ES2237119T3 - Procedimientos para inhibir helicobacter pylori. - Google Patents
Procedimientos para inhibir helicobacter pylori.Info
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Abstract
Un procedimiento in vitro para identificar una molécula capaz de inhibir in vivo el crecimiento o la supervivencia de Helicobacter, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un Helicobacter parental con dicha molécula en una muestra biológica; (b) probar y comparar la respuesta al pH extracelular y la sensibilidad a la acidez de la cepa parental con una cepa deficiente en UreI y/o de una cepa deficiente en UreI complementada con un plásmido portador de ureI en presencia o ausencia de dicha molécula activa; y (c) seleccionar dicha molécula que exhiba un efecto diferencial sobre la cepa parental o la cepa complementada en comparación con la cepa deficiente en UreI.
Description
Procedimientos para inhibir Helicobacter
pylori.
Esta invención se refiere a procedimientos para
seleccionar moléculas capaces de inhibir in vivo la
supervivencia de Helicobacter, en particular de
Helicobacter pylori, mediante la inhibición específica de la
actividad de UreI, a las moléculas identificadas por estos
procedimientos y al uso de estas moléculas para tratar o prevenir
la infección por Helicobacter.
Helicobacter pylori es una bacteria
gramnegativa microaerófila que coloniza la mucosa gástrica de seres
humanos (10). H. pylori se asocia con gastritis y la
enfermedad de úlcera péptica y se ha mostrado que incrementa el
riesgo de cáncer gástrico. La ureasa es un factor de virulencia
importante de H. pylori. Está implicada en la neutralización
del microambiente ácido de la bacteria y también desempeña un papel
en el metabolismo de H. pylori (11, 26).
La región ureasa del genoma de H. pylori
está compuesto por dos grupos de genes comunes para todas las cepas
(9 y figura 1), donde uno comprende los genes ureAB que
codifican las subunidades estructurales de la ureasa y el otro
contiene los genes ure-EFGH que codifican las
proteínas accesorias requeridas para la incorporación de níquel en
el sitio activo de la ureasa. El gen ureI se encuentra en posición
directamente en 5' de este último grupo génico y se transcribe en
la misma dirección (figura 1). Los genes ureA, ureB, ureE, ureF,
ureG, ureH y ureI y los productos génicos se han
descrito y reivindicado en la patente de EE.UU. 5.695.931 y se ha
permitido la solicitud de patente de número de serie
08/472.285.
Las distancias que separan ureI del
ureE (un par de bases, pb) y ureE de ureF (11
pb) sugieren que
ureI-ureE-ureF constituyen un
operón. La cotranscripción de ureI y ureE se ha
demostrado mediante análisis por transferencia Northern (1).
Anteriormente, Ferrero y col. (1994) habían descrito un mutante N6
de H. pylori con un gen ureI alterado mediante un
trasposón MiniTn3-Km (13). Esta cepa
(N6-ureI::TnKm-8) presentaba un
fenotipo ureasa negativo, de forma que se concluyó que ureI
era un gen accesorio requerido para la actividad ureasa
completa.
Las secuencias de UreI de H. pylori
y las proteínas AmiS, codificadas por los operones de amidasa
alifática de Pseudomonas aeruginosa y Rhodococcus sp.
R312, son similares (5, 27). Las amidasas alifáticas catalizan la
hidrólisis intracelular de amidas alifáticas de cadena corta para
producir el correspondiente ácido orgánico y amoniaco. Se ha
mostrado que H. pylori también posee tal amidasa alifática,
que hidroliza la acetamida y la propionamida in vitro
(23).
En vista de la similitud entre las secuencias de
UreI y AmiS junto con las muy parecidas estructuras
de los sustratos de ureasa y amidasa (urea:
NH_{2}-CO-NH_{2} y acetamida:
CH_{3}-CO-NH_{2}) y la
producción de amoniaco por ambas enzimas, se requiere una mejor
comprensión de la función de la proteína UreI de H.
pylori. Esta comprensión abrirá nuevas oportunidades para la
prevención y el tratamiento de las infecciones producidas por H.
pylori.
Esta invención proporciona procedimientos para
identificar moléculas capaces de inhibir in vivo el
crecimiento y/o la supervivencia de las especies de
Helicobacter, en particular H. pylori. En particular,
los procedimientos de esta invención implican la selección de
moléculas que inhiban de forma específica la función de la proteína
UreI.
La invención abarca las moléculas identificadas
mediante los procedimientos de esta invención y el uso de las
moléculas mediante los procedimientos de esta invención para tratar
o prevenir la infección en seres humanos y animales producida por
Helicobacter y, en particular, por H. pylori.
Otro aspecto de esta invención es un
procedimiento para prevenir o tratar la infección producida por
especies de Helicobacter mediante la administración a un ser
humano o un animal que necesite tal tratamiento de una molécula
capaz de inhibir in vivo el crecimiento y/o la supervivencia
de las especies de Helicobacter. Una de tales moléculas
según la invención se caracteriza por una elevada afinidad por
UreI, lo que permite (i) su transporte al interior de la
célula de Helicobacter o (ii) inhibir las propiedades de
transporte de UreI o (iii) inhibir la función de UreI
mediante la inhibición de la interacción de UreI con la ureasa u
otras proteínas de Helicobacter. Mediante la inhibición de
UreI, tal molécula hace que las bacterias sean más sensibles a la
acidez.
