ES2244169T3

ES2244169T3 - Suministro direccionado de medios biologicamente activos.

Info

Publication number: ES2244169T3
Application number: ES99900624T
Authority: ES
Inventors: Michel Schneider; Feng Yan; Agnes Hiver
Original assignee: Bracco International BV
Current assignee: Bracco International BV
Priority date: 1998-02-09
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-02-02
Also published as: JP2002502829A; CA2319433A1; CA2319433C; EP1056473B8; EP1056473A1; JP4772958B2; DE69925461T2; US6258378B1; ATE296113T1; AU1980999A; ZA99987B; AU753196B2; WO1999039738A1; EP1056473B1; DE69925461D1; NZ506051A

Abstract

Una formulación para el suministro asistido por ultrasonidos de una sustancia biológicamente activa a un sitio diana seleccionado en el organismo de un paciente que comprende, como suspensión en un líquido portador: y a) vesículas de liposomas que encapsulan, dentro de la fase acuosa de su núcleo, la sustancia biológicamente activa; b) una cantidad eficaz de microesferas llenas de gas fisiológicamente aceptable o aire; estando organizadas dichas vesículas de liposomas y dichas microesferas llenas de gas o aire de modo que tengan afinidad unas por otras.

Description

Suministro direccionado de medios biológicamente activos.

Campo de la invención

La presente invención concierne a composiciones o formulaciones para administración y suministro controlable de sustancias o medios bioactivos a sitios seleccionados, v.g. órganos o tejidos, en el cuerpo de pacientes. Las formulaciones comprenden suspensiones acuosas ingeribles o inyectables de liposomas que llevan sustancias activas tales como fármacos o agentes de diagnóstico encapsulados en ellas. La formulación está disponible también en forma de kit, comprendiendo los kits componentes precursores estériles.

Antecedentes de la técnica

El suministro direccionado por la circulación de liposomas que encapsulan medios bioactivos como sustancias terapéuticas o diagnósticas hacia áreas seleccionadas en el organismo, combinado con la liberación asistida de dichas sustancias en sitios específicos está atrayendo una gran atención en el campo médico. Por ejemplo, N. Shoucheng et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 29 (1994), 827-834 han descrito la inyección de liposomas de larga vida (encubiertos) que contienen doxorrubicina en la circulación de animales experimentales y la inducción posterior de liberación controlada de la doxorrubicina en sitios seleccionados en el cuerpo por hipertermia local inducida por energía ultrasónica enfocada. Análogamente, Bednarski et al. Radiology 204 (1997), 263-268 han descrito el direccionamiento guiado por resonancia magnética de vesículas de liposomas que incorporan productos farmacéuticos hacia áreas específicas en el cuerpo, yendo seguido esto por la liberación controlada por ultrasonidos en los tejidos de dichos productos farmacéuticos, debiéndose el efecto a hipertermiálisis de la membrana liposómica.

En los documentos WO94/28873 y WO96/39079, se describe una técnica en la cual microesferas llenas de gas y direccionadas por vía inyectable, por ejemplo liposomas llenos de gas, que comprenden agentes terapéuticos embebidos en el interior de la membrana bicapa del liposoma se direccionan a órganos específicos en los cuales aquéllos se hacen explosionar por irradiación ultrasónica a fin de liberar dichas sustancias terapéuticas embebidas. Es difícil incorporar fármaco en los liposomas llenos de gas (es decir en la fase gaseosa o la membrana superficial) sin afectar a su estabilidad. Incluso si un fármaco puede cargarse en esta clase de vesículas, el mismo debe ser de naturaleza hidrófoba y la carga útil debería ser muy baja. Así, este método exhibe una utilidad práctica muy limitada. Y debido también a que después de la explosión, la sustancia terapéutica puede adherirse durante cierto tiempo a los constituyentes de la membrana liposómica rota en la que aquéllos estaban embebidos, o las partes escindidas de las membranas liposómicas pueden simplemente "ser eliminadas por lavado" por el torrente sanguíneo de tal modo que la sustancia activa no puede liberarse en el sitio direccionado sino en cualquier otro lugar.

El documento WO93/25241 describe una técnica de producción de imágenes por ultrasonido en la cual una suspensión de microesferas se direcciona a órganos del cuerpo y se hace colapsar bajo estimulación por energía ultrasónica, con lo cual se emite un pulso de señal acústica de banda ancha y se detecta su eco por sistemas Doppler de color.

Aunque los métodos de la técnica son meritorios, puede presentarse un problema debido al nivel de energía requerido para romper la membrana de los liposomas y liberar el contenido de los mismos a un área direccionada; si el área está localizada profundamente en el cuerpo, la penetración del haz de energía en el cuerpo puede tener efectos dañinos en los tejidos interpuestos. Por esta razón, los investigadores han emprendido la búsqueda de un agente liberador de energía no invasivo, asociado estrechamente con las vesículas de liposomas, que pueden contribuir inocuamente a la rotura de la membrana del liposoma y liberar el contenido atrapado de la misma. Dicho de otro modo, es muy deseable poner a disposición un agente que contenga suficiente energía potencial almacenada en él para abrir las vesículas de liposomas sin dañar los tejidos próximos o interpuestos, liberándose dicha energía a voluntad por medios de desencadenamiento externos, de tal modo que los medios bioactivos encapsulados en el liposoma se liberen en un sitio seleccionado. El efecto buscado puede compararse con el de un resorte hipotético prearmado para ser disparado a distancia y cuya energía, una vez liberada, haga que el contenido del liposoma se descargue a voluntad. La presente invención se propone alcanzar este efecto deseado.

Sumario de la invención

Resumidamente, la invención implica direccionar liposomas que contienen fármacos a áreas seleccionadas en el organismo y romper o abrir subsiguientemente los liposomas para liberar el contenido encapsulado en un sitio dado. En este método, el agente que contiene la energía potencial a utilizar en asociación con las vesículas de liposomas y cuya energía puede liberarse a voluntad para ayudar a liberar el contenido encapsulado del liposoma está constituido por micropartículas (microcuerpos) con aire o gas confinado. Las micropartículas son preferiblemente microesferas, microvesículas, o microcápsulas, llenas con aire o gas, más preferiblemente microburbujas o microbalones llenos con aire o gas. Cuando se hace que las microesferas llenas con aire o gas en estrecha proximidad con las vesículas de liposomas se rompan o explosionen, la energía de cavitación liberada se propagará en todas direcciones y contribuirá a abrir la membrana del liposoma para liberar el contenido encapsulado o, por cambiar la permeabilidad de la membrana, a mejorar la difusión del fármaco. Los pulsos desencadenantes de, por ejemplo, energía radiante o sónica para hacer estallar las microesferas o microcápsulas llenas con el gas confinado no precisan ser tan enérgicos como los requeridos para actuar
directamente sobre las membranas de los liposomas, por lo que el impacto sobre los tejidos próximos se reduce.

La invención se implementa por la vía de composiciones o formulaciones inyectables que comprenden liposomas (direccionados opcionalmente hacia sitios u órganos específicos) que llevan encapsulados en ellos agentes útiles terapéutica o diagnósticamente y microesferas llenas con aire o gas, es decir microburbujas o microbalones que, opcionalmente, pueden estar asociados con los liposomas. Las microburbujas o microbalones son los descritos en los documentos EP-A-0 474 833; EP-A-0 458 745; EP-A-0 502 814; EP-A-0 554 213; EP-A-0 619 743 y EP-A-0 682 530.

