ES2236761T3 - Metodo para proteger plantas de cultivo contra plagas de insectos. - Google Patents

Metodo para proteger plantas de cultivo contra plagas de insectos.

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA CONTROLAR ESPECIES DE SESAMIA EN PLANTAS DE CULTIVO, PERO EN ESPECIAL EN EL MAIZ Y OTRAS PLANTAS CEREALES, INCLUYENDO PERO SIN LIMITARSE A SESAMIA NONAGRIOIDES, S. INFERENS, S. CALAMISTIS, S. CRETICA, ETC., QUE INCLUYE APLICAR UNA PROTEINA DE TOXINA DE BACILLUS THURINGIENSIS A LA PLANTA DE CULTIVO QUE VA A SER PROTEGIDA. LA TOXINA ES PREFERIBLEMENTE CRYLA(B), UNA PROTEINA INSECTICIDA VEGETATIVA (VIP), O UNA MEZCLA DE LAS MISMAS.

Description

Método para proteger plantas de cultivo contra plagas de insectos.
La presente invención se refiere a un método para reprimir la especie Sesamia en plantas de cultivo mediante el uso de proteínas de toxina que pueden obtenerse del Bacillus thuringiensis y/o de otras especies de Bacillus.
El Bacillus thuringiensis pertenece al gran grupo de bacterias gram-positivas, aerobias, formadoras de endosporas. A diferencia de otras especies de Bacillus muy estrechamente relacionadas, tales como B. cereus o B. anthracis, la mayoría de las especies de Bacillus thuringiensis conocidas hasta ahora producen en el curso de su esporulación un cuerpo de inclusión parasporal que, a causa de su estructura cristalina, generalmente se denomina también cuerpo cristalino. Este cuerpo cristalino está compuesto por pro-toxoproteínas cristalinas con actividad insecticida, las llamadas \delta-endotoxinas.
Estos cristales de proteína son responsables de la toxicidad del Bacillus thuringiensis para los insectos. La \delta-endotoxina no muestra su actividad insecticida hasta después de la ingestión oral del cuerpo cristalino, cuando éste se disuelve en el jugo intestinal de los insectos diana. En la mayor parte de los casos, el componente tóxico real se libera de la protoxina como consecuencia de la segmentación proteolítica producida por la acción de proteasas del tubo digestivo de los insectos.
Las \delta-endotoxinas de las diversas cepas de Bacillus thuringiensis se caracterizan por una elevada especificidad hacia determinados insectos diana, especialmente con respecto a varias larvas de lepidópteros, coleópteros y dípteros, y por un alto grado de actividad frente a tales larvas susceptibles. Otra ventaja del uso de \delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis reside en el hecho de que las toxinas son inocuas para las personas, otros mamíferos, aves y peces.
Las diversas proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis han sido clasificadas basándose en su espectro de actividad y similitud de secuencias. La clasificación desplegada por Höfte y Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242-255 (1989) puso las proteínas cristalinas insecticidas entonces conocidas en cuatro clases principales. Generalmente, las clases principales se definen por su espectro de actividad, siendo las proteínas CryI activas frente a lepidópteros, las proteínas CryII activas frente a lepidópteros y a dípteros, las proteínas CryIII activas frente a coleópteros y la proteínas CryIV activas frente a dípteros.
Dentro de cada clase principal, las \delta-endotoxinas se agrupan de acuerdo con la similitud de secuencia. Las proteínas CryI son producidas típicamente como proteínas protoxina de 130-140 kDa, que son segmentadas protelíticamente para producir toxoproteínas con actividad insecticida con un tamaño de aproximadamente 60-70 kDa. La porción activa de la \delta-endotoxina reside en la porción NH_{2}-terminal de la molécula de longitud completa. Höfte y Whiteley, supra, clasificaron en seis grupos las proteínas CryI entonces conocidas, IA(a), IA(b), IA(c), IB, IC y ID. Desde entonces, también se han caracterizado las proteínas clasificadas como CryIE, CryIF, CryIG, CryIH y CryIX.
El espectro de la actividad insecticida de una \delta-endotoxina individual procedente de Bacillus thuringiensis tiende a ser más bien estrecho, siendo una \delta-endotoxina dada activa solamente frente a unos pocos insectos. La especificidad es la consecuencia de la eficiencia de los diversos pasos implicados en la producción de una toxoproteína activa y su subsiguiente capacidad para interaccionar con la células epiteliales en el tubo digestivo de los insectos.
Hasta ahora no ha sido publicada tal actividad para especies del género de lepidópteros Sesamia, que causan daños considerables en cosechas de cereales, especialmente en el hemisferio sur, incluyendo el área mediterránea. Las pérdidas de rendimiento ocasionadas por especies Sesamia en el maíz están en el intervalo de 5% a 10%, pero pueden llegar hasta el 40% en casos graves. En cambio, en la técnica se ha creído que las toxinas Bt tales como las toxinas del tipo CryI mencionadas antes, no son activas frente a especies Sesamia y no pueden usarse adecuadamente para reprimir las plagas de Sesamia en plantas de cultivo.
Por consiguiente, uno de los objetos de la invención es proporcionar un método para reprimir especies de Sesamia en plantas de cultivo, pero preferentemente en maíz y otras plantas de cereales, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, Sesamia nonagrioides, S. interferens, S. calamistis, S. cretica, etc. Este objetivo pudo conseguirse sorprendentemente dentro del alcance de la invención aplicando una proteína \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis a la planta de cultivo que se desea proteger. En particular, puede usarse una clase de proteínas de toxina que pueden obtenerse a partir de cultivos vegetativos de especies de Bacillus, los llamados VIPs, incluyendo VIP1, VIP2 y VIP3 [documento EP-A 0 690 916; solicitud internacional nº EP 95/03826, cuya descripción se incorpora al presente texto como referencia en su totalidad], en un método de acuerdo con la invención para reprimir plagas de Sesamia.
La presente invención se refiere entonces a un método para proteger las plantas contra los daños causados por especies de Sesamia, que comprende administrar directa o indirectamente a la planta o a la semilla de la planta o a la zona de crecimiento que se ha de proteger, una toxoproteína de Bacillus spp., preferentemente una proteína del tipo VIP mencionado anteriormente, bien sea pura o en forma de una composición entomicida que comprende al menos una de dichas proteínas o un microorganismo, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis y/o Bacillus cereus, que contiene al menos un gen de toxina que codifica dichas toxoproteínas. Dichos microorganismos usados en un método de acuerdo con la presente invención pueden ser o bien cepas de origen natural o, en la alternativa, una cepa recombinante que comprende el DNA que codifica la toxina en forma recombinante.
En otra realización, puede usarse una planta transgénica según la invención en un método para proteger las plantas frente a los daños causados por especies de Sesamia, que comprende transformar dicha planta con un gen de toxina que codifica una toxoproteína procedente de una especie Bacillus, pero especialmente una proteína del tipo VIP o una proteína del tipo VIP y una proteína del tipo CryI, y expresar dicha toxoproteína en una cantidad suficiente para proporcionar la represión frente a especies de Sesamia al plantar la planta así transformada dentro de un área en la que podría aparecer dicha plaga de insectos.
Se conocen genes del tipo CryA a partir de varias especies de Bacillus thuringiensis incluyendo, pero sin limitarse a ellas, Bt kurstaki HD1 [cry IA(a); Schnepf et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6264-6272], Bt subsp berliner [cry IA(b); Wabiko et al. (1986) DNA 5, 305-314; Höfte et al. (1986) Eur J Biochem 161, 273-280]; Bt subsp kurstaki HD-73 [cry IA(c); Adang et al. (1985) Gene 36, 289-300], Bt HD2 [cry IB; Brizzard et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 2723-2724], Bt subsp entomocidus [cryIC; Honee et al. (1988) Nucl. Acids. Res. 16, 6240], Bt subsp aizawai [cry IC, cryID; cryIF; cryIX; Sanchis et al. (1988), EP-A 0 295 156; Gawron-Burke et al. (1991), WO 91/16434], Bt subsp darmstadiensis [cry IE; Hofte y Whiteley (1989), EP-A 0 358 557], y Bt subsp kenyae [cryIE; Visser et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 6783-6788; Kramer et al. (1995, WO 95/34656]. Otros genes del tipo de cryI se describen en la solicitud europea 0 367 474, 0 401 979 y en la solicitud internacional PCT WO 90/13651. Son preferidos para su uso dentro del alcance de la presente invención los productos de expresión de genes del tipo cryIA, pero especialmente de genes del tipo cryIA(b) tales como los derivados de Bacillus thuringiensis var. kurstaki o de variantes sintéticas de los mismos. Son especialmente preferidos los genes del tipo cryIA(b) mostrados en las SEQ ID No: 53 a 55.
Las composiciones entomicidas para usar en el método según la invención para proteger plantas de cultivo frente a plagas de Sesamia comprenden preferentemente como ingrediente activo al menos una toxoproteína procedente de Bacillus thuringiensis o un microorganismo que contiene al menos un gen que codifica dicha toxoproteína, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis que contiene al menos un gen que codifica dicha toxoproteína, o un derivado o mutante del mismo, junto con coadyuvante agrícola tal como un vehículo, diluyente, tensioactivo o coadyuvante para favorecer la aplicación. El ingrediente activo contenido en la composición entomicida puede ser una toxoproteína de tipo VIP como se describe en la solicitud europea EP-A 0 690 916 y la solicitud internacional PCT nº EP 95/03826 o un microorganismo que contiene al menos un gen que codifica dicha toxoproteína del tipo VIP o una combinación de proteínas del tipo CryI y del tipo VIP, bien sea en forma esencialmente pura o como parte de un microorganismo. En el alcance de la invención de esta solicitud se incluyen proteínas del tipo VIP como se muestran en las SEQ ID No: 1, 2, 4 a 7, 17 a 24, 26 a 32, 35, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 49, 50, 51 ó 52.