Otro aspecto más de esta invención es la
producción de antígenos inmunogénicos de UreI y su uso como vacunas
para prevenir la infección producida por especies de
Helicobacter y/o la colonización del estómago o el
intestino. Los antibióticos contra estos antígenos de UreI también
entran dentro del alcance de esta invención.
Esta invención además se refiere a cepas
recombinantes de H. pylori, que comprenden un gen modificado
de ureI, de forma tal que los productos del gen modificado
contribuyen a la atenuación de la capacidad de las bacterias para
sobrevivir in vivo y, por tanto, de sus efectos
patogénicos.
La figura 1 representa el grupo del gen de la
ureasa de las cepas parentales de H. pylori N6 y SS1 y de
los mutantes derivados deficientes en UreI, las cepas
N6-823, N6-834 y SS
1-834. Los genes están indicados por cuadros con
una flecha que muestra la dirección de su transcripción. Las
distancias entre los genes ure se dan en pares de bases, pb.
Se muestra el lugar de hibridación con los cebadores usado para
confirmar el correcto intercambio de alelos en las cepas
N6-823, N6-834 y
SS1-834. Los cuadros vacíos representan los casetes
que contienen los genes que confieren resistencia a Cm (cat) o a Km
(aphA-3). La actividad ureasa de estas cepas
se indica a la derecha en la figura. La actividad ureasa se midió
como la liberación de amoniaco en extractos brutos de bacterias
cultivadas durante 48 horas en placas con agar sangre, como se ha
descrito anteriormente (9). Una unidad corresponde a la cantidad de
enzima requerida para hidrolizar 1 \mumol de urea min^{-1}
mg^{-1} de proteína total. Los datos se proporcionan en la media
\pm desviación estándar, calculadas en 3-5
determinaciones.
La figura 2A representa un mapa de restricción de
pILL823, pILL824, pILL833 y pILL834. Los cuadros pequeños marcan el
vector de cada plásmido y los cuadros grandes corresponden a los
genes. Ori indica la posición del origen de replicación CoIE
1. Sp^{R} y Ap^{R} son los genes que confieren
resistencia a la espectinomicina y a la ampicilina,
respectivamente. También se muestran los casetes insertados en
ureI y que confieren resistencia a cloranfenicol
(cat) o a kanamicina (aphA-3). Se da
la secuencia de la región de ADN que comprende el codón de
terminación de ureI y el codón de iniciación de ureE,
incluido el sitio Bc/I en el que se insertó el adaptador H19. La
inserción de H19 en el sitio Bc/I del pILL824 produjo pILL825,
también se muestra la región intergénica resultante
ureI-ureE. El codón de terminación de
ureI y el codón de iniciación de ureE se encuentran
dentro de cuadros y el sitio de unión del ribosoma (RBS) está
subrayado. Los paréntesis indican la posición de los sitios de
restricción eliminados mediante ligación.
La figura 2B representa un mapa de restricción de
dos plásmidos lanzadera de H. pylori/E. coli:
- pILL845 y pILL850. Los cuadros pequeños marcan el vector de cada plásmido y los cuadros grandes corresponden a los genes.
- Ori indica la posición del origen de replicación CoIE1 de E. coli y repA el gen que codifica la proteína RepA necesaria para la replicación autónoma del pHe12 en H. pylori.
- Cm^{P} señala el gen que confiere resistencia a cloranfenicol. El promotor ureI se representa por una "P" con una flecha que indica la dirección de la transcripción. Los otros símbolos son como en la figura 1.
La figura 3 muestra la alineación de la secuencia
de aminoácidos de UreI de H. pylori con las de proteínas
similares y la predicción de la estructura bidimensional de
miembros de la familia de proteínas UreI/AmiS. En los cuadros se
indican los residuos idénticos en una posición en, al menos, cuatro
secuencias, y los guiones indican los huecos insertados para
optimizar la alineación. Los organismos de los que se originaron
las secuencias y el grado de identidad con la proteína UreI de
H. pylori son: UreI-Hp, Helicobacter
pylori (195 residuos, nº de acceso M84338);
UreI-Hf, Helicobacter felis (74% de identidad
sobre 196 residuos, nº de acceso A41012);
ureI-Lacto, Lactobacillus fermentum (55% de
identidad sobre la secuencia larga parcial de 46 residuos, nº de
acceso D10605); UreI-Strepto, Streptococcus
salivarius (54% de identidad sobre una secuencia larga parcial
de 129 residuos, nº de acceso U35248); AmiS-Myco,
Mycobacterium smegmatis (39% de identidad sobre 172
residuos, nº de acceso X57175); AmiS-Rhod,
Rhodococcus sp. R312 (37% de identidad sobre 172 residuos, nº
de acceso Z46523) y AmiS-Pseudo, Pseudomonas
aeruginosa (37% de identidad sobre 171 residuos, nº de acceso
X77161). Las hélices alfa transmembrana predichas se muestran en
los cuadros sombreados. Las regiones que separan estos cuadros son
giros hidrófilos marcados como "DENTRO", cuando se piensa que
son intracelulares, y "FUERA" cuando se piensa que son
extracelulares.
La figura 4 representa la cinética de la
liberación de amoniaco por la cepa parental N6 (panel A) y la cepa
deficiente en UreI N6-834 (panel B). Las bacterias
(2\cdot10^{8}/ml) se recogieron y se lavaron (como describen
Skouloubris y col., (30)), se resuspendieron en 10 ml de suero
salino tamponado con fosfato (PBS) a pH 7, 5 ó 2,2 en presencia de
urea 10 mM. Después de 0, 3, 5 y 30 minutos, se extrajeron 0,5 ml y
se centrifugaron para eliminar las bacterias. El sobrenadante se
mantuvo en hielo hasta que se midió la concentración de amoniaco
mediante el ensayo comercializado por Sigma (kit con referencia nº
171).
