NACHWEIS VON DIARRHOGENEN E . COLI-KEIMEN
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Sal- monellen, Shigellen, Yersinien sowie enteropathogenen Escheri- chia coli (E.coli; EPEC) , insbesondere Shiga Toxin produzierende E.coli (STEC) , enterohämorrhagische E.coli (EHEC), en- terotoxigene E.coli (ETEC), enteroinvasive E.coli (EIEC) und/oder enteroaggregative E.coli (EAEC) , einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens sowie monoklonale Antikörper zur Verwendung in diesem Verfahren und Hybridomazellen, welche solche Antikörper produzieren.
Die zur Darmflora gehörenden gramnegativen Stäbchenbakterien E.coli sind an sich harmlose kommensale Bakterien. Jedoch gibt es eine Reihe pathogener Subspezies bzw. Varianten wie die erwähnten STEC, EHEC, ETEC, EIEC und EAEC. Diese Bakterien lagern sich mit unterschiedlichen Anheftungsmechanismen an die Epithelzellen der Darmwand an (z.B. ETEC durch Fimbriae, EHEC und STEC durch einen als Typ III bezeichneten Sekretionsapparat) . Dabei bedienen sich die Bakterien unterschiedlicher Mechanismen um die Wirtszelle nachhaltig zu schädigen bzw. an diese Zellen anzuheften, um tödliche Zellgifte aus dem Bakte- rien-Cytoplasma mittels eines hierfür typischen Sekretionsap- parates, des sogenannten Typ-III-Sekretionsapparates , direkt in die Targetzelle des Wirtes einzuschleusen.
Derartige enteropathogene E . coli-Infektionen treten weltweit auf und zwar sowohl als human- als auch als tierpathogene Keime. Insbesondere EHEC und STEC sind in Ländern mit einer hoch entwickelten Landwirtschaf verbreitet.
Prinzipiell gelten Tiere, insbesondere Rinder, aber auch andere Wiederkäuer wie Schafe und Ziegen als Hauptquelle für ente- ropathogene E.coli. Hierzu gehören auch andere landwirtschaftliche Nutztiere wie Pferde und Schweine oder auch Heimtiere wie Hunde und Katzen. Schließlich können auch Wildtiere wie Rehe, Wildschweine oder Gemsen die Quelle für eine derartige Infektion darstellen.
Die Übertragung der Erreger erfolgt indirekt über fäkalkonta- minierte Lebensmittel, vor allem aber durch unzureichend gegartes Fleisch, wie z.B. in Hamburgern, rohe Fleischprodukte wie Würste, nicht sterilisierte Milch und Produkte hieraus wie Rohmilch, Käse aber auch Trinkwasser. Weitere Infektionsquellen sind unzureichend gewaschener Salat und Sprossen, insbesondere aus biologischem Anbau. Eine weitere wesentliche Rolle spielt auch die direkte Übertragung von Mensch zu Mensch (fä- kal-oral) wie sie innerhalb einer Familie, aber auch in Gemeinschaftseinrichtungen wie Kindergärten, Altenheimen und Krankenhäusern auftritt und dabei die Ursache für Epidemien darstellt. Die Inkubationszeit beträgt üblicherweise eins bis drei Tage, kann jedoch auch bis zu acht Tagen andauern. Dabei besteht die Ansteckungsgefahr so lange die infektiösen Keime im Stuhl ausgeschieden werden. Eine derartige Keimausscheidung dauert üblicherweise 25 Tage, in Einzelfällen jedoch auch länger, d.h. bis über einen Monat. Viele derartiger infektiöser Enteritiden bzw. infektiöser Durchfälle verlaufen relativ harmlos und ohne klinisch relevante Symptome. Etwa bei einem Drittel der manifesten Erkrankungen tritt ein leichter Durchfall in Erscheinung. Dabei können die Durchfälle im Verlauf zunehmend blutig erscheinen und eine Ruhr-ähnliche Symptomatik aufweisen. Bei etwa 10 - 20 % der Erkrankten, insbesondere bei Säuglingen, Kleinkindern, alten und immungeschwächten Patienten entwickeln sich schwere Verlaufsformen, die bis zum hä- molytisch-uremischen Syndrom (HUS) mit hämolytischer Anämie führen können, sowie zu Nierenversagen bis zur Anurie und
thrombotischer Mikroangiopathie, ebenso zu einer thrombo- tisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP) mit Thrombozytopenie, Hautblutungen, hämolytischer Anämie und neurologischen Ausfällen. Derartige Infektionen sind für den Tod von etwa einer Million Kindern pro Jahr verantwortlich.
