ES2231883T3

ES2231883T3 - Procedimiento para desarrollar mamiferos con propiedades geneticas definidas.

Info

Publication number: ES2231883T3
Application number: ES97936698T
Authority: ES
Inventors: Erwin Wagner; Zhao-Qi Wang
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-09
Publication date: 2005-05-16
Anticipated expiration: 2017-08-09
Also published as: JP4129472B2; US20020178457A1; EP0928332B1; ATE281516T1; JP2000516463A; JP2006296440A; EP0928332A1; US6492575B1; PT928332E; CA2263729A1; DE59712068D1; WO1998006834A1; CA2263729C; DE19632532A1

Abstract

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE MAMIFEROS CON PROPIEDADES GENETICAS DEFINIDAS, EN PARTICULAR MAMIFEROS TRANSGENICOS. PARA OBTENER EN UNA UNICA ETAPA ANIMALES QUE DERIVAN COMPLETAMENTE DE CELULAS ES (CELULAS EMBRIONARIAS) QUE HAN SIDO IN VITRO GENETICAMENTE TRANSFORMADAS Y, SE INYECTAN CELULAS TOTIPOTENTES CULTIVADAS (CELULAS EMBRIONARIAS) EN BLASTOCITOS TETRAPLOIDES, Y EL EMBRION RESULTANTE SE IMPLANTA EN UNA MADRE PORTADORA.

Description

Procedimiento para desarrollar mamíferos con propiedades genéticas definidas.

El invento se refiere a la producción de animales mamíferos no humanos con propiedades genéticas definidas, en particular a la producción de animales transgénicos.

Los animales transgénicos son organismos, en cuya línea germinal se habían introducido modificaciones genéticas permanentes; un gen introducido de modo nuevo es designado como transgénico. Los animales transgénicos constituyen para la moderna biología una herramienta imprescindible, con el fin de realizar la regulación, específica para tejidos, de genes y de su función en el desarrollo y en las enfermedades. La tecnología transgénica ofrece además la posibilidad de poner a disposición modelos de animales para enfermedades de los seres humanos, así como producir grandes cantidades de proteínas en animales de granja.

En el caso de la técnica utilizada hasta ahora con la mayor frecuencia de la producción de animales transgénicos, un ADN recombinante se microinyecta en los huevos fertilizados; una técnica adicional, para introducir genes en embriones de animales, utiliza virus en la mayor parte de los casos vectores retrovíricos recombinantes (véase el artículo de compendio de Wagner y Keller, 1992).

La tercera y más reciente técnica para introducir material genético ajeno en animales, aprovecha el potencial de las células troncales embrionarias (células ES de Embrionic Stem cells) para formar animales quiméricos. Los embriones de animales mamíferos tienen la capacidad de poder incorporar células ajenas durante su desarrollo. Dos diferentes embriones antes de la implantación, habitualmente para mórulas, se asocian in vitro; esto proporciona un embrión quimérico, que constituye una mezcla de ambos embriones. Estos embriones se transfieren a continuación a una ratona simuladamente embarazada, que actúa como madre nodriza; los descendientes quiméricos obtenidos presentan en sus tejidos una diferente proporción de células, que proceden de uno de los dos embriones originales. La combinación de este método con la utilización de células ES se manifestó como muy eficaz para la producción de animales manipulados genéticamente.

Las células troncales embrionarias se derivan de la masa celular interna ("inner cell mass", ICM) de blastocistos; éstas son células totipotentes que se pueden desarrollar para formar todas las series de origen celular (linajes de células) inclusive células germinales, cuando se introducen en un embrión por inyección en blastocistos diploides o por asociación con mórulas (Robertson1987; Bradley, 1987; Beddington y Robertson, 1989, Nagy y colaboradores, 1990). Las células ES se pueden aislar a partir de blastocistos y a continuación se pueden establecer como linajes de células permanentes, cuando se cultivan en condiciones de cultivación bien definidas, que se han de respetar con exactitud; ellas se pueden manipular genéticamente. Por causa de esta capacidad, constituyen una herramienta eficaz para la modificación del genoma de animales mamíferos, en particular de ratones, introduciendo p.ej. introduciendo con su ayuda mutaciones deliberadas u otras modificaciones genéticas en los animales (Wagner y colaboradores 1991; Ramírez Solís y colaboradores, 1993: Skarnes, 1993; Bronson y Smithies, 1994).

Desde hace algún tiempo están a disposición células con la denominación de "células germinales embrionarias" ("Embryonic germ cells"; = células "EG"), que se pueden cultivar a partir de células germinales primordiales para formar linajes de células inmortalizadas y son similares en muchos aspectos a las células ES; entre otras cosas, las células EG son topipotentes, se pueden manipular igual que las células ES, y forman una quimera de línea germinal cuando se introducen en blastocistos (Donovan y colaborares, 1997).

En el transcurso de los últimos años se desarrollaron diferentes técnicas experimentales, para producir animales, que se derivan de células topipotentes. (Las células topipotentes son células con la capacidad de diferenciarse para formar todas las células somáticas así como para formar células germinales. Estos métodos tenían en el caso de las células ES, predominantemente, como finalidad la de conservar in vitro todo el potencial de desarrollo de las células ES (Williams y colaboradores 1998; Smith y colaboradores, 1998) y restringir el potencial de desarrollo de las células anfitriones (hospedantes) en el caso de la formación de quimeras y por consiguiente aumentar la capacidad de la formación de quimeras de línea germinal (Nagy y colaboradores, 1990; Kaufmann y Webb 1990). Uno de los progresos más importantes en el desarrollo de estas técnicas consiste en la utilización de embriones tetraploides como células anfitriones, puesto que las células tetraploides, después de la implantación, presentan solamente un limitado potencial para el desarrollo (Nagy y colaboradores 1990; Kaufmann y Webb, 1990; Kubiak y Tarkowski, 1985). Cuando células tetraploides se asocian con embriones diploides la diferenciación de las células tetraploides está restringida ampliamente al endodermo primitivo y al trofectodermo, que forman a continuación un tejido extraembrionario, mientras que las células diploides pueden formar el embrión propiamente dicho (James y West, 1994; James y colaboradores, 1995).

