ES2226681T3 - Uso de factor de crecimiento epidermico como agente terapeutico gastrointestinal. - Google Patents

Abstract

Un uso de factor de crecimiento epidérmico (EGF) para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir las úlceras gástricas o las dolencias debidas a úlceras gástricas en un animal susceptible a esas úlceras o que las padece, en el que dicha dolencia surgida de las úlceras gástricas es la colonización bacteriana de los lugares de úlcera gástrica y en el que dicha bacteria es Helicobacter pylori.

Description

Uso de factor de crecimiento epidérmico como agente terapéutico gastrointestinal.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con el uso de factor de crecimiento epidérmico (EGF) como agente terapéutico gastrointestinal. En particular el EGF se puede utilizar para promover la ganancia de peso y evitar la colonización gastrointestinal por patógenos. El EGF se puede usar también para aumentar la absorción de inmunoglobulinas. La inhibición de la cascada de señalización del EGF se puede usar para evitar la captación de compuestos tóxicos o adversos así como para promover la pérdida de peso.

Antecedentes de la invención

Algunos factores de crecimiento intestinal aceleran la maduración y renovación del epitelio. Uno de ellos es el factor de crecimiento epidérmico (EGF), un péptido gastrointestinal pequeño, estable en medio ácido, presente de forma natural en las secreciones salivales e intestinales y en otros líquidos corporales, producido en grandes cantidades en el calostro y en la leche. El EGF promueve a) la proliferación y diferenciación de las células intestinales durante las etapas tempranas de la vida, b) la maduración funcional del intestino previa al destete, y c) la proliferación epitelial en el tubo digestivo adulto (10, 11, 12, 13, 14). Además el EGF regula por aumento de forma aguda (en minutos) la absorción intestinal de electrólitos y nutrientes, un efecto que, según se ha demostrado, está relacionado con un alargamiento simultáneo de las microvellosidades apicales de los enterocitos (15). Los beneficios terapéuticos potenciales del EGF se han resaltado en estudios en los que el tratamiento tópico con EGF promovió la cicatrización de heridas (30) y, más recientemente, por la observación de que la administración de EGF potencia la absorción de nutrientes en el resto de intestino después de la resección masiva (16). El colon, en el que se observa la máxima carga bacteriana durante la infección por microorganismos como Escherichia coli, exhibe más receptores de EGF (17) que el intestino delgado. El EGF regula por aumento la función de todo el intestino, incluido el colon (12,16).

Aunque se han descrito diversas funciones del EGF, no se había publicado anteriormente su función de prevenir la colonización intestinal por patógenos o de acelerar la ganancia de peso. Estas dos propiedades recientemente descubiertas lo convierten en un agente terapéutico extremadamente útil. La capacidad del EGF de prevenir la colonización o infección intestinal por patógenos puede tener importantes aplicaciones terapéuticas. Una de estas aplicaciones es el tratamiento de la colibacilosis entérica en animales de granja jóvenes.

La colibacilosis entérica es una infección bacteriana con considerables implicaciones para la economía de la industria agrícola. La colibacilosis entérica (también llamada disentería) es una de las enfermedades más frecuentes de los animales de granja recién nacidos o jóvenes (1-6). El microbio responsable es la bacteria patógena Escherichia coli (E. coli). La infección ocurre en cualquier lugar de cría de animales de granja y es una causa importante de pérdidas económicas en el occidente de Canadá y en otras partes del mundo. La enfermedad se caracteriza por diarrea, deshidratación y posiblemente la muerte. Por lo tanto, existe una necesidad real de desarrollar un método de evitar las pérdidas económicas causadas por la colibacilosis entérica.