Diese Bakterien zeichnen sich nicht nur durch ihre besondere pathogene Virulenz, sondern auch durch eine große Umweltstabilität und durch eine gute Überlebensfähigkeit im sauren Milieu aus, wie es beispielsweise im Magen herrscht. So reicht eine Dosis von 10 bis 100 Bakterien aus, um eine Infektion auszulösen. Das Auftreten von STEC und/oder EHEC Infektionen ist daher nach dem Bundesseuchengesetz meldepflichtig. Um eine Infektion mit enteropathogenen E.coli nachzuweisen sind eine Reihe von Untersuchungsmethoden bekannt. Dabei werden die vom Bakterium ausgeschiedenen Shiga Toxine I und II in Stuhlproben mittels eines Enzyme linked immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen.
Toxine, wie z.B. Shiga Toxin I und II, werden jedoch auch von anderen Keimen produziert, so dass deren Nachweis nicht für enteropathogene E.coli spezifisch ist, d.h. der Nachweis dieser Toxine führt dazu, dass fälschlicherweise andere bakterielle Infektionen als EHEC bzw. STEC eingestuft werden. So werden z.B. Shiga Toxine in E.coli auf einem ca. 50 Kb großen Phagenplasmid kodiert, das genetisch instabil ist und in manchen Stämmen verloren gehen kann, ohne dass diese Stämme dabei ihre enteropathogenen Eigenschaften verlieren. Daher führt der fehlende Nachweis von Toxinen auch zu falsch negativen Ergebnissen. Andererseits werden Shiga Toxine auch von anderen Erregern gebildet, so dass der Nachweis dieser Toxine auch zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Die Produktion und Sekretion solcher Proteine bei STEC ist beispielsweise bei F. Ebel, T. Chakraborty et al . in Infection and Immuni ty, Vol. 64 (1996), S. 4472 - 4479 beschrieben.
Die charakteristische Adhäsion vieler enteropathogener E.coli an Darmwandzellen wird als attaching/effacing Phänotyp bezeichnet und ist unbedingte Voraussetzung für den weiteren schweren Infektionsverlauf. Das genetische Korrelat des attaching/effacing Phänotyps ist der sogenannte LEE-Locus (locus of enterocyte effacement) , eine Pathogenitätsinsel , die im Gegensatz zu den obigen Toxinen direkt im Bakteriengenom liegt. Dieser LEE-Locus codiert unter anderem auch die Proteine des Typ III Sekretionsapparates, sowie Effektorproteine, die eine modulierende Wirkung auf die Eigenschaften der Zielzelle haben. Der Nachweis dieses LEE-Locus erfolgt üblicherweise über das sogenannte eae-Gen.
Da der LEE-Locus für die Adhäsion der Bakterien an die Darmwand verantwortlich ist (attaching/effacing Phänotyp) , wurde er bereits intensiv untersucht. Es ist allgemein bekannt, dass in Reinkulturen die Effektorproteine, die von dem Typ III Sekretionsapparat ausgeschleust werden, insbesondere esp-A, esp-B, esp-D, esp-E und esp-F im Kulturüberstand nachweisbar sind. So beschreibt beispielsweise B. Kenny et al . in Infec- tion and Immunity (1997) , Seiten 2606 - 2612 den Nachweis von esp-B sowie esp-C und geringen Mengen esp-A im Überstand der Kulturmedien, und zwar durch Ausfällen der Proteine im Überstand und deren Detektion entweder auf Polyacrylamid-Gelen oder auf immunologischem Wege durch direktes Beschichten von Mikrotiterplatten über Nacht und Reaktion mittels Enzym-markierten Antikörpern. Dieser Test hat jedoch den Nachteil, dass durch die fehlende Aufreinigung, d. h. Abtrennung von anderen Proteinen, der Nachweis nicht hinreichend spezifisch ist. Er ist damit zum Nachweis von pathogenen E . coli -Keimen nicht geeignet. Darüber hinaus ist das Verfahren recht aufwendig.
Die von den nationalen Gesundheitsämtern üblicherweise anerkannten Verfahren umfassen den direkten Nachweis des Shiga-To- xins , den Nachweis der verschiedenen Serotypen, den Nachweis
fehlender fermentativer Eigenschaften (z.B. Sorbitfermentation) oder den Nachweis bestimmter Gene, insbesondere der To- xingene oder des eae-Gens mittels PCR.
