ES2219714T3 - Potenciacion de la expresion de enzimas proteoliticas en el moho de koji. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TIENE POR OBJETO UN MOHO "KOJI" QUE ES CAPAZ DE EXPRESAR AL MENOS 2 VECES MAS DE ENDO - Y EXO PEPTIDASAS QUE LA CEPA DE TIPO SILVESTRE ASPERGILLUS ORYZAE CNCM I-1882, Y ESPECIALMENTE AL MENOS 30 MU DE ACTIVIDAD DE LA ENDOPEPTIDASA, AL MENOS 30 MU DE ACTIVIDAD DE LA LEUCINA AMINOPEPTIDASA, Y AL MENOS 10 MU DE ACTIVIDAD DE LA PROLIL DIPETIDIL - PEPTIDASA, POR ML DE SOBRENADANTE, CUANDO SE CULTIVA EN UN MEDIO MINIMO QUE CONTIENE UN 0,2% DE PROTEINAS DE GRANOS DE SOJA. LA INVENCION PROPORCIONA IGUALMENTE UNA PROTEINA DE FIJACION DEL DNA DEL ASPERGILLUS ORYZAE (AREA) QUE TIENE AL MENOS LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS QUE VA DEL AMINOACIDO 1 AL 731 DE LA SEQ.ID.NO:2, O DERIVADOS FUNCIONALES DE LOS MISMOS. LA INVENCION PROPORCIONA ASI MISMO UNA MOLECULA DE DNA QUE COMPRENDE UN GEN AREA QUE CODIFICA LA PROTEINA DE FIJACION DEL DNA DE ACUERDO CON LA INVENCION. EN UN CUARTO ASPECTO, LA INVENCION PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA LA SOBREPRODUCCION DE ENZIMAS PROTEOLITICOS, QUE COMPRENDE CULTIVAR UN MOHO DE "KOJI" SEGUN LA INVENCION EN UN MEDIO ADECUADO DE CRECIMIENTO, EN CONDICIONES QUE HAGAN QUE EL MOHO EXPRESE ENZIMAS, Y AISLAR OPTATIVAMENTE LOS ENZIMAS EN FORMA DE CONCENTRADO. EN OTRO ASPECTO, LA INVENCION PROPORCIONA EL USO DEL MOHO DE "KOJI" DE LA INVENCION PARA HIDROLIZAR MATERIALES QUE CONTIENEN PROTEINAS. EN UN ULTIMO ASPECTO MAS, LA INVENCION PROPORCIONA UN PRODUCTO ALIMENTARIO QUE COMPRENDE UN HIDROLIZADO DE PROTEINAS QUE SE OBTIENE POR FERMENTACION CON UN MOHO "KOJI" DE LA INVENCION, DE UN MATERIAL QUE COMPRENDE PROTEINAS Y AL MENOS 5 MM DE L - GLUTAMINA.

Description

Potenciación de la expresión de enzimas proteolíticas en el moho de koji.

La invención se refiere a modificaciones genéticas de moho de koji permitiendo la expresión potenciada de enzimas proteolíticos.

Campo de la invención

Las proteínas hidrolizadas, que se usan ampliamente en la industria alimentaria, se pueden preparar mediante hidrólisis de material proteico con ácido, álcali o enzimas. Varios métodos han utilizado moho de koji para la preparación de productos alimentarios, que son hidrolizados mediante la acción de una gran variedad de amilasas secretadas, proteinasas y peptidasas. Los mohos de koji son aquellos tradicionalmente usados para la realización de un cultivo de koji (US4308284) incluyendo células del género Aspergillus, Rhizopus y/o Mucor, especialmente Aspergillus soyae, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Rhizopus oryzae, Rhizopus oligosporus, Rhizopus japonicus, Rhizopus formosaensis, Mucor circinelloides, Mucor japanicus, Penicillium glaucum y Penicillium fuscum, por ejemplo.

De acuerdo con las reglas del Código Internacional de la Nomenclatura Botánica (ICBN), Aspergillus es un género anamórfico. Esto indica que los verdaderos Aspergillus sólo se reproducen asexualmente mediante conidiosporas. No obstante, la típica morfología de conidiosporas de Aspergillus puede también encontrarse en hongos que pueden reproducirse sexualmente mediante ascosporas. Algunos taxonomistas de Aspergillus causan confusión, debido a que no se ajustan a la terminología de ICBN. En su lugar, intentan hacer varias revisiones a los esquemas taxonómicos para incluir Aspergillus nidulans en este género, a pesar del hecho que su correcto nombre taxonómico es Emericella nidulans (Samson, En: Aspergillus. Biology and Industrial Applications, pág, 355-390, Ed. por Bennett y Klich, Boston).

La PE417481 (Societé des Produits Nestlé) describe así un proceso para la producción de una salsa de soja fermentada, en que un koji se prepara mediante la mezcla de un cultivo de koji con una mezcla de soja cocida y trigo tostado, entonces el koji se hidroliza en una suspensión acuosa de 3 a 8 horas de 45ºC a 60ºC con los enzimas producidos durante la fermentación del cultivo de koji, también se prepara un moromi por la adición de cloruro sódico a la suspensión de koji hidrolizada, el moromi se deja fermentar y se prensa entonces y el licor obtenido es pasteurizado y clarificado.

La PE429760 (Societé des Produits Nestlé) describe un procedimiento para la producción de un aromatizante en que se prepara una suspensión acuosa de un material rico en proteínas, las proteínas se solubilizan por hidrólisis de la suspensión con una proteasa a pH 6,0 a 11,0, la suspensión se trata en calor a pH 4,6 a 6,5, y la suspensión se hace madurar con enzimas de un cultivo de koji.

Del mismo modo, la PE96201923.8 (Societé des Produits Nestlé) describe un procedimiento para la producción de un sabor cárnico, en que se prepara una mezcla que contiene una fuente de proteínas vegetal y una fuente que contiene carbohidratos vegetales, dicha mezcla que tenía inicialmente al menos un 45% de materia seca, la mezcla se inocula con un cultivo de koji y mediante una o más especies de microorganismos implicados en la tradicional fermentación de la carne, y la mezcla es incubada hasta que los sabores cárnicos se forman.

No obstante, por otro lado, la hidrólisis ácida o alcalina puede destruir los aminoácidos esenciales producidos durante la hidrólisis reduciendo así el valor nutricional, mientras que la hidrólisis enzimática raramente llega a completarse por lo que las proteínas hidrolizadas contienen cantidades sustanciales de péptidos. La optimización y posterior desarrollo de los procesos de koji han sido seriamente obstaculizados por la falta de conocimiento sobre la naturaleza de los enzimas hidrolíticos, su regulación y cómo afectan los parámetros del proceso a su expresión y actividad (pej., temperatura, pH, actividad del agua, y concentración de sal).

En el hongo Emericella nidulans (Katz et al., Gene, 150, 287-292, 1994), la actividad fermentativa se somete al menos a tres circuitos de control general incluyendo la represión de catabolito de carbono, represión de metabolito de azufre y nitrógeno. Estos tres circuitos reguladores garantizan que las fuentes de nitrógeno, carbono y azufre disponibles en un sustrato sean utilizadas secuencialmente de acuerdo a su cantidad de nitrógeno, energía y azufre. La represión de metabolito de nitrógeno se ejerce mediante el producto génico areA en Emericella nidulans (Arst et al., Mol. Gen. Genet., 26,111-141, 1973), mientras que en los otros hongos Neurospora crassa (Davies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3753-3757, 1987), Penicillium chrysogenum (Haas et al., Curr. Genet., 27, 150-158, 1995) y Saccharomyces cerevisiae (Minehart et al., Mol. Cell. Biol., 11, 6216-6228, 1991) genes similares ejercen una función similar.

El gen areA codifica una proteína de unión al DNA que actúa positivamente (AREA), perteneciendo a la familia GATA de los factores de transcripción, que son necesarios para la utilización de todas las fuentes de nitrógeno excepto amoníaco o L-glutamina. Bajo condiciones de desrepresión de nitrógeno, señalizado mediante altos niveles intracelulares de glutamina, la expresión de areA es regulada mediante tres mecanismos: 1) la proteína AREA es inactivada, 2) la transcripción de areA se paraliza y 3) mediante la acción de la secuencia trailer 3' sin traducir (3'-UTS), se potencia la degradación del mRNA de areA (Platt et al., EMBO J., 15, 2791-2801, 1996). En ausencia de una proteína AREA funcional, solo amoníaco o L-glutamina puede utilizarse como fuente de nitrógeno. Por lo tanto, la pérdida de función de los mutantes areA puede utilizar sólo amoníaco o L-glutamina como fuente de nitrógeno (Arst et al., 1973).

