MXPA01013195A

MXPA01013195A - Conservacion de un substituto de la sangre basado en hemoglobina con una sobreenvoltura transparente.

Info

Publication number: MXPA01013195A
Application number: MXPA01013195A
Authority: MX
Inventors: Maria S Gawryl
Original assignee: Biopure Corp
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2002-06-04
Also published as: EP1196030B1; US7041800B1; US6288027B1; AU760123B2; ES2215689T3; CN1191754C; AU6081700A; DE60010704D1; DE60010704T2; HK1046082B; HK1046082A1; ATE266314T1; JP2003520774A; EP1196030A1; CN1384707A; WO2001001775A1; US20020128182A1; WO2001001775A8; CA2373753C; CA2373753A1

Abstract

La invencion se relaciona con un metodo para conservar la estabilidad de un substituto de la sangre basado en hemoglobina consistente en mantener el substituto de la sangre basado en hemoglobina en una atmosfera substancialmente libre de oxigeno. El metodo para conservar un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado consiste en mantener el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado en un paquete de sobreenvoltura de pelicula de barrera frente al oxigeno. En una realizacion, el paquete contiene un material laminado transparente consistente en una capa de barrera para el oxigeno y una capa de poliolefina, donde el laminado tiene un grosor de entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 0,01 pulgadas (o entre aproximadamente 0,0254 y aproximadamente 0,254 milimetros) y una permeabilidad al oxigeno menor de aproximadamente 0,01 centimetros cubicos por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 0,01 cc por 645 centimetros cuadrados) a lo largo de 24 horas a 1 atmosfera y a aproximadamente 23°C. La capa de barrera para el oxigeno consiste en alcohol etilenvinilico. Tambien se facilita aqui un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado conservado que consiste en un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado y un paquete de sobreenvoltura de pelicula de barrera para el oxigeno. El paquete contiene un material laminado transparente que consiste en una capa de barrera para el oxigeno y una capa de poliolefina. Dicha capa de barrera para el oxigeno tiene una permeabilidad al oxigeno menor de aproximadamente 0,01 centimetros cubicos por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 0,01 cc por 645 centimetros cuadrados) a lo largo de 24 horas a 1 atmosfera y a aproximadamente 27°C de temperatura ambiente, donde el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado esta sellado en el interior del paquete de sobreenvoltura. En una realizacion, la capa de barrera para el oxigeno consiste en alcohol etilenvinilico.