En un trabajo más antiguo, diferentes linajes de células ES se asociaban con mórulas, para producir de esta manera fetos que proceden totalmente de células ES (los organismos que proceden totalmente de células ES se designan en lo sucesivo como "animales ES", p.ej. ratones ES; o bien "fetos ES"); los fetos ES obtenidos murieron sin embargo en el parto (Nagy, 1990). Estudios adicionales mostraron que se pueden obtener ratones ES viables y fértiles, que proceden exclusivamente de células ES, cuando se utilizan células R1 de tipo salvaje de una pasada anterior (Nagy y colaboradores, 1993) o linajes de células TT2 (Ueda y colaboradores, 1995) para la asociación con mórulas tetraploides.

Se produjeron ratones ES, además, inyectando en una primera etapa células ES en blastocistos diploides, con lo que se obtenían en primer término ratones quiméricos; unos cruces adicionales proporcionaron, después de dos generaciones, ratones ES. El método de la inyección en blastocistos fue descrito en primer término por Gardner, 1968, una versión simplificada de Bradley y Robertson, 1986, así como por Bradley, 1987.

La meta de obtener ratones ES viables por medio de la utilización de células ES procedentes de pasadas posteriores, no se alcanzó con los métodos disponibles hasta ahora (Nagy y colaboradores, 1993); la producción de ratones ES mediando utilización de células ES modificadas genéticamente pareció ser imposible absolutamente. (La posibilidad de utilización de células ES procedentes de pasadas posteriores presenta una importancia sobre todo en lo que se refiere a la utilización de linajes de células y además en lo que se refiere a la utilización de células ES modificadas genéticamente, cuya selección va acompañada de modo natural con un aumento del número de pasadas.

El presente invento se estableció la misión de poner a disposición un nuevo procedimiento con el que se puedan obtener animales mamíferos no humanos con propiedades genéticas definidas, en particular animales mamíferos transgénicos, que se derivan totalmente de células ES.

El problema planteado por la misión establecida es resuelto mediante un procedimiento para la producción de animales mamíferos no humanos con unas propiedades genéticas definidas, en particular animales mamíferos transgénicos, en los que se introducen en blastocistos células troncales embrionarias de la misma especie de animal mamífero, y el embrión obtenido se transfiere a una madre nodriza. El procedimiento está caracterizado porque se introducen en blastocistos tetraploides células troncales embrionarias con propiedades genéticas definidas.

Con ayuda del procedimiento conforme al invento se pueden obtener animales, que se derivan totalmente de células ES. El procedimiento conforme al invento ofrece la ventaja de obtener, en una única etapa, animales derivados totalmente de células ES, a partir de células ES cultivadas in vitro.

Dentro del concepto de "animales mamíferos transgénicos" entran dentro del marco del presente invento, de acuerdo con la definición, animales que son portadores de una modificación genética permanente de un tipo arbitrario.

Los animales, que "se derivan totalmente de células ES", contienen de manera preferible hasta en un 100%, células que proceden de células ES. Sin embargo, los animales pueden tener una pequeña proporción, preferiblemente no mayor que 10%, de células que se derivan de los blastocistos tetraploides.

En una forma preferida de realización del invento, los animales mamíferos son ratones, sin embargo, el procedimiento puede encontrar aplicación fundamentalmente a todos los animales mamíferos, a partir de los cuales se pueden obtener células ES. Una premisa para obtener células ES de otros animales mamíferos distintos de los ratones, es la definición de condiciones que permitan la cultivación de células ES a partir de estos organismos y el establecimiento de linajes de células ES, entre otras cosas la necesidad de factores de crecimiento específicos así como de células alimentadoras para la cultivación concomitante (co-cultivación) con las células ES. Estas condiciones se pueden determinar empíricamente con ayuda de experimentos en serie.

El aislamiento de células ES a partir de blastocistos, el establecimiento de linajes de células ES y su subsiguiente cultivación, se llevan a cabo de acuerdo con métodos habituales, tal como han sido descritos p.ej. por Doetchmann y colaboradores 1985; Li y colaboradores, 1992; Robertson, 1987; Bradley, 1987; Wurst y Joyner, 1993; Hogan y colaboradores, 1994; Wang y colaboradores, 1992. Las células ES, p.ej. células ES de ratón, se pueden ensayar en experimentos previos para determinar si ellas, a causa de su potencial de desarrollo, son apropiadas para la utilización en el marco del presente invento. Para esto, células de los linajes que interesan se inyectan en embriones diploides de ratón, los embriones obtenidos se introducen en madres nodriza y los cachorros se investigan en cuanto al grado de quimerismo así como a la frecuencia de la formación de quimeras de línea germinal.

Los blastocistos tetraploides se pueden obtener, de acuerdo con métodos conocidos, por fusión eléctrica de embriones de dos células, y a continuación se pueden cultivar tal como se ha descrito p.ej. por James y colaboradores 1992; Nagy y Rossant, 1993; o Kubiak y Tarkowski, 1985.

La introducción de las células ES en los blastocistos se lleva a cabo asimismo de una manera de por sí conocida. Es preferido dentro del marco del presente invento el método de la microinyección, tal como fue descrito p.ej. por Wang y colaboradores, 1991. En el caso de la microinyección habitual se inyectan en un equipo de micro-manipulación aproximadamente 5-10 células ES, que se habían sacado de una suspensión celular individual, dentro de un blastocisto, que había sido inmovilizado mediante una pipeta de retención. Seguidamente, los embriones se incuban por lo menos durante 3 h, eventualmente durante toda una noche.

