ES2250882T3

ES2250882T3 - Procedimiento para la produccion de preparaciones enriquecidas en tocotrienol.

Info

Publication number: ES2250882T3
Application number: ES03717027T
Authority: ES
Inventors: Peter Kossler; Norbert Fuchs; Behzad Sadeghi
Original assignee: Vis-Vitalis Lizenz- und Handels GmbH
Current assignee: Vis-Vitalis Lizenz- und Handels GmbH
Priority date: 2002-05-03
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2023-04-30
Also published as: AU2003221617A1; ATE308334T1; WO2003092709A1; DK1501525T3; EP1501525A1; AT414082B; US20050234248A1; ATA6852002A; SI1501525T1; CA2487693A1; EP1501525B1; DE50301559D1; JP2005536191A; TW200400957A

Abstract

Procedimiento para la producción de preparaciones enriquecidas en tocotrienol, caracterizado por los siguientes pasos: - Incubación de semillas vegetales con una solución nutriente de electrolitos, de manera que se formen brotes vegetales enriquecidos en tocotrienol, - Obtención de los brotes vegetales y - Extracción de una preparación que contiene tocotrienol, a partir de los brotes vegetales obtenidos, en particular, a partir del salvado y del germen de los brotes vegetales obtenidos.

Description

Procedimiento para la producción de preparaciones enriquecidas en tocotrienol.

La invención se refiere a un procedimiento para la producción de preparaciones enriquecidas en tocotrienol.

Mientras que la ciencia alimentaria convencional durante las últimas décadas se limitaba a examinar de forma primaria nutrientes (proteínas, hidratos de carbono, grasas, vitaminas, sustancias minerales y oligoelementos), en cuanto a sus propiedades "nutrientes" (es decir, en cuanto a la garantía del metabolismo de síntesis y del funcionamiento), durante los últimos años se enfocaron de forma creciente las llamadas sustancias vegetales secundarias (sustancias fitoquímicas) por ser de interés para la ciencia de la alimentación. Aunque estas sustancias naturales por definición no se cuentan entre los nutrientes clásicos, ejercen numerosos efectos biológicos, por lo que también se las denomina "sustancias vegetales bioactivas".

Los tocotrienoles pertenecen a esta categoría de sustancias vegetales, aunque también se los cuenta como vitaminas porque presentan actividad de vitamina E, aunque baja. Además de esta actividad de vitamina E, estos tocotrienoles presentan propiedades de reducción del colesterol, citoprotectoras y antioxidantes. A nivel molecular, los antioxidantes se caracterizan por su capacidad de ceder electrones a moléculas coparticipantes, midiéndose esta capacidad de ceder electrones para compuestos definidos de moléculas individuales mediante el llamado potencial de oxidorreducción estándar, en cambio, expresándose para mezclas de antioxidantes mediante la llamada capacidad antioxidante (capacidad reductora). El potencial antioxidante de tocotrienoles, en comparación con el de los tocoferoles sintéticos, dependiendo del medio de análisis y del procedimiento de análisis, se describe como cincuenta a mil veces
mayor.

Debido a su estructura molecular, los tocotrienoles son exclusivamente liposolubles, de manera que en el tejido humano y animal predominantemente despliegan su actividad biológica en los compartimientos lipófilos (biomembranas intracelulares y extracelulares). Por ello, los antioxidantes lipófilos desempeñan un papel biológico importante en el marco de la protección antioxidante de núcleos celulares (material genético), de las mitocondrias (abastecimiento celular de energía), del retículo endoplasmático (rendimiento de síntesis celular), así como en la membrana celular (estabilidad y duración de la vida de tejidos). Por esta razón, los tocotrienoles revisten una enorme importancia en cuanto a la protección del material genético (protección contra mutaciones por peróxidos, radicales y xenobióticos dañinos), al abastecimiento celular óptimo de energía (capacidad de rendimiento de células inmunitarias y de células de órganos), al rendimiento celular de síntesis (potencial de regeneración del sistema inmunitario y de tejidos), así como para la capacidad de funcionamiento y la duración de vida de todas las células corporales, que llega más allá del fin básico de alimentación. En particular, el sistema nervioso, el sistema nervioso central, igual que el sistema nervioso periférico, que en más del 50% está constituido por sustancias lipoides, depende de la protección suficiente y permanente de sus estructuras por antioxidantes lipófilos. Por ello, los campos de aplicación medicinal de alimentación de los tocotrienoles comprenden el sistema inmunitario (alergias, cáncer), así como el sistema cardiovascular (angina de pecho, infarto de miocardio, prevención y cuidado posterior), el aparato de músculos/tendones/articulaciones (enfermedades degenerativas de músculos y articulaciones), el hígado como órgano desintoxicante (enfermedades debidas al medio ambiente), la piel (enfermedades atópicas, envejecimiento) y finalmente, procesos de regeneración del sistema nervioso (en esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedades espinales y neurológicas periféricas, y consecuencias de lesiones).

Por ello, existe una necesidad de que se proporcionen productos que contengan tocotrienol, en particular, productos naturales con contenido especialmente alto de tocotrienol.