Ein Vergleich der unterschiedlichen Nachweisverfahren ist beispielsweise von R. Kugler et al . in "EHEC in Deutschland", Bundesgesundheitsblatt , Sonderheft Oktober 1998, Seiten 13 - 19 beschrieben. Allen diesen Verfahren ist es gemeinsam, dass sie recht aufwendig und für sich allein mehr oder weniger unzuverlässig sind. Durch die enorme Pathogenität und Virulenz und dem damit einhergehenden Gefährdungspotential für die Bevölkerung besteht somit Bedarf für einen Nachweis für derartige enteropathogene Bakterien aus der Familie der Enterobakte- riceae, insbesonders E.coli-Keime sowie Shigellen, Salmonellen und Yersinien, mit dem mit hoher Sicherheit, Schnelligkeit und hoher Spezifität auch mit wenig geschultem Personal eine mögliche Infektion nachgewiesen werden kann. Die Erfindung hat daher zum Ziel, diesen Bedarf zu befriedigen.
Dieses Ziel wird mit den in den Ansprüchen definierten Verfahren und Tests erreicht.
Erfindungsgemäß wurde nämlich gefunden, dass sich durch Anzucht der Keime aus einer Probe die sekretorischen Proteine des Typ-III -Apparates nicht nur in Reinkultur sondern auch neben anderen üblichen im Darm vorkommenden Keimen nachweisen lassen, wenn man die Keime aufschließt. Es hat sich auch gezeigt, dass man auf diese Weise problemlos andere Proteine des LEE-Locus und damit entsprechende enteropathogene Keime nachweisen kann. Erfindungsgemäß nachzuweisende Keime sind alle diejenigen, die einen LEE-Locus enthalten, insbesonders Yersinien, Shigellen, Salmonellen, Keime der Familie der Enterobakteriaceae sowie EHEC, STEC, ETEC, EIEC und/oder EAEC. Weitere mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachzuweisende
Keime sind insbesonders Citrobacter spp . , Enterobacter spp., Hafnia spp. und/oder pseudomoniceae .
Der Aufschluss der Bakterien erfolgt üblicherweise mittels einer Lyse auf an sich bekannte Weise. Besonders bevorzugt ist es die Lyse mittels eines Detergenzes durchzuführen. Hierzu eignen sich sämtliche üblichen zur Lyse geeigneten Detergen- zien solange diese nicht den späteren Nachweis der Proteine stören. Ein besonders bevorzugtes Detergens zur Zelllyse, welches nicht stört, ist 3- [N- (3 -Cholanamidopropyl) -Dimethylammi- no] -1-Propansulfonat (CHAPS) sowie Derivate davon, insbesonders Derivate der Gallensäure und Derivate der N-Alkylsulfobe- taine sowie Gemische davon. Ebenso geeignet sind Tenside vom CHAPSO-Typ (3- [N- (3 -Cholanamidopropyl ) -Dimethylammino] - 2-Hy- droxy-1-Propansulfonat) . Weitere erfindungsgemäß verwendbare Detergenzien können den Katalogen und Veröffentlichungen spezieller Hersteller entnommen werden, z.B. CALBIOCHEM: Deter- gents: A Guide to the properties and uses of detergents in biological Systems; by Srirama M. Bhairi; (1997) . Prinzipiell ist es auch möglich die geernteten und zu analysierenden Bakterienzellen mittels Ultraschall aufzuschließen. Auch andere übliche AufSchlussmethoden wie Scher- und Druckbehandlungen, insbesondere osmotische Druckbehandlungen, sind zur erfindungsgemäßen Lyse der Bakterienzellen geeignet.
Zur Erhöhung der Nachweisgrenze der esp's können beliebige Proteine, insbesonders Serumproteine verschiedener Spezies zugesetzt werden. Auf diese Weise können die zu bestimmenden Proteine des LEE-Locus vor noch vorhandenen bzw. neu synthetisierten Proteasen geschützt werden. Es ist auch möglich auf diese Weise eventuell störende Detergenzien unspezifisch zu binden.