Además de tratar la colibacilosis entérica en animales jóvenes de granja, el EGF se puede emplear también para tratar o prevenir cualquier dolencia que se produce como consecuencia de la colonización intestinal por un patógeno, es decir, un virus (por ejemplo, coronavirus, parvovirus, rotavirus), una bacteria (por ejemplo, Salmonella sp. y Shigella sp.) o un parásito (por ejemplo, Cryptosporidium sp. y Eimeria sp.) y la diarrea del viajero. El documento EP-A-0161817 muestra que el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la urogastrona humana, un polipéptido emparentado con él, protegen la mucosa gastrointestinal contra la formación de úlceras por estímulos lesivos; se reivindica específicamente el uso de la urogastrona humana para elaborar un medicamento con el fin de promover la cicatrización de la úlcera gastrointestinal. M. ITOH y col. describen en el JOURNAL OF CLINICAL GASTROENTEROLOGY 10(1), 1988, S7-S12, que la urogastrona humana corresponde al EGF humano en su estructura química y su actividad biológica, y que el EGF posee un efecto citoprotector directo sobre la mucosa gástrica. S.J. Konturek publica en el SCANDINAVIAN JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY, 23(2), 1988, p. 129-133, que la urogastrona contiene 37 aminoácidos, que son idénticos a los del EGF. También se han descrito formulaciones farmacéuticas que contienen factor de crecimiento epidérmico (EGF) en los documentos US-A-3917824, EP-A-0267015, EP-A-0454026, EP-A-0545772, WO-A-93/21224.

Otro uso importante del EGF consiste en la prevención de la colonización bacteriana en lugares de úlcera gástrica. En la actualidad, está perfectamente probado que la infección por la bacteria Helicobacter pylori es un factor de riesgo importante de recidiva de la úlcera péptica. Se ha demostrado que ocurre colonización bacteriana en el lugar de la úlcera y que contribuye a la cronicidad de la misma. Por lo tanto, el EGF puede ser útil para prevenir la colonización por la bacteria Helicobacter pylori y, por lo tanto, puede resultar útil para acelerar la cicatrización de las úlceras gástricas.

Además de demostrar que la administración de EGF puede prevenir la colonización intestinal por patógenos, los inventores han demostrado también que el EGF puede potenciar la ganancia de peso en animales. Este último efecto es inesperado porque ciertas publicaciones han indicado que el EGF carece de efecto sobre la ganancia de peso (21,25). Otros estudios que investigaron los efectos del EGF en cerdos (28,29) fueron incapaces de demostrar una aceleración de la velocidad de crecimiento, a pesar de detectar aumentos simultáneos de los niveles de disacaridasas intestinales.

El uso de EGF para acelerar la ganancia de peso también tiene numerosas aplicaciones terapéuticas importantes. Esta propiedad es útil al tratar la infección intestinal, especialmente cuando la infección va acompañada de pérdida de peso por diarrea y deshidratación. Esta propiedad también resulta útil para aumentar la producción en la industria animal, como por ejemplo en la industria vacuna, porcina, avícola y piscícola. Esta última industria gana importancia a medida que se incrementa la producción de pescado por acuicultura. En la industria animal, el EGF puede administrarse fácilmente como aditivo alimentario o en el agua de bebida de los animales de granja. El empleo de EGF para promover la ganancia ponderal se puede utilizar también en el tratamiento de personas mal nutridas o pacientes con anorexia nerviosa.

Además de prevenir la colonización por patógenos y aumentar la ganancia de peso, también se ha demostrado que el EGF aumenta la absorción intestinal de nutrientes. Esta propiedad posee también múltiples aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, esta propiedad hace que el EGF resulte más útil en el tratamiento de infecciones intestinales o en promover la ganancia de peso aumentando la absorción de nutrientes que pueden ser necesarios en esas circunstancias. Además, regulando por aumento la absorción gastrointestinal, el EGF puede incrementar también la captación de inmunoglobulina en el recién nacido.