La invención incluye también sistemas o kits precursores que pueden incluir suspensiones de liposomas que encapsulan sustancias bioactivas y suspensiones de microesferas que contienen aire o gas (microburbujas o microbalones estables), o liposomas secos que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos en forma de polvo estabilizado, así como suspensiones en un líquido portador de microburbujas o microbalones estables que contienen aire o gas, o liposomas secos que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos y microbalones en forma de polvo seco, o precursores de microburbujas como fosfolípidos pulverulentos estratificados almacenados en contacto con aire o un gas fisiológicamente aceptable.

Descripción detallada de la invención

Los aspectos principales de la invención tal como se exponen en las reivindicaciones que se acompañan están basados en el descubrimiento inesperado de que puede conseguirse un suministro direccionado extremadamente eficiente de ingredientes biológicamente activos por un método en el cual se administra a un paciente una composición inyectable que comprende (a) liposomas que contienen agentes encapsulados útiles terapéutica o diagnósticamente útiles y (b) microesferas llenas con aire o gas, es decir microburbujas o microbalones. Se deja que la formulación inyectada alcance, por la vía de la circulación, un órgano o tejido seleccionado/deseado y a continuación el órgano o los tejidos direccionados se irradia(n) con un haz de energía (preferiblemente ultrasónico) para estallar o hacer estallar las microesferas llenas de aire o gas, con lo cual la energía del gas liberada abre las vesículas de liposomas adyacentes, causando con ello la dispensación de la o las sustancias biológicamente activas encapsuladas en el sitio deseado del organismo del paciente.

Después de la administración de una cantidad eficaz de una formulación de este tipo en los sistemas vascular o linfático de dicho paciente, la progresión en la circulación de la formulación administrada hacia el sitio seleccionado puede observarse por medios de formación de imágenes ultrasónicos o MRI, de tal modo que la irradiación y el estallido consecutivo de las microesferas llenas de gas por sonólisis o de cualquier otro modo se efectúa únicamente cuando la formulación alcanza o atraviesa o pasa a través del sitio deseado. Claramente, el proceso de irradiación puede llevarse a cabo de modo continuo o intermitente durante cada circulación cíclica de la formulación a través o a lo largo del sitio direccionado.

La irradiación ultrasónica puede llevarse a cabo por medio de una sonda de ecografía modificada adaptada para monitorizar simultáneamente la señal de eco reflejada y proporcionar con ello una imagen del sitio irradiado. Esto puede mejorar adicionalmente la eficacia del método.

Evidentemente, puede no ser necesario que la cantidad total de energía descargada en el sitio del órgano sobrepase la requerida para romper las microesferas llenas de gas y liberar la sustancia bioactiva, minimizando así la irradiación del tejido en el órgano o sitio direccionado. La frecuencia de la irradiación ultrasónica requerida hasta romper las microesferas puede variar desde aproximadamente 0,3 a 3 MHz. Debe indicarse que aunque cualquier tejido perfundido con sangre o linfa puede ser direccionado de acuerdo con la invención, se cree que las afecciones tratadas más eficazmente están relacionadas con lesiones endoteliales, macrófagos situados alrededor de tumores, tejidos vasculares tumorales, trombosis, etc.

Como está admitido universalmente, las soluciones de liposomas son suspensiones acuosas de vesículas microscópicas de forma esférica, cuyo núcleo puede retener atrapadas soluciones acuosas de sustancias disueltas en el líquido portador de los liposomas. Estas vesículas están formadas usualmente por una o más bicapas moleculares dispuestas concéntricamente (laminillas) de compuestos anfipáticos, es decir compuestos que tienen un resto hidrófilo lipófobo direccionado hacia la fase acuosa) y un resto hidrófobo lipófilo que mantiene unidas las capas. (Véase por ejemplo "Liposome Methodology", compilador L.D. Leserman et al., Inserm 136, 2-8 de mayo de 1982). Las sustancias bioactivas pueden estar encapsuladas dentro de la fase acuosa del núcleo de las vesículas de liposomas y las suspensiones pueden inyectarse en el cuerpo, con lo cual puede hacerse que aquéllas circulen en la sangre o la linfa; como se ha dicho antes, la liberación de las sustancias encapsuladas será luego resultado de la apertura o ruptura o colapso de la membrana de la vesícula liposómica. El método direccionado es particularmente adecuado para administración local de sustancias tóxicas que, si no se direccionaran, podrían causar (y causarían) en caso contrario efectos secundarios importantes a otros órganos; fármacos de este tipo incluyen por ejemplo anfotericina B o NSAID's o fármacos cuya administración se requiere durante periodos prolongados tales como dexametasona, insulina, vitamina E, etc. El método es adecuado también para administración de agentes trombolíticos tales como uroquinasa o estreptoquinasa, o compuestos antitumorales tales como taxol, etc.

Definiciones de los términos "microburbujas" y "microbalones" tal como se utilizan en esta memoria se dan en las publicaciones a las que se ha hecho referencia anteriormente. Por ejemplo, en la presente exposición, "microburbuja" designa específicamente microesferas llenas de aire o gas en suspensión en una fase portadora líquida que generalmente son resultado de la introducción en ellas de aire o un gas en forma dividida, conteniendo también preferiblemente la fase líquida agentes con actividad superficial o tensioactivos para controlar las propiedades de superficie de los mismos y la estabilidad de las burbujas. En las microburbujas, el límite o la envoltura alrededor del núcleo de gas es sumamente evanescente y puede estar constituido simplemente por la capa interfacial gas/líquido que tiene generalmente sólo unos cuantos nanómetros de espesor. El término "microbalón" designa preferiblemente microesferas de aire o gas con un límite o envoltura material tangible formado por moléculas distintas de las del líquido de suspensión, por ejemplo, una proteína o una membrana polímera o lipídica, teniendo esta envoltura decenas o centenares de nm de espesor.

Más específicamente, en la presente invención puede considerarse que el volumen interno de las microburbujas está limitado por la interfase gas/líquido, o dicho de otro modo, las microburbujas están limitadas únicamente por una envoltura que envuelve las moléculas del líquido y los agentes tensioactivos fijados sin cohesión en la interfase o límite entre el gas y el líquido. En la presente invención, los agentes tensioactivos comprenden preferiblemente uno o más fosfolípidos al menos en parte en forma laminar o de laminillas. La expresión "forma laminar" indica que los agentes tensioactivos se encuentran en la forma de películas delgadas que implican una o más capas moleculares (forma de "estratificado"). La conversión de dichos agentes tensioactivos fosfolipídicos formadores de película en forma de laminillas puede realizarse fácilmente por metodología de liposomas, por ejemplo por homogeneización a presión o por sonicación bajo frecuencias acústicas o ultrasónicas. En este contexto, debe recordarse que, como se ha dicho arriba, la membrana de las vesículas liposómicas propiamente dicha está hecha de fosfolípidos en forma de laminillas.

Muchos agentes con actividad superficial o tensioactivos, con inclusión de lípidos, particularmente fosfolípidos, pueden estratificarse para adaptarse a esta clase de estructura. En esta invención, se utilizan con preferencia los lípidos empleados comúnmente para fabricación de liposomas, por ejemplo fosfolípidos saturados, naturales o preferiblemente sintéticos, así como otros agentes tensioactivos o glicéridos que pueden conformarse en capas o películas.