Erfindungsgemäß wurde nämlich gefunden, dass sich die sogenannten sekretorischen Typ- III -Proteine lediglich in Reinkul-
tur im Überstand nachweisen lassen. Ihr Nachweis bei Kulturen aus Lebensmitteln und/oder insbesondere Stuhl versagt jedoch, da sich diese Proteine nicht mehr im Überstand einer Mischkultur nachweisen lassen, wie sie beispielsweise bei einer Probenentnahme in der Praxis erhalten wird. Erfindungsgemäß wurde nämlich gefunden, dass sofern überhaupt Proteine sekretiert werden, diese offenbar instabil sind und/oder durch andere Mikroorganismen und/oder Proteasen innerhalb weniger Minuten verbraucht bzw. verdaut werden.
Erfindungsgemäß wurde nun auch gefunden, dass die zu analysierenden, den LEE-Locus enthaltenden Mikroorganismen wie die zuvor genannten E . coli -Stämme, intrazellulär ein Reservoir an diesen Proteinen anlegen. Durch Sammeln der Zellen und deren Aufschluss bzw. Extraktion lassen sich somit wesentlich höhere Konzentrationen dieser Proteine gewinnen, so dass diese auch mittels gängigen immunologischen Verfahren wie ELISA-Tests sicher nachweisbar werden. Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, dass diese Konzentrationen insbesonders dann erreicht werden, wenn diese bei Temperaturen zwischen 28°C und 45°C, vorzugsweise von 33 °C - 39°C, kultiviert werden. Diese Kultivierungstemperaturen werden vorzugsweise mindestens vor der Ernte angelegt. Der pH des Kulturmediums beträgt vorzugsweise zwischen 5 und 9,5, wobei 6,5 - 7,8 besonders zweckmäßig ist.
Das Kulturmedium weist vorzugsweise einen Natriumgehalt von 25 - 1000 mM, einen Chloridgehalt von 20 - 1050 mM, einen Kalziumgehalt von 0,1 - 10 mM, einen Eisengehalt von 0,005 - 10 mM, einen Magnesiumgehalt von 0,005 - 5 mM, einen Ammoniumgehalt von 0,1 - 150 mM, einen Sulfatgehalt von 0,01 - 160 mM, vorzugsweise einen Sulfatgehalt von 0,01 - 150 mM sowie ggf. einen Mangangehalt von 0,001 - 10 mM. Besonders geeignet ist ein modifiziertes ABT-Wachstumsmedium bestehend aus einem Ammoniumsulfatgehalt von 1 - 150 mM, insbesondere 10 - 20 mM, einem Phosphatpuffer zur Beibehaltung des pH-Wertes und zwar
eines pH von 5,8 - 6,5, vorzugsweise 6,2 - 6,5, einem Natriumchloridgehalt von 25 - 1000 mM, vorzugsweise 50 - 250 mM, einem Magnesiumchloridgehalt von 0,05 - 5 mM, vorzugsweise 0,3 - 2 mM, einem Kalziumchloridgehalt von 0,01 - 10 mM, vorzugsweise 0,5 - 2 mM, einem Eisenchloridgehalt von 0,0005 - 1 mM, vorzugsweise 0,005 - 0,01 mM und ggf. einem Mangansulfatgehalt von 0,001 - 10 mM, vorzugsweise 1 - 5 mM.
Prinzipiell können erfindungsgemäß sämtliche Proteine des LEE-Locus bestimmt werden. Es ist jedoch bevorzugt die Proteine des Sekretionsapparates vom Typ III und zwar insbesondere dessen sekretorische Proteine zu bestimmen, wobei die esp-A, esp-B, esp-D, esp-E und/oder esp-F besonders bevorzugt sind. Von den sekretorischen esp-Proteinen ist esp-B wiederum am meisten bevorzugt. Die Proteine des LEE-Locus, insbesondere die esp-Proteine sind bekannt und beispielsweise in F. Ebel et al. Molecular Biology (1998), Sei te 147 - 161 , F. Ebel et al . Infection and immuni ty (1996) , Seite 4472 - 4479, Christina Deibel et al . Molecular Biology (1998), Seite 463 - 474, L. Lai et al . Infection and Immuni ty (1997), Seite 221 - 2217 und B. Macnamara FEMS Microbiology Letters (1998) , Seite 71 - 78 beschrieben. Weitere Untersuchungen an diesen Proteinen sind beispielsweise von R. DeVinney et al . in Cellular and Molecular Life Science (1999), Seite 961 - 976, C. -Jenkins et al . Journal of Medical Microbiology (2000) , Seite 97-101, M. Fivac et al . Trends in Microbiology (1999), Seite 341 - 343, C. Deibel et al . Molecular Biology (1998), Seite 463 - 474 und B. Macnamara in FEMS Microbiology Letters (1998), Seite 71 - 78 beschrieben. In einzelnen Fällen können zur Absicherung des Nachweises auch noch andere für die enteropathogenen E.coli typischen Toxine, Proteine und/oder serotypische Epitope nachgewiesen werden. Bislang hat es sich jedoch als nicht notwendig erwiesen, da der erfindungsgemäße Nachweis sehr zuverlässig ist.