Por ello, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de preparaciones enriquecidas en tocotrienol, que presenta los siguientes pasos:

-: Incubación de semillas vegetales con una solución nutriente de electrolitos, de manera que se formen brotes de plantas enriquecidos con tocotrienol,

-: Obtención de los brotes vegetales y

-: Extracción de una preparación que contiene tocotrienol a partir de los brotes vegetales obtenidos, en particular, a partir del salvado y del germen de los brotes vegetales obtenidos.

Se demostró, que mediante el procedimiento conforme a la invención puede aumentarse decisivamente el contenido de tocotrienol de brotes vegetales, aunque otras sustancias vegetales secundarias antioxidantes emparentadas de forma cercana como, por ejemplo, tocoferoles, durante la germinación, en particular, durante la germinación llevada a cabo conforme a la invención, en parte se reducen fuertemente. En principio, en el transcurso de la germinación, en general, se parte de la base de que la necesidad de la semilla que germina, en cuanto a material de síntesis y moléculas protectoras antioxidantes, aumenta para este proceso y son usadas en seguida las sustancias existentes o formadas inmediatamente de forma nueva, para cubrir esta necesidad aumentada. Por ello, era más sorprendente que una clase determinada, especialmente valiosa de compuestos, los tocotrienoles, pudiera enriquecerse de forma selectiva por la germinación en solución nutriente enriquecida por electrolitos.

La germinación de semillas vegetales en soluciones nutrientes de electrolitos está descrita, por ejemplo, en los documentos EP 0770324 A y EP 0799578 A. Era conocido, que los brotes obtenidos de esta manera presentan un contenido aumentado de electrolitos, sin embargo, el gasto de moléculas protectoras antioxidantes también aumenta y por ello, la cantidad de éstas en el brote está reducida.

Conforme al documento US 5908940 A, se describe un procedimiento especial para la producción de productos de "Tocol" (tocotrienol, tocoferol y compuestos similares al tocotrienol), en el que se calienta de forma seca una materia prima vegetal a 80-150ºC, durante 30 minutos a 4 horas, después de lo cual se extraen los componentes deseados. Como material vegetal de partida, allí se mencionan una serie de los más diversos materiales. Pero allí no están previstos ni la germinación del material de partida (para producir los brotes enriquecidos por electrolitos), ni el enriquecimiento del material de partida con nutrientes inorgánicos. El procedimiento allí descrito más bien apunta a inactivar enzimas vegetales por acción del calor, para impedir una degradación de tocoferoles y tocotrienoles. El aspecto central sorprendente de la presente invención, por el que justamente pueden obtenerse tocotrienoles con rendimiento aumentado, a partir de brotes enriquecidos especialmente por electrolitos, pero, por ejemplo, al mismo tiempo se reduce el contenido de tocoferol, no se desprende de este documento ni se sugiere esto mediante el
mismo.

El documento EP 0616810 A1 se refiere al uso de arroz germinante como medicamento, en particular, para la profilaxis y la terapia del cáncer. Sin embargo, este documento ni se refiere de forma general a un contenido de tocotrienol, ni puede extraerse ninguna indicación de que justamente en brotes (de arroz) pueda comprobarse un contenido aumentado de tocotrienol. Además, de este documento no se desprende que se realice la germinación en medios enriquecidos con electrolitos.

Aquí la solución nutriente de electrolitos preferentemente contiene, de forma independiente para cada uno, 1 mg/l o más, preferentemente, 10 mg/l o más, en particular, 50 mg/l o más, de iones de cinc, hierro, potasio, y/o magnesio, 0,5 mg/l o más, preferentemente, 5 mg/l o más, en particular, 25 mg/l o más, de iones de cobre, manganeso, estroncio y/o litio, 0,1 mg/l o más, preferentemente, 1 mg/l o más, en particular, 5 mg/l o más, de iones de selenio, molibdeno, cromo, arsénico, vanadio y/o cobalto.

En principio, el procedimiento conforme a la invención es aplicable a muchas especies distintas de semillas vegetales, pero conforme a la invención, desde luego, se prefieren semillas que, o bien, posibiliten contenidos de tocotrienol particularmente altos, o bien semillas de plantas que sean muy especialmente apropiadas para llevar a cabo el procedimiento conforme a la invención a gran escala industrial. Por ello, preferentemente se usan semillas vegetales seleccionadas entre semillas de nuez, trigo, girasol, palma, centeno, cebada, avena, amaranto, quinoa, arroz, o mezclas de estas semillas.

Preferentemente, se secan los brotes vegetales antes de la extracción. Esto no sólo aumenta su capacidad de ser almacenados, sino que vuelve apropiados los brotes vegetales obtenidos conforme a la invención para muchas aplicaciones a gran escala técnica.

Además, se prefiere moler los brotes vegetales antes de la extracción, porque el contenido de tocotrienoles y otros antioxidantes lipófilos que determinan el valor, así como de ácidos grasos esenciales, es mayor en el salvado y en el germen. De esta manera, los brotes pueden transferirse mejor a instalaciones extractoras (de aceite) calificadas, en particular, aquéllas con separadores a presión, y extraerse.

