ES2217396T3

ES2217396T3 - Utilizacion de il-7 en el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes, en particular, la diabetes mellitus insulinodependiente.

Info

Publication number: ES2217396T3
Application number: ES97907134T
Authority: ES
Inventors: Jean-Francois Bach; Jean-Marc Gombert; Andre Herbelin; Michel Morre
Original assignee: Sanofi Synthelabo SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-26
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2017-02-26
Also published as: WO1997031648A1; NO983917D0; NO983917L; DK0883406T3; BR9707776A; US20040180037A1; DE69728654T2; FR2745185B1; JPH11508605A; DE69728654D1; US6713053B1; AU1929397A; PT883406E; FR2745185A1; JP3138481B2; ATE264112T1; EP0883406B1; EP0883406A1; NO321569B1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA UTILIZACION DE LA INTERLEUQUINA 7 O DE LINFOCITOS T PREVIAMENTE INCUBADOS EN PRESENCIA DE IL 7 PARA LA ELABORACION DE UN MEDICAMENTO O DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD AUTOINMUNE, EN PARTICULAR, UNA ENFERMEDAD AUTOINMUNE GENERADA POR UN DEFECTO EN LA INMUNORREGULACION DE LAS CELULAS T CD4+.

Description

Utilización de IL-7 en el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes, en particular, la diabetes mellitus insulinodependiente.

La presente invención, se refiere a una nueva utilización de interleucina-7 (IL-7), en el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes, de una forma particular, en la diabetes mellitus insulinodependiente.

La diabetes del tipo 1, o diabetes mellitus insulinodependiente (DMID), se considera, hoy en día, como una enfermedad auto-inmune (Endocr. Rev. 1994, 15 (4), 516 - 542), caracterizada por la presencia de anticuerpos anti-células beta y por su sensibilidad a una terapia inmunosupresiva. El DMID, resulta, a la vez, en el hombre, y en el ratón, "nonobese diabetic" (NOD), de una respuesta inmunitaria de tipo celular predominante, caracterizándose, la respuesta humoral, por la secreción de anticuerpos anti-membrana y anti-productos segregantes de las células beta (N. Engl. J. Med. 1981, 304, 1454 - 1465, N. Engl. J. Med., 1992, 327, 302). La respuesta inmunitaria del tipo celular, se caracteriza por lesiones histológicas o "insulitis", provocadas por las infiltraciones de células inflamatorias e inmunitarias de tipos macrófagos, linfocitos B y T en el interior de los islotes de Langerhans del páncreas (Diabetología, 1989, 32, 282 - 289; Insulitis and type 1 diabetes, - Insulitis y dibetes del tipo 1 -, Academic Press Tokio, 1989, 35 - 50).

El modelo de los "ratones NOD", es un modelo espontáneo de diabetes auto-inmune o diabetes del tipo 1. Argumentos convergentes, indican el hecho de que, la aparición inesperada de la enfermedad, se encuentra bajo el control de las células T immunorregulantes CD4^{+}. Éste, es un efecto acelerado por la timectomía realizada a la edad de 3 semanas (Eur. J. Immuno. 1989, 19, 889-895), y puede prevenirse, en un sistema de transferencia, mediante la co-inyección de timocitos o de células esplénicas CD4^{+}, de ratones jóvenes NOD, todavía no diabéticos, (J. Expr. Med. 1989, 169, 1669 - 1680).

Se ha sugerido y mostrado, de una forma indirecta, el hecho de que, las células linfocitos T helper 2 (Th2), debido a su capacidad para producir interleucina-4 (IL-4), son las células inmunorregulantes CD4^{+}, de las que se trata aquí (Autoinmunity, 1993, 15, 113-122). Se ha mostrado, en efecto, el hecho de que, la administración de IL-4 (J. Exp. Med. 1993, 178 (1), 87-99), o de anticuerpos monoclonales anti-interferon-\gamma (INT-\gamma), prevenía el inicio de la dibetes y que, la administración de interleucina-12 (IL-12), inductor de linfocitos T helper 1 (Th1), aceleraba el inicio de la diabetes (J. Exp. Med. 1955, 181 (2), 817 - 821).