Description

CONSERVACIÓN DE UN SUBSTITUTO DE LA SANGRE BASADO EN HEMOGLOBINA CON UNA SOBREENVOLTURA TRANSPARENTE SOLICITUDES RELACIONADAS Esta Solicitud es una Continuación de la Solicitud copendiente de patente EE.UU. N° de Serie 09/348.881, presentada el 7 de Julio de 1999, que es una Continuación-en-Parte de la Solicitud de Patente EE.UU. K° de Serie 09/173.189, presentada el 14 de Octubre de 1998, que es una Continuación-en-Parte de la Solicitud de patente EE.UU. N° de Serie 08/974.658, presentada el 19 de Noviembre de 1997 y ahora abandonada, que es una Continuación de la Solicitud de patente EE.UU. N° de Serie 08/471.583, presentada el 7 de Junio de 1995 y que actualmente es la Patente concedida 5.691.452, que es una Continuación-en-Parte de la Solicitud de patente EE.UU. N° de Serie 08/458.916, presentada el 2 de Junio de 1995 y que actualmente es la Patente concedida 5.840.582, que es una Continuación de la Solicitud de Pa-tente EE.UU. N° de Serie 08/409.337, presentada el 23 de Marzo de 1995 y que actualmente es la Patente concedida 5.854.209. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe una necesidad de disponer de un substi-tuto de la sangre para tratar o prevenir la hipoxia que se produce como resultado de una pérdida de sangre (por ejemplo, por hemorragia aguda o durante operaciones quirúrgicas) , como resultado de anemia (por ejemplo, anemia perniciosa o anemia de células falciformes) , o como resultado del shock (por ejemplo, shock hipovolémico, shock anafilác-tico, shock séptico o shock alérgico) . El uso de sangre y de fracciones de la sangre como substituto sanguíneo está lleno de inconvenientes. Por ejemplo, el uso de sangre entera va frecuentemente acompañado del riesgo de transmisión de virus productores de hepatitis y de virus productores del SIDA, que pueden com-plicar la recuperación de los pacientes o dar lugar a muerte de los pacientes. Adicionalmente, el uso de sangre entera requiere tipificación de la sangre y pruebas sanguíneas cruzadas para evitar los problemas inmunohematológicos y la incompatibilidad entre donantes. La hemoglobina humana, como substituto de la sangre, posee actividad osmótica y capacidad para transportar y transferir oxígeno, pero tiene el inconveniente de ser rápidamente eliminada de la circulación por vía renal y a través de las paredes vasculares, dando como resultado una vida media muy corta y, por lo tanto, típicamente insa-tisfactoria. Además, la hemoglobina humana está también f ecuentemente contaminada con niveles tóxicos de endotoxi-nas, bacterias y/o virus. La hemoglobina humana sufre de las mismas defi-ciencias que la hemoglobina humana. Además, la hemoglobina de fuentes no humanas está también típicamente contaminada con proteínas, tales como anticuerpos, que podrían causar una respuesta del sistema inmune en el receptor. Previamente, se han utilizado al menos otros cuatro tipos de substitutos de la sangre, incluyendo compuestos perfluoroquímicos, análogos sintetizados de la hemoglobina, hemoglobina encapsulada en liposomas y hemoglobina modificada químicamente. Sin embargo, muchos de estos substitutos de la sangre han tenido típicamente tiempos cortos de retención intravascular, siendo eliminados del sistema circulatorio como substancias extrañas o permaneciendo en el hígado, en el bazo y en otros tejidos. Además, muchos de estos substitutos de la sangre han resultado ser biológicamente incompatibles con los sistemas vivos. Así, a pesar de los recientes avances en la preparación de substitutos de la sangre basados en hemoglo-bina, sigue habiendo necesidad de un substituto de la sangre que tenga niveles de contaminantes, tales como endo-toxinas, bacterias, virus, fosfolípidos y proteínas distintas de la hemoglobina que sean suficientemente bajos como para prevenir, en general, la aparición de una respuesta del sistema inmune y cualquier efecto toxicológico resultante de una infusión del substituto de la sangre. Además, el substituto de la sangre debe ser capaz de transportar y transferir cantidades adecuadas de oxígeno a los tejidos en condiciones ambientales y debe tener un buen tiempo de re-tención intravascular. Se prefiere además que el substituto de la sangre 1) tenga una actividad oncótica generalmente equivalente a la de la sangre entera, 2) pueda ser transfundido a la mayoría de los receptores sin pruebas sanguíneas cruzadas o de sensibilidad y 3) pueda ser almacenado con cantidades mínimas de refrigeración durante largos períodos . El substituto de la sangre es típicamente empaquetado en una sobreenvoltura de laminado de hoja metálica que tiene altas propiedades de barrera para el 02 y la humedad. Los laminados de hojas metálicas son típicamente opacos, no permitiendo, por lo tanto, la inspección visual del producto ni la inspección de la integridad del paquete primario. Más aún, una sobreenvoltura opaca requiere el uso de un segundo mareaje en la parte exterior de la sobreen-voltura. En el pasado, los laminados transparentes que contenían silicio con altas propiedades de barrera para el oxígeno y la humedad no resultaron útiles en equipo de empaquetamiento automatizado, ya que la tensión sobre el material hacía que se agrietara o perdiera de algún otro modo las propiedades de barrera. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un método para conservar un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado, que consiste en mantener un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado empaquetado en un paquete de sobreenvoltura de película barrera frente al oxígeno, donde el paquete de sobreenvoltura consiste en un material laminado transparente que consiste en una capa de barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina, donde el laminado tiene un grosor de entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 0,01 pulgadas (o entre aproximadamente 0,0254 y aproximadamente 0,254 milímetros) y una permeabilidad al oxígeno menor de aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 0,01 cc por 645 centímetros cuadrados) a lo largo de 24 horas a 1 atmósfera y a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) , donde la capa de barrera frente al oxígeno consiste en alcohol etilenvinllico. En una realización, el método consiste en mantener el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado en una sobreenvoltura de película de barrera para el oxígeno consistente en un material laminado transparente que tiene un grosor de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,005 pulgadas (o entre aproximadamente 0,254 y aproximadamente 0,127 milímetros). La presente invención se dirige también a un substituto sanguíneo basado en hemoglobina desoxigenado conservado que consiste en un substituto sanguíneo basado en hemoglobina desoxigenado empaquetado y un paquete trans-párente de sobreenvoltura de película de barrera frente al oxígeno. En una realización, el material laminado transparente consiste en una capa de barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina, cuya capa de barrera para el oxígeno tiene una permeabilidad al oxígeno de menos de aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 0,01 cc por 645 centímetros cuadrados) a lo largo de 24 horas a 1 atmósfera y a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) y donde la capa de barrera para el oxígeno consiste en alcohol etilenvinílico. El substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado empaquetado es sellado dentro del paquete de sobreenvoltura, conservando así el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado en un ambiente substancialmente libre de oxí-geno. En una realización de la presente invención, el material laminado transparente es utilizado en combinación con un material laminado de hoja metálica en un empaquetamiento automatizado. En una realización, se ha utilizado una máquina de empaquetamiento automatizado fabricada por Tiromat (Avon, MA) . Las ventajas de esta invención son numerosas. Una ventaja es que la hemoglobina almacenada según los métodos de esta invención tiene un mayor grado de pureza y una mayor vida útil de almacenaje. Las sobreenvolturas de alta barrera proporcionan un nivel añadido de calidad del producto incluso cuando se emplean empaquetamientos primarios de alta barrera. Además, las sobreenvolturas transparentes de alta barrera de la presente invención proporcio-nan propiedades de barrera extremadamente alta para el oxígeno y el vapor de agua, pero no tienen capa de sarán (cloruro de polivinilideno, PVDC) . El PVDC plantea problemas de desechos médicos, ya que se generan productos clorados, tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos y ácido clorhídrico, durante la incineración. Las sobreenvolturas transparentes permiten poder ver la etiqueta del paquete primario. Por lo tanto, no es típicamente necesaria una segunda etiqueta sobre la sobreenvoltura. Además, también se pueden evaluar la inspección de la calidad del producto y la integridad del paquete primario. Más aún, según se demuestra aquí por primera vez, se puede usar un equipo de automatización con los laminados transparentes de barrera para el oxígeno, permitiendo la producción de números muy grandes de paquetes en un corto período de tiempo y con muy poca mano de obra humana y sin pérdida de las propiedades de barrera. El substituto de la sangre permanece estable a temperatura ambiente durante períodos de dos años o más, un perfeccionamiento significativo sobre los métodos anteriores . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las características y otros detalles de la pre-senté invención serán ahora descritos y señalados más en particular en las reivindicaciones . Se entenderá que las realizaciones particulares de la invención son mostradas a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden ser empleadas en diversas realizaciones sin desviarse del alcance de la presente invención. La invención se relaciona con un método para conservar la estabilidad de un substituto de la sangre basado en hemoglobina, que consiste en mantener el substituto de la sangre basado en hemoglobina en una atmósfera substancialmente libre de oxígeno. Este método puede ser llevado a cabo manteniendo el substituto de la sangre en un re-cipiente impermeable al oxígeno, tal como un paquete primario de barrera para el oxígeno, una sobreenvoltura de película de barrera para el oxígeno (por ejemplo, una bolsa) , un recipiente de vidrio (por ejemplo, un vial) o un reci-píente de acero. Cuando el paquete primario es una película de barrera para el oxígeno, el recipiente puede ser fabricado a partir de una variedad de materiales, incluyendo películas poliméricas (por ejemplo, un poliéster esencialmente impermeable al oxígeno, alcohol etilenvinílico (EVOH) o nilón) y laminados de éstas. Cuando el recipiente incluye una sobreenvoltura de barrera para el oxígeno, la sobreenvoltura puede ser fabricada a partir de una variedad de materiales, incluyendo películas poliméricas (por ejemplo, un poliéster esencialmente impermeable al oxígeno, alcohol etilenvinílico (EVOH) o nilón) y laminados, tales como un laminado transparente (por ejemplo, un laminado que contenga óxido de silicio o EVOH) o un laminado de hoja metálica (por ejemplo, un laminado de hoja de plata o de aluminio) . Cuando la sobreenvoltura es una película, tal como una película de poliéster, se puede hacer que la película sea esencialmente impermeable al oxígeno por una variedad de métodos adecuados. En una realización, la película fabricada es esencialmente impermeable al oxígeno. Alternativamente, cuando el material polimérico no es sufi-cientemente impermeable al oxígeno como para cumplir las especificaciones deseadas, la película puede ser laminada o tratada de algún otro modo para reducir o eliminar la permeabilidad al oxígeno. En una realización preferida, se emplea un laminado transparente para al menos una de las caras de la sobreenvoltura. En una realización, al menos una capa del laminado transparente es una barrera para el oxígeno. La capa de barrera para el oxígeno tiene preferiblemente un grosor de entre aproximadamente 0,0001 y 0,001 pulgadas (o aproximadamente 2,54 x 10"3 y 0,025 milímetros). Tanto para el paquete primario como para la sobreenvoltura, el lamina-do contiene típicamente una o más capas poliméricas. El polímero puede ser una variedad de materiales poliméricos, incluyendo, por ejemplo, una capa de poliéster (por ejemplo, un poliéster de calibre 48) , nilón o una capa de poliolefina, tal como polietileno, acetato de etilenvinilo o polipropileno o copolímeros de éstos. Las sobreenvolturas de la invención pueden ser de una variedad de construcciones, incluyendo viales, cilindros, cajas, etc. En una realización preferida, el recipiente está en forma de una bolsa. Se puede formar una bol-sa adecuada uniendo continuamente una o más (por ejemplo, dos) láminas en su(s) perímetro (s) para formar una construcción estrechamente cerrada impermeable al oxigeno que tenga un centro que pueda ser llenado. La forma de la bolsa puede ser una de las rutinariamente encontradas en la téc-nica. En el caso de los laminados que contienen poliolefinas, tales como polietileno o polipropileno lineales de baja densidad, de baja densidad, de media densidad o de alta densidad y sus copolímeros, el perímetro de la bolsa es unido o sellado usando calor. Está dentro de los conoci-mientos de la técnica determinar la temperatura apropiada para generar una construcción estrechamente cerrada e impermeable al oxígeno y/o la humedad. Los recipientes tienen preferiblemente una permeabilidad al oxígeno de menos de aproximadamente 0,01 cc por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 0,1 cc por 645 centímetros cuadrados) por 24 horas y por atmósfera a temperatura ambiente, preferiblemente menos de aproximada-mente 0,005 cc por pulgada cuadrada (o aproximadamente 0,005 cc por 6,45 centímetros cuadrados) en estas condiciones. Los recipientes que cumplen estos criterios incluyen, por ejemplo, recipientes de plástico con sobreenvoltura, tales como recipientes laminados de alta barrera con una sobreenvoltura construida, por ejemplo, a partir de poliolefina, tal como polipropileno, alcohol etilenvinílico y otra capa de poliolefina, tal como un laminado de polietileno lineal de baja densidad. En una realización, el lami-nado consiste en polipropileno, EVOH y copolímero de polipropileno a espesores de 1,8 milipulgadas, 1,2 milipulgadas y 3,0 milipulgadas, respectivamente (o 0,046, 0,030 y 0,076 milímetros, respectivamente) . La permeabilidad al oxígeno del laminado de alta barrera es de 0,00153 cc por 100 pul-gadas cuadradas (ó 0,0015 cc por 645 centímetros cuadrados por atmósfera y por día a 25°C, 100%/50% de humedad relativa (HR) ) (interior/exterior) y la transmisión de vapor de agua es de aproximadamente 0,354 mg por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 0,354 mg por 645 centímetros cua-drados) por atm y por día (25°C, 100%/50% de HR) . Estas bolsas de plástico sobreenvueltas con películas compuestas son selladas usando un aparato sellador Tiromat (Avon, Massachusetts) . En una realización, la sobreenvoltura contiene dos hojas de material laminado transparente. En otra realización, una hoja del paquete de sobreenvoltura consiste en un material laminado de hoja metálica y otra hoja consiste en un material laminado transparente. En otra realización, loa hoja del fondo del paquete de sobreenvoltura es un laminado de hoja metálica y se forma de tal modo que al menos se defina una forma de disco o cámara en el laminado de hoja metálica. El substituto de la sangre basado en hemoglobina, en un paquete primario, es puesto entonces en las cámaras de la hoja metálica, con la cámaras de la hoja metálica, con la etiqueta mirando hacia arriba. Se purga entonces la hoja y el substituto de la sangre basado en hemoglobina en el paquete primario con nitrógeno y se hace el vacío y se sella entonces el laminado transparente por calor a la capa de fondo del laminado de hoja metálica, creando un substituto de la sangre basado en hemoglobina sobreenvuelto. En una realización preferida, el substituto de la sangre es empaquetado en una atmósfera substancialmente libre de oxígeno. Como ejemplos de atmósferas adecuadas se incluyen nitrógeno, argón y helio. Tal como se define aquí, el substituto de la sangre es una composición transportadora de oxígeno basada en hemoglobina para uso en humanos, mamíferos y otros ver-tebrados, que es capaz de transportar y transferir oxígeno a órganos y tejidos vitales al menos y que puede mantener suficiente presión oncótica intravascular. Un vertebrado es como se ha definido clásicamente, incluidos los humanos, o cualquier otro animal vertebrado que utilice sangre en un sistema circulatorio para transferir oxígeno a los tejidos. Adicionalmente, la definición de sistema circulatorio es la clásica, consistiendo en el corazón, las arterias, las venas y la microcirculación, incluidas las estructuras vasculares menores tales como los capilares . Un substituto de la sangre de la invención tiene preferiblemente niveles de endotoxinas, fosfolípidos, proteínas extrañas y otros contaminantes que no dan lugar a una respuesta significativa del sistema inmune y que son no tóxicos para el receptor. Preferiblemente, un substituto de la sangre es ultrapuro. Ultrapuro tal como se define aquí significa que contiene menos de 0,5 UE/ml de endotoxina, menos de 3,3 nmoles/ml de fosfolípidos y un bajo o ningún nivel detectable de proteínas distintas de la hemoglobina, tales como seroalbúmina o anticuerpos. El término "endotoxina" se refiere a lipopoli-sacáridos unidos a células producidos como parte de la capa externa de la pared celular de bacterias gram-negativas, los cuales, en muchas condiciones, son tóxicos. Cuando se inyectan a animales, las endotoxinas pueden causar fiebre, diarrea, shock hemorrágico y otras lesiones tisulares. Se ha definido la unidad de endotoxina (UE) por la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de 1983, página 3014, como la actividad contenida en 0,1 nanogramos del patrón de referencia EE.UU. lote EC-5. Un vial de EC-5 contiene 10.000 UE . Como ejemplos de medios adecuados para determinar las concentraciones de endotoxina en un substituto de la sangre se incluyen el método "Metodología Cinéti-ca/Turbidimétrica del Lisado de Amebocitos de Limuus (LAL) 5000", desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts . La hemoglobina polimerizada estable, tal como se define aquí, es una composición transportadora de oxígeno basada en hemoglobina que no aumenta o reduce substancialmente en cuanto a distribución de peso molecular y/o contenido en metahemoglobina durante períodos de almacenamiento a temperaturas de almacenamiento adecuadas durante períodos de dos años o más y, preferiblemente, durante períodos de dos años o más, cuando se almacena en un ambiente bajo en oxígeno. Las temperaturas de almacenamiento adecuadas para el almacenamiento durante un año o más son de entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 40 °C. El rango preferido de temperatura de almacenamiento es de entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25 °C. Un ambiente adecuado bajo en oxígeno, o un am-biente que está substancialmente libre de oxígeno, se define como la cantidad acumulativa de oxígeno en contacto con el substituto de la sangre a lo largo de un período de almacenamiento de al menos aproximadamente dos meses, prefe-riblemente de al menos aproximadamente un año, o más preferiblemente de al menos aproximadamente dos años, que dará lugar a una concentración de metahemoglobina de menos de aproximadamente un 15% en peso en el substituto de la sangre. La cantidad acumulativa de oxígeno incluye la infil-tración de oxígeno en el paquete del substituto de la sangre y el contenido de oxígeno original del substituto de la sangre y el paquete . En todo este método, desde la recogida de las células rojas de la sangre ("RBC") hasta la polimerización de la hemoglobina, se mantiene la solución de sangre, las RBC y la hemoglobina en condiciones suficientes para minimizar el crecimiento microbiano, o biocarga, tal como manteniendo la temperatura a menos de aproximadamente 20 °C y por encima de 0°C. Preferiblemente, se mantiene la tempera-tura a aproximadamente 15 °C o menos. Más preferiblemente, se mantiene la temperatura a 10 ± 2°C. En este método, las porciones de los componentes para el procedimiento de preparación de un substituto de la sangre basado en hemoglobina polimerizada estable son suficientemente sanitizadas como para producir un producto estéril. Estéril es como se define en la técnica, concretamente, que la solución cumple con los requerimientos de la Farmacopea de los Estados Unidos en cuanto a esterilidad provistos en USP XXII, Sección 71, páginas 1483-1488. Ade-más, las porciones de componentes que se exponen a la corriente del proceso, son normalmente soldadas o revestidas con un material que no reacciona con la corriente del pro-ceso o la contamina. Dichos materiales pueden incluir acero inoxidable u otras aleaciones de acero, tales como Inconel . Como fuentes de RBC adecuadas se incluyen sangre humana, sangre bovina, sangre ovina, sangre porcina, sangre de otros vertebrados y hemoglobina producida trans-génicamente, tal como la Hb transgénica descrita en BIO/TECHNOLOGY, 12: 55-59 (1994). La sangre puede ser recogida de donantes vivos o recién sacrificados. Un método para recoger sangre entera bovina está descrito en las Patentes EE.UU. N° 5.084.558 y 5.296.465, concedidas a Rausch y col. Se prefiere que la sangre sea recogida de un modo sanitario. En la recogida, o poco después de ella, se mezcla la sangre con al menos un anticoagulante para evitar una coagulación significativa de la sangre. Los anticoagulantes adecuados para la sangre son los clásicamente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, citrato de sodio, ácido etilendiaminatetraacético y heparina. Cuando se mezcla con sangre, el anticoagulante puede estar en forma sólida, tal como polvo, o en solución acuosa. Se entiende que la fuente de solución de sangre puede ser de una muestra recién recogida o de una muestra antigua, tal sangre de humanos difuntos de un banco de sangre. Además, la solución de sangre podría haber sido pre-viamente mantenida en estado congelado y/o líquido. Se prefiere que la solución de sangre no esté congelada antes de su uso en este método. En otra realización, antes de poner en contacto la solución de sangre con los anticoagulantes, se estudian los niveles de antibióticos en la solución de sangre, tales como penicilina. Los niveles de antibióticos son determinados para obtener un grado de seguridad de que la muestra de sangre no está cargada con un organismo infectante verificando que el donante de la muestra de sangre no estaba siendo tratado con un antibiótico. Como ejemplos de ensayos adecuados para antibióticos se incluyen un kit de ensayo de penicilina (Difco, Detroit, MI) , que emplea un método titulado "Detección Rápida de Penicilina en Leche" . Se prefiere que las soluciones de sangre contengan un nivel de penicilina inferior o igual a aproximadamente 0,008 unidades/ml. Alternativamente, se puede usar un programa de manejo de rebaños para monitorizar la falta de enfermedad o el tratamiento con antibióticos del ganado vacuno. Preferiblemente, la solución de sangre es filtrada antes de o durante la etapa de anticoagulación, por ejemplo por filtración, para eliminar grandes agregados y partículas. Un tamiz de 600 mallas es un ejemplo de filtrador adecuado . Las RBC en la solución de sangre son entonces lavadas por medios adecuados, tales como diafiltración o una combinación de etapas discretas de dilución y concen-tración con al menos una solución, tal como una solución isotónica, para separar las RBC de las proteínas plasmáticas extracelulares, tales como seroalbúminas o anticuerpos (por ejemplo, inmunoglobulinas (IgG) ) . Se entiende que las RBC pueden ser lavadas en un modo de lotes o de alimenta-ción continua. Las soluciones isotónicas aceptables son como se conoce en la técnica e incluyen soluciones, tales como una solución de citrato/salina, que tienen un pH y una osmolaridad que no rompen la las membranas celulares de las RBC y que desplazan la porción de plasma de la sangre entera. Una solución isotónica preferida tiene un pH neutro y una osmolaridad de entre aproximadamente 285 y 315 mOsm. En una realización preferida, la solución isotónica está compuesta por una solución acuosa de citrato de sodio dihidrato (6,0 g/1) y cloruro de sodio (8,0 g/1) . El agua que puede ser usada en el método de la invención incluye agua destilada, agua desionizada, agua para inyección ("WFI") y/o agua de bajo contenido en pirógenos ("LPW") . La WFI , que es preferida, es agua destilada desionizada que cumple las Especificaciones Farmacológicas de EE.UU. para el agua para inyección. La WFI está además descrita en Pharmaceutical Engineering, 11, 15-23 (1991) . El LPW, que es preferida, es agua desionizada que contiene menos de 0,002 UE/ml. Se prefiere que la solución isotónica sea filtrada antes de añadirla a la solución de sangre. Como ejem-píos de filtros adecuados se incluyen una membrana de ultrafiltración Millipore de 10.000 Dalton, tal como un filtro Millipore Cat # CDUF 050 Gl o fibra hueca de A/G Technology, 10.000 Dalton (Cat # UFP-10-C-85) . En una realización preferida, las RBC en la so-lución de sangre son lavadas por diafiltración. Como dia-filtros adecuados se incluyen membranas microporosas con tamaños de poro que separan las RBC de componentes de la solución de sangre substancialmente más pequeños, tales como un filtro de 0,1 µm a 0,5 µm (por ejemplo, un filtro de fibra hueca de 0,2 µm, cartucho de microfiltración Microgon Krosflo II) . Al mismo tiempo, se añade una solución isotónica filtrada de manera continua (o en lotes) como relleno a un ritmo igual a la velocidad (o volumen) de filtrado perdido a través del diafiltro. Durante el lavado de las RBC, los componentes de la solución de sangre que son significativamente más pequeños de diámetro que las RBC, o que son fluidos, tales como el plasma, pasan a través de las paredes del diafiltro en el filtrado. Las RBC, las plaquetas y los cuerpos de mayor tamaño de la solución de sangre diluida, tales como las células blancas de la sangre, quedan retenidos y se mezclan con la solución isotónica, que es añadida de manera continua o por lotes, para formar una solución de sangre dializada. En una realización más preferida, el volumen de solución de sangre en el tanque de diafiltración es inicialmente diluido por adición de un volumen de una solución isotónica filtrada al tanque de diafiltración. Preferiblemente, el volumen de solución isotónica añadida es aproximadamente igual al volumen inicial de la solución de sangre. En una realización alternativa, las RBC son la-vadas a través de una serie de etapas secuenciales (o secuenciales inversas) de dilución y concentración, donde la solución de sangre es diluida añadiendo al menos una solución isotónica y concentrada fluyendo a través de un filtro, formando así una solución de sangre dializada. El lavado de las RBC está completo cuando el nivel de proteínas plasmáticas que contaminan las RBC ha sido substancialmente reducido (típicamente, al menos aproximadamente un 90%) . Típicamente, el lavado de las RBC se completa cuando el volumen* de filtrado drenado de un diafiltro 34 iguala aproximadamente un 300% o más del volumen de solución de sangre contenida en el tanque de diafiltración antes de diluir la solución de sangre con la solución isotónica filtrada. Un lavado de JRBC adicional puede separar aún más las proteínas plasmáticas extracelulares de las RBC. Por ejemplo, la diafiltración con 6 volúmenes de solución isotónica puede eliminar al menos aproximadamente un 99% de IgG de la solución de sangre.