La tabla 2 muestra los resultados obtenidos con
las pruebas de viabilidad in vitro y las mediciones del
pH.
La tabla 3 proporciona los valores de producción
de amoniaco por las cepas N6 y N6-834 presentados
en los gráficos de la Figura 4.
El grupo de la ureasa de las especies de
Helicobacter es único entre los muchos operones de ureasa de
bacterias gramnegativas que se han secuenciado (20) en que poseen
un gen adicional, ureI. De este modo, la función del UreI ha
sido objeto de muchas especulaciones. Principalmente se le ha
atribuido la función de una proteína accesoria requerida para la
incorporación de níquel en el sitio activo de la ureasa o de un
transportador de níquel. Se ha construido una cepa de H.
pylori con una deleción de ureI sustituido por un casete
apolar (casete de resistencia a kanamicina) y se denominó
N6-834 (30). La cepa se ha depositado en el C.N.C.M.
(Colección Nacional de Cultivos de microorganismos, 25 rue du
Docteur Roux, 75724 París Cédex 15, Francia) el 28 de junio de
1999. Esta es la primera vez que se ha mostrado que un casete
apolar (19) es funcional en H. pylori. Estos resultados
proporcionan una valiosa herramienta para el análisis genético de
los complejos operones de H. pylori, tales como Cag, una isla
multigénica de patogenicidad.
Mediante estudios con esta cepa se demostró que
no se requiere UreI para la completa actividad de la ureasa de
H. pylori, medida tras el crecimiento in vitro a pH
neutro. Este resultado es contrario a la implicación de UreI en el
transporte de níquel, ya que tal proteína NixA (3), ya identificada
en H. pylori, es necesaria para una completa actividad
ureasa. Al comparar las ureasas expresadas en una cepa deficiente
en UreI y la correspondiente cepa parental se muestra que (i)
presentan el mismo pH óptimo de actividad (pH 8), (ii) las
subunidades estructurales de ureasa, UreA-B, se
producen en cantidades iguales y (iii) la localización de la ureasa
en la célula es idéntica.
En el presente documento se ha demostrado que (i)
UreI es esencial para la colonización en ratones por H.
pylori, (ii) UreI es importante para la supervivencia de H.
pylori a pH ácido y (iii) UreI es necesario para la
"activación" de la ureasa a pH bajo.
Durante el proceso de colonización del estómago
H. pylori tiene que tratar con importantes variaciones de pH
y en especial se tiene que adaptar con rapidez a pH extremadamente
ácidos (un pH tan ácido como 1,4). Los inventores han mostrado que
para la adaptación de H. pylori a la acidez se requiere
UreI, algo consistente con la ausencia de colonización en el
estómago de ratón. Como proteína esencial para la resistencia de
H. pylori a la acidez, UreI ciertamente desempeña un papel
clave en la infección, establecimiento y persistencia de H
pylori. UreI posee una secuencia similar a las de las proteínas
AmiS, de la que se ha propuesto que está implicada en el transporte
de amidas de cadena corta (27), moléculas de estructura similar a la
de la urea. Las proteínas UreI/AmiS poseen las características de
proteínas integrales de membrana, probablemente de la membrana
citoplasmática.
Se pueden proponer diferentes papeles para UreI.
Por ejemplo, UreI podría estar implicado en el transporte (importe
o exporte) de urea o de amidas de cadena corta activas
específicamente a pH bajo. Sin embargo, es menos probable que UreI
desempeñe un papel esencial como transportador de amidas, ya que un
mutante SS1, deficiente en amidasa alifática, coloniza de un modo
tan eficaz como la cepa parental en los experimentos de colonización
en ratones. Además, la actividad amidasa no se ve
significativamente modificada por la deleción de ureI en la
cepa mutante N6-834 (C.N.C.M., presentada el 28 de
junio de 1999). El importe o exporte de urea podría ser consistente
con la existencia de un ciclo de urea, que es una de las
características de H. pylori (28).
Por otra parte, UreI podría estar implicado en un
sistema activo de exporte de amoniaco. Por último, UreI podría
estar implicado en un mecanismo de acoplamiento de la actividad
ureasa con el pH periplasmático, lo que permite que la ureasa se
convierta en más activa cuando el pH celular sea ácido.
Los resultados de los inventores son compatibles
con la primera hipótesis de UreI como un transportador de urea
activo a valores de pH ácido y con la tercera hipótesis de UreI
como un tipo de proteína sensora entre el pH periplasmático y la
actividad ureasa. Los inventores piensan que estas dos hipótesis no
son excluyentes. Cualquiera que sea el papel de UreI, como proteína
de membrana esencial para la supervivencia de H. pylori in
vivo, en la actualidad proporciona un potente objetivo para un
nuevo tratamiento de erradicación y para el desarrollo de vacunas
contra H. pylori.
Se pueden identificar moléculas capaces de
inhibir in vivo el crecimiento y/o la supervivencia de
Helicobacter mediante el contacto de una cepa parental de
Helicobacter con dicha molécula en una muestra biológica;
probar y comparar, en presencia o ausencia de urea, la sensibilidad
al pH extracelular de la cepa parental con una cepa deficiente en
UreI y con una cepa deficiente en UreI complementada con
ureI; la selección de dichas moléculas que exhiban un efecto
diferencial sobre la cepa parental o complementada en comparación
con la cepa deficiente en UreI; y la recolección de dicha molécula
activa.
