezclador estático al interior de una Super Centrífuga Sharples (Modelo # AS-16, División Sharples de Alfa-Laval Separation, Inc.), la cual era adecuada para separar la Hb de los componentes de los GR diferentes a la hemoglobina. La centrífuga se hizo girar a una velocidad suficiente para separar el coloide de GR lisados en una fase ligera de Hb y una fase pesada. La fase ligera estaba compuesta de Hb y contenía también componentes diferentes a la hemoglobina con una densidad aproximadamente igual o inferior a la densidad de la Hb.

La fase de Hb se descargó continuamente de la centrífuga, a través de un microfiltro de 0,45 \mum Millipore Pellicon Cassette, Cat # HVLP 000 C5, y se introdujo en un tanque de retención para la preparación de la purificación de la Hb. Los estromas celulares se devolvieron luego junto con el producto retenido desde el microfiltro al tanque de retención. Durante la microfiltración, se mantuvo la temperatura dentro del tanque de retención a un valor de 10ºC o inferior. Para mejorar la eficiencia, se finalizaba la microfiltración cuando la presión de fluido a la entrada del microfiltro aumentaba desde una presión inicial de aproximadamente 68,95 kPa hasta aproximadamente 172,37 kPa. El microfiltrado de Hb se transfirió luego desde el microfiltro al interior del tanque de microfiltrado.

Posteriormente, el microfiltrado de Hb se bombeó a través de un ultrafiltro de 100.000 Daltons Millipore Cat# CDUF 050 H1. Una parte sustancial de la Hb y el agua, contenida en el microfiltrado de Hb, atravesó el ultrafiltro de 100.000 Daltons para formar un ultrafiltrado de Hb, mientras que los desechos celulares más grandes, tales como proteínas con un peso molecular superior a aproximadamente 100.000 Daltons, quedaron retenidos y se hicieron recircular de vuelta al interior del tanque de microfiltrado. Simultáneamente, se añadió continuamente WFI al tanque de microfiltrado para compensar la perdida de agua en el ultrafiltrado. Generalmente, los desechos celulares incluyen todos los componentes celulares enteros y fragmentados excepto la Hb, proteínas celulares más pequeñas, electrólitos, coenzimas y compuestos intermedios metabólicos orgánicos. La ultrafiltración continuó hasta que la concentración de Hb en el tanque de microfiltrado era inferior a 8 gramos/litro (g/l). Mientras se sometía la Hb a ultrafiltración, la temperatura interna del tanque de microfiltrado se mantuvo a un valor de aproximadamente
10ºC.

El ultrafiltrado de Hb se transfirió al interior de un tanque de ultrafiltrado, en el que dicho ultrafiltrado de Hb se hizo recircular luego a través de un ultrafiltro Millipore Cat # CDUF 050 T1 de 30.000 Daltons para retirar los componentes celulares más pequeños, tales como electrólitos, coenzimas, compuestos intermedios metabólicos y proteínas con un peso molecular inferior a aproximadamente 30.000 Daltons, y agua del ultrafiltrado de Hb, formándose, de este modo, una solución concentrada de Hb que contiene aproximadamente 100 g de Hb/l.

La solución concentrada de Hb se trasladó luego desde el tanque de ultrafiltrado al medio contenido en columnas cromatográficas paralelas (60,96 de longitud con un diámetro interno de 20,32 cm) para separar la Hb mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. Las columnas cromatográficas contenían un medio de intercambio aniónico adecuado para separar Hb de proteínas diferentes a la hemoglobina. EL medio de intercambio aniónico se formó a partir de gel de sílice. El gel de sílice se expuso a \gamma-glicidoxi-propilsilano para formar grupos epoxídicos activos y luego se expuso a C_{3}H_{7}(CH_{3})NCl para formar un medio de intercambio aniónico de amonio cuaternario. Este método de tratar gel de sílice se describe en la Journal of Chromatography, 120:321-333 (1976).