Debido a su estructura química, las preparaciones de tocotrienoles preferentemente se obtienen en forma de aceites. Por ello, preferentemente se efectúa la extracción con obtención de un extracto oleoso. Aunque también es posible la extracción mediante disolventes orgánicos (aún con disolventes orgánicos inocuos desde el punto de vista de la tecnología alimenticia) o en suspensiones (acuosas) (por ejemplo, con micelas, etc.), no se la prefiere conforme a la invención, porque las preparaciones de tocotrienol conforme a la invención preferentemente deben proporcionarse de forma tan natural, genuina y biológicamente valiosa como sea posible. Para ello, también es favorable extraer conjuntamente la mayor cantidad posible de coparticipantes naturales de reacción de los tocotrienoles, para lograr un grado de efecto biológico lo más alto posible en la administración al ser humano.

Por ello, de especial preferencia, la extracción conforme a la invención se efectúa con CO_{2} supercrítico. Pero los componentes liposolubles también pueden extraerse, por ejemplo, con hexano u otros disolventes orgáni-
cos.

Como por una incubación demasiado larga con la solución nutriente puede bajar nuevamente el contenido de tocotrienoles en los brotes, es necesario que se optimice para cada tipo de semilla la duración de la incubación con la solución nutriente. Pero esto es totalmente posible para el experto, por ejemplo, por los procedimientos de incubación y de análisis dados a conocer en la siguiente sección de ejemplos. Preferentemente, se selecciona de tal manera la duración de la incubación, que pueda obtenerse un contenido óptimo de tocotrienoles. Preferentemente, se incuba hasta que el contenido de tocotrienoles aumente al menos en el 100%, en particular, en el 300%, en comparación con el contenido en semillas no germinadas.

\newpage

La incubación aquí tiene lugar a temperaturas y condiciones que sean apropiadas o probadas para la germinación usual de semillas del tipo seleccionado. Conforme a una realización preferida, la incubación conforme a la invención se lleva a cabo a una temperatura de 10 a 40ºC, preferentemente, de 15 a 30ºC, en particular, de 19 a 21ºC.

La solución nutriente de electrolitos, con la que se incuban las semillas vegetales, preferentemente, contiene iones de vanadio, selenato, molibdato, cobalto, cromo (III), manganeso, estroncio, litio, cobre, hierro (III), cinc, gluconato, citrato, lactato o combinaciones de estos iones, en una cantidad de 0,1 a 1000 mg, preferentemente, de 1 a 500 mg, en particular, de 3 a 100 mg.

La extracción conforme a la presente invención puede lograrse mediante un gran número de dispositivos y procedimientos apropiados, respectivamente adecuados a las semillas o brotes, seleccionados. Conforme a la invención, demostró ser especialmente apropiada la extracción mediante autoclaves y separadores a presión. Éstos preferentemente pueden funcionar, independientemente unos de otros, a una presión de autoclave de 10000 kPa o más, preferentemente, de 20000 kPa o más, en particular, de 25000 kPa o más, a una presión de separador de 2000 kPa o más, preferentemente, de 3000 kPa o más, en particular, de 4500 kPa o más, a una temperatura de autoclave de 30ºC o más, preferentemente, de 40ºC o más, en particular, de 50ºC o más, y a una temperatura de separador de 20ºC o más, preferentemente, de 30ºC o más, en particular, de 40ºC o más.

Según la duración de la incubación y el gasto de la solución nutriente, la incubación en casos preferidos puede llevarse a cabo cambiando al menos una vez, preferentemente, al menos dos veces, en particular, al menos tres veces, la solución nutriente.

Conforme a otro aspecto, la presente invención se refiere a preparaciones enriquecidas en tocotrienol, a partir del germen y/o del salvado de brotes vegetales, que pueden obtenerse mediante el procedimiento conforme a la invención. Aquí se prefieren especialmente preparaciones de brotes de trigo enriquecidas en tocotrienol, a partir del germen y/o del salvado de brotes de trigo, que presentan un contenido de tocotrienol de 500 mg/kg de material seco o más, preferentemente, de 1000 mg/kg de material seco, en particular, de 2000 mg/kg de material seco. Además, también se prefieren preparaciones de brotes de cebada enriquecidas en tocotrienol, a partir del germen y/o del salvado de brotes de cebada, que presentan un contenido de tocotrienol de 1500 mg/kg de material seco o más, preferentemente, un contenido de gamma-tocotrienol de 500 mg/kg de material seco, en particular, un contenido de gamma-tocotrienol de 200 mg/kg de material seco.

A partir de las preparaciones conforme a la invención, enriquecidas en tocotrienol, pueden producirse formulaciones que contienen tocotrienol que son parte de un aspecto especialmente importante desde el punto de vista de la ciencia de la alimentación y que, en particular, pueden actuar como antioxidante eficaz, biológicamente valioso, porque su contenido aumentado de tocotrienol no sólo actúa como administración aislada (aumentada) de tocotrienol, sino porque los tocotrienoles, conforme a la invención pueden administrarse juntamente con sus coparticipantes naturales de acción (en particular, coparticipantes de oxidorreducción), y con estos coparticipantes también son incomparablemente más eficaces.