Una molécula activa de forma específica en UreI
será aquélla que convierta a H. pylori en sensible a pH
ácido (pH 2,2) en presencia de urea sin que afecte al
comportamiento de la cepa a pH neutro. La sensibilidad a la acidez
en presencia de urea se puede comprobar en células enteras de H.
pylori según un protocolo descrito en los ejemplos y adaptado de
Clyne y col. (8). En la actualidad, los inventores están intentando
adaptar esta prueba en células enteras de E. coli que porten
el grupo completo del gen de la ureasa en un plásmido
(ureAB-ureIEFGH). La selección de una
molécula que convierta a esta E. coli recombinante en más
sensible a la acidez en presencia de urea se llevará a cabo como se
ha descrito para H. pylori en los ejemplos. Para distinguir
entre moléculas inhibidoras que actúan sobre UreI y aquéllas que
actúen sobre ureasa se medirá el pH del medio tras incubación de
células enteras a pH 7 en presencia de urea. Las moléculas
interesantes son aquéllas que afectan a la respuesta a la acidez
sin que inhiban la alcalización del medio observada después de la
incubación a pH neutro.
Estos procedimientos se pueden usar para
identificar moléculas que inhiban cualquier especie de
Helicobacter que porte un homólogo de UreI. Esto incluye las
especies gástricas de Helicobacter. Helicobacter pylori,
Helicobacter felis, Helicobacter mustelae, Helicobacter
muridarum y también Helicobater heilmannii, Helicobacter
canis, Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus y
Helicobacter troguntum.
Las moléculas identificadas mediante los
procedimientos de esta invención serán capaces de inhibir la
actividad de UreI mediante (i) la inhibición del transporte de urea
o de amidas de cadena corta, (ii) la inhibición del exporte del
amoniaco o (iii) la inhibición de la "activación" de ureasa a
pH bajo. Las moléculas de acuerdo con los puntos (i) y (ii) deberían
ser capaces de difundirse a través de la membrana externa y
deberían ser activas incluso a concentraciones bajas. Las moléculas
candidatas adecuadas son análogos estructurales de la urea o de
amidas de cadena corta, derivados de amoniaco o inhibidores de
ureasa. Por ejemplo, las moléculas derivadas de AHA (ácido
acetohidroxámico), hidroxiurea, ácido hipúrico, flurofamida,
hidroxilamina, metilurea, tiourea (29) o metilamonio. Las moléculas
de acuerdo con el punto (iii) deberían inhibir el contacto entre
UreI (probablemente insertado en la membrana citoplasmática) y las
proteínas de H. pylori periplasmáticas, de membrana o
citoplasmáticas, que son necesarias para la "activación" de la
ureasa a pH bajo. Estas proteínas podrían ser subunidades
estructurales de la propia ureasa, las proteínas accesorias u otras
proteínas. Las moléculas obtenidas según esta invención no deberían
ser inhibidores competitivos de la ureasa, no deberían ser tóxicas
o mutagénicas in vivo y podrían potenciar la acción de
antibióticos o de moléculas bactericidas. La validación de la acción
de tales moléculas podría realizarse in vivo en el modelo
animal con ratones con el par de cepas isogénicas SS1 y
SS1-834 como se ha descrito en los ejemplos.
Un ejemplo de una molécula de acuerdo con esta
invención es un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para
UreI. Preferentemente, el anticuerpo es capaz de inhibir de forma
específica la actividad UreI.
Las moléculas de esta invención se pueden
administrar en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable a un paciente con una infección producida por
Helicobacter. Por otra parte, las composiciones
inmunogénicas que comprenden una o más moléculas según esta
invención se pueden administrar en una composición de vacunas para
prevenir la infección por especies de Helicobacter.
Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con
esta invención también pueden comprender toda o parte de la
proteína UreI. Preferentemente, los fragmentos de UreI comprenden al
menos 10 aminoácidos consecutivos de la secuencia nativa de UreI y,
más preferentemente, los fragmentos comprenden al menos 18, 20 ó 25
aminoácidos consecutivos de la secuencia nativa de UreI. Otros
fragmentos de UreI adecuados pueden contener al menos 40 o al menos
100 aminoácidos consecutivos de la secuencia nativa de UreI. Entre
los fragmentos adecuados de Helicobacter pylori se incluyen,
por ejemplo, fragmentos seleccionados del grupo compuesto por los
residuos aminoacidicos 22 a 31, 49 a 74, 94 a 104 y 123 a 142 de
H. pylori (GenBank, número de acceso M84338).
Ahora se hará referencia a los siguientes
ejemplos. Los ejemplos son meramente ejemplificantes de la
invención y no deben interpretarse como limitantes de la
invención.
Mediante intercambio de alelos se generaron cepas
de H. pylori con mutaciones definidas en ureI, para
determinar si la proteína UreI era necesaria para la producción de
ureasa activa. Para este propósito se construyeron en E.
coli dos plásmidos (pILL823 y pILL834) con casetes que portaban
genes de resistencia a antibióticos insertados en ureI.
En un plásmido, pILL823 (figura 2A), se inactivó
el gen ureI mediante inserción de un gen cat sin
promotor, que confiere resistencia al cloranfenicol (Cm). Un
fragmento de restricción BamHI de extremos romos de 780 pb
que contenía el "cartucho cat" de pCM4 (Pharmacia, Suecia) se
introdujo en un sitio único HpaI, entre los codones 21 y 22
de ureI, en pILL753 (9). En el plásmido resultante, pILL823
(figura 2A), cat se encuentra en la misma orientación que
ureI y se expresa bajo el control del promotor de
ureI.