En una forma preferida de realización del invento se utilizan células ES manipuladas genéticamente, a fin de obtener animales transgénicos.

En lo que se refiere al tipo de la modificación genética de las células ES no existen restricciones de ningún tipo. Los genes se pueden sobreexpresar, mutar o excluir en lo que se refiere a la producción de los denominados animales "knock out" (= modificados en su información genética); además se pueden insertar genes ajenos o llevar a cabo supresiones (deleciones) intracromosomales. La modificación genética se puede llevar a cabo en uno o en ambos anhelos, este último enfoque fue descrito p.ej. por Hilberg y Wagner, 1992, para la exclusión del gen c-jun. El hecho de que el presente invento hace posible una modificación genética en ambos alelos, constituye una ventaja especial; con los métodos del estado de la técnica era posible, solamente después de varios cruces y de una cultivación larga y complicada de animales, que tenían una modificación genética en un alelo, obtener animales transgénicos en los que ambos alelos eran portadores de la deseada modificación.

Para la manipulación genética de las células ES se pueden utilizar métodos habituales. Por lo general, se utilizan plásmidos, de modo preferido plásmidos linealizados, que son portadores de la deseada modificación genética. En atención a la aptitud para la selección de las células ES modificadas genéticamente, los plásmidos contienen convenientemente un gen marcador, p.ej. el gen de resistencia a la neomicina, higromicina o puromicina, bajo el control de un promotor. En atención a la expresión de un gen contenido en el plásmido dentro de las células anfitriones, el plásmido puede contener secuencias de control de la expresión del gen, p.ej. un promotor fuerte y funcional en células ES, tales como el promotor de PGK (de PhosphoGlicerinKinase = fosfo glicerol cinasa).

Los métodos, con los que se introduce el plásmido en las células, son métodos clásicos conocidos en la bibliografía para la transferencia in vitro de un ADN en células de animales mamíferos, p.ej. por electroporación, precipitación con fosfato de calcio, o por métodos que se basan en la endocitosis mediada por receptores, divulgada, p.ej., en el documento de solicitud de patente internacional WO 93/07283.

Un método adicional, para la introducción de modificaciones genéticas en las células ES, utiliza virus, p.ej. vectores retrovíricos recombinantes; en lo que se refiere a los segmentos de secuencias que están contenidos en el vector, que hacen posible la selección de células modificadas genéticamente o bien la expresión en la célula, es válido fundamentalmente lo que se ha dicho acerca de los plásmidos (Wagner y Keller, 1992; Stewart y colaboradores, 1985).

Con ayuda del procedimiento conforme al invento es posible producir de manera rutinaria animales mamíferos transgénicos viables y fértiles, en particular ratones ES, a partir de células ES modificadas genéticamente in vitro.

Con ayuda del procedimiento conforme al invento, entre otras cosas, a partir de células ES manipuladas genéticamente, que sobreexpresan p.ej. un gen específico, o en las que se había desactivado un gen específico, se pueden producir de una manera reproducible animales transgénicos, que se pueden utilizar entre otras cosas para estudios de funciones de genes o para la producción de proteínas. El procedimiento conforme al invento ofrece, en comparación con los procedimientos habituales destinados a la producción de animales transgénicos, una posibilidad productiva, rápida y rentable, de producir fetos de animales mutantes, en particular fetos de ratón, así como razas transgénicas, directamente a partir de células totipotentes, en las que se habían llevado a cabo las deseadas modificaciones genéticas.

La totalidad de los tres linajes de células ES, que se han investigado dentro del marco del invento, con las denominaciones D3, R1 y GS1, formaron quimeras de línea germinal después de su inyección en blastocistos diploides. En el caso de una inyección en blastocistos tetraploides se obtuvieron ratones ES vivos a partir de células R1 y GS1. Con células D3 no se consiguió, tampoco con células de una pasada anterior (pasada 9), producir ratones ES vivos después de la inyección de células ES en blastocistos tetraploides. Esto está en consonancia con observaciones anteriores a partir de experimentos de asociación (Nagy y colaboradores, 1990; véase también la Tabla 2) con estas células. La incapacidad de las células D3 de formar ratones ES viables, no ha de ser atribuida presumiblemente al hecho de que estas células han perdido su potencial de desarrollo; las células D3 se emplearon ya con frecuencia en los denominados experimentos de "dirección hacia genes" ["Gene targeting"], pudiéndose obtener después de su inyección en blastocistos diploides un elevad grado de quimerismo así como quimeras de línea germinal (Urbánek y colaboradores, 1994, Wang y colaboradores, 1992; Wang y colaboradores, 1994; véase también la Tabla 1). Sin embargo, es posible que el potencial de las células D3, de diferenciar algunos tipos de células, que son críticos para la adaptación del feto a la vida postnatal, es perjudicado a causa de modificaciones genéticas o epigenéticas desconocidas. Esta suposición es apoyada por la observación, de que las células D3 están en situación de producir fetos, que se desarrollan hasta el momento de un parto normal, pero que, sin embargo, los animales neonatos (recién nacidos) no están situación de mantener la respiración, así como de que ellos presentan un peso corporal y una politactilia de magnitud aumentada, y mueren en el parto. Estas propiedades recuerdan a las características fenotípicas de ratones, a los que les falta el gen Igf2/Mpr "impreso" (Wang y colaboradores, 1994; Lau y colaboradores, 1994); podría ocurrir que los genes impresos ("imprinted") o los genes que regulan el crecimiento de los fetos, sean responsables del efecto observado. Mientras que en el entorno de células anfitriones de embriones diploides las funciones defectuosas de las células ES deberían ser complementadas por las células anfitriones, el potencial de desarrollo propio de las células D3, a causa de su imposibilidad de diferenciación, de poder formar todos los tipos de células funcionales, parece estar restringido en un entorno que procede totalmente de células ES. La introducción de diferentes cepas ES de tipo salvaje en embriones tetraploides, convenientemente en experimentos en serie, puede servir por lo tanto como ensayo más rápido y más seguro, a fin de comprobar la idoneidad de células ES para la utilización en el marco del presente invento.