Según la necesidad, a la preparación que contiene tocotrienoles, conforme a la invención, preferentemente pueden añadirse adicionalmente principios activos farmacéuticos, coadyuvantes farmacéuticos, productos de la técnica de los alimentos o aditivos de la técnica de los alimentos. Pero preferentemente debería cuidarse de que con tal adición no se afecte considerablemente el "equilibrio natural" entre los tocotrienoles y los coparticipantes naturales de acción extraídos.

La presente invención se explica en más detalle mediante los siguientes ejemplos, a los que, sin embargo, no debe limitarse.

Ejemplo 1 Procedimiento para la obtención de aceites ricos en tocotrienol, a partir de cereales germinantes

De determinados aceites vegetales, como aceite de nueces, aceite de germen de trigo o aceite de girasol, se conoce que son particularmente ricos en tocoferoles, en particular, en D, L-beta-tocoferol. En cambio, el aceite de palma, así como centeno, cebada, avena, salvado de trigo, y arroz, presentan altos contenidos de tocotrienoles antioxidantes. Se sabe, que semillas de cereales o leguminosas germinantes aumentan sus contenidos de vitaminas por vía endógena, para cuidar el rendimiento de síntesis aumentado durante el proceso de germinación.

Además, en el transcurso de la formación aumentada de nuevas células también se incrementan en casi el 50% los ácidos grasos poliinsaturados, para poder poner a disposición en cantidad suficiente "material de síntesis" biológicamente valioso para la nueva formación de células. Sin embargo, los ácidos grasos poliinsaturados son muy susceptibles de oxidación frente a la luz y al oxígeno, de manera que las semillas germinantes también sintetizan cantidades correspondientes de antioxidantes lipófilos (tocotrienoles) para la protección de estos ácidos grasos biológicamente valiosos. La meta de los presentes ensayos era determinar de forma cualitativa y cuantitativa la modificación de los contenidos de tocoferol y tocotrienol durante el proceso de la germinación, y buscar posibilidades de aumentar selectivamente, en particular, los contenidos de tocotrienoles antioxidantes, durante el proceso de germina-
ción.

La siguiente tabla 1 muestra los contenidos de ácidos (altamente) insaturados, determinados mediante cromatografía gaseosa, del "aceite de salvado de cebada, por germinación durante 24 horas con solución nutriente", expuesto en la tabla 5:

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

Análisis químicos
Tipo	Valores
% de agua (gravimétrico)	4,9%
Índice de ácidos (titrimétrico)	8,8
% de ácido graso libre (calculado)	4,4%
Índice de peróxidos según Wheeler	4,1
Composición de la mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos:
(mediante cromatografía gaseosa)
Ácido palmítico	19,8%
Ácido esteárico	1,1%
Ácido oleico	19,5%
Ácido linoleico	53,6%
Ácido linolénico	4,1%
Ácido aráquico	0,3%
Ácido behénico	0,3%
Ácido erúcico	0,1%
Ácido lignocérico	0,2%
Ácido eicosapentaénico (C20 5=)	0,2%
Ceniza (gravimétrico)	< 0,1 g/100 g
Grasa (según Weibull)	94,6 g/100 g
Ácidos grasos saturados	20,5 g/100 g
Ácidos grasos monoinsaturados	19,3 g/100 g
Ácidos grasos poliinsaturados	54,8 g/100 g
Sustancia insoluble en éter de petróleo	1,0%
Contenido de jabones	0,3%

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayos de germinación

Se hicieron germinar semillas de trigo y de cebada capaces de germinar, alternativamente con agua destilada o con una solución nutriente, durante un período de tiempo de 24, o en su caso, 96 horas.

\newpage

La solución nutriente contenía las siguientes sales nutrientes disueltas (indicado en mg/l):

TABLA 2

Sulfato de óxido de vanadio 5 H_{2}O	24,85
Selenato de sodio	11,95
Molibdato de sodio	12,60
Cloruro de cobalto 6 H_{2}O	20,20
Cloruro de cromo III	25,60
Cloruro de manganeso	73,75
Lactato de estroncio	84,25
Cloruro de litio	152,75
Gluconato de cobre	178,50
Citrato de amonio e hierro III	178,50
Gluconato de cinc	394

Antes de la etapa de germinación propiamente dicha, se remojaron las semillas de cereales durante doce horas en las soluciones correspondientes. La germinación tuvo lugar a temperatura ambiente (19-21ºC) y condiciones normales de luz de día/noche, en aparatos de germinación usuales en el mercado, que estaban constituidos por cubetas de plástico transparentes, dispuestas unas sobre otras, con dispositivo de desagote. Durante la germinación, se enjuagaban los brotes dos veces por día con las soluciones correspondientes (es decir, agua destilada y solución nutriente, respectivamente 250 ml/90 g). Después de la recolección, los brotes se enjuagaron a fondo con agua bidestilada (tres veces con aproximadamente 800 ml) y, a continuación, se secaron a 60ºC bajo aire caliente. Después del proceso de secado, se molieron las semillas germinadas y se extrajeron los salvados obtenidos de esta manera mediante CO_{2} supercrítico.