Son particularmente preferidos los fosfolípidos seleccionados de fosfolípidos neutros tales como fosfatidil-colina hidrogenada (HSPC), dipalmitoil-, diestearoil- y diaraquidoil-fosfatidilcolina (DPPC, DSPC, DAPC); fosfolípidos cargados negativamente tales como ácido dipalmitoil- y diestearoil-fosfatídico (DPPA, DSPA), dipalmitoil- y diestearoil-fosfatidilserina (DPPS, DSPS), dipalmitoil- y diestearoil-fosfatidilglicerol (DPPG, DSPG); fosfolípidos reactivos tales como derivados de fosfatidil-etanolamina acoplados a un polietilenglicol, una biotinil-, una glutaril-, una caproil- o una succinil-amina.

Los microbalones que son útiles en esta invención se describen en el documento EP-A-0 458 645. Los mismos tienen una envoltura tangible hecha de un material sustancial, v.g. una membrana polímera con resistencia mecánica definida. Dicho de otro modo, aquéllos son microesferas de material sólido flexible en las cuales el aire o gas está confinado más o menos herméticamente. Pueden utilizarse también microbalones fabricados por sonicación de soluciones viscosas de proteínas como sero-albúmina al 5% y que tienen diámetros en el intervalo de 1-20 \mum, y estabilizados por desnaturalización de la proteína formadora de membrana.

El polímero que constituye la envoltura o membrana límite de los microbalones inyectables preferidos en esta invención puede estar hecho de la mayoría de los polímeros hidrófilos biodegradables fisiológicamente compatibles. Entre tales polímeros, que pueden ser naturales o sintéticos, pueden citarse polisacáridos de baja solubilidad en agua, policianoacrilatos, polilactidas y poliglicolidas y sus copolímeros, copolímeros de lactidas y lactonas tales como \gamma-caprolactona, \delta-valerolactona, polipéptidos, y proteínas tales como gelatina, colágeno, globulinas y albúminas. La gran versatilidad en la selección de polímeros sintéticos es otra ventaja de la presente invención dado que, como sucede en el caso de los pacientes alérgicos, puede evitarse preferiblemente la utilización de microbalones hechos de proteínas naturales (albúmina, hemoglobina) como en los documentos US-A-4.276.885 o EP-A-0 324 938. Otros polímeros adecuados incluyen poli-(orto)ésteres (véanse por ejemplo los documentos US-A-4.093.709; US-A-4.131.648; US-A-4.138.344; US-A-4.180.646); ácido poliláctico y poliglicólico y sus copolímeros, por ejemplo DEXON (J. Heller, Biomaterials 1 (1980), 51; poli(DL-lactida-co-\gamma-caprolactona), poli(DL-lactida-co-\delta-valerolactona), poli(DL-lactida-co-\gamma-butiro-lactona), polialquilcianoacrilatos; poliamidas, polihidroxibutirato; polidioxanona; poli-\beta-aminocetonas (Polymer 23 (1982), 1693); polifosfazenos (Science 193 (1976), 1214); y polianhídridos. Referencias a polímeros biodegradables pueden hallarse en R. Langer et al., Macromol. Chem. Phys. C23 (1983), 61-126. Pueden utilizarse también poliaminoácidos tales como los ácidos poliglutámico y poliaspártico así como sus derivados, v.g., ésteres parciales con alcoholes inferiores o glicoles. Un ejemplo útil de tales polímeros es poli-(t.butil-glutamato). Son también posibles copolímeros con otros aminoácidos tales como metionina, leucina, valina, prolina, glicina, alanina, etc. Otros derivados de ácido poliglutámico y poliaspártico con biodegradabilidad controlada han sido consignados (véanse los documentos WO87/03891; US 4.888.398 y EP-A-0 130 935).

Los gases para llenar las microesferas de esta invención incluyen aire, y la mayoría de los gases comunes en el campo de los gases ecogénicos, por ejemplo SF_{6}, CF_{4}, C_{2}F_{6}, C_{3}F_{6}, C_{3}F_{8}, C_{4}F_{6}, C_{4}F_{8}, C_{4}F_{10}, C_{5}F_{10}, C_{5}F_{12}, aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, gases nobles, y mezclas de los mismos. Pueden utilizarse también líquidos inocuos de punto de ebullición bajo que se vaporizarán a la temperatura del cuerpo o por la acción de pulsos de energía aplicados a distancia, tales como C_{6}F_{14}, como componente volátil confinable de las micropartículas en la presente invención.

Los gases confinados pueden hallarse a la presión atmosférica o a presiones mayores o menores que la atmosférica; por ejemplo, los gases confinados pueden hallarse a presiones iguales a la presión hidrostática del líquido portador que retiene los liposomas y las microesferas llenas de gas.

En la presente invención, las microesferas llenas de gas pueden estar asociadas más o menos estrechamente con los liposomas, es decir aquéllas pueden estar simplemente mezcladas con las vesículas de liposomas con lo cual las mismas estarán estadísticamente distanciadas unas de otras. Alternativamente, las vesículas de liposomas y las microesferas llenas de gas pueden estar organizadas de modo que tengan afinidad unas por otras, por ejemplo aquéllas pueden estar provistas con los componentes moleculares de un par conjugado. Como ejemplo, puede incorporarse un antígeno en la membrana del liposoma y un anticuerpo en las microesferas, o viceversa, con lo cual la conjugación antígeno-anticuerpo hará que las microesferas y las vesículas de liposomas se acoplen unas a otras. Son también posibles otros sistemas de acoplamiento que implican donantes y receptores en las clases de sustancias enumeradas a continuación: anfetaminas, barbituratos, sulfonamidas, sustratos inhibidores de las monoamino-oxidasas, hormonas, enzimas, lípidos, ligandos específicos de membranas celulares, agentes anti-hipertensivos, neurotransmisores, aminoácidos, oligopéptidos, radio-sensibilizadores, esteroides (v.g., estrógeno y estradiol), anticuerpos mono- y policlonales así como fragmentos de los mismos, carbohidratos (tales como derivados de glucosa), ácidos grasos, receptores y sustratos muscarínicos (tales como benzilato de 3-quinuclidinilo), receptores y sustratos de dopamina (tales como espiperona), biotina, péptidos y proteínas capaces de fijarse a receptores específicos, receptores y sustratos de
benzodiazepina.

Son también posibles sistemas que implican sitios de acoplamiento múltiples. Por ejemplo, en una realización particular del método y la formulación de la presente invención, las envolturas tanto de las vesículas de liposomas como de las microesferas de gas están provistas de sitios de acoplamiento de biotina y una suspensión de la misma en un líquido portador acuoso se mezcla con avidina, con lo cual tanto las vesículas de liposomas como las microesferas de gas se aglutinarán por acoplamiento con avidina.

Los liposomas utilizados en esta invención son preferiblemente del tipo de vida larga (encubiertos), es decir resistentes a la captura por el RES. Liposomas encubiertos se describen en documentos tales como J. Pharmacy & Pharmacol. 39 (1987), 52P); los documentos EP-A-0 354 855, WO91/05545; EP-A-0 759 785; EP-A-0 731 690; Biochimica et Biophysica Acta 1126 (1992), 255-260, y "Stealth Liposomes" recopilado por D. Lasic y F. Martín (1995) CRC Press, Londres, incorporándose por referencia todas las publicaciones en la presente memoria descriptiva.

