ES2250420T3 - Metodo que permite detectar moduladores del ambito quinasa del receptor del vegf. - Google Patents
Metodo que permite detectar moduladores del ambito quinasa del receptor del vegf.Info
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Abstract
Un método para medir el efecto de un compuesto de modulación de VEGF-R2 putativo que comprende las siguientes etapas, en este orden: A) proporcionar un compuesto de ensayo, una proteína de fusión VEGF-R2 de rata cinasa, y un substrato de cinasa que comprende una fracción de afinidad y una sede de fosforilación de VEGF-R2 de rata en una solución adecuada para proporcionar actividad catalítica de VEGF-R2 de rata y que contiene 33P-ã-ATP como fuente de fosfato: B) contacto del compuesto, proteína de fusión de cinasa, y substrato de cinasa durante el tiempo suficiente para proporcionar un substrato 33P-fosforilado; C) aislamiento del substrato de cinasa fosforilado por captura de afinidad en una placa de ensayo de pocillos múltiples; D) separación del 33P-ã-ATP remanente por aspiración de la solución acuosa primero y posterior lavado con la placa con una segunda solución; y E) detección de un cambio en la actividad de cinasa por seguimiento de la velocidad o de la cantidad absoluta de transferencia de 33P por la cinasa al substrato en la presencia del compuesto.
Description
Método que permite detectar moduladores del
ámbito quinasa del receptor del VEGF.
La presente invención se refiere a ensayos para
la detección de compuestos con actividad farmacológica, en
particular para la detección de moduladores del dominio de cinasa de
receptor de factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF-R2).
La angiogénesis juega un papel en varios procesos
que incluyen el desarrollo de la vasculatura, cicatrización de
heridas y mantenimiento del sistema reproductor de la mujer. La
angiogénesis patológica va asociada a estados de enfermedad tales
como cáncer, retinopatía diabética, artritis reumatoide,
endometriosis y psoriasis. Los factores de crecimiento endoteliales
vasculares (VEGFs) son mediadores tanto de angiogénesis normal como
patológica. El VEGF transmite señales a las células a través de sus
receptores afines, que pertenecen a la familia de tirosina cinasa de
receptor (RTK) de receptores de transmembrana. Estos receptores son
tripartitos, consistiendo en un dominio de unión a ligando
extracelular, un dominio de transmembrana, que ancla el receptor en
la membrana de la célula y un dominio de tirosina cinasa
intracelular. Una subfamilia de RTKs comprende los receptores
Flt1/VEGF-R1 y KDR/Flk1/VEGF-R2, que
se unen a VEGFs, La unión del ligando de VEGF al receptor da por
resultado la estimulación de la actividad de tirosina cinasa del
receptor y transducción de señales biológicas en la célula. El
receptor KDR/Flk1/VEGF-R2 media las actividades
biológicas de mitogénesis y proliferación de células endoteliales
mientras que el receptor Flt1/VEGF-R1 media
funciones tales como adhesión de células endoteliales. Se ha visto
que la inhibición de señales de KDR/Flk1/VEGF-R2
inhibe el proceso de angiogénesis. Los inhibidores de este receptor
podrían ser útiles en el tratamiento de enfermedades donde existe
angiogénesis desregulada o descontrolada.
La secuencia para la forma de
VEGF-R2 de ratón está descrita en la Patente
estadounidense 5.283.354. La secuencia humana está descrita en la
Patente estadounidense 5.861.301, sin embargo, la secuencia descrita
en esta patente contiene varias diferencias de la secuencia correcta
que incluyen una mutación del punto de inactivación que hace
no-funcional a la proteína en el dominio de cinasa.
La secuencia de VEGF-R2 humano funcional está
descrita en una solicitud de Patente internacional separada PCT WO
98/58053. El dominio de receptor de VEGF de rata cinasa es similar
a la correspondiente secuencia humana y se abrió al exámen público
el 13 de marzo de 1997 (Genbank, número de admisión U93306 y
U933307) y después descrito en J. Biol. Chem 273;
2090-97 (1998). El dominio de cinasa intracelular de
rata es idéntico en un 97% a la secuencia humana en las regiones de
tirosina cinasa de terminal N y terminal C, y 89% idéntico en el
dominio de inserción de cinasa interviniente (KID). No existe
ninguna descripción de una forma soluble del dominio de
VEGF-R2 de rata cinasa o la utilización de tal
proteína en un método para ensayar compuestos en cuanto a actividad
inhibidora sospechada de cinasa.
