DE69923559T2

DE69923559T2 - Methoden zur inhibierung von helicobacter pylori

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Publication number: DE69923559T2
Application number: DE69923559T
Authority: DE
Inventors: Hilde De Reuse; Stephane Skouloubris; Valerie Cussac; Agnès Labigne
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-29
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-06-30
Also published as: EP1092040A2; ATE288498T1; US6762051B2; US20040115772A1; JP4445128B2; JP2002519039A; PT1092040E; US6190667B1; AU4779599A; ES2237119T3; EP1092040B1; US20020102269A1; US7517666B2; US20050176077A1; US6416968B1; WO2000000634A2; WO2000000634A3; DE69923559D1

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Screening von Molekülen, fähig zum Inhibieren des Überlebens von Helicobacter, insbesondere Helicobacter pylori, in vivo durch spezifisches Inhibieren der Aktivität von UreI, Moleküle, welche durch diese Verfahren identifiziert werden, und die Verwendung dieser Moleküle zur Behandlung oder Verhinderung einer Helicobacter-Infektion.
Hintergrund der Erfindung
Helicobacter pylori ist ein mikroaerophiles gramnegatives Bakterium, welches die Magenschleimhaut von Menschen bevölkert (10). H. pylori ist mit Gastritis und Magengeschwür-Erkrankung assoziiert und erhöht erwiesenermaßen das Risiko von Magenkrebs. Urease ist ein Haupt-Virulenzfaktor von H. pylori. Sie ist beim Neutralisieren der sauren Mikroumgebung des Bakteriums beteiligt und spielt ebenfalls eine Rolle im Stoffwechsel von H. pylori (11, 26).
Die Urease-Region des H. pylori-Genoms besteht aus zwei Gen-Clustern, welche allen Stämmen gemeinsam sind (9 und 1), wobei einer die ureAB-Gene umfasst, codierend für die strukturellen Urease-Untereinheiten, und der andere die ureEFGH-Gene enthält, codierend für die akzessorischen Proteine, welche für den Einbau von Nickel in die aktive Stelle von Urease erforderlich sind. Das ureI-Gen liegt unmittelbar stromaufwärts von diesem letztgenannten Gen-Cluster und wird in der gleichen Richtung transkribiert (1). Die Gene ureA, ureB, ureE, ureF, ureG, ureH und ureI und Genprodukte sind in dem U.S.-Patent 5 695 931 und der zugelassenen Patentanmeldung Serien-Nr. 08/472 285 beschrieben und beansprucht worden.
Die Abstände, welche ureI von ureE (ein Basenpaar, bp) und ureE von ureF (11 bp) trennen, legen nahe, dass ureI-ureE-ureF ein Operon bilden. Die Cotranskription von ureI und ureE ist mittels Northern-Blot-Analyse gezeigt worden (1). Eine H. pylori-N6-Mutante mit einem ureI-Gen, disrupiert durch ein MiniTn3-Km-Transposon, wurde früher von Ferrero et al. (1994) beschrieben (13). Dieser Stamm (N6-ureI::TnKm-8) präsentierte einen Urease-negativen Phenotyp, so dass es gefolgert wurde, dass ureI ein akzessorisches Gen wäre, das für die vollständige Urease-Aktivität erforderlich ist.
Die Sequenzen von UreI aus H. pylori und der AmiS-Proteine, codiert von den aliphatischen Amidase-Operons von Pseudomonas aeruginosa und Rhodococcus sp. R312, sind ähnlich (5, 27). Aliphatische Amidasen katalysieren die intrazelluläre Hydrolyse kurzkettiger aliphatischer Amide unter Herstellung der entsprechenden organischen Säure und Ammoniak. Es ist gezeigt worden, dass H. pylori auch eine solche aliphatische Amidase besitzt, welche Acetamid und Propionamid in vitro hydrolysiert (23).
In Hinsicht auf die Sequenzähnlichkeit zwischen UreI und AmiS, zusammen mit den sehr ähnlichen Strukturen der Urease- und Amidase-Substrate (Harnstoff: NH₂-CO-NH₂ und Acetamid: CH₃-CO-NH₂) und die Herstellung von Ammoniak durch beide Enzyme, wird ein besseres Verständnis der Funktion des UreI-Proteins von H. pylori erfordert. Dieses Verständnis wird neue Möglichkeiten für die Verhinderung und Behandlung von H. pylori-Infektionen eröffnen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung sieht Methoden zur Identifizierung von Molekülen vor, welche fähig sind, das Wachstum und/oder das Überleben von Helicobacter-Spezies, insbesondere H. pylori, in vivo zu inhibieren. Insbesondere beinhalten die Methoden dieser Erfindung das Screening hinsichtlich Molekülen, welche die Funktion des UreI-Proteins spezifisch inhibieren.
Die Erfindung beinhaltet die Moleküle, identifiziert durch die Methoden dieser Erfindung, und die Verwendung der Moleküle mittels der Methoden dieser Erfindung, um eine Infektion mit Helicobacter und insbesondere H. pylori in Menschen und Tieren zu behandeln oder zu verhindern.
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung ist eine Methode zur Verhinderung oder Behandlung einer Infektion mit Helicobacter-Spezies durch Verabreichen eines Moleküls an einen Menschen oder ein Tier, welche einer solchen Behandlung bedürfen, das fähig zur Inhibierung des Wachstums und/oder Überlebens von Helicobacter-Spezies in vivo ist. Ein derartiges Molekül gemäß der Erfindung ist durch eine hohe Affinität für UreI charakterisiert, welche ihm gestattet (i) innerhalb der Helicobacter-Zelle transportiert zu werden, oder (ii) Transport-Eigenschaften von UreI zu inhibieren, oder (iii) UreI-Funktion durch Inhibieren der UreI-Wechselwirkung mit Urease oder anderen Heliobacter-Proteinen zu inhibieren. Durch Inhibieren von UreI macht ein derartiges Molekül die Bakterien empfindlicher gegenüber Säure.
Noch ein anderer Aspekt dieser Erfindung ist die Herstellung von immunogenen UreI-Antigenen und ihre Verwendung als Impfstoffe zur Verhinderung einer Infektion mit Helicobacter-Spezies und/oder der Besiedelung des Magens oder des Darms. Antikörper gegen die UreI-Antigene sind ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Erfindung eingeschlossen.