Cada columna se trató previamente lavando abundantemente las columnas cromatográficas con un primer tampón el cual facilitaba la unión de la Hb. Luego se inyectaron en cada columna cromatográfica 4,52 litros de la solución concentrada de Hb. Después de inyectar la solución concentrada de Hb, las columnas cromatográficas se lavaron luego introduciendo sucesivamente tres tampones diferentes a través de las columnas cromatográficas para producir un eluato de Hb, produciendo un gradiente de pH en el interior de las columnas. La temperatura de cada tampón durante su uso era aproximadamente 12,4ºC. Los tampones se filtraron previamente a través de una membrana de ultrafiltración de 10.000 Daltons antes de inyectarlos sobre las columnas cromatográficas.

El primer tampón, tris-hidroximetil-aminometano (Tris) 20 mM (pH de aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4), transportaba la solución concentrada de Hb dentro del medio en las columnas cromatográficas para unir la Hb. Con el segundo tampón, una mezcla del primer tampón y el tercer tampón, teniendo dicho segundo tampón un pH de aproximadamente 8,3, se ajustó luego el pH dentro de las columnas cromatográficas para eluir componentes contaminantes diferentes a la hemoglobina desde las columnas cromatográficas, mientras quedaba retenida la Hb. Continuó manteniéndose el equilibrio con el segundo tampón durante aproximadamente 30 minutos a un caudal de aproximadamente 3,56 lpm por columna. Se descartó el eluato procedente del segundo tampón para desecharlo. Con el tercer tampón, solución tris 50 mM (pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5) se eluyó luego la Hb desde las columnas cromatográficas.

El eluato de Hb se dirigió luego a través de un filtro estéril de 0,22 \mum Sartobran Cat # 5232507 G1PH hasta un tanque en el que se recogió el eluato de Hb. Se desecharon el primer 3% a 4% del eluato de Hb y el último 3% a 4% del eluato de Hb.

El eluato de Hb se usó adicionalmente, si dicho eluato contenía menos de 0,05 UE/ml de endotoxina y contenía menos de 3,3 nmoles/ml de fosfolípidos. Se añadieron a sesenta litros de eluato ultrapuro, que tenía una concentración de 100 g de Hb/l, 9 l de tampón de NaCl 1,0 M, solución Tris 20 mM (pH 8,9), formándose, de este modo, una solución de Hb con una fuerza iónica de 160 mM, para reducir la afinidad al oxígeno de la Hb en la solución de Hb. Luego se concentró la solución de Hb a una temperatura de 10ºC, haciéndola recircular a través del ultrafiltro, específicamente un filtro Millipore Helicon, Cat # CDUF050G1 de 10.000 Daltons, hasta que la concentración de Hb era
110 g/l.

Después se desoxigenó la solución de Hb, hasta que la pO_{2} de la solución de Hb se redujo hasta el nivel en el que el contenido de HbO_{2} era aproximadamente 10%, haciendo recircular la solución de Hb a 12 lpm, a través de una membrana de transferencia de fases de microfiltro de polipropileno de 0,05 \mum de Hoechst-Celanese Corporation Cat # G-240/40 de, para formar una solución de Hb desoxigenada (en adelante "desoxi-Hb"). Simultáneamente, se dirigía gas nitrógeno a un caudal de 60 lpm a través del lado contrario de la membrana de transferencia de fases. Durante la desoxigenación, la temperatura de la solución de Hb se mantuvo entre aproximadamente 19ºC y aproximadamente 31ºC.

También durante la desoxigenación, y posteriormente durante todo el procedimiento, la Hb se mantuvo en un medio ambiente con bajo contenido de oxígeno para minimizar la absorción de oxígeno por la Hb y mantener un contenido de Hb oxigenada (oxihemoglobina o HbO_{2}) inferior a aproximadamente 10% en la desoxi-Hb.

La desoxi-Hb (60 litros) se filtró luego por diálisis a través de un ultrafiltro con 180 l de un tampón de almacenamiento, que contenía 0,2% en peso de N-acetil-L-cisteína, tampón de fosfato sódico 33 mM (pH 7,8) que tenía una pO_{2} inferior a 50 torr, para formar una desoxi-Hb estabilizada para la oxidación. Antes de mezclarlo con la desoxi-Hb, el tampón de almacenamiento se despirogenó con un filtro de despirogenización Millipore Helicon, Cat # CDUF050G1 de 10.000 Daltons.