La composición puede contener también otro compuesto biológicamente activo. Dicho compuesto puede ser un fertilizante o donador de micronutrientes u otros preparados que influyen sobre el crecimiento de la planta. También puede ser un agente selectivo herbicida, insecticida, funguicida, bactericida, nematicida, moluscicida, o mezclas de varios de estos preparados, si se desea, junto con otros vehículos, agentes tensioactivos o coadyuvantes para facilitar la aplicación aceptables en agricultura, empleados habitualmente en la técnica de la formulación. Los vehículos y coadyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias empleadas normalmente en la tecnología de la formulación, p. ej. sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes.
La composición puede comprender de 0,1 a 99% en peso del ingrediente activo, de 1 a 99,9% en peso de un coadyuvante sólido o líquido, y de 0 a 25% en peso de un agente tensioactivo. El ingrediente activo, o la composición que contiene dicho ingrediente activo, pueden ser administrados a las plantas o cultivos que se han de proteger junto con otros determinados insecticidas o productos químicos [1993 Crop Protection Chemicals Reference (Referencia de productos Químicos para la Protección de Cultivos, de 1991), Chemical and Pharmaceutical Press, Canadá] sin perder potencia. Es compatible con la mayoría de los otros productos para pulverización agrícola usados normalmente, pero no debe usarse en soluciones para pulverización excesivamente alcalinas si interviene una toxina de tipo CryI. Puede administrarse en forma de polvo fino, suspensión, polvo humectable o en cualquier otra forma de material adecuado para la aplicación agrícola.
El ingrediente activo, que es preferentemente una proteína del tipo VIP mencionada anteriormente, o la composición que comprende dicho ingrediente activo, puede aplicarse (a) a un entorno en el que puede aparecer la plaga de insectos, (b) a una planta o a parte de una planta con el fin de proteger dicha planta o parte de la planta del daño causado por una plaga de insectos, o (c) a una semilla, con el fin de proteger una planta que se desarrolla a partir de dicha semilla del daño causado por una plaga de insectos.
Un método de aplicación preferido en la zona de la protección de las plantas es la aplicación a las hojas (aplicación foliar), dependiendo el número de aplicaciones y la tasa de aplicación, de la planta a proteger y del riesgo de infestación por la plaga en cuestión. Sin embargo, el ingrediente activo puede también penetrar en las plantas a través de las raíces (acción sistémica) si el lugar de las plantas es impregnado con una formulación líquida o si el ingrediente activo es incorporado en forma sólida en el lugar de las plantas, por ejemplo en el terreno, p. ej. en forma granular (aplicación al terreno). En cultivos de arroz, tales gránulos pueden aplicarse en cantidades dosificadas al arrozal anegado.
Las composiciones a usar en un método de acuerdo con la invención son también adecuadas para proteger material de propagación de plantas, p. ej. las semillas, tal como frutos, tubérculos o granos, o esquejes de plantas, de plagas de insectos. El material de propagación puede tratarse con la formulación antes de plantar; la semilla, por ejemplo, puede ser tratada antes de la siembra. El ingrediente activo de la invención puede aplicarse también a granos (recubrimiento), bien sea impregnando los granos con una formulación líquida o recubriéndolos con una formulación sólida. La formulación puede aplicarse también al sitio de la plantación cuando el material de propagación se está plantando, por ejemplo en los surcos de la arada durante la siembra. La invención se refiere también a los métodos de tratar material de propagación de plantas y al material de propagación de plantas así tratado.
Dentro del alcance de la invención las composiciones pueden aplicarse en cualquier método conocido para el tratamiento de semillas o terreno con cepas bacterianas. Por ejemplo, véase la patente de EE.UU. nº 4.863.866. Las cepas son eficaces para el biocontrol incluso aunque el microorganismo no esté vivo. Sin embargo, se prefiere la aplicación al microorganismo vivo.
Los cultivos diana a proteger dentro del alcance de la presente invención son aquellos que son plantas hospedadoras para especies Sesamia, entre las que se incluyen, pero sin limitarse a ellas, las siguientes especies de plantas: maíz, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo, panizo y cultivos relacionados, hierbas forrajeras (dáctilo aglomerado, grama fescue y similares), y caña de azúcar.
El ingrediente activo según la invención puede usarse en forma no modificada o junto con cualquier vehículo adecuado aceptable en agricultura. Tales vehículos son coadyuvantes empleados convencionalmente en la técnica de la formulación agrícola, y por tanto se formulan de manera conocida para formar concentrados emulsionables, pastas para recubrir, soluciones que pueden pulverizarse directamente o que pueden diluirse, emulsiones diluidas, polvos humectables, polvos solubles, polvos finos, granulados, y también encapsulaciones, por ejemplo, en polímeros. Al igual que la naturaleza de las composiciones, los métodos de aplicación tales como pulverización, atomización, espolvoreo, dispersión o vertido, se eligen de acuerdo con el objetivo pretendido y las circunstancias que prevalecen. Tasas de aplicación ventajosas son normalmente de aproximadamente 50 g a aproximadamente 5 kg de ingrediente activo (i.a.) por hectárea ("ha"), preferentemente de aproximadamente 100 g a aproximadamente 2 kg de i.a./ha. Tasas de aplicación importantes son aproximadamente 200 g a aproximadamente 1 kg de i.a./ha y aproximadamente 200 g a aproximadamente 500 g de i.a./ha.
Para el tratamiento de semillas las tasas de aplicación adecuadas son de 0,5 g a 1000 g de i.a. por 100 kg de semillas, preferentemente de 3 g a 100 g de i.a. por 100 kg de semillas, o 10 g a 50 g de i.a. por 100 kg de semillas.
Los vehículos y coadyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias empleadas de ordinario en la tecnología de la formulación, p. ej. sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes. Las formulaciones, es decir las composiciones entomicidas, preparados o mezclas de los mismos con otros ingredientes activos, y, en su caso, un coadyuvante sólido o líquido, se preparan de manera conocida, p. ej. mezclando homogéneamente y/o moliendo los ingredientes activos con diluyentes, p. ej. disolventes, vehículos sólidos y en algunos casos compuestos con actividad superficial (tensioactivos).
Los disolventes adecuados son: hidrocarburos aromáticos, preferentemente las fracciones que contienen de 8 a 12 átomos de carbono, p. ej. mezclas de xileno o naftalenos sustituidos, ftalatos tales como ftalato de dibutilo o ftalato de dioctilo, hidrocarburos alifáticos tales como ciclohexano o parafinas, alcoholes y glicoles y sus éteres y ésteres, tales como etanol, etilenglicol monometil o monoetil éter, cetonas tales como ciclohexanona, disolventes fuertemente polares tales como N-metil-2-pirrolidona, dimetilsulfóxido o dimetilformamida, así como aceites vegetales o aceites vegetales epoxidados tales como aceite de coco o aceite de soja epoxidados; o agua.
Los vehículos sólidos usados, p. ej., como polvos finos y polvos dispersables, son normalmente cargas minerales naturales tales como calcita, talco, caolín, montmorillonita o atapulgita. Para mejorar las propiedades físicas también es posible añadir también ácido silícico altamente disperso o polímeros absorbentes altamente dispersos. Los vehículos adsorbentes granulados adecuados son de tipo poroso, por ejemplo pómez, ladrillo molido, sepiolita o bentonita; y los vehículos no absorbentes adecuados son materiales tales como calcita o arena. Además, puede usarse un gran número de materiales pregranulados de naturaleza orgánica o inorgánica, p. ej. especialmente dolomita o restos vegetales pulverizados.
Dependiendo de la naturaleza de los ingredientes activos a formular, los compuestos con actividad superficial adecuados son agentes tensioactivos no iónicos, catiónicos y/o aniónicos que tienen buenas propiedades emulsionantes, dispersantes y humectantes. Se entenderá también que la expresión "agentes tensioactivos" comprende mezclas de agentes tensioactivos. Los agentes tensioactivos aniónicos adecuados pueden ser tanto jabones solubles en agua como compuestos con actividad superficial sintéticos solubles en agua. Son jabones adecuados las sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos o sales de amonio sustituido o no sustituido, de los ácidos grasos superiores (C_{10}-C_{22}), p. ej. las sales sódicas o potásicas de ácido oleico o esteárico, o de mezclas de ácidos grasos naturales que pueden obtenerse, p. ej., a partir de aceite de coco o aceite de sebo. Otros agentes tensioactivos adecuados son también las salas de metil taurina de ácidos grasos, así como los fosfolípidos modificados y no modificados.
Sin embargo, más frecuentemente se usan los llamados agentes tensioactivos sintéticos, especialmente sulfonatos grasos, sulfatos grasos, derivados sulfonados de bencimidazol o alquilarilsulfonatos. Los sulfonatos o sulfatos grasos están normalmente en forma de sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos o sales de amonio sustituido o no sustituido, y generalmente contienen un radical alquilo C_{8}-C_{22}, que también incluye el resto alquilo de radicales acilo, p. ej. la sal sódica o cálcica de ácido lignosulfónico, de dodecilsulfato o de una mezcla de sulfatos de alcoholes grasos obtenidos de ácidos grasos naturales. Estos compuestos comprenden también las sales de ésteres de ácido sulfúrico y ácidos sulfónicos de aductos de alcohol graso/óxido de etileno. Los derivados sulfonados de bencimidazol contienen preferentemente 2 grupos ácido sulfónico y un radical ácido graso que contiene aproximadamente de 8 a 22 átomos de carbono. Ejemplos de alquilarilsulfonatos son las sales de sodio, calcio o trietanolamina del ácido dodecilbencenosulfónico, ácido dibutilnaftalenosulfónico o de un producto de condensación de ácido naftalenosulfónico/formaldehído. También son adecuados los correspondientes fosfatos, p. ej. sales del éster de ácido fosfórico de un aducto de p-nonilfenol con 4 a 14 moles de óxido de etileno.