Diese Erfindung betrifft ferner rekombinante Stämme von H. pylori, umfassend ein modifiziertes ureI-Gen, so dass die Produkte des modifizierten Gens zur Attenuierung der Fähigkeit des Bakteriums, in vivo zu überleben, und somit seiner pathogenen Effekten, beitragen.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 zeigt den Urease-Gen-Cluster der elterlichen H. pylori-Stämme N6 und SS1 und der abgeleiteten Mutanten, defizient hinsichtlich UreI, Stämme N6-823, N6-834 und SS1-834. Die Gene sind durch Kästen mit einem Pfeil, der die Richtung ihrer Transkription zeigt, angegeben. Die Abstände zwischen den ure-Genen sind in Basenpaaren, bp, angegeben. Die Stelle, welche an die Primer hybridisiert, verwendet zur Bestätigung des korrekten Allel-Austauschs in den Stämmen N6-823, N6-834 und SS1-834, wird gezeigt. Leere Kästen repräsentieren die Kassetten, enthaltend die Gene, welche Resistenz gegen Cm (cat) oder gegen Km (aphA-3) verleihen. Die Urease-Aktivität dieser Stämme ist auf der rechten Seite der Figur angegeben. Die Urease-Aktivität wurde als die Freisetzung von Ammoniak an Rohextrakten von Bakterien gemessen, welche 48 Stunden auf Blut-Agarplatten gezüchtet worden waren, wie früher beschrieben (9). Eine Unit bzw. Einheit entspricht der Menge an Enzym, erforderlich zur Hydrolysierung von 1 μmol Harnstoff mm^–1 mg^–1 Gesamtprotein. Die Daten sind Mittelwerte ± Standabweichung, berechnet aus 3 bis 5 Bestimmungen.
Die 2A zeigt eine Restriktionskarte von pILL823, pILL824, pILL833 und pILL834. Schmale Rechtecke bzw. Kästen stehen für den Vektor jedes Plasmids, und breite Kästen entsprechen den Genen. Ori gibt die Position des ColE1-Replikationsursprungs an. Sp^R und Ap^R sind die Gene, welche Resistenz gegen Spectinomycin bzw. Ampicillin verleihen. Es werden auch Kassetten gezeigt, welche in ureI inseriert sind und Resistenz gegen Chloramphenicol (cat) oder Kanamycin (aphA-3) vermitteln. Die Sequenz der DNA-Region, umfassend das ureI-Stopp-Codon und das ureE-Start-Codon, einschließlich der BclI-Stelle, worin der Adaptor H19 inseriert wurde, ist angegeben. Die Insertion von H19 in die BclI-Stelle von pILL824 erzeugte pILL825, die resultierende intergenische ureI-ureE-Region wird ebenfalls gezeigt. Das Stopp-Codon von ureI und das Start-Codon von ureE sind eingerahmt, und die Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) ist unterstrichen. Klammern geben die Position von Restriktionsstellen an, welche durch Ligation entfernt wurden.
Die 2B zeigt eine Restriktionskarte von zwei H. pylori/E. coli-Shuttle-Plasmiden: pILL845 und pILL850. Schmale Kästen markieren den Vektor jedes Plasmids, und breite Kästen entsprechen den Genen. Ori gibt die Position des E. coli-ColE1-Replikationsursprungs an, und repA das Gen, codierend für das RepA-Protein, notwendig für eine autonome Replikation des pHe12 in H. pylori. Cm^p markiert das Gen, welches Resistenz gegen Chloramphenicol vermittelt. Der ureI-Promotor ist durch ein "P" repräsentiert, wobei ein Pfeil die Richtung der Transkription anzeigt. Die anderen Symbole sind wie in der 1.
3 zeigt die Übereinanderstellung bzw. Alignierung der Aminosäuresequenz von UreI aus H. pylori mit jenen von ähnlichen Proteinen, und eine Vorhersage der zweidimensionalen Struktur von Mitgliedern der UreI/AmiS-Protein-Familie. Reste, welche an einer Position in mindestens vier Sequenzen identisch sind, sind eingerahmt, und Bindestriche zeigen Lücken, welche eingefügt sind, um die Übereinanderstellung zu optimieren. Die Organismen, aus denen die Sequenzen abstammen, und der Grad der Identität mit dem UreI-Protein aus H. pylori sind: UreI-Hp, Helicobacter pylori (195 Reste, Zugangs-Nr. M84338); UreI-Hf, Helicobacter felis (74% Identität über 196 Reste, Zugangs-Nr. A41012); UreI-Lacto, Lactobacillus fermentum (55% Identität über die 46 Reste lange Teilsequenz, Zugangs-Nr. D10605); UreI-Strepto, Streptococcus salivarius (54% Identität über die 129 Reste lange Teilsequenz, Zugangs-Nr. U35248); AmiS-Myco, (Mycobacterium smegmatis (39% Identität über 172 Reste, Zugangs-Nr. X57175); AmiS-Rhod, Rhodococcus sp. R312 (37% Identität über 172 Reste, Zugangs-Nr. Z46523) und AmiS-Pseudo, Pseudomonas aeruginosa (37% Identität über 171 Reste, Zugangs-Nr. X77161). Vorhergesagte Transmembran-α-Helices sind als schattierte bzw. unterlegte Kästen gezeigt. Die Regionen, welche diese Kästen trennen, sind hydrophile Schleifen, gekennzeichnet als "IN", bei Vorhersage als intrazellulär, und "OUT" bei Vorhersage als entrazellulär.
Die 4 zeigt die Kinetik der Ammoniakfreisetzung durch den N6-Elternstamm (Tafel A) und den UreI-defizienten Stamm N6-834 (Tafel B). Bakterien (2 × 10⁸/ml) wurden geerntet und gewaschen (wie beschrieben in Skouloubris et al. (30)) und in 10 ml Phosphat-Salz-Puffer (PBS) bei pH 7, 5 oder 2,2 in Gegenwart von 10 mM Harnstoff resuspendiert. Nach 0, 3, 5 und 30 Minuten wurden 0,5 ml entnommen und zentrifugiert, um die Bakterien zu beseitigen. Der Überstand wurde auf Eis gehalten, bis die Ammoniakkonzentration unter Verwendung des Assays gemessen wurde, der im Handel von Sigma erhältlich ist (Kit-Referenz-Nr. 171).
Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse, welche mit den in vitro-Lebensfähigkeits-Tests und den pH-Messungen erhalten wurden.
Die Tabelle 3 gibt die Werte der Ammoniakerzeugung durch den Stamm N6 und N6-834 wieder, welche auf den Grafiken der 4 präsentiert sind.