La solución de sangre dializada es entonces expuesta a medios para separar las RBC en la solución de sangre dializada de las células blancas de la sangre y las plaquetas, tales como la centrifugación. Se entiende que se pueden emplear otros métodos generalmente conocidos en la técnica para separar las RBC de otros componentes de la sangre. Por ejemplo, sedimentación, donde el método de separación no rompe las membranas celulares de una cantidad significativa de las RBC, tal co-mo menos de aproximadamente un 30% de las RBC, antes de la separación de las RBC y los otros componentes de la sangre. Después de la separación de las RBC, las RBC son usadas por un medio para lisar RBC con objeto de liberar la hemoglobina de las RBC y formar una solución que contiene hemoglobina. El medio de lisis puede usar varios métodos de lisis, tales como lisis mecánica, lisis química, lisis hipotónica u otros métodos de lisis conocidos que liberen hemoglobina sin dañar significativamente la capacidad de la Hb para transportar y liberar oxígeno. En aún otra realización, se puede procesar hemoglobina recombinantemente producida, tal como la hemoglobina recombinantemente producida descrita en Nature, 356: 258-260 (1992), en el método de la invención en lugar de las RBC. Se lavan las células bacterianas que contienen la hemoglobina y se separan de los contaminantes descritos anteriormente. Se rompen entonces mecánicamente estas células bacterianas por medios conocidas en la técnica, tales como un molino de bolas, para liberar la hemoglobina de las células y formar una fase de células Usadas. Esta fase de células usadas es entonces procesada como lo es la fase de RBC usadas. Después de la lisis, la fase de RBC usadas es entonces ultrafiltrada para eliminar restos celulares de mayor tamaño, tales como proteínas con un peso molecular por encima de aproximadamente 100.000 Daltons. En general, los restos celulares incluyen todos los componentes celula-res enteros y fragmentados con la excepción de la Hb, proteínas celulares más pequeñas, electrolitos, coenzimas e intermediarios metabólicos orgánicos. Como ultrafiltros aceptables se incluyen, por ejemplo, los filtros de 100.000 Dalton fabricados por Millipore (Cat # CDUF 050 Hl) y los fabricados por A/G Technology (Need-ham, MA; Modelo N° UFP100E55) . Se prefiere que la ultrafiltración continúe hasta que la concentración de Hb en la fase de RBC usadas sea menor de 8 gramos/litro (g/1) para maximizar el rendi-miento de hemoglobina disponible para la polimerización. Se pueden incluir otros métodos para separar la Hb de la fase de RBC lisada, incluyendo la sedimentación, la centrifugación o la microfiltración. El ultrafiltrado de Hb puede ser entonces ultrafiltrado para eliminar los restos celulares de menor tamaño, tales como electrolitos, coenzimas, intermediarios metabólicos y proteínas menores de aproximadamente 30.000 Dalton de peso molecular, y el agua del ultrafiltrado de Hb. Como ultrafiltros adecuados se incluyen un ul-trafiltro de 30.000 Dalton (Millipore Cat # CDUF 050 TI y/o Armicon, # 540 430) . La solución de Hb concentrada puede ser entonces dirigida a una o más columnas cromatográficas paralelas para separar aún más la hemoglobina por cromatografía líquida de alto rendimiento de los otros contaminantes, tales como anticuerpos, endotoxinas, fosfolípidos y enzimas y virus . Como ejemplos de medios adecuados se incluyen medios de intercambio aniónico, medios de intercambio catiónico, medios de interacción hidrofóbica y medios de afinidad. En una realización preferida, las columnas cromatográficas contienen un medio de intercambio aniónico adecuado para separar la Hb de las proteínas distintas de la hemoglobina. Como medios adecuados de intercambio aniónico se incluyen, por ejemplo, sílice, alúmina, gel de titania, dextrano entrecruzado., agarosa o un resto derivatizado, tal como una poliacrilamida, un metacrilato de polihidroxietilo o un es-tirenodivinilbenceno, que ha sido derivatizado con una fun-cionalidad química catiónica, tal como un grupo dietilaminoetilo o aminoetilo cuaternario. Un medio adecuado de intercambio aniónico y los eluyentes correspondientes para la absorción y desorción selectivas de la Hb en comparación con otras proteínas y contaminantes, que es probable que están en una fase de RBC lisadas, son fácilmente determina-bles por alguien con conocimientos razonables en la técnica. En una realización más preferida, se usa un método para formar un medio de intercambio aniónico a partir de gel de sílice, que es hidrotérmicamente tratado para aumentar el tamaño de poro, expuesto a ?-glicidoxi-propilsilano para formar grupos epdxido activos y luego expuesto a C3H7(CH3)NC1 para formar un medio de intercambio aniónico de amonio cuaternario. Este método está descrito en el Journal of Chromatography, 120: 321-333 (1976), aquí incorporado como referencia en su totalidad. Las columnas cromatográficas son primeramente pretratadas lavando con un primer eluyente que facilita la unión de la Hb. Se inyecta entonces solución de Hb concen-trada sobre el medio en las columnas. Después de inyectar la solución de Hb concentrada, las columnas cromatográficas son sucesivamente lavadas con diferentes eluyentes para producir un eluato de Hb purificada aparte. En una realización preferida, se usa un gradiente de pH en columnas cromatográficas para separar los contaminantes proteicos, tales como la enzima anhidrasa carbónica, fosfolípidos, anticuerpos y endotoxinas de la Hb. Se dirige secuencialmente cada uno de una serie de tampones que tienen diferentes valores de pH para crear un gradiente de pH en el medio en la columna cromatográfica. Se prefiere filtrar los tampones, tal como con una membrana de despirogenación de 10.000 Dalton. Los tampones usados para separar la Hb deben tener una baja intensidad iónica, de tal forma que la elución de la Hb y de los contaminantes distintos de hemoglobina es generalmente dependiente del pH y no significativamente dependiente de la intensidad ióni-ca. Típicamente, los tampones con una concentración iónica de aproximadamente 50 mM o menos tienen bajas intensidades iónicas adecuadas . El primer tampón transporta la solución de Hb concentrada al medio en las columnas cromatográficas y fa-cilita la unión de la Hb al medio. El segundo tampón ajusta entonces el pH en las columnas para eluir los componentes contaminantes distintos de la hemoglobina, manteniendo al mismo tiempo la Hb unida al medio. El tercer tampón eluye entonces la Hb. Se recoge luego el eluato de Hb. Se prefie-re que el eluato de Hb vaya dirigido a través de un filtro estéril. Como filtros estériles adecuados se incluyen filtros de 0,22 µm, tales como un filtro Sartorius Sartobran Cat # 5232507 G1PH. En una realización preferida, el primer 3% a 4% del eluato de Hb y el último 3% a 4% del eluato de Hb son desechados para tener seguridad de la pureza del eluato de Hb.