Se añadió continuamente el tampón de almacenamiento a un ritmo aproximadamente equivalente a la pérdida de fluido a través del ultrafiltro. La filtración por diálisis continuó hasta que el volumen de fluido perdido por filtración por diálisis a través del ultrafiltro era aproximadamente tres veces el volumen inicial de la desoxi-Hb.

Antes de transferir la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación al interior de un aparato de polimerización, se añadió WFI empobrecida en oxígeno para purgar dicho aparato de polimerización de oxígeno con el fin de evitar la oxigenación de la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación. La cantidad de WFI añadida al aparato de polimerización era la cantidad que daría lugar a una solución de Hb con una concentración de aproximadamente 40 g de Hb/l, cuando se añadió la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación al reactor de polimerización. El WFI se hizo recircular luego por todo el aparato de polimerización, para desoxigenar el WFI haciéndola fluir a través de una membrana de transferencia de fases de microfiltro de polipropileno de 0,05 \mum (Hoechst-Celanese Corporation Cat # 5PCM.108, 7,43 m^{2}) en sentido contrario a un flujo de nitrógeno presurizado. Los caudales de WFI y gas nitrógeno, a través de la membrana de transferencia de fases, eran aproximadamente 10 a 20 lpm y 40 a 60 lpm, respectivamente.

Después de que la pO_{2} del WFI en el aparato de polimerización se redujo a un valor inferior a aproximadamente 2 torr de pO_{2}, el reactor de polimerización se rodeó con una atmósfera inerte de nitrógeno introduciendo un flujo de aproximadamente 20 lpm de nitrógeno en el interior de la parte superior del reactor de polimerización. La desoxi-Hb estabilizada para la oxidación se transfirió luego al interior del reactor de polimerización.

La polimerización se realizó en un tampón de fosfato de 12 mM con un pH de 7,8, que tenía una concentración de cloruro inferior o igual a aproximadamente 35 mmolar.

La desoxi-Hb estabilizada para la oxidación y la N-acetil-cisteína posteriormente se mezclaron lentamente con el agente de reticulación glutaraldehído, específicamente 29,4 gramos de glutaraldehído por cada kilogramo de Hb durante un período de cinco horas, mientras se calentaba a 40ºC y se hacía recircular la solución de Hb a través de un mezclador estático de 1,27 cm Kenics con 6 elementos (Chemineer, Inc), para formar la solución de Hb polimerizada (poli(Hb)).

La recirculación de la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación y el glutaraldehído a través del mezclador estático produjo unas condiciones de flujo turbulento mezclando en general uniformemente el glutaraldehído con la desoxi-Hb estabilizada para la oxidación, con lo que se redujo la capacidad para formar bolsas de desoxi-Hb que contienen altas concentraciones de glutaraldehído. Generalmente, el mezclamiento uniforme de glutaraldehído y desoxi-Hb redujo la formación de poli(Hb) de alto peso molecular (que tiene un peso molecular superior a 500.000 Daltons) y también permitió un mezclamiento más rápido de glutaraldehído y desoxi-Hb durante la polimerización.

Además, se produjo una reticulación intramolecular de Hb significativa durante la polimerización de Hb como efecto de la presencia de N-acetil-cisteína durante la polimerización de Hb.

Después de la polimerización, la temperatura de la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización se redujo a una temperatura entre aproximadamente 15ºC a aproximadamente 25ºC.

Después, se concentró la solución de poli(Hb) haciendo recircular dicha solución de poli(Hb) a través del ultrafiltro hasta que se aumentó la concentración de la poli(Hb) a un valor de aproximadamente 85 g/l. Un ultrafiltro adecuado es un filtro de 30.000 Daltons (por ejemplo, Millipore Helicon, Cat # CDUF050LT).

Posteriormente, la solución de poli(Hb) se mezcló después con 66,75 g de borohidruro sódico y se hizo recircular nuevamente a través del mezclador estático. Específicamente, por cada nueve litros de solución de poli(Hb) se añadió un litro de solución de borohidruro sódico 0,25 M a un caudal de 0,1 a 0,12 lpm.