Ausführliche Beschreibung
Der Urease-Cluster von Helicobacter-Spezies ist unter den vielen Urease-Operons von Gramnegativen Bakterien, welche sequenziert worden sind (20), dahingehend einzigartig, dass er ein Extra-Gen, ureI, besitzt. Die Funktion von UreI ist deshalb der Gegenstand vieler Spekulationen gewesen. Ihm wurde meistens die Funktion eines akzessorischen Proteins, erforderlich für den Nickeleinbau an der aktiven Stelle von Urease, oder eines Nickel-Transporters zugedacht. Ein H. pylori-Stamm, welcher eine Deletion von ureI trug, ersetzt durch eine nichtpolare Kassette (Kanamycin-Resistenz-Kassette), wurde konstruiert und erhielt den Namen N6-834 (30). Der Stamm ist bei der C. N. C. M. (Collection Nationale de Culture de Microoganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankreich) am 28. Juni 1999 hinterlegt worden. Dies ist das erste Mal, dass gezeigt wurde, dass eine nichtpolare Kassette (19) in H. pylori funktionell ist. Diese Ergebnisse sehen ein wertvolles Werkzeug für die genetische Analyse von komplexen H. pylori-Operons, wie Cag, einer multigenen Pathogenitäts-Insel, vor.
Untersuchungen mit diesem Stamm zeigten, dass UreI für die volle Aktivität von Urease von H. pylori nicht erforderlich ist, wie gemessen nach Wachstum in vitro bei neutralem pH-Wert. Dieses Ergebnis spricht dagegen, dass UreI am Nickeltransport beteiligt ist, da ein solches Protein, NixA (3), welches bereits in H. pylori identifiziert wurde, für die volle Urease-Aktivität notwendig ist. Der Vergleich von Ureasen, exprimiert aus einem UreI-defizientem Stamm und dem entsprechenden Eltern-Stamm, zeigt, dass (i) sie denselben Aktivitätsoptimum-pH-Wert aufzeigen (pH 8); (ii) die Urease-Strukturunterheiten, UreA-B, in gleichen Mengen hergestellt werden; und (iii) die zelluläre Lokalisierung der Urease identisch ist.
Es wird hierin gezeigt, dass (i) UreI für die Kolonisierung von Mäusen durch H. pylori wesentlich ist; (ii) UreI für das Überleben von H. pylori bei saurem pH wichtig ist; und (iii) das UreI für die Urease-"Aktivierung" bei niedrigem pH notwendig ist.
Während des Besiedelungsvorgangs des Magens muss H. pylori mit bedeutenden pH-Schwankungen zurechtkommen und muss sich speziell rasch an einen äußerst sauren pH anpassen (so sauer wie pH 1,4). Wir haben gezeigt, dass UreI für die Anpassung von N. pylori passen (so sauer wie pH 1,4). Wir haben gezeigt, dass UreI für die Anpassung von H. pylori an ein saures Milieu erforderlich ist, was mit der Abwesenheit einer Besiedelung des Mäusemagens konsistent ist. Als ein wesentliches Protein für die Resistenz von H. pylori gegen Azidität spielt UreI sicherlich eine Schlüsselrolle in der Infektion, Einnistung und Persistent von H. pylori. UreI besitzt eine ähnliche Sequenz zu jener der AmiS-Proteine, von denen vorgeschlagen wurde, am Transport von kurzkettigen Amiden beteiligt zu sein (27), Molekülen, welche strukturell ähnlich zu Harnstoff sind. Die UreI/AmiS-Proteine besitzen die Merkmale von integralen Membranproteinen, wahrscheinlich der zytoplasmatischen Membran.
Es können unterschiedliche Rollen für UreI vorgeschlagen werden. Zum Beispiel könnte UreI am Transport (Import oder Export) von Harnstoff oder kurzkettigen Amiden, welcher spezifisch bei niedrigem pH aktiv ist, beteiligt sein. Allerdings ist eine wesentliche Rolle für UreI als ein Amid-Transporter weniger wahrscheinlich, weil eine SS1-Mutante, welche hinsichtlich aliphatischer Amidase defizient ist, in Maus-Besiedelungs-Experimenten eine ebenso effiziente Koloniebildung aufzeigt, wie der Elternstamm. Darüber hinaus ist die Amidase-Aktivität durch die Deletion von ureI in dem Mutanten-Stamm N6-834 (C. N. C. M., eingereicht am 28. Juni 1999) nicht signifikant modifiziert. Der Import oder Export von Harnstoff könnte mit der Existenz eines Harnstoffzyklus konsistent sein, der eines der Kennzeichen von H. pylori ist (28).
Alternativ dazu könnte UreI an einem aktiven Ammoniak-Exportsystem beteiligt sein. Schließlich könnte UreI an einem Mechanismus der Kopplung der Urease-Aktivität an den periplasmatischen pH-Wert beteiligt sein, welcher gestattet, dass Urease aktiver wird, wenn der extrazelluläre pH sauer ist.
Unsere Ergebnisse sind kompatibel mit der ersten Hypothese, dass UreI ein Harnstofftransporter ist, der bei sauren pH-Werten aktiv ist, und der dritten Hypothese, dass UreI eine Art Sensorprotein zwischen dem periplasmatischen pH-Wert und der Urease-Aktivität ist. Wir denken, dass diese zwei Hypothesen nicht in Ausschließlichkeit gelten. Was auch immer die Rolle von UreI ist, als ein für das Überleben von H. pylori in vivo wesentliches Membranprotein stellt es nun ein bedeutsames Ziel für eine neue Bekämpfungstherapie und für Impfstoffe gegen H. pylori zur Verfügung.
Moleküle, die fähig zur Inhibierung des Wachstums und/oder Überlebens von Helicobacter in vivo sind, können durch In-Kontakt-Bringen eines elterlichen Helicobacter-Stamms mit dem Molekül in einer biologischen Probe; Testen und Vergleichen der Empfindlichkeit des elterlichen Stamms gegenüber dem extrazellulären pH mit einem Stamm, der defizient für UreI ist, und mit einem UreI-defizientem Stamm, der mit ureI komplementiert ist, in Gegenwart oder Abwesenheit von Harnstoff; Auswählen der Moleküle, die eine unterschiedliche Wirkung auf den elterlichen oder den komplementierten Stamm im Vergleich zu dem UreI-defizienten Stamm zeigen; und Gewinnen des aktiven Moleküls identifiziert werden.