El fondo genético de las respectivas razas de ratones, de las que proceden las diferentes células ES, debería ser un factor adicional, que influya sobre la capacidad de vida de los ratones ES. Todos los linajes de células ES, utilizados dentro del marco del presente invento, procedían de la raza de ratón 129: las células R1 procedían de un blastocisto de ratón procedente de un cruce entre las subrazas 129/Sv y 129/Sv-CP (Nagy y colaboradores, 1993); las células GS1 procedían de células D3 129/Sv/Ev. (Doetchmann y colaboradores 1985) y las células J1 (Li y colaboradores, 1992) procedían de células TT2 129/Sv o 129/terSv, que también proporcionaban ratones ES, procedían de una cepa híbrida F1 (C57BL/6 x CBA) (Nagy y colaboradores, 1993). A causa de los resultados obtenidos dentro del marco del presente invento, así como de trabajos anteriores (Nagy y colaboradores 1993, Ueda y colaboradores, 1995), no puede excluirse que los linajes de células ES, que se derivan de diferentes razas o subrazas de ratón, presente diferentes capacidades para la formación de ratones ES viables.

La eficiencia en la producción de ratones ES recién nacidos mediante inyección de células R1 de tipo salvaje en embriones tetraploides (14%) era mayor que la producción mediante asociación (6% en el marco del presente invento o bien 7% en el trabajo descrito por Nagy y colaboradores (1993)). Este resultado está en coincidencia con una comparación entre el método de la asociación y el de la inyección de células ES en embriones diploides (Wood y colaboradores, 1993). La utilización conforme al invento de blastocistos tetraploides para el método de inyección, dio como resultado que algunos clones seleccionados de células R1, que se habían cultivado in vitro durante un período de tiempo más largo que 24 pasadas (p.ej. los R169.2.3 y R-fra3) todavía presentaban la capacidad de producir ratones ES viables. Estos resultados son dignos de mención, en particular a la vista de los resultados de anteriores experimentos de asociación, en los cuales las células R1 de tipo salvaje perdieron su capacidad de producir ratones ES viables después de la pasada 14 (Nagy y colaboradores, 1993). Las razones por las que la inyección de células ES en blastocistos tetraploides conduce de una manera reproducible a la formación de ratones ES, no han sido explicadas totalmente. Puesto que las células ES se obtienen originalmente a partir de la ICM de blastocistos, y estas células de la ICM son también muy similares (Beddington y Robertson, 1989), se puede concebir que tanto la proximidad en el espacio de las células ES y de la ICM como también su compatibilidad en el desarrollo, son responsables de este efecto. Esta suposición es apoyada, además de ello, por la observación, hecha a partir de experimentos comparativos, de que la eficiencia de producir ratones quiméricos, era menor cuando se incorporaban células ES en mórulas diploides por debajo de la "zona pellucida", que cuando se utilizaba el método habitual de inyección en blastocistos (inyección en blastocistos diploides).

La alta eficiencia del método conforme al invento lo hace superior con respecto a los métodos del estado de la técnica (asociación de células AS con blastocistos tetraploides o inyección en blastocistos diploides) y ofrece la posibilidad, única hasta el momento, de producir ratones mutantes directamente a partir de células totipotentes modificadas genéticamente.

La producción de ratones mutantes viables directamente a partir de células ES manipuladas genéticamente, tiene muchas ventajas. Puesto que los tejidos fetales proceden totalmente de células totipotentes, que son modificables genéticamente, esta técnica ofrece una vía directa para producir un material fetal de origen puramente de células ES para estudios biológicos celulares, biológicos moleculares o genéticos (Forrester y colaboradores, 1991; Carmeliet y colaboradores, 1996).

Los fetos ES reproducen el modelo de expresión de genes específicos tales como el del gen Pax5 o de un gen "atrapado", de una manera segura, en comparación con fetos que han procedido de las mismas células ES por cruces de ratones mutantes heterocigotos. Ventajosamente, se pueden utilizar fetos ES para estudios de expresión, puesto que con ello se hace posible una producción rápida de un material fetal (en algunos días), mientras que la cultivación convencional dura normalmente de cuatro a cinco meses. Además de ello, el modelo de expresión seguro y reproducible en fetos ES minimiza las posibles complicaciones en tejidos quiméricos habituales, que, de acuerdo con la definición, constan tanto de células ES de tipo salvaje como también de células ES mutadas. Por lo tanto, esta técnica es útil para estudios acerca de la función de genes o acerca la identificación de nuevos genes; p.ej. en estudios de "atrapamiento de genes" ["gene trap"] (Skarnes, 1993). Se mostró que con ayuda del método conforme al invento (inyección de células ES en blastocistos tetraploides), se pueden producir de un modo más eficiente linajes de ratones mutantes, p.ej. transgenes c-fos y ratones "knock out" fra-1, directamente a partir de células ES. El procedimiento conforme al invento ofrece la posibilidad de producir linajes de ratones transgénicos a partir de células ES, que se habían seleccionado previamente para la integración y expresión de transgenes. La eficiencia de producir ratones, que sobreexpresan un gen específico, es mejorada significativamente con ello - en comparación con el habitual método de inyección, en el que se utilizan blastocistos diploides -. El procedimiento conforme al invento se aplicó en varios estudios de sobreexpresión y desactivación de genes. Además de ello, es posible producir con este método tejidos mutantes para el estudio de efectos específicos, en el caso de que la desactivación o sobreexpresión condujese a la muerte o una gametogénesis perjudicada en mutantes heterocigotos o incluso en quimeras (p.ej. véase la cita de Carmeliet y colaboradores, 1996).

