PT1479394E - Utilização do factor de crescimento epidérmico (egf) para o aumento do ganho de peso num animal - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DO FACTOR DE CRESCIMENTO EPIDÉRMICO (EGF) PARA O AUMENTO DO GANHO DE PESO NUM ANIMAL"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização do factor de crescimento epidérmico (EGF) na alimentação ou na água de beber de animais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Um número de factores de crescimento intestinais acelera a maturação e renovação epitelial. Um deles é o factor de crescimento epidérmico (EGF), um pequeno peptídeo gastrointestinal, estável aos ácidos, que está presente naturalmente nas secreções salivares e intestinais e noutros fluidos corporais e é produzido em grandes quantidades no colostro e no leite. 0 EGF promove a) a proliferação e diferenciação de células intestinais durante os primeiros anos de vida, b) a maturação funcional do intestino pré-desmamo e c) proliferação epitelial no intestino adulto (10, 11, 12, 13, 14). Além disso, o EGF regula positivamente de modo agudo (no espaço de minutos) a absorção pelo intestino delgado de electrólitos e nutrientes, um efeito que se verificou estar relacionado a um prolongamento simultâneo das microvilosidades apicais de enterócitos, sublinhada em estudos onde o tratamento tópico com 1 EGF promoveu a cicatrização de feridas (30) e, mais recentemente, pela observação de que a administração de EGF melhora a absorção de nutrientes no intestino, remanescente após ressecção maciça (16). Em comparação com o intestino delgado, encontram-se mais receptores para EGF no cólon (17), onde é observada a maior carga bacteriana durante a infecção com microrganismos, tal como Escheriachia colí. O EGF regula positivamente a função em todo o intestino, incluindo o cólon (12, 16) . O documento GB-2198351 divulga uma composição compreendendo EGF e um material fornecedor de ferro mas explica que esta composição, quando alimentada, não tem nenhum efeito no crescimento de leitões. Zijlstra et al. descrevem em J. Ped. Gastroent. Nutr. 19(4):382-390 (1994) que suínos infectados com rotavirus tratados com EGF puderam ter um maior aumento no peso corporal nos dias 6 e 7 do estudo, mas não há nenhuma divulgação de um aumento de ganho de peso em geral. Imada et al. referem em Am. J. Physiol. 253 (3 Part 1) : E251-E254 (1987) que a administração de EGF a murganhos neonatais pode causar um aumento dependente da dose no ganho de peso, mas esse ganho de peso não foi diferente durante o tratamento com EGF.

Embora tenha sido referido que o EGF possui uma variedade de funções, não foi anteriormente referido o seu papel na prevenção da colonização intestinal por patógenos ou na aceleração do ganho de peso. Estas duas propriedades de EGF recentemente verificadas tornam-no extremamente útil como agente terapêutico. A capacidade de EGF para prevenir a colonização ou infecção intestinais por patógenos possui muitas aplicações terapêuticas importantes. Uma tal aplicação reside no tratamento da colibacilose entérica em animais de criação jovens. 2 A colibacilose entérica é uma infecção bacteriana com implicações consideráveis para a economia da indústria agrícola. A colibacilose entérica (igualmente denominada por diarreia) é uma das doenças mais comuns de animais de criação recém-nascidos e jovens (1 - 6) . 0 micróbio responsável pela doença é a bactéria patogénica Escherichia coli (E. coli) . A infecção ocorre onde quer que se mantenham animais de criação e é uma causa significativa de prejuízo económico no Canadá Ocidental e noutras partes do mundo. A doença é caracterizada por diarreia, desidratação e eventualmente a morte. Por conseguinte, existe uma verdadeira necessidade de desenvolver um método para prevenir o prejuízo económico causado pela colibacilose entérica.