Ein spezifisch auf UreI wirksames Molekül wird ein solches sein, welches H. pylori empfindlich für sauren pH (pH 2,2) in Gegenwart von Harnstoff macht, ohne das Verhalten des Stamms bei neutralem pH zu beeinflussen. Die Empfindlichkeit gegenüber Azidität in Gegenwart von Harnstoff, kann an H. pylori-Gesamtzellen unter Befolgung eines in den Beispielen beschriebenen und von Clyne et al. (8) adaptierten Protokolls getestet werden. Wir versuchen nun, diesen Test auf E. coli-Gesamtzellen zu übertragen, welche den vollständigen Urease-Gen-Cluster auf einem Plasmid tragen (ureAB-ureIEFGH). Das Screening hinsichtlich eines Moleküls, welches diesen rekombinanten E. coli gegenüber Azidität in Gegenwart von Harnstoff empfindlicher macht, wird durchgeführt, wie es in den Beispielen für H. pylori beschrieben wurde. Um zwischen inhibitorischen Molekülen, welche auf UreI wirken, und denjenigen, welche auf Urease wirken, zu unterscheiden, wird der pH-Wert des Mediums nach Gesamtzell-Inkubation bei pH 7 in Gegenwart von Harnstoff gemessen werden. Interessierende Moleküle sind diejenigen, welche die Antwort auf Azidität beeinflussen, ohne die Alkalisierung des Mediums zu inhibieren, die nach einer Inkubation bei neutralem pH beobachtet wird.
Diese Verfahren können angewandt werden, um Moleküle zu identifizieren, welche jedwede Helicobacter-Spezies inhibieren, die ein UreI-Homolog trägt. Dies schließt die gastrischen Helicobacter-Spezies Helicobacter pylori, Helicobacter felis, Helicobacter mustelae, Helicobacter muridarum und auch Helicobacter heiimannii, Helicobacter canis, Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus und Helicobacter troguntum ein.
Die durch die Methoden dieser Erfindung identifizierten Moleküle werden zur Inhibierung von UreI-Aktivität in der Lage sein durch (i) Inhibieren des Transports von Harnstoff oder kurzkettigen Amiden, (ii) Inhibieren des Ammoniak-Exports oder (iii) Inhibieren der Urease"Aktivierung" bei niedrigem pH. Die Moleküle gemäß Punkt (i) und (ii) sollten in der Lage sein, durch die äußere Membran zu diffundieren und sollten sogar bei niedriger Konzentration aktiv sein. Geeignete Kandidatenmoleküle sind Strukturanaloga von Harnstoff oder kurzkettigen Amiden, Ammoniak-Derivate oder Urease-Inhibitoren; beispielsweise Moleküle, abgeleitet aus AHA (Acetohydroxamsäure), Hydroxyharnstoff Hippursäure, Flurofamid, Hydroxylamin, Methylharnstoff Thioharnstoff (29) oder Methylammonium. Die Moleküle gemäß Punkt (iii) sollten den Kontakt zwischen UreI (wahrscheinlich inseriert in der zytoplasmati schen Membran) und periplasmatischen, membranständigen oder zytoplasmatischen H. pylori-Proteinen, welche für Urease-"Aktivierung" bei niedrigen pH notwendig sind, inhibieren. Diese Proteine könnten die strukturellen Untereinheiten von Urease selbst, die akzessorischen Proteine oder sonstige Proteine sein. Gemäß dieser Erfindung erhaltene Moleküle sollten keine kompetitiven Inhibitoren von Urease sein, sollten in vivo nicht toxisch oder mutagen sein, und könnten die Wirkung von Antibiotika oder bakteriziden Molekülen potenzieren. Die Auswertung der Wirkung solcher Moleküle könnte in vivo im Maus-Tiermodell mit dem Paar von isogenen Stämmen SS1 und SS1-834, wie beschrieben in den Beispielen, durchgeführt werden.
Ein Beispiel eines Moleküls gemäß dieser Erfindung ist ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der für UreI spezifisch ist. Vorzugsweise ist der Antikörper in der Lage, UreI-Aktivität spezifisch zu inhibieren.
Die Moleküle dieser Erfindung können in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger an einen Patienten verabreicht werden, der unter einer Infektion mit Helicobacter leidet. Alternativ dazu können immunogene Zusammensetzungen, umfassend eine oder mehrere Moleküle gemäß dieser Erfindung in einer Impfstoffzusammensetzung verabreicht werden, um eine Infektion durch Helicobacter-Spezies zu verhindern.
Immunogene Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung können auch die Gesamtheit oder einen Teil des UreI-Proteins umfassen. Vorzugsweise umfassen die UreI-Fragmente mindestens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren der nativen UreI-Sequenz, und weiter bevorzugt umfassen die Fragmente mindestens 18, 20 oder 25 aufeinander folgende Aminosäuren der nativen UreI-Sequenz. Andere geeignete UreI-Fragmente können mindestens 40 oder mindestens 100 aufeinanderfolgende Aminosäuren der nativen UreI-Sequenz enthalten. Geeignete Fragmente von Helicobacter pylori schließen beispielsweise Fragmente ein, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Aminosäure-Resten 22 bis 31, 49 bis 74, 94 bis 104 und 123 bis 142 von H. pylori (GenBank Zugangs-Nr. M84338).
Nun wird Bezug auf die folgenden Beispiele genommen werden. Die Beispiele sind für die Erfindung lediglich exemplarisch und sollten nicht als die Erfindung einschränkend ausgelegt werden.
Beispiele
Konstruktion von definierten Mutationen des ureI-Gens von H. pylori
H. pylori-Stämme mit definierten Mutationen in ureI wurden durch allelischen Austausch erzeugt, um zu bestimmen, ob das UreI-Protein für die Herstellung der aktiven Urease notwendig ist. Für diesen Zweck wurden zwei Plasmide (pILL823 und pILL834) mit Kassetten, welche Antibiotikaresistenz-Gene, inseriert in ureI, trugen, in E. coli konstruiert.
In einem Plasmid, pILL823 (2A), wurde das ureI-Gen durch Insertion eines promotorlosen cat-Gens, welches Resistenz gegen Chloramphenicol (Cm) verleiht, inaktiviert. Ein 780 by großes glattendiges BamHI-Restriktionsfragment, enthaltend die "cat-Patrone" aus pCM4 (Pharmacia, Schweden), wurde in die einmalige HpaI-Stelle, zwischen den Codons 21 und 22 von ureI in pILL753 (9) eingeführt. In dem resultierenden Plasmid pILL823 (2A), liegt cat in der gleichen Orientierung wie ureI vor und wird unter der Kontrolle des ureI-Promotors exprimiert.