La principal fuente de inmunoglobulina en el recién nacido es el calostro y la leche materna, y la falta de absorción apropiada de inmunoglobulina materna está relacionada con una elevada morbilidad y mortalidad por enfermedades infecciosas (31). La velocidad de absorción de inmunoglobulina es máxima durante los primeros días de vida, después de lo cual se produce una disminución de la captación de inmunoglobulina y el cierre del tubo digestivo. La administración de EGF puede a) promover la absorción de inmunoglobulina del calostro, la leche u otras fuentes (como los preparados orales de inmunoglobulina) y b) retrasar el cierre intestinal, lo que puede facilitar también la captación de inmunoglobulina.

Como se ha tratado anteriormente, el EGF causa un aumento de la absorción intestinal de nutrientes. En consecuencia, la inhibición de la cascada de señalización del EGF disminuye la absorción intestinal de nutrientes. Nunca se han estudiado los beneficios clínicos de inhibir la cascada de señalización del EGF en la regulación de la absorción gastrointestinal de nutrientes. Se predice que es posible utilizar antagonistas del receptor de EGF o de la cascada de señalización del EGF como agentes terapéuticos gastrointestinales en las situaciones en las que puede estar justificada una disminución de la absorción gastrointestinal, como, por ejemplo, en el tratamiento de la obesidad, o para disminuir la captación intestinal de sustancias tóxicas o adversas.

Resumen de la invención

La presente invención está relacionada con el uso del factor de crecimiento epidérmico (EGF) para la fabricación de un medicamento como se describe en las reivindicaciones 1 y 8. Las realizaciones preferidas de la invención se describen en las reivindicaciones adjuntas 2-6 y 8-12.

El término "animal", tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye todos los miembros del reino animal, como los peces y los mamíferos (incluidos los animales de granja e incluso los seres humanos).

El término "patógeno", tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye cualquier organismo capaz de causar patología, como las bacterias, los virus y los parásitos. Ejemplos de patógenos bacterianos que pueden invadir el tubo digestivo son E. coli y Salmonella typhimurium.

El EGF se administra preferiblemente por vía oral, por ejemplo, en el alimento del animal. Además, se ha demostrado que el EGF liofilizado añadido al agua de bebida es estable y, por lo tanto, puede ser administrado de esta forma.

En una realización, la presente invención proporciona el uso de EGF para la fabricación de un medicamento con el objetivo de prevenir la colonización bacteriana de úlceras gástricas o acelerar la cicatrización de úlceras gástricas asociadas a Helicobacter pylori.

El uso de EGF para la para la fabricación del medicamento de la invención lleva a una ganancia de peso en un animal. Esto resulta útil para aumentar la producción en la industria animal, como en la industria agrícola y la acuicultura, donde se demandan aditivos alimentarios no farmacológicos para potenciar la producción.

El uso de EGF en el medicamento también aumenta la absorción de inmunoglobulina en el intestino de un animal, especialmente en un animal recién nacido.

En el ámbito de la presente invención también se incluye el uso de EGF para preparar un medicamento para tratar o prevenir cualquiera de dichas dolencias anteriormente.

Descripción del dibujo

La Figura 1 es una gráfica que muestra el efecto del EGF sobre la ganancia de peso en conejos.

Descripción detallada de la invención Ejemplo 1 Efecto del EGF sobre la infección intestinal.

Se realizaron experimentos con el fin de determinar los efectos del EGF sobre la infección intestinal por E. coli. Los resultados de los experimentos se han combinado y se resumen a continuación.

Se estudiaron en 3 grupos 28 conejos New Zealand White (de 6 semanas de edad) en 3 grupos: 1) Controles (Con, n=9), 2) infectados con 1 x 10^{7} RDEC-E. coli (I, n=10), y 3) infectados tratados con 60 \mug diarios de EGF por vía oral durante 10 días, empezando 3 días antes de la infección (I-EGF, n=9). Diariamente se evaluaron en los animales la ganancia de peso, la eliminación rectal de E. coli y la presencia de diarrea. Siete días después de la infección, se sacrificaron los animales y se obtuvo mucosa del yeyuno (JEJ), el íleon (ILE) y el colon proximal (PROX) para efectuar la cuantificación de E. coli, y del yeyuno para realizar el análisis de enzimas en la mucosa.