Donde las columnas cromatográficas han de ser reutilizadas, se eluyen después las proteínas distintas de hemoglobina y la endotoxina contaminantes que quedan en las columnas mediante un cuarto tampón. El uso de gradientes de pH para separar la Hb de los contaminantes distintos de hemoglobina está aún más descrito en la Patente EE.UU. 5.691.452, solicitada el 7 de Junio de 1995, aquí incorporada como referencia. En una realización preferida, el primer tampón es una solución de trishidroximetilaminometano (Tris) (concentración aproximadamente 20 mM; pH aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4) . El segundo tampón es una mezcla del primer tampón y un tercer tampón, teniendo el segundo tampón un pH de aproximadamente 8,2 a aproximadamente 8,6. El tercer tampón es una solución tris (concentración aproximadamente 50 M; pH aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5) . El cuarto tampón es una solución de NaCl/Tris (concentraciones aproximadamente 1,0 M de NaCl y aproximadamente 20 mM de Tris; pH aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4, preferiblemente aproximadamente 8,9-91). Es particularmente preferido que el pH del segundo tampón sea de entre aproximadamente 8,2 y aproximadamente 8,4. Típicamente, los tampones usados están a una temperatura de entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 50°C. Preferiblemente, la temperatura del tampón es de aproximadamente 12,4 ± 1,0°C durante su utilización. Además, los tampones son típicamente guardados a una temperatura de aproximadamente 9°C a aproximadamente 11 °C. El eluato de Hb es entonces preferiblemente desoxigenado antes de la polimerización para formar una solución de Hb desoxigenada (en adelante, desoxi-Hb) por medios que desoxigenen substancialmente la Hb sin reducir significativamente la capacidad de la Hb en el eluato de Hb para transportar y liberar oxígeno, tal como ocurriría por desnaturalización de la formación de hemoglobina oxidada (metaHb) . En una realización, el eluato de Hb es desoxigenado por transferencia gaseosa de un gas inerte a través de una membrana de fase. Dichos gases inertes incluyen, por ejemplo, nitrógeno, argón y helio. Se entiende que se pueden usar otros medios para desoxigenar una solución de hemoglobina, los cuales son conocidos en la técnica, para desoxigenar el eluato de Hb. Dichos otros medios pueden incluir, por ejemplo, rociado con nitrógeno del eluato de Hb, depuración química con agentes reductores, tales como N-acetil-L-cisteína (NAC) , cisteína, ditionito o ascorbato de sodio o fotolisis por la luz. Después de la elución de la columna cromatográfica, el eluato de Hb es preferiblemente concentrado para mejorar la eficacia del proceso. El eluato de Hb es recirculado a través de un ultrafiltro para concentrar el eluato de Hb y formar una solución de Hb concentrada. Como ultra-filtros adecuados se incluyen, por ejemplo, ultrafiltros de 30.000 o menos Dalton (por ejemplo, Millipore Helicón, Cat # CDUF050G1 o Amicon Cat # 540430) . Típicamente, la concentración del eluato de Hb se completa cuando la concentra-ción de Hb es de entre aproximadamente 100 y aproximadamente 120 g/1. Mientras se concentra el eluato de Hb, se mantiene la temperatura del eluato de Hb preferiblemente a aproximadamente 8-12°C. Se dirige entonces tampón a la solución de Hb, que está preferiblemente concentrada, para ajustar la intensidad iónica de la solución de Hb y aumentar la desoxigenación de la Hb. Se prefiere ajustar la intensidad iónica a entre aproximadamente 150 meq/1 y aproximadamente 200 meq/1 para reducir la afinidad del oxígeno de la Hb en la solución de Hb. Como tampones adecuados se incluyen tampones con un pH que no dé lugar a una desnaturalización sig-nificativa de la proteína Hb, pero que tenga una intensidad iónica suficientemente alta para promover la desoxigenación de la Hb. Como ejemplos de tampones adecuados se incluyen soluciones salinas con un rango de pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,9. Un tampón preferido es una solu-ción acuosa de NaCl 1,0 M, Tris 20 mM con un pH de aproximadamente 8,9. Preferiblemente, la solución de Hb tamponada resultante es entonces recirculada a través del ultrafiltro para concentrar de nuevo la solución de Hb y mejorar la eficacia del proceso. En una realización preferida, la concentración se completa cuando la concentración de Hb es de aproximadamente 100 g/1 a aproximadamente 120 g/1. Durante la desoxigenación, la solución de Hb circula a través de una membrana de transferencia de fase adecuada. Como membranas de transferencia de fase apropiadas se incluyen, por ejemplo, un microfiltro de fibra hueca de polipropileno de 0,05 µm (por ejemplo, Hoechst-Celanese Cat # 5PCM-107) . Al mismo tiempo, se pasa un contraflujo de un gas inerte a través de la membrana de transferencia de fase. Como gases inertes adecuados se incluyen, por ejemplo, nitrógeno, argón y helio. El intercambio de gases a través de la membrana de transferencia de fases elimina así el oxígeno de la solución de Hb. La desoxigenación continúa hasta que la p02 de la solución de Hb se reduce a un nivel en el que el nivel de Hb oxigenada (oxihemoglobina o Hb02) en la solución de Hb es de aproximadamente un 20% o menos. En una realización preferida, el contenido de Hb02 en la solución de Hb es de aproximadamente un 10% o menos. Durante la desoxigenación, la temperatura de la solución de Hb es mantenida típicamente a un nivel que equilibre la velocidad de desoxigenación frente a la velocidad de formación de metahemoglobina. Se mantiene la temperatura para limitar el contenido de metahemoglobina a menos de un 20%. Una temperatura óptima dará lugar a menos de aproximadamente un 5% de contenido de metahemoglobina y, preferiblemente, a menos de aproximadamente un 2,5% de contenido de metahemoglobina, mientras aún se está desoxigenando la solución de Hb. Típicamente, durante la desoxigenación, la temperatura de la solución de Hb se mantiene entre aproximadamente 19°C y aproximadamente 31°C. Durante la oxigenación, y posteriormente a través del resto de las etapas del método de la invención, se mantiene la Hb en un ambiente de bajo contenido en oxígeno para minimizar la absorción de oxígeno por la Hb y mantener un contenido en Hb02 de menos de aproximadamente un 20%, preferiblemente menos de aproximadamente un 10%. La Hb desoxigenada es entonces preferiblemente equilibrada con un tampón de almacenamiento de bajo contenido en oxígeno, que contiene un compuesto sulfhidrilo, para formar una desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Como compuestos sulfhidrilo adecuados se incluyen agentes reductores no tóxicos, tales como N-acetil-L-cisteína (NAC) , D, L-cisteína, ?-glutamilcisteí-na, glutatión, 2,3-dimercapto-1-propanol, 1, 4-butanodi-tiol, tioglicolato y otros compuestos sulfhidrilo biológicamente compatibles. El contenido en oxígeno de un tampón de almacenamiento de bajo contenido en oxígeno debe ser lo suficientemente bajo como para no reducir significativamente la concentración de com- ás puesto sulfhidrilo en el tampón y para limitar el contenido de oxihemoglobina en la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación a aproximadamente un 20% o menos, preferiblemente menos de aproximadamente un 10%. Típicamente, el tampón de almacenamiento tiene una p02 de menos de aproximadamente 50 torr. En una realización preferida, el tampón de almacenamiento debe tener un pH adecuado para equilibrar la polimerización de Hb y la formación de metahemoglobina, tí-picamente aproximadamente 7,6 a aproximadamente 7,9. La cantidad de un compuesto sulfhidrilo mezclado con la desoxi-Hb es una cantidad lo suficientemente alta como para aumentar el entrecruzamiento intramolecular de la Hb durante la polimerización y lo suficientemente baja como para no reducir significativamente el entrecruzamiento intermolecular de las moléculas de Hb, debido a una alta intensidad iónica. Típicamente, se necesita aproximadamente una mol de grupos funcionales sulf-hidrilo (-SH) para estabilizar frente a la oxidación entre aproximadamente 0,25 moles y aproximadamente 5 moles de desoxi-Hb. En una realización preferida, el tampón de almacenamiento contiene aproximadamente 25-35 mM de tampón fosfato de sodio (pH 7,7-7,8) y contiene una cantidad de NAC tal que la concentración de NAC en la desoxi-Hb estabi-lizada frente a la oxidación sea de entre aproximadamente un 0,003% y aproximadamente un 0,3% en peso. Más preferiblemente, la concentración de NAC en la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación es de entre aproximadamente un 0,05% y aproximadamente un 0,2% en peso. Preferiblemente, el tampón de almacenamiento es filtrado antes de mezclarlo con la desoxi-Hb, tal como a través de una membrana de ultrafiltración de 10.000 Dalton (Millipore Helicón Cat # CDUF050G1 o A/G Technology Maxcell Cat # UFP-10-C-75) . En una realización, la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación fluye después a través de un filtro opcional. Como filtros adecuados se incluyen un prefiltro de polipropileno de 0,2 µm y un microfiltro estéril de 0,5 µm (Pall Profile II, Cat # ABIY005Z7 o Gelman Supor) . La desoxi-Hb se mantiene en una atmósfera substancialmente libre de oxígeno. Esto puede conseguirse, por ejemplo, pur-gando y protegiendo el aparato del procedimiento con una manta de un gas inerte, tal como nitrógeno, antes y después de llenar con la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Eventualmente, antes de transferir la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación a la polimerización, se añade una cantidad apropiada de agua al reactor de polimerización. En una realización, una cantidad apropiada de agua es aquella cantidad que da lugar a una solución con una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 g/1 de Hb cuando se añade la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación al reactor de la polimerización. Preferiblemente, el agua está libre de oxígeno. Después de reducir la p02 del agua en la etapa de polimerización a un nivel suficiente para limitar el contenido de Hb02 a aproximadamente un 20%, típicamente a menos de aproximadamente 50 torr, se protege el reactor de polimerización con un gas inerte, tal como nitrógeno. Se transfiere entonces la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación al reactor de la polimerización, que es al mismo tiempo protegido con un flujo apropiado de un gas inerte. Se eleva la temperatura de la solución de desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación en el reactor de la polimerización a una temperatura que optimice la polimerización de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación cuando contacte con un agente entrecruzante. Típicamente, la temperatura de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación es de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C y, preferiblemente, de aproximadamente 41 °C a aproximadamente 43 °C a través de toda la polimerización. Un ejemplo de un medio aceptable de transferencia térmica para calentar el reactor de la polimerización es un sistema calefac-tor con camisa, que se calienta dirigiendo etilenglicol caliente a través de la camisa. La desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación es entonces expuesta a un agente entrecruzante adecuado a una temperatura suficiente para polimerizar la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y formar una solución de hemoglobina polimerizada (poli (Hb) ) a lo largo de un período de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 6 horas . Como ejemplos de agentes entrecruzantes adecuados se incluyen agentes polifuncionales que entrecruzarán proteínas Hb, tales como glutaraldehído, succindialdehído, formas activadas de polioxietileno y dextrano, a-hidroxialdehídos, tales como glicolaldehído, éster N-maleimido-6-aminocaproil- (ácido 2'-nitro-4'-sulfónico) fenílico, éster N-hidroxisuccinimida del ácido m-maleimidobenzoico, 4- (N-maleimidometil) ciciohexano-1-carboxilato de succinimidilo, 4- (N-maleimidometil) ciciohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimi-dilo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, (4-yodoacetil) aminobenzoato de N-succinimidilo, (4-yodoacetil) aminobenzoato de sulfosuccinimidilo, 4- (p-maleimidofenil) butirato de succinimidilo, (4-p-maleimidofenil) butirato de sulfosuccinimidilo, clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, N,N'-fenilendimaleimida y compuestos pertenecientes a la clase bisimidato, la clase acildiazida o la clase dihaluro de arilo, entre otros. Una cantidad adecuada de un agente entrecruzante es aquella cantidad que permite el entrecruzamiento intramolecular para estabilizar la Hb y también el entrecruzamiento intermolecular para formar polímeros de Hb, para así aumentar la retención intravascular. Típicamente, una cantidad adecuada de un agente entrecruzante es aquella cantidad en donde la razón molar de agente entrecruzante a Hb está por encima de aproximadamente 2:1. Preferiblemente, la razón molar de agente entrecruzante a Hb es de entre aproximadamente 20:1 y 40:1. Preferiblemente, la polimerización es llevada a cabo en un tampón coa un pH de entre aproximadamente 7,6 y aproximadamente 7,9, que tiene una concentración de cloruro menor o igual a aproximadamente 35 mmolar. En una realización preferida, se añade una cantidad adecuada de agente entrecruzante a la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y se mezcla luego por un medio de mezcla con baja cizalla. Un medio de mezcla de baja cizalla adecuado incluye una mezcladora estática. Una mez-dadora estática adecuada es, por ejemplo, una mezcladora estática "Kenics", obtenida de Chemineer, Inc. En una realización, la recirculación de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y el agente entrecruzante a través de la mezcladora estática causa condi-ciones de flujo turbulento, con mezcla generalmente uniforme del agente entrecruzante con la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación, reduciendo así el potencial para formar bolsillos de desoxi-Hb que contienen altas concentraciones del agente entrecruzante. La mezcla generalmente uniforme del agente entrecruzante y la desoxi-Hb reduce la formación de polímeros de Hb de alto peso molecular, es de-cir, polímeros que pesan más de 500.000 Dalton, y también permite una mezcla más rápida del agente entrecruzante y al desoxi-Hb durante la polimerización. Más aún, se producirá un entrecruzamiento intramolecular significativo de la Hb durante la polimerización de la Hb debido a la presencia de un compuesto sulfhidrilo, preferiblemente NAC. Mientras que no se conoce el mecanismo exacto de la interacción del compuesto sulfhidrilo con glutaraldehído y/o Hb, se supone que el compuesto sulfhidrilo afecta a la unión química Hb/agente entrecruzante de una forma que inhibe al menos parcialmente la formación de polímeros de Hb de alto peso molecular y forma preferentemente Hb tetramérica estabilizada. La poli (Hb) se define como poseedora de un significativo entrecruzamiento intramolecular si una porción substancial (por ejemplo, al menos aproximadamente un 50%) de las moléculas de Hb están químicamente unidas en la poli (Hb) y sólo una pequeña cantidad, tal como menos de aproximadamente un 15%, están contenidas en cadenas de hemoglobina polimerizada de alto peso molecular. Las molé-culas de poli (Hb) de alto peso molecular son moléculas, por ejemplo, con un peso molecular por encima de aproximadamente 500.000 Dalton. En una realización preferida, se usa glutaraldehído como agente entrecruzante. Típicamente, se usan aproximadamente 10 a aproximadamente 70 gramos de glutaraldehído por kilogramo de desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Más preferiblemente se añade glutaraldehído a lo largo de un período de cinco horas, hasta haber añadido aproximadamente 29-31 gramos de glutaraldehído por cada kilogramo de desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Después de la polimerización, la temperatura de la solución de poli (Hb) en el reactor de polimerización es típicamente reducida a aproximadamente 15°C a aproximadamente 25 °C. Cuando el agente entrecruzante usado no es un aldehido, la poli (Hb) formada es generalmente una poli (Hb) estable. Cuando el agente entrecruzante usado es un aldehido, la poli (Hb) formada generalmente no es estable hasta mezclarla con un agente reductor adecuado para reducir los enlaces menos estables en la poli (Hb) y formar enlaces más estables. Como ejemplos de agentes reductores adecuados se incluyen borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, ditionito de sodio, trimetilamina, t-butilamina, morfolina borano y piridina borano. Antes de añadir el agente reductor, la solución de poli (Hb) es eventualmente concentrada por ultrafiltración hasta que la concentración de la solu-ción de poli (Hb) aumenta a entre aproximadamente 75 y aproximadamente 85 g/1. Un ejemplo de ultrafiltro adecuado es un filtro de 30.000 Dalton (por ejemplo, Millipore Helicón, Cat # CDUF050LT y Amicon, Cat # 540430) . El pH de la solución de poli (Hb) es ajustado entonces al rango de pH alcalino para conservar el agente reductor y evitar la formación de hidrógeno gaseoso, que puede desnaturalizar la Hb durante la posterior reducción. En una realización, el pH es ajustado a más de 10. El pH puede ser ajustado añadiendo una solución tampón a la solu-ción de poli(Hb) durante o después de la polimerización. La poli (Hb) es típicamente purificada para eliminar la hemoglobina no polimerizada. Esto puede conseguirse por diafil-tración o cromatografía con hidroxiapatito (véase, por ejemplo, la Patente EE.UU. 5.691.453, que es aquí incorporada como referencia) . Después del ajuste de pH, se añade al menos un agente reductor, preferiblemente una solución de borohidruro de sodio, a la etapa de polimerización típicamente a través del bucle de desoxigenación. Típicamente, añaden aproximadamente 5 a aproximadamente 18 moles de agente reductor por mol de tetrámero de Hb (por 64.000 Dalton de Hb) en la poli (Hb) . En una realización preferida, por cada nueve litros de solución de poli (Hb) en el subsistema de polimerización 98, se añade un litro de solución de borohidruro de sodio 0,25 M a un ritmo de 0,1 a 0,12 lpm. El pH y los electrolitos de la poli (Hb) estable pueden ser restaurados a niveles fisiológicos para formar un substituto de la sangre basado en hemoglobina polimerizada estable por diafiltración de la poli (Hb) estable con una solución de diafiltración que tiene un pH adecuado y niveles de electrolitos fisiológicos. Preferiblemente, la solución de diafiltración es una solución tampón. Cuando se reduce la poli (Hb) con un agente reductor, la solución de diafiltración tiene un pH ácido, preferiblemente de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6. También se puede añadir un compuesto sulfhidrilo no tóxico a la solución de poli (Hb) estable como depurador de oxígeno para aumentar la estabilidad del substituto de la sangre basado en hemoglobina polimerizada final. El compuesto sulfhidrilo puede ser añadido como parte de la solución de diafiltración y/o puede ser añadido por separado. Se añade una cantidad de compuesto sulfhidrilo para establecer una concentración de sulfhidrilo que elimine el oxígeno para mantener el contenido en metahemoglobina en menos de aproximadamente un 15% a lo largo del período de almacenamiento. Preferiblemente, el compuesto sulfhidrilo es NAC. Típicamente, la cantidad de compuesto sulfhidrilo añadida es una cantidad suficiente para establecer una concentración de sulfhidrilo de entre aproximadamente un 0,05% y aproximadamente un 2% en peso. En una realización preferida, el substituto de la sangre es empaquetado en condiciones de manipulación asépticas, al tiempo que se mantiene presión con una atmósfera inerte substancialmente libre de oxígeno en el reactor de polimerización y en el resto del aparato de transporte. Las especificaciones para un substituto de la sangre basado en hemoglobina polimerizada estable adecuado formado por el método de la invención son dadas en la Tabla I.