Das zweite Plasmid, pILL834, trug ein ureI-Gen, in welchem alle außer den ersten 21 Codons deletiert und mit einer nicht-polaren Kassette ersetzt worden waren, aufgebaut aus dem aphA-3-Kanamycin(Km)-Resistenzgen (25), welches von seinen eigenen Promotor- und Terminatorregionen deletiert worden ist (19). Es ist gezeigt worden, dass diese Kassette in Shigella flexneri (19) und anderen Organismen (wie Yersinia enterocolitica, 2) die Transkription der stromabwärts gelegenen Gene innerhalb eines Operons nicht beeinflusst, solange diese distalen Gene intakte Translationssignale besitzen. Es gibt nur ein Basenpaar, welches ureI von ureE trennt (1) und ureE besitzt keine eigene RBS (Ribosomenbindungsstelle), sodass die Expression von ureI und ureE transkriptionell und translationell gekoppelt ist. Deshalb wurde eine ureI-Deletion von der Addition einer RBS unmittelbar stromaufwärts von ureE begleitet. Es wurden drei Zwischenformen, pILL824, pILL825 und pILL833 (2A), konstruiert, um das letztendliche Plasmid pILL834 (2A) herzustellen. Ein 1,8 kb großes HpaI-HindIII-Restriktionsfragment aus pILL753 (9) wurde zwischen die EcoRV- und HindIII-Stellen von pBR322 inseriert, wodurch pILL824 erhielt. Die Insertion des H19-Adapters (welcher eine RBS und ein ATG im selben Raster mit ureE trug, Tabelle 1) in eine BclI-Stelle, welche mit den zwei ersten Codons von ureE überlappte, in pILL824 erzeugte pILL825 (2A). Das BamHI-Fragment von pILL825 wurde dann durch ein 1,3 kb großes glattendiges PvuII-BamHI-Fragment aus pILL753 ersetzt. Dies führte zur Rekonstitution eines voll-ständigen ureI-Gens, und dieses Plasmid wurde pILL833 genannt. Schließlich wurde pILL834 durch Ersetzen des HpaI-BglII-Fragmentes von pILL833 (wodurch alle außer den ersten 21 Codons von ureI deletiert wurden) mit einem 850 by großen glattendigen EcoRI-BamHI-Fragment von pUC18K2, enthaltend die nicht-polare Km-Kassette (19), erhalten.
Tabelle 1: Name und Nukleotidsequenz von Oligonukleotiden
Einführung von ureI-Mutationen in H. pylori
H. pylori-ureI-Mutanten wurden durch allelischen Austausch im Anschluss an Elektroporation mit einer konzentrierten Präparation von pILL823 und pILL834, wie früher beschrieben von Skouloubris et al. (23), aus dem H. pylori-Stamm N6 (12) und aus dem Maus-adaptierten H. pylori-Stamm SS1 (Sydney Strain, 17) hergestellt. Bakterien mit chromosomalem allelischen Austausch mit pILL823 wurden auf Cm (4 μg/ml) selektiert, und diejenigen mit chromosomalem allelischen Austausch mit pILL834 auf Km (20 μg/ml). Es wurde bestimmt, dass der gewünschte allelische Austausch in den Stämmen N6-823, N6-834 und SS1-834 stattgefunden hatte (1), indem eine PCR mit den entsprechenden Oligonukleotiden durchgeführt wurde (Tabelle 1). Die mit genomischer DNA von diesen Stämmen erhaltenen PCR-Produkte waren wie erwartet (i) für Stamm N6-823: 140 by mit den Primern H28-H34, 220 by mit H35-9B, und 1,2 kb mit H28-9B, und (ii) für die Stämme N6-834 und SS1-834, 150 by mit den Primern H28-H50, 180 by mit H17-12B und 1 kb mit H28-12B.
Die Wachstumsrate des Stamms N6-834, welcher eine nicht-polare Deletion von ureI trug, wurde mit derjenigen des elterlichen Stamms N6 verglichen. Es wurde kein Unterschied in der Koloniegröße auf Blutagar-Medium-Platten beobachtet. Identische Verdoppelungszeiten und stationäre-Phase-OD wurden für beide Stämme gemessen, welche in BHI(Oxoid)-Flüssig medium gezüchtet worden waren, enthaltend 0,2% ∃-Cyclodextrin (Sigma). Somit ist UreI für das in vitro Wachstum von H. pylori nicht wesentlich.
Ureaseaktivität von H. pylori-ureI-Mutanten
Die Urease-Aktivität der Stämme N6-823, N6-834 und SS1-834 wurde in vitro gemessen, wie früher beschrieben von Cussac et al. (9) und mit der Aktivität der Elternstämme, N6 und SS1 (1), verglichen. Die Urease-Aktivität war im Stamm N6-823 nahezu vollständig eliminert (0,3 ± 0,1 Units). Die Stämme N6-834 und SS1-834 mit nicht-polaren ureI-Mutationen besaßen Wildtyp-Spiegel der Aktivität (N6-834 und SS1-834: 12 ± 2 Units; Elternstämme, N6: 10 ± 1, und SS1: 12 ± 0,4 Units).
Das pH-Optimum der Urease, hergestellt entweder von dem N6-Elternstamm oder von dem UreI-defizienten Stamm N6-834, wurde gemessen und verglichen. Für beide Stämme hatte die Urease ein pH-Optimum von 8, was mit den veröffentlichten Daten übereinstimmt.