Cohen (B.L., J. General Microbiology 71 (1972), 293-299) describe la represión de amonio de las proteasas extracelulares en Aspergillus nidulans. El mutante xprD1 se selecciona por la desrepresión de proteasas en presencia de amonio, y muestra que retiene la capacidad de usar amonio como única fuente de nitrógeno.

Recientemente el gen areA de Emericella nidulans se ha descrito que media la represión de metabolito de nitrógeno de dicho hongo (Kudla A., et al. EMBO J. 9(1990), 1355-1364).

WO 95/35385 (NOVO NORDISK) se refiere a los hongos, en donde el gen areA ha sido modificado. El efecto de tal modificación se refirió como resultado en una pérdida de capacidad de los hongos para producir proteasas.

Las observaciones en la fermentación de koji sugieren que la represión de metabolito de nitrógeno es un parámetro principal en la fermentación de koji. Por ejemplo, altos niveles de L-glutamina muestran afectar negativamente la actividad proteolítica en la fermentación de koji.

Además, se ha observado que altos niveles de actividad proteolítica y actividad glutaminasa son dos condiciones mútuamente exclusivas en la fermentación de koji (Ushijima, et al., Agric. Biol. Chem., 51, 1051-1057, 1997). Por ejemplo, la adición de L-glutamina 25 mM en un medio mínimo de crecimiento que contiene 0,1% de gluten de trigo, reduce la actividad de enzima endoproteolítico en alrededor 40-50 veces. Este fenómeno puede explicarse postulando que la L-glutamina es necesaria para la inducción de la glutaminasa. No obstante, desde que la L-glutamina es también el efector de la represión de metabolito de nitrógeno, la expresión de enzimas proteolíticos se suprime cuando la glutaminasa es inducida.

Considerando el hecho que la glutaminasa convierte de forma adecuada la L-glutamina en ácido L-glutámico que es un importante potenciador del sabor natural (ver WO95/31114), existe por lo tanto una necesidad de superar la supresión mediada por L-glutamina de enzimas proteolíticos, permitiendo la expresión simultánea de glutaminasa y enzimas proteolíticos en mohos de koji.

Además, dependiendo de la naturaleza de la proteína y de los enzimas usados para la proteolisis, los péptidos formados pueden no obstante tener sabores extremadamente amargos y son por lo tanto organolépticamente indeseables. Existe por lo tanto también una necesidad para los métodos de hidrolizar proteínas que llevan a un alto grado de hidrólisis de proteínas y de hidrolizados con excelentes propiedades organolépticas.

Finalmente, el análisis bioquímico de los péptidos residuales en cereales hidrolizados por mohos de koji, pej. gluten de trigo, muestra que una cantidad considerable de L-glutamina permanece secuestrada en péptidos que contienen prolina (Adler-Nissen, En: Enzymatic hydrolysis of food proteins. Elsevier Applied Sciencies Publishers LTD, p120, 1986). Existe por lo tanto también una necesidad para los métodos de hidrolización de proteínas que llevan a la liberación de grandes cantidades de L-glutamina.

Resumen de la invención

La presente invención posee por objeto un moho de koji, seleccionado de los géneros Aspergillus, Rhizopus o Mucor, expresando un ácido nucleico que codifica un polipéptido que posee la secuencia de aminoácidos 1-731 del ID de SEC Nº 2, tal que el moho es capaz de expresar, al menos 2 veces más endo- y exo-peptidasas que la cepa salvaje Aspergillus oryzae CNCM I-1882, y especialmente al menos 30 mU de actividad endopeptidasa, al menos 30 mU de actividad leucina-amino-peptidasa y al menos 10 mU de actividad prolil-dipeptidil-peptidasa por ml de sobrenadante cuando crecen en un medio mínimo que contiene el 0,2% de proteínas de soja, y tal que el moho es capaz todavía de expresar endo- y exopeptidasas cuando está en presencia de al menos 5mM de L-glutamina y presentando una actividad potenciada de prolil-dipeptidil-peptidasa.

En un segundo aspecto, la invención también proporciona una proteína de unión al DNA de Aspergillus oryzae (AREA) que posee la secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al aminoácido 731 del ID de SEC Nº 2.

En un tercer aspecto, la invención proporciona una molécula de DNA que comprende un gen areA que codifica la proteína de unión al DNA de acuerdo con la invención.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para sobreproducir enzimas proteolíticos, que comprende el cultivo de un moho de koji de acuerdo con la invención en un medio de crecimiento adecuado bajo condiciones en las que el moho expresa enzimas, y opcionalmente se aíslan los enzimas en forma de concentrado.

En otro aspecto, la invención proporciona la utilización de moho de koji de acuerdo con la invención para hidrolizar materiales que contienen proteínas.

Descripción detallada de la invención

Dentro de la siguiente descripción, los porcentajes se dan en peso, excepto cuando se indica lo contrario. Las secuencias de aminoácidos o nucleótidos referidas como "ID de SEC Nº" son siempre presentados en el listado de secuencias posterior. Una unidad de enzima leucina-aminopeptidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de p-nitroanilina por minuto a 37ºC del sustrato leucina-p-nitroanilida (absorción medida a 400 nm; \varepsilon = 10500 M^{-1}cm^{-1}). Una unidad de enzima prolil-dipeptidil-peptidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de p-nitroanilina por minuto a 37ºC del sustrato alanina-prolina-p-nitroanilida (absorción medida a 400 nm; \varepsilon = 10500 M^{-1}cm^{-1}). Una unidad de enzima endopeptidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de péptidos solubles en TCA por minuto a 37ºC del sustrato caseína marcado con resorufina bajo las condiciones prescritas (Boehringer Nº Cat. 1080733; absorción medida a 574nm).

El término "koji" se define como el producto de fermentación con un cultivo de moho de koji de una mezcla de una fuente de proteínas y una fuente de carbohidratos, especialmente de una mezcla de planta leguminosa o de una planta oleaginosa cocida y de una fuente de cereales tostada o cocida, por ejemplo de una mezcla de soja o granos cocidos y de arroz o trigo tostado o cocido.

De forma similar, la expresión "derivado funcional de un enzima" incluye todas las secuencias de aminoácidos que difieren por sustitución, deleción, adición de algunos aminoácidos, por ejemplo 1-20 aminoácidos, pero que mantienen sus actividades originales o funciones. La selección de un derivado funcional se considera obvio para un experto en el campo, ya que uno puede crear fácilmente variantes de la proteína AREA truncada (ver ID de SEC Nº 2) mediante la ligera adaptación de los métodos conocidos por un experto de la materia, por ejemplo los métodos descritos por Adams et al. (PE402450; Genencor), por Dunn et al (Protein Engineering, 2, 283-291, 1988), por Greener et al. (Strategies, 7, 32-34, 1994), y/o por Deng et al. (Anal. Biochem, 200, 81, 1992).

En particular, una proteína puede considerarse generalmente como un derivado de otra proteína, si su secuencia es al menos un 85% idéntica a la proteína, preferiblemente al menos el 90%, en particular el 99%. En el contexto de la presente revelación, la identidad está determinada por la proporción entre el número de aminoácidos de una secuencia derivada que es idéntica a aquellas de la proteína AREA truncada (ver ID de SEC Nº 2) y el número total de aminoácidos de dicha secuencia derivada.

La presente invención se refiere así a cualquier moho de koji que proporcione una expresión potenciada de enzimas proteolíticos, dando lugar a un alto grado de hidrólisis de proteínas y para hidrolizados con excelentes propiedades organolépticas. Por lo tanto, estos mohos de koji expresan (1) altos niveles de endopeptidasas, tal como aquellas que son capaces de producir péptidos solubles en TCA a 37ºC a partir de caseína, y (2) altos niveles de exopeptidasas tales como la leucina-amino-peptidasa que elimina las leucinas N-terminales (Deng et al. Anal. Biochem, 200, 81, 1992) y la prolil-dipeptidil-peptidasa que elimina dipéptidos N-terminal X-prolina, en donde X puede ser aminoácido (Barret et al., en Mammalian Proteases: A Glossary and Bibliography, N.Y., Acad. Press, 2, p.132, 1986).

Considerando el hecho de que los mohos de koji de la invención proporcionan una actividad potenciada de prolil-dipeptidil-peptidasa, pueden usarse adecuadamente para liberar la L-glutamina que permanece secuestrada en los péptidos que contienen prolina.