Tabla I a Medidos en la Hb antes de la polimerización. El substituto de la sangre estable es entonces almacenado en un recipiente de almacenamiento a corto plazo o en recipientes de almacenamiento estériles, cada uno de ellos con un ambiente pobre en oxígeno, según se ha descrito con detalle anteriormente. El recipiente de almacenamiento debe ser también lo suficientemente impermeable al paso del vapor de agua como para evitar una concentración significativa del substituto de la sangre por evaporación a lo largo del período de almacenamiento. Una concentración significativa del substituto de la sangre es la concentración que da como resultado que uno o más parámetros del substituto de la sangre estén elevados por encima de la es-pecificación. La síntesis de un substituto de la sangre basado en hemoglobina polimerizada estable, formado según el método de la invención, está aún más descrita en la Patente EE.UU. N° 5.296.465. Los vertebrados que pueden recibir el substituto de la sangre, formado por los métodos de la invención, incluyen mamíferos, tales como un humano, un primate no humano, un perro, un gato, una rata, un caballo o una oveja. Además, los vertebrados que pueden recibir dicho subs-tituto de la sangre incluyen fetos (vertebrados prenatales) , vertebrados post-natales o vertebrados en el momento del nacimiento. Un substituto de la sangre de la presente invención puede ser administrado al sistema circulatorio in-yectando el substituto de la sangre directa y/o indirectamente en el sistema circulatorio del vertebrado por uno o más métodos de inyección. Como ejemplos de métodos de inyección directa se incluyen las inyecciones intravascula-res, tales como las inyecciones intravenosas e intraarte-ríales, y las inyecciones intracardíacas . Como ejemplos de métodos de inyección indirecta se incluyen inyecciones intraperitoneales, inyecciones subcutáneas, de tal manera que el substituto de la sangre sea transportado por el sistema linfático al sistema circulatorio, o inyecciones en la mé-dula ósea por medio de un trocar o catéter. Preferiblemente, el substituto de la sangre es administrado intravenosamente .