Realizaciones particularmente preferidas de la presente invención implican liposomas que comprenden tres componentes: A. un lípido neutro, por ejemplo, un lípido no iónico o de ion dipolar o sus derivados; B. un lípido cargado negativa o positivamente, y C. un lípido que lleva un componente funcional, por ejemplo N-biotinil-PE o PEG-PE. Pueden utilizarse colesterol o derivados de colesterol para reemplazar una parte del componente A, como es conocido generalmente por las personas expertas.

Los lípidos utilizados para fabricar los liposomas pueden seleccionarse de un grupo que comprende: lípidos y fosfolípidos tales como lecitina de soja, lecitina parcialmente refinada, fosfolípidos hidrogenados, lisofosfato, fosfatidil-colina, fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-serina, fosfatidil-inositol, cardiolipina, esfingolípidos, gangliósidos, cerebrósidos, ceramidas, otros ésteres análogos de fosfatidil-colina (PAF), lisoPAF); fosfolípidos sintéticos tales como L-\alpha-lecitina (dilauroilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, bilinoloilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, di-araquidoilfosfatidilcolina); derivados de fosfatidil-etanolamina, tales como 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1-acil-2-acil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina, dinitrofenil- y dinitrofenilamino-caproil-fosfatidiletanolamina, 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-polietilenglicol (PEG-PE), N-biotinil-PE, N-caproilamina-PE, N-dodecilamina-PE, N-MPB-PE, N-PDD-PE, N-succinil-PE, N-glutaril-PE; fosfatidil-gliceroles tales como dipalmitoilfosfatidilglicerol, diestearoil-fosfatidilglicerol; ácidos fosfatídicos (sal de 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfato, sal de sodio de 1-acil-2-acil-sn-glicero-3-fosfato; fosfatidilserina tal como sal de sodio de 1,2-diacil-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina], sal de sodio de 1-acil-2-acil-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina], ácido lisofosfatídico, lípidos catiónicos tales como 1,2-diacil-3-trimetilamonio-propano (TAP), 1,2-diacil-3-dimetilamoniopropano (DAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N',N''-trimetilamonio (DOTMA); lípidos polimerizables tales como diíno-PC, diínoPE (por ejemplo 1,2-bis(10,12-tricosadiínoil-sn-glicero-3-fosfocolina; fosfolípidos con grupos de cabeza multivariables tales como fosfatidiletanol, fosfatilpropanol y fosfatidilbutanol, fosfatidiletanolamina-N-monometilo, 1,2-di-estearoil(dibromo)-sn-glicero-3-fosfocolina; y fosfolípidos con cadenas de ácido graso parcial o totalmente fluoradas.

Un agente emulsionante o tensioactivo puede incorporarse también en los liposomas a utilizarse para preparación de los liposomas, tales como Pluronics®, Poloxamer®, Span®, Brig®, Tweens®, Triton-X®; y agentes con actividad superficial fluorados tales como Zonyl®.

Para preparar las suspensiones de liposomas útiles en la presente invención, pueden aplicarse las técnicas convencionales en el campo, por ejemplo la descrita en los documentos anteriores y el siguiente: Liposomes as Drug Carriers, por G. Gregoriadis, Wiley & Sons, Nueva York (1988).

Por ejemplo, como se expone en el documento GB-A-2.134.869, microesferas (de 10 \mum o menos) de un sólido portador hidrosoluble (NaCl, sacarosa, lactosa, y otros carbohidratos) se recubren con una mezcla de fosfolípidos; a continuación, por disolución de este vehículo recubierto en una fase acuosa, se obtendrán vesículas de liposomas. En el documento GB-A-2.135.647, partículas insolubles, v.g. microperlas de vidrio o resina se recubren por mojado en un solución de lípidos en un disolvente orgánico seguido por eliminación del disolvente por evaporación. Las microperlas recubiertas de lípido se ponen después en contacto con una fase acuosa portadora, con lo cual se formarán vesículas liposómicas en dicha fase portadora.

Es particularmente interesante observar que, en la presente invención, la generación de las microburbujas, cuyo estallido eventual ayudará a romper la membrana de las vesículas liposómicas y liberar el contenido encapsulado, está relacionado directamente (aunque de modo parcial) con la formación de los liposomas. De hecho, como se expone en el documento EP-A-0 474 833, la admisión de aire o un gas en una suspensión de liposomas proporcionará suspensiones estables de microburbujas que contienen desde aproximadamente 10^{7} a 10^{10} microburbujas/ml, o más. Asimismo, de acuerdo con el mismo documento, resultarán suspensiones de burbujas similares de la exposición durante cierto tiempo a aire o un gas de formulaciones de fosfolípidos laminares secos (que pueden compararse con liposomas almacenados secos), y mezcla posterior con un líquido portador. Por tanto, en la presente invención es interesante (aunque no obligatorio) comenzar con suspensiones o soluciones de liposomas preparadas por cualquier técnica conocida, e introducir después de ello aire o un gas, con lo cual se formará una suspensión estable de microburbujas estabilizada por la presencia de los agentes tensioactivos en forma laminar. Por supuesto, el material que forma las paredes del liposoma tendrá que estar modificado dentro del alcance de la presente invención, v.g., por ejemplo por mezcla con el mismo o injerto covalente en el mismo de moléculas extrañas diseñadas para acoplamiento como se ha descrito con anterioridad. Alternativamente, puede comenzarse también con vesículas de liposomas "sin carga", es decir vesículas que no tienen todavía una sustancia bioactiva encapsulada en ellas. A continuación, antes o después de la introducción de aire o un gas en la solución de liposomas para proporcionar una suspensión deseada de microburbujas, la carga de las vesículas de liposomas puede efectuarse como se describe en el documento EP-A-0 514 523.

En una realización, puede prepararse una formulación de polvo seco de liposomas que contienen medios bioactivos encapsulados en ellos de acuerdo con el documento US-A-4.229.360, conteniendo el material formador de la pared del liposoma un precursor de acoplamiento agonista (v.g., biotina). A continuación, la suspensión de liposomas se regenera utilizando un líquido acuoso portador que contiene un antagonista (v.g. avidina), con lo cual se formarán burbujas junto con las vesículas de liposomas, estabilizadas ambas por los lípidos que contienen biotina y el acoplamiento por la avidina contenida en la solución.

En una variante, las preparaciones de liposomas y las formaciones de microesferas llenas de gas pueden prepararse por supuesto individualmente y mezclarse entre sí antes de la administración. Aquéllas pueden administrarse también individualmente, en cuyo caso la administración se efectúa secuencialmente en cualquier orden con o sin demora entre las inyecciones, es decir para retardar la interferencia de las microburbujas y las vesículas de liposomas. En ciertas aplicaciones o modos de tratamiento pueden contemplarse varias inyecciones de microburbujas para ayudar a la liberación del contenido de los liposomas en varios sitios o para la liberación repetida del ingrediente activo de los liposomas en el mismo sitio.

Como se ha dicho anteriormente, son utilizables también microbalones con aire o gas confinado de acuerdo con la invención para ayudar a la apertura de las vesículas de liposomas. En este caso, los microbalones se preparan por separado de los liposomas, preferiblemente de acuerdo con las técnicas expuestas en el documento EP-A-0 458 745, y se mezclan después con la suspensión de liposomas de interés. También de modo natural, la envoltura de los microbalones contendrá preferiblemente un precursor de acoplamiento diseñado para conjugarse eventualmente con un receptor de la membrana liposómica (o viceversa). Logros prácticos de una realización de este tipo se exponen más adelante en la parte experimental.