Los mohos de koji que proporcionan la siguiente expresión potenciada de enzimas proteolíticos están particularmente adaptados para el propósito de la invención: al menos 30 mU/ml*, preferiblemente al menos 50 mU/ml* de actividad endopeptidasa; al menos alrededor de 30 mU/ml*, preferiblemente al menos 50 mU/ml* de actividad leucina-amino-peptidasa; y al menos 10 mU/ml*, preferiblemente al menos alrededor de 15 mU/ml* de actividad prolina-dipeptidil-peptidasa (* por ml de sobrenadante cuando crece en un medio mínimo que contiene 0,2% de proteínas de soja).

Además, los mohos de koji que superan la supresión mediada por L-glutamina de enzimas proteolíticos, permitiendo la expresión simultánea de glutaminasa y enzimas proteolíticos, también son parte de la invención. Estos mohos de koji así pueden expresar las actividades proteolíticas anteriormente mencionadas cuando crecen en un medio mínimo que contiene 0,2% de proteínas de grano de soja y al menos 5 mM de L-glutamina (0,073% p/p), por ejemplo.

Los mohos de koji de la invención pueden obtenerse mediante U.V. aleatorio y/o mutagénesis química, seguida por la selección de moho de koji mutado proporcionando las características fenotípicas requeridas.

La selección de moho de koji mutado particularmente conteniendo un gen areA mutado que no está reprimido, cuando el moho mutado crece en un medio mínimo que contiene cantidades represivas de L-glutamina, alcanza adecuadamente las necesidades de la presente invención. A este fin, los mutantes areA pueden seleccionarse fácilmente mediante mutagénesis aleatoria clásica (UV, química) y selección en placas que contienen alrededor de 100 mM de cloruro de metil amonio y 0,2% de proteína de soja, por ejemplo.

Debe notarse que la actividad prolil-dipeptidil-peptidasa que no está controlada de forma natural por la expresión del gen areA, está potenciada contra todas las expectativas de cuando el gen areA está desreprimido. Ya que la expresión de la actividad prolil-dipeptidil-peptidasa está inducida por péptidos (resultados sin publicar), este incremento dependiente de AREA en la actividad puede de hecho estar causado por la liberación potenciada de péptidos mediante las endoproteasas que están bajo el control de areA.

Considerando el hecho de que la mutagénesis aleatoria por UV y/o química consume mucho tiempo, será también más adecuado construir mohos de koji de la invención mediante tecnología recombinante. Por lo tanto, un moho de koji de la invención puede contener preferiblemente un gen recombinante areA que está truncado por lo que la proteína AREA truncada en el extremo C terminal se mantiene funcional pero no reprimida cuando el moho crece en un medio mínimo que contiene cantidades represivas de L-glutamina. Debe notarse que este truncamiento lleva también a un mRNA de areA que es menos sensible a la degradación del mRNA.

El truncamiento puede efectuarse cortando el gen areA nativo en una región predeterminada, e introduciendo una región terminadora permitiendo así la transcripción de un mRNA de areA truncado. El truncamiento se realiza preferiblemente corriente abajo de la secuencia codificante del dominio de unión al DNA de AREA, que puede ser fácilmente identificado por el lazo de 17 aminoácidos unido a dos pares de residuos cisteína. Más precisamente, el truncamiento puede efectuarse corriente abajo de la secuencia de areA que codifica la estructura de aminoácidos conservativa cisteína-2X-cisteína-17X- cisteína-2X-cisteína, en donde X es cualquier aminoácido y los números 2 y 17 se refieren al número de aminoácidos (Caddick et al., Antonie van leeuwenhoek, 65, 169-177, 1994). Este truncamiento puede llevarse particularmente a cabo en los 100 aminoácidos tras la secuencia areA que codifica el dominio de unión al DNA.

Cualquier gen funcional areA fúngico, puede usarse en el contexto de la presente invención, y en particular cualquier gen funcional areA capaz de hibridar bajo condiciones astringentes al gen areA de Aspergillus oryzae con la secuencia del nucleótido desde el nucleótido 1189 al nucleótido 3846 de la ID de SEC Nº:1 o derivados funcionales de los mismos debido a la degeneración del código genético.

Un gen areA funcional puede obtenerse en forma sustancialmente purificada usando el método descrito dentro de los siguientes ejemplos de cualquier cepa de Aspergillus oryzae. Alternativamente, un gen areA puede (1) detectarse también a partir de otros géneros o especies de hongos mediante el uso de sondas de DNA derivadas de la secuencia de nucleótidos de la ID de SEC Nº:1 en un ensayo de hibridación astringente, y (2) recuperado mediante el método bien conocido de la PCR-inversa mediante el uso de cebadores adecuados derivados de la ID de SEC Nº:1 que comprende el gen areA. En otro aspecto, un gen areA puede también sintetizarse in vitro y entonces multiplicarse usando la reacción en cadena de la polimerasa, por ejemplo.

Un gen areA apropiadamente truncado así puede particularmente consistir en la secuencia de nucleótidos definido por los nucleótidos 1189-1604 y 1704-3480 de la ID de SEC Nº:1 (ID de SEC Nº:1 contiene un intrón) o derivados funcionales de los mismos debido a la degeneración del código genético, por ejemplo. Este gen truncado codifica así para la proteína de unión al DNA AREA de Aspergillus oryzae con la secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al aminoácido 731 de la ID de SEC Nº:2, que se requiere para la utilización de todas las fuentes de nitrógeno excepto amoníaco o L-glutamina.

Este gen areA truncado puede entonces introducirse en un vector, pej., un plásmido replicativo o un plásmido integrador no replicativo circular o linearizado, y puede estar operativamente unido a secuencias reguladoras que regulan un gen diferente en dicho organismo de origen, o que regula un gen diferente en un organismo extraño (promotor y/o terminador), por ejemplo. Una secuencia reguladora diferente de la secuencia reguladora nativa se seleccionará generalmente por su alta eficiencia o características deseables, tales como, en caso de un promotor, inducibilidad o alta capacidad de expresión, por ejemplo.

Si se prefiere la expresión heteróloga, indica que el gen de la invención se expresa en otro organismo diferente al huésped original (cepa, variedad, especie, género, familia, orden, clase o división) las secuencias reguladoras están derivadas preferiblemente de un organismo similar o igual al huésped de expresión. Por ejemplo, si el huésped de expresión es un Aspergillus, entonces las secuencias reguladores derivaran de Aspergillus. El promotor adecuado para la expresión constitutiva, preferiblemente en un huésped fúngico, debe ser un promotor de los siguientes genes: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, fosfo-glicerato quinasa, triosa fosfato isomerasa y acetamidasa, por ejemplo. Un promotor adecuado para la expresión inducible, preferiblemente en un huésped fúngico, puede ser un promotor de uno de los siguientes genes: endoxilanasa IIA, glucoamilasa A, celobiosahidrolasa, amilasa, invertasa, alcohol deshidrogenasa y amiloglucosidasa. La selección de una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de la invención y capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos se considera obvia para un experto en la materia.

El vector también puede comprender un marcador de selección para discriminar las células huésped en las que el material de DNA recombinante ha sido introducido de células que no comprenden dicho material recombinante. Tales marcadores de genes son, por ejemplo, en caso de preferir la expresión en hongos, los genes conocidos ga-2, pyrG, pyr4, pyrA, trpC, amdS o argB. La molécula de DNA puede comprender también al menos un origen de replicación adecuado. Los métodos de transformación adecuados y los vectores de expresión adecuados ofrecen un promotor de transcripción adecuado, señales de terminación de transcripción adecuados y marcadores de genes adecuados para seleccionar células transformadas son ya conocidas en la literatura para muchos organismos incluyendo diferentes Aspergillus, Rhizopus y Mucor. En el evento se necesita la expresión fúngica, el sistema de expresión descrito en PE278355 (Novartis) puede así adaptarse de forma particular.

Los mohos de koji recombinantes pueden obtenerse mediante cualquier método que permita a un DNA extraño ser introducido en una célula. Tales métodos incluyen la transformación, electroporación, o cualquier otra técnica conocida para aquellos expertos en la materia.

En el contexto de la presente invención, los mohos de koji son aquellos tradicionalmente usados para realizar un cultivo de koji incluyendo células del género Aspergillus (taxonomía ICBN), Rhizopus y/o Mucor. Entre éstos, las siguientes especies pueden utilizarse, incluyendo Aspergillus soyae, Aspergillus oryzae (ATCC 20386), Aspergillus phoenicis (ATCC 14332), Aspergillus niger (ATCC 1004), Aspergillus awamori (ATCC 14331), Rhizopus oryzae (ATCC 4858), Rhizopus oligosporus (ATCC 22959), Rhizopus japonicus (ATCC 8466), Rhizopus formosaensis, Mucor circinelloides (ATCC 15242), Mucor japanicus, Penicillium glaucum y Penicillium fuscum (ATCC 10447). Las cepas referidas mediante un número ATCC están accesibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852, EE.UU. La invención no se limita mediante tales indicaciones que tan sólo se han proporcionado para permitir a un experto en la materia llevar a cabo la invención.