Los agentes tensioactivos no iónicos son preferentemente derivados de poliglicol-éter de alcoholes alifáticos o cicloalifáticos, o ácidos grasos saturados o insaturados y alquilfenoles, conteniendo dichos derivados de 3 a 30 grupos glicol-éter y de 8 a 20 átomos de carbono en el resto hidrocarburo (alifático) y de 6 a 18 átomos de carbono en el resto alquilo de los alquilfenoles.
Otros agentes tensioactivos no iónicos adecuados son los aductos solubles en agua de poli(óxido de etileno) con polipropilenglicol, etilendiaminopolipropilen glicol y alquil polipropilen glicol que contiene de 1 a 10 átomos de carbono en la cadena alquilo, los cuales aductos contienen de 20 a 250 grupos etilen glicol éter y de 10 a 100 grupos propilen glicol éter. Estos compuestos contienen normalmente de 1 a 5 unidades de etilen glicol por unidad de propilen glicol. Los ejemplos representativos de agentes tensioactivos no iónicos son nonilfenolpolietoxietanoles, poliglicol éteres de aceite de ricino, aductos de óxido de polietileno/polipropileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilen glicol y octilfenoxipolietoxietanol. Los ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, tales como el trioleato de polioxietilen sorbitán, son también agentes tensioactivos no iónicos adecuados.
Los agentes tensioactivos catiónicos son preferentemente sales de amonio cuaternario que contienen, como sustituyente N, al menos un radical alquilo C_{8}-C_{22} y, como otros sustituyentes, radicales alquilo inferior no sustituidos o halogenados, bencilo o hidroxi-alquilo inferior. Las sales están preferentemente en forma de haluros, metilsulfatos o etilsulfatos, p. ej. cloruro de esteariltrimetilamonio o bromuro de bencidil-(2-cloroetil)etilamonio.
Los agentes tensioactivos que suelen emplearse en la técnica de la formulación se describen, p. ej., en "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publishing Corp. Ridgewood, N.J., 1979; Dr. Helmut Stache, ``Tenside Taschenbuch (Manual de Agentes Tensioactivos), Carl Hanser Verlag, Munich/Viena.
Otra característica particularmente preferida de una composición entomicida de la presente invención es la persistencia del ingrediente activo cuando se aplica a plantas y terreno. Las posibles causas para la pérdida de actividad incluyen la inactivación por la luz ultravioleta, el calor los exudados foliares y el pH. Por ejemplo, a pH elevado, particularmente en presencia de reductores, los cristales de \delta-endotoxina se solubilizan y se hacen así más sensibles a la inactivación proteolítica. Un pH foliar elevado puede ser también importante, en particular cuando la superficie de la hoja puede estar en el intervalo de pH 8 a 10. La formulación de una composición entomicida para ser usada en el método de acuerdo con la presente invención puede enfrentarse a estos problemas incluyendo aditivos para prevenir la pérdida de ingrediente activo o bien encapsulando el material de manera tal que el ingrediente activo esté protegido frente a la desactivación. La encapsulación puede realizarse químicamente (McGuire y Shasha, J. Econ. Entomol. 85: 1425-1433, 1992) o biológicamente (Barnes y Cummings, 1986; EP-A 0 192 319). La encapsulación química implica un procedimiento en el que el ingrediente activo se recubre con un polímero, mientras que la encapsulación biológica implica la expresión de los genes de la \delta-endotoxina en un microbio. Para la encapsulación biológica, el microbio intacto que contiene la toxoproteína se usa como ingrediente activo en la formulación. La adición de protectores de UV puede reducir eficazmente el daño por irradiación. La inactivación debida al calor puede controlarse también incluyendo un aditivo apropiado.
Dentro de la presente solicitud se prefieren formulaciones que comprenden microorganismos vivos como ingrediente activo, bien sea en forma de célula vegetativa o, más preferentemente, en forma de esporas, si está disponible. Las formulaciones adecuadas pueden consistir, por ejemplo, en geles polímeros que están reticulados con cationes polivalentes y comprenden estos microorganismos. Esto ha sido descrito, por ejemplo, por D. R. Fravel et al. en Phytopathology, Vol. 75, nº 7, 774-777, 1985, para alginato como material polímero. Por esta publicación se sabe también que pueden usarse conjuntamente materiales vehículo. Estas formulaciones, por regla general, se preparan mezclando soluciones de polímeros formadores de geles de origen natural o sintéticos, por ejemplo alginatos, y soluciones salinas acuosas de iones de metales polivalentes de manera que formen gotículas individuales, siendo posible que los microorganismos se suspendan en una de las dos soluciones de reacción, o en ambas. La formación de gel comienza con el mezclado en forma de gota. Es posible el subsiguiente secado de estas partículas de gel. Este proceso se llama gelificación ionotrópica. Dependiendo del grado de secado, se forman partículas compactas y duras de polímeros que están estructuralmente reticulados por medio de cationes polivalentes y comprenden los microorganismos y un vehículo presente distribuido de forma predominantemente uniforme. El tamaño de las partículas puede ser de hasta 5 mm.
Composiciones basadas en polisacáridos parcialmente reticulados que, además de un microorganismo, pueden comprender también, por ejemplo, ácido silícico finamente dividido como material vehículo, teniendo lugar la reticulación, por ejemplo, por medio de iones Ca^{++}, se describen en el documento EP-A1-0 097 571. Las composiciones tienen una actividad de agua no superior a 0,3. W. J. Cornick et al. describen en un trabajo de revisión [New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppresing Agricultural Pests and Diseases, páginas 345-372, Alan R. Liss, Inc. (1990)] varios sistemas de formulación, gránulos con vermiculita como vehículo y esferas compactas de alginato preparadas mediante el proceso de gelificación ionotrópica que se ha mencionado. Tales composiciones se describen también por D. R. Fravel en Pesticide Formulations and Application Systems: 11º volumen, ASTM STP 1112 American Society for Testing and Materials, Filadelfia, 1992, páginas 173 a 179, y pueden usarse para formular los microorganismos recombinantes de acuerdo con la invención. Otros métodos para formular microorganismos vivos se describen en el documento WO 96/02638.
Las composiciones entomicidas para usar en un método de acuerdo con la invención contienen normalmente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 99%, preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 95%, y lo más preferentemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 90%, del ingrediente activo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 99,9%, preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 99%, y lo más preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 95% de un coadyuvante sólido o líquido, y de aproximadamente 0 a aproximadamente 25%, preferentemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 25%, y lo más preferentemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20% de un agente tensioactivo.
Aunque los productos comerciales se formulan preferentemente como concentrados, el usuario final empleará normalmente formulaciones diluidas de concentración sustancialmente más baja. Las composiciones entomicidas pueden contener también otros ingredientes tales como estabilizantes, antiespumantes, reguladores de la viscosidad, aglutinantes, agentes de pegajosidad, así como fertilizantes u otros ingredientes activos con el fin de obtener efectos especiales.
Sorprendentemente se ha encontrado que una combinación variable cuantitativamente de dos ingredientes activos, por una parte una proteína de tipo Cry o \delta-endotoxina y por otra parte una proteína de tipo VIP, muestra una acción sinérgica que es ventajosamente adecuada para controlar especies de Sesamia en plantas de cultivo y que extiende los límites de la acción de ambas toxoproteínas desde dos puntos de vista:
En primer lugar, las tasas de aplicación del compuesto de la toxoproteína tipo Cry y de las proteínas tipo VIP se reducen, al tiempo que mantienen una acción igualmente buena. En segundo lugar, la mezcla combinada alcanza también un grado elevado de represión de plagas cuando las dos sustancias individuales se han hecho completamente ineficaces al haberse aplicado tasas indebidamente bajas. Esto permite una mayor seguridad en su uso.
Las composiciones según la invención son valiosas para el tratamiento preventivo y/o curativo en el campo de la represión de plagas, incluso a bajas tasas de aplicación, al mismo tiempo que son bien toleradas, y no son tóxicas para ellas, por las especies de sangre caliente, peces y plantas, y tienen un espectro biocida muy favorable. Las composiciones según la invención son activas frente a todas las plagas o todos los estadíos de desarrollo individual de especies de Sesamia. La acción insecticida de los compuestos según la invención puede hacerse evidente bien sea directamente, es decir, destruyendo las plagas inmediatamente, o solamente después de haber pasado un cierto tiempo.
En consecuencia, la invención se refiere además a una composición insecticida que comprende, como ingrediente activo, una toxoproteína de tipo Cry y una proteína de tipo VIP, preferentemente en una cantidad sinérgicamente efectiva junto con un vehículo aceptable en agricultura. Se prefiere una composición que comprende una combinación de una proteína de tipo CryI y una proteína de tipo VIP.
Un efecto sinérgico está siempre presente cuando la acción de la combinación del ingrediente activo de la toxoproteína de tipo Cry con las proteínas de tipo VIP excede del total de la acción de los ingredientes activos aplicados individualmente. Sin embargo, no se han de aplicar solamente medios cuantitativos para evaluar una actividad sinérgica, sino también medios cualitativos tales como, por ejemplo, una ampliación del espectro de actividad.
Dicha composición puede proporcionarse en forma de mezcla química que comprende las toxoproteínas en forma esencialmente pura o en forma de una mezcla que comprende al menos una de las toxoproteínas como parte de un microorganismo o planta transgénica.
En una realización específica de la invención, uno de los ingredientes activos puede aplicarse a la planta directamente, por ejemplo, mediante aplicación foliar como se ha descrito antes en el presente texto, mientras que el segundo principio activo puede ser proporcionado por la propia planta en la expresión de un gen previamente transformado, que codifica dicho segundo principio activo.