El segundo plásmido, pILL834, portaba un gen
ureI en el que se habían delecionado todos excepto los
primeros 21 codones y se habían sustituido con un casete apolar
compuesto por el gen de resistencia a kanamicina
aphA-3 (Km) (25), que se ha delecionado de
sus propias regiones promotora y terminadora (19). En Shigella
flexneri (19) y otros organismos (tales como Yersinia
enterocolitica, 2), se ha mostrado que este casete no afecta a
la transcripción de los genes en 3' en un operón, siempre que estos
genes distales posean intactas las señales de traducción. Sólo hay
un par de bases de separación entre ureI y ureE
(figura 1) y ureE no posee un RBS (sitio de unión al
ribosoma) propio, de forma que la expresión de ureI y
ureE está acoplada a nivel transcripcional y traduccional.
Por tanto, una deleción en ureI se acompañó con la adición
de un RBS directamente en 5' de ureE. Se construyeron tres
intermediarios, pILL824, pILL825 y pILL833 (figura 2A), con el fin
de producir el plásmido final, pILL834 (figura 2A). Se insertó un
fragmento de restricción HpaI-HindIII de 1,8 Kb de
pILL753 (9) entre los sitios EcoRV y HindIII de
pBR322, para dar pILL824. La inserción del adaptador H19 (que porta
un RBS y ATG en fase con ureE, tabla 1) en un sitio Bc/I en
superposición con los dos primeros codones de ureE en
pILL824, produjo pILL825 (figura 2A). A continuación se sustituyó el
fragmento BamHI de pILL825 con un fragmento de extremos
romos de 1,3 Kb PvuII-BamHI de pILL753. Esto dio como
resultado la reconstitución de un gen ureI completo, este
plásmido se denominó pILL833. Por último, pILL834 se obtuvo mediante
sustitución del fragmento HpaI-Bg/I de pILL833
(delecionando de este modo todos excepto los 21 primeros codones de
ureI) con un fragmento EcoRI-BamHI de extremos
romos de 850 pb de pUC18K2 que contiene el casete apolar Km
(19).
Los mutantes de ureI de H. pylori
se produjeron mediante intercambio de alelos tras electroporación
con una preparación concentrada de pILL823 y pILL834, como
anteriormente han descrito Skoloubris y col. (23) de la cepa N6 de
H. pylori (12) y de la cepa SS1 adaptada para ratones de
H. pylori (Cepa Sydney, 17). Las bacterias con intercambio
de alelos cromosómicos con pILL823 se seleccionaron en Cm (4
\mug/ml) y aquéllos con intercambio de alelos cromosómicos con
pILL834 en Km (20 \mug/ml). Se determinó que el intercambio de
alelos deseado había tenido lugar en las cepas
N6-823, N6-834 y
SS1-834 (figura 1) mediante PCR con los
oligonucleótidos adecuados (tabla 1). Los productos de PCR
obtenidos con ADN genómico de estas cepas fueron como cabía esperar
(i) para la capa N6-823: 140 pb con los cebadores
H28-H34, 220 pb con H35-9B y 1,2 kb
con H28-9B, e (ii) para las capas
N6-834 y SS1-834, 150 pb con los
cebadores H28-H50, 180 pb con
H17-12B y 1 kb con H28-12B.
La tasa de crecimiento de la cepa
N6-834 con una deleción apolar de ureI se
comparó con la de la cepa parental N6. No se observaron diferencias
en el tamaño de las colonias en placas con medio agar sangre. Se
midieron tiempos de multiplicación por duplicados idénticos y la DO
de la fase estacionaria para ambas cepas cultivadas en medio
líquido BHI (Oxoid) con 0-2% de
beta-ciclodextrina (Sigma). Por tanto, UreI no es
esencial para el crecimiento de H. pylori in vitro.
La actividad ureasa de las cepas
N6-823, N6-834 y
SS1-834 se midió in vitro como describieron
anteriormente Cussac y col. (9) y se comparó con la actividad de las
cepas parentales, N6 y SS1 (figura 1). La actividad ureasa estaba
casi por completo abolida en la cepa N6-823 (0,3
\pm 0,1 unidades). Las capas N6-834 y
SS1-834, con mutaciones apolares en ureI
poseían niveles de actividad similares a los de la cepa natural
(N6-834 y SS1-834: 12 \pm 2
unidades; cepas parentales, N6: 10 \pm 1 y SS1: 12 \pm 0,4
unidades).
Se midió y comparó el pH óptimo de la ureasa
producida por la capa parental N6 o por la cepa deficiente en UreI
N6-834. Para ambas cepas, la ureasa posee un pH
óptimo de 8, que es consistente con los datos publicados.