A fin de implementar el método de la invención, las preparaciones se administrarán de acuerdo con rutas usuales, v.g. intravenosa, perfusión, etc. Por ejemplo, pueden inyectarse en la circulación de individuos por medios usuales (IV o de otro tipo) preparaciones direccionadas (o no direccionadas) como se ha descrito arriba que contienen en mezcla liposomas con medios bioactivos atrapados y microesferas (microburbujas o microbalones) con aire o gas confinado en su interior. Después de cierto tiempo, cuando el material inyectado ha alcanzado un sitio de órgano o tejido direccionado en el cuerpo, se aplican pulsos de energía procedentes del exterior (por ejemplo por encima o sobre la piel en relación con el sitio) para hacer que las partidas que contienen gas explosionen; la energía de cavitación liberada con ello por la explosión provoca la apertura de la envoltura del liposoma y la descarga de los materiales encapsulados.

Los pulsos de energía requeridos para explosionar las microesferas llenas de gas son preferiblemente pulsos sónicos o ultrasónicos. En este contexto, véase la publicación por M.W. Miller et al. en Ultrasound in Med. & Biol. 22 (1996), 1131-1154. En términos generales, pueden aplicarse sistemas transductores directamente al cuerpo o a través de un acoplador de camino de agua con las frecuencias comprendidas en el intervalo de aproximadamente 0,3 a 3 MHz. En una realización preferida, se utiliza una sonda ultrasónica modificada para monitorizar el desplazamiento de las burbujas después de su administración y la destrucción de las mismas en el momento apropiado en el sitio de aplicación. El colapso de las burbujas se representa luego por un cambio espectacular de la señal de eco reflejada. La señal de monitorización está comprendida en el intervalo de 1 MHz a 10 MHz, y preferiblemente entre 2 y 7 MHz.

Teniendo presentes las diversas realizaciones de formulación a utilizar posiblemente en la presente invención, los sistemas de precursores desarrollados comprenden componentes a mezclar antes de su utilización y suministrados comercialmente por ejemplo en una forma de kit para almacenamiento y transporte más fáciles. Estos sistemas precursores pueden incluir las realizaciones siguientes:

(A) Solución (o suspensiones) de liposomas que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos. La solución se trata luego con aire o un gas, por ejemplo por infusión antes de la aplicación mediante una jeringuilla o de otro modo.

(B) Solución (o suspensiones) de liposomas que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos y una suspensión de microesferas que contienen aire o gas (microburbujas o microbalones estables) para ser mezcladas con
ellos.

(C) El kit que comprende liposomas secos que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos en forma estabilizada de polvo y una suspensión en un líquido portador de microburbujas o microbalones que contienen aire o gas. Ambos componentes deben mezclarse antes de su utilización.

(D) El kit que puede comprender liposomas secos que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos en forma estabilizada de polvo, microbalones en forma de polvo seco, o precursores de microburbujas como fosfolípidos pulverulentos estratificados almacenados en contacto con aire o un gas y un líquido portador aministrable, mezclándose dichos componentes antes de su utilización.

(E) En una variante simplificada, el kit puede comprender liposomas secos almacenados en forma estabilizada de polvo en contacto con aire o un gas y que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos y un líquido portador administrable, que pueden mezclarse antes de su utilización, con lo cual se forma una suspensión estable de microburbujas debido al efecto estabilizador de los fosfolípidos.

Como ya se ha mencionado, el método de la invención basado en la cavitación acústica por estallido de microburbujas puede utilizarse no sólo para promover la lisis de los liposomas para suministro de fármacos y aumento del contraste en la formación de imágenes por ultrasonidos, sino también para modificar la permeabilidad celular para la transfección o expresión de genes. Los liposomas pueden ser termosensibles, fusogénicos, sensibles al pH, encubiertos (v.g. PE-PEG) con o sin factores específicos de autoguiado y cargados con sustancias terapéuticas, de formación de imágenes o genéticas diferentes. Preferiblemente, los liposomas son unilaminares, una estructura que permite una capacidad alta de encapsulación de fármacos (es decir, relación sustancia activa/lípido alta), y una baja estabilidad al cizallamiento bajo cavitación acústica.

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplo 1 A) Liposomas LUV (vesículas unilaminares grandes) marcados con biotina

Se disolvieron en 150 ml de una mezcla (1:2) de cloroformo y metanol a 50ºC 0,75 g de fosfatidil-colina de soja hidrogenada (HSPC, de Nattermann Chemie, Alemania), 50 mg de ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA, de Sygena, Suiza), y 10 mg de N-biotinil Cap-PE (Avanti Polar Lipids, EE.UU.). Se añadieron a esto 200 g de perlas de vidrio de 1 mm (Polyscience Inc., EE.UU.) y se homogeneizó el todo en un homogeneizador. Después de eliminar el disolvente en el evaporador rotativo, el residuo se suspendió en 200 ml de solución tampón (TRIS 10 mM + NaCl al 0,9%, pH 7,2) que contenía 10% de fármaco trazador óptico (carboxifluoresceína) y la mezcla se calentó a 60ºC para hidratar los lípidos. Se separaron las perlas y la solución de liposomas se extruyó cinco veces a través de membranas de filtración de policarbonato de 1 \mum; a continuación, la solución se dializó contra el mismo tampón para eliminar las sustancias no atrapadas. Después de la diálisis, se comprobó la solución (contador Coulter), siendo el diámetro medio de las vesículas de liposomas aproximadamente 1,3 \mum.

B) Microburbujas marcadas con biotina

En 150 ml de tampón (TRIS 10 mM + 0,9% NaCl, pH 7,2) se dispersaron a 65ºC 200 mg de dipalmitoilfosfatidil-glicerol (DPPG) y 200 mg de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), todos ellos de Sygena, 10 mg de N-biotinil-CapPE y 5 g de Pluronic® F-108. Después de enfriar a la temperatura ambiente, la solución se puso en un aparato emulsificador equipado con un cabezal Polytron® y se emulsionó (10.000 rpm) durante 2 min en una atmósfera de perfluorobutano (C_{4}F_{10}) para proporcionar una suspensión de burbujas lechosa. Se desechó la capa superior de espuma y la solución se dejó sedimentar. La capa superior de la suspensión de burbujas se recogió y se resuspendió en tampón TRIS-NaCl; después de ello, se repitió dos veces la operación de decantación, con lo cual las burbujas en la suspensión purificada final tenían un tamaño medio de 2,6 \mum a una concentración de 5 x 10^{8} burbujas/ml.

C) Liberación ultrasónica de carboxifluoresceína (CF) por los liposomas

Se prepararon tres muestras diferentes de 205 \mul como sigue:

a) 20 \mul de solución de liposomas (A) + 185 \mul de tampón TRIS-NaCl

b) 20 \mul de solución de liposomas (A) + 5 \mul de tampón TRIS-NaCl + 180 \mul de solución de microburbujas (B)

c) 20 \mul de solución de liposomas (A) + 5 \mul de solución de avidina (1 mg/ml en tampón TRIS) + 180 \mul de solución de microburbujas (B).

Las muestras dispuestas en tubos Eppendorff se sometieron durante 10 min al efecto de ultrasonidos en un aparato Branson 5200 (47 KHz, 0,2 W/cm^{2}). Después del tratamiento, las muestras se centrifugaron y la fluorescencia del trazador liberado en el sobrenadante se midió con un fluorímetro Kontron SFN-25 (excitación a 480 nm; emisión a 520 nm). Se utilizaron como control muestras idénticas (sin tratar). Los resultados se recogen en la tabla siguiente.