Otro objeto de la invención se refiere al uso de un microorganismo recombinante que comprende un gen de toxina que codifica una toxoproteína de Bacillus thuringiensis en un método para controlar plantas de cultivo frente a los daños causados por especies de Sesamia, el cual microorganismo recombinante puede ser aplicado directamente a la planta que se ha de proteger, o bien la toxoproteína producida de manera recombinante puede ser primero aislada del microorganismo recombinante y formulada de la manera anteriormente descrita antes de ser aplicada a la planta de cultivo que se desea proteger. El microorganismo recombinante puede contener un gen de toxina que codifica una toxoproteína de tipo VIP como se describe en la solicitud europea A 0 690 916 y la solicitud internacional PCT nº EP 95/03826, o una combinación de genes que codifican al menos una toxina de tipo Cry y una toxina de tipo VIP, respectivamente.
Para la producción recombinante de la toxoproteína en un organismo hospedador, la secuencia codificadora puede ser insertada en una casete de expresión diseñada para el hospedador elegido, e introducida en el hospedador en el que se produce de forma recombinante. La elección de las secuencias reguladoras específicas tales como promotor, secuencia señal, secuencias no traducidas 5' y 3', y potenciador apropiado para el hospedador elegido, está dentro del nivel de conocimientos de un profesional de la técnica. La molécula resultante, que contiene los elementos individuales unidos en el marco de lectura apropiado, pueden ser insertados en un vector capaz de ser transformado en la célula hospedadora. Los vectores de expresión y métodos adecuados para la producción recombinante de proteínas son bien conocidos para organismos hospedadores tales como E. coli (véase, p. ej., Studier y Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986); Brosius, DNA 8: 759 (1989)), levadura (véase, p. ej., Schneider y Guarente, Meth. Enzymol. 194: 373 (1991)) y células de insectos (véase, p. ej., Luckow y Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)). Los ejemplos específicos incluyen plásmidos tales como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) y vectores de expresión de baculovirus, p. ej. los que se derivan del genoma del virus de la polihedrosis nuclear de Autographica californica (AcMNPV). Un sistema de baculovirus/insecto preferido es pVI11392/células Sf21 (Invitrogen, La Jolla, CA).
La toxoproteína producida por técnicas recombinantes puede también ser aislada y purificada usando una diversidad de técnicas estándar. Las técnicas actuales que pueden usarse variarán dependiendo del organismo hospedador usado, si la toxoproteína está diseñada para secreción, y otros factores así, familiares para un profesional experto (véase, p. ej., el capítulo 16 de Ausubel, F. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", publicado por John Wiley and Sons, Inc. (1994).
Otro objeto de la invención se refiere al uso de plantas transgénicas que comprenden y expresan un gen de toxina que codifica una toxoproteína de Bacillus thuringiensis en una cantidad suficiente para proporcionar control frente a especies de Sesamia, en un mátodo para proteger plantas de cultivo frente a los daños causados por plagas de Sesamia. Son especialmente preferidas las plantas transgénicas que expresan un gen de toxina que codifica una proteína de tipo VIP como se describe en el documento EP-A 0 690 916 y la solicitud internacional PCT nº EP95/03826, incorporada al presente texto como referencia en su totalidad. La invención se refiere también al uso de plantas transgénicas que comprenden y expresan un gen de toxina que codifica una toxoproteína de Bacillus thuringiensis, pero especialmente una toxoproteína del tipo Cry, y que también comprenden y expresan un gen de toxina que codifica una proteína de tipo VIP en cantidad suficiente para proporcionar la represión de las especies de Sesamia. Una planta hospedadora que expresa dichos genes de toxina tendrá un resistencia mejorada contra el ataque de insectos de la especie Sesamia y por tanto estará mejor equipada para resistir pérdidas de cosecha asociadas con tal ataque.
En una realización preferida, la expresión de una o más \delta-endotoxinas de Bt en una planta transgénica viene acompañada por la expresión de una o más proteínas de tipo VIP. Esta co-expresión de más de un principio insecticida en la misma planta transgénica puede conseguirse obteniendo por ingeniería genética una planta que contenga y exprese todos los genes necesarios. Alternativamente puede ser modificada genéticamente una planta, planta madre 1, para la expresión de proteínas de tipo VIP. Una segunda planta, planta madre 2, puede ser modificada genéticamente para la expresión de endotoxina \delta de Bt. Cruzando la planta madre 1 con la planta madre 2, se obtienen plantas progenie que expresan todos los genes introducidos en las plantas madre 1 y 2. Las \delta-endotoxinas particularmente preferidas son las descritas en el documento EP-A 0618976, incorporado al presente texto como referencia.
También está comprendido en la presente invención el uso de microorganismos recombinantes o plantas transgénicas que comprenden un gen que codifica moléculas de DNA que se hibridan con una molécula de DNA que codifica una toxoproteína de la especie Bacillus, pero preferentemente con una sonda de oligonucleótido que puede obtenerse de dicha molécula de DNA que comprende una porción contigua de la secuencia codificadora de dicha toxoproteína, de al menos 10 nucleótidos de longitud, bajo condiciones de severidad moderada. La invención comprende preferentemente el uso de microorganismos recombinantes o plantas transgénicas que comprenden un gen que codifica moléculas de DNA que se hibridan con una molécula de DNA que codifica una toxoproteína de Bacillus thuringiensis o B. cereus, especialmente con una molécula de DNA que codifica una toxoproteína de tipo VIP.
Los factores que afectan a la estabilidad de híbridos determinan la severidad de la hibridación. Uno de estos factores es la temperatura de fusión T_{m}, que puede ser calculada fácilmente de acuerdo con la fórmula proporcionada en DNA PROBES, George H. Séller y Mark M. Manak. McMillan Publishers Ltd., 1993, Section one: Molecular Hybridization Technology; p. 8 y sig.
La temperatura de hibridación preferida está en el intervalo de aproximadamente 25ºC por debajo de la temperatura de fusión calculada T_{m}, y preferentemente en el intervalo de aproximadamente 12-15ºC por debajo de la temperatura de fusión calculada T_{m}, y en el caso de los oligonucleótidos en el intervalo de aproximadamente 5-10ºC por debajo de la temperatura de fusión T_{m}.
La invención se refiere además a una bolsa comercial que comprende semillas de una planta transgénica que comprenden al menos un gen de toxina que codifica una toxoproteína de Bacillus thuringiensis, preferentemente una toxoproteína del tipo VIP, y que expresa dicha toxoproteína en una cantidad suficiente para proporcionar la represión de especies de Sesamia, junto con instrucciones etiquetadas para su uso para la represión de plagas de Sesamia en plantas de cultivo. Dentro de esta invención se prefiere una bolsa comercial que contiene semillas de una planta transgénica que comprenden como ingrediente activo un gen que codifica al menos una toxoproteína de tipo Cry y una proteína de tipo VIP, preferentemente en una cantidad sinérgicamente efectiva. Se prefiere especialmente una combinación de una toxoproteína CryA(b) con una proteína de tipo VIP.
El otro objeto de la invención es una bolsa comercial que comprende una composición insecticida de acuerdo con la invención, junto con instrucciones etiquetadas para su uso para la represión de plagas de Sesamia en plantas de cultivo.
Por "planta" se entiende cualquier especie vegetal que puede ser transformada genéticamente por métodos conocidos en la técnica, pero especialmente aquellas plantas que son plantas hospedadoras para la especie Sesamia, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, las siguientes especies de plantas: maíz, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo, mijo y cultivos relacionados, hierbas forrajeras (dáctilo aglomerado, grama fescue y similares), y caña de azúcar.
Los métodos conocidos en la técnica para la transformación de plantas se discuten a continuación. Las plantas hospedadoras incluyen, pero sin limitarse a ellas, las especies previamente listadas como cultivos diana.
Se ha descubierto que el uso de codón de un gen de toxina de Bacillus thuringiensis nativo es significativamente diferente del que es típico de un gen vegetal. En particular, el uso de codón de un gen de Bacillus thuringiensis nativo es muy diferente del de un gen de maíz. Como consecuencia, el mRNA de este gen no puede ser utilizado eficientemente. El uso de codón podría influir sobre la expresión de genes a nivel de traducción o transcripción o procesamiento del mRNA. Para optimizar un gen de toxina para la expresión en plantas, por ejemplo en maíz, el uso de codón se optimiza usando los codones que son los más preferidos en el maíz (codones preferidos del maíz) en la síntesis de un gen sintético que codifica la misma proteína que se encuentra para la secuencia del gen de toxina nativo. El uso de codón preferido del maíz optimizado es efectivo para la expresión de niveles elevados de la proteína insecticida de Bt. Otros detalles para construir genes de toxina sintéticos optimizados en maíz pueden encontrarse en el documento WO 93/07278, incorporado al presente texto como referencia en su totalidad.
Los genes de toxina derivados de microorganismos pueden diferir también de los genes vegetales. Los genes vegetales difieren de los genes encontrados en microorganismos en que su RNA transcrito no posee secuencia definida del sitio de unión con el ribosoma adyacente a la metionina de iniciación. En consecuencia, los genes microbianos pueden potenciarse mediante la inclusión de un iniciador de la traducción de consenso eucariótico en el ATG. Clontech (catálogo de 1993/1994, página 210) ha sugerido la secuencia GTCGACCATGGTC como iniciador de la traducción de consenso para la expresión del gen uidA de E. coli en plantas. Además, Joshi (Nucl. Acids Res. 15: 6643-6653 (1987)) ha comparado muchas secuencias vegetales adyacentes al ATG y sugiere el consenso TAAACAATGGCT. En situaciones en las que se encuentran dificultades en la expresión de ORFs microbianos en plantas, la inclusión de una de estas secuencias en el ATG de iniciación puede mejorar la traducción. En tales casos, los tres últimos nucleótidos del consenso pueden no ser apropiados para la inclusión en la secuencia modificada, debido a su modificación del segundo resto AA. Las secuencias preferidas adyacentes a la metionina de iniciación pueden diferir entre especies vegetales distintas. Examinando la secuencia de genes de maíz presentes en la base de datos GenBank/EML, puede distinguirse qué nucleótidos adyacentes al ATG deben ser modificados para mejorar la traducción del gen de toxina introducido en el maíz.