Finalmente, el procedimiento conforme al invento ofrece la posibilidad de producir de una manera rápida y rentable razas de animales mutantes, en particular razas de ratones, y obtener un acceso rápido a fetos y animales mutantes, lo cual constituye una esencial ventaja para la investigación en el sector de la genética de los ratones.

Aparte de para la producción de animales transgénicos, el procedimiento conforme al invento se puede utilizar para la producción de animales ES no modificados genéticamente, que presenten determinadas propiedades deseadas. Para ello se emplean células ES, que se seleccionan previamente en lo que se refiere a las deseadas propiedades mediante experimentos de cultivación, a fin de obtener animales idénticos con las correspondientes propiedades.

Compendio de las figuras

Figura 1: Producción de embriones tetraploides, inyección de células ES en blastocistos tetraploides.

Figura 2: Análisis de la GPI de ratones recién nacidos y de la descendencia de ratones ES que proceden de células R1.

Figura 3: Comparación de la expresión del gen lacZ en fetos ES y en fetos que proceden de cruces heterocigotos.

En los siguientes Ejemplos, que ilustran el presente invento, se utilizaron, cuando no se indicase otra cosa distinta, los siguientes materiales y métodos:

a) Ratones

Como donantes de embriones diploides se utilizaron ratones C57BL/6 y como donantes de embriones tetraploides se utilizaron ratones B6CBAF1 (C57BL/5 x CBA). Ambas razas son homocigóticas para el alelo Gpi-1^{b} en el locus Gpi-1, que codifica la glucosa fosfato isomerasa (GPI de Glukose Phosphat Isomerase).

b) Células ES y transferencia de genes

Se utilizaron las siguientes células ES descritas en la bibliografía:

: células D3 (Doetchmann y colaboradores, 1985)

: células R1 (Nagy y colaboradores, 1993)

: células J1 (Li y colaboradores, 1992).

Se aislaron células GS1 a partir de blastocistos de la subraza 129/SV/EV. Esta raza de ratón se estableció a partir de un ratón quimérico, obtenido después de una transferencia desde la línea germinal de células ES del genotipo AB1. Las células AB1-ES habían sido establecidas originalmente a partir de la subraza 129/Sv/EV, tal como ha sido descrito por McMahon y Bradley, 1990, y por Papaioannou, 1993. Para el aislamiento de las células GS1, se utilizó en lo esencial el método descrito por Robertson, 1987: Se sembraron blastocistos sobre una placa de 4 pocillos en células alimentadoras, la ICM se multiplicó después de una cultivación durante 5 días. Los terrones similares a células ES se desintegraron con una pipeta y se sembraron de nuevo sobre una nueva placa con células alimentadoras. Las células ES expandidas fueron identificadas e investigadas adicionalmente en lo que se refiere a su cariotipo y a su totipotencia en lo que se refiere al desarrollo.

Todas las células ES fueron aisladas originalmente a partir de la reproducción de blastocistos, que se habían obtenido a partir de la raza de ratón 129, que es homocigótica para el alelo Gpi-1^{a}. Con el fin de modificar a las células ES, células R1 de la pasada 16 se electroporaron con diferentes construcciones; clones resistentes a G418 fueron seleccionados y expandidos antes de la elección. Se utilizaron las siguientes construcciones: un vector que sobreexpresa al c-fos (Wang y colaboradores, 1991); un denominado "vector de atrapamiento de genes" con la denominación pSA\betageo, que contiene un gen de fusión lacZ - neo sin promotor, y que tiene la propiedad de poder integrarse en intrones de genes arbitrarios (Friedrich y Soriano, 1991); un denominado "vector de dirección hacia genes" ["Gene Targeting-Vector"] , que interrumpe al gen Pax5 por recombinación homóloga en ratones (Urbánek y colaboradores, 1994), así como un vector de dirección hacia genes que interrumpe por recombinación homóloga al gen fra-1 endógeno ("antígeno 1" relacionado con Fos ["Fos related antigen 1"]). Para la producción del vector de dirección hacia el gen fra-1 se aislaron a partir de una biblioteca genómica de ratón algunos clones cósmidos, que contienen el gen fra-1, y se determinaron la secuencia y la organización de exones e intrones de todo el gen. Sobre la base de esta información se introdujo en el gen fra-1 una mutación cero (nula) por recombinación homóloga en células ES. Partiendo del plásmido pGNA (Le Mouellic y colaboradores, 1990; 1992) se construyó un vector de dirección hacia genes. En éste, los dominios esenciales de fijación y dimerización de ADN (Leucinzipper) de fra-1 habían sido reemplazados por los genes bacterianos, que codifican la \beta-galactosidasa y la resistencia a neomicina, que sirven en animales mamíferos como genes reporteros o como marcadores seleccionables. Después de la electroporación de células ES, se analizaron colonias resistentes a G418, o bien mediante un análisis de transferencia de borrón Southern [Southern blot] o por una tinción, para determinar la actividad de \beta-galactosidasa, con el fin de confirmar la integración de los vectores.