TABLA 1

Muestra	Liberación de CF (%)
	Sin ultrasonidos (control)	Tratada con ultrasonidos
A	2,3	4,1
B	10	23,6
C	9,7	53,4

Como se puede ver por los resultados que anteceden, el suministro máximo de sustancia atrapada en los liposomas ocurre cuando las burbujas se acoplan con los liposomas por conjugación con avidina.

Ejemplo 2

Se prepararon liposomas MLV (MLV = vesículas multilaminares) a la concentración de 10 mg (de mezcla de lípidos)/ml (de fase acuosa) utilizando una mezcla 75:20:5 (p/p) de DSPC/colesterol/DPPA. La fase acuosa era una solución 10 mM de CF en tampón. La hidratación de la mezcla de lípidos (formación de vesículas de liposomas) se efectuó por calentamiento a 65ºC bajo agitación moderada durante 10 min.

Las muestras a ensayar estaban constituidas por 100 \mul de suspensión de liposomas más diversas cantidades de la preparación de microburbujas (B) descrita en el Ejemplo 1 (véase la Tabla siguiente). A continuación, para los ensayos, las muestras se diluyeron ulteriormente para completar 6 ml con tampón TRIS y se circularon en un tubo de plástico de paredes delgadas (f = 4 mm) sumergido en un baño a temperatura constante de 37ºC con una bomba peristáltica. Se aplicaron pulsos procedentes de un generador Tabor 8550, amplificados con un amplificador ENI RF A-150, con un transductor enfocado de 1 MHz (Parametric Inc., EE.UU.) situado a 9 cm del tubo. Se midió la presión acústica en el tubo con un hidrófono conectado a una pantalla digital (DL-4100 de Yokogawa, Japón). Se aplicaron los parámetros experimentales adicionales siguientes: longitud de pulso, 10 \mus; número de estallidos, 100; amplitud de presión en el tubo (pico a pico), 1,6 Mpa; tiempo de exposición, 3 min; tasa de flujo 15 ml/min. Los resultados se recogen en la Tabla siguiente.

TABLA 2

Muestra	Liberación de CF (\mumol)
Liposomas sólo	1,0
+ 0,1 ml B (del Ej. 1)	1,9
+ 0,5 ml B	7,7
+ 2,5 ml B	15,9

Ejemplo 3

Se preparó una suspensión de liposomas MLV como en el Ejemplo 2. Una porción de la misma (LUV-1) se convirtió en LUV por congelación y descongelación repetidas, seguidas por cinco extrusiones a través de membranas de 1 \mum. Otra porción (LUV-2) se extruyó ulteriormente a través de membranas de 0,6, 0,4 y 0,2 \mum sucesivamente. Las muestras a ensayar se mezclaron con la suspensión de microburbujas (B) para producir una relación volumétrica liposoma/microburbuja de 1:5. Las muestras se ensayaron en cuanto a liberación de CF como se indica en el Ejemplo 1. Los resultados se recogen en la Tabla siguiente.

TABLA 3

Liposomas	Tamaño (mm)	Relación de	Liberación de CF (%)
		encapsulación (\mul/mg)
MLV	810	2,3	16
LUV-1	630	8,1	41
LUV-2	260	1,3	10

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la influencia de diversos parámetros tales como frecuencia del transductor, potencia de salida, tasa de flujo, tiempo de exposición, etc. sobre la lisis de los liposomas con microburbujas de gas inducida por ultrasonidos.

El Ejemplo 2 se repitió con una concentración constante burbujas/liposomas y exposiciones a ultrasonidos diferentes. Los resultados han demostrado que el cambio en la frecuencia del transductor desde 1 a 2,25 MHz reduce el grado de liberación de CF por los liposomas en condiciones en las cuales todos los restantes parámetros se mantenían constantes. Se realizó una observación similar respecto a cambios en la tasa de flujo. Cuanto mayor es el flujo tanto menor es el número de las microburbujas explosionadas o destruidas.

Se ha observado que la destrucción de las microburbujas era más eficiente para potencias acústicas más altas, teniendo como consecuencia directa una mayor liberación de CF por los liposomas. Por consiguiente, puede decirse que el grado de lisis de los liposomas era proporcional al aumento de amplitud aplicado.

El efecto del tiempo de exposición era aparentemente dependiente de los diferentes ajustes de potencia, frecuencia y tasa de flujo. La lisis de los liposomas era completa cuando se destruían todas las microburbujas contenidas en la suspensión. Sin embargo, durante una infusión continua de las microburbujas, la lisis total de los liposomas aumentaba y se mantenía elevada en tanto que se mantenía la infusión de microburbujas.

Resultados experimentales (3 min de irradiación US, 500 \mul de liposomas, 2,5 \mul de burbujas):

	Variación de frecuencia	Variación de la presión acústica	Variación de la tasa de
	a 1,5 MPa, 10 ml/min	a 1 MHz y 10 ml/min	flujo a 1 MHz y 1,5 MPa
	1 MHz	2,25 MHz	0,5 MPa	1,5 MPa	5 ml	10 ml	15 ml
Burbuja %*	81,9	68,5	69,5	81,9	94,4	81,9	70,3
Lisis %**	18,7	5,1	7,3	18,7	25,3	18,7	13,2
* % de burbujas destruidas por irradiación US, determinado por Coulter.
** Lisis de liposomas determinada por liberación de CF.

Estos datos demuestran que la lisis de los liposomas está relacionada estrechamente con la cantidad de burbujas destruidas por ultrasonidos (sonólisis).

Ejemplo 5

Se prepararon liposomas unilaminares grandes (LUV) de acuerdo con M.H. Gaber et al., Int. J. Rad. Oncol. Bio. Phys. 36 [5] (1996), 1177-1187. Una mezcla en relación molar (100:50:30:6) de DPPC (dipalmitoilfosfatidil-colina), HPSC, colesterol, y PE-PEG (diestearoilfosfatidil-etanolamina derivatizada con polietilenglicol 1900) se disolvió en un disolvente orgánico (véase Ejemplo 1), y después de ello se dejó evaporar la solución obtenida en contacto con una iso-superficie a fin de formar una película de los fosfolípidos sobre dicha superficie. A continuación se añadió una solución 10 mM de CF en TRIS (10 mM + 0,9% NaCl, pH 7,4) en la cantidad requerida para formar una solución de 5 mg/ml de liposomas; la hidratación se efectuó por calentamiento por encima del punto de transición y la solución de liposomas se extruyó 5 veces a través de membranas de tamaño de poro decreciente. El tamaño medio de burbuja, medido por dispersión de la luz (aparato Nycom) era aproximadamente 140 nm.

Se prepararon muestras por mezcla con la preparación de microburbujas del Ejemplo 1, encontrándose esta también en la misma proporción. La Tabla 4 siguiente muestra la liberación de CF después de exposición de las muestras a energía ultrasónica como en el Ejemplo 1 durante 10 min a diversas temperaturas. Los datos incluyen también controles (sin burbujas, y sin ultrasonidos) como se indica. Dichos datos demuestran claramente el efecto de la temperatura. Obsérvese también que, en ausencia de la influencia "catalítica" de los microcuerpos que contienen gas, el efecto del ultrasonido no es muy superior al de la temperatura.