Estos resultados sugieren firmemente que el
fenotipo negativo para ureasa de
N6-ureI::TnKm-8 (13) y la actividad ureasa
muy débil de las cepas N6-823 se debían a un efecto
polar de los casetes insertados sobre la expresión de los genes en
3' ureE y ureF (figura 1). Esta hipótesis se comprobó
mediante la medición de la actividad ureasa de la capa
N6-823 complementada en trans con un plásmido
lanzadera E. col/H. pylori que exprese los genes
ureE-F. Este plásmido, pILL845 (figura 2B),
se obtuvo mediante inserción de un fragmento
ClaI-BamHI de 2,8 kb de pILL834 (que comprende el
extremo 3' de ureB, la deleción apolar de ureI y los
genes intactos de ureE y ureF) en los sitios
correspondientes del vector lanzadera pHel2 construido por
Heuermann y Haas (15). Se realizó la electroporación de la cepa
N6-823 con una preparación de ADN de pILL845 como
describieron Skouloubris y col. (23) y los transformantes se
seleccionaron en kanamicina (20 \mug/ml) y cloranfenicol (4
\mug/ml). En la cepa N6-823 con el pILL845 se
recuperó la actividad ureasa natural, lo que confirmó que la
actividad ureasa muy baja de la cepa N6-823 se
debía a un efecto polar sobre la expresión de los genes accesorios
ureE-F. En Klebsiella aerogenes, la
ausencia de UreE tiene poco efecto sobre la actividad ureasa (4). En
contraste con ello, UreF, como parte del complejo proteico
accesorio (UreDFG), es absolutamente necesario para la producción
de ureasa activa (21). Por tanto, por analogía, es muy probable que
el fenotipo de los mutantes polares de ureI de H.
pylori se debiera a la ausencia de expresión de
ureF.
Las subunidades estructurales de la ureasa, UreA
y UreB, producidas por la cepa N6 o la cepa N6-834
se compararon con la técnica de inmunotransferencia usando una
mezcla de antisuero dirigida contra cada subunidad de la ureasa. Se
observó que la cantidad de cada subunidad producida por las dos
cepas era idéntica. La posibilidad de que la localización en la
células de la ureasa podría verse afectada por la ausencia de UreI
se estudió después del fraccionamiento celular (separación de las
proteínas solubles de las proteínas asociadas a membrana y del
sobrenadante) de las cepas N6 y N6-834. Estos
experimentos no revelaron ninguna diferencia entre la localización
en la célula de la ureasa en la cepa natural o en el mutante
deficiente en UreI. Estos resultados demostraron que, a pH neutro,
UreI no está implicado en la estabilización de las subunidades
estructurales de la ureasa ni en un procedimiento de ureasa dirigido
contra un compartimento celular específico.
El modelo animal con ratones para la infección
por la cepa SS1 de H. pylori (cepa Sydney, 17), validado por
Chevalier y col. (7) y Ferrero y col (14), se usó para comprobar la
función de UreI in vivo. Se infectó a los ratones con el
mutante apolar de ureI, SS1-834, y con la
cepa parental, SS1, (que se había sometido a un número equivalente
de subcultivos in vitro) como control positivo. Este
experimento se repitió tres veces y produjo resultados idénticos
(30). Se usaron dos mutantes SS1-834 construidos por
separado. La primera cepa mutante se había sometido a 30
subcultivos in vitro, la segunda sólo a 20. En las mismas
condiciones experimentales, la cepa SS1 puede someterse a más de 80
subcultivos in vitro sin perder su capacidad de
colonización.
En cada experimento, se administró a 10 ratones
(ratones Swiss específicos sin patógenos de seis a ocho semanas de
edad), por vía orogástrica, alícuotas (100 \mul) que contenían
10^{6} bacterias de las cepas SS1 o SS1-834 de
H. pylori preparadas en caldo de peptona, como describieron
Ferrero y col (14). Se sacrificó a los ratones cuatro semanas
después de la inoculación. La presencia de H. pylori se
comprobó con una prueba directa de ureasa en biopsias realizadas en
la mitad del estómago (14). El resto de los tejidos gástricos se
usaron para el cultivo cuantitativo de H. pylori, según lo
descrito por Ferrero y col. (14). En cada experimento, los estómagos
de 10 ratones infectados con SS1 dieron positivo en la prueba de la
ureasa. La carga de bacterias era de entre 5\cdot10^{4} y
5\cdot10^{5} unidades formadoras de colonias (UFC) por g de
estómago. Ninguno de los estómagos de los ratones infectados con la
cepa SS1-834 dio positivo para la ureasa y de ellos
no se cultivaron células de H. pylori. Por tanto, la
proteína UreI es esencial para la supervivencia y/o colonización
in vivo por H. pylori del estómago de ratones.
La supervivencia en condiciones ácidas en
presencia o ausencia de urea 10 mM se comprobó con las cepas N6 y
N6-834. Los procedimientos detallados en
Skouloubris y col. (39) se basaron en los descritos por Clyne
y col. (8). Se recogieron bacterias en crecimiento
exponencial, se lavaron en PBS (suero salino tamponado con fosfato)
y aproximadamente 2\cdot10^{8} UFC/ml se resuspendieron en PBS
de pH 2,2 o pH 7 en presencia o ausencia de urea 10 mM y se
incubaron a 37ºC. Después de una hora de incubación (i) se llevaron
a cabo cultivos cuantitativos de las cepas de H. pylori para
evaluar la supervivencia de las bacterias y (ii) las bacterias se
centrifugaron y se midió el pH del medio. Los resultados obtenidos
se presentan en la tabla 2. En ausencia de urea ambas cepas, N6 y
N6-834, presentaron fenotipos idénticos, es decir,
morían a pH 2,2, y sobrevivían a pH 7 sin modificar el pH final del
medio (tabla 2). Tras la incubación a pH 7 en presencia de urea,
ambas cepas morían porque el pH final aumentó hasta pH 9. A pH 2,2
en presencia de urea, la cepa parental sobrevivió bien, ya que fue
capaz de aumentar el pH hasta la neutralidad. Por el contrario, se
obtuvo un fenotipo completamente diferente con la cepa deficiente
en ureI N6-384, que fue incapaz de elevar el pH y
cuya viabilidad se vio gravemente afectada (tabla 2).