Además, se ha demostrado que la eliminación de sitios de ayuste ilegítimos puede mejorar la expresión y la estabilidad de los genes introducidos. Los genes clonados a partir de fuentes no vegetales y no optimizados para la expresión en plantas pueden contener motivos que pueden ser reconocidos en plantas como sitios de ayuste 5' o 3'. En consecuencia, el proceso de transcripción puede terminarse prematuramente generando mRNA truncado o borrado. Los genes de toxina pueden ser construidos por ingeniería genética para eliminar estos sitios de ayuste ilegítimos usando los métodos bien conocidos en la técnica.
Es bien sabido que muchas proteínas de \delta-endotoxina procedentes de Bacillus thuringiensis se expresan realmente como protoxinas. Estas protoxinas se solubilizan en el entorno alcalino del intestino del insecto y se convierten proteolíticamente por medio de proteasas en un fragmento nuclear tóxico (Höfte y Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242-255 (1989)). Para proteínas de \delta-endotoxina de la clase CryI, el fragmento nuclear tóxico se localiza en la mitad N-terminal de la protoxina. Está dentro del alcance de la presente invención que los genes que codifican la forma de protoxina de longitud completa o bien el fragmento nuclear tóxico truncado de la nueva toxoproteína, pueden ser usados en vectores de transformación vegetales para conferir propiedades insecticidas a la planta hospedadora.
Las moléculas de DNA recombinante pueden ser introducidas en la célula vegetal en varias formas reconocidas en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que la elección del método podría depender del tipo de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, señalada para la transformación. Los métodos adecuados para la transformación de células vegetales incluyen microinyección (Crossway et al., BioTechniques 4: 320-334 (1986)), electroporación (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606 (1986), transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915-921 (1988)), transferencia directa de genes (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984)) y aceleración de partículas balísticas usando dispositivos disponibles de Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin, y Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (véanse, por ejemplo, Sanford et al., patente de EE.UU. nº 4.945.050 y McCabe et al., Biotechnology 6: 923-926 (1988)). Véanse también Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22. 421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5: 27-37 (1987) (cebolla); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988) (soja); McCabe et al., Bio/Technology 6: 923-926 (1988) (soja); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (arroz); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309 (1988) (maíz); Klein et al., Bio/Technology 6: 559-563 (1988) (maíz); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440-444 (1988) (maíz); Fromm et al., Bio/ Technology 8: 833-839 (1990); y Gordon-Kamm et al., Plant cell 2: 603-618 (1990) (maíz); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530 (1990) (cloroplasto de tabaco); Koziel et al. (Biotechnology 11: 194-200 (1993)) (maíz); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989) (arroz); Christou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991) (arroz); solicitud de patente europea EP 0 332 581 (dáctilo aglomerado y otras Pooideae); Vasil et al. (Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) (trigo); Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993) (trigo); Wan et al. (Plant Physiol. 104: 37-48 (1994) (cebada); Umbeck et al. (Bio/Technology 5: 263-266 (1987) (algodón).
Un conjunto de realizaciones particularmente preferidas para la introducción de moléculas de DNA recombinante en maíz mediante bombardeo con microproyectiles, puede encontrarse en el documento WO 93/07278, incorporado al presente texto como referencia en su totalidad. Otra realización preferida es el método de transformación del protoplasto para maíz, como se describe en la solicitud de patente europea EP 0 292 435, incorporada al presente texto como referencia en su totalidad.
Las propiedades genéticas construidas en las semillas y plantas transgénicas descritas anteriormente se han transmitido por reproducción sexual o crecimiento vegetativo, y por ello pueden mantenerse y propagarse en plantas de la progenie. Generalmente dichos mantenimiento y propagación hacen uso de métodos agrícolas conocidos desarrollados para adaptarse a propósitos específicos tales como labranza, siembra o cosecha. También pueden aplicarse procedimientos especializados tales como tecnologías hidropónicas o de invernadero. Como el cultivo en desarrollo es vulnerable al ataque y a los daños causados por insectos o infecciones, así como a la competencia por malezas, se adoptan medidas para reprimir las malezas, enfermedades de las plantas, insectos nemátodos y otras condiciones adversas para mejorar el rendimiento. Estas incluyen medidas mecánicas tales como labranza del suelo o eliminación de malezas y plantas infectadas, así como la aplicación de productos agrícolas tales como herbicidas, funguicidas, gameticidas, nematicidas, reguladores del crecimiento, agentes de maduración e insecticidas.
El uso de las propiedades genéticas ventajosas de las semillas y plantas transgénicas según la invención puede hacerse también en la reproducción de plantas que tiende al desarrollo de plantas con propiedades mejoradas tales como tolerancia frente a las plagas, herbicidas o estrés, mejora del valor nutricional, aumento del rendimiento, o mejora de la estructura que produce menos pérdidas por encamado o por rotura. Las diversas etapas de la reproducción se caracterizan por una intervención humana bien definida, tal como la selección de las líneas a cruzar, polinización directa de las líneas progenitoras, o selección de las plantas de la progenie apropiadas. Dependiendo de las propiedades deseadas se toman medidas de reproducción distintas. Las técnicas relevantes son bien conocidas en este campo e incluyen, pero sin limitarse a ellas, hibridación, autopolinización, reproducción por retrocruzamiento, reproducción de multilíneas, mezcla de variedades, hibridación interespecífica, técnicas aneuploides, etc. Las técnicas de hibridación incluyen también la esterilización de plantas para obtener plantas estériles masculinas o femeninas, por medios mecánicos, químicos o bioquímicos. La polinización cruzada de una planta estéril masculina con polen de una línea diferente asegura que el genoma de la planta estéril masculina pero fértil femenina obtendrá uniformemente propiedades de ambas líneas progenitoras. Así, las plantas y semillas transgénicas de acuerdo con la invención puede usarse para la reproducción de líneas de plantas mejoradas que, por ejemplo, aumentan la eficacia de métodos convencionales tales como el tratamiento herbicida o plaguicida, o permiten prescindir de tales métodos debido a sus propiedades genéticas modificadas. Alternativamente, pueden obtenerse nuevos cultivos con tolerancia al estrés mejorada que, debido a su "dotación" genética optimizada, dan un producto de cosecha de mejor calidad que los productos que no pudieron tolerar condiciones adversas de desarrollo comparables.
En la producción de semillas, la calidad y uniformidad de germinación de las semillas son características esenciales del producto, mientras que la calidad y uniformidad de la germinación de semillas cosechadas y vendidas por el agricultor no es importante. Como es difícil mantener un cultivo libre de semillas de otros cultivos y malezas, para reprimir enfermedades que van en la semilla y para producir una semilla con buena germinación se han desarrollado prácticas de producción de semillas muy extensivas y bien definidas por los productores de semillas, que han experimentado en la técnica del crecimiento, acondicionamiento y comercialización de semillas puras. Así, es práctica común para el agricultor comprar semilla certificada que cumple unas normas de calidad concretas en vez de usar semillas cosechadas de sus propios cultivos. El material de propagación usado como semillas se trata normalmente con un recubrimiento protector que comprende herbicidas, insecticidas, funguicidas, bactericidas, menaticidas, moluscicidas o mezclas de ellos. Los recubrimientos protectores usados habitualmente comprenden compuestos tales como captano, carboxina, thiram (TMTD®), metalaxil (Apron®) y pirimifos-metilo (Actellic®). Si se desea, estos compuestos se formulan junto con otros vehículos, agentes tensioactivos o coadyuvantes para facilitar la aplicación empleados habitualmente en la técnica de la formulación para proporcionar protección contra los daños causados por plagas bacterianas, fúngicas o animales. Los recubrimientos protectores pueden ser aplicados impregnando el material de propagación con una formulación líquida o recubriendo con una formulación húmeda o seca combinada. También son posibles otros métodos de aplicación tales como el tratamiento directo en los brotes del fruto.
Otro aspecto de la presente invención es proporcionar nuevos métodos agrícolas, tales como los métodos ejemplificados anteriormente, que se caracterizan por el uso de plantas transgénicas, material de plantas transgénicas o semillas transgénicas de acuerdo con la presente invención, para proporcionar la represión contra especies de Sesamia.
Para reproducir progenie a partir de plantas transformadas de acuerdo con el método de la presente invención, puede usarse un método tal como el siguiente: plantas de maíz producidas como se describe en los ejemplos expuestos se desarrollan en tiestos en un invernadero o en el terreno, como se sabe en la técnica, y se permite que florezcan. Se obtiene polen de la espiga macho madura y se usa para polinizar las mazorcas de la misma planta, plantas hermanas o cualquier planta de maíz que se desee. Del mismo modo, la mazorca que se desarrolla en la planta transformada puede ser polinizada por el polen obtenido de la misma planta, plantas hermanas o cualquier planta de maíz que se desee. La progenie transformada obtenida por este método puede distinguirse de la progenie no transformada por la presencia del gen o genes introducidos y/o del DNA que acompaña (genotipo), o el fenotipo conferido. La progenie transformada puede igualmente ser autopolinizada o cruzada con otras plantas, y se hace normalmente con cualquier planta que lleve un rasgo deseado. Del mismo modo, las plantas de tabaco o cualquier otra planta transformada producida por este método, puede ser autopolinizada o cruzada como se sabe en la técnica, con el fin de producir una progenie con las características deseadas. Igualmente, pueden reproducirse otros organismos transgénicos producidos por una combinación de los métodos conocidos en la técnica y esta invención, como se sabe en la técnica, con el fin de producir una progenie con las características deseadas.