Der erfindungsgemäße Nachweis der entsprechenden Proteine des LEE-Locus erfolgt mittels bekannter Methoden, insbesondere mittels einer Gel- vorzugsweise einer SDS-Elektrophorese und vor allem mittels immunologischer Methoden. Unter den immunologischen Methoden sind klassische ELISA und RIA, neue Methoden wie Fluoreszenz-Korrelation-Spektroskopie, Antikörper-PCR etc., sowie moderne Biosensoren bevorzugt. Hierzu gehören am- perometrische, potentiometrische, ionenselektive oder photometrische Sensoren ebenso, wie Feldhalbleiterelektroden wie Feldeffektortransitoren (FET) , chemosensitive Feldeffektortransistoren (CHEMFET) , Suspended-gate-Feldeffektransistoren
(SGFET) oder ionensensitive Feldtransistoren, wie sie beispielsweise zusammenfassend in E.A.H. Hall und G. Hummel in "Biosensoren" Springer Verlag Heidelberg, Deutschland (1975) beschrieben sind. Weitere ionenselektive Feldeffekttransistoren und optische Detektoren sind unter anderem von F. Aberl und H. Wolf in "Aktuelle Trends in der Immunsensorik" , Labor 2000, Seite 70- 96, (1993) beschrieben. Besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren sind piezzoelektrische Schwingquarze und Oberflächenwellenelemente insbesondere Mikrowaagen geeignet. Dabei wird ein primärer Antikörper ein sogenannter Fänger auf einem piezzoelektrischen Substrat immobilisiert und nach der Bindung mit dem zu analysierenden Protein, die Massenänderung gemessen. Solche Sensoren sind beispielsweise von A. Leidel et al . in "Proceedings of the Second International Symposium an Miniaturised Total Analysis System jiTAS" Basel
(1996) beschrieben. Quarzkristallmikrowaagen sind beispielsweise von C. Köstlinger et al . in Fresenius J. Anal.Chem
(1994), Seite 349 - 354 beschrieben.
Bei den erfindungsgemäß ebenfalls besonders bevorzugten ELISA' s wird ein erster Antikörper, der mit einem ersten Epitop des zu analysierenden Proteins bindet, immobilisiert. Nach dem Auftragen der zu analysierenden Lösung werden die aufzufindenden Proteine an diesem ersten Antikörper spezifisch mittels
ihres ersten Epitopes an dem Antikörper spezifisch gebunden und sie können so durch Waschen mit einer Waschlösung vom nicht-interessierenden Proteinrest abgetrennt werden. Wird nun ein zweiter markierter Antikörper zugegeben, der spezifisch mit einem zweiten Epitop des aufzufindenden bzw. zu detektie- renden Proteins bindet, dann läßt sich mittels dem Marker die Anzahl der isolierten bzw. immobilisierten Proteine bestimmen. Derartige Tests und Marker sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise übliche Avidin, Streptavidin/Biotin vermittelte Reaktionen. Es wurde auch gefunden, dass üblicherweise gegen die zuvor genannten E.coli esp-Proteine gerichteten Antikörper nicht mit esp-Proteinen aus Salmonellen kreuzreagieren. Solche Antikörper werden erfindungsgemäß besonders bevorzugt verwendet. Obwohl es erfindungsgemäß auch möglich ist, polyklonale Antikörper zu verwenden, sind monoklonale Antikörper bevorzugt. Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern sind prinzipiell bekannt und werden beispielsweise von Köhler und Milstein in Nature (1975) , 256; Sei te 495 - 497 beschrieben.