En la tabla 1 se muestran los resultados de los experimentos. Los coprocultivos de los conejos infectados (I) y de los infectados y tratados con EGF (I-EGF) fueron positivos para E. coli, pero no los de los conejos de control. En el grupo I, 4 animales tenían diarrea en comparación con ningún caso en los animales I-EGF y en los de control. La infección tuvo como consecuencia una disminución de la ganancia de peso que se evita con el EGF (véase Tabla 1). El tratamiento con EGF también redujo la colonización del yeyuno, el íleon y el colon proximal por E. coli en más del 85% en comparación con I, e impidió la disminución de la actividad yeyunal de maltasa y sacarasa.

Los resultados precedentes demuestran que la administración de EGF posee algunos beneficios clínicos en conejos infectados por E. coli, como se ilustra por la potenciación de la ganancia de peso y la ausencia de diarrea en comparación con los animales infectados no tratados. El tratamiento con EGF se asocia a un aumento de las actividades de disacaridasas y con una disminución de la colonización bacteriana en la mucosa intestinal.

Ejemplo 2 Efecto del EGF sobre la infección intestinal y la traslocación bacteriana

Se realizó un experimento para evaluar in vitro los efectos del EGF exógeno sobre la traslocación bacteriana a través del epitelio y para determinar si los efectos del EGF son específicos para cada bacteria.

Se añadieron 2 x 10^{8} Salmonella typhimurium o E. coli patógenas a la superficie apical de monocapas de CaCo2 humanas confluentes cultivadas en membranas Transwell (3,0 \mum de porosidad). Sobre las monocopas se depositó EGF apical (100 \muM)o solución salina con tampón de fosfato (PBS) 15 minutos antes de la infección. Cada hora después de la infección (0-7 h) se sustituyó el medio situado bajo la membrana, calculando la velocidad de migración bacteriana transepitelial (UFC/h)

Los resultados demuestran que, in vitro, el EGF retrasaba la traslocación inicial de E. coli 1 hora y después inhibía la tasa de invasión más del 95%. La traslocación de S. typhimurium se abolía por completo en las monocapas tratadas con EGF.

Los resultados anteriores demuestran que el EGF ejerce sus efectos clínicos, al menos en parte, interfiriendo en la traslocación bacteriana. El EGF puede ejercer también sus efectos controlando la colonización bacteriana interfiriendo en la multiplicación bacteriana y/o en la adherencia de las bacterias a la superficie intestinal. La microscopia electrónica de barrido en los estudios de membranas Transwell corroboraba este efecto. De hecho, estas observaciones revelaron cantidades significativamente más elevadas de microorganismos adheridos a las monocapas no tratadas en comparación con las que habían sido expuestas a EGF. Los hallazgos apoyan aún más el que la terapia con EGF puede ser útil para tratar o prevenir infecciones entéricas.

Ejemplo 3 Efecto del EGF sobre la ganancia de peso

Se examinaron los beneficios potenciales del EGF sobre la ganancia de peso. Un grupo de conejos New Zealand White (de 6 semanas de edad, 500-700 g) recibió dosis orales diarias de EGF humano recombinante (100 \mug/kg de peso corporal) y a los animales de control se les administró exclusivamente suero fisiológico. A los 9 días, los animales tratados con EGF tenían una ganancia de peso media acumulativa de 422 \pm 27 g( n=10) mientras que los controles sólo ganaron 394 \pm 16 g (n=11). Remitiéndonos a la Figura 1, la pendiente de la curva de regresión lineal de la ganancia de peso en animales tratados con EGF fue significativamente mayor (P 0,002) que la de los controles no tratados. Dado el aspecto lineal de ambas curvas, el proseguir la alimentación con EGF probablemente dé lugar un efecto creciente mantenido sobre la ganancia de peso.

Estos resultados indican que el EGF puede promover la aceleración de la ganancia de peso en animales sanos.