El vertebrado en tratamiento puede ser normovo-lémico, hipervolémico o hipovolémico antes de, durante y/o después de la infusión del substituto de la sangre. El substituto de la sangre puede ser dirigido al sistema cir-culatorio por métodos tales como carga superior y por métodos de intercambio. Un substituto de la sangre puede ser administrado terapéuticamente para tratar tejidos hipóxicos en un vertebrado, que se producen como resultado de muchas causas diferentes, incluyendo un flujo reducido de RBC en una porción del sistema circulatorio o a través de éste, anemia y shock. Además, el substituto de la sangre puede ser administrado profilácticamente para prevenir la depleción de oxígeno de los tejidos en un vertebrado, que podría ser el resultado de una reducción posible o esperada en el flujo de RBC a un tejido o a través del sistema circulatorio del vertebrado. Se puede encontrar una mayor discusión de la administración de hemoglobina para tratar terapéutica o profilácticamente la hipoxia, particularmente por una obs-trucción arterial parcial o por un bloqueo parcial en la microcirculación, y las dosificaciones usadas en ello, en la Solicitud copendiente de Patente EE.UU. N° de Serie 08/409.337, presentada el 23 de Marzo de 1995, la cual es aquí incorporada a modo de referencia en su totalidad. Típicamente, una dosificación adecuada, o una combinación de dosis de substituto de la sangre, es una cantidad que, cuando está contenida dentro del plasma sanguíneo, da lugar a una concentración de hemoglobina total en la sangre del vertebrado de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 gramos de Hb/dl o más, si es necesario para compensar pérdidas de grandes volúmenes de sangre. La invención será ahora adicional y específica-mente descrita mediante los siguientes ejemplos. Ejemplo 1 Síntesis de substituto de la sangre basado en Hb polimerizada estable Tal como se describe en la Patente EE.UU. N° .296.465, se recogieron muestras de sangre entera de bóvi-do y se mezclaron con un anticoagulante de citrato de sodio para formar una solución de sangre . Se mantuvo cada muestra de solución de sangre tras la recogida a una temperatura de aproximadamente 2°C y se filtró luego para eliminar los grandes agregados y partículas con un tamiz de 600 mallas. Antes de reunirías, se estudió el nivel de penicilina en cada muestra de solución de sangre con un kit de ensayo comprado a Difco, Detroit, Michigan, usando el método titulado "Rápida Detección de Penicilina en Leche" , para asegurarse de que los niveles de penicilina en las soluciones de sangre eran <0,008 unidades/ml. Se juntaron entonces las muestras de soluciones de sangre y se mezclaron con una solución acuosa despirogenada de citrato de sodio para formar una solución al 0,2% en peso de citrato de sodio en sangre entera bovina (en adelante, "solución de sangre con 0,2% de citrato de sodio") . Se pasó entonces la solución de sangre con 0,2% de citrato de sodio en serie a través de filtros de polipropileno de 800 µm y 50 µm para eliminar los grandes restos en la solución de sangre de un diámetro de aproximadamente 50 µm o más. Se lavaron entonces las RBC para separar las proteínas plasmáticas extracelulares, tales como BSA o IgG, de las RBC. Para lavar las RBC contenidas en la solución de 3, sangre, se diluyó inicialmente el volumen de solución de sangre en el tanque de diafiltración por adición de un volumen igual de una solución isotónica filtrada al tanque de diafiltración. Se filtró la solución isotónica con una mem-brana de ultrafiltración Millipore (Cat # CDUF 050 Gl) de 10.000 Dalton. La solución isotónica estaba compuesta por 6,0 g/1 de citrato de sodio dihidrato y 8,0 g/1 de cloruro de sodio en agua para inyección (WFI) . Se concentró entonces la solución de sangre di-luida de nuevo a su volumen original por diafiltración a través de un diafiltro de fibra hueca de 0,2 µm (cartucho de microfiltración Microgon Krosflo II) . Al mismo tiempo, se añadió solución isotónica filtrada de forma continua como relleno, a un ritmo igual al ritmo de pérdida del fil-trado a través del diafiltro de 0,2 µm. Durante la diafiltración, los componentes de la solución de sangre diluida que eran significativamente menores en cuanto a diámetro que las RBC, o que son fluidos, tales como el plasma, pasaron a través de las paredes del diafiltro de 0,2 µm con el filtrado. Las RBC, las plaquetas y los cuerpos de mayor tamaño de la solución de sangre diluida, tales como las células blancas de la sangre, quedaron retenidos con la solución isotónica continuamente añadida para formar una solución de sangre dializada. Durante el lavado de las RBC, se mantuvo la solución de sangre diluida a una temperatura de entre aproximadamente 10 y 25 °C, con una presión de fluido a la entrada del diafiltro de entre aproximadamente 25 psi y aproximadamente 30 psi para mejorar la eficacia del proceso. Se completó el lavado cuando el volumen de filtrado drenado del diafiltro igualó aproximadamente un 600% del volumen de solución de sangre antes de diluir con la solución isotónica filtrada. Se bombeó entonces de forma continua la solución de sangre dializada a un ritmo de aproximadamente 4 Ipm a una Supercentrífuga Sharples , Modelo # AS-16, equi-pada con una chapa anular #28. La centrífuga trabajaba mientras era al mismo tiempo alimentada con solución de sangre dializada, para separar las RBC de las células blancas de la sangre y las plaquetas. Durante la operación, la centrífuga giraba a una velocidad suficiente para separar las RBC en una fase pesada de RBC, mientras que también separaba una porción substancial de las células blancas de la sangre ("WBC") y las plaquetas en una fase ligera de WBC, específicamente a aproximadamente 15.000 rpm. Se descargó una fracción de la fase RBC y de la fase WBC por separado y de forma continua de la centrífuga durante la operación. Después de la separación de las RBC, las RBC fueron lisadas para formar una solución que contenía hemoglobina. Se liso mecánicamente una porción substancial de las RBC mientras se descargaban las RBC de la centrífuga. Las membranas celulares de las RBC se rompieron al impactar con la pared de la línea de descarga de la fase de RBC a un ángulo con respecto al flujo de la fase RBC hacia el exterior de la centrífuga, liberando así la hemoglobina (Hb) de las RBC a la fase RBC. La fase de RBC lisadas fluyó entonces a través de la línea de descarga de la fase de RBC a una mezcladora estática (Kenics 1/2 pulgada con 6 elementos, Chemineer, Inc.) . Al mismo tiempo que la transferencia de la fase RBC a la mezcladora estática, se inyectó también una cantidad igual de WFI en la mezcladora estática, donde la WFI se mezcló con la fase de RBC. Las velocidades de flujo de la fase de RBC y la WFI a la mezcladora estática son cada una de aproximadamente 0,25 lpm. La mezcla de la fase de RBC con WFI en la mezcladora estática produjo un coloide de RBC lisadas. Se transfirió entonces el coloide de RBC lisadas de la mezcla-dora estática a una Supercentrífuga Sharples (Modelo # AS-16, Sharples División of Alfa-Laval Separation, Inc., que era adecuada para separar la Hb de los componentes no hemo-globínicos de las RBC. Se hizo girar la centrífuga a una velocidad suficiente para separar el coloide de RBC lisadas en una fase ligera de Hb y una fase pesada. La fase libera estaba compuesta por Hb y también contenía componentes no hemoglobínicos con una densidad aproximadamente igual o inferior a la densidad de la Hb. La fase Hb fue descargada de manera continua de la centrífuga a través de un microfiltro de 0,45 µm Millipore Pellicon Cassette, Cat # HVLP 000 C5, y a un tanque de contención en preparación para la purificación de la Hb . Se devolvieron entonces los estromas celulares con el material retenido del microfiltro al tanque de contención. Durante la microfiltración, se mantuvo la temperatura en el tanque de contención a 10°C o menos. Para mejorar la eficacia, cuando la presión de fluido a la entrada del microfiltro aumentó de una presión inicial de aproximadamente 10 psi a aproximadamente 25 psi, se completó la microfiltración. Se transfirió entonces el microfiltrado de Hb del microfiltro al tanque de microfiltrado. A continuación, se bombeó el microfiltrado de Hb a través de un ultrafiltro de 100.000 Dalton Millipore Cat # CDUF 050 Hl . Una porción substancial de la Hb y el agua, contenidas en el microfiltrado de Hb, permeó a través del ultrafiltro de 100.000 Dalton para formar un ultrafiltrado de Hb, mientras que los restos celulares de mayor ta-maño, tales como proteínas, con un peso molecular por encima de aproximadamente 100.000 Dalton, quedaron retenidos y fueron recirculados de nuevo al tanque de microfiltrado. Al mismo tiempo, se añadió WFI de forma continua al tanque de microfiltrado como relleno para la pérdida de agua en el ultrafiltrado. En general, los restos celulares incluyen todos los componentes celulares enteros y fragmentados, a excepción de la Hb, proteínas celulares más pequeñas, electrolitos, coenzimas e intermediarios metabólicos orgánicos. La ultrafiltración continuó hasta que la concentración de Hb en el tanque de microfiltrado fue menor de 8 gramos/litro (g/1) . Mientras se ultrafiltraba la Hb, se mantuvo la temperatura interna del tanque de microfiltrado a aproximadamente 10 °C . El ultrafiltrado de Hb fue transferido a un tanque de ultrafiltrado, en el que se hizo entonces recircular al ultrafiltrado de Hb a través de un ultrafiltro de 30.000 Dalton Millipore Cat # CDUF 050 TI para eliminar los componentes celulares más pequeños, tales como electroli-tos, coenzimas, intermediarios metabólicos y proteínas menores de aproximadamente 30.000 Dalton de peso molecular y el agua del ultrafiltrado de Hb, formando así una solución de Hb concentrada que contenía aproximadamente 100 g de Hb/1. Se dirigió entonces la solución de Hb concentrada desde el tanque de ultrafiltrado al medio contenido en columnas cromatográficas paralelas (2 pies de largo con un diámetro interior de 8 pulgadas) para separar la Hb por cromatografía líquida de alto rendimiento. Las columnas cromatográficas contenían un medio de intercambio aniónico adecuado para separar la Hb de las proteínas no hemoglobí-nicas . Se formó el medio de intercambio aniónico a partir de gel de sílice. Se expuso el gel de sílice a ?-glicidoxipropilsilano para formar grupos epóxido activos y se expuso luego a C3H7(CH3)NC1 para formar un medio de intercambio de aniones amonio. Este método de tratamiento del gel de sílice está descrito en el Journal of Chromatography, 120: 321-333 (1976). Cada columna fue pretratada lavando las columnas cromatográficas con un primer tampón que facilitaba la unión de la Hb. Se inyectaron luego 4,52 litros de la solu-ción de Hb concentrada en cada columna cromatográfica. Después de inyectar la solución de Hb concentrada, las columnas cromatográficas fueron entonces lavadas dirigiendo sucesivamente tres tampones diferentes a través de las columnas cromatográficas para producir un eluato de Hb produ-ciendo un gradiente de pH en las columnas . La temperatura de cada tampón durante su uso era de aproximadamente 12,4°C. Los tampones fueron prefiltrados a través de una membrana de ultrafiltración de 10.000 Dalton antes de la inyección en las columnas cromatográficas . El primer tampón, tris-hidroximetilaminometa-no (Tris) 20 mM (pH aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4), transportaba la solución de Hb concentrada al medio de las columnas cromatográficas para unir la Hb. El segundo tampón, una mezcla del primer tampón y un tercer tampón, teniendo el segundo tampón un pH de aproximadamente 8,3, ajustaba entonces el pH en las columnas cromatográficas para eluir los componentes no hemoglobínicos contaminantes de las columnas cromatográficas, mientras retenía la Hb. El equilibrado con el segundo tampón continuaba durante aproximadamente 30 minutos a una velocidad de flujo de aproximadamente 3,56 lpm por columna. Se eliminó el eluato del segundo tampón como desecho. El tercer tampón, Tris 50 mM (pH aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5) eluyó entonces la Hb de las columnas cromatográficas . Se dirigió entonces el eluato de Hb a través de un filtro estéril de 0,22 µ Sartobran Cat # 5232507 G1PH a un tanque en el que se recogió el eluato de Hb. Se dirigió el primer 3-4% del eluato de Hb y el último 3-4% del eluato de Hb a desecho . Se usó aún el eluato de Hb si el eluato contenía menos de 0,05 UE/ml de endotoxina y contenía menos de 3,3 nmoles/ml de fosfolípidos. A sesenta litros de eluato ultrapuro, que tenía una concentración de 100 g de Hb/1, se añadieron 9 1 de tampón NaCl 1,0 M, Tris 20 mM (pH 8,9), formando así una solución de Hb con una intensidad iónica de 160 mM, para reducir la afinidad por el oxígeno de la Hb en la solución de Hb. Se concentró entonces la solución de Hb a 10 °C por recirculación a través del ultrafiltro, específicamente un filtro de 10.000 Dalton Millipore Helicón, Cat # CDUF050G1, hasta que la concentración de Hb fue de 110 g/1. La solución de Hb fue entonces desoxigenada hasta que el pH de la solución de Hb se redujo hasta el nivel en que el contenido en Hb02 era de aproximadamente un 10% mediante recirculación de la solución de Hb a 12 Ipm a través de una membrana de transferencia de fase de micro-filtro de polipropileno de 0,05 µm de Hoechst-Celanese Corporation Cat # G-240/40, para formar una solución de Hb desoxigenada (en adelante, "desoxi-Hb"). Al mismo tiempo, se dirigió un flujo de 60 Ipm de nitrógeno gaseoso a través del contralado de la membrana de transferencia de fase. Du-rante la desoxigenación, se mantuvo la temperatura de la solución de Hb entre aproximadamente 19 °C y aproximadamente 31°C.