Utilizando tecnología de proximidad de centelleo,
se han desarrollado ensayos homogéneos para una variedad de dianas
moleculares (Cook, N.D. (1996). Drug Discovery Today
1:287-294; Picardo, M. y Hughes, K.T. (1997). En
"High Throughput Screening "(Análisis de selección de alto
rendimiento global) [Devlin, J.P. (Ed)], Dekker, Nueva York, NY,
páginas 307-316). En pocas palabras, se inmoviliza
la diana de interés ya sea por recubrimiento o incorporación a un
soporte sólido que contiene un material fluorescente. Una molécula
radiactiva, llevada muy cercana a la fase sólida por asociación con
la diana inmovilizada, causa la excitación del material fluorescente
que emite entonces luz visible. La emisión de luz visible forma la
base de detección de interacción ligando/diana con éxito y se mide
con un dispositivo de seguimiento apropiado. Un ejemplo de ensayo de
proximidad de centelleo es el descrito en la Patente estadounidense
No. 4.568.649, registrada el 4 de febrero de 1986. La Patente
estadounidense 5.770.176 describe ensayos para receptores nucleares
donde el receptor funcional se une a ácido nucleico inmovilizado.
Los materiales para estos tipos de ensayos se pueden encontrar en el
comercio y son de DuPont NEN® (Boston, Massachusetts) bajo el nombre
de FlashPlate^{TM}. El desarrollo de ensayos de proximidad de
centelleo para la detección de función de cinasa ha sido descrito
para tirosina cinasas src purificadas para substratos de
péptidos (Naykayama, G.R. y col. J. Biomolecular Screening
(1998) 3:43-48; McDonald, O.B. y col. (1999),
Anal Biochem. 268:318-329). Hasta donde llega
el conocimiento de los autores, no están publicados ensayos de
proximidad de centelleo que describan función de VEGF tirosina
cinasa soluble o que ensayen compuestos inhibidores utilizando
técnicas similares.
La presente invención proporciona métodos para
medir fosforilación por una proteína de fusión que comprende el
dominio de VEGF de rata cinasa y ensayos para detectar moduladores
de actividad de VEGF cinasa.
Según esto, la invención proporciona un método y
un ensayo para la detección de compuestos que modulan la actividad
enzimática de VEGF cinasa que comprende las etapas de:
- A)
- proporcionar un compuesto de ensayo, una proteína de fusión VEGF-R2 de rata cinasa y un substrato de cinasa que comprende una fracción de afinidad y una sede de fosforilación de VEGF-R2 de rata en una solución adecuada para proporcionar actividad catalítica de VEGF-R2 de rata y que contiene ^{33}P-\gamma-ATP como fuente de fosfato:
- B)
- contacto del compuesto, proteína de fusión de cinasa, y substrato de cinasa durante el tiempo suficiente para proporcionar un substrato ^{33}P-fosforilado;
- C)
- aislamiento del substrato de cinasa fosforilado por captura de afinidad en una placa de ensayo de pocillos múltiples;
- D)
- separación del ^{33}P-\gamma-ATP remanente por aspiración de la solución acuosa primero y posterior lavado con la placa con una segunda solución; y
- E)
- detección de un cambio en la actividad de cinasa por seguimiento de la velocidad o de la cantidad absoluta de transferencia de ^{33}P por la cinasa al substrato en la presencia del compuesto.
Figura 1: Mancha Western:
anti-fosfotirosina de dominio de
VEGF-R2 de rata cinasa +/- un inhibidor
Figura 2: Dominio de VEGF-R2 de
rata cinasa purificado
Figura 3: IC_{50} de un inhibidor de
VEGF-R2 de rata
Figura 4: gráfico de barras de conteos del ensayo
por minuto +/- un inhibidor
Figura 5: Muestra la linealidad del ensayo
El término "dominio de proteína", tal como
aquí se utiliza, se refiere a una región de una proteína que puede
plegarse en una estructura tridimensional estable, frecuentemente
independiente del resto de la proteína y que puede estar dotada con
una función particular. Esta estructura puede mantener una función
específica asociada con una función del dominio dentro de la
proteína original que incluye actividad enzimática, creación de un
motivo de reconocimiento para otra molécula, o proporcionar
componentes estructurales necesarios para que exista una proteína en
un entorno particular, de proteína, tanto dentro de una familia de
proteínas como dentro de superfamilias de proteínas relacionadas,
pudiendo ser los dominios de proteína regiones conservadas por
evolución.
El término "superfamilia de proteínas", tal
como aquí se utiliza, se refiere a conjuntos de proteínas cuya
relación de evolución puede no estar completamente establecida o
puede estar distante según estándares filogenéticos aceptados, pero
muestran estructura tridimensional similar o muestran un acuerdo
único de aminoácidos críticos. El término "familia de
proteínas" tal como aquí se utiliza se refiere a proteínas cuyas
relaciones de evolución han sido establecidas por los estándares
filogénicos aceptados.