Las semillas y plantas así producidas pueden ser introducidas en un esquema de cultivo vegetal diseñado para proteger las plantas de cultivo contra los daños causados por especies Sesamia.
Se sabe hace tiempo que la represión de la segunda generación de especies Sesamia es difícil de conseguir por la aplicación de insecticidas, porque las larvas suelen localizarse en el fondo de la planta desarrollada y son por tanto difíciles de alcanzar pulverizando insecticida. Por ello es aconsejable controlar la población en diapausia en invierno y la primera generación de especies Sesamia en primavera y reducir así la población de la segunda generación de insectos. En invierno, la población en diapausia puede reprimirse volteando la tierra y simultáneamente moliendo los residuos vegetales que quedan (tocones, raíces) después de la cosecha. En primavera, la primera generación puede ser controlada mediante la aplicación de insecticidas. Como resultado, la segunda generación se reduce y puede ser controlada con menor esfuerzo.
Por ello es otro aspecto de la presente invención proporcionar un método agrícola para reprimir la primera y segunda generaciones de insectos Sesamia, el cual método combina los métodos del estado de la técnica con los desarrollados dentro del alcance de la presente invención. En particular, el método agrícola de acuerdo con la invención comprende combinar medios mecánicos, químicos y de ingeniería genética para conseguir una represión plena de Sesamia en plantas de cultivo.
El método agrícola para la represión plena de especies de Sesamia en plantas de cultivo de acuerdo con la invención comprende el uso de semillas o plantas a las cuales se ha aplicado directa o indirectamente, como ingrediente activo, una toxoproteína de una especie de Bacillus, pero preferentemente una toxoproteína del tipo de VIP o una proteína del tipo de VIP y una proteína del tipo de CryI. La aplicación directa de dichas toxoproteínas a la semilla o a la planta puede realizarse tratando dichas semillas o plantas con una composición de acuerdo con la presente invención como se describió anteriormente en el presente texto. Alternativamente, los ingredientes activos pueden aplicarse indirectamente a la semilla o a la planta a proteger, es decir expresando uno o más genes que codifican al menos una toxoproteína del tipo de VIP o una proteína del tipo de VIP y una proteína del tipo de CryI dentro de dicha semilla o planta, preferentemente en una cantidad sinérgicamente efectiva.
La aplicación directa e indirecta de los ingredientes activos de acuerdo con la presente invención puede combinarse de forma que se exprese una proteína de tipo VIP o bien de tipo Cry dentro de la planta, mientras que la otra proteína es aplicada a la planta externamente.
La expresión transgénica de una proteína de tipo VIP o una proteína de tipo VIP y una proteína de tipo Cry dentro de la planta puede también combinarse con un tratamiento químico de dicha planta usando uno cualquiera de los insecticidas aplicados comúnmente.
Por tanto la invención se dirige además a un método agrícola para proteger plantas frente a los daños causados por especies Sesamia, que comprende una combinación de las etapas (2) y (3) con una cualquiera de las etapas (1) o (4):
(1) control de la población en diapausia mediante molienda mecánica de los residuos de las plantas después de la cosecha;
(2) control de la primera generación de especies Sesamia mediante uno de los métodos de acuerdo con la presente invención;
(3) control de la segunda generación de especies Sesamia mediante uno de los métodos de acuerdo con la presente invención;
(4) control de la población en diapausia, la primera y/o la segunda generación tratándolas con un insecticida aplicado comúnmente.
Una realización preferida de la presente invención es el uso de plantas transformadas de acuerdo con la invención en un método agrícola para reprimir las especies Sesamia reduciendo la población de la primera generación, y preferentemente también la población de la segunda generación de las especies Sesamia. También se prefiere la combinación de plantas transgénicas con la aplicación de composiciones que comprenden un compuesto biológico como se define anteriormente o un insecticida aplicado comúnmente.
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Ejemplos
Los ejemplos que siguen describen con más detalle los materiales y métodos usados para llevar a cabo la invención. Se ofrecen a título de ilustración y no de limitación.
Ejemplo 1 Métodos generales
Las manipulaciones del DNA se hicieron usando procedimientos que son normales en la técnica. Estos procedimientos pueden frecuentemente ser modificados y/o sustituidos sin cambiar sustancialmente el resultado. Excepto cuando se indiquen otras referencias, la mayoría de estos productos se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edición, 1989.
Ejemplo 2 Transformación de la planta 2.1. Vector de transformación
La transformación de la planta se realiza usando los vectores de transformación vegetales pCIB 4431 y pCIB 3064, cuya construcción se describe en el documento WO 93/07278 y en Koziel et al. (1993) [Biotechnology Vol. 11, 194-200], cuyas descripciones se incorporan al presente texto como referencia.
pCIB 4431 es un vector diseñado para transformar maíz. Contiene dos genes de endotoxina Bt cryIA(b) sintéticos quiméricos expresables en maíz. Estos genes son el promotor de PEP carboxilasa/cryIA(b) sintético y un promotor de polen/cryIA(b) sintético.
El pCIB 4431 que contiene el gen sintético de cryIA(b) proporcionado como SEQ ID NO:1 fue depositado el 21 de septiembre de 1992 en el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A. bajo el número de entrada NRRL nº B-18998.
El pCIB 3064 contiene un gen bar expresable en plantas (615 pb) que fue originalmente clonado de Streptomyces hygroscopicus [Thompson et al. (1987) EMBO J 6, 2519-2523]. Codifica una fosfinotricina acetiltransferasa (PAT), que confiere tolerancia a la fosfinotricina. El gen bar está bajo el control del promotor CaMV 35S y terminador [OW et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4870-4874] para proporcionar resistencia a la fosfinotricina.
Ejemplo 3 Producción de plantas de maíz transgénicas que contienen el gen sintético CryIA(b) de maíz
El ejemplo que sigue utiliza un dispositivo Biolistic para introducir partículas recubiertas de DNA en células de maíz, a partir de las cuales se generan plantas transformadas.
3.1 Tejido
Embriones de maíz inmaduros, de aproximadamente 1,5 a 2,5 mm de longitud, se escindieron de una mazorca de genotipo 6N615 14-15 días después de la polinización. La planta madre se desarrolló en el invernadero. Antes de la escisión, la mazorca se esterilizó en superficie con Clorox al 20% durante 20 minutos y se aclaró 3 veces con agua estéril. Los embriones individuales fueron puestos en placa con el lado del escutelo hacia arriba en un área de 2 cm cuadrados, 36 embriones para una placa, en el medio de iniciación de callo, medio 2DG4 + 5 clorameben (sales mayoritarias N6, sales minoritarias B5, hierro MS, 2% de sacarosa, con 5 mg/l de chloramben, 20 mg/l de glucosa y adiciones de 10 ml de G4 (Tabla 1) añadidas después de poner en autoclave.
TABLA 1 Adiciones de G4
Ingrediente por litro de medio
Hidrolizado de caseína 0,5 g
Prolina 1,38 g
Acido nicotínico 0,2 mg
Piridoxina\cdotHCl 0,2 g
Tiamina\cdotHCl 0,5 mg
TABLA 1 (continuación)
Ingrediente por litro de medio
Colina\cdotHCl 0,1 mg
Riboflavina 0,05 mg
Biotina 0,1 mg
Acido fólico 0,05 mg
Pantotenato Ca 0,1 mg
Acido p-aminobenzoico 0,05 mg
B12 0,136 \mug
Preparación del DNA para el suministro
El microportador se preparó esencialmente de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el dispositivo Biolistic. Mientras se agitan en vórtice 50 \mul de microportador de oro de 1,0 \mum, se añaden 5 \mul de pCIB 4431 (1,23 \mug/\mul) [nº 898] + 2 \mul de pCIB 3064 (0,895 \mug/\mul) [nº 456], seguido por 50 \mul de CaCl_{2} 2,5 M, y después 20 \mul de espermidina 0,1 M (base libre, calidad TC). La mezcla resultante se agitó en vórtice durante 3 minutos y se microfugó durante 10 segundos. El sobrenadante se retiró y los microportadores se lavaron 2 veces con 250 \mul de EtOH al 100% (calidad para HPLC) agitando en vórtice brevemente, centrifugando y eliminando el sobrenadante. Los microportadores se resuspenden en 65 \mul de EtOH al 100%.
3.3 Bombardeo
El tejido se bombardeó usando el dispositivo Biolistics PDS-1000He. El tejido se puso sobre el estante 8 cm por debajo del estante que tapa la pantalla. El tejido fue disparado una vez con la solución DNA/microportador de oro, 10 \mul secado sobre el macroportador. La pantalla de tapado usada se perforó a mano usando malla de acero inoxidable 10 x 10. Se usaron discos de rotura de 10.700 kN/m^{2}. Después del bombardeo, los embriones se cultivaron en la oscuridad a 25ºC.
3.4 Formación de callo
Los embriones se pasaron a medio para la iniciación de callo con 3 mg/l de PPT 1 día después del bombardeo. Los embriones fueron evaluados en relación con la iniciación del callo a las 2 y 3 semanas después del bombardeo. Las respuestas fueron transferidas a medio para mantenimiento del callo, 2DG4 + medio 0,5 2,4-D con 3 mg/L de PPT. El medio de mantenimiento del callo es sales mayoritarias N6, sales minoritarias B5, hierro MS, 2% de sacarosa, con 0,5 mg/l de 2,4-D, 20 mg/l de glucosa, y adiciones de 10 ml de G4 añadidas después de poner en autoclave. El callo embriogénico fue subcultivado cada 2 semanas a medio de mantenimiento fresco que contiene 3 mg/L de PPT. Cada embrión que produjo callo fue cultivado como evento individual dando lugar a una línea individual.