Los parámetros de extracción para la obtención de la fracción oleosa a partir de los brotes y salvados de cereales eran:

Para las muestras en análisis 1 - 4 expuestas en la siguiente tabla 3:

TABLA 3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Tiempo de extracción:  \+  \hskip3cm  \+ > 210 minutos\cr 
Presión del autoclave: \+ \+ > 28000 kPa\cr  Separador a presión
1: \+ \+ 6500 kPa\cr  Separador a presión 2: \+ \+ 4200 kPa\cr 
Temperatura del autoclave: \+ \+ 65ºC\cr  Temperatura del separador
a presión 1: \+ \+ 43ºC\cr  Temperatura del separador a presión 2:
\+ \+
26,8ºC\cr}

Los contenidos de aceite de los salvados ascendían a 2,2 hasta 3,6% en peso.

Para las muestras en análisis 5 a 7, expuestas en la siguiente tabla 4:

TABLA 4 Extracción en una etapa con separación del extracto en una etapa

	Presión del autoclave:	26000 kPa
	Separador a presión:	5000 kPa
	Temperatura del autoclave:	45-50ºC
	Temperatura del separador:	35ºC

El CO_{2} total y el flujo de CO_{2} dependen de la respectiva materia prima usada.

Ejemplo 2 Determinación de los tocoferoles y los tocotrienoles en los aceites de germen y de salvado

Se separaron los tocoferoles y los tocotrienoles mediante HPLC, después de la saponificación del material muestra y después de la extracción con n-hexano, y se comprobaron mediante los tiempos de retención con un detector de fluorescencia. La valoración cuantitativa se efectuó mediante una comparación de las áreas de los picos, por el procedimiento estándar externo. Como fase estacionaria servía una columna de HPLC 250 x 4,6 MMX ¼'' VALCO; LiChrosorb Si60-5, como fase móvil servía una mezcla de n-hexano y dioxano (95:5), como estándares de comparación se usaron tocoferol y tocotrienol de la empresa Calbiochem.

TABLA 5

Los análisis comparativos de las muestras individuales dieron por resultado (todos los valores en mg/kg de muestra en análisis):

Muestra en análisis	\alpha-	\beta-	\gamma-	\delta-	\alpha-	\beta-	\gamma-	\delta-	\Sigma	\Sigma	\Sigma
	T^{1)}	T^{2)}	T^{3)}	T^{4)}	T3^{5)}	T3^{6)}	T3^{7)}	T3^{8)}	T^{9)}	T3^{10)}	E^{11)}
1. Aceite de germen de trigo,	3276	0	1048	0	0	124	0	0	4324	124	4448
a partir de semilla no
germinada, extraído con el
separador a presión 2
2. Aceite de germen de trigo,	1339	283	14	14	833	1075	167	34	1650	2190	3759
por germinación durante
96 horas con solución
nutriente, extraído con el
separador a presión 2
3. Aceite de salvado de	630	222	3	4	358	804	52	11	859	1224	2083
trigo, a partir de semillas
no germinadas, extraído
con el separador a presión 1
4. Aceite de salvado de	91	0	6	0	799	424	71	20	97	1314	1411
trigo, por germinación
durante 96 horas con
solución nutriente, extraído
con el separador a presión 1
5. Aceite de salvado de	264	0	149	12	893	140	275	33	425	1341	1766
cebada, por germinación
durante 24 horas con agua
6. Aceite de salvado de	143	10	43	8	1028	251	559	60	204	1898	2102
cebada, por germinación
durante 24 horas con
solución nutriente
7. Aceite de salvado de	88	0	59	6	320	78	156	22	153	576	729
cebada, por germinación
durante 96 horas con
solución nutriente
Notas de pie:
\begin{minipage}[t]{155mm} ^{1)} alfa-tocoferol, ^{2)} beta-tocoferol, ^{3)} gamma-tocoferol, ^{4)} delta-tocoferol; ^{5)} alfa-tocotrienol, ^{6)} beta-tocotrienol, ^{7)} gamma-tocotrienol, ^{8)} delta-tocotrienol; ^{9)} suma de tocoferol, ^{10)} suma de tocotrienol, ^{11)} suma de vitamina E. \end{minipage}

Los resultados del análisis muestran:

- Un descenso del contenido de tocoferoles a favor de un aumento de los tocotrienoles durante la germinación, lo que indica una reducción de la actividad celular de vitamina E con un simultáneo aumento de las necesidades de antioxidante durante el proceso de germinación. A nivel celular, "germinación" significa una actividad aumentada a nivel enzimático. La célula vegetal necesita una cantidad multiplicada de material se síntesis de alto valor biológico, es decir, ácidos grasos poliinsaturados, así como fosfolípidos, para la nueva formación de material celular, es decir, para el crecimiento. Debido a la susceptibilidad de este material biológico de alto valor a altas temperaturas y al oxígeno, también aumenta la necesidad de moléculas protectoras antioxidantes. Los presentes resultados de análisis muestran que
la célula vegetal suple esta necesidad aumentada de protección por transformación de los tocoferoles en tocotrienoles.