Diese Ergebnisse legen in starkem Maße nahe, dass der Urease-negative Phänotyp des Stamms N6-ureI::TnKm-8 (13) und die sehr schwache Urease-Aktivität des Stamms N6-823 auf einem polaren Effekt der inserierten Kassetten auf die Expression der stromabwärts gelegenen Gene ureE und ureF beruhten (1). Diese Hypothese wurde durch Messen von Ureaseaktivität des Stamms N6-823 getestet, welcher in trans mit einem E. coli/H. pylori-Shuttle-Plasmid komplementiert war, welches die Gene ureE-F exprimierte. Dieses Plasmid, pILL845 (2B), wurde durch Insertion eines 2,8 kb großen ClaI-BamHI-Fragmentes von pILL834 (umfassend das 3'-Ende von ureE, die nicht-polare Deletion von ureI und intakte ureE- und ureF-Gene) in die entsprechenden Stellen des Shuttle-Vektors pHe12, konstruiert von Heuermann und Haas (15), erhalten. Der Stamm N6-823 wurde mit einer DNA-Präparation von pILL845, wie beschrieben von Skouloubris et al. (23), mittels Elektroporation behandelt, und Transformanten wurden auf Kanamycin (20 μg/ml) und Chloramphenicol (4 μg/ml) selektiert. In dem Stamm N6-823, welcher pILL845 enthält, wurde Wildtyp-Urease-Aktivität wiederhergestellt, was bestätigt, dass die sehr geringe Urease-Aktivität des Stamms N6-823 auf einem polaren Effekt auf die Expression der akzessorischen Gene ureE-F beruhte. In Klebsiella aerogenes hatte die Abwesenheit von UreE einen geringen Effekt auf die Urease-Aktivität (4). Im Gegensatz dazu ist UreF als Teil des akzessorischen Proteinkomplexes (UreDFG) für die Herstellung von aktiver Urease absolut notwendig (21). In Analogie hierzu ist es somit wahrscheinlich, dass der Phänotyp der polaren ureI-Mutanten von H. pylori aufgrund der Abwesenheit von ureF-Expression zustande kam.
Die Urease-Strukturuntereinheiten, UreA und UreB, hergestellt von Stamm N6 oder Stamm N6-834, wurden mit der Western-Blot-Technik unter Verwendung einer Mischung von Antiseren, welche gegen jede Urease-Untereinheit gerichtet waren, verglichen. Es wurde beobachtet, dass die Menge jeder Untereinheit, welche von den zwei Stämmen hergestellt wurde, iden tisch ist. Die Möglichkeit, dass die zelluläre Lokalisierung von Urease in Abwesenheit von UreI betroffen sein könnte, wurde nach einer zellulären Fraktionierung (welche die löslichen von den Membran-assoziierten Proteinen und von dem Überstand trennte) der Stämme N6 und N6-834 untersucht. Diese Experimente enthüllten keinen Unterschied zwischen der zellulären Lokalisierung von Urease im Wildtypstamm oder in der UreI-defizienten Mutante. Diese Ergebnisse zeigen, dass UreI bei neutralem pH, weder an der Stabilisierung der Urease-Strukturuntereinheiten noch an einem Prozess des Targetings von Urease zu einem spezifischen Zell-Kompartiment beteiligt ist.
Kolonisierungs-Test für die H. pylori-Mutante SS1-834 in Maus-Tiermodell
Das Mausmodell für die Infektion durch den H. pylori-Stamm SS1 (Sidney-Stamm, 17), erprobt von Chevalier et al. (7) und Ferrero et al. (14), wurde verwendet, um die Funktion von UreI in vivo zu testen. Mäuse wurden mit der nicht-polaren ureI-Mutante SS1-834 und mit dem Elternstamm SS1 (welche eine äquivalente Zahl von in vitro-Unterkulturen durchlaufen hatten) als Positivkontrolle infiziert. Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt und erzeugte identische Ergebnisse (30). Es wurden zwei unabhängig voneinander konstruierte SS1-834-Mutanten verwendet. Der erste Mutantenstamm hatte 30 Unterkulturen in vitro durchlaufen, der zweite lediglich 20. Unter denselben experimentellen Bedingungen, kann der Stamm SS1 mehr als 80 Unterkulturen in vitro durchlaufen, ohne sein Koloniebildungsvermögen zu verlieren.
In jedem Experiment wurden Aliquots (100 μl), enthaltend 10⁶ H. pylori-Bakterien des Stamms SS1 oder SS1-834, hergestellt in Pepton-Nährmedium, orogastrisch an jeweils 10 Mäuse (6 bis 8 Wochen alte, spezifisch pathogenfreie Swiss-Mäuse) verabreicht, wie beschrieben von Ferrero et al. (14). Die Mäuse wurden vier Wochen nach der Inokulation getötet. Die Gegenwart von H. pylori wurde mit einem direkten Urease-Test an Biopsie-Proben getestet, welche an der Hälfte des Magens vorgenommen wurden (14). Das verbleibende Magengewebe wurde für eine quantitative Kultur von H. pylori verwendet, wie beschrieben von Ferrero et al. (14). In jedem Experiment zeigten die Mägen der zehn SS1-infizierten Mäuse sämtlich ein positives Ergebnis für Urease. Die Bakterienbelastung belief sich auf zwischen 5 × 10⁴ und 5 × 10⁵ koloniebildende Einheiten (CFU) pro g des Magens. Keiner der Mägen der mit dem Stamm SS1-834 infizierten Mäuse zeigte ein positives Testergebnis für Urease, und aus ihnen wurden keine H. pylori-Zellen kultiviert. Daher ist das UreI-Protein für das Überleben von H. pylori in vivo und/oder die Kolonisierung des Mäusemagens wesentlich.
UreI ist wesentlich für die H. pylori-Resistenz gegen Azidität
Das Überleben unter sauren Bedingungen in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM Harnstoff wurde mit den Stämmen N6 und N6-834 getestet. Die ausführlich in Skouloubris et al. (30) geschilderten experimentellen Vorgehensweisen basierten auf denjenigen, welche in Clyne et al. beschrieben werden (8). Exponentiell herangezüchtete Bakterien wurden geerntet, in PBS (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung) gewaschen, und ungefähr 2 × 10⁸ CFU/ml wurden in PBS von pH 2,2 oder pH 7 in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM Harnstoff resuspendiert und bei 37°C inkubiert. Nach einstündiger Inkubation wurden (i) quantitative Kulturen der H. pylori-Stämme durchgeführt, um das Bakterienüberleben auszuwerten, und wurden (ii) die Bakterien zentrifugiert, und der pH-Wert des Mediums wurde gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 wiedergegeben. In Abwesenheit von Harnstoff präsentierten beide Stämme, N6 und N6-834, einen identischen Phänotyp, d. h. sie wurden bei pH 2,2 getötet und überlebten bei pH 7 ohne Modifizierung des End-pH-Werts des Mediums (Tabelle 2). Nach Inkubation bei pH 7 in Gegenwart von Harnstoff wurden beide Stämme getötet, weil der End-pH-Wert auf pH 9 stieg. Bei pH 2,2 in Gegenwart von Harnstoff überlebte der elterliche Stamm gut, da er in der Lage war, den pH-Wert bis zur Neutralität zu erhöhen. Im Gegensatz dazu wurde ein vollständig anderer Phänotyp mit dem UreI-defizienten Stamm N6-834 erhalten, welcher nicht in der Lage war, den pH zu erhöhen, und dessen Lebensfähigkeit ernsthaft beeinträchtigt war (Tabelle 2).