No obstante, otro estudio, mostró el hecho de que, si las células "Th2-like" diabetológicas encontradas infiltradas los islotes, no provocaban la aparición de la enfermedad, éstas no ofrecerían, no obstante, una protección significativa. (Science, 1995, 268 (5214), 1185-1188). Así, de esta forma, si se ha sugerido y se ha mostrado, de una forma indirecta, el hecho de que, la aparición de la diabetes en los ratones NOD, se encuentra sobre el control de las células Th2, no se facilita ninguna explicación o sugerencia, sobre el carácter de la anomalía presente en los ratones NOD, del proceso fisiológico que se desprende, y que se encuentra en el origen de la emergencia de una autoinmunidad anti-islotes de Langherans en el origen de la diabetes en estos animales. Se ha sugerido, igualmente, recientemente, el hecho de que, la diferenciación de las células Th2, podía controlarse mediante un tipo de células T, caracterizado por el fenotipo TCR-\alpha\beta, CD4^{-}CDB^{-} (doble negativo, DN) o CD4^{+}CDB^{-}(positivo simple), portadores de un fenotipo natural (no expresión del "Heat Stable Antigen" HSA - Antígeno estable al calor HSA), que expresa, selectivamente, el marcador de activación CD44. Esta sub-población, la cual se caracteriza igualmente en las otras cepas, por el marcador NK1.1, tiene la capacidad de producir, en gran cantidad, IL4, después de la estimulación mediante un anticuerpo policlonal anti-TCR-\alpha\beta (TCR-\alpha\beta: receptor \alpha\beta de las células T) (J. Immunol. 1995, 155 (10), 4544 - 4550).

Por otra parte, se ha mostrado el hecho de que, este sub-tipo, tiene la particularidad de restringirse mediante las moléculas de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y de utilizar, de una forma preferente, el gen V\beta8 del receptor T (J. Exp. Med. 1993), 178, 901 - 908), subtipo cuya proliferación se induce de forma específica mediante la interleucina-7 (J. Exp. Med. 1994, 180 (2), 653 - 661).

Las proteínas interlecina-7 de los mamíferos (citocina IL-7s), en particular, en el hombre y en el ratón, los ADNs correspondientes, los vectores de expresión que codifican para las IL-7s, sus procedimientos de producción, incluyendo los sistemas recombinantes, se han descrito ya (patente estadounidense US 4 965 195).

Las proteínas interleucina-7 de los mamíferos, se designarán, a partir de ahora, en la parte que sigue de este documento, como "IL-7". El IL-7, es un factor de crecimiento linfopoyético, el cual tiene la capacidad de estimular el desarrollo y la proliferación de las células de la médula ósea (documento internacional de patente WO 89 / 033884). La estimulación de la producción de plaquetas (documento internacional de patente WO 90 / 09194), mediante la inducción de la proliferación de megacariocitos, ha sido una de las primeras aplicaciones de la administración de la IL-7. Se han descrito igualmente otras aplicaciones de la IL-7, como la correspondiente a la encaminada a al tratamiento del cáncer o de la infección vírica por inmunoterapia, a partir de células modificadas que producen la IL-7, bien ya sea por una inyección directa de las células modificadas in vivo, o bien ya sea por una fase previa de tratamiento in vitro, antes de la inyección (documento internacional de patente XO 92 / 01 459). Se ha descrito, igualmente, la utilización de la IL-7, para la proliferación de linfocitos T, humanos, específicos anti-HIV, como terapia potencial del SIDA (j. of Leucocite Biology, 1995, 58 (6), 623 - 633, para el tratamiento del melanoma maligno, en el sector de la dermatología (Hautarzt, 1995, 46 (10), 676-682), así como en calidad de potencializador de una vacuna para la prevención de una infección (microbiana y viral) y del establecimiento de un tumor (documento de patente internacional WO 94 / 22473). Se ha descrito, igualmente, la utilización de anticuerpos anti-IL-7, para el estudio y la investigación de procesos fisiológicos y patológicos, en particular, concernientes a la diferenciación y la proliferación de los linfocitos (documento de patente internacional WO 94 / 28160). Se han descrito otras aplicaciones que asocian la IL-7, con otras citocinas, como la asociación con la IL-4, para la inducción in vitro de la diferenciación de las células pre-B (documento de patente internacional WO 94 / 04685) o con la IL-3, para el tratamiento de la leucopenia (documento de patente internacional WO 94 / 04455), y para la prevención del trastorno de la médula ósea, después de terapia cancerosa o de injerto de médula (WO 93 / 03061).

Lynch y colegas, describen, en FASEB, volumen 4, nº 7, página A2183, la inmunoterapia de los tumores, utilizando lifoncitos T estimulados por la IL-7.