Las células recombinantes de la invención pueden comprender el gen areA truncado integrado de forma estable en el cromosoma o en un plásmido replicativo. Entre todas las células recombinantes así creadas, la presente invención posee particularmente por objeto las cepas A. oryzae CNCM I-1881, CNCM I-1883 y CNCM I-1884.

Preferiblemente, sólo un gen areA truncado y funcional es integrado en el cromosoma bajo el control de secuencias reguladoras que son nativas para el organismo huésped.

Para poder integrar de forma estable en el cromosoma de células eucariotas sólo un gen areA truncado y funcional que está fusionado a un promotor y un terminador que son nativos para el organismo huésped, la molécula de DNA de la invención puede estar integrada mediante una ligera adaptación del protocolo de Ruiter-Jacobs et al. (Curr. Genet.,16, 159-163,1989), es decir,

(1) preparar un fragmento de DNA no replicativo mediante la ligación del gen areA truncado, que está operativamente unido al promotor y terminador que son nativos para el organismo huésped, corriente abajo de la secuencia de DNA que codifica un gen esencial, estando dicho gen inactivado por al menos una mutación y/o una deleción (este gen esencial puede ser cualquier gen implicado en la síntesis de RNA, tales como el gen pyrG en el caso de usarse A. oryzae, por ejemplo); (2) seleccionando un organismo huésped que contiene el gen esencial que está sin embargo inactivado por otra(s) mutación(es) o delecion(es); (3) transformando dicho organismo huésped con el fragmento de DNA no replicativo; (4) identificando transformantes integrados en que el fragmento de DNA está integrado para restaurar la función nativa del gen esencial; (5) seleccionando un transformante integrado en que sólo un fragmento de DNA está integrado.

La sobreexpresión de la proteína de unión al DNA, AREA puede obtenerse mediante incorporación del gen areA truncado en un huésped de expresión, estando dicho gen areA operativamente unido a una o más secuencias reguladoras que sirven para aumentar los niveles de expresión de la proteína AREA de la invención.

La sobreexpresión puede alcanzarse además introduciendo (plásmido replicativo) o integrando (mediante integración en el genoma) múltiples copias del gen areA funcional truncado de la invención. Como ejemplos de mohos koji que contienen múltiples copias de genes areA funcionales truncados, los transformantes Aspergilus oryzae A (ver ejemplo 1) Aspergilus oryzae xprD1 (ver ejemplo 3) y Aspergilus oryzae NF1 que contiene pNFF68 (ver ejemplo 4) se depositaron bajo el tratado de Budapest en donde recibieron respectivamente los números de depósito CNCM
I-1881, CNCM I-1883 y CNCM I-1884.

La invención también está dirigida a un proceso para sobreproducir enzimas proteolíticos que comprende, proporcionar mohos koji de la invención en un medio de crecimiento adecuado bajo condiciones en las que el moho expresa enzimas proteolíticas, y opcionalmente aislando los enzimas en forma de concentrado, por ejemplo eliminando los sólidos del caldo de fermentación mediante centrifugación o filtración. La selección del medio apropiado puede basarse en la elección del huésped de expresión y/o basarse en los requisitos reguladores del material DNA recombinante. Tales medios son bien conocidos por los expertos en la materia. Tras la fermentación, los mohos pueden eliminarse del caldo de fermentación mediante centrifugación o filtración.

Las concentraciones típicas de L-glutamina alcanzadas durante la hidrólisis de koji en un sistema líquido pueden ser del 0,5-1% p/p, por ejemplo. Los mohos koji presentes son aquellos particularmente adaptados para hidrolizar cualquier material que contenga proteínas, en particular aquellos que contienen altas cantidades de L-glutamina (más de 5mM). Estos materiales que contienen proteínas pueden ser mezclas de una fuente de proteínas y una fuente de carbohidratos, especialmente una mezcla de una planta leguminosa o de una planta oleaginosa cocida y de una fuente de cereales tostada o cocida, por ejemplo una mezcla de soja o brotes cocidos y de arroz o trigo tostado o cocido.

Las composiciones que contienen gluten de trigo están particularmente adaptadas para el propósito de la presente invención, ya que altas cantidades de L-glutamina permanecen secuestradas en péptidos que contienen prolina cuando el gluten de trigo es hidrolizado mediante cultivos tradicionales de koji.

En el evento uno puede intentar, después o durante la hidrólisis con mohos de koji, para liberar tanto como sea posible la L-glutamina unida a los residuos de prolina, la presente invención proporciona un método en que el moho de koji de la invención se utiliza en combinación con al menos un enzima o un microorganismo proporcionando una actividad prolidasa, que sirve para decir que un enzima posee un alto nivel de especificidad hacia dipéptidos del tipo X-Pro (Ezespla et al., Ap. Env. Microb., 63, 314-316, 1997; Dicha clase de enzima ya está disponible por Sigma: E.C. 3.4.13.9).

Además, los mohos de koji de la invención están particularmente adaptados para hidrolizar materiales que contienen proteínas que comprenden al menos 5mM de L-glutamina, permitiendo la formación de ácido L-glutámico que es un importante potenciador natural del sabor y alto nivel de hidrolizados de proteína con excelentes propiedades organolépticas.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un producto alimentario que comprende un hidrolizado de proteína obtenible por fermentación de un material que comprende proteínas y al menos 5mM de L-glutamina con un moho de koji de la invención. Dicho alimento contiene de forma natural grandes cantidades de ácido L-glutámico (y/o L-glutamato) y alto nivel de hidrolizados de proteína con excelentes propiedades organolépticas proporcionando un sabor no amargo y una alergenicidad significativamente inferior que las proteínas sin hidrolizar.

Un producto alimentario importante de la presente invención es un ingrediente de un sustituto de leche materna para infantes, o un ingrediente proteico vegetal hidrolizado. El sustituto de leche puede además formularse en sustancialmente la misma forma como la que se indica en la literatura anterior para productos de este tipo (cf. PE 96202475.8)

La presente invención no se limita en alcance por las realizaciones específicas aquí descritas. Ciertamente, varias modificaciones de la invención, además de aquellas descritas aquí, serán evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de las descripciones precedentes y las figuras que las acompañan. Tales modificaciones intentan entrar dentro del alcance de las reivindicaciones. Varias publicaciones se citan aquí, las revelaciones de las cuales se incorporan a modo de referencia en su integridad en la extensión necesaria para entender la presente invención. La manipulación del DNA, clonaje y transformación de células bacterianas son, excepto cuando se indica de otra manera, llevadas a cabo de acuerdo con el manual de Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989). Estos ejemplos están precedidos mediante una breve descripción de las figuras, de los plásmidos y de las cepas utilizadas, y por la composición de varios medios. Las cepas A. oryzae TK3, Aspergilus oryzae A (ver ejemplo 1), Aspergilus oryzae NF2 (ver ejemplo 2) Aspergilus oryzae xprD1 (ver ejemplo 3) y Aspergilus oryzae NF1 que contiene pNFF68 (ejemplo 4) se depositaron bajo el tratado de Budapest, en la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris, France, el 24 de Junio de 1997, en donde recibieron respectivamente los números de depósito CNCM I-1882, CNCM I-1881, CNCM I-1885, CNCM I-1884, y CNCM I-1883. Todas las restricciones como la disponibilidad de estos depósitos serán retiradas tras la primera publicación de esta solicitud u otra solicitud que reivindique beneficio o prioridad a esta solicitud.

Figuras

- La Figura 1 muestra el mapa de restricción de pNFF21 que comprende el gen truncado areA de E. nidulans y el promotor y terminador pkiA.

- La Figura 2 muestra las actividades relativas de Endo, LAP y DPPIV de A. oryzae TK3 (tipo salvaje), A. oryzae transformado con pNFF28 acompañado del gen pyrG (control pyr+), A. oryzae areA mutante de disrupción (control areA-; ver ejemplo 2) y 3 mutantes de A. oryzae NF1 que fueron cotransformados con pNFF28 y pNFF21.