Além do tratamento da colibacilose entérica em animais de criação jovens, o EGF pode ser igualmente utilizado no tratamento ou prevenção de qualquer estado que resulte de colonização intestinal por um patógeno, i. e., um vírus (por exemplo coronavírus, parvovírus, rotavírus), uma bactéria (por exemplo Salmonella sp. e Shigella sp.) ou um parasita (por exemplo Cryptospordium sp. e Eimeria sp.) e diarreia do viajante. Outra importante utilização de EGF reside na prevenção da colonização bacteriana nos locais de úlcera gástrica. Está já bem documentado que a infecção pelas bactérias Helicobacter pylorí constitui um factor de risco principal para a doença da úlcera péptica recorrente. Verificou-se que a colonização bacteriana ocorre no local da úlcera e contribui para a cronicidade da úlcera. Por conseguinte, o EGF pode ser útil na prevenção da colonização das bactérias Helicobacter pylori e, por conseguinte, pode ser útil na aceleração da cicatrização das úlceras gástricas. 3

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, por conseguinte, à utilização do factor de crescimento epidérmico (EGF) para a preparação de um agente para aumentar o ganho de peso num animal.

Outro aspecto da invenção é a utilização do factor de crescimento epidérmico para a preparação de um aditivo para a água de beber ou alimentação para o aumento do ganho de peso num animal. Um aspecto adicional refere-se a utilização do factor de crescimento epidérmico para a preparação de um medicamento para a promoção do ganho de peso num animal e, em particular, para a preparação de um medicamento para o tratamento de pessoas subalimentadas e pessoas sofrendo de anorexia nervosa.

De acordo com a presente invenção, o factor de crescimento epidérmico é adicionado na alimentação ou na água de beber do animal. 0 factor de crescimento epidérmico é administrado ao animal, de um modo preferido oralmente, de um modo mais preferido numa quantidade de 10 a 10000 yg/kg por dia e, de um modo muito preferido numa quantidade de 10 a 100 yg/kg e, de um modo preferido durante um período de, pelo menos, dez dias. O animal pode ser seleccionado de animal adulto, animal recém-nascido, animal jovem, animal juvenil, animal de criação, animal produtor de alimentos, ou um animal sofrendo de uma infecção. O animal pode igualmente ser o humano.

Para além da demonstração de que a administração de EGF pode prevenir a colonização intestinal por patógenos, os requerentes verificaram igualmente que o EGF pode melhorar o ganho de peso em animais. O último efeito é inesperado, visto 4 que determinadas publicações indicaram que o EGF não tem nenhum efeito no ganho de peso (21, 25) . Outros estudos investigando os efeitos de EGF em suinos (28, 29) foram incapazes de demonstrar uma aceleração na taxa de crescimento, apesar de aumentos simultâneos nos níveis de dissacaridases intestinais. A utilização de EGF na aceleração do ganho de peso possui, igualmente, muitas aplicações terapêuticas importantes. Esta propriedade é útil no tratamento da infecção intestinal, especialmente quando a perda de peso devida à diarreia e desidratação acompanha a infecção. Esta propriedade é, igualmente útil no aumento de produção na indústria animal, tais como na indústria da carne de bovino, de suíno, de aves domésticas e pesqueira. A última indústria está a tornar-se mais importante, à medida que está a ser produzido mais peixe através da aquacultura. Na indústria animal, o EGF pode ser facilmente administrado como aditivo alimentar ou na água de beber de animais de criação. A utilização de EGF para promover o ganho de peso pode ser igualmente utilizada para tratar pessoas subalimentadas e pessoas sofrendo de anorexia nervosa.

Para além de impedir a colonização por patógenos e de aumentar o ganho de peso, verificou-se igualmente que o EGF aumenta a absorção intestinal de nutrientes. Esta propriedade possui igualmente muitas aplicações terapêuticas. Por exemplo, esta propriedade torna o EGF mais útil no tratamento de infecções intestinais ou na promoção do ganho de peso, pelo aumento da absorção de nutrientes que podem ser necessários em tais circunstâncias. Além disso, por intermédio da regulação positiva da absorção gastrointestinal, o EGF pode igualmente aumentar a absorção de imunoglobulina no recém-nascido. 5 A principal fonte de imunoglobulina do recém-nascido consiste no colostro e leite maternos e a não absorção apropriada de imunoglobulina materna correlaciona-se com elevada morbidade e mortalidade devido a doenças infecciosas (31) . A taxa de absorção de imunoglobulina é maior durante os primeiros dias de vida, após os quais a absorção de imunoglobulina decresce e ocorre a oclusão intestinal. A administração de EGF pode (a) promover a absorção de imunoglobulina a partir do colostro, leite ou outras fontes (tais como preparações orais de imunoglobulina) e (b) retardar a oclusão intestinal a qual pode igualmente melhorar a absorção de imunoglobulina.