Dabei ist es auch möglich nur Teile eines Antikörpers zu verwenden, insbesonders Antigen-bindende Teile, sofern diese zum immunologischen Nachweis einsetzbar sind. Die erfindungsgemäß zu verwendenden Antikörper sind auf an sich bekannte Weise erhältlich. Dabei werden sezernierte oder rekombinante Esp l s aus EHEC-Kulturüberstand durch Präzipitation mit z.B. Trichlores- sigsäure oder Polyethylenglycol gewonnen und anschliessend in einem Puffer/Adjuvans -Gemisch solubilisiert . Danach wird ein Versuchstier mit den so erhaltenen Esp ' s bzw. mit Bruckstücken davon, welche die entsprechenden Epitope aufweisen, immunisiert und die gebildeten Antikörper isoliert . Die genetische Information für diese speziellen Antikörper kann bei Bedarf gentechnisch manipuliert werden, um die Funktionalität der gebildeten Antikörper zu optimieren (z.B. rekombinante Antikörper, „ Single- chain" -Antikörper) . Zur weiteren Optimierung der
Funktionalität können die gebildeten Antikörper mit anderen Molekülen konjugiert werden (z.B. Biotin, Enzyme). Die hierzu erforderliche Methodik ist bekannt und in der allgemein zugänglichen Fachliteratur beschrieben.
Vorzugsweise werden jedoch nach der Methode von Köhler, Mil- stein (Nature 256, 495-497 (1975)) erhältliche monoklonale Antikörper verwendet. Dabei werden beispielsweise BALB/C- Mäuse mit dem beschriebenen Proteingemisch immunisiert und die Milzzellen dieser Tiere mit einer Myelomazelllinie, beispielsweise die bei der DSMZ hinterlegten (SP2/0-AG14) ACC146, sowie ACC43 (X63AG8.653) fusioniert. Die in den As- cites bzw. Kulturüberstand sezernierten Antikörper werden, beispielsweise im Western Blot und/oder ELISA, auf ihre Spe- zifität getestet und isoliert. Üblicherweise gehören die so erhaltenen Antikörper zur Klasse IgGl oder IgG2.
Dabei ist die DSMZ-ACC146 (SP2/0-AG14) ein Hybrid zwischen BALB/c-Milzzellen und my-Zellen. Sie werden als nicht synthetisierend oder sekretierend beschrieben und sind resistent gegenüber 20 μg/ml Azaguanin. Sie weisen eine einzelne in Suspension rundzellige Morphologie auf und werden in 92,5 % Is- cove's MDM mit 7,5 % FCS um 2 mM L-Glutamin bei 37°C und 7,5 % C02 gehalten. Die X63 AG8.653-Zellen sind Mau≤-Myelomazellen, die von einem nicht sekretierenden Klon von P3-X63AGB, der als Fusionspartner zur Herstellung von Hybridomas beschrieben ist, erhalten werden. Bei diesen Zellen handelt es sich um Zellen mit einer einzelnen runden großzelligen Morphologie in Suspension, die in 90 % Dulleccon's MEM oder RPMI 1640 + 10 % FCS bei 37°C mit 5 % C02 gehalten werden.
Erfindungsgemäß bevorzugte Antikörper werden aus den Hybri- domazelllinien B-289 mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2492 sowie B-292 mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2493 erhalten.
Zur Herstellung der Hybridomazeillinien wurden, wie bei Köhler und Milstein (s. o.) beschrieben, Mäuse mit den esp- Proteinen immunisiert und deren Milzzellen mit einer Melomazelllinie X63AG8.653 fusioniert. Diese Melomazelllinien sind bei anerkannten Hinterlegungsstellen, die beispielsweise der DSMZ in Braunschweig, Deutschland, oder bei der ATCC, USA, käuflich erhältlich. Die so erhaltenen Zellen wurden auf RPMI-1640 Medium mit 10% FCS bei 37°C und 5% C02 ggf. im Beisein von 1% Glutamin und Penicillin/Streptomycin kultiviert, auf Antikörper produzierende Stämme selektioniert und die Antikörper auf Bindungfähigkeit mit esp-Proteinen getestet. Auf dieser Weise wurden die zuvor genannten Zelllinien erhalten, welche monoklonale Antikörper produzieren, die spezifisch gegen esp-B-Proteine der von enterohämorrhagische E. Coli-Zellen gerichtet sind.