El término "fusión de proteínas", tal como
aquí se utiliza, se refiere a una nueva construcción de proteína
quimérica que es el resultado de combinar dos o más dominios o
regiones de enlazado de diferentes proteínas con el propósito de
combinar en una sola cadena de polipéptido funciones y propiedades
de reconocimiento normalmente asociadas con dos o más polipéptidos
distintos. El modo más frecuente de realizar esto es el de clonación
molecular adyacente de las secuencias de nucleótido que codifican
para los dominios de proteína deseados para dar lugar a la creación
de una nueva secuencia de polinucleotidos que codifique la proteína
deseada. Alternativamente, la creación de una proteína de fusión se
puede llevar a cabo por unión química de dos proteínas juntas.
El término "región de enlazado" o "dominio
de enlazado", o términos descriptivos similares, tales como aquí
se emplean, se refiere a tramos de polinucleóido o secuencia de
polipéptido que se emplean en la construcción de un vector de
clonación o proteína de fusión. Las funciones de una región de
enlazado pueden incluir la introducción de sedes de clonación en la
secuencia de nucleótido, introducción de un componente flexible o
región de creación de espacio entre dos dominios de proteína, o
creación de una etiqueta de afinidad para interacción molecular
específica. Se puede introducir una región de enlazado en una
proteína de fusión sin un propósito específico, pero como un
compromiso resultante de selecciones hechas durante la
clonación.
El término "sede de clonación" o "sede de
policlonación", tal como aquí se emplea, se refiere a una región
de la secuencia de nucleótido contenida dentro de un vector de
clonación o sometida a ingeniería con una proteína de fusión que
tiene una o más secuencias de reconocimiento de endonucleasa de
restricción disponibles. Una manipulación adecuada de sedes de
endonucleasa de restricción permite clonar en "tandem" dos o
más secuencias de nucleótidos de manera que los dominios de proteína
codificados respectivos se traducen al cuadro relativo a un codón de
iniciación particular, dando así el producto de proteína deseado
después de transcripción y traducción. Estas secuencias de
nucleótidos se pueden introducir entonces en otros vectores de
clonación, utilizados para crear nuevas proteínas de fusión, o
utilizarlas para introducir mutaciones específicas dirigidas a
sede. Es muy conocido por los especialistas en la técnica que las
sedes de clonación se pueden someter a ingeniería genética en la
deseada localización por mutaciones silenciosas, mutación
conservada, o introducción de una región de enlazado que contiene
las secuencias de consenso de la enzima de restricción deseadas. Se
sabe, además, por los especialistas que la localización precisa de
una sede de clonación puede ser flexible en tanto se mantenga la
deseada función de la proteína o fragmento de la misma que se
clona.
Tal como aquí se emplea, "vectores de
expresión" se definen aquí como secuencias de ácido nucleico que
se requieren para la transcripción de copias clonadas de genes y la
traducción de sus mARNs a un huésped apropiado. Estos vectores se
pueden utilizar para expresar genes eucarioticos o procarióticos en
una diversidad de huésped que incluyen E. coli, algas
azul-verdes, células de plantas, células de
insectos, células de hongos, incluyendo células de levaduras, y
células animales.
El término "compuesto de ensayo", tal como
aquí se utiliza en conexión con un modulador del que se sospecha
actividad de VEGF-R cinasa, se refiere a una
molécula orgánica que tiene el potencial de interrumpir la actividad
enzimática específica de la cinasa. Por ejemplo, pero sin limitar
por ello el alcance de la presente invención, los compuestos pueden
incluir pequeñas moléculas orgánicas, péptidos de aminoácidos
sintéticos o naturales, proteínas o secuencias de ácidos nucleicos
sintéticos o naturales, o cualquiera de los derivados químicos de
los antes mencionados. Compuestos que son agonistas incrementan el
ritmo o la cantidad total de fosfato transferido al substrato de
cinasa. Compuestos que son antagonistas reducen el ritmo o cantidad
total de fosfato transferido al substrato de cinasa.
El término "derivado químico" describe una
molécula que contiene fracciones químicas adicionales que
normalmente no son una parte de la molécula base. Estas fracciones
pueden mejorar la solubilidad, vida media, absorción, etc. de la
molécula base. Alternativamente, las fracciones pueden atenuar
efectos secundarios indeseables de la molécula base o reducir la
toxicidad de la molécula base. Ejemplos de estas fracciones están
descritos en varios textos, tales como en "Pharmaceutical
Sciences" de Remington.
La presente invención proporciona métodos para
medir la fosforilación por una proteína de fusión que comprende el
dominio de VEGF de rata cinasas y ensayos para detectar moduladores
de actividad de VEGF cinasa. En particular, las proteínas de fusión
útiles en el método de la presente invención comprenden terminal
carboxilo de aminoácidos del dominio de transmembrana del
VEGF-R2 de rata y opcionalmente una etiqueta de
afinidad, por ejemplo una etiqueta de polihistidina. Una proteína de
fusión particularmente preferida es una en que la etiqueta de
polihistidina está localizada en el terminal N y el dominio de VEGF-
R2 de rata cinasa comprende aminoácidos 786-1343 de
la proteína de VEGF-R2 de rata.