c) Obtención de embriones de dos células; fusión eléctrica

Embriones de dos células fueron aislados a partir de ratones B6CBAF1 hembras en el día 1,5 después del coito (p.c.) y se utilizaron para la producción de blastocistos tetraploides (Figura 1A). Mediante fusión eléctrica se produjo una tetraploidía de los embriones, habiendo sido modificado el procedimiento descrito por Nagy y Rossant (1993); embriones de dos células fueron equilibrados durante 30 s (segundos) en una solución 0,3 M de manitol, antes de que ellos fuesen dispuestos individualmente entre dos electrodos de platino en manitol 0,3 M y fuesen sometidos a un corto golpe de corriente eléctrica a 95 V durante 30 \mus (microsegundos) en un campo efectivo de 2 V mediando utilización de un generador de choques de corriente eléctrica CF-100 (Biochemical Laboratory Service; Budapest) (Figura 1B). Después de un período de tiempo de incubación de 15 min (minutos) comenzaron a fusionarse dos blastómeros (Figura 1C, flecha vacía) y a formar gradualmente un embrión de una célula (Figura 1C, flecha).

d) Asociación de células AS con mórulas, inyección de células ES en blastocistos

Para la asociación, las mórulas se aislaron a partir de los oviductos de ratonas embarazadas (día 2,5 p.c.) o se obtuvieron a partir de embriones de una célula tetraploides, cultivando a éstos durante 24 hasta 40 h después de la fusión eléctrica. El tratamiento y la asociación de las células ES se llevo a cabo, tal como ha sido descrito por Nagy y colaboradores (1990). Se aislaron blastocistos diploides a partir del útero de ratonas C57BL/6 embarazadas (día 3,5 p.c.). Con el fin de obtener blastocistos tetraploides, los embriones de una célula fusionados eléctricamente se cultivaron durante 48 a 60 h (horas) después de la fusión (en el medio M16 a 37ºC en una incubadora con una mezcla de 95% de aire y 5% de CO_{2}; Figura 1D). Las células ES, de tipo salvaje o manipuladas genéticamente, se inyectaron luego con el método descrito por Wang y colaboradores (1991) en blastocistos diploides o tetraploides (Figura 1E, Figura 1F). Mientras que los embriones diploides inyectados se desarrollaron en el período de tiempo de embarazo normal y luego se desprendieron de un modo natural, las ratonas embarazadas que habían concebido los embriones tetraploides se sometieron en el día 18,5 a una operación de cesárea (Nagy y colaboradores, 1990). Los fetos viables, valorados a causa de los latidos del corazón y la respiración, fueron criados por una hembra que había parido en el mismo día o en el día anterior. Algunos de los cachorros vivos se investigaron en cuanto a marcadores de la GPI. Los ratones ES sobrevivientes se emparejaron adicionalmente con ratones C57BL/6 de tipo salvaje, con el fin de ensayarlos en cuanto a la fertilidad y la herencia de línea germinal.

e) Análisis de la isoenzima GPI

Diferentes tejidos de fetos o animales adultos, que procedían de células ES, se aislaron y se desmenuzaron en agua destilada. Las muestras fueron lisadas mediante tres ciclos de congelación y descongelacion, y fueron sometidas, después de la extracción de proteínas, al análisis de la GPI, como ha sido descrito por Bradley (1987) y Wang y colaboradores (1991). En los tejidos quiméricos se estimó la proporción de las células, que procedían de células ES o de la anfitriona, a partir de la relación de la actividad de la isoenzima GPI-1A o bien GPI-1B, que había sido hecha visible en un ensayo óptico acoplado.

f) Histoquímica de la \beta-galactosidasa

Se utilizó el método descrito por Sanes y colaboradores (1996) en una forma modificada, con el fin de determinar la actividad de \beta-galactosidasa en embriones intactos fijados. Los embriones y sus membranas extra-embrionarias se fijaron durante 5-10 min (con 100 mM de fosfato de Na, de pH 7,4, 5 mM de EGTA, 2 mM de MgCl_{2}, 0,2% de glutaraldehído), a continuación se lavaron tres veces (con 100 mM de fosfato de Na, de pH 7,4, 2 mM de MgCl_{2}, 0,01% de desoxicolato de Na, 0,02% de NP-40) y se tiñeron con una mezcla de reacción histoquímica (100 mM de fosfato de Na, de pH 7,4, 2 mM de MgCl_{2}, 0,01% de desoxicolato de Na, 0,02% de NP-40, 5 mM de cianuro de K y hierro (III), 5 mM de cianuro de K y hierro (II) y 1 mg/ml de X-Gal).

Ejemplo 1 Producción de ratones quiméricos, que proceden de embriones diploides y de células ES de tipo salvaje

Con el fin de ensayar el potencial de desarrollo de diferentes linajes de células ES, se utilizaron en primer término cuatro diferentes linajes de células ES de tipo salvaje, con el fin de producir ratones quiméricos, y concretamente, por un lado, por asociación de las células ES con mórulas diploides, por otro lado, mediante su inyección en blastocistos diploides. De la totalidad de los cuatro linajes de células ES se pudo mostrar que éstos están en situación, después de que se hubieron incorporado en embriones de ratón diploides, de suministrar un alto grado de quimerismo así como de formar quimeras de línea germinal con gran frecuencia (véase la Tabla 1). De manera interesante, se obtuvo una alta proporción de quimeras hembras también con células R1 y J1, de las que algunas heredaron el color de la piel Agouti de la raza 129/Sv en su descendencia (Tabla 1).