El documento de patente internacional WO 96 / 01122, describe la inducción de una respuesta inmune contra un patógeno de un tumor, con la ayuda de linfocitos T estimulados ex vivo, con IL-7 (página 2, líneas 16 - 31), y el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes, con linfocitos T, mantenidos no reactivos, cultivándolos ex vivo, con antígeno de un anticuerpo anti-IL-7, que inhibe la señal celular normalmente inducida por la IL-7, sobre la cadena del receptor de citocinas (página 2, línea 32, página 3, línea 6).

Los autores de la presente invención, han mostrado, en el momento presente, sobre la base de un estudio fenotípico e citometría de flujo, utilizando los marcadores HSA, CD4, CD8, CD44 y V\beta8, el hecho de que, una sub-población de timocitos de fenotipo CD44^{-}TCR-\alpha\beta HSA^{-}, y utilizando preferentemente el gen V\alpha\beta del receptor T, se reduce numéricamente, en el ratón NOD, de una edad de 3 semanas (a la vez, para las poblaciones CD4^{-}CD8^{-}DN (doble negativo CD4^{-}CD8^{-}) y CD4^{+} (simple positivo), y de una edad de 8 semanas /para la población DN). Se ha encontrado ahora, también, el hecho de que, en las dos edades, esta sub-población, produce poca IL-4, o nada en absoluto. Finalmente, los autores de la presente invención, han mostrado el hecho de que, esta doble anomalía numérica y funcional, se corrige in vitro e in vivo, mediante la IL-7, factor de crecimiento de esta sub-población celular y que, así, la IL-7, se encuentra en condiciones de proteger a los mamíferos de la diabetes, principalmente, de la diabetes mellitus insulinodependiente, puediéndose extender, esta propiedad, igualmente, a todas las enfermedades auto-inmunes, generadas por un defecto de producción de la IL-4, por las células Th2 y, principalmente, por la citada sub-población celular descrita anteriormente, arriba y, de una forma general a todas las enfermedades auto-inmunes, principalmente, aquéllas generadas por un defecto en la inmunorregulación mediante las células CD4^{+}.

Así, según uno de sus aspectos, la presente invención, tiene por objeto la utilización de la IL-7 o de linfocitos T, previamente incubados en presencia de IL-7 o modificados, produciendo la IL-7, para la preparación de medicamentos o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes, en particular, las enfermedades auto-inmunes generadas por un defecto en la inmunorregulación mediante las células T CD4^{+}.

Se prefieren, entre las citadas enfermedades auto-inmunes, las enfermedades auto-inmunes que se generan por un defecto de producción de la IL-4, mediante las células Th2.

Son particularmente preferidas, entre las citadas enfermedades auto-inmunes, las enfermedades auto-inmunes generadas por un defecto de producción de la IL-4, ligado a un déficit cuantitativo y funcional de sub-tipo de células T de fenotipo HSA^{-}, CD4^{+}CD8^{-} o CD4^{-}CD8^{-}, CD44^{+}, TCR-\alpha\beta^{+}, V\beta8^{+}, NK 1,1^{+}.

Entre las citadas enfermedades auto-inumunes, además de la diabetes mellitus insulinodependiente, pueden tratarse, de una forma preferente, mediante los citados medicamentos o composiciones, la encéfalo-miellitus auto-inmune, la artritis reumatoide auto-inmune, la poliartritis, las hepatitis auto-inmunes del tipo 2, la gastritis auto-inmune, la esclerosis auto-inmune, la sialoadenitis, la adrenalitis, la ooforitis, las glomerulonefritis, la tiroiditis auto-inmune, así como todo mecanismo patogénico de tipo auto-inmune, en la terapia asociada al tratamiento del SIDA.

De una forma preferible, la enfermedad autoinmune, es la diabetes mellitus insulinodependiente.

De una forma ventajosa, los linfocitos T previamente incubados en presencia de IL-7, utilizados en concordancia con la presente invención, son células autólogas o singénicos de las células de los pacientes a los cuales se destinan las composiciones que los comprenden.

La invención, comprende igualmente, composiciones farmacéuticas que ofrecen un nuevo enfoque o estudio para tratar enfermedades autoinmunes generadas por un defecto de producción de IL-4, por las células Th2, particularmente, las enfermedades auto-inmunes generadas por un defecto de producción de IL-4, ligado a un déficit cuantitativo y funcional de los sub-tipos de células T de fenotipo HSA^{-}, CD4^{+}CD8^{-} o CD4^{-}CD8^{-}, CD44^{+}, TCR-\alpha\beta^{+}, V\beta8^{+}, NK 1,1^{+} como, principalmente, la dibetes mellitus insulinodependiente.