Como acima discutido, o EGF causa um aumento na absorção intestinal de nutrientes. Consequentemente, a inibição da cascata de sinalização de EGF reduz a absorção intestinal de nutrientes. Os benefícios clínicos da inibição da cascata de sinalização de EGF na regulação da absorção gastrointestinal de nutrientes nunca foram avaliados. Prevê-se que os antagonistas do receptor de EGF ou da cascata de sinalização de EGF possam ser utilizados como agente terapêutico gastrointestinal quando se justifique a diminuição da absorção intestinal, por exemplo, no tratamento da obesidade ou para diminuir a absorção intestinal de substâncias tóxicas ou adversas. 0 termo "animal" como aqui utilizado deve incluir todos os membros do reino animal, tais como peixes e mamíferos (incluindo animais de criação e, até, humanos). 0 termo "patógeno" como aqui utilizado deve incluir qualquer organismo capaz de causar doença, tal como bactérias, vírus e parasitas. Exemplos de patógenos bacterianos que podem 6 invadir o sistema gastrointestinal incluem a E. coli e a salmonella typhimurium.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de EGF para aumentar o ganho de peso num animal. Tal é útil no aumento de produção na indústria animal, tais como a indústria agrícola e indústria aquícola, em que exista uma procura de aditivos alimentares não farmacológicos que melhorem a produção. 0 EGF é, de um modo preferido, administrado oralmente, por exemplo na alimentação do animal. Para além disso, EGF liofilizado adicionado à água de beber provou ser estável e pode, por conseguinte, ser administrado como tal.

Num aspecto secundário, a utilização de EGF como acima descrito, trata e previne igualmente as infecções entéricas (virais, bacterianas ou parasitárias) num animal.

Noutro aspecto secundário, a utilização de EGF como acima descrito, serve para tratar ou prevenir a colibacilose entérica (diarreia) num animal.

Noutro aspecto secundário, a utilização de EGF como acima descrito, ajuda a prevenir a úlcera gástrica ou para acelerar a cicatrização de úlceras gástricas associadas a Helicobacter pylori.

Num aspecto secundário adicional, a utilização de EGF como acima descrito, aumenta a absorção de imunoglobulina no intestino de um animal, especialmente um animal recém-nascido. 7

Ainda num aspecto adicional, a presente invenção proporciona a utilização de um agente que inibe a actividade de EGF para diminuir a absorção intestinal de nutrientes. 0 que pode ser útil em situações onde se deseje uma absorção intestinal diminuída, tais como no tratamento da obesidade ou na diminuição da absorção intestinal de toxinas. A presente invenção inclui igualmente dentro do seu âmbito a utilização de EGF para preparar um medicamento para tratar ou prevenir quaisquer dos estados acima mencionados.

Descrição do Desenho A figura 1 é um gráfico exibindo o efeito de EGF no ganho de peso em coelhos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO EXEMPLO 1:

Efeito de EGF na infecção intestinal.

As experiências foram conduzidas para determinar os efeitos de EGF na infecção intestinal por E. coli. Os resultados das experiências foram combinados e estão sumariados abaixo.

Vinte e oito coelhos brancos New Zealand (6 semanas de idade) foram estudados em 3 grupos: 1) Controlos (Con, n=9), 2) Infectados com 1 x 107 RDEC-E. coli (I, n=10), e 3) Infectados-tratados com 60 yg de EGF oral diariamente durante 10 dias, com início 3 dias antes da infecção (I-EGF, n=9). Os animais foram avaliados diariamente quanto a ganho de peso, passagem rectal de E. coli e presença de diarreia. Sete dias após a infecção, os animais foram mortos e a mucosa obtida a partir do jejuno (JEJ), íleo (ILE), e cólon proximal (PROX) para quantificação de E. coli e do jejuno para ensaios enzimáticos de mucosa.