Según esto, la invención proporciona un método y
ensayo para la detección de compuestos que modulan la actividad
enzimática de VEGF cinasa que comprende las etapas de:
- A)
- proporcionar un compuesto de ensayo, una proteína de fusión VEGF-R2 de rata cinasa y un substrato de cinasa que comprende una fracción de afinidad y una sede de fosforilación de VEGF-R2 de rata en una solución adecuada para proporcionar actividad catalítica de VEGF-R2 de rata y que contiene ^{33}P-\gamma-ATP como la fuente de fosfato;
- B)
- contacto del compuesto, proteína de fusión de cinasa, y substrato de cinasa durante el tiempo suficiente para proporcionar un substrato ^{33}P-fosforilado;
- C)
- aislamiento del substrato de cinasa fosforilado por captura de afinidad en una placa de ensayo de pocillos múltiples;
- D)
- separación de ^{33}P-\gamma-ATP remanente aspirando primero la solución acuosa y lavando después con la placa con una segunda solución; y
- E)
- detección de un cambio en la actividad de cinasa por seguimiento de la velocidad o cantidad absoluta de transferencia de ^{33}P por la cinasa al substrato en la presencia del compuesto.
Los substratos de VEGF-R2 de rata
útiles en los métodos de la presente invención se determinan por
incubación de las proteínas de fusión de la presente invención en un
tampón adecuado con un substrato putativo durante el tiempo
suficiente para actividad enzimática de VEGF-R2 de
rata para fosforilar el substrato. El substrato se aísla, por
ejemplo por SDS-PAGE, espectroscopia de masas, HPLC,
o los ensayos aquí descritos y analizados para determinar la
presencia de transferencia de fosfato a un radical de tirosina en el
substrato. Los substratos preferidos son los fragmentos de
polipétidos del dominio de VEGF-R2 cinasa (vía
autofosforilación) de VEGF-R2 de rata, fragmentos de
polipéptido de fosfolipasa C\gamma, o poliglutamato/tirosina
(Glu:Tyr 4:1).
Los ensayos descritos aquí detectan actividad
enzimática (y modulación de actividad enzimática) por vía de
inmovilización del péptido del substrato, por ejemplo por
utilización de un par fracción de afinidad - captura de afinidad tal
como captura de estreptavidina de un péptido de substrato
biotinilado. Los pares de captura de afinidad son muy conocidos en
la especialidad e incluyen, por ejemplo, avidina/biotina, epítopes
de anticuerpos contenidos dentro del péptido de substrato o
polipéptido mayor, dominio de unión de dextrano/maltosa del gen de
Escherichia coli malE, glutation
S-transferasa (GST), y polihistidina/níquel
inmovilizado. La polihistidina se refiere a un polipéptido que
contiene 3 a 10 radicales de histidina consecutivos, particularmente
seis radicales de histidina consecutivos.
Los ensayos de captura de afinidad particulares
de la invención se designan como "Ensayo de autofosforilación"
y "Ensayo de fosforilación de polipéptidos". En el ensayo de
autofosforilación se incuba una proteína de fusión, que contiene un
dominio catalítico de VEGF-R2 de rata cinasa y al
menos un dominio de captura de afinidad, en un tampón adecuado para
su actividad enzimática en presencia de ATP radionmarcado. Los
autofosforilatos de proteína cinasa (por vía de una interacción de
la molécula de cinasa que interactúa con una molécula similar) da
por resultado la transferencia de un grupo fosfato radiomarcado a la
proteína de fusión. La proteína de fusión se une entonces a la
superficie del vehículo de proximidad de centelleo a través de un
par de captura de afinidad equilibrado. La fosforilación se mide por
emisión de luz visible desde un vehículo de proximidad de
centelleo. En el ensayo de fosforilación de polipéptido, se incuba
un péptido o polipéptido de substrato de VEGF-R2 de
rata que contiene un dominio de fosforilación y se incuba al menos
un dominio de captura de afinidad en un tampón adecuado para el
equilibrado de la actividad enzimática de cinasa en la presencia de
ATP radiomarcado. La proteína cinasa equilibrada se añade a la
mezcla y fosforila el substrato, lo que da por resultado la
transferencia de un grupo de fosfato radiomarcado al substrato. El
substrato fosforilado se une entonces a la superficie de un vehículo
de proximidad de centelleo a través de un par de captura de afinidad
equilibrado. La proteina VEGF-R2 de rata cinasa no
puede contener un dominio del par de captura de afinidad, para
evitar autofosforilación detectable. La fosforilación se mide por
emisión de luz visible desde el vehículo de proximidad de centelleo.
En ambos casos, el dominio de afinidad puede ser el polipéptido
existente o puede ser un dominio distinto o un pequeño polipéptido
introducido como parte de una proteína de fusión.