Tales tipos de composiciones, comprenden, como principio activo, la IL-7, preferentemente, en forma soluble y / o lifoncitos T autólogos o singénicos de las células del paciente al cual se destina la composición farmacéutica, habiendo sido, los citados linfocitos T, previamente incubados en presencia de IL-7.

Éstas pueden igualmente presentarse en forma de asociaciones con otros principios activos, por ejemplo, otros agentes inmunomoduladores.

Estas diferentes composiciones, pueden administrarse en concordancia con diversas formas de administración, las cuales podrán ser determinadas por parte de la persona experta en este arte de la técnica, en función del tipo de composición concernida.

Las composiciones que comprenden IL-7, como principio activo, pueden por ejemplo administrarse por vía sistemática, de una forma preferente, por vía intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica, o por vía oral.

Las composiciones que comprende linfocitos T, como principio activo, se administran, de una forma preferente, por vía intravenosa o intraperitoneal.

Las formas de administración preferidas, así como las posologías y formas galénicas óptimas, pueden determinarse según los criterios generalmente tomados en cuenta en el establecimiento de un tratamiento terapéutico adaptado a un paciente como, por ejemplo, la edad y el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento, y los efectos secundarios constatados.

La presente invención, se refiere, igualmente, a un procedimiento de fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes, en particular, las enfermedades auto-inmunes generadas por un defecto en la inmunorregulación de las células T CD4^{+}, caracterizado por el hecho de que procede a mezclar IL-7 y / o linfocitos T autólogos o singénicos de las células del paciente al cual se destina la composición, habiendo sido, los citados linfocitos T, previamente incubados en presencia de IL-7, con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, eventualmente, en asociación con otros principios activos.

De una forma particular, la invención, se refiere a un procedimiento de fabricación de un medicamento o composición farmacéutica, para el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes generadas por un defecto de producción de IL-4 o las células Th2, muy en particular, las enfermedades auto-inmunes generadas por un defecto de producción de IL-4, ligado a un déficit cuantitativo y funcional de sub-tipo de células T de fenotipo HSA^{-}, CD4^{+}CD8^{-} o CD4^{-}CD8^{-}, CD44^{+}, TCR-\alpha\beta^{+}, V\beta8^{+}, NK 1,1^{+}, tales como, principalmente, la diabetes mellitus insulinodependiente.

La presente invención, se refiere a un procedimiento de tratamiento terapéutico caracterizado por el hecho de que se procede a administrar una dosis terapéutica eficaz de interleucina-7 o de linfocitos T, previamente incubados en presencia de IL-7, a una paciente afectado de una enfermedad auto-inmune, de una forma particular, una enfermedad autoinmune generada por un defecto en la inmunorregulación por las células T CD4^{+}.

De una forma ventajosa, el procedimiento según la presente invención, se aplica al tratamiento de la diabetes mellitus insulinodependiente.

La presente invención, se ilustra en las figuras 1 y 2, que se facilitan a continuación.

La figura 1, muestra el efecto corrector in vitro de IL-7, sobre la producción de IL-4 por células thymocites matures HSA^{-}CD8^{-} en el ratón NOD y C57BL/6 joven (figura 1 a) y adulto (figura 1 b).

En la experiencia presentada, los timocitos HSA^{-}CD8^{-} recientemente recogidos de los ratones NOD y C57BL/6 jóvenes (de una edad de 3 semanas) o adultos (de una edad de 8 semanas), se cultivan a 1,0 x 10^{5} células / hoyos con un anticuerpo monoclonal anti-TCR-\alpha\beta^{+}, en presencia (columna rellena con trazos) o en ausencia (columna vacía) de IL-7 a 1000 U/ml. El sobrenadante, se recoge, después de un transcurso de tiempo de 48 horas de incubación, y se dosifica en IL-4, mediante ELISA (media sobre 3 a 4 experiencias de los ensayos experimentales).

En la descripción que se facilita a continuación, aparecerán otras características y ventajas de la invención, a raíz de los ejemplos y las tablas que recopilan los resultados de los ensayos experimentales.

La figura 2, muestra el efecto del tratamiento de los ratones mediante IL-7, sobre la producción primaria de IL-4 mediante los esplenocitos.