Antes de añadir el borohidruro sódico a la solución de poli(Hb), se basificó el pH de dicha solución de poli(Hb) ajustando el pH a un valor de aproximadamente 10 para conservar el borohidruro sódico y evitar la formación de gas hidrógeno. Se ajustó el pH de la solución de poli(Hb) sometiendo la solución de poli(Hb) a filtración por diálisis con aproximadamente 215 l de tampón de borato sódico 12mM despirogenado, desoxigenado, que tenía un pH de aproximadamente 10,4 a aproximadamente 10,6. La solución de poli(Hb) se sometió a filtración por diálisis haciendo recircular dicha solución de poli(Hb) desde el reactor de polimerización a través del ultrafiltro de 30 kD. El tampón de borato sódico se añadió a la solución de poli(Hb) a un ritmo aproximadamente equivalente al ritmo de pérdida de fluido a través del ultrafiltro en la filtración por diálisis. La filtración por diálisis continuó hasta que el volumen de fluido perdido a través del ultrafiltro en la filtración por diálisis era aproximadamente tres veces el volumen inicial de la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización.

Después de ajustar el pH, se añadió solución de borohidruro sódico al reactor de polimerización para reducir los enlaces en la solución de poli(Hb) y formar una poli(Hb) estable en solución. Durante la adición de borohidruro sódico, la solución de poli(Hb) en el reactor de polimerización se hizo recircular continuamente a través del mezclador estático y la membrana de transferencia de fases de microfiltro de polipropileno de 0,05 \mum para retirar el oxígeno e hidrógeno disueltos. El flujo a través de un mezclador estático proporcionaba también unas condiciones de flujo turbulento de borohidruro sódico con las que se que mezclaba rápida y efectivamente el borohidruro sódico con la solución de poli(Hb). Los caudales de la solución de poli(Hb) y el gas nitrógeno a través de la membrana de transferencia de fases de 0,05 \mum eran entre aproximadamente 2,0 y 4,0 lpm y aproximadamente 12 y 18 lpm, respectivamente. Después de completarse la adición de borohidruro sódico, continuó la reducción en el reactor de polimerización mientras que un agitador contenido en dicho reactor giraba a aproximadamente 75 rotaciones por minuto.

Aproximadamente una hora después de añadir borohidruro sódico, la solución de poli(Hb) estable se hizo recircular desde el reactor de polimerización a través del ultrafiltro de 30.000 Daltons hasta que la concentración de la solución de poli(Hb) estable era 110 g/l. Después de la concentración, se restablecieron los valores de pH y electrólitos de la solución de poli(Hb) estable a niveles fisiológicos para formar un sustituto de sangre estable a base de Hb polimerizada, filtrando por diálisis la solución de poli(Hb) estable, a través del ultrafiltro de 30.000 Daltons, con un tampón de pH bajo filtrado y desoxigenado que contenía lactato sódico 27 mM, NAC 12 mM, NaCl 115 mM, KCl 4 mM y CaCl_{2} 1,36 mM en WFI, (pH 5,0). La Filtración por diálisis continuó hasta que el volumen de fluido perdido durante la filtración por diálisis a través del ultrafiltro era aproximadamente 6 veces el volumen de pre-filtración por diálisis del producto de Hb concentrado.

Después de restablecerse los valores de pH y electrólitos a niveles fisiológicos, luego se diluyó el sustituto de sangre estable a base de Hb polimerizada hasta una concentración de 5,0 g/dl añadiendo el tampón de pH bajo filtrado y desoxigenado al reactor de polimerización. El sustituto de sangre diluido se sometió luego a filtración por diálisis haciéndolo recircular desde el reactor de polimerización a través del mezclador estático y un filtro de purificación de 100.000 Daltons en sentido contrario a un tampón filtrado y desoxigenado que contenía lactato sódico 27 mM, NAC 12 mM, NaCl 115 mM, KCl 4 mM y CaCl_{2} 1,36 mM en WFI, (pH 7,8). La filtración por diálisis continuó hasta que el sustituto de sangre contenía una cantidad inferior o igual a aproximadamente el 10% de especies tetrámeras modificadas y tetrámeras no modificadas determinadas mediante GPC cuando se operaba en condiciones de disocia-
ción.