Die verschiedenen, mit den hergestellten Antikörpern reagierenden Proteine wurden auf SDS-Gelen voneinander getrennt, durch ein Elektroblot-Verfahren auf eine Polyvinylidendiflu- oridmembran übertragen (dem Fachmann als Western-Blot bekannt) und durch N-terminale Proteinsequenzierung (dem Fachmann als Edman-Abbau bekannt) identifiziert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ganz besonders zur Durchführung an Stuhlproben geeignet. Dort liegt häufig nur 1 pathogener E.coli-Keim gegenüber 200 - 300 normalen nicht pa- thogenen E . coli-Keimen vor, wodurch dessen Nachweis außerordentlich erschwert wird.
Die Erfindung betrifft auch einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein derartiger Testkit enthält einen, an einer festen Phase immobilisierten ersten Antikörper der mit einem ersten Epitop eines aufzufindenden Proteins des LEE-Locus reagiert. Als feste Phase dient im erfindungsgemäßen Test vorzugsweise einer der zuvor genannten biologischen Sen-
soren, wie Quarzkristallmikrowaagen, Halbleiterelektroden oder auch Mikrotitterplatten, Chips, insbesonders Si02-Chips, Glas- beads, Membranen etc. In diesem Fall wird die Bindung des zu bestimmenden Proteins an den Antikörper mittels physikalischer Methoden nachgewiesen.
Im Fall des klassischen Immunassays ist der Antikörper insbesondere an die Wände eines Näpfchens von Mikrotiterplatten gebunden. In diesem Fall wird mindestens ein weiterer mit dem aufzufindenden Protein spezifisch und selektiv bindender ggf. markierter Antikörper zum Nachweis des Proteins benötigt. Vorzugsweise ist jedoch auch der zweite Antikörper nicht markiert und der erfindungsgemäße Testkit enthält weitere enzymmarkierte Antikörper, welche an den zweiten Antikörper des Testkits binden.
Die Erfindung soll an den folgenden Beispielen erläutert werden.
Beispiel :
Vom Stuhl eines erkrankten Patienten wurde jeweils eine Probe entnommen und in einer Kultur (Flüssigkultur) in einem modifizierten ABT-Medium über Nacht geschüttelt. Das Medium enthielt 2 mg/ml (NH4)2S04, 3 mg/ml Na2HP04, 3 mg/ml KH2P04, 3 mg/ml NaCl, 1 MM MgCl2, 0,1 mM CaCl2, 0,01 MM FeCl3, 0,2 (W/V) Glukose sowie 0,025 mg/ml Thiamin. Die Kultivationstemperatur betrug 37°C. Danach wurden die Bakterienzellen abzentrifugiert und die zu bestimmenden Proteine durch einen Zellaufschluß mittels Detergentien insbesondere CHAPS (1%) extrahiert. Anschließend wurde die espB-Konzentration im Extrakt wie folgt mittels eines ELISA's bestimmt.
Der Extrakt wird 1:2 in PBS / 0,1% TWEEN-20 verdünnt. Eine mit Primärantikörper gegen esp-B beschichtete ELISA-Platte wird auf Raumtemperatur gebracht. Danach wird die Platte mit 50 μl
Extrakt pro Vertiefung beschickt und 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wird die Platte 3 x mit PBS / 0,1 % TWEEN-20 gewaschen (200 μl pro Vertiefung) und dann mit einem biotinylierten anti espB Antikörper (400 μg/ml; 50 μl pro well) für 1 h bei RT inkubiert. Danach wird die Platte nochmals 3 x mit PBS / 0,1 % TWEEN-20 gewaschen (200 μl pro Vertiefung) und schließlich wird mit löslichem Streptavi- din-Meerrettichperoxidase-Konjugat (1:400 verdünnt; 50 μl pro well) für 1 h bei RT inkubiert.
Anschließend wird wiederum 3 x mit PBS / 0,1 % TWEEN-20 gewaschen (200 μl pro Vertiefung) und dann mit gebrauchsfertiger Substratlösung (100 μl pro Vertiefung) für 60 min. inkubiert.
Danach wird die Farbentwicklung durch zupipettieren von alkalischem Puffer (100 μl/well) gestoppt und photometrisch die Extinktion bei 405 nm (5 - 30 min. nach Zugabe der Stopplösung) gegen eine Referenzwellenlänge von 492 nm gemessen.
Als Vergleichstest wurde das Shiga-Toxin I und II-Gen (STX) und das Hämolysin-Gen (hly) mittels PCR bestimmt. Die Ergebnisse waren wie folgt :
Auswertung
Weitere 30 Proben wurden übereinstimmend mit allen 3 Testmethoden negativ gemessen.
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