También durante la desoxigenación, y posteriormente a lo largo del proceso, se mantuvo la Hb en un ambiente pobre en oxígeno para minimizar la absorción de oxígeno por la Hb y mantener un contenido en Hb oxigenada (oxihemoglobina o Hb02) de menos de aproximadamente un 10% en la desoxi-Hb. Se diafiltró entonces la desoxi-Hb (60 litros) a través de un ultrafiltro con 180 de un tampón de almacenamiento que contenía un tampón de 0,2% en peso de N-acetilcisteína, fosfato de sodio 33 mM (pH 7,8) que tenía una p02 de menos de 50 torr, para formar una desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. Antes de mezclar con la desoxi-Hb, se despirogenó el tampón de almacenamiento con un filtro despirogenante de 10.000 Dalton Millipore Heli-con, Cat # CDUF050G1. Se añadió continuamente el tampón de almacenamiento a un ritmo aproximadamente equivalente a la pérdida de fluido a través del ultrafiltro. La diafiltración continuó hasta que el volumen de fluido perdido por diafiltra-ción a través del ultrafiltro fue aproximadamente tres veces el volumen inicial de la desoxi-Hb. Antes de transferir la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación a un aparato de polimerización, se añadió WFI libre de oxígeno al reactor de polimerización para purgar el aparato de polimerización de oxígeno y evitar la oxigenación de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación. La cantidad de WFI añadida al aparato de polimerización era aquella cantidad que diera lugar a una solución de Hb con una concentración de aproximadamente 40 g de Hb/1 al añadir la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación al reactor de la polimerización. La WFI fue entonces recirculada por todo el aparato de polimerización para des-oxigenar la WFI por flujo a través de una membrana de transferencia de fase de microfiltro de polipropileno de 0,05 µm (Hoechst-Celanese Corporation Cat # 5PCM-108, 80 pies cuadrados) frente a un contraflujo de nitrógeno presu-rizado. Las velocidades de flujo de WFI y nitrógeno gaseoso, a través de la membrana de transferencia de fase eran de aproximadamente 18 a 20 lpm y 40 a 60 lpm, respectivamente . Después de reducir la p02 de la WFI en el apa-rato de polimerización a una p02 de menos de aproximadamente 2 torr, se protegió el reactor de polimerización con una manta de nitrógeno por medio de un flujo de aproximadamente 20 lpm de nitrógeno al espacio de cabeza del reactor de polimerización. Se transfirió entonces la desoxi-Hb estabili-zada frente a la oxidación al reactor de polimerización. Se llevó a cabo la polimerización en un tampón fosfato de 12 mM con un pH de 7,8, que tenía una concentración de cloruro menor o igual a aproximadamente 35 mmolar. La desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y la N-acetilcisteína fueron mezcladas lentamente a continuación con el agente entrecruzante glutaraldehído, concretamente con 29,4 gramos de glutaraldehído por cada kilogramo de Hb a lo largo de un período de cinco horas, mientras se calentaba a 40 °C y se recirculaba la solución de Hb me-diante una mezcladora estática Kenics 1-1/pulgada con 6 elementos (Chemineer, Inc.), para formar una solución de Hb polimerizada (poli (Hb) ) . La recirculación de la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación y del glutaraldehído mediante la mez-dador estática causó condiciones de flujo turbulento con mezcla generalmente uniforme del glutaraldehído con la desoxi-Hb estabilizada frente a la oxidación, reduciendo así el potencial de formación de bolsillos de desoxi-Hb con contenido de grandes concentraciones de glutaraldehído. La mezcla generalmente uniforme del glutaraldehído y la desoxi-Hb reducía la formación de poli (Hb) de alto peso mole-cular (que tiene un peso molecular por encima de 500.000 Dalton) y permitía también una mezcla más rápida del glutaraldehído y la desoxi-Hb durante la polimerización. Además, se produjo un entrecruzamiento intramolecular significativo de la Hb durante la polimerización de la Hb como efecto de la presencia de N-acetilcisteína con la polimerización de la Hb. Tras la polimerización, la temperatura de la solución de poli (Hb) en el reactor de polimerización se redujo a una temperatura de entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 25 °C. Se concentró entonces la solución de poli (Hb) recirculando la solución de poli (Hb) a través del ultrafiltro hasta que la concentración de la poli (Hb) aumentó a aproximadamente 85 g/1. Un ultrafiltro adecuado es un fil-tro de 30.000 Dalton (por ejemplo, Millipore Helicón, Cat # CDUF050LT) . A continuación, se mezcló la solución de poli (Hb) con 66,75 g de borohidruro de sodio y se recirculó de nuevo mediante la mezcladora estática. Concretamente, por cada nueve litros de solución de poli (Hb) , se añadió un litro de solución de borohidruro de sodio 0,25 M a un ritmo de 0,1 a 0,12 lpm. Antes de añadir el borohidruro de sodio a la solución de poli (Hb) , se basificó el pH de la solución de poli (Hb) ajustando el pH a un pH de aproximadamente 10 para conservar el borohidruro de sodio y para evitar la formación de hidrógeno gaseoso. El pH de la solución de poli (Hb) fue ajustado diafiltrando la solución de poli (Hb) con aproximadamente 215 1 de tampón borato de sodio 12 mM desoxigenado y despirogenado, que tenía un pH de aproximadamente 10,4 a aproximadamente 10,6. Se diafiltró la solución de poli (Hb) recirculando la solución de poli (Hb) desde el reactor de polimerización a través del ultrafiltro de 30 kD. Se añadió el tampón borato de sodio a la solución de poli (Hb) a un ritmo aproximadamente equivalente al ritmo de pérdida de fluido a través del ultrafiltro de la diafiltra-ción. La diafiltración continuó hasta que el volumen de fluido perdido a través del ultrafiltro de la diafiltración era aproximadamente tres veces el volumen inicial de la solución de poli (Hb) en el reactor de polimerización. Después del ajuste del pH, se añadió la solu-ción de borohidruro de sodio al reactor de polimerización para reducir los enlaces en la solución de poli (Hb) a enlaces y para formar poli (Hb) en solución. Durante la adición de borohidruro de sodio, se recirculó continuamente la solución de poli (Hb) en el reactor de polimerización a través de la mezcladora estática y la membrana de transferencia de fase de microfiltro de polipropileno de 0,05 µm para eliminar el oxígeno y el hidrógeno disueltos. El flujo a través de una mezcladora estática también proporcionaba condiciones de flujo turbulento de borohidruro de sodio, que mez-ciaban rápida y eficazmente el boroh?druro de sodio con la solución de poli (Hb) . Las velocidades de flujo de la solución de poli (Hb) y de gas nitrógeno a través de la membrana de transferencia de fase de 0,05 µm eran de entre 2,0 y 4,0 Ipm y entre aproximadamente 12 y 18 lpm, respectivamente. Tras completarse la adición del borohidruro de sodio, la reducción continuó en el reactor de polimerización mientras un agitador contenido en el mismo giraba a aproximadamente 75 rotaciones por minuto. Aproximadamente una hora después de la adición del borohidruro de sodio, se hizo recircular a la solución de poli (Hb) estable desde el reactor de polimerización a través del ultrafiltro de 30.000 Dalton hasta que la concentración de solución de poli (Hb) estable fue de 110 g/1. Después de la concentración, se restauraron el pH y los electrolitos de la solución de poli (Hb) estable a niveles fisiológicos para formar un substituto de sangre basado en Hb polimerizada estable, mediante diafiltración de la solución de poli (Hb) estable a través del ultrafiltro de 30.000 Dalton, con un tampón filtrado y desoxigenado de bajo pH que contenía lactato de sodio 27 mM, NAC 12 mM, NaCl 115 mM, KCl 4 mM y CaCl2 1,36 mM en WFI (pH 5,0) . La diafiltra-ción continuó hasta que el volumen de fluido perdido por diafiltración a través del ultrafiltro fue aproximadamente 6 veces el volumen de prediafiltración del producto de Hb concentrado . Después de restaurar el pH y los electrolitos a niveles fisiológicos, se diluyó entonces el substituto de la sangre basado en Hb polimerizada estable a una concentración de 5,0 g/dl añadiendo el tampón filtrado y desoxigenado de bajo pH al reactor de la polimerización. Se dia-filtró entonces el substituto de la sangre diluido por re-circulación desde el reactor de polimerización a través de la mezcladora estática y un filtro de purificación de 100.000 Dalton frente a un tampón filtrado desoxigenado que contenía lactato de sodio 27 mM, NAC 12 mM, NaCl 115 mM, KCl 4 mM y CaCl2 1,36 mM en WFI (pH 7,8). La diafiltración continuó hasta que el substituto de la sangre contuvo una cantidad menor o igual a aproximadamente un 10% de especies tetraméricas modificadas y tetraméricas no modificadas por GPC cuando se hizo en condiciones disociantes. El filtro de purificación fue conducido en condiciones de baja presión de transmembrana con una línea restringida de permeado. Después de la eliminación de can-tidades substanciales de Hb tetramérica modificada y Hb te-tramérica no modificada, la recirculación del substituto de la sangre continuó a través del ultrafiltro de 30.000 Dalton hasta que la concentración del substituto de la sangre fue de aproximadamente 130 g/1. Se guardó entonces el substituto de la sangre estable en un recipiente adecuado que tenía un ambiente pobre en oxígeno y una baja infiltración de oxígeno. Ejemplo 2 Almacenamiento del substituto de la sangre basado en hemoglobina: sobreenvoltura de hoja metálica El substituto de la sangre basado en hemoglobina preparado en el Ejemplo 1, empaquetado en un paquete Stericon de 600 ml, fue sobreenvuelto en un paquete laminado de hoja metálica (KAPAK 50303, al que se hace referencia a continuación como "hoja metálica"), paquete Cryovac BYV200 o Cryovac P640B. KAPAK 50303 es un recipiente laminado de hoja metálica en el que la capa de hoja metálica es una hoja metálica de aluminio. Cryovac BYV200 es un laminado que contiene una capa de alcohol polivinílico revestida por los dos lados con Sarán de 0,0006 pulgadas (ó 0,015 milímetros) . La permeabilidad al oxígeno de estos dos laminados es menor de 0,02 cc por 100 pulgadas cuadradas (ó 0,02 cc por 645 centímetros cuadrados) por 24 h por atm por 72 °F (ó 22 °C) y 0% de humedad. Cryovac P640B es un material la-minado que contiene una capa de Nilón orientada biaxialmente y revestida con Sarán de 0,0006 pulgadas (ó 0,015 milímetros) , una capa adhesiva y una capa selladora de polieti- leño lineal de baja densidad. La permeabilidad al oxígeno del material es de aproximadamente 8 a 15 cc por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 8 a 15 cc por 645 centímetros cuadrados) por 24 horas por atm a 72 °C (ó 22 °C) y 0% de humedad. Los substitutos de la sangre empaquetados fueron mantenidos a temperatura ambiente durante aproximadamente 48 días con toma de muestras periódicas de la concentración y/o los niveles de N-acetil-L-cisteína (NAC) , bis- N-acetil-L-císteína (NAC2) , Hb total (THb) , hemoglobina oxigenada (Hb02) y metahemoglobina (metaHb) . En la Tabla II, se dan los resultados. Tabla II Datos de estabilidad de las sobreenvolturas So Se repitió esencialmente el experimento anterior, donde se sobreenvolvió un substituto de la sangre basado en hemoglobina en un paquete laminado de hoja metálica (KAPAK 50303) . Se mantuvieron los substitutos de la sangre empaquetados a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 meses, con toma periódica de muestras de la concentración y/o niveles de N-acetil-L-cisteína (NAC) , bis-N- acetil-L-cisteína (NAC2) , HB total (THb) , hemoglobina oxigenada (Hb02) y metahemoglobina (metaHb) . En la Tabla III, se dan los resultados. Tabla III Datos de estabilidad de las sobreenvolturas de hoja metálica Ejemplo 3 Almacenamiento de substituto de la sangre basado en hemoglobina: paquete primario Se empaquetó el substituto de la sangre basado en hemoglobina, tal como fue preparado en el Ejemplo 1, en un paquete primario de barrera frente al oxígeno (E-13135 y E-13242, American National Can) . La construcción del paquete primario ha sido descrita con detalle en lo que antece-de. El paquete primario es un material laminado que consiste en una capa de polietileno de densidad media, una capa de alcohol etilenvinílico/nilón y una capa selladora de polietileno lineal de baja densidad.