- La Figura 3 muestra el mapa de restricción del inserto de 4,6 kb EcoRI-HindIII del plásmido pNFF5, que complementa la mutación areA19 en Emericella nidulans G332; ambos exones acompañando la región codificadora están indicados con flechas sólidas.

- La Figura 4 muestra la construcción de disrupción de areA pNFF44 que contiene los dos exones del gen pyrG de E. nidulans (pyr1 y pyr2), los dos exones del gen areA de A. oryzae (areA1 y areA2) y el gen bacteriano de resistencia a la kanamicina (KanaR).

- La Figura 5 muestra el lugar de mutagénesis dirigida del gen areA de A. oryzae; los desemparejamientos en el cebador mutagénico con la secuencia salvaje areA están indiciados como sigue; el codón de finalización (TAA) está en cursiva, el sitio AflII subrayado doble y el sitio introducido EcoRV está marcado en negrita y está subrayado.

- La Figura 6 muestra las actividades relativas de Endo, LAP y DPPIV de A. oryzae TK3 (tipo salvaje) y 9 mutantes de A. oryzae NF1 que fueron co-transformados con el producto de amplificación areA desreprimido y el producto de amplificación pyrG, y los transformantes se seleccionaron en MM con glucosa y glutamina.

Cepas y plásmidos

- E. nidulans G191 (pyrG89, fwnA1, pabaA1, YuA1), E. nidulans G353 (areA1, biA1) y E. nidulans G332
(pabaA1, yA2, xprD1) se obtuvieron del Glasgow Genetic Stock Center vía el Dr. A.J. Clutterbuck. Otras cepas de tipo salvaje de Emericella nidulans también se pueden utilizar en los siguientes ejemplos.

- Aspergillus oryzae TK3 se obtuvo de la colección de cepas de Nestlé.

- Aspergillus oryzae NF1 (pyrG1) es un derivado auxótrofo de uridina de A. oryzae TK3 en que el gen pyrG, codificando la orotidina 5'-fosfato descarboxilasa, se inactivó por disrupción de la diana.

- Escherichia coli BZ 234 (Colección del Biozenter, Universidad de Basilea, Basilea, Suiza) se usó como huésped para la propagación de plásmidos. Las cepas JM109 de E.coli (endA1, recA1, gyrA96, hsdR17 (r_{k-}, m_{k+}), relA1, supE44, \lambda-\Delta(lac-proAB) [F', traD36, proA+B+, lacI^{q}Z\DeltaM15]) y EM1301 (lacZ53, mutS201::Tn5, thyA36, rha-5, metB1, deoC, IN(rrnD-rrnE)) se usaron en la mutagénesis dirigida a un sitio.

- El plásmido pHELP1 se usó para clonación directa en Emericella nidulans (Gems y Clutterbuck, Curr. Genet., 24, 520-524, 1993; Número de Acceso GenBank: X78051).

- El plásmido pNFF28 contiene el gen pyrG de A. oryzae TK3 (Número de acceso GenBank: Y13811).

- El plásmido pFBY182, conteniendo el gen pepB como un fragmento EcoRI-XbaI bajo el control del promotor y terminador pkiA de Aspergillus niger obtenido de Novartis, Suiza, vía Dr. Gabor Jarai (Número de acceso GenBank: S38698).

- pNEB193 (New England Biolabs), pAlter1 (Promega), pBluescriptSK- (Stratagene), pHSS19 y pGEM-T (Promega), y pK18 (Número de acceso GenBank: M17626) se usaron para subclonación.

Medio

La base de nitrógeno fúngica (FNB) estaba compuesta por 1x Base de nitrógeno de levadura (YNB) sin aminoácidos y (NH_{4})_{2}SO_{4} (Difco) con 50 mM de glucosa como fuente de carbono y 10 mM NaNO_{3} como fuente de nitrógeno. En el caso de E. nidulans G353 (areA1, biA1), 10 mM de glutamina se añadieron como fuente de nitrógeno. Los ensayos de crecimiento se realizaron en MM (que contiene por litro 1,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g de KCl, Pontecorvo, 1953) sólo ahora 10 mM NaNO_{3} sirve como única fuente de nitrógeno. Los ensayos en placa de proteasa se realizaron en MM con 0,2% de proteína de soja como única fuente de carbono y nitrógeno. Para estudios cuantitativos matraces cónicos de 250 ml rellenos con 80 ml de MM con 0,2% de proteína de soja, como única fuente de carbono y nitrógeno, se inocularon con 10^{6} conidioesporas/ml y se incubaron durante 5 días a 30ºC sin agitación.

Ejemplo 1 Sobreexpresión del gen areA truncado de E. nidulans

Para asegurar la viabilidad de aumentar la expresión de enzimas proteolíticas por modulación de la expresión de areA, decidimos sobreexpresar el gen de Emericella nidulans en A. oryzae TK3.

Con este fin, la amplificación de la región codificante del gen areA a partir de Emericella nidulans G191 y clonación del producto de PCR en el vector de expresión pFBY182 se consiguieron tal como sigue; con los oligonucleótidos ID de SEC. Nº:3 e ID de SEC. Nº:4, un fragmento de 2.174 pb, comprendiendo la región codificante de areA entre las posiciones 2009 y 4168, se amplificó a partir de DNA genómico de E. nidulans G191. Al mismo tiempo se añadió un sitio EcoRI al extremo 5' y un sitio XbaI en el extremo 3', permitiendo la clonación direccional en el vector de expresión fúngico pFBY182 digerido con EcoRI-XbaI para dar pNFF21 (ver figura 1). En pNFF21, la transcripción areA está bajo control del promotor y terminador pkiA de A.niger (Graaff, Curr.Genet., 22, 21-27, 1992), previniendo así la regulación hacia abajo en condiciones de represión ejercidas por su 3'UTS nativo.

pNFF21 se introdujo en A. oryzae NF1 (pyrG1) por co-transformación con pNFF28 conteniendo el gen pyrG de A. oryzae. Por lo tanto, A. oryzae NF1 creció en MM con 0,1% de extracto de levadura (Difco), 50 mM de glucosa y 5 mM de glutamina. El micelio se cultivó por filtración estéril, se lavó una vez con agua estéril doblemente destilada y una vez con K0,8MC (20 mM MES-HCl pH 5,8, 0,8 M KCl, 50 mM CaCl2). 1,5 g de micelio se resuspendió en 20 ml de una solución esterilizada por filtro de 5 mg/ml de Novozyme 234 en K0,8MC. La suspensión del micelio se incubó a 30ºC durante 2 horas con agitación enérgica (120 rpm). Los protoplastos se liberaron del micelio mediante resuspensión enérgica con una pipeta, se lavó dos veces con 20 ml de S1,0TC (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1M Sorbitol, 50 mM CaCl_{2}) y se resuspendieron en una conentración final de 10^{8}/ml en S1,0TC. 20 ml de DNA se mezclaron con 200 \mul de protoplastos y 50 \mul de 25% PEG 6000 en 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM CaCl_{2} y se incubó durante 20 min. en hielo. A esta mezcla, se añadieron 2 ml de 25% PEG6000 (BDH) en 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl_{2}, se mezclaron enérgicamente y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente, 4 ml de S1.0TC se añadió y alícuotas de 1,0 ml se mezclaron con 5 ml de 2% agarosa de bajo punto de fusión (Sigma) en OFNB (base de nitrógeno fúngico osmóticamente estabilizada) y se puso en agar OFNB (Difco) con 50 mM de glucosa y 10 mM de NaNO_{3}. Los transformantes NF1 de A. oryzae se pusieron en MM agar con 1 M de sacarosa, 50 mM de glucosa y 5 mM de glutamina.

Los transformantes resultantes se cribaron en MM conteniendo 2% de proteína de soja. Entre los 20 transformantes cribados, tres mostraron un aumento de la secreción de actividad proteolítica a juzgar por los tamaños de los halos que envuelven la colonia tras 36 horas de incubación a 30ºC (transformantes A, B y C). Estos tres transformantes se hicieron crecer en cinco días a 30ºC en cultivos líquidos estacionarios en MM con 0,2% de proteína de soja y analizados para la actividad proteolítica con los controles apropiados.