Os resultados das experiências são apresentados na Tabela 1. Culturas fecais de coelhos infectados (I) e infectados e tratados com EGF (I-EGF) mas não coelhos de Controlo foram positivos para E. coli. No grupo I, 4 animais tiveram diarreia em comparação com nenhum nos animais I-EGF ou de Controlo. A infecção resultou em ganho de peso reduzido (WG), o qual é impedido por EGF (ver Tabela 1) . 0 tratamento de EGF reduziu igualmente a colonização de E. coli no jejuno, íleo e cólon proximal em > 85% em comparação a I, e impediu a diminuição das actividades de maltase e sucrase no jejuno.

Os resultados acima demonstram que a administração de EGF possui um número de benefícios clínicos em coelhos infectados com E. coli, como ilustrado pelo ganho de peso melhorado e ausência de diarreia, quando comparado a animais infectados não tratados. 0 tratamento com EGF está associado a actividades aumentadas de dissacaridase e a colonização bacteriana reduzida na mucosa intestinal. 9 EXEMPLO 2:

Efeito De EGF Na Infecção Intestinal E Translocação Bacteriana

Conduziu-se uma experiência para avaliar os efeitos de EGF exógeno na translocação bacteriana através do epitélio in vitro e para determinar se os efeitos de EGF são específicos de bactérias.

Dois x 108 Salmonella typhimurium ou E. coli patogénicas humanas foram adicionados à superfície apical de monocamadas confluentes de CaCo2 humanas, crescidas em membranas Transwell (3,0 ym de porosidade). As monocamadas receberam EGF (100 μΜ) apical ou PBS 15 min antes da infecção. O meio sob a membrana foi substituído a cada hora após a infecção (0-7 h), e foi calculada a taxa de migração transepitelial bacteriana (CFU/h).

Os resultados demonstram que, in vitro, o EGF retardou a translocação inicial de E. coli em 1 hora e depois disso inibiu a taxa de invasão em > 95%. A translocação de S. typhimurium foi completamente abolida nas monocamadas tratadas com EGF.

Os resultados acima demonstram que o EGF exerce os seus benefícios clínicos, pelo menos em parte, pela interferência com a translocação bacteriana. O EGF pode igualmente exercer o seu efeito no controlo da colonização bacteriana pela interferência com a multiplicação bacteriana e/ou interferindo com a aderência bacteriana à superfície intestinal. Esta última foi adicionalmente sugerida por microscopia electrónica de varrimento nos estudos da membrana Transwell. De facto, estas observações revelaram números significativamente mais elevados de microrganismos aderindo à superfície epitelial de monocamadas 10 não tratadas em comparação àquelas que foram expostas a EGF. Os resultados sustentam adicionalmente que a terapia de EGF pode ser útil no tratamento ou prevenção de infecções entéricas. EXEMPLO 3:

Efeito de EGF no ganho de peso: 0 EGF foi testado quanto aos seus potenciais benefícios no ganho de peso. Um grupo de coelhos brancos New Zealand (6 semanas de idade, 500-700 g) recebeu doses orais diárias de EGF humano recombinante (100 yg/Kg de peso corporal) e os animais de controlo receberam apenas solução salina. Aos 9 dias, animais tratados com EGF tiveram um ganho de peso cumulativo médio de 422 ± 27 g (n=10) ao passo que os controlos aumentaram apenas 394 í 16 g (n=ll) . Com referência à Figura 1, o declive da curva de regressão linear do ganho de peso nos animais tratados com EGF foi significativamente maior (P 0,002) do que o de controlos não tratados. Dado o aspecto linear de ambas as curvas, é provável que a alimentação continuada com EGF produza um efeito de aumento constante no ganho de peso.

Estes resultados indicam que o EGF pode promover a aceleração do ganho de peso em animais saudáveis. 11 EXEMPLO 4:

Efeito de EGF e de um Inibidor do Receptor de EGF na Absorção de Nutrientes.

Estas experiências foram conduzidas para determinar os efeitos de EGF e de um inibidor do receptor de EGF na absorção de nutrientes e na ultra-estrutura das microvilosidades.