La implicación directa de la proteína UreI en la
capacidad de H. pylori para resistir la acidez se ha
confirmado mediante transcomplementación con el plásmido pILL850
(figura 2B, mapa de restricción y detalles de la construcción).
Este plásmido [CNCM 1-2245, presentado el 28 de
junio de 1999] deriva del vector lanzadera de H. pylori/E.
coli a pH 12 (15). El plásmido pILL850 porta el gen ureI
bajo el control de su propio promotor y se construyó de la siguiente
manera: un fragmento de restricción Bc/I de 1,2 kb del plásmido
pILL753 (9) se introdujo entre los sitios de restricción
BamHI y Bc/I de pHeI2 (figura 2B). Las cepas N6 y
N6-834 se transformaron con este plásmido y se
estudió el fenotipo de las cepas complementadas en experimentos de
pruebas de sensibilidad a la acidez descritas anteriormente. Como
se muestra en la tabla 2, el fenotipo de la cepa
N6-834 complementada con pILL850 es idéntico al de
la cepa parental N6. Es interesante el hecho de que se ha
descubierto que la actividad ureasa de las cepas complementadas
(medidas en extractos sonicados, como se ha descrito en Skouloubris
y col. (30)) es significativamente mayor en comparación con
las cepas correspondientes sin pILL850. Con el propósito del
depósito en el CNCM, pILL80 se introduce en una cepa de E.
coli, MC1061 (Wertman KF. y col., 1986, Gene 49:
253-262).
La cantidad de amoniaco producido en el medio
extracelular de células enteras de H. pylori se midió
mediante un ensayo enzimático comercializado por Sigma, según las
instrucciones del proveedor. Estos experimentos se realizaron tras
la incubación de las células en PBS a diferentes valores de pH y
después de distintos tiempos de incubación. Tales experimentos
proporcionaron una evaluación precisa de la producción y excreción
de amoniaco en distintas cepas, así como una medida de la cinética
de esta reacción. En un experimento control se mostró que la
producción de amoniaco era muy baja (10-20 \muM)
en ausencia de urea.
La figura 4 representa la cinética (tiempos de
incubación 0, 3, 5 y 30 minutos) de amoniaco extracelular liberado
por la cepa parental N6 (panel A) y por la cepa deficiente en UreI
N6-834 (panel B) incubadas en PBS a pH 2,2, pH 5 o
pH 7 en presencia de urea 10 mM. Los resultados obtenidos indican
que (i) el amoniaco se produce en una gran cantidad y se libera con
rapidez al medio extracelular; e (ii) en la cepa natural N6 (figura
4, panel A y tabla 3) la producción de amoniaco se ve
significativamente aumentada cuando el pH extracelular es ácido.
Este efecto ya es visible a pH 5 e incluso es más fuerte a pH 2,2.
Esta última observación es consistente con los resultados de Scout
y col. (31), que sugirieron activación de ureasa a pH bajo.
En los experimentos de los inventores, la rapidez de la respuesta a
la acidez va en contra de la dependencia de la activación de la
ureasa de la regulación transcripcional o de la síntesis de
novo de proteínas.
A continuación se midió la producción de amoniaco
en la cepa deficiente en UreI N6-834 (figura 4,
panel B y tabla 3). A pH neutro, la cinética de la producción de
amoniaco fue similar a la de la cepa natural. En contraste con
ello, a pH 5 la producción de amoniaco se redujo y se retrasó en
comparación con la cepa natural. A pH 2,2 se observó un efecto
espectacular de la ausencia de UreI, en el que la cantidad de
amoniaco fue muy baja, lo que es consistente con los resultados de
los inventores, que muestran que UreI es necesario para la
adaptación a la acidez.
Los resultados de los inventores demuestran que
UreI es esencial para la resistencia de H. pylori a la
acidez. En ausencia de UreI, la ureasa, aunque presente en
cantidades enormes, no es capaz de proteger las bacterias contra la
agresión de la acidez. Esto es consistente con el papel esencial de
UreI in vivo. Durante su paso por el lumen ácido del
estómago, se ve afectada la viabilidad de la cepa deficiente en
UreI. Como consecuencia, la carga bacteriana es demasiado baja como
para permitir la colonización. Los diferentes papeles propuestos
para UreI se presentan en el apartado "descripción
detallada".
Se llevó a cabo una búsqueda sistemática de
homólogos de UreI en los bancos de datos de proteínas. Se determinó
que H. pylori no es la única bacteria ureolítica con un gen
ureI. Dos microorganismos grampositivos relacionados a nivel
filogenético, Streptococcus salivarus, una bacteria de la
placa dental (6), y Lactobacillus fermentum, una bacteria del
ácido láctico (16), portan los genes para homólogos de UreI (figura
3) situados directamente en 5' de los genes estructurales de la
ureasa. El gen ureI se ha detectado en varias especies de
Helicobacter, el gen ureI de H. felis se ha
secuenciado por completo (figura 3 y permitió la solicitud de
patente de EE.UU. nº de serie 08/467.822, cuyo contenido completo
se incorpora en el presente documento por referencia). Mediante
experimentos de PCR se ha sugerido que hay un gen ureI en
H. heilmannii (24) y en H. mustelae.
Se ha comunicado la existencia de similitudes en
las secuencias de la proteína UreI de H. pylori y de las
proteínas AmiS expresadas por los operones de amidasa alifática de
P. aeruginosa (27) y Rhodococcus sp. R312 (5). En
Mycobacterium smegmatis existe un homólogo a AmiS adicional
codificado por un gen, ORF P3, localizado directamente en 5' de un
gen de amidasa (18).