Con este fin, las conidioesporas (10^{6}/ml) de estas tres cepas se usaron para inocular 80 ml de líquido MM con 0,2% de proteína de soja como única fuente de carbono y nitrógeno. Estos cultivos se incubaron durante 5 días a 30ºC sin agitación. Tras la filtración para eliminar el micelio, el medio se sometió a ensayo para la actividad endoproteolítica (Endo), la actividad Leucina amino-peptidasa (Lap) y actividad prolina-dipeptidil-peptidasa (DPPIV). La actividad de la enzima endoproteolítica se midió con caseína marcada con resorufina de acuerdo con la descripción del método Boheringer suministrado con el sustrato (caseína marcada con resorufina, Nº Cat. 1080733). Las actividades leucina aminopeptidasa y dipeptidil peptidasa IV se determinaron por espectrometría UV con sustratos sintéticos Leu-pNa y Ala-Pro-pNa (Bachem, Suiza) respectivamente, de acuerdo con Sarath et al. (En Protease assay methods for proteolytic enzymes: a practical approach, Beynon R.J, Bond J.S., eds., IRL Press, Oxford). 10 mM solución stock sustrato en dimetilsulfóxido (DMSO) se diluyó con 100 mM de tampón fosfato sódico, pH 7,0, a una concentración final de 0,5 mM. 20-100 \mul de medio de cultivo sobrenadante se añadió y la reacción se continuó durante hasta 60 min a 37ºC. Un control con sustrato blanco se ensayó en paralelo. La liberación del grupo cromóforo 4-nitroanilina (\varepsilon: 10'500 M^{-1}cm^{-1}) se midió a 400 nm y las actividades se expresaron como mU/ml (nmol/min/ml).

Las actividades proteolíticas relativas se muestran en la figura 2. En areA la actividad endoproteolítica mutante de disrupción (Endo) y la leucina aminopeptidasa (Lap) estaban significativamente reducidas en comparación con las cepas control TK3 y pyr+, mientras que la actividad prolina dipeptidil peptidasa (DPPIV) no se vió afectada. Aparentemente, la expresión de la prolina dipeptidilpeptidasa no está bajo el control de areA. La introducción de múltiples copias de E.nidulans areA en A. oryzae NF1 bajo el control de las señales de expresión pkiA resulta en una sobre-expresión de la actividad de los enzimas endoproteolíticos, leucina aminopeptidasa y prolina-dipeptidil-peptidasa.

Ejemplo 2 Sobre-expresión del gen areA truncado de A. oryzae 1) Clonación del gen areA de A. oryzae

El gen areA de A. oryzae se clonó por complementación del correspondiente gen areA de E. nidulans con el método de la biblioteca instantánea (Gems et al., 1993).

Primero de todo, el aislamiento del DNA genómico se realizó de acuerdo con el protocolo modificado del método descrito por Raeder y Broda (Let. appl. Microbiol., 1, 17-20, 1985). El micelio se cultivó por filtración, se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se liofilizó. Entonces se redujo a un polvo fino usando un mortero y su mazo. 200 mg del micelio en polvo se resuspendieron en 2,5 ml de tampón de extracción (200 mM Tris-HCl pH 8,5 150 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5%SDS) y la solución se extrajo con 1,75 ml de tampón de extracción equilibrado con fenol y 0,75 ml de cloroformo/isoamilalcohol (24:1, v/v). La mezcla se centrifugó (20 min, 3000 g). La fase acuosa se recuperó y se incubó con 125 \mul de solución RNAsa A (Boheringer) (10 mg/ml) durante 10 min a 37ºC. 1,25 ml de 2-propanol (Merck) entonces se añadieron. El pellet se lavó con 70% etanol y finalmente se resuspendió en 500 ml de tampón TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 ml de 2 x QBT (1,5 M NaCl, 100 mM MOPS, 30% etanol, pH 7,0) se añadieron a la muestra que entonces se aplicó a un "Genomic-tip 100" (Qiagen), se alcanzó y se eluyó tal como recomendaba el proveedor.

La clonación por complementación entonces se obtuvo por mezcla de 40 \mug de BamHI digerido con pHELP1 con tanto 100 \mug de BamHI digerido o 100 \mug de DNA genómico parcialmente digerido con Sau3A de A. oryzae TK3. Además, 40 \mug de pHELP1 digerido con KpnI se mezclaron con 100 \mug de DNA genómico digerido con KpnI de A. oryzae TK3. Todas las tres mezclas de DNA se introdujeron en E. nidulans G332 y los transformantes se seleccionaron en un medio FNB osmóticamente estabilizado con NaNO_{3} como única fuente de nitrógeno.

El experimento de transformación con el DNA de A. oryzae TK3 parcialmente digerido con Sau3A, no proporcionó ningún transformante. Por el contrario los experimentos con DNA de A. oryzae TK3 digeridos con BamHI y KpnI proporcionaron 14 y 3 transformantes respectivamente. De nuevo esos transformantes exhibieron un crecimiento irregular, que sugirió que el gen complementario se localizó en un plásmido replicado autónomamente. En un experimento separado 40 \mug de pHELP1 digerido con KpnI se co-transformó con 100 \mug de DNA genómico digeridos con KpnI de E. nidulans G332 (xprD1) y se obtuvo un transformante.

De los tres transformantes derivados de BamHI y un transformante areA derivado de KpnI, los plásmidos se rescataron por transformación de E.coli. No se pudieron aislar plásmidos del transformante de la transformación xprD1. De cada uno de los transformantes areA+ BamHI de E. nidulans se pueden recuperar varios plásmidos. El análisis por restricción de esos plásmidos mostró que eran derivados de pHELP1 conteniendo fragmentos de restricción adicional, pero que no todos estos insertos llevan sitios BamHI terminales. De forma similar, a partir de los transformantes KpnI areA+ se pueden recuperar varios derivados de pHELP1, ninguno de los cuales tiene un inserto con sitios KpnI terminales. Estas observaciones indican inestabilidad de los plásmidos.

Un derivado pHELP1 de BamHI (pNFF3) y uno de KpnI (pNFF4) se escogieron para el posterior análisis. Los insertos de ambos clones hibridaron la región codificante del gen areA de E. nidulans. El análisis detallado de estos dos clones mostró que en pNFF3, el gen areA íntegro se localizó en el fragmento de 4,6 kb EcoRI-HindIII (Fig.3). Este fragmento EcoRI-HindIII de 4,6 kb se subclonó en pHSS19 para dar pNFF5. Una vez re-introducido en E. nidulans G323, pNFF5 restaura su capacidad de crecimiento en NaNO_{3} como única fuente de nitrógeno demostrando que este plásmido contiene un gen areA funcional (datos no mostrados).

2) Caracterización del gen areA de A. oryzae

La secuencia de nucleótidos completa del inserto EcoRI-HindIII de pNFF5 se determinó por análisis de ambas cadenas en subclones parcialmente solapados. Se determinó la secuencia de nucleótidos, en un secuenciador automático Licor modelo 4000. Los cebadores marcados IRD41 se usaron para secuenciar ambas cadenas de los subclones parcialmente solapados por el método de didesoxinucleótido de Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 74, 5463-5467, 1977). El análisis de la secuencia de DNA se realizó usando los programas de ordenador GCG (Devereux et al., Nucl. Acids Res., 12, 387-395, 1987).

Los resultados muestran que el gen areA de A. oryzae codifica una proteína de 853 residuos de aminoácidos con un peso molecular deducido de 91,5 kDa (ver ID de SEC Nº:2). A nivel de proteínas el areA de A. oryzae presenta una similitud del 83% y a nivel de DNA un 70% de similitud con el gen areA de E. nidulans.

Además, en la región del promotor putativo la homología total del DNA con E. nidulans alcanza el 43%. Aún así, siete tramos de DNA de 5 a 13 pb de longitud muestran el 100% de la secuencia idéntica y ocupan virtualmente posiciones idénticas en ambos promotores. Estas secuencias podrían representar elementos activadores en cis. Además, las regiones no transcritas 5' contienen varios sitios de unión AREA putativos (GATA o TATC; Fu and Marzluf, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87, 5351-5355, 1990) dos de los cuales ocupan posiciones idénticas como los dos sitios de unión AREA funcionales en E. nidulans.

3) Disrupción del gen areA de A. oryzae

Para elucidar el papel de areA en la expresión de los genes que codifican la proteasa, se generó un mutante sin areA se generó por disrupción génica. Para construir tal alelo nulo de areA, los dos fragmentos internos SmaI (ver Fig.3) se eliminaron de pNFF5 para dar pNFF10. Para hacer eso, pNFF10 se creó por digestión de pNFF5, conteniendo el gen areA de A. oryzae TK3, con SmaI y autoligándose el vector al fragmento que lo contiene. Esto elimina los fragmentos SmaI de 0,2 kb y 0,5 internos del segundo exón del gen areA en pNFF5.