Ejemplo 4 Almacenamiento de substituto de la sangre basado en hemoglobina: sobreenvoltura transparente Se sobreenvolvió el substituto de la sangre basado en hemoglobina, preparado como en el Ejemplo 1, empaquetado en un paquete primario adecuado, en un paquete laminado transparente consistente en una capa de polipropileno, una capa de alcohol etilenvinílico y una capa de polipropileno. Se usó una máquina de empaquetado automatizado (Tiromat) para generar las sobreenvolturas. La permeabilidad al oxígeno del material es de aproximadamente 0,00153 cc por 100 pulgadas cuadradas (ó 0,00153 cc por 645 centímetros cuadrados) por atm por día (a 25°C y 100%/50% HR) . El substituto de la sangre empaquetado fue mantenido a 40 °C y 100%/60% HR durante 12 meses y se midieron la concentración y/o niveles de N-acetil-L-cisteína (NAC) , bis-N- acetil-L-cisteína (NAC2) , HB total (THb) , hemoglobina oxigenada (Hb02) y metahemoglobina (metaHb) . En la Tabla IV, se dan los resultados . El mantenimiento de las muestras a la elevada temperatura de 40 °C durante 12 meses tiene el efecto del almacenamiento durante 24 meses a 23 °C. Tabla IV Datos de estabilidad acelerada de sobreenvolturas Transparentes (EVOH) Ejemplo 5 Análisis de la hemoglobina polimerizada Se determina la concentración de endotoxina en el producto de hemoglobina por el método "Metodología Ciné-tica/Turbidimétrica del LAL 5000", desarrollado por Associates of Cape Cod, Woods Hole, Massachusetts, J. Levin y col., J. Lab. Clin . Med. , 75: 903-911 (1970). Se usaron va-rios métodos para estudiar cualquier traza de estroma, por ejemplo un ensayo de precipitación, inmunotransferencia y ensayo inmunosorbente ligado a enzimas ("ELISA"), para una proteína de membrana celular o glicolípido específicos conocidos por los expertos en la técnica. Se determinó el recuento de material particulado por el método "Materia particulada en inyecciones: inyecciones de grandes volúmenes para infusiones de una sola dosis", U. S. Pharmacopeia, 22: 1596, 1990. Para determinar la concentración de glutaralde-hído, se derivatizó una muestra representativa de 400 µl del producto de hemoglobina con dinitrofenilhidrazina y luego se inyectó una alícuota de 100 µl de la solución derivada en una columna YMC AQ-303 ODS a 27°C, a una velocidad de 1 ml/min, junto con un gradiente. El gradiente con-sistía en dos fases móviles, ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% en agua y TFA 0,08% en acetonitrilo. El flujo en gradiente consistía en un 60% de TFA 0,08% constante en acetonitrilo durante 6,0 minutos, un gradiente lineal de un 85% de TFA 0,08% en acetonitrüo a lo largo de 12 minutos, un gradiente lineal de un 100% de TFA 0,08% en acetonitrilo a lo largo de 4 minutos mantenido a un 100% de TFA 0,08% en acetonitrilo durante 2 minutos y re-equilibrando a un 45% de TFA 0,1% en agua. Se midió la detección por ultravioleta a 360 nm. Para determinar la concentración de NAC, se diluyó una alícuota de producto de hemoglobina a 1:100 con fosfato de sodio desgasificado en agua y se inyectaron 50 µl en una columna YMC AQ-303 ODS con un gradiente. Los tampones del gradiente consistían en un fosfato de sodio en solución acuosa y una mezcla de acetonitrilo 80% en agua con TFA 0,05%. El flujo de gradiente consistía en un 100% de fosfato de sodio en agua durante 15 minutos, luego un gradiente lineal de un 100% de mezcla de acetonitrilo 80% y TFA 0,05% a lo largo de 5 minutos, con un mantenimiento durante 5 minutos. El sistema fue entonces reequilibrado a un 100% de fosfato de sodio durante 20 minutos. El análisis de fosfolípidos fue realizado por un método basado en los procedimientos contenidos en los dos trabajos siguientes: Kolarovic y col., "A Comparison of Extraction Methods for the Isolation of Phospholipids from Biological Sources", Anal. Biochem . , 156: 244-250, 1986, y Duck-Chong, C.G., "A Rapid Sensitive Method for Determining Phospholipid Phosphorus Involving Digestión with Magnesium Nitrate", Lipids, 14: 492-297, 1979. Se determinó la osmolaridad por análisis en un Osmómetro Criomático Avanzado, Modelo #3C2, Advanced Ins-truments, Inc., Needham, Massachusetts. Las concentraciones de hemoglobina total, meta-hemoglobina y oxihemoglobina fueron determinadas en un Co-Oxímetro Modelo #482, de Instrumentation Laboratory, Lexington, Massachusetts. Las concentraciones de Na+, K+, Cl", Ca++ y p0 fueron determinadas por un Novastat Profile 4, Nova Biomedical Corporation, Waltham, Massachusetts.

La constante de unión del oxígeno, P50, fue determinada por un Hemox-Analyzer, TCS Corporation, South-hampton, Pennsylvania. La temperatura y el pH fueron determinados por métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica. El peso molecular (P.M.) fue determinado mediante cromatografía de permeación por gel ("GPC") de productos de hemoglobina en condiciones disociantes. Una muestra representativa del producto de hemoglobina fue analizada en cuanto a la distribución de pesos moleculares. Se diluyó el producto de hemoglobina a 4 mg/ml en una fase móvil de Bis-Tris 50 mM (pH 6,5), MgCl2 750 mM y EDTA 0,1 mM. Este tampón sirve para disociar el tetrámero de Hb en dímeros, los cuales no han sido entrecruzados con otros dímeros de Hb a través de entrecruzamientos intramoleculares o intermoleculares, a partir de la poli (Hb) . Esta muestra diluida fue inyectada en una columna TosoHaas G3000SW. La velocidad de flujo era de 0,5 ml/min y la detección por ultravioleta fue registrada a 280 nm. Los resultados de las pruebas anteriores sobre substitutos de la sangre basados en Hb veterinarios (OXY-GLOBIN™) y humano, formados según el método de la invención, están resumidos en las Tablas V y VI, respectivamente.

Tabla V Medidos en la Hb antes de la polimerización.

Tabla VI a Medidos en la Hb antes de la polimerización. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando tan sólo una experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención aquí descrita. Éstos y cualquier otro equivalente pretenden quedar amparados por las reivindicaciones siguientes .

Claims

REIVINDICACIONES
La invención reivindicada es : 1. Un método para conservar un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado y empaquetado consistente en mantener el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado y empaquetado en un paquete de sobreenvoltura de película de barrera para el oxígeno que incluye un material laminado transparente, cuyo material laminado transparente consiste en una capa de poliolefina y una capa de barrera para el oxígeno que incluye alcohol etilenvinílico, donde el laminado tiene un grosor de entre aproximadamente 0,0254 y 0,254 milímetros y una permeabilidad al oxígeno de menos de aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 645 centímetros cuadrados a lo largo de 24 horas a una atmósfera y a aproximadamente 23 °C. 2. El método de la Reivindicación 1, donde la capa de poliolefina y la capa de barrera frente al oxígeno están coextruidas.
3. El método de la Reivindicación 1, donde el paquete de sobreenvoltura de película de barrera para el oxígeno incluye al menos dos hojas de un material laminado, donde al menos una hoja del paquete de sobreenvoltura consiste en un material laminado transparente y donde al menos otra hoja del paquete con sobreenvoltura consiste en un material laminado de hoja metálica.
4. El método de la Reivindicación 3, donde el paquete de sobreenvoltura es producido: a) formando dicho laminado de hoja metálica pa-ra que defina al menos una cámara, b) colocando el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado en dicha cámara y c) sellando por calor el laminado transparente al laminado de hoja metálica, mediante lo cual se forma dicha sobreenvoltura de película de barrera frente al oxígeno, que contiene así el substituto de sangre basado en hemoglobina dentro de la sobreenvoltura.
5. El método de la Reivindicación 1, donde el substituto de la sangre basado en hemoglobina es mantenido bajo una atmósfera de nitrógeno, argón o helio.
6. Un substituto de la sangre basado en hemo-globina desoxigenado conservado, que consiste en: a) un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado y empaquetado y b) un paquete de sobreenvoltura de película de barrera para el oxígeno que contiene un material laminado transparente, cuyo material laminado transparente consiste en una capa de poliolefina y una capa de barrera para el oxígeno que incluye alcohol etilenvinílico, donde el laminado tiene una permeabilidad al oxígeno de menos de aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 645 centímetros cua-drados a lo largo de 24 horas a una atmósfera y a aproximadamente 23 °C, donde el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado y empaquetado está sellado dentro del paquete de sobreenvoltura.
7. El substituto de la sangre desoxigenado con-servado de la Reivindicación 6, donde la primera capa de poliolefina y la capa de barrera frente al oxígeno están coextruidas .
8. El substituto de la sangre desoxigenado conservado de la Reivindicación 6, donde el paquete de sobre-envoltura de película de barrera para el oxígeno incluye al menos dos hojas de un material laminado, donde al menos una hoja del paquete de sobreenvoltura consiste en un material laminado transparente y donde al menos otra hoja del paquete con sobreenvoltura consiste en un material laminado de hoja metálica.
9. El substituto de la sangre desoxigenado conservado de la Reivindicación 8, donde el paquete de sobre-envoltura es producido: a) formando dicho laminado de hoja metálica para que defina al menos una cámara, b) colocando el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado empaquetado en dicha cámara y c) sellando por calor el laminado transparente al laminado de hoja metálica, mediante lo cual se forma dicha sobreenvoltura de película de barrera frente al oxígeno, que contiene así el substituto de sangre basado en hemoglobina empaquetado dentro de la sobreenvoltura. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un método para conservar la estabilidad de un substituto de la sangre basado en hemoglobina consistente en mantener el substituto de la sangre basado en hemoglobina en una atmósfera substancialmente libre de oxígeno. El método para conservar un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado consiste en mantener el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado en un paquete de sobreenvoltura de película de barrera frente al oxígeno. En una realización, el paquete contiene un material laminado transparente consistente en una capa de barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina, donde el laminado tiene un grosor de entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 0,01 pulgadas (o entre aproximadamente 0,0254 y aproximadamente 0,254 milímetros) y una permeabilidad al oxígeno menor de aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 0,01 cc por 645 centímetros cuadrados) a lo largo de 24 horas a 1 atmósfera y a aproximadamente 23 °C. La capa de barrera para el oxígeno consiste en alcohol etilenvinílico. También se facilita aquí un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado conservado que consiste en un substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado y un paquete de sobreenvoltura de película de barrera para el oxígeno. El paquete contiene un material laminado transparente que consiste en una capa de barrera para el oxígeno y una capa de poliolefina. Dicha capa de barrera para el oxígeno tiene una permeabilidad al oxígeno menor de aproximadamente 0,01 centímetros cúbicos por 100 pulgadas cuadradas (o aproximadamente 0,01 cc por 645 centímetros cuadrados) a lo largo de 24 horas a 1 atmósfera y a aproximadamente 27°C de temperatura ambiente, donde el substituto de la sangre basado en hemoglobina desoxigenado está sellado en el interior del paquete de sobre-envoltura. En una realización, la capa de barrera para el oxígeno consiste en alcohol etilenvinílico.