El método preferido para detectar actividad
enzimática sobre el péptido de substrato es transferir ^{33}P al
substrato por hidrólisis de ^{33}P- \gamma-ATP.
Este método comprende las siguientes etapas de:
- 1)
- proporcionar un compuesto de ensayo, una proteína de fusión VEGF de rata cinasa, y un péptido substrato de cinasa que comprende una fracción de afinidad y una sede de fosforilación de VEGF-R2 de rata en una solución adecuada para proporcionar actividad catalítica de VEGF de rata y que contiene ^{33}P-\gamma-ATP como fuente de fosfato;
- 2)
- contacto del compuesto, proteína de fusión de cinasa, y substrato de cinasa durante el tiempo suficiente para proporcionar un substrato ^{33}P-fosforilado;
- 3)
- aislamiento del substrato de cinasa fosforilado por captura de afinidad en una placa de ensayo de pocillos múltiples;
- 4)
- separación del ^{33}P-\gamma-ATP remanente aspirando primero la solución acuosa y lavando después con la placa con una segunda solución;
- 5)
- detección de un cambio en la actividad de cinasa por seguimiento de la velocidad o cantidad absoluta de transferencia de ^{33}P por la cinasa al substrato en presencia del compuesto.
El método de autofosforilación preferido para
medir el efecto de un compuesto de modulación de
VEGF-R2 putativo sobre la actividad de cinasa de
VEGF-R2 de rata comprende las etapas siguientes:
- A)
- proporcionar un compuesto de ensayo, una proteína de fusión de VEGF-R2 de rata cinasa que comprende hexahistidina de terminal N unida a los aminoácidos 786-1343 de la proteina VEGF-R2 de rata, una solución adecuada para proporcionar actividad catalítica de VEGF-R2 de rata y que contiene ^{33}P-\gamma-ATP como la fuente de fosfato;
- B)
- contacto del compuesto y la proteína de fusión de cinasa durante el tiempo suficiente para proporcionar un substrato ^{33}P-fosforilado;
- C)
- aislamiento de la proteína de fusión de cinasa fosforilada por captura de afinidad utilizando una placa de ensayo de pocillos múltiples recubierta con NTA-níquel;
- D)
- separación del ^{33}P-\gamma-ATP remanente aspirando primero la solución acuosa y lavando después con la placa con una solución salina tamponada con fosfato que contiene un compuesto quelante de catión divalente a una concentración de aproximadamente 1mM a 100 mM; y
- E)
- detección de un cambio en la actividad de cinasa por seguimiento de la velocidad o cantidad absoluta de transferencia de ^{33}P a la proteína de fusión de cinasa por autofosforilación en la presencia del compuesto.
El cambio en la cantidad de producto puede se la
cantidad total como una función del tiempo (ensayo de
parada-tiempo) o puede ser cinético por medida de
un cambio en la velocidad enzimática como una función del tiempo.
Los ensayos cinéticos se miden desde el momento del contacto inicial
de la enzima y substrato al momento en que se observa que se ha
generado un 50% del máximo del producto.
La cantidad esperada de función enzimática de
VEGF-R2 de rata se puede determinar llevando a cabo
un ensayo concurrentemente o separadamente, como el ensayo descrito
con un compuesto que no inhibe la función enzimática, o con un
vehículo disolvente que contiene propiedades similares a las del
compuesto de ensayo utilizado, pero sin el compuesto de ensayo, tal
como DMSO, DMF, o alcohol isopropílico.
La solución utilizada para lavar la placa no es
particularmente limitativa, e incluye soluciones tamponadas
fisiológicamente con o sin detergentes. Estas soluciones son muy
conocidas en la especialidad. Soluciones particularmente preferidas
contienen compuesto quelante de catión divalente, preferiblemente
EDTA o EGTA a una concentración de aproximadamente 1 mM a
aproximadamente 100 mM. El compuesto quelante sirve para inhibir más
la actividad catalítica de cinasa, e incrementa la eficacia del
ensayo por aumento de la relación señal a ruido.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención, no siendo, sin embargo, limitativos de la misma.
El dominio de receptor de VEGF de rata tirosina
cinasa se clonó desde cADN de hígado de rata por reacción PCR. El
cebador delantero
(5-ATCCTAGG
TACCGTTATGCGGGCCAATG: SEC.ID. No.1) se diseñó para que se correspondiera con la secuencia de VEGF-R2 humano, pero con una sede Kpnl introducida para facilitar la subclonación y un codon de iniciación artificial que se correspondería con el aminoácido 786 de la proteína de rata. El cebador inverso (5-TGTGGCGGCCGCCGGGTGGTG GAAAG; SEC.ID. No.2) correspondía a la secuencia de VEGF-R2 de ratón e introducía una sede Notl tras el codón de parada del gen de rata para facilitar la subclonación. Este fragmento de ácido nucleico se clonó en el vector de expresión pcADN3,1(+) (In Vitrogen Co, Carlsbad, CA). El clon se expresó en células COS y se encontró que era funcional en estudios de autofosforilación. Experimentos con un inhibidor conocido de fosforilación de receptor VEGF, mostraron que el clon de receptor de VEGF de rata era inhibido por este compuesto, indicando así que el dominio de receptor VEGF de rata cinasa funcionaba de manera análoga a los dominios de VEGF-R cinasa similares (Figura 1).