Ejemplo 4 Efecto del EGF y de un inhibidor del receptor de EGF sobre la absorción de nutrientes

Estos experimentos se realizaron para determinar los efectos del EGF y de un inhibidor del receptor de EGF sobre la absorción de nutrientes y la ultraestructura del borde en cepillo.

Los experimentos iniciales demostraron que el EGF luminal aumentaba la absorción de glucosa en tejido intacto. Experimentos posteriores examinaron los efectos del EGF y de un inhibidor del receptor de EGF (tirfostina 51) sobre la absorción de nutrientes por la membrana del borde en cepillo intestinal. La tirfostina 51 es un inhibidor específico de la tirosina quinasa, que constituye un elemento crucial en la cascada de señalización intracelular del EGF. Los estudios se realizaron en conejos New Zealand White (700-1000 g; aproximadamente 8 semanas de edad). Se ligaron 10 asas ciegas de yeyuno de 10 cm separadas por 1 cm empezando en una localización 5 cm distal al ligamento de Treitz. En experimentos separados se administraron EGF (60 mg/mL), EGF + tirfostina (10 \muM), o tirfostina sólo (10 \muM) en un excipiente de 1,5 mL de suero fisiológico a una de las asas. La otra asa sólo recibió excipiente y actuaba como control emparejado. Al cabo de una hora, se extirparon las asas y se realizó un raspado de la mucosa para preparar vesículas de membrana del borde en cepillo. Se determinó, mediante técnicas establecidas, la captación de nutrientes (D-glucosa y L-prolina) al interior de las vesículas de la membrana del borde en cepillo. El EGF en la luz estimulaba un aumento significativo con respecto a los controles (p<0,001) en el transporte de glucosa (EGF 16,1 \pm 1,0 frente a CONTROL 11,5 \pm 0,9 mmol/min/mg de proteína; n=5) y de prolina (EGF 3,8 \pm 0,5 frente al CONTROL (2,6 \pm 0,3 mmol/min/mg de proteína; n=5) del borde en cepillo. El transporte de glucosa y de prolina se potenciaron en un grado similar, lo que sugiere que el EGF estimula un aumento generalizado en el transporte de nutrientes. La administración simultánea de tirfostina (TYR) bloqueó por completo el aumento de la captación de glucosa inducido por EGF y provocó una reducción significativa (p<0,001) en la captación de nutrientes en comparación con los controles
(EGF + TYR 5,9 \pm 0,3 frente a CONTROL 10,7\pm 0,6 nmol/min/mg de proteína; n=4). Posteriormente, una serie adicional de experimentos estudió el efecto de la tirfostina sola sobre el transporte de glucosa del borde en cepillo. La tirfostina sola redujo significativamente la captación de glucosa (p<0,001) en comparación con los controles (TYR 8,0 \pm
0,8 frente a CONTROL 10,7 \pm 1,0 nmol/min/mg de proteína; n=4). Los inventores habían demostrado previamente que la absorción intestinal de nutrientes está relacionada con la ganancia de peso en diversos modelos diferentes. Por lo tanto, el tratamiento con EGF aumenta la absorción de nutrientes y promueve la ganancia de peso. A la inversa, el tratamiento con tirfostina puede promover una disminución de la ganancia de peso o la pérdida de peso, y, por lo tanto, puede resultar útil en el tratamiento de la obesidad. El tratamiento con tirfostina puede disminuir también la captación intestinal de sustancias tóxicas o adversas.

Ejemplo 5 Efecto del EGF sobre la absorción de inmunoglobulina

En otra serie de experimentos, se estudió la capacidad del EGF de aumentar la captación de inmunoglobulina en el intestino de animales jóvenes.