El filtro de purificación operaba en condiciones de baja presión a través de la membrana con un conducto de permeato limitado. Después de retirar cantidades sustanciales de Hb tetrámera modificada y Hb tetrámera no modificada, continuó la recirculación del sustituto de sangre a través del ultrafiltro de 30.000 Daltons hasta que la concentración de dicho sustituto de sangre era aproximadamente 130 g/l.

Después, el sustituto de sangre estable se almacenó en un recipiente adecuado que tenía un medio ambiente con bajo contenido de oxígeno y una baja infiltración de oxígeno.

Ejemplo 2 Almacenamiento del sustituto de sangre a base de hemoglobina: envoltorio de láminas metálicas

El sustituto de sangre a base de hemoglobina, preparado según el Ejemplo 1, envasado en un envase Stericon de 600 ml, se envolvió en un envase de estratificado de láminas metálicas (KAPAK 50303, denominado en adelante como "lámina"), Cryovac BYV200 ó Cryovac P640B. El KAPAK 50303 es un recipiente de estratificado de láminas en el que la capa de láminas es una lámina de aluminio. Cryovac BYV200 es un estratificado que contiene una capa de poli(alcohol vinílico) revestida por ambos lados con Saran de 0,015 milímetros. La permeabilidad al oxígeno de estos dos estratificados es inferior a 0,02 cm^{3} por 645 centímetros cuadrados) por 24 horas por atmósfera a 22ºC y 0% de humedad. Cryovac P640B es un material estratificado que comprende una capa de nilón orientada biaxialmente revestida con Saran de 0,015 mm, una adhesivo y una capa sellante de polietileno de baja densidad. La permeabilidad al oxígeno del material es de aproximadamente 8 a 15 cm^{3} por 645 centímetros cuadrados por 25 horas por atmósfera a 22ºC y 0% de humedad. Los sustitutos de sangre envasados se mantuvieron a temperatura ambiente durante 418 días tomando periódicamente muestras para determinar la concentración y/o los niveles de N-acetil-L-cisteína (NAC), bis-N-acetil-L-cisteína (NAC_{2}), Hb total (THb), hemoglobina oxigenada (HbO_{2}) y metemoglobina (metHb). Los resultados se exponen en la Tabla II.

TABLA II Datos de estabilidad en envoltorios

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El experimento anterior se repitió esencialmente, en el que se envolvió un sustituto de sangre a base de hemoglobina en un envase de estratificado de láminas (KAPAK 50303). Los sustitutos de sangre envasados se mantuvieron a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 meses tomando periódicamente muestras para determinar la concentración y/o niveles de N-acetil-L-cisteína(NAC), bis-N-acetil-L-cisteína (NAC_{2}), Hb total (THb), hemoglobina oxigenada (HbO_{2}) y metemoglobina (metHb). Los resultados se muestran en la Tabla III

TABLA III Datos de estabilidad en envoltorios de láminas metálicas

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Ejemplo 3 Almacenamiento del sustituto de sangre a base de hemoglobina: envase primario

El sustituto de sangre a base de hemoglobina, cómo se preparó en el Ejemplo 1, se envasó en un envase primario barrera para el oxígeno (E-13135 y E13242, American National Can.)La estructura del envase primario se discutió con detalle anteriormente. El envase primario es un material estratificado que comprende una capa de polietileno de densidad media, una capa de copolímero de etileno y alcohol vinílico/nilón, y una capa sellante de polietileno lineal de baja densidad.

Ejemplo 4 Almacenamiento de sustituto de sangre a base de hemoglobina. Sobreenvoltura transparente

El sustituto de sangre a base de hemoglobina, cómo se preparó en el Ejemplo 1, envasado en un envase primario adecuado, se envolvió en un envase de estratificado transparente que comprende una capa de polipropileno, una capa de copolímero de etileno y alcohol vinílico y una capa de polipropileno. Se usó una máquina de envasado automático (Tiromat) para generar los envoltorios. Las permeabilidad al oxígeno del material es aproximadamente 0,00153 cm^{3} por 645 cm^{2} por atmósfera por día (a 25ºC y 100%/50% de HR). El sustituto de sangre envasado se mantuvo a 40ºC y una HR de 100%/60% durante aproximadamente 12 meses y se midieron la concentración y/o los niveles de N-acetil-L-cisteína (NAC), bis-N-acetil-L-cisteína (NAC_{2}), Hb total (THb), hemoglobina oxigenada (HbO_{2}) y metemoglobina (met Hb). Los resultados se muestran en la Tabla IV. El mantenimiento de las muestras a la temperatura elevada de 40ºC durante 12 meses tiene el mismo efecto que el almacenamiento durante 24 meses a 23ºC.