TACCGTTATGCGGGCCAATG: SEC.ID. No.1) se diseñó para que se correspondiera con la secuencia de VEGF-R2 humano, pero con una sede Kpnl introducida para facilitar la subclonación y un codon de iniciación artificial que se correspondería con el aminoácido 786 de la proteína de rata. El cebador inverso (5-TGTGGCGGCCGCCGGGTGGTG GAAAG; SEC.ID. No.2) correspondía a la secuencia de VEGF-R2 de ratón e introducía una sede Notl tras el codón de parada del gen de rata para facilitar la subclonación. Este fragmento de ácido nucleico se clonó en el vector de expresión pcADN3,1(+) (In Vitrogen Co, Carlsbad, CA). El clon se expresó en células COS y se encontró que era funcional en estudios de autofosforilación. Experimentos con un inhibidor conocido de fosforilación de receptor VEGF, mostraron que el clon de receptor de VEGF de rata era inhibido por este compuesto, indicando así que el dominio de receptor VEGF de rata cinasa funcionaba de manera análoga a los dominios de VEGF-R cinasa similares (Figura 1).
Se creó una proteína de fusión que consistía en
el dominio intracelular del VEGF-R2 de rata con una
etiqueta de polihistidina (HIS) añadida al terminal N por
subclonación del anterior fragmento Kpnl + Notl en el vector de
expresión pFastBac (Gibco/BRI, Grand Island, NY) en cuadro con un
codón de iniciación artificial seguido de seis radicales de
histidina. La proteína de fusión del dominio de cinasa recombinante
soluble del VEGF-R2 de rata se expresó en células de
insecto Hi5 utilizando vector de expresión FastBac (Gibco/BRL) de
baculovirus y se purificó hasta una homogeneidad superior al 85%
utilizando cromatografía de afinidad de quelato metálico
esencialmente como describe el fabricante (Cat. #69670 y Cat
#60755-3, Novagen, Madison, WI) (Figura 2).
Se desarrolló un método de análisis de selección
(screening) utilizando dominio de receptor de VEGF de rata tirosina
cinasa, soluble, para fosforilar un substrato de péptido biotinilado
para identificación de compuestos que inhiben la actividad del
receptor de VEGF. El substrato de péptido PLC-1
consiste en un fragmento de fosfolipasa-C\gamma de
aminoácidos 462 a 475
[(Biotina)KHKKLAEGSAYEEV-amida: SEC. ID. No.
3), un substrato in vivo conocido del
VEGF-R2, o alternativamente 0,6 microgramos del
substrato artificial poli Glu:Tyr (4:1) (Cat, #
P-0275, Sigma, St. Louis, MO) que estaba biotinilado
al azar.
Se preparó una mezcla de reacción de cinasa que
contenía Tris-HCl 50 mM pH = 8, MgCl_{2} 10 mM,
Na_{3}PO_{4} 0,1 mM, DTT 1 mM, ATP 10 \muM, substrato de
péptido PLC-1 biotinilado 0,25 \muM, y
^{33}P-\gamma-ATP
[2000-3000 Ci/mmol] 0,8 \muCurios por pocillo. Se
dispensaron 70 \mul de la mezcla de reacción de cinasa al pocillo
de una placa FlashPlate^{TM} (Cat. #SMP-103, NEN,
Boston, MA) recubierta de estreptavidina. Se añadió después 1
\mul del material de reserva del compuesto de ensayo en DMSO al
100% a los pocillos resultando una concentración final de 1% de DMSO
en la reacción (100 \mul de volumen de reacción final incluyen la
subsiguiente solución de enzima), Se diluyó luego receptor VEGF de
rata tirosina cinasa, soluble, en Tris-HCl 50 mM pH
8,0, BSA al 0,1% a una concentración de 5 ng por microlitro y se
añadieron 30 \mul (150 ng por pocillo de ensayo) a cada pocillo
para iniciar la reacción. La reacción se incubó durante una hora a
30ºC. Al final de la incubación de 1 hora, la reacción se terminó
por aspiración de la mezcla de reacción desde la placa y lavando dos
veces los pocillos con PBS que contenía EDTA 100 mM. El substrato
biotinilado quedó inmovilizado sobre la FlashPlate^{TM} y se midió
la incorporación de
^{33}P-\gamma-ATP por lectura de
la placa sobre un contador de centelleo. Se midió la inhibición de
la actividad de VEGF-R2 por observación de una
cantidad reducida de
^{33}P-\gamma-ATP incorporada al
substrato inmovilizado. Como muestra la Figura 4, la incorporación
de ^{33}P-\gamma-ATP al
substrato inmovilizado conducía a una diferencia substancial
comparada con la inhibición máxima con un inhibidor conocido
(aproximadamente una diferencia de cinco veces). Según esto, este
ensayo es útil como ensayo de selección de alto rendimiento total,
donde se prefiere una relación de señal a ruido (S/N) de 5 a 10
veces tanto por razones económicas (en cuanto a uso de reactivos),
de precisión (delineación clara entre un resultado positivo y uno
negativo), y sensibilidad (detección de compuestos que inhiben
actividad de cinasa en un intervalo de concentración útil). Señal a
ruido se define como [actividad de enzima sola]/[actividad de
enzima en presencia de un inhibidor].