Se asignaron de forma aleatoria ratas (Sprague-Dawley, de 14 días de edad) a uno de los 3 grupos siguientes. En el tiempo 0, se administró una de las 3 soluciones siguientes por lavado oral a cada uno de los grupos. El grupo 1 recibió sólo suero fisiológico (0,4 mL). El grupo 2 recibió suero fisiológico (0,2 mL) + IgG de oveja (0,2 mL, 5 mg/mL). El grupo 3 recibió EGF en suero fisiológico (0,1 \mug/mL) + IgG de oveja (0,2 mL, 5 mg/mL). A la hora, las 2 horas y las cuatro horas tras la inoculación se extrajo sangre de 4 animales de cada grupo por punción cardíaca (después de anestesia con metoxifluorano). Se separó el suero sanguíneo, y se determinaron los niveles de IgG de rata por inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA). Los valores se expresan en forma de media \pm error estándar de IgG de oveja en el suero sanguíneo (\mugUmL)(Tabla 2).

Los resultados se muestran en la Tabla 2 e indican que la administración de EGF aumenta la captación de inmunoglobulina del intestino.

Lo anterior describe nuevas utilidades del EGF. En particular, se ha demostrado que el EGF previene la colonización gastrointestinal por patógenos y promueve la ganancia de peso en animales. Además, puede aumentar la absorción de inmunoglobulina en animales jóvenes. En consecuencia, el EGF es un agente muy útil que se puede emplear para aumentar la producción en la industria animal, como por ejemplo en la industria vacuna, porcina y avícola, así como en la acuicultura. Además el tratamiento con EGF puede resultar beneficioso en seres humanos (por ejemplo, durante la enfermedad de Crohn, la infección gastrointestinal, la diarrea del viajero, etc.) El EGF puede acelerar también la curación de las úlceras gastrointestinales evitando la colonización del lugar de la úlcera.

Los inhibidores del EGF pueden disminuir la absorción de nutrientes en el intestino y, como tales, pueden resultar útiles para tratar la obesidad o prevenir la absorción de toxinas.

La forma de administración, la formulación y la dosis de EGF o del inhibidor del EGF pueden modificarse dependiendo de la aplicación concreta. Por ejemplo, al tratar animales de granja jóvenes, el EGF se puede administrar por vía oral en el alimento o el agua de bebida del animal. Los límites de dosis pueden oscilar entre 10 y 10.000 \mug/kg al día.

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Referencias

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Claims (12)

1. Un uso de factor de crecimiento epidérmico (EGF) para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir las úlceras gástricas o las dolencias debidas a úlceras gástricas en un animal susceptible a esas úlceras o que las padece, en el que dicha dolencia surgida de las úlceras gástricas es la colonización bacteriana de los lugares de úlcera gástrica y en el que dicha bacteria es Helicobacter pylori.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho tratamiento previene la colonización bacteriana de los lugares de úlcera gástrica.

3. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho tratamiento acelera la cicatrización de las úlceras gástricas.

4. El uso según la reivindicación 1, en el que la bacteria Helicobacter pylori se asocia a dichas úlceras gástricas o a dolencias que surgen de las úlceras gástricas.

5. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento está diseñado para su administración oral.

6. El uso según la reivindicación 1 en el que dicho medicamento está diseñado para ser añadido al alimento de dicho animal.

7. Un uso de factor de crecimiento epidérmico (EGF) para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir las úlceras gástricas o dolencias que surgen de úlceras gástricas en un animal susceptible a estas úlceras o que las padece, en el que dicho tratamiento previene la colonización bacteriana de los lugares de úlcera gástrica.

8. El uso según la reivindicación 7, en el que dicha bacteria es Helicobacter pylori.

9. El uso según la reivindicación 7, en el que dicho tratamiento acelera la curación de las úlceras gástricas.

10. El uso según la reivindicación 7, en el que la bacteria Helicobacter pylori se asocia a dichas úlceras gástricas o a dolencias que surgen de las úlceras gástricas.

11. El uso según la reivindicación 7, en el que dicho tratamiento está diseñado para su administración oral.

12. El uso según la reivindicación 7, en el que dicho medicamento está diseñado para ser añadido al alimento de dicho animal.