- Una estimulación de la síntesis endógena de tocotrienoles en la semilla germinante, por suministro de oligoelementos minerales esenciales antes de la germinación y durante la misma: Mientras la célula vegetal - contrariamente a la célula humana- sea capaz de cubrir su necesidad (aumentada) de sustancias orgánicas vitales (vitaminas, antioxidantes, ácidos grasos poliinsaturados) mediante síntesis propia, de forma independiente, depende del suministro exógeno de sustancias minerales (sustancias minerales, oligoelementos), igual que el ser humano. Como muestran los presentes exámenes, por el suministro de oligoelementos minerales puede aumentarse significativamente el contenido de tocotrienol de semillas germinantes, en comparación con procedimientos tradicionales de germinación (es decir, germinación con agua).

- Un descenso de los contenidos de tocoferol y de tocotrienol en una prolongación de la germinación, demostrado por el ejemplo del salvado de cebada.

Ejemplo 3 Análisis de la calidad biológica de mezclas naturales de tocotrienol

En el marco de un análisis ex vivo-in vitro, se examina la capacidad antioxidante de aceite de salvado de trigo rico en tocotrienol, en comparación con aceite de germen de trigo, acetato de tocoferol y D-alfa-tocoferol. En este procedimiento de examen se somete suero humano a la carga oxidante de una cantidad definida de para-benzoquinona. Por adición de cantidades definidas de los antioxidantes que se han de examinar (mezcla natural de tocotrienoles a partir de aceite de salvado de trigo, aceite de germen de trigo, acetato de tocoferol, D-alfa-tocoferol) se determina cuantitativamente la capacidad de la muestra en ensayo de ser cargada de forma antioxidante, mediante la determinación colorimétrica de la para-dihidroquinona formada por reducción de la para-benzoquinona. En este examen, la mezcla de tocotrienoles a partir de salvado de trigo germinado presentaba una capacidad antioxidante 500 veces mayor, en comparación con el acetato de tocoferol y una capacidad antioxidante 1000 veces mayor que el D-alfa-tocoferol.

Estos ensayos se llevaron a cabo de la siguiente manera:

Se obtiene sangre humana sin aditivos de donantes y después de 1 hora de reposo en el refrigerador (aproximadamente +4ºC a +7ºC), se centrifuga a 800 -1000 g (con una duración de 10 minutos). Se retiran y reúnen las fracciones de suero separadas. El suero puede almacenarse a -22ºC durante aproximadamente 14 días o puede usarse inmediatamente para las mediciones necesarias.

Para determinar la capacidad antioxidante de un agente antioxidante, en etapas, se carga el suero con radicales. Para la formación de radicales, se usó p-benzoquinona.

En el medio fisiológico (pH = levemente alcalino) esta sustancia se transforma en un radical aniónico relativamente estable, del sistema de quinhidrona. Allí la p-benzoquinona acepta un átomo de hidrógeno (1 protón/1 electrón).

La siguiente reacción, para formar el producto final estable p-dihidroquinona, ocurre a pH 6,9-7,4 en minutos y de forma lineal primaria inversamente proporcional al contenido de antioxidante (= agente reductor) en el medio de reacción.

De esta manera, para la determinación del producto final (dihidroquinona) como típica sustancia coloreada, se cumple con las condiciones para la validez de la ley de Lambert-Beer.

El radical aniónico relativamente estable (quinhidrona), por acepción de otro electrón (hidrógeno de los antioxidantes disponibles), en un segundo paso de reducción se transforma en la dihidroquinona. La reacción puede seguirse colorimétricamente, porque el pasaje hacia la sustancia completamente reducida (dihidroquinona) está acompañado por una fuerte intensificación del color.

La determinación colorimétrica de la cantidad de producto final se efectúa a \lambda = 500 nm. La extinción a esta longitud de onda entonces es directamente proporcional a la cantidad de producto final de la reacción o también a la cantidad de antioxidante que ha reaccionado para la transformación de la etapa intermedia de radical.

A partir de las condiciones de reacción estequiométricas, del aumento lineal de extinción y del gasto creciente de forma lineal del principio activo antioxidante, puede calcularse exactamente la proporción que ha reaccionado.

Según Michaelis/Kalkar o Pauling (Holleman-Wiberg; Lehrbuch der Anorganischen Chemie, Editorial de Gruyter (1995)) la intensidad de la reacción hasta formar hidroquinona depende de la relación de las concentraciones de sustancia oxidada respecto a las de sustancia reducida. Es decir: mientras más alta sea la oferta de reducción (antioxidantes), más fuertemente será inhibida la reacción, el contenido de dihidroquinona que se forma disminuye. De esta manera, el uso de esta reacción es apropiado de manera sobresaliente para la determinación de informes cuantitativos finamente dosificados, para sustancias de efecto reductor en sistemas de oxidorreducción.

Manera de proceder

En tres series paralelas de medición se cargan muestras de suero (cada una de 500 ml) de los sueros reunidos con p-benzoquinona, en tres etapas (con 10, 20 y 30 \mug). Después de 30, 60, 90 y 180 segundos de tiempo de reacción, respectivamente se averiguan los valores de extinción a \lambda = 500 nm. El valor medio del valor a los 60 segundos, en las cantidades calculadas de reacción, corresponde al título definido (= un tercio de reacción). Este valor resulta de forma precisa de la representación gráfica de los valores medios como curva de extinción. A este valor determinado de calibración de los sueros reunidos sin adición de antioxidantes se refieren de forma comparativa todos los otros exámenes con adición de antioxidantes (es decir, con oferta creciente de antioxidantes en el suero, la extinción para dihidroquinona debe decrecer).