Ejemplo 2 Producción de ratones ES viables por asociación de células ES con embriones tetraploides o por inyección de las células en blastocistos

Con el fin de producir embriones tetraploides, embriones de dos células recibieron un golpe de corriente eléctrica, que condujo a la fusión de aproximadamente un 90% de los embriones. Estos embriones se cultivaron adicionalmente. Se llevaron a cabo cinco experimentos, en los cuales los embriones se desarrollaron con alta frecuencia para formar mórulas (68-95%) y para formar blastocistos (80-98%). Las mórulas se utilizaron para la asociación con células ES y los blastocistos se utilizaron con el fin de inyectar células ES en ellos (Figura 1E, Figura 1F). La totalidad de los cuatro linajes de células Es de tipo salvaje (D3, R1, J1 y GS1) se utilizaron en atención a la producción de ratones ES. A partir de la asociación con células D3, después de una operación de cesárea se obtuvieron 26 animales recién nacidos vivos, de los cuales sin embargo no sobrevivió ninguno (Tabla 2). Asimismo, a partir de células J1 no se pudo obtener ningún ratón ES viable (Tabla 2). En contraposición con ello, las células R1, después de una asociación con mórulas tetraploides, proporcionaron ratones ES con una frecuencia similar (véase la Tabla 2) a como se describió por Nagy y colaboradores, 1993.

Puesto que el método de la inyección de células ES en blastocistos diploides era similarmente eficiente, en lo que se refiere a la formación de quimeras, a como lo era el método de asociación (véase también la cita de Wood y colaboradores 1993), se investigó como siguiente paso si se pueden obtener ratones ES por inyección de células de tipo salvaje en blastocistos tetraploides. En el caso de la utilización de células D3 a partir de la pasada 9, se pudo obtener una proporción relativamente alta (28%) de fetos totalmente desarrollados en el día 18,5 p.c. (E18,5) mediante una operación de cesárea (Tabla 2); los recién nacidos no pudieron sin embargo mantener la respiración y murieron poco tiempo después de ello. De manera interesante, estos animales recién nacidos tenían un peso corporal más alto así como una polidactilidia más alta. De 36 blastocistos tetraploides, que se habían inyectado con células R1 (de la pasada 14), nueve cachorros viables nacieron mediante una operación de cesárea en el momento E18,5 (Tabla 2). Cinco de ellos pudieron mantener la respiración y fueron criados por una madre nodriza. Desgraciadamente, dos cachorros no se pudieron encontrar después de 7 días y uno murió a la edad de 5 semanas. Dos de estos ratones ES sobrevivieron hasta la edad adulta y mostraron una herencia total de la línea germinal (Tabla 2). Después de la inyección de células GS1 en 54 blastocistos tetraploides se desarrollaron 17 embriones en el período de tiempo de embarazo normal (Tabla 2). Seis cachorros nacieron mediante cesárea y pudieron mantener su respiración. Cinco cachorros murieron en el transcurso de 48 h, y un ratón ES sobrevivió hasta la edad adulta y dejó en herencia el material genético procedente de las ES en la descendencia (Tabla 2).

Ejemplo 3 Producción de ratones ES con clones celulares ES modificados genéticamente

Después de que a partir de blastocistos tetraploides, en los que se habían inyectado células de tipo salvaje R1 o GS1, hubieron resultado ratones ES viables, se investigó, como siguiente paso, si el método conforme al invento es apropiado también para proporcionar ratones ES mutantes a partir de células ES manipuladas genéticamente. Como primer paso, células R1 se electroporaron con el vector de expresión c-fos y dos clones resistentes a G418, con las denominaciones R-169.2.3 y R-169.2.5, se utilizaron para la inyección en blastocistos tetraploides (los clones R1 se cultivaron antes de su inyección en blastocistos durante más de 24 pasadas). El clon R-169.2.5 se inyectó en total en 103 blastocistos; se obtuvieron doce recién nacidos mediante una operación de cesárea. Tres de ellos mantuvieron su respiración, pero murieron después de 48 h. El clon R 169.2.3 proporcionó un mayor número de recién nacidos sobrevivientes; 23 cachorros eran viables después de la operación de cesárea; doce de ellos fueron criados por una madre nodriza (Tabla 2). Desgraciadamente, siete recién nacidos murieron en los primeros tres días a causa del cuidado insuficiente por la madre nodriza. Otros dos ratones se perdieron durante la fase de destete. Tres ratones sobrevivieron hasta la edad adulta. Después de que mediante un análisis Southern Blot se hubo confirmado que el transgén se había heredado en la descendencia, se establecieron dos linajes transgénicos.

En un experimento adicional se utilizó un clon R1 con la denominación R-fra 3 (fra-1 +/-) procedente de la pasada 24, en el que un alelo del gen fra-1 ha sido interrumpido por recombinación homóloga. Células R-fra 3 se inyectaron en 48 blastocistos tetraploides; mediante una operación de cesárea se obtuvieron ocho cachorros vivos. Cuatro de cinco recién nacidos, criados por una madre nodriza, alcanzaron la edad adulta, y de tres de ellos se pudo confirmar que habían heredado el alelo mutado (fra-1 +/-) en la descendencia (Tabla 2). La ratona quimérica hembra era estéril, lo cual estaba en contraposición con los resultados obtenidos con células R1 de tipo salvaje, donde con estas células y con embriones diploides se obtuvieron hembras quiméricas, que pudieron producir y aportar la descendencia de línea germinal.

Ejemplo 4 Análisis de la GPI en tejidos de fetos ES y ratones ES

Con el fin de confirmar, que los fetos y ratones adultos, obtenidos de acuerdo con los Ejemplos anteriores, proceden realmente de una manera exclusiva de células ES, se llevó a cabo un análisis de la GPI, con el que se puede determinar la contribución de las células ES a la formación de tejidos. A partir de los experimentos, en los que se había llevado a cabo una asociación, la totalidad de los once fetos procedentes de células D3, uno procedente de células R1 y uno procedente de células J1, mostraron en todos los tejidos investigados una procedencia en un 100% de células ES (Tabla 3). Un feto derivado de células R1 tenía una pequeña proporción de tejido (aproximadamente un 10%) en el corazón, que procedía de células anfitrionas, procediendo los otros tejidos investigados exclusivamente de células ES (Figura 2A, Tabla 3). De igual modo, la mayor parte de los fetos ES y la totalidad de los ratones ES adultos derivados de R1 y GS1, que se habían producido mediante inyección de las células en blastocistos tetraploides, procedían exclusivamente de células ES, con la excepción de dos fetos derivados de las D3 (E18,5), que tenían en el corazón, en el pulmón y en el hígado una contribución de células anfitrionas en un grado de 10 hasta 50%. De manera digna de mención, cuatro fetos procedentes de células R1 ya manifestaron en el estadio temprano (día 13,5 p.c) exclusivamente el marcador GPI-1A especifico para ES (Tabla 3). Adicionalmente, los descendientes de los ratones ES procedentes de R1 se investigaron mediante un análisis de la GPI, pudiéndose mostrar que ellos procedían de células ES.