La alineación de estas proteínas UreI/AmiS
[usando el programa Clustal W(1.60)] definió porciones de
aminoácidos muy conservadas (figura 3). Todos estos bloques
conservados, a excepción de uno, son segmentos muy hidrófobos.
Estas regiones, cada una con una longitud de 17 a 22 residuos,
probablemente se plieguen en hélices alfa transmembranales (Figura
3). Se predijeron seis regiones transmembrana para las proteínas de
H. pylori, H. felis y P. aeruginosa y siete para las
de Rhodococcus sp. R312 y M. smegmatis (predicciones
muy fiables, realizadas con pHD, un perfil alimentó el sistema de
red neuronal como describe Rost y col. (22)). La orientación
de las proteínas UreI/AmiS en la membrana se dedujo a partir de las
cargas de las regiones hidrófilas intercaladas, que son cortas en
estas proteínas (figura 3). Las primeras cinco de estas regiones
están mal conservadas y son de varias longitudes. El último segmento
interhelical común a estas proteínas está significativamente más
conservado que los otros. Esta región, que se pensó que era
intracelular, puede ser un sitio activo de UreI o un sitio de
multimerización o interacción con un asociado intracelular. Estos
resultados sugieren totalmente que los miembros de la familia
UreI/AmiS, que se encuentran en bacterias grampositivas y
gramnegativas, son proteínas integrales de membrana. Estas
proteínas no poseen una secuencia señalizadora y, por tanto,
deberían estar insertadas en la membrana citoplasmática en las
bacterias gramnegativas.
Se sintetizaron dos péptidos, seleccionados de la
secuencia UreI, y se inyectaron en dos conejos con el fin de
obtener suero que contuviera anticuerpos policlonales dirigidos
contra UreI. Un péptido corresponde al primer giro intracelular
predicho de UreI (desde el residuo nB 15 al 31, véase la figura 3) y
el segundo corresponde al segundo giro extracelular predicho de
UreI (desde el residuo nB 118 a 134, véase la figura 3). En la
actualidad se están probando estos sueros y si se comprueba que
reconocen la proteína UreI, permitirá que los inventores definan
con precisión la localización de esta proteína y verificar la
estructura bidimensional predicha de UreI que se presenta en la
figura 3.
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgaagatctct aggacttgta ttgttatat
\hfill29
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<210> 4
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> cebador
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<400> 4
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\hfill23
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<210> 5
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<212> ADN
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<400> 5
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\hfill23
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<210> 6
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<212> ADN
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\hfill23
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\hfill20
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\hfill25
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> cebador
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<400> 9
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\hfill27
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<210> 10
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<211> 195
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<212> PRT
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<213> H. pylori
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<400> 10
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<210>11
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<211> 196
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<212> PRT
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<213> H. felis
\newpage
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 46
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<212> PRT
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<213> Lactobacillus fermentum
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<400>12
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<210> 13
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<211> 129
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<212> PRT
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<213> Streptococcus salivarius
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 213
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<212> PRT
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<213> Myco. Smegmatis
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<400>14
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<210> 15
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<211> 206
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<212> PRT
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<213> Rhodococcus sp.
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 171
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<212> PRT
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<213> P. aeruginosa
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\vskip0.400000\baselineskip
<400>16
Claims (8)
1. Un procedimiento in vitro para
identificar una molécula capaz de inhibir in vivo el
crecimiento o la supervivencia de Helicobacter, que
comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un Helicobacter parental con dicha molécula en una muestra biológica;
- (b)
- probar y comparar la respuesta al pH extracelular y la sensibilidad a la acidez de la cepa parental con una cepa deficiente en UreI y/o de una cepa deficiente en UreI complementada con un plásmido portador de ureI en presencia o ausencia de dicha molécula activa; y
- (c)
- seleccionar dicha molécula que exhiba un efecto diferencial sobre la cepa parental o la cepa complementada en comparación con la cepa deficiente en UreI.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el grado de sensibilidad a la acidez se mide el la etapa
(b).
3. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las moléculas son específicas para UreI.
4. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la cepa de Helicobacter se selecciona del grupo
compuesto por Helicobacter pylori, Helicobacter felis,
Helicobacter heilmannii, Helicobacter mustelae, Helicobacter canis,
Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus, Helicobacter
muridarum y Helicobacter troguntum.
5. Una cepa de H. pylori que porta una
deleción de ureI sustituida por un casete apolar.
6. La cepa de H. pylori de la
reivindicación 5, en la que el casete apolar es un casete de
resistencia a kanamicina.
7. Una cepa de H. pylori según cualquiera
de las reivindicaciones 5 a 6, que porta un gen ureI en el
que todos a excepción de los primeros 21 codones estaban
delecionados y sustituidos con un casete apolar compuesto por el
gen aphA-3 de resistencia a kanamicina, que
se ha delecionado de sus propias regiones promotora y
terminadora.
8. Un plásmido pILL850, depositado en el C. N. C.
M. el 28 de junio de 1999, bajo en número de acceso
I-2245, capaz de replicarse de forma estable en
H. pylori, que porta el gen ureI y que complementa el
mutante N6-834 de H. pylori.
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