3.5 Regeneración
Después de 12 semanas en selección, el tejido se retiró del medio de mantenimiento del callo con PPT y se puso en medio de regeneración. El medio de regeneración es 0,25MS3S5BA (0,25 mg/l 2,4 D, 5 mg/l BAP, sales MS, 3% de sacarosa) durante 2 semanas, seguido por subcultivo a medio MS3S para regeneración de plantas. Después de 4 a 10 semanas, las plantas se retiraron y se pusieron en GA 7.
3.6 Retrocruzamiento
Las plantas transgénicas regeneradas son retrocruzadas en una base genética diferente [2N217AF; 6Y021] dando por resultado los Eventos AB01 [2N217AF(Bt)] y AB10 [6Y021(Bt)], que son hemicigóticos para el rasgo Bt. Las líneas nativas no transformadas 2N217AF [CG01] y 6Y021 [CG10] se usan como testigos en el ensayo de Sesamia descrito a continuación en el Ejemplo 4.
Ejemplo 4 Ensayo de Sesamia
Parámetros registrados: Se dejaron larvas de Sesamia nonagrioides [MCB] de 24/48 horas de edad alimentándose en hojas de maíz. Las larvas no habían sido alimentadas previamente. 72 y 120/152 horas más tarde se registró el número de larvas vivas e ínstar de desarrollo de cada una. En cada caso se observó el tipo de daños en las hojas.
Tratamientos: Se usaron cuatro "eventos" de maíz diferentes (AB01, AB10, CG01, CG10). Las hojas se cortaron y se usaron en experimentos de alimentación como se describen a continuación.
\newpage
Número de larvas ensayadas: Grupos de 5 larvas se pusieron dentro de recipientes de material plástico traslúcido, con varios trozos de hojas de hojas de maíz. Los recipientes eran cilíndricos, de 5,4 cm de diámetro y 3 cm de altura. Se usaron para cada "evento" diez y seis grupos de 5 larvas cada uno (80 larvas). Así, para toda la evaluación se usó un total de 320 larvas MCB. Esta se hizo en 2 etapas. En la primera etapa se usaron larvas de 24 horas de edad; en la segunda etapa, larvas de 48 horas de edad.
Condiciones experimentales: Temperatura 25 \pm 1ºC, fotoperiodo: 16L/8D
Resumen de los resultados:
Porcentaje de mortalidad después de 72 horas (media \pm error típico):
AB01: 84 \pm 8% (n = 15, n es el número de recipientes con 5 larvas)
AB10: 87 \pm 7% (n = 15, n es el número de recipientes con 5 larvas)
CG10: 2,5 \pm 1,7% (n = 16, n es el número de recipientes con 5 larvas)
CG01: 3,8 \pm 2,7% (n = 16, n es el número de recipientes con 5 larvas)
Porcentaje de mortalidad después de 120/152 horas (media \pm error típico):
AB01: 100% (n = 15, n es el número de recipientes con 5 larvas)
AB10: 100% (n = 15, n es el número de recipientes con 5 larvas)
CG10: 14 \pm 3% (n = 16, n es el número de recipientes con 5 larvas)
CG01: 14 \pm 5% (n = 16, n es el número de recipientes con 5 larvas)
Desarrollo: Dado que la mayoría de las larvas en AB01 y AB10 murieron antes de la primera observación (72 h), no se pudo observar el efecto del hospedador sobre el desarrollo larvario. Sin embargo, hubo algunas indicaciones de retraso del desarrollo larvario en AB01 y AB10.
Daños en las hojas de maíz cortadas: Se distinguieron claramente dos tipos de daños en las hojas de maíz. Los trozos de hojas codificadas como AB01 y AB10 mostraban pequeños orificios en la epidermis superior, mientras que las codificadas como CG10 y CG01 mostraban zonas amplias sin epidermis superior. Las larvas en AB01 y AB10 comieron escasamente y no se observaron excrementos en los recipientes traseros. En cambio, las larvas en CG01 y CG10 comieron grandes zonas de epidermis superior y se observaron abundantes excrementos en el recipiente
trasero.
Conclusión: Los resultados del ensayo de Sesamia indican un intenso efecto de AB01 y AB10 sobre la mortalidad larvaria y la alimentación larvaria. Con la metodología empleada en las presentes pruebas, no se detectaron diferencias entre AB01 y AB10. Los daños en AB01 y AB10 fueron mucho menores que en CG01 y CG10.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Ejemplo pasa a página siguiente)
Ejemplo 5 Efectos de Vip3A sobre larvas neonatas de Sesamia nonagrioides
1
Efectos de Vip3A sobre larvas neonatas del barrenador del maíz mediterráneo Sesamia nonagrioides. CG00526 es el genotipo de maíz usado como testigo negativo. Es una línea nativa, que ha sido descrita por Koziel et al. (1993), Bio/Technology 11, p. 194-200.
El gen que codifica la proteína Vip3A fue transformado en el genotipo CG00526 mediante biolística. Los cruces CG00526 x 891 y 892 se refieren a cruces de eventos de transformación (891 y 892) con la línea progenitora CG00526. Dos de los eventos obtenidos que expresan la proteína Vip3A han sido usados para el bioensayo con insectos (segregantes positivos). Los segregantes positivos son plantas que han heredado el gen vip3A. Los segregantes negativos son plantas T1 que no han heredado el gen vip3A y que por consiguiente no expresan la proteína Vip3A.
(1) INFORMACION GENERAL
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: CIBA-GEIGY AG
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Klybeckstr. 141
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CODIGO POSTAL (ZIP): 4002
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELEFONO: +41 61 69 11 11
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: +41 61 696 79 76
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TELEX: 962 991
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCION: Método para controlar plagas de insectos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NUMERO DE SECUENCIAS: 55
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30B
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6049 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus cereus 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AB78
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: NRRL B-21058
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1082..2467
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /producto = "VIP2A(a)"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 2475..5126
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Secuencia de codificación para la proteína VIP1A (a) de 100 kd. Esta secuencia de codificación se repite en SEQ ID NO:4 y se traduce separadamente".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
2
3
4
5
6 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..20
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Péptido señal para señalización vacuolar".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2655 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iV)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus cereus 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AB78
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: NRRL B-21058
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..2652
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /producto= "proteína VIP1A (a) de 100 kd". Esta secuencia es idéntica a la porción de la SEQ ID NO:1 entre los nucleótidos, e incluyéndolos, 2475 a 5126''.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
10
11
12
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 884 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
15 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
16
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2004 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus cereus 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AB78
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: NRRL B-21058
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1.. 2001
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /producto= "proteína VIP1A (a) de 80 kDa". /nota = Esta secuencia es idéntica a la porción de la SEQ ID NO:1 entre las posiciones de los nucleótidos, e incluyéndolos, 3126 a 5126''.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 667 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
23
24
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus cereus 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AB78
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: NRRL B-21058
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Secuencia N-terminal de proteína purificada a partir de la cepa AB78"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asx Gly Asp Ser Ile Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= ``Sonda de oligonucleótido basada en aminoácidos 3 a 9 de la SEQ ID NO:8, utilizando el uso de codón de Bacillus thuringiensis.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAATTGATC AAGATACNGA T 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus thuringiensis 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AB88
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Secuencia de aminoácidos N-terminal de proteína conocida como fracción 23 de intercambio aniónico (más pequeña)"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus thuringiensis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus thuringiensis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ala Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus thuringiensis 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AB88
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Secuencia de aminoácidos N-terminal de VIP de 35 kDa activa frente a Agrotis ipsilon"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Ser Glu Asn Thr Gly Lys Asp Gly Gly Tyr Ile Val Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus thuringensis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Secuencia N-terminal de delta-endotoxina de 80 kDa"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu}
2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bacillus thuringiensis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Secuencia N-terminal a partir de delta-endotoxina de 60 kDa"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:17
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2655 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1.. 2652
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota = "secuencia de DNA optimizada de maíz para proteína VIP1A (a) de 100 kd de AB78".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17
\vskip1.000000\baselineskip
27
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:18
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2004 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iV)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1.. 2004
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Secuencia de DNA optimizada de maíz para proteína VIP1A(a) de 80 kDa de AB78"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18
\vskip1.000000\baselineskip
30
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4074 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1.. 1386
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /producto= "proteína VIP2A (b) de Btt".
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1394.. 3895
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /producto= "proteína VIP1A (b) de Btt".