Experiências iniciais demonstraram que o EGF luminal aumentou a absorção de glucose em tecido intacto. Experiências subsequentes examinaram os efeitos de EGF e de um inibidor do receptor de EGF (tirfostina 51) na absorção intestinal de nutrientes na membrana das microvilosidades. A tirfostina 51 é um inibidor especifico da tirosina cinase, que é um elemento critico da cascata de sinalização intracelular de EGF. Os estudos foram realizados em coelhos brancos New Zealand (700 - 1000 g; de aproximadamente 8 semanas de idade) . Dois laços jejunais cegos de 10 cm separados por um segmento de 1 cm foram atados com inicio 5 cm distai ao ligamento de Treitz. Em experiências separadas, EGF (60 ng/mL), EGF + tirfostina (10 μΜ) , ou apenas tirfostina (10 μΜ) em 1,5 mL de veiculo salino foi administrado a um dos laços. O outro laço recebeu apenas o veiculo e serviu como controlo emparelhado. Uma hora depois, os laços foram removidos e a mucosa raspada para preparação de vesículas membranares de microvilosidades. A absorção de nutrientes (D-glucose e L-prolina) para dentro das vesículas membranares de microvilosidades foi determinada através de técnicas estabelecidas. O EGF luminal estimulou um aumento significativo (p<0,001) no transporte de glucose membranar nas microvilosidades (EGF 16,1 ± 1,0 vs CONTROLO 11,5 ± 0,9 nmol/min/mg proteína; n=5) e prolina (EGF 3,8 ± 0,5 12 vs CONTROLO 2,6 ± 0,3 nmol/min/mg proteína; n=5) em comparação aos controlos. Tanto o transporte de glucose como de prolina foi melhorado até um grau semelhante, sugerindo que o EGF estimula um aumento generalizado no transporte de nutrientes. A administração simultânea de tirfostina (TYR) bloqueou completamente o aumento induzido por EGF na absorção de glucose e resultou numa redução significativa (p<0,001) na absorção de nutrientes em comparação a controlos (EGF + TYR 5,9 ± 0,3 vs CONTROLO 10,7 ± 0,6 nmol/min/mg proteína; n=4). Subsequentemente, uma série adicional de experiências examinou o efeito de apenas tirfostina no transporte de glucose nas microvilosidades. A tirfostina isolada reduziu significativamente (p<0,001) a absorção de glucose em comparação a controlos (TYR 8,0 ± 0,8 vs CONTROLO 10,7 ±1,0 nmol/min/mg proteína; n=4) . Os requerentes demonstraram anteriormente que a absorção intestinal de nutrientes se correlaciona com o ganho de peso num número de diferentes modelos. Deste modo, o tratamento com EGF aumenta a absorção de nutrientes e promove o ganho de peso. Inversamente, o tratamento com tirfostina pode promover uma diminuição no ganho de peso ou na perda de peso e, por conseguinte, pode ser útil no tratamento da obesidade. O tratamento com tirfostina pode reduzir igualmente a absorção intestinal de substâncias tóxicas ou adversas. EXEMPLO 5:

Efeito de EGF na Absorção de Imunoglobulina

Noutra série de experiências, o EGF foi testado quanto à sua capacidade para melhorar a absorção de imunoglobulina no intestino de animais jovens. 13

Os ratos (Sprague-Dawley de 14 dias de idade) foram atribuídos aleatoriamente a um de 3 grupos. No tempo 0, uma de 3 soluções foi distribuída por lavagem oral a cada grupo: ao Grupo 1 foi dado apenas solução salina (0,4 mL) ; o Grupo 2 recebeu solução salina (0,2 mL) + IgG de ovelha (0,2 mL, 5 mg/mL) ; o Grupo 3 recebeu EGF em solução salina (0,1 yg/mL) + IgG de ovelha (0,2 mL, 5 mg/mL). Uma, duas e quatro horas após a inoculação, foi recolhido o sangue de 4 animais em cada grupo através de punção cardíaca (após anestesia com metoxiflurano). O soro foi separado e os níveis de IgG de ovelha foram determinados por Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA). Os valores foram expressos como média ± erro padrão de soro de IgG de ovelha (pg/mL) (Tabela 2) .