Para comprobar la capacidad antioxidante del aceite de salvado de trigo rico en tocotrienoles conforme a la invención, se llevaron a cabo tres series paralelas de medición en muestras de suero, añadiendo 500 \mug/ml de la preparación conforme a la invención. Aquí se produjo un descenso del valor de extinción (\lambda = 500 nm/60 s), en comparación con el suero no tratado, en un promedio de 0,017 unidad.

Con referencia a la curva de valores de extinción del suero comparativo sin aditivos y las condiciones estequiométricas usadas (determinación de suero/concentración de p-benzoquinona/ cantidad por ml de dilución del suero), a partir de este sistema de calibración resulta el factor de conversión de extinción respecto a la inhibición por radicales.

Con la dilución 1/50 usada de las muestras comparativas de suero y de la reacción de un tercio (comparación de extinciones) de la cantidad usada de moléculas (que se ha de calcular a partir de la concentración de p-benzoquinona por unidad de volumen, según el número de Loschmidt), resulta el factor de conversión para radicales de quinhidrona. Por lo tanto, 0,017 unidad de extinción corresponde a: 0,017 \cdot 10 \cdot 28,08 = 4,914 \mug de radicales por ml/s.

En la preparación:

De 3 mg de la preparación conforme a la invención en 6 ml de suero, de esto se diluye 0,5 ml en dilución 1:10, de forma isotónica, resultan 250 \mug en 5 ml. Las mediciones de extinción se efectuaron en 1,5 ml de esto, añadiendo 10, 20 y 30 \mug de p-benzoquinona, lo que corresponde a una cantidad de 75 \mug de la preparación conforme a la inven-
ción.

: 75 \mug de preparación conforme a la invención = 4,914 \mug de radicales por ml/s.

: 1 mg de la preparación conforme a la invención = 65,52 \mug de radicales, así como

: 1 g de la preparación conforme a la invención = 65,52 mg de radicales por ml y s.

Como rendimiento desintoxicante de la preparación conforme a la invención.

Esta actividad puede convertirse de forma deseada mediante el número de Loschmidt en las etapas de oxígeno:

: 1 g de aceite conforme a la invención = desintoxicación de 23,28 \cdot 10^{20} radicales OH\cdot (peso atómico = 17)

o

: 12,37 \cdot 10^{20} radicales O_{2}\cdot (peso atómico = 32).

Otro criterio para la valoración del efecto antioxidante (protector) lo representa (la influencia sobre) el tamponamiento de oxidorreducción. Sustancias fisiológicamente activas con efecto antioxidante estabilizan o aumentan la capacidad de sistemas biológicos de oxidorreducción (por ejemplo, suero) de ser cargados de forma oxidante, a pesar de la carga creciente por radicales.

Para determinar la actividad de la preparación conforme a la invención para estabilizar la capacidad de sistemas biológicos de ser cargados por oxidación, nuevamente se examinaron tres series de ensayo y se determinaron los valores medios:

1. Suero entero (vital) humano, sin preparación conforme a la invención (suero en blanco)

Se cargan muestras de suero de 0,5 ml de volumen cada una, con 10, 20 y 30 \mug de p-benzoquinona. Después de 30 minutos de incubación (a 20ºC) se miden los potenciales de oxidorreducción (mV), se comparan con el potencial del ensayo en blanco (sin p-benzoquinona) y se representan gráficamente en forma de curva de tampón. La función de tampón resulta como función lineal entre los puntos de potencial para 10, 20 y 30 \mug de carga por p-benzoquinona.

2. Suero entero (vital) humano, con 500 \mug de preparación conforme a la invención por ml

Igualmente se cargan las muestras de suero, cada una de un volumen de 0,5 ml, con 10, 20 y 30 \mug de p-benzoquinona. Después de 30 minutos de incubación, se miden los potenciales de oxidorreducción y se representan gráficamente comparándolos con el valor de potencial sin p-benzoquinona. También aquí resulta la función de tampón como ecuación lineal del compuesto de los puntos para 10, 20 y 30 \mug de p-benzoquinona.

Resultado

Para suero con adición de la preparación conforme a la invención, resulta una relación de aumento de la curva del tampón de + 0,35 mV. Sin preparación conforme a la invención, la relación de aumento de la función lineal de tampón asciende solamente a - 0,35 mV.

El producto conforme a la invención de esta manera representa un antioxidante altamente eficaz, también en condiciones fisiológicas (también in vivo).

Para una evaluación ampliada de la calidad del producto, es necesaria la comparación con otros antioxidantes. A este fin, análogamente a lo descrito anteriormente, se efectuaron respectivamente tres series de análisis para los siguientes productos:

Aceite de germen de trigo (prensado en frío, al 100%, de calidad farmacéutica purísima), acetato de D,L-alfa-tocoferol (sintético, 50%) -. (vis-vitalis (AT)), alfa-tocoferol (natural, 50%) - (vis-vitalis (AT)).