Como marcador de selección, un producto de PCR, comprendiendo el gen pyrG de E. nidulans, se insertó en el único sitio SmaI de pNFF10 para dar pNFF44 (Fig.4). Por lo tanto, con los oligonucleótidos ID de SEC Nº:5 e ID de SEC Nº:6, el gen pyrG se amplificó a partir de E. nidulans G332 y el producto de PCR de 1851 pb clonado en pGEM-T (Promega) para dar pNFF38 y pNFF39. El fragmento EcoRI, abarcando el gen pyrG se recuperó de pNFF39, se dejaron los extremos romos con la T4 DNA polimerasa y se clonó en el sitio SmaI de pNFF10.

Esta construcción pNFF44, linearizada con EcoRI y NheI, se usó para transformar A. oryzae NF1, y los transformantes se seleccionaron en MM estabilizado osmóticamente conteniendo glucosa y glutamina como fuente de carbono y nitrógeno respectivamente. Todos los transformantes pyrG+ además se testearon para ver su capacidad de usar nitrógeno y proteínas de soja como únicas fuentes de nitrógeno. Cuatro transformantes pyrG+ exhibieron una reducción sorprendente o ningún crecimiento en el nitrato MM y tres no formaron un halo cuando crecieron durante dos días en MM conteniendo proteína de soja 0,2% como única fuente de nitrógeno y carbono (datos no mostrados). Un Southern blot de DNA genómico digerido con SmaI de estos cuatro y otros seis transformantes pyrG+, fue digerido con SmaI y sondado con un inserto de 4,6 kb EcoRI-HindIII de pNFF5. Sólo en uno de los transformantes, los dos fragmentos internos SmaI del gen areA se eliminaron, identificando este transformante como mutante sin areA. El mutante de disrupción areA se llamó NF2.

El mutante areA NF2 creció durante 5 días a 30ºC sin agitación en 80 ml de MM con 0,2% de proteína de soja. El mutante areA creció pobremente en MM con 0,2% de proteína de soja. El análisis del caldo de cultivo mostró un descenso del 75% en la actividad endoproteolítica total y un descenso del 60% en la actividad leucina aminopeptidasa en comparación con el control TK3 de A. oryzae (WT) (Fig 2). Por el contrario la actividad prolina dipeptidilpeptidasa en el mutante areA no difirió significativamente del control de tipo salvaje (Fig.2).

4) Construcción del alelo areA constitutivo

Los experimentos de cotransformación con pNFF5, conteniendo el gen areA WT, no proporcionaron los cotransformantes que sobreprodujeron enzimas proteolíticas (datos no mostrados). Esto sugiere una estrecha regulación del gen areA de A. oryzae.

Para permitir la expresión constitutiva de las enzimas proteolíticas (esto es en la presencia de glutamina), el truncamiento del gen areA se obtuvo. Por mutagénesis dirigida a un sitio, un codón de stop (TAA), un sitio AflII y uno EcoRV se introdujeron en el fragmento areA EcoRI-HindIII de 4,6 kb, truncando la proteína AREA tras el residuo de aminoácido 752 (ver figura 5).

Con este fin, el inserto EcoRI-HindIII de pNFF5 se ligó en pALTER1 y se introdujo en E.coli JM109 para dar pNFF49. Por superinfección con el fago ayudante M13KO7, el DNA de cadena simple se generó a partir de pNFF49 que se usó en el procedimiento de la mutagénesis dirigida a un sitio con el kit II de los sitios Alterados (Promega). Entonces 0,05 pmoles de pNFF49 de cadena simple se hibridaron con 0,25 pmoles de oligonucleótido reparador de ampicilina ID de SEC Nº: 7, 0,25 pmoles de oligonucleótidos knock-out de tetraciclina ID de SEC Nº:8 y 1,25 pmoles de oligonucleótido mutagénico areA/xprD1 ID de SEC Nº:9, en 20 ml de 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 y 50 mM NaCl en un termociclador Perkin Elmer programado para calentar la mezcla de hibridación a 75ºC durante 5 min y entonces enfriando a 45ºC en una tasa de 1ºC/min. A partir de 45ºC a 20ºC la tasa de enfriamiento aumentó a 1,5ºC/min. Después se añadieron 3 ml 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM dNTPs, 10 mM ATP y 20 mM DTT. La mezcla se incubó durante 90 min a 37ºC con 5U T4 DNA polimerasa y 1U T4 DNA ligasa. Una alícuota de 3 ml de la mezcla de reacción se introdujo en E.coli ES1301 por electroporación y se seleccionaron los transformantes en 5 ml de LB conteniendo 125 mg/ml de ampicilina. Los plásmidos mutados se recuperaron de ES1301 y se introdujo en BZ234.

El fragmento EcoRI-EcoRV de 3,5 kb se clonó además en pBlueskript para dar pNFF58. Para ensayar la funcionalidad pNFF58 se introdujo en A. oryzae NF2 (ver posteriormente) y los transformantes se seleccionaron en OFNB conteniendo NaNO_{3} como única fuente de nitrógeno. Con pNFF58, 1,5 transformantes/\mug se obtuvieron y con el control pNFF5, 6 transformantes/\mug. Estos datos prueban que pNFF58 aún contiene un gen areA funcional. Los transformantes pNFF58 se cribaron para ver la actividad proteolítica en MM con 0,2% de proteína de soja y MM con 0,2% de proteína de soja y 10 mM de glutamina. Sobre un 0,2% de proteína de soja, muchos transformantes produjeron halos mayores que los controles de tipo salvaje (A. oryzae TK3) sugiriendo que la sobreexpresión resulta en una secreción potenciada de enzimas proteolíticos. La mayoría de los transformantes producen halos en ambos medios, sugiriendo una expresión desreprimida de los enzimas proteolíticos (datos no mostrados).

Ejemplo 3 Construcción de cepas de moho de koji sobreproductoras de proteasa

Para producir una producción potencial de cepas de mohos de koji, al menos una copia adicional del alelo desreprimido areA sería necesario introducirlo en el derivado NF1 de A. oryzae TK3. Por razones legales, esto debe realizarse sin introducir secuencias bacterianas, especialmente genes de resistencia a antibióticos. Para este fin los insertos de pNFF28 y pNFF58 se amplificaron por PCR con la DNA polimerasa pfuI y los oligonucleótidos desfosforilados ID de SEC Nº:10 e ID de SEC Nº:11. Los productos de amplificación se autoligaron y purificaron. 10 \mug del producto de amplificación pNFF58 y 10 \mug del producto de amplificación pNFF28 se introdujeron en A. oryzae NF1 y los transformantes se seleccionaron sobre MM osmóticamente establecido con glucosa 50 mM y glutamina 5 mM. Como control también se introdujeron 10 \mug de pNFF28. El plásmido pNFF28 era portador de 30 transformantes/\mug, el producto de PCR de pNFF28 de 6 transformantes/\mug y los productos de PCR de pNFF28/pNFF58 de 16 transformantes/\mug.

Los potenciales cotransformantes se cribaron por incremento de la actividad proteasa en MM con 0,2% de proteína de soja y MM con 0,2% de proteína de soja y L-Glutamina 10 mM. Doce transformantes produjeron más actividad proteolítica en ambos medios como indicaba el mayor tamaño de halo que produjeron. Para cuantificar la sobreexpresión, nueve de ellos se incubaron sin agitación durante 5 días a 30ºC en 80 ml de MM que contenía 0,2% de proteína de soja. El medio de cultivo se probó para la actividad proteolítica (Fig. 6).

Al igual que el gen areA de E. nidulans bajo el control de las señales de expresión de pkiA de A.niger (Fig.2), las tres clases de actividad proteolítica probadas fueron incrementadas al compararlas con la cepa salvaje A. oryzae TK3 y el derivado pyrG de A. oryzae NF1.

El análisis Southern blot de las cepas sobreproductoras de proteasas muestra que todos los cotransformantes contienen de 2 a 4 copias integradas funcionalmente del gen areA desreprimido.

Comparando los niveles observados de sobreproducción y el número de copias funcionalmente integradas del gen areA desreprimido, no se observó ninguna relación clara. El transformante xprD1 produce los mayores niveles de actividad proteolítica y contiene múltiples copias de xprD1 funcionalmente integrado. No obstante, el transformante xprD12 contiene muchas menos copias del xprD1 funcionalmente integrado pero produce al menos la misma actividad que el transformante xprD1. Además, los patrones de hibridación de xprD6 y xprD7 son muy similares, no obstante xprD6 sobreproduce todas las actividades ensayadas 1,5 veces pero xprD7 sobreproduce sólo la prolina dipeptidilpeptidasa.