Los fetos ES y los ratones adultos, que se habían producido por inyección de células R1 modificadas genéticamente en blastocistos tetraploides, se investigaron asimismo mediante un análisis de la GPI. De tejidos de dos cachorros recién nacidos (E18,5) que se habían derivado del clon ES R-169.2.5, se mostró que ellos procedían totalmente de células ES. El análisis de la GPI de cachorros con una edad de tres días (derivados de células D3) y de ratones adultos, que se habían producido con células R1, que o bien sobreexpresaban un trasgén c-fos (R-169.2.3) o un alelo desactivado de fra-1 (R-fra-3) mostró, en todos los tejidos investigados, que éstos procedían en un 100% de células ES (Tabla 3). Además, en la descendencia de estos ratones ES se llevaron a cabo análisis de la GPI y Southern Blot. En este caso, se confirmó que solamente el marcador GPI-1A estaba presente en todos los descendientes; algunos heredaron también o bien el transgén (c-fos) o el alelo interrumpido fra-1. La Figura 2A muestra el análisis de la GPI de ratones ES recién nacidos, que procedían de células R1. Todos los tejidos, excepto la placenta y el corazón, contenían solamente el marcador GPI-1A, lo cual apunta a una procedencia de células ES en un 100%. La Figura 2B muestra el análisis de la GPI de la descendencia de un ratón ES: La sangre de cuatro cachorros de un ratón ES adulto contenía exclusivamente la isoenzima GPI-1A, lo cual confirma la procedencia de ES de la descendencia.

Ejemplo 5 Comparación del modelo de expresión de genes de embriones de células ES y embriones de línea germinal

Con el fin de comprobar la idoneidad del procedimiento conforme al invento para la producción de ratones ES destinados a la investigación de la expresión de genes y fenotipos mutantes, se investigó cuándo y dónde se habían expresado genes específicos en embriones de células ES y en embriones de línea germinal. Para esta investigación, se seleccionaron dos clones de células ES, manipulados genéticamente, que contenían el gen reportero lacZ, conduciendo uno de ellos a un modelo muy restringido de expresión de lacZ (Pax5 +/-, clon ES D3-15; Urbánek y colaboradores, 1994); mientras que el otro proporcionaba una extensa coloración de \beta-galactosidasa (compárese más abajo). La Figura 3 muestra la comparación de la expresión del gen lacZ en fetos ES (Figuras 3A,C), con la existente en fetos que procedían de cruces heterocigotos (Figuras 3B,D). Los embriones E9,5 obtenidos a partir de blastocistos tetraploides, que habían sido inyectados con el clon D3-15, mostraron una expresión específica del gen lacZ en la frontera entre el mesocéfalo (cerebro medio) y el cerebro trasero (Figura 3A, flecha). Este modelo de tinción era idéntico al obtenido de embriones, que se habían obtenido a partir de cruces heterocigotos (Figura 3B, véase también la cita de Urbánek y colaboradores, 1994). El segundo clon ES investigado era un clon R1 con la denominación R-\betageo3, que se había obtenido a partir de un experimento de atrapamiento de genes. Las células R-\betageo3 se inyectaron en blastocistos diploides y tetraploides. Los embriones diploides inyectados proporcionaron quimeras fértiles, algunos de ellos heredaron el transgén lacZ en su descendencia. Transcurrió un período de tiempo de aproximadamente cuatro a cinco meses para establecer un linaje de ratón transgénico de este tipo y tener a disposición embriones procedentes de cruces heterocigotos. Los embriones, obtenidos mediante inyección de células R-\betageo3 en blastocistos tetraploides, se aislaron en el día 8,5 y se tiñeron para determinar la actividad de \beta-galactosidasa. En todo el embrión propiamente dicho, en la membrana amniótica (Figura 3, flecha vacía) y en el alantoides se detectó una intensa tinción, pero no en la vesícula blastodérmica (Figura 3C, flecha vacía). Este modelo de tinción era idéntico al modelo de tinción obtenido en embriones heterocigotos que se habían obtenido después de un cruce heterocigoto (Figura 3D). Estos resultados muestran que el modelo de expresión del transgén en ratones ES se conserva de manera segura a través de la herencia de la línea germinal.

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Claims

1. Procedimiento para la producción de animales mamíferos no humanos, que se derivan de células troncales embrionarias con propiedades genéticas definidas, en particular animales mamíferos transgénicos, en el que células troncales embrionarias de la misma especie de animal mamífero se introducen en blastocistos y el embrión obtenido se transfiere a una madre nodriza, caracterizado porque se introducen células troncales embrionarias con propiedades genéticas definidas en blastocistos tetraploides.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los animales mamíferos son ratones.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se utilizan blastocistos, que se habían obtenido mediante fusión eléctrica de embriones de dos células y subsiguiente cultivación.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las células troncales embrionarias se introducen mediante microinyección en blastocistos tetraploides.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se utilizan células troncales embrionarias manipuladas genéticamente.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque las células troncales embrionarias manipuladas genéticamente se habían obtenido por introducción de plásmidos, que son portadores de la deseada modificación genética.