TABLA IV Datos de estabilidad acelerada en envoltorios transparente (EVOH)

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Ejemplo 5 Análisis de hemoglobina polimerizada

Se determina la concentración de endotoxina en el producto de hemoglobina mediante el método "Kinetic/ Turbidimetric LAL 5000 Methodology" desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts, J. Levin et al., J. Lab. Clin. Med., 75:903-911 (1970). Se usaron diversos métodos de ensayos para determinar cualquier traza de estroma, por ejemplo, un ensayo de precipitación, inmunotinción, y ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) para determinar un glicolípido o proteína específica de la membrana celular, conocidos por los expertos en la técnica.

Se determinó el recuento de materia particulada mediante el método de "Particulate Matter in Injections: Large Volumen Injections for Single Dose Infusions", U.S: Pharmacopeia, 22:1596, 1990.

Para determinar la concentración de glutaraldehído, se derivatizó una muestra representativa del producto de hemoglobina de 400 \mul con dinitrofenilhidrazina y se inyectó luego una parte alícuota de 100 \mul de la solución derivatizada en una columna YMC AQ-303 ODS a 27ºC, a un caudal de 1 ml/min, junto con un gradiente. El gradiente consistía en dos fases móviles, ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en agua (TFA) y TFA al 0,08% en acetonitrilo. El flujo de gradiente consistía en un 60% constante de TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 6,0 minutos, un gradiente lineal hasta 85% de TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 12 minutos, un gradiente lineal hasta 100% de TFA al 0,08% en acetonitrilo durante 4 minutos mantenido a 100% de TFA al 0,08% en acetonitirlo durante 2 minutos y un nuevo equilibrio a 45% de TFA al 0,1% en agua. La detección ultravioleta se midió a 360 nm.

Para determinar la concentración de NAC, se diluyó 1:100 una parte alícuota de producto de hemoglobina con fosfato sódico desgasificado en agua y se inyectaron 50 \mul en una columna YMC AQ-303 ODS con un gradiente. Los tampones de gradiente consistían en una solución de fosfato sódico en agua y una mezcla de 80% de acetonitrilo en agua con 0,05% de TFA. El flujo de gradiente consistía en 100% de fosfato sódico en agua durante 15 minutos, luego un gradiente lineal hasta 100% de fosfato sódico en agua durante 15 minutos, luego un gradiente lineal hasta 100% de mezcla de 80% de acetonitrilo y 0,05% de TFA durante 5 minutos, manteniendo la mezcla durante 5 minutos. Después, el sistema se volvió a equilibrar a 100% de fosfato sódico durante 20 minutos.

Se realizó un análisis de fosfolípidos mediante un método basado en los procedimientos contenidos en los dos siguientes artículos: Kolarovic et al., "A Comparison of Extraction Methods for the Isolation of Phospholipids from Biological Sources", Anal. Biochem., 156:244-250, 1986 y Duck-Chong, C.G., "A Rapid Sensitive Method for Determining Phospholipid Phosphorus Involving Digestion With Magnesium Nitrate", Lipids, 14:492-497, 1979.

Se determinó la osmolaridad mediante análisis en un Osmómetro Criomático Avanzado, Modelo #3C2, Advanced Instruments, Inc, Needham, Massachusetts.

Se determinaron las concentraciones de hemoglobina total, metemoglobina y oxihemoglobina en un Co-Oxímetro Modelo #482, de Instrumentation Laboratory, Lexington, Massachusetts.

Se determinaron las concentraciones de Na^{+}, K^{+}, Cl^{-}, Ca^{++}, y pO_{2} mediante un Novastat Profile 4, Nova Biomedical Corporation, Walktham, Massachusetts.

Se determinó la constante de unión a oxígeno, P_{50} mediante un Analizador Hemox, TCD Corporation, Southhampton, Pensilvania.