Komplementation des UreI-defizienten Stamms N6-834 mit dem Plasmid pILL850
Die direkte Beteiligung des UreI-Proteins an der Fähigkeit von H. pylori, ein saures Milieu zu überstehen, ist durch Trans-Komplementation mit dem Plasmid pILL850 (2B, Restriktionskarte und Details der Konstruktion) bestätigt worden. Dieses Plasmid [CNCM I-2245, eingereicht am 28. Juni 1999] ist aus dem H. pylori/E. coli-Shuttle-Vektor pHe12 abgeleitet (15). Das Plasmid pILL850 trägt das ureI-Gen unter der Steuerung seines eigenen Promotors und wurde wie folgend konstruiert: Ein 1,2 kb großes BclI-Restriktionsfragment von Plasmid pILL753 (9) wurde zwischen die BamHI- und BclI-Restriktionsstellen von pHe12 eingeführt (2B). Die Stämme N6 und N6-834 wurden mit diesem Plasmid transformiert, und der Phänotyp der komplementierten Stämme in den obenstehend beschriebenen Aziditäts-Empfindlichkeitstest-Experimenten wurde untersucht. Wie in der Tabelle 2 gezeigt, ist der Phänotyp des Stamms N6-834, komplementiert mit pILL850, identisch zu demjenigen des elterlichen Stamms N6. Interessanterweise ist von der Urease-Aktivität der komplementierten Stämme (gemessen an sonifizierten Extrakten, wie beschrieben in Skouloubris et al. (30)) festgestellt worden, signifikant höher zu sein im Vergleich zu derjenigen der entsprechenden Stämme ohne pILL850. Zum Zwecke der Hinterlegung bei der CNCM wird pILL850 in einen E. coli-Stamm, MC1061 (Wertman KF. et al., 1986, Gene 49: 253 – 262) eingebracht.
Messungen der Ammoniakerzeugung
Die Menge an Ammoniak, erzeugt im extrazellulären Medium von H. pylori-Gesamtzellen, wurde durch einen enzymatischen Assay gemessen, der im Handel von Sigma erhältlich ist, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Diese Experimente wurden nach Inkubation der Zellen in PBS bei unterschiedlichen pH-Werten und nach verschiedenen Inkubationszeiten durchgeführt. Solche Experimente ergaben eine präzise Auswertung der Ammoniakerzeugung und -ausscheidung in verschiedenen Stämmen sowie ein Maß der Kinetik der Reaktion. Ein Kontrollexperiment zeigte, dass die Ammoniakerzeugung in Abwesenheit von Harnstoff sehr gering war (10–20 μm).
Die 4 zeigt die Kinetik (0, 3, 5 und 30 Minuten Inkubationszeit) von extrazellulärem Ammoniak, freigesetzt von dem elterlichen Stamm N6 (Tafel A) und dem UreI-defizienten Stamm N6-834 (Tafel B), inkubiert in PBS bei pH 2,2, pH 5 oder pH 7 in Gegenwart von 10 mM Harnstoff. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass (i) Ammoniak in großem Maße erzeugt und in das extrazelluläre Medium freigegeben wird; und (ii) in dem N6-Wildtypstamm ( 4, Tafel A und Tabelle 3) die Ammoniakerzeugung signifikant verstärkt ist, wenn der extrazelluläre pH sauer ist. Dieser Effekt ist bereits bei pH 5 sichtbar, und ist bei pH 2,2 sogar noch stärker. Diese letztgenannte Beobachtung ist konsistent mit den Ergebnissen von Scott et al. (31), der eine Urease-Aktivierung bei niedrigem pH-Wert vorschlug. In unseren Experimenten spricht die Schnelligkeit der Antwort auf Azidität gegen eine Urease-Aktivierung, welche von transkriptioneller Regulierung oder von de novo Proteinsynthese abhängig ist.
Die Ammoniakerzeugung wurde dann in dem UreI-defizienten Stamm N6-834 gemessen ( 4, Tafel B und Tabelle 3). Bei neutralem pH-Wert war die Kinetik der Ammoniakerzeugung ähnlich zu derjenigen des Wildtypstamms. Im Gegensatz dazu war die Ammoniakerzeugung bei pH 5 im Vergleich zum Wildtypstamm verringert und verzögert. Ein dramatischer Effekt der Abwesenheit von UreI wurde bei pH 2,2 beobachtet, wobei die Menge an Ammoniak sehr gering war, was konsistent mit unseren Ergebnissen ist, welche zeigen, dass UreI notwendig für die Anpassung an Azidität ist.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass UreI wesentlich für die Resistenz von H. pylori gegen Azidität ist. In Abwesenheit von UreI, ist Urease, obwohl in großen Mengen vorhanden, nicht in der Lage, die Bakterien gegen die Aggressivität des sauren Milieus zu schützen. Dies steht in Übereinstimmung mit der essentiellen Rolle von UreI in vivo. Während seines Übertritts in das saure Magen-Lumen ist die Lebensfähigkeit des UreI-defizienten Stamms beeinträchtigt. Als Folge davon wird die Bakterienbelastung zu gering, um eine Besiedelung zu gestatten. Die verschiedenen Rollen, welche für UreI vorgeschlagen wurden, werden im Abschnitt "Ausführliche Beschreibung" dargestellt.
Übereinanderstellung der UreI- und AmiS-Proteinsequenzen und zweidimensionale Strukturvorhersage
Eine systematische Suche nach UreI-Homologen in den Protein-Datenbanken wurde durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass H. pylori nicht das einzige ureolytische Bakterium mit einem ureI-Gen ist. Zwei phylogenetisch verwandte Gram-positive Organismen, Streptococcus salivarius, ein Zahnkaries-Bakterium (6), und Lactobacillus fermentum, ein Milchsäure-Bakterium (16), tragen Gene für UreI-Homologe (3), welche unmittelbar stromaufwärts der Urease-Strukturgene lokalisiert sind. Das ureI-Gen ist in verschiedenen Helicobacter-Spezies nachgewiesen worden; das H. felis-ureI-Gen ist vollständig sequenziert worden ( 3 und zugelassene U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/467 822, deren gesamter Inhalt hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist). PCR-Experimente haben nahegelegt, dass es ein ureI-Gen in H. heilmannii (24) und H. mustelae gibt.