Se recopilan los resultados en la siguiente tabla 6:

TABLA 6

	Aceite de germen de trigo	Aceite de	Acetato de	D-alfa-
	conforme a la invención	germen de trigo	tocoferol	tocoferol
Título de antioxidante	0,19	0,14	0,125	0,06
Radicales \mug/ml\cdots	5,335	3,92	3,51	1,6848
Tocotrienoles en 500 mg de	850 \mug	1,4 mg		250 mg
sustancia/ml
Efecto de 1 mg de tocotrienol	6,276	2,8	0,014	0,00674
en \mug de radicales/ml\cdots
Factor de eficacia	1	0,446	0,0022	0,001
		(1/2,24)	(1/450)	(1/930)

A partir de todos los exámenes resulta la siguiente conclusión:

La preparación conforme a la invención es eficaz como producto protector antioxidante y también despliega una alta función protectora contra la hiperoxidación, también en condiciones fisológicas, por el aumento del tamponamiento de oxidorreducción (carga) de sistemas biológicos de oxidorreducción.

Conclusión final

Aunque en contraste con los tocoferoles, los tocotrienoles presentan menor actividad de vitamina E, muestran rendimientos antioxidantes notablemente mayores. La capacidad antioxidante de antioxidantes lipófilos es un parámetro de calidad importante para el uso en medicina alimenticia, en enfermedades inmunitarias, cardiocirculatorias de músculos/articulaciones, hepáticas, dermatológicas y nerviosas. Gérmenes y salvados de semillas de cereales y de leguminosas, en comparación con semillas no germinadas, presentan contenidos menores de tocoferol, pero contenidos mayores de tocotrienol. En comparación con agua destilada, puede estimularse notablemente la síntesis vegetal de tocotrienoles durante el proceso de germinación, por la adición conforme a la invención de oligoelementos minerales esenciales.

Claims

1. Procedimiento para la producción de preparaciones enriquecidas en tocotrienol, caracterizado por los siguientes pasos:

- Incubación de semillas vegetales con una solución nutriente de electrolitos, de manera que se formen brotes vegetales enriquecidos en tocotrienol,

- Obtención de los brotes vegetales y

- Extracción de una preparación que contiene tocotrienol, a partir de los brotes vegetales obtenidos, en particular, a partir del salvado y del germen de los brotes vegetales obtenidos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las semillas vegetales están seleccionadas entre semillas de nuez, trigo, girasol, palma, centeno, cebada, avena, amaranto, quinoa, arroz, o mezclas de estas semillas.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los brotes vegetales se secan antes de la extracción.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se muelen los brotes vegetales antes de la extracción.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se efectúa la extracción para obtener un extracto oleoso.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se efectúa la extracción con CO_{2} supercrítico o con hexano.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la incubación se lleva a cabo a una temperatura de 10 a 40ºC, preferentemente, de 15 a 30ºC, en particular, de 19 a 21ºC.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque un litro de solución nutriente contiene iones de vanadio, selenato, molibdato, cobalto, cromo (III), manganeso, estroncio, litio, cobre, hierro (III), cinc, gluconato, citrato, lactato, o combinaciones de estos iones, en una cantidad de 0,1 a 1000 mg, preferentemente, de 1 a 500 mg, en particular, de 3 a 100 mg.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la extracción se lleva a cabo mediante autoclave y separadores a presión e, independientemente entre sí, a una presión de autoclave de 10000 kPa o más, preferentemente, de 20000 kPa o más, en particular, de 25000 kPa o más, a una presión de separador de 2000 kPa o más, preferentemente, de 3000 kPa o más, en particular, de 4500 kPa o más, a una temperatura de autoclave de 30ºC o más, preferentemente, de 40ºC o más, en particular, de 50ºC o más, y a una temperatura de separador de 20ºC o más, preferentemente, de 30ºC o más, en particular, de 40ºC o más.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la incubación se lleva a cabo con al menos uno, preferentemente, al menos dos, en particular, al menos tres cambios de la solución nutriente.

11. Preparaciones enriquecidas en tocotrienol, a partir del germen y/o del salvado de brotes vegetales, que pueden obtenerse mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Preparaciones de brotes de trigo enriquecidas en tocotrienol, a partir del germen y/o del salvado de brotes de trigo, caracterizadas porque presentan un contenido de tocotrienol de 500 mg/kg de material seco o más, preferentemente, de 1000 mg/kg de material seco, en particular, de 2000 mg/kg de material seco.

13. Preparaciones de brotes de cebada enriquecidas en tocotrienol, a partir del germen y/o del salvado de brotes de cebada, caracterizadas porque presentan un contenido de tocotrienol de 1500 mg/kg de material seco o más, preferentemente, un contenido de gamma-tocotrienol de 500 mg/kg de material seco, en particular, un contenido de beta-tocotrienol de 200 mg/kg de material seco.

14. Formulación que contiene tocotrienol, que contiene preparaciones enriquecidas en tocotrienol, según una de las reivindicaciones 11 a 14.

15. Formulación que contiene tocotrienol, según la reivindicación 14, caracterizada porque adicionalmente presenta principios activos farmacéuticos, coadyuvantes farmacéuticos, productos de la técnica de alimentos o aditivos de la técnica de alimentos.