Ejemplo 4 Expresión del alelo xprD1 de A. oryzae con el promotor y el terminador del gen dppIV de A. oryzae

Los experimentos de cotransformación del ejemplo 2 resultaron en cepas que tienen múltiples copias de pNFF58 integrado en el genoma y que sobreproduce la actividad proteolítica de 2 a 3 veces cuando se compara con la cepa TK3 de tipo salvaje. Por el contrario, las cepas con una copia de pNFF21 (ejemplo 1), donde areA de E. nidulans está bajo el control de un promotor glicolítico fuerte resulta en una sobre-expresión de 6 veces. Estos datos sugieren que el promotor areA nativo es un promotor débil y que la expresión de un areA truncado funcional bajo control de un promotor fuerte da mejores resultados.

Con este fin, el gen dppIV de A. oryzae TK3 se amplificó por PCR con la PfuI DNA polimerasa y oligonucleótidos fosforilados ID de SEC Nº:12 e ID de SEC Nº:13. El producto de PCR entonces se digirió con los enzimas ApaI y EcoRV. El fragmento de 4,8 kb ApaI-EcoRV digerido se subclonó en pALTER1 (Promega) para dar pNFF61. Después pNFF61 se sometió a una mutagénesis dirigida a sitio de acuerdo con el protocolo de Deng et al. (Anal. Biochem., 200, 81, 1992), usando los oligonucleótidos mutagénicos 5'-fosforilados ID de SEC Nº:14 e ID de SEC Nº:15 de acuerdo con el manual del kit II de los Sitios Alterados (Promega) resultando en pNFF62. Usando el enzima PfuI polimerasa y los oligonucleótidos ID de SEC Nº:16 e ID de SEC Nº:17, el alelo xprD1 se amplificó por PCR, a partir de pNFF58 conteniendo el alelo xprD1 de A. oryzae, como un fragmento EcoRI-EcoRV de 3,4 kb. El producto de amplificación xprD1 de 2294 pb entonces se fosforiló y se clonó en el vector pK19 digerido con SmaI (Pridmore et al., Gene, 56, 309-312, 1987) para dar pNFF64. Finalmente el inserto NotI-Ecl136III a partir de pNFF64 se insertó en NotI-HpaI pNFF62 creando pNFF68 abarcando el alelo xprD1 fusionado al promotor y terminador dppIV.

PNFF68 se introdujo en NF1 de A. oryzae por cotransformación con pNFF28, y los transformantes primarios se cribaron para ver su actividad proteolítica aumentada en placas MM conteniendo 0,2% de proteína de soja. Cinco de los 35 transformantes presentaron tamaños de halo aumentados en comparación con A. oryzae TK3. Entre los 5 transformantes así seleccionados, uno se depositó bajo el Tratamiento de Budapest en el CNCM, donde éste recibió el número de depósito CNCM I-1883.

Los cotransformantes que sobreexpresan los enzimas proteolíticos y los controles de tipo salvaje se pusieron en placas MM conteniendo 0,2% de proteína de soja y 5 mM de L-glutamina. Todos los cotransformantes seleccionados aún producen un halo en presencia de glutamina 5 mM, mientras que el tipo salvaje no, indicando la expresión desreprimida de la actividad proteolítica.

Para cuantificar la sobreexpresión, los transformantes se incubaron sin agitación durante 5 días a 30ºC en 80 ml MM conteniendo 0,2% de proteína de soja. El medio de cultivo entonces se ensayó para ver la actividad proteolítica. Los resultados muestran una sobreproducción de la actividad proteolítica de al menos 6 veces cuando se compara con la cepa TK3 de tipo salvaje.

Ejemplo 5

Para preparar una salsa de soja fermentada, se prepara un koji por mezcla de un cultivo de koji CNCM I-1883 de Aspergillus oryzae con una mezcla de soja cocida y trigo tostado, el koji entonces se hidroliza en una suspensión acuosa durante de 3 a 8 horas a 45ºC a 60ºC con los enzimas producidos durante la fermentación del cultivo CNCM I-1 de Aspergillus oryzae, un moromi se prepara además mediante la adición de una cantidad apropiada de cloruro sódico a la suspensión de koji hidrolizada, el moromi se deja fermentar y entonces se presiona y el licor obtenido se pasteuriza y clarifica.

Ejemplo 6

Para producir un agente aromático, se preparó una suspensión acuosa de una mezcla de soja cocida y trigo tostado, las proteínas se solubilizan por hidrólisis de la suspensión con una proteasa a pH 6,0 a 11,0, la suspensión se trata con calor a pH 4,6 a 6,5, y la suspensión se hace madurar con la enzima prolidasa de Sigma y enzimas proteolíticos que se han aislado de un medio líquido fermentado por Aspergillus oryzae CNCM I-1881.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

\hskip0.6cm

(A) NOMBRE: SOCIETE DES PRODUITS NESTLE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: AVENUE NESTLE 55

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: VEVEY

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: VAUD

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: SUIZA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1500

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POTENCIACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS EN EL MOHO DE KOJI

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4657 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exon

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LOCALIZACIÓN: 1189..1604

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: intrón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1605..1703

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exon

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1704..3846

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1189..3480

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= AREA TRUNCADA

\hskip6.6cm

/nota= "AREA TRUNCADA INMEDIATAMENTE CORRIENTE A- {}\hskip6.6cm BAJO DE LA SECUENCIA QUE CODIFICA UN DOMINIO {}\hskip6.6cm DE UNIÓN AL DNA"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 853 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio de unión

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 652-676

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/NOTA= "SITIO DE UNIÓN AL DNA"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..731

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= "AREA TRUNCADA QUE ESTÁ AÚN ACTIVA PERO NO REPRIMIDA POR L-GLUTAM..."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc = "OLIGONÚCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATTCATG AGTGGCATCG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEÓTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTAGACTAC AAACTCATCG TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATTCCATG GTGTCCTCGT CGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATTCGAGC CGTCAGTGAG GCTC

\hfill

24

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTGCCATTG CTGCAGGCAT CGTGGTG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGGGCCTC TTGCGGGCGT CCATTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCCGTCAC GACTTAAGAT ATCAAGCCGC GC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGGAAAC AGTCACGAC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTTTCCCA GTCACGAC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN:/desc="OLIGONUCLEOTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCCCGGTA CCCAATTCGC CC

\hfill

22

Claims (12)

1. Un moho de koji, seleccionado del género Aspergillus, Rhizopus o Mucor expresando un ácido nucleico que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos 1-731 de la ID de SEC Nº:2, tal que

el moho es capaz de expresar al menos 2 veces más endo- y exopeptidasas que la cepa de tipo salvaje Aspergillus oryzae CNCM I-1882 cuando crece en un medio mínimo que contiene 0,2% de proteínas de soja, y tal que

el moho es aún capaz de expresar endo- y exopeptidasas cuando está en presencia de al menos 5 mM L-glutamina, y

presentando una actividad prolil-dipeptidil-peptidasa potenciada.

2. El moho de koji de acuerdo con la reivindicación 1, que ha integrado copias múltiples del ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. El moho de koji de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico está unido operativamente al menos a una secuencia reguladora capaz de dirigir la sobreexpesión del polipéptido tal como se identifica mediante los aminoácidos 1-731 de la ID de SEC Nº 2.

4. El moho de koji de acuerdo con la reivindicación 1, que expresa

al menos 30 mU de actividad endopeptidasa

al menos 30 mU de actividad leucina-amino-peptidasa, y

al menos 10 mU de actividad prolina-dipeptidil-peptidasa,

por ml de sobrenadante, cuando crece en un medio mínimo contiene 0,2% de proteínas de grano de soja.

5. El moho de koji de acuerdo con la reivindicación 1, que es CNCM I-1881, CNCM I-1883 y CNCM I-1884.

6. Una proteína de unión al DNA de Aspergillus oryzae con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-731 de la ID de SEC. Nº 2.

7. Un ácido nucleico, codificando el polipéptido con la secuencia de aminoácidos 1-731 de la ID de SEC Nº 2.

8. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, que está unido operativamente al menos a una secuencia reguladora, capaz de dirigir la expresión de dicho gen.

9. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 ó 8, que tiene la secuencia de nucleótidos 1189-1604 y 1704-3480 de la ID de SEC Nº 1.

10. Un método para sobreproducir enzimas proteolíticos, comprendiendo el cultivo de un moho de koji de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones en que el moho de koji expresa enzimas, y opcionalmente aislando los enzimas en forma de un concentrado.

11. El uso de un moho de koji de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para hidrolizar materiales que contienen proteínas.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en combinación con un enzima y/o un microorganismo proporcionando la actividad prolidasa.