Os resultados são apresentados na Tabela 2 e indicam que a administração de EGF aumenta a absorção de imunoglobulina a partir do intestino. O exposto acima descreve novas utilidades para o EGF. Em particular, verificou-se que o EGF previne a colonização gastrointestinal por patógenos e que promove o ganho de peso em animais. Adicionalmente, o EGF pode aumentar a absorção de imunoglobulina em animais jovens. Consequentemente, o EGF é um agente muito útil que pode ser utilizado para aumentar a produção na indústria animal, tal como a indústria da carne de bovino, de suíno e de aves domésticas, bem como na aquacultura. Adicionalmente, o tratamento com EGF pode ter benefícios clínicos em seres humanos (í. e., durante a doença de Crohn, infecção gastrointestinal, diarreia do viajante, etc.). O EGF pode igualmente acelerar a cicatrização de úlceras gastrointestinais pela prevenção da colonização no local da úlcera. 14

Os inibidores de EGF podem diminuir a absorção de nutrientes no intestino e, como tal, podem ser úteis no tratamento da obesidade ou na prevenção da absorção de toxinas.

Um especialista na técnica entenderá que a presente invenção se refere a novas utilidades de EGF e a inibidores de EGF. Os exemplos descritos devem ser entendidos como modelos para exemplificar a invenção e não para limitar a invenção. 0 modo de administração, a formulação e a dose de EGF ou de inibidor de EGF podem variar, dependendo da utilidade particular. Por exemplo, no tratamento de animais de criação jovens, o EGF pode ser administrado oralmente na alimentação ou na água de beber do animal. A gama de dosagem pode ser alterada desde 10-10000 yg/Kg por dia. 15 TABELA 1

Ganho de Peso E. Coli (Logio CFU/cm) MALT SUC Cumulativo (u/g) (u/g) (gramas JEJ ILE PROX CONTROLO 314+23 0 0 0 301+106 77+17 INFECTADOS 237+27 4,19+0,3 6,16+0,3 4,92+0,3 151+36 28+3 INFECTADOS + EGF 316+16* 3,10+0,4* 4,88+0,2* 4,09+0,2* 436+48* 89+19* % DE CLEARANCE BACTE-RIANA NO GRUPO INFECTADOS + EGF 92% 95% 85%

Os Valores são médias + erro Padrão da média de 5 animais por grupo 7 dias após a inoculação * P<0,05 I-EGF vs. I. TABELA 2 CONCENTRAÇÃO de IgG de opvelha (pg/mL) no soro de ratos

Tempo Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 (Pós-Inoculação) (Solução (Solução (EGF + IgG salina) salina + IgG) 1 hora 0 + 0 1,2 + 0,8 4,7 + 1,9 2 horas N/A 4,4 + 1,5 9,8 + 3,9 3 horas 0 + 0 5,8 + 2,2 12,2 + 3,8 N/A = não disponível 16

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Lisboa, 3 de Abril de 2007 21

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização do factor de crescimento epidérmico (EGF) para a preparação de uma preparação de EGF para o aumento do ganho de peso num animal.
2. 2. Utilização do factor de crescimento epidérmico (EGF) para a preparação de um medicamento para a promoção do ganho de peso num animal.
3. 3. Utilização, como reivindicado na reivindicação 2, em que o medicamento é para o tratamento de pessoas subalimentadas e pessoas sofrendo de anorexia nervosa.
4. 4. Utilização de quaisquer das reivindicações precedentes 1 a 3, em que o EGF está presente na alimentação ou na água de beber do animal.
5. 5. Utilização de qualquer reivindicação precedente 1 a 4, em que a preparação de EGF é para consumo oral.
6. 6. Utilização de qualquer reivindicação precedente 1 a 5, em que a preparação é para um consumo oral de EGF pelo animal de 10 a 10000 yg/Kg por dia. 1
7. 7. Utilização de qualquer reivindicação precedente 1 a 6, em que a preparação é para um animal seleccionado a partir de animal adulto, animal jovem, animal saudável, animal com uma infecção, animal de criação, animal produtor de alimentos, um humano.
8. 8. Utilização do factor de crescimento epidérmico (EGF) para o aumento da produção animal na agricultura ou na indústria aquícola.
9. 9. Utilização da reivindicação 8, em que o factor de crescimento epidérmico (EGF) é adicionado à alimentação ou à água de beber do animal.
10. 10. Utilização da reivindicação 9, em que o factor de crescimento epidérmico (EGF) é administrado durante, pelo menos, 10 dias. Lisboa, 3 de Abril de 2007 2