Para evaluar mejor la seguridad de este ensayo,
se replicaron las condiciones esencialmente como se han descrito
para evaluar la proporcionalidad de la actividad de cinasa en
función del tiempo. Como se muestra en la Figura 5, el ensayo es
lineal durante al menos 3,5 horas. Según esto, es útil cuando se
lleva a cabo un análisis de selección (screening) de alta
rendimiento global al permitir flexibilidad y fiabilidad de la
realización del ensayo.
Este ensayo se llevó a cabo para determinar la
IC_{50} para compuestos que inhiben la actividad de cinasa del
VEGF-R2 tal como inhibidor-A
(C_{13}H_{10}N_{2}O, Cat. # CD00870, Maybridge Chemicals,
Cornwall, Reino Unido) (Figura 3). Estos compuestos se ensayaron por
duplicado a 8 concentraciones [100 \muM, 10 \muM, 1 \muM, 100
nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM]. Se determinó una señal máxima y una mínima
para el ensayo en cada placa. Se calculó la IC_{50}
(concentración del compuesto que da por resultado una inhibición del
50 por ciento de la señal máxima) a partir de la curva de
dosis-respuesta del porcentaje de inhibición de la
señal máxima en el ensayo según la fórmula [señal
máxima-fondo/señal del compuesto de
ensayo-fondo(100) = % de inhibición] llevando
a una gráfica el porcentaje de inhibición en función del logaritmo
de la concentración del compuesto de ensayo.
Como se muestra en la Figura 3, el inhibidor A
inhibe con éxito la actividad de VEGF-R2 cinasa,
ensayada frente al substrato PLC1 y el substrato
poliglutamato/tirosina (Glu:Tyr 4:1).
Se preparó una mezcla de reacción de cinasa que
contenía Tris-HCl 50 mM, pH = 8, MgCl_{2} 10 mM,
Na_{3}PO_{4} 0,1mM, DTT 1 mM, ATP 10 \muM, y 0,8 \muCurios
por pocillo de ^{33}P-\gamma-ATP
[2000/3000 Ci/mmol]. Se dispensan 70 \mul de la mezcla de
reacción de cinasa en el pocillo de una FlashPlate^{TM} recubierta
con NTA-níquel (Cat. # SMP107, NEN, Boston, MA) Se
añadió entonces 1 \mul del material de compuesto de ensayo en
DMSO al 100% a los pocillos lo que daba una concentración final de
DMSO de 1% en la reacción (el volumen final de reacción de1% de
DMSO en la reacción (100 \mul de volumen de reacción final
incluyen la subsiguiente solución de enzima). Se diluye entonces
tirosina cinasa de rata, soluble, que contiene una etiqueta 6XHIS de
terminal N en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, BSA al 0,1% a
una concentración de 5 ng por microlitro y 30 \mul (150 ng por
pocillo de ensayo) a cada pocillo para iniciar la reacción. Se
incuba la reacción durante una hora a 30ºC. Al cabo de 1 hora de
incubación, se termina la reacción por aspiración de la mezcla de la
placa y lavando los pocillos dos veces con PBS que contenía EDTA
100 mM. El 6XHIS-receptor de VEGF se inmoviliza
sobre la FlashPlate^{TM} y se mide la incorporación de
^{33}P-\gamma-ATP vía
autofosforilación por lectura de la placa sobre un contador de
centelleo. Se mide la inhibición de la actividad enzimática del
VEGF-R2 por observación de la cantidad reducida de
^{33}P-\gamma-ATP incorporada a
la enzima inmovilizada. Los resultados de este ensayo se muestran
en las Figuras 4 y 5.