TABLA 4

	Liberación de CF (%) a tºC
Muestra	25	37	41
Calor sólo	3	17	28
Calor + US	4	17	31
Calor + US + burbujas	16	32	54

Otro aspecto de la utilización de la energía de cavitación liberada en un medio por la explosión de microcuerpos llenos de gas es la acción sobre las gotitas de una emulsión de líquidos farmacéuticamente aceptables en una fase portadora. Por consiguiente, es posible transportar la mezcla de emulsión y microburbujas a un área seleccionada en el cuerpo y, una vez en ella, puede desencadenarse la rotura de las gotitas por la desintegración de las burbujas controlada a distancia. El líquido contenido en las gotitas puede tener sustancias bioactivas disueltas en él, las cuales se distribuirán luego en el área de interés. En una variante, si su punto de ebullición es suficientemente bajo, este líquido se vaporizará simplemente y producirá una plétora de nuevas burbujas y señal ecográfica aumentada. Podrían contemplarse muchos otros aspectos de la utilización del suministro de energía localizado por burbujas susceptibles de explosionar.

Ejemplo 6

Se disolvieron 1 g de dipalmitoil-fosfatidil-glicerol (DPPG, Sygena, Suiza) y 10 mg de N-biotinil Cap-PE (Avanti Polar Lipids, EE.UU.) en 100 ml de agua destilada que contenía 3 gramos de Pluronic®-F108 (un agente tensioactivo no iónico). Se obtuvo una solución clara a 60ºC con agitación. Esta solución se mezcló con un gas (v.g. C_{4}F_{10}) en un homogeneizador de alta velocidad (Polytron®, 10.000 rpm) durante unos cuantos minutos. Se obtuvo una suspensión opaca que contenía entre 10^{8} y 10^{9} microburbujas de gas/ml con una distribución de tamaños comprendida entre 0,7 y 10 \mum. Para eliminar el agente tensioactivo, las moléculas de biotinil libres (no incorporadas) y estrechar la distribución de tamaños de las microburbujas, las suspensiones se decantaron (lavaron) repetidamente varias veces con agua hasta que se eliminó todo el agente tensioactivo en la suspensión (lo que se controló por IR o HPLC). La distribución de tamaños y el número de microburbujas pueden ajustarse igualmente por control de la duración de decantación y el volumen de la fase sobrenadante (fase de burbujas) recuperada. Típicamente, eran suficientes tres decantaciones. En el caso en que las moléculas de autoguiado o biomoléculas eran inestables en soluciones acuosas, las suspensiones de microburbujas se congelaron (v.g. por debajo de -18ºC) y se guardaron hasta su utilización.

Dado que los agentes tensioactivos o detergentes se utilizaron únicamente para facilitar la solubilización de los lípidos y la formación de las microburbujas de gas, los mismos se separaron después de la formación de las microburbujas. Pueden utilizarse todos los agentes tensioactivos susceptibles de disolución, co-solubilización o dispersión de los fosfolípidos en medio acuoso. Ejemplos de tales agentes tensioactivos son Pluronic®, Polaxmer®, Tween®, Span®, Chaps (detergente de ion dipolar no desnaturalizante utilizado a menudo para bioquímica de membranas) y numerosos agentes tensioactivos hidrocarbonados (alquil-sulfato de sodio, etc.), agentes tensioactivos de fluorocarbonos (v.g., perfluoro-alquil-polioxietileno), iónicos o no iónicos. Como el elemento principal de la envoltura estabilizadora de las microburbujas, pueden utilizarse muchas moléculas de fosfolípidos (v.g. fosfatidil-colina, fosfatidil-serina, fosfatidil-glicerol, etc.), pero para el método de este ejemplo se prefieren los fosfolípidos cargados negativamente, debido a su co-solubilidad en agua en presencia de otros agentes tensioactivos. En esta técnica pueden utilizarse también muchos lípidos sintéticos que contienen perfluorocarbonos para preparación de microburbujas. Además, en esta preparación puede utilizarse una mezcla de más de dos agentes tensioactivos o de varias moléculas de lípidos, lo que proporciona a menudo microburbujas con propiedades interesantes y con un alto rendimiento de microburbujas.

Este ejemplo demuestra que el método de "agotamiento de agente tensioactivo o detergente" (similar al proceso utilizado en la preparación de los liposomas) puede emplearse para incorporar el factor de autoguiado en las microburbujas confiriéndolas propiedades específicas para direccionamiento in vivo.

Claims

1. Una formulación para el suministro asistido por ultrasonidos de una sustancia biológicamente activa a un sitio diana seleccionado en el organismo de un paciente que comprende, como suspensión en un líquido portador:

a) vesículas de liposomas que encapsulan, dentro de la fase acuosa de su núcleo, la sustancia biológicamente activa; y

b) una cantidad eficaz de microesferas llenas de gas fisiológicamente aceptable o aire;

estando organizadas dichas vesículas de liposomas y dichas microesferas llenas de gas o aire de modo que tengan afinidad unas por otras.

2. La formulación de la reivindicación 1, en la cual las vesículas de liposomas y las microesferas están provistas cada una con los componentes respectivos de un par conjugado.

3. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 anteriores, en la cual las microesferas son microburbujas limitadas por una interfase líquido/gas.

4. La formulación de la reivindicación 3, en la cual el líquido portador comprende compuestos anfipáticos para estabilizar las microesferas que contienen gas contra un colapso prematuro.

5. La formulación de la reivindicación 4, en la cual los compuestos anfipáticos son fosfolípidos.

6. La formulación de la reivindicación 5, en la cual los fosfolípidos son fosfolípidos saturados.

7. La formulación de las reivindicaciones 3 a 6, en la cual la estabilización de las microburbujas se lleva a cabo por una monocapa de fosfolípidos en la interfase gas/líquido.

8. La formulación de las reivindicaciones 5, 6 ó 7, en la cual los fosfolípidos se seleccionan de fosfolípidos neutros, fosfolípidos cargados negativamente, o fosfolípidos reactivos.

9. La formulación de la reivindicación 8, en la cual los fosfolípidos se seleccionan de fosfatidil-colina hidrogenada (HSPC), dipalmitoil-, diestearoil- y diaraquidoil-fosfatidilcolina (DPPC, DSPC, DAPC); ácido dipalmitoil y diestearoilfosfatídico (DPPA, DSPA), dipalmitoil y diestearoil-fosfatidilserina (DPPS, DSPS), dipalmitoil- y diestearoil-fosfatidilglicerol (DPPG, DSPG), derivados de fosfatidil-etanolamina acoplados a un polietilenglicol, una biotinil-, una glutaril-, una caproil- o una succinil-amina.

10. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 anteriores, en la cual las microesferas son microbalones limitados por una membrana tangible.

11. La formulación de la reivindicación 10, en la cual la membrana de los microbalones está hecha de un polímero natural o sintético.

12. La formulación de la reivindicación 1, en la cual las vesículas de liposomas y las microesferas están provistas cada una con sistemas de acoplamiento que implican donantes y receptores.

13. la formación de la reivindicación 12, en la cual tanto las vesículas de liposomas como las microesferas están provistas con un elemento donante acoplador y la formulación comprende adicionalmente un elemento aceptor con multisitios, con lo cual donante y aceptor llegarán a conjugarse y las vesículas de liposomas y los microcuerpos se ponen en contacto unos con otros.