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1.. 4074
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Secuencia de DNA clonada de Btt que contiene los genes tanto de VIP1A(b) como de VIP2A(b)".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19
33
34
35
36
37
38
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 462 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20
40
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 834 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
42
43
44
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4041 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1.. 4038
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /producto= "producto de fusión VIP1A(a)/VIP2A(a)"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 22
46
47
48
49
50
51
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1346 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
53
54
55
56
57 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1369 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1.. 1386
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota = "secuencia de DNA optimizada de maíz para proteína VIP2A (a) de AB78".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 24
\vskip1.000000\baselineskip
59
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..19
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Péptido señal de secreción para segregar VIP2 de una célula"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Gly Val}
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
His Cys Leu 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:26
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2655 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1.. 2655
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota = "secuencia de DNA optimizada de maíz que codifica VIP1A (a)".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 26
\vskip1.000000\baselineskip
61
62 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:27
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1389 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..1389
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "secuencia de DNA optimizada de maíz, que codifica VIP2A (a)"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 27
63 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:28
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2378 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 9.. 2375
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "secuencia de DNA nativa que codifica la proteína VIP3A(a) de AB88 como se contiene en pCIB7104"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 28
\vskip1.000000\baselineskip
64
65
66
67
68 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 789 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29
69
70
71
72 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:30
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2403 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 11.. 2389
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota = "secuencia de DNA optimizada de maíz que codifica VIP3A (a)".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 30
\vskip1.000000\baselineskip
73
74 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:31
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2612 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 118.. 2484
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota = "secuencia de DNA nativa que codifica VIP3A(b) de AB424".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 31
\vskip1.000000\baselineskip
76
77
78
79
80 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 789 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32
81
82
83
84 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:33
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "se usa cebador forward para hacer pCIB5526"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCACCA TGAAGACCAA CCAGATCAGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:34
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "se usa cebador inverso para hacer pCIB5526"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGCTTCAGC TCCTT 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:35
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2576 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 9.. 2564
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "secuencia optimizada de maíz que codifica VIP1A(a) con la señal de secreción de Bacillus eliminada, como se contiene en pCIB5526"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 35
\vskip1.000000\baselineskip
85
86
87
88
89 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 852 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36
90
91
92
93 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:37
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "se usa cebador forward para hacer pCIB5527"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCACCA TGCTGCAGAA CCTGAAGATC AC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:38
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "se usa cebador inverso para hacer pCIB5527"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGCTTCCAC TCCTTCTC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:39
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1241 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 9.. 1238
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "secuencia de DNA optimizada de maíz, que codifica VIP2A(a) con la señal de secreción de Bacillus eliminada como se contiene en pCIB5527"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 39
\vskip1.000000\baselineskip
94
95
96 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 410 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40
97
98
99 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:41
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "oligonucleótido que codifica la señal de secreción eucariótica usado para construir pCIB5527"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 41
100 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:42
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1241 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 9.. 1238
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "secuencia de DNA optimizada de maíz que codifica VIP2A(a) con la señal de secreción de Bacillus eliminada y la señal de secreción eucariótica insertada como se contiene en pCIB5528"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42
101
102 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 410 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43
103
104 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:44
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 86 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "oligonucleótido que codifica el péptido de dirección vacuolar usado para construir pCIB5533"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 44
105 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:45
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1358 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 9..1355
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota = "VIP2A(a) optimizada de maíz con la señal de secreción de Bacillus eliminada y la señal de dirección vacuolar insertada como se contiene en pCIB5533"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 45
106
107
108 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 449 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46
109
110
111 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 1..16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "Péptido enlazador para la fusión de VIP1A(A) y VIP2A(a) usado para construir pCIB5533"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:48
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA que codifica el péptido enlazador usado para construir pCIB5533"''
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 48
112 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:49
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4031 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCION: /desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 6.. 4019
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /nota= "secuencia de DNA optimizada de máiz que codifica una proteína de fusión VIP2A(a) - VIP1A(a) como se contiene en pCIB5531"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 49
\vskip1.000000\baselineskip
113
114
115
116
117
118
119 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1338 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50
120
121
122
123
124 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:51
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2444 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICION: 17.. 2444
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACION: /producto= "fusión 3A(a) sintética:nativa"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 51
125
126
127
128 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 809 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52
129
130
131
132 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:53
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3474 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: gen CryI(A) BT sintético optimizado de maíz puro
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 53
\vskip1.000000\baselineskip
133
134
135
136
137
138 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:54
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3508 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: gen CryIA(b) de BT optimizado de maíz, de longitud completa
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54
\vskip1.000000\baselineskip
139
140
141
142
143
144 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO:55
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1961 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iV)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: gen CryIA(b) de BT sintético truncado optimizado de maíz
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 55
145
146
147

Claims (28)

1. Un método para la protección de plantas, incluyendo la progenie de las mismas, contra los daños producidos por especies Sesamia, que comprende aplicar directa o indirectamente a la planta, o a la semilla de la planta, o al área de cultivo de la planta, una toxoproteína de una especie de Bacillus, como ingrediente activo, en donde la toxoproteína es una proteína de tipo VIP-3.
2. Un método según la reivindicación 1ª, en el que la proteína de tipo VIP3 es una proteína VIP3A(a) o una proteína VIP3A(b).
3. Un método según las reivindicaciones 1ª o 2ª, en el que la toxoproteína es una proteína de tipo VIP3 de acuerdo con las SEQ ID Nos. 28 a 32, 51 ó 52.
4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que la toxoproteína se aplica a la planta en forma de composición entomicida.
5. Un método según la reivindicación 4ª, en el que la composición entomicida comprende un microorganismo, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis y/o de Bacillus cereus, que contienen al menos un gen de toxina que codifica dicha toxoproteína, junto con un vehículo adecuado.
6. Un método según la reivindicación 5ª, en el que el microorganismo contiene al menos un gen de la proteína de tipo VIP3, tal como un gen de la proteína VIP3A(a) o de la proteína VIP3A(b), que codifica dicha toxoproteína.
7. Un método según las reivindicaciones 5ª o 6ª, en el que la toxoproteína es una proteína de tipo VIP3 de acuerdo con las SEQ ID Nos. 28 a 32, 51 ó 52.
8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 4ª a 7ª, en el que dicha composición comprende otra toxoproteína, en el que dicha toxoproteína es una proteína de tipo Cry, preferentemente una proteína de tipo CryI, más preferentemente una proteína de tipo CryIA y lo más preferentemente una proteína de tipo CryIA(b), o un microorganismo que expresa dicha toxoproteína.
9. Un método según las reivindicaciones 6ª o 7ª, en el que el microorganismo es un organismo recombinante.
10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en el que la toxoproteína se aplica indirectamente a la planta, expresando dentro de dicha planta y en la progenie de la misma un gen de toxina que codifica una toxoproteína de la especie Bacillus para producir dicha toxoproteína en una cantidad suficiente para proporcionar la represión de especies Sesamia al plantar la planta así transformada dentro de una zona en la que puede aparecer dicha plaga de insectos, en el que el gen de toxina codifica una toxoproteína de tipo VIP-3.
11. Un método según la reivindicación 10ª, en el que la proteína de tipo VIP-3 es una proteína VIP3A(a) o una proteína VIP3A(b).
12. Un método según las reivindicaciones 10ª o 11ª, en el que el gen de toxina es un gen sintético cuyo uso de codón se optimiza usando los codones que son los más preferidos en plantas.
13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 10ª a 12ª, en el que el gen de toxina codifica una proteína de tipo VIP3 según las SEQ ID números 28 a 32, 51 ó 52.
14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª, en el que la planta a proteger es un cereal.
15. Un método según la reivindicación 14ª, en el que la planta a proteger es una planta de maíz.
16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 10ª a 15ª, en el que al menos una toxoproteína del tipo VIP3 es expresada en la planta a proteger, en combinación con una toxoproteína de tipo Cry, en una cantidad suficiente para proporcionar la represión de plagas de Sesamia.
17. Una composición que comprende como ingrediente activo al menos una proteína de tipo VIP-3 y una toxoproteína de tipo Cry, en una cantidad efectiva como insecticida, junto con un vehículo aceptable en agricultura.
18. El uso de un ingrediente activo como se define en las reivindicaciones precedentes para reprimir plagas de Sesamia en plantas de cultivo.
19. El uso de una composición según la reivindicación 17ª para reprimir plagas de Sesamia en plantas de cultivo.
20. El uso de una planta transgénica según se define en la reivindicación 10ª para reprimir plagas de Sesamia en plantas de cultivo.
21. El uso de microorganismos recombinantes o plantas transgénicas según se define en las reivindicaciones precedentes, que comprenden una molécula de DNA que se hibrida con el complemento de un gen de tipo VIP3 que codifica la correspondiente toxoproteína bajo condiciones de severidad moderada, para reprimir plagas de Sesamia en plantas de cultivo.
22. Una bolsa comercial que comprende semillas de una planta transgénica o un microorganismo, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis y/o de Bacillus cereus, que comprende al menos un gen de toxina que codifica una toxoproteína como se define en la reivindicaciones precedentes, y que expresa dicha toxoproteína en una cantidad suficiente para proporcionar represión contra especies de Sesamia, junto con instrucciones en la etiqueta para su uso en la represión de plagas de Sesamia en plantas de cultivo.
23. Una bolsa comercial que comprende semillas de una planta transgénica o un microorganismo, pero especialmente una cepa de Bacillus thuringiensis y/o Bacillus cereus, que contiene al menos una proteína tipo VIP3 o una proteína tipo VIP3 y una toxoproteína tipo Cry, como se definió anteriormente en el presente texto, junto con un vehículo adecuado, en una cantidad suficiente para proporcionar la represión contra especies de Sesamia, junto con instrucciones en la etiqueta para su uso en la represión de plagas de Sesamia en plantas de cultivo.
24. Una bolsa comercial que comprende una composición insecticida según la reivindicación 17ª, junto con instrucciones en la etiqueta para su uso en la represión de especies de Sesamia en plantas de cultivo.
25. Un método agrícola, en el que se usa una planta transgénica, o su progenie, que comprende un gen de toxina que codifica una toxoproteína de una especie de Bacillus y que expresa dicha toxoproteína en una cantidad suficiente para proporcionar la represión contra especies de Sesamia, o semillas transgénicas de la misma, como se define anteriormente en el presente texto.
26. Una planta transgénica que expresa al menos una proteína de tipo VIP3 en combinación con al menos una toxoproteína de tipo CryI como se define anteriormente en el presente texto, en cantidad suficiente para proporcionar la represión de plagas de Sesamia.
27. Una planta transgénica según la reivindicación 26ª, en la que la proteína de tipo Cry es una toxoproteína CryIA(b).
28. Una planta transgénica según las reivindicaciones 26ª o 27ª, que es una planta de maíz.
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