Sequenzähnlichkeiten zwischen dem UreI-Protein von H. pylori und den AmiS-Proteinen, exprimiert von den aliphatischen Amidase-Operons von P. aeruginosa (27) und Rhodococcus sp. R312 (5), sind berichtet worden. In Mycobacterium smegmatis gibt es ein weiteres AmiS-Homolog, kodiert von einem Gen, ORF P3, welches unmittelbar stromaufwärts eines Amidase-Gens lokalisiert ist (18).
Die Alignierung dieser UreI/AmiS-Proteine [unter Verwendung des Programms Clustal W (1.60)] definierte stark konservierte Abschnitte von Aminosäuren (3). Alle außer einem dieser konservierten Blöcke liegen in stark hydrophoben Segmenten. Diese Regionen, jeweils 17 bis 22 Reste lang, sind wahrscheinlich zu Transmembran-∀-Helices gefaltet (3). Es wurden sechs Transmembran-Regionen für die Proteine aus H. pylori, H. felis und P. aeruginosa, und sieben für diejenigen aus Rhodococcus sp. R12 und M, smegmatis vorhergesagt (hochzuverlässige Vorhersagen, durchgeführt mit pHD, einem profil-gefütterten neuronalen Netzwerksystem, wie beschrieben von Rost et al. (22)). Die Orientierung der UreI/AmiS- Proteine in der Membran wurde aus den Ladungen der interkalierten hydrophilen Regionen abgeleitet, welche in diesen Proteinen kurz sind (3). Die ersten fünf derartigen Regionen sind schwach konserviert und von unterschiedlicher Länge. Das diesen Proteinen gemeinsame, letzte interhelicale Segment ist signifikant stärker konserviert als die anderen. Diese Region, welche vorhergesagtermaßen intrazellulär ist, kann die aktive Stelle von UreI oder Multimerisierungs- oder Wechselwirkungsstelle mit einem intrazellulären Partner sein. Diese Ergebnisse legen in starkem Maße nahe, dass die Mitglieder der UreI/AmiS-Familie, welche sowohl in Gram-positiven als auch in -negativen Bakterien gefunden werden, integrale Membranproteine sind. Diese Proteine besitzen keine Signalsequenz und sollten deshalb in die zytoplasmatische Membran in Gram-negativen Bakterien inseriert werden.
Zwei Peptide, selektiert aus der UreI-Sequenz, wurden synthetisiert und in zwei Kaninchen injiziert, um Serum zu erhalten, welches gegen UreI gerichtete polyklonale Antikörper enthält. Ein Peptid entspricht der ersten vorhergesagten intrazellulären Schleife von UreI (von Rest nB 15 bis 31, siehe 3), und das zweite entspricht der zweiten vorhergesagten extrazellulären Schleife von UreI (von Rest nB 118 bis 134, siehe 3). Diese Seren werden gegenwärtig getestet, und falls sie nachweislich das UreI-Protein erkennen, werden sie uns gestatten, die Lokalisierung dieses Proteins präzise zu definieren und die in der 3 präsentierte zweidimensionale vorhergesagte Struktur von UreI zu bestätigen.
Tabelle 2: Effekt der Gegenwart von Harnstoff bei pH 7, 5 oder 2,2 auf (i) die Lebensfähigkeit von verschiedenen H. pylori-Stämmen und (ii) den extrazellulären pH (angegeben als End-pH). Die experimentellen Bedingungen sind in Bezugstelle 30 und in den Beispielen beschrieben. Der Stamm N6 ist der elterliche Stamm, und der Stamm N6-834 ist die UreI-defiziente Mutante. Das Plasmid pILL850 ist aus einem E. coli/H. pylori-Shuttle-Vektor abgeleitet, es trägt das ureI-Gen und komplementiert die ureI-Mutation des Stammes N6-834.
Tabelle 3
Bezugsstellen

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Claims

In vitro Methode zur Identifizierung von einem Molekül, das fähig ist, das Wachstum oder das Überleben von Helicobacter in vivo zu inhibieren, umfassend die folgenden Schritte: (a) in Kontaktbringen eines elterlichen Helicobacter mit diesem Molekül in einer biologischen Probe; (b) Testen und Vergleichen der Antwort auf den extra-zellulären pH und die Säureempfindlichkeit des elterlichen Stamms mit einem Stamm, der defizient für UreI ist, und/oder mit einem UreI-defizienten Stamm, der mit einem ureI-tragenden Plasmid komplementiert ist, in Gegenwart oder Abwesenheit von diesem aktiven Molekül, und (c) Auswählen des Moleküls, das eine unterschiedliche Wirkung auf den elterlichen Stamm oder den komplementierten Stamm im Vergleich zu dem UreI-defizienten Stamm zeigt.
Methode gemäß Anspruch 1, worin der Grad der Säureempfindlichkeit in Schritt (b) gemessen wird.
Methode gemäß Anspruch 1, worin die Moleküle für UreI spezifisch sind.
Methode gemäß Anspruch 1, worin der Helicobacter-Stamm ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Helicobacter pylori, Helicobacter felis, Helicobacter heilmannii, Helicobacter mustelae, Helicobacter canis, Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus, Helicobacter muridarum, und Helicobacter troguntum.
Ein H. pylori-Stamm, der eine Deletion von ureI trägt, die durch eine nichtpolare Kassette ersetzt wurde.
H. pylori-Stamm gemäß Anspruch 5, worin die nichtpolare Kassette eine Kanamycin-Resistenz-Kassette ist.
H. pylori-Stamm gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6, der ein ureI-Gen trägt, in dem alle bis auf die ersten 21 Kodons deletiert worden sind und durch eine nichtpolare Kassette, aufgebaut aus dem aphA-3-Kanamycin-Resistenz-Gen, das von seinem eigenen Promotor und den Terminatorregionen deletiert worden ist, ersetzt worden sind.
Plasmid pILL850, hinterlegt bei der C. N. C. M. am 28. Juni 1999 unter der Hinterlegungsnummer I-2245, das fähig ist, stabil in H. pylori zu replizieren, welches das ureI-Gen trägt und die H. pylori N6-834-Mutante komplementiert.