14. La formulación de la reivindicación 12 ó 13, en la cual los sistemas de acoplamiento que implican donantes y receptores se seleccionan del grupo constituido por anfetaminas, barbituratos, sulfonamidas, sustratos inhibidores de las monoamino-oxidasas, hormonas, enzimas, lípidos, ligandos específicos de membranas celulares, agentes antihipertensivos, neuro-transmisores, aminoácidos, oligopéptidos, radio-sensibilizadores, esteroides, anticuerpos mono- y policlonales así como fragmentos de los mismos, carbohidratos, ácidos grasos, receptores y sustratos muscarínicos, receptores y sustratos de dopamina, biotina, péptidos y proteínas capaces de fijarse a receptores específicos, y receptores y sustratos de benzodiazepina.

15. La formulación de la reivindicación 14, en la cual está presente un antígeno en la membrana de liposomas y un anticuerpo de las microesferas, o viceversa, de tal modo que la conjugación antígeno-anticuerpo hará que las vesículas de liposomas y las microesferas se pongan en contacto unas con otras.

16. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la cual el gas contenido en las microesferas se selecciona de SF_{6}, CF_{4}, C_{2}F_{6}, C_{3}F_{6}, C_{3}F_{8}, C_{4}F_{6}, C_{4}F_{8}, C_{4}F_{10}, C_{5}F_{10}, C_{5}F_{12}, C_{6}F_{14}, aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, gases nobles, y mezclas de los mismos.

17. Un kit que comprende componentes precursores en forma estéril separada de una formulación para el suministro asistido por ultrasonidos de una sustancia biológicamente activa a un sitio diana seleccionado en el organismo de un paciente, comprendiendo dicha formulación los siguientes componentes:

a) vesículas de liposomas que encapsulan dentro de la fase acuosa de su núcleo una sustancia biológicamente activa; y

b) microesferas llenas de gas fisiológicamente aceptable o aire;

proporcionando dichos componentes precursores dicha formulación una vez mezclados.

18. Un kit de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende:

a) una suspensión de liposomas que tiene sustancias bioactivas encapsuladas en ellos;

b) una suspensión de microesferas que contienen gas fisiológicamente aceptable o aire en un líquido portador.

19. Un kit de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende:

a) un polvo de liposomas secos que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos en forma estabilizada;

b) una suspensión de microesferas llenas de gas fisiológicamente aceptable o aire en un líquido portador.

20. Un kit de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende:

a) liposomas secos que tienen sustancias bioactivas encapsuladas en ellos en forma de polvo estabilizado;

b) microbalones llenos de gas en forma de polvo seco o precursores de microburbujas como fosfolípidos saturados pulverulentos estratificados almacenados en contacto con aire o un gas fisiológicamente aceptable y, opcionalmente, estabilizadores hidrosolubles; y

c) un líquido portador acuoso administrable.

21. Un kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el cual las vesículas de liposomas y las microesferas llenas de aire o gas están organizadas de modo que tengan afinidad unas por otras.

22. El kit de la reivindicación 21, en el cual las vesículas de liposomas y las microesferas están provistas cada una con los componentes respectivos de un par conjugado.

23. El kit de la reivindicación 21 en el cual las vesículas de liposomas y las microesferas están provistas cada una con sistemas de acoplamiento que implican donantes y receptores.

24. El kit de la reivindicación 23, en el cual tanto las vesículas de liposomas como las microesferas están provistas con un elemento acoplador donante, comprendiendo el kit adicionalmente un elemento aceptor de multisitios, con lo cual donante y aceptor llegarán a conjugarse y las vesículas de liposomas y las microesferas se ponen en contacto unas con otras.

25. El kit de las reivindicaciones 23 ó 24, en el cual los sistemas de acoplamiento que implican donantes y receptores se seleccionan del grupo constituido por anfetaminas, barbituratos, sulfonamidas, sustratos inhibidores de las monoamino-oxidasas, hormonas, enzimas, lípidos, ligandos específicos de membranas celulares, agentes antihipertensivos, neuro-transmisores, aminoácidos, oligopéptidos, radio-sensibilizadores, esteroides, anticuerpos mono- y policlonales así como fragmentos de los mismos, carbohidratos, ácidos grasos, receptores y sustratos muscarínicos, receptores y sustratos de dopamina, biotina, péptidos y proteínas capaces de fijarse a receptores específicos, receptores y sustratos de benzodiazepina.

26. El kit de la reivindicación 25, en el cual está presente un antígeno en la membrana de los liposomas y un anticuerpo de las microesferas, o viceversa, de tal modo que la conjugación antígeno-anticuerpo hará que las vesículas de liposomas y las microesferas se pongan en contacto unas con otras.

27. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26, en el cual los liposomas están hechos de lípidos y/o fosfolípidos naturales o sintéticos seleccionados de fosfatidil-colina hidrogenada (HSPC), lisofosfato, ácido fosfatídico, fosfatidil-glicerol, fosfatidil-colina, fosfatidil-serina, fosfatidil-etanol-amina, colesterol y sus derivados homólogos.

28. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 en el cual las microesferas son microburbujas limitadas por una interfase líquido/gas estabilizada por compuestos anfipáticos contra el colapso prematuro.

\newpage

29. El kit de la reivindicación 28 en el cual dichos compuestos anfipáticos son fosfolípidos, preferiblemente fosfolípidos saturados.

30. El kit de la reivindicación 29 en el cual los fosfolípidos se seleccionan de fosfolípidos neutros tales como fosfatidil-colina hidrogenada (HSPC), dipalmitoil-, diestearoil- y diaraquidoil-fosfatidilcolina (DPPC, DSPC, DAPC); fosfolípidos cargados negativamente tales como ácido dipalmitoil- y diestearoil-fosfatídico (DPPA, DSPA), dipalmitoil- y diestearoil-fosfatidilserina (DPPS, DSPS), dipalmitoil- y diestearoil-fosfatidilglicerol (DPPG, DSPG); fosfolípidos reactivos tales como derivados de fosfatidil-etanolamina acoplados a un polietilenglicol, una biotinil-, una glutaril-, una caproil- o una succinil-amina.

31. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, en el cual las microesferas son microbalones limitados por una membrana tangible.

32. El kit de la reivindicación 31, en el cual la membrana de los microbalones está hecha de un polímero natural o sintético.

33. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 32, en el cual el gas en las microesferas se selecciona de SF_{6}, CF_{4}, C_{2}F_{6}, C_{3}F_{6}, C_{3}F_{8}, C_{4}F_{6}, C_{4}F_{8}, C_{4}F_{10}, C_{5}F_{10}, C_{5}F_{12}, C_{6}F_{14}, aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, gases nobles, y mezclas de los mismos.

34. El uso del kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 33 para la fabricación de un medicamento para uso en tratamiento terapéutico o génico.

35. Un método de fabricación de una formulación para el suministro asistido por ultrasonidos de una sustancia biológicamente activa a un sitio diana seleccionado en el organismo de un paciente por utilización de un kit de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 33.

36. Un proceso para preparar una formulación para el suministro asistido por ultrasonidos de una sustancia biológicamente activa a un sitio diana seleccionado en el organismo de un paciente, comprendiendo dicha formulación, como una suspensión en un líquido portador:

comprendiendo dicho proceso los pasos de:

i) preparar individualmente dichas microesferas y dichas vesículas de liposomas; y

ii) mezclar dichas microesferas con dichas vesículas de liposomas sea antes de la administración a los pacientes o en el momento de la administración.

37. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 36 para preparación de una formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

38. Uso de la formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para la fabricación de un medicamento para uso en tratamiento terapéutico o génico.