Se determinaron la temperatura y el pH mediante métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica.

Se determinó el peso molecular (M.W.) realizando cromatografía de permeación en gel (GPC) sobre los productos de hemoglobina en condiciones de disociación. Se analizó una muestra representativa del producto de hemoglobina para determinar la distribución de pesos moleculares. El producto de hemoglobina se diluyó hasta 4 mg/ml en de una fase móvil de solución Bis-Tris 50 mM (pH 6,5), MgCl_{2} 750 mM y EDTA 0,1 mM. Este tampón sirve para disociar tetrámeros de Hb en dímeros, los cuales no han sido reticulados a otros dímeros de Hb mediante reticulaciones intramoleculares o intermoleculares, a partir de la poli(Hb). La muestra diluida se inyectó en una columna TosoHaas G3000SW. El caudal era 0,5 ml/min y la detección ultravioleta se registró a 280 nm.

Los resultados de los ensayos anteriores en sustitutos de sangre a base de Hb veterinaria (OXIGLOBIN^{TM}) y humana, formados según el método de la invención, se resumen en las Tablas V y VI, respectivamente.

TABLA V

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TABLA VI

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Claims

1. Un método para conservar un sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado, que comprende mantener el sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado en un envase con envoltorio de película barrera para el oxígeno, en el que el envase comprende un material estratificado transparente que comprende una capa barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina, en el que el estratificado tiene un espesor de entre aproximadamente 0,0254 y 0,254 mm, y una permeabilidad al oxígeno inferior a aproximadamente 0,01 cm^{3} por 645 cm^{2} durante 24 horas a una atmósfera y a aproximadamente 23ºC, en el que la capa barrera para el oxígeno comprende un copolímero de etileno y alcohol vinílico.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la capa de poliolefina y la capa barrera para el oxígeno están co-extruidas.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el envase con envoltorio de película barrera para el oxigeno comprende al menos dos hojas de material estratificado, en el que al menos una hoja del envase con envoltorio comprende un material estratificado transparente y en el que al menos una de las otras hojas del envase con envoltorio comprende un material estratificado de láminas.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el envase con envoltorio se produce:

a): conformando dicho estratificado de láminas para que defina al menos una cámara;

b): colocando el sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada en el interior de dicha cámara; y

c): sellando con calor el estratificado transparente al estratificado de láminas, con lo que se forma dicho envoltorio de película barrera para el oxígeno, quedando contenido, de este modo, el sustituto de sangre a base de hemoglobina dentro del envoltorio.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el sustituto de sangre a base de hemoglobina se mantiene bajo una atmósfera de nitrógeno, argón o helio.

6. Un sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada conservado, que comprende:

a): un sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado; y

b): un envase con envoltorio de película barrera para el oxígeno que comprende un material estratificado transparente que comprende una capa barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina, en el que el estratificado tiene una permeabilidad al oxígeno inferior a aproximadamente 0,01 cm^{3} por 645 cm^{2} durante 24 horas a una atmósfera y a aproximadamente 23ºC, en el que el sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado está herméticamente cerrado dentro del envase con envoltorio y en el que la capa barrera para el oxígeno comprende un copolímero de etileno y alcohol vinílico.

7. El sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 6, en el que la primera capa de poliolefina y la capa barrera para el oxígeno están co-extruidas.

8. El sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 6, en el que el envase con envoltorio de película barrera para el oxígeno comprende al menos dos hojas de material estratificado, en el que al menos una hoja del envase con envoltorio comprende un material estratificado transparente y en el que al menos una de las otras hojas del envoltorio comprende un material estratificado de láminas.

9. El sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada conservado de la reivindicación 8, en el que el envase con envoltorio se produce:

a): conformando dicho estratificado de láminas de manera que defina al menos una cámara;

b): colocando el sustituto de sangre a base de hemoglobina desoxigenada envasado en el interior de dicha cámara; y

c): sellando con calor el estratificado transparente al estratificado de láminas, con lo que se forma dicho envoltorio de película barrera para el oxígeno, quedando contenido, de este modo, el sustituto de sangre a base de hemoglobina envasado dentro del envoltorio.