<110> Emanuel, Stuart, Jonhson,
Dana
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para detectar moduladores
de Dominio de VEGF cinasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ORT-1260
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente In Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligunucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcctaggta ccgttatgcg ggccaatg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtggcggcc gccgggtggt ggaaag
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
substrato de péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Lys Lys Leu Ala Glu Gly Ser Ala Tyr
Glu Glu Val}
Claims (7)
1. Un método para medir el efecto de un compuesto
de modulación de VEGF-R2 putativo que comprende las
siguientes etapas, en este orden:
A) proporcionar un compuesto de ensayo, una
proteína de fusión VEGF-R2 de rata cinasa, y un
substrato de cinasa que comprende una fracción de afinidad y una
sede de fosforilación de VEGF-R2 de rata en una
solución adecuada para proporcionar actividad catalítica de
VEGF-R2 de rata y que contiene
^{33}P-\gamma-ATP como fuente de
fosfato:
B) contacto del compuesto, proteína de fusión de
cinasa, y substrato de cinasa durante el tiempo suficiente para
proporcionar un substrato
^{33}P-fosforilado;
C) aislamiento del substrato de cinasa
fosforilado por captura de afinidad en una placa de ensayo de
pocillos múltiples;
D) separación del
^{33}P-\gamma-ATP remanente por
aspiración de la solución acuosa primero y posterior lavado con la
placa con una segunda solución; y
E) detección de un cambio en la actividad de
cinasa por seguimiento de la velocidad o de la cantidad absoluta de
transferencia de ^{33}P por la cinasa al substrato en la
presencia del compuesto.
2. El método según la reivindicación 1 donde el
substrato es proteína VEGF-R2 de rata cinasa,
fragmentos de polipéptidos de VEGF-R2 de rata, un
fragmento de polipéptido de fosfolipasa C \gamma, o
poliglutamato/tirosina (Glu-Tyr 4:1)
3. El método según la reivindicación 2 donde el
substrato comprende además, como fracción de afinidad, biotina, un
epítope de anticuerpo contenido dentro del substrato, un dominio de
unión a dextrano/maltosa del gen de Escherichia coli malE,
glutation S-transferasa (GST), o polihistidina.
4. El método según la reivindicación 1 donde la
proteina de fusión VEGF-R2 de rata cinasa comprende
los aminoácidos 786-1343 de la proteína
VEGF-R2.
5. El método según la reivindicación 1 donde el
cambio en la actividad de cinasa da por resultado una relación señal
a ruido en el intervalo de 5 a 10 veces.
6. Un método para medir el efecto de un compuesto
de modulación de VEGF-R2 putativo que comprende las
siguientes etapas, en ese orden:
A) proporcionar un compuesto de ensayo, una
proteína de fusión VEGF-R2 de rata cinasa, que
comprende una hexahistidina de terminal N unida a los aminoácidos
786-1343 de la proteína VEGF-R2 de
rata y una solución adecuada para proporcionar actividad catalítica
de VEGF-R2 de rata y que contiene
^{33}P-\gamma-ATP como fuente de
fosfato:
B) contacto del compuesto y la proteína de fusión
de cinasa durante el tiempo suficiente para proporcionar un
substrato ^{33}P-fosforilado;
C) aislamiento de la proteína de fusión de cinasa
forforilada por captura de afinidad utilizando una placa de ensayo
de pocillos múltiples recubierta de NTA-níquel;
D) separación de
^{33}P-\gamma-ATP por aspiración
de la solución acuosa primero y lavando después con la placa con
una solución salina tamponada con fosfato que contiene un compuesto
quelante de catión divalente a la concentración de 1 mM a 100 mM;
y
E) detección de un cambio en la actividad de
cinasa por seguimiento de la velocidad o cantidad absoluta de
transferencia de ^{33}P a la proteína de fusión de cinasa por
autofosforilación en la presencia del compuesto.
7. Un método para medir el efecto de un compuesto
de modulación de VEGF-R2 putativo que comprende las
siguientes etapas en ese orden:
A) proporcionar un compuesto de ensayo, una
proteína de fusión de VEGF-R2 de rata cinasa, que
comprende aminoácidos 786-1343 de la proteína
VEGF-R2 de rata y un substrato de
VEGF-R2 de rata biotinilado en una solución adecuada
para proporcionar actividad catalítica de VEGF-R2 de
rata y que contiene
^{33}P-\gamma-ATP como fuente de
fosfato:
B) contacto del compuesto, proteína de fusión de
cinasa y substrato durante el tiempo suficiente para proporcionar un
substrato ^{33}P-fosforilado;
C) aislamiento del substrato de cinasa
fosforilado por captura de afinidad utilizando una placa de ensayo
de pocillos múltiples recubierta de avidina o estreptavidina;
D) separación de
^{33}P-\gamma-ATP remanente por
aspiración de la solución acuosa primero y posterior lavado con
placa con una solución salina tamponada con fosfato que contiene un
compuesto quelante de catión divalente a la concentración de 1 mM a
100 mM; y
E) detección de un cambio en la actividad de
cinasa por seguimiento de la velocidad o cantidad absoluta de
transferencia de ^{33}P al substrato en la presencia del
compuesto.
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