En la experiencia presentada, los ratones de diferentes orígenes, de una edad 8 a 12 meses, recibieron inyecciones subcutáneas diarias de 2 \mug de IL-7 o de albúmina sérica bovina (excipiente), durante un transcurso de tiempo de 7 días consecutivos. El octavo día, los ratones, se trataron mediante el anticuerpo anti-CD3 y, a continuación, los esplenocitos, se cultivaron (5\cdot10^{6} células por pozo) y, la producción de IL-4, se midió mediante el test de ensayo CT.4S. Se procedió a calcular el porcentaje de aumento de la producción de IL-4, de la siguiente manera: ((cantidad de IL-4 producido después del tratamiento mediante el excipiente)-1) x 100. Los resultados, corresponden a una experiencia tipo. Las producciones de IL-4 (U/ml) por los esplenocitos de los ratones tratados mediante el excipiente, son respectivamente de 94,3; 53,5; 11,0 y 11,4, para los ratones NALB/c, C57BL/6, NOD y C57BL/6\betam^{-/-}.

Ejemplo 1 Estudio de la ontogenia de los timocitos CD44^{+}TCR-\alpha\beta^{+} en los ratones NOD, comparado con el ratón C57BL/6 no diabético

Se procedió a mantener ratones de crianza, y C57BL/6, hembras, en condicionesmedioambientales específicas de no patogenicidad. Todos los ratones NOD, se verificaron como no manifestando ningún signo evidente de diabetes (ni glicosuria ni hiperglicemia). Los timos (thymus), de aproximadamente 5 a 15 ratones exangües, se extraen con cuidado y, a continuación se mezclan. Los thymocytes matures doble negativos (DN) y CD4^{+} simples, positivos, se enriquecen, a continuación, mediante incubación, a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 40 minutos, con anticuerpos anti-CD8(3-155; IgM de la rata, descrita en J. Immunol., 1980, 125, 2665-2672), anti-HSA (J11d; IgM de la rata, Pharmigen) y anti-complemento (complemento del conejo Low Tox, Cederlane, Ontario, Canadá). Las células muertas, se eliminan, a continuación, por centrifugación, en gradiente de densidad (J. prep., Techgen, Les Ulis, France). Una citometría de flujo de los anticuerpos diferentes de los utilizados por la lisis celular, muestran el hecho de que, más del 95% de la células recuperadas, son de fenotipo HSA^{-} CD8^{-}.

El marcaje, se efectúa tal y como se describe en J. Exp. 1994, 180, 653-661. Los anticuerpos utilizados, se producen mediante hibridomas comercializados. Los anticuerpos anti-TCR-\alpha\beta (clon H57-597, Pharmigen) o anti\beta8V (clon F23,1, descrito en J. Inmunol. 143, 3994-4000) biotinilados o marcados a la fluoresceína (FITC), se utilizan combinados con anticuerpos anti-CD4 (clon RN 4,5, Pharmigen), marcado a la FITC.

Para el marcaje a 3 colores, las células, después de la incubación en presencia de los anticuerpos biotinilados, se incuban, a continuación, con anticuerpos monoclonales apropiadamente marcados con FITC y con PE, y conjugados con la streptavidina-Tricolor (Sav-Tri, Caltag).

El control de testigo de marcaje no específico, se efectúa en paralelo. El aparato utilizado, es un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). La extracción mínima de muestra, es aproximadamente igual a 1 x 10^{4} células viables.

La dosificación de la producción de la citocina, se efectúa a partir de las células en cultivo sobre medio, tal como se describe en J. of Immunolg. 1995, 155 (10), 4544 - 4550 y J. Exp. Med. 1944, 180, 653-661. Se procede a depositar aproximadamente 10^{5} células, por hoyo, en cúpulas de fondo redondo de microplaca de 96 hoyos (Nunc. Roskilde, Dinamarca), reproduciéndose, cada ensayo, un número de tres veces. Las cúpulas, se recubren con 10 \mug/ml de anticuerpos anti TCR-\alpha\beta (clon H57-597) y la células, se incuban, en un transcurso de tiempo de 48 horas, en presencia o ausencia de IL-7 a 1000 U/ml (Sanofi, Toulouse, Francia) para 200 \mul de volumen final por hoyo, el sobrenadante, se recoge a continuación, y se almacena, a una temperatura de -70ºC, antes de la dosificación de IL-4.

La dosificación de IL-4, se efectúa mediante el procedimiento ELISA tipo sándwich, tal y como se describe en J. of Immunol. 1995, 155 (10) 4544 - 4550.

Los resultados obtenidos, y que se ilustran mediante la tabla 1 que se facilita abajo, a continuación, muestran el hecho de que, la aparición de sub-población de timocitos de fenotipo TCR-\alpha\beta^{+} CD44^{+}, cuantificada entre las células THSA^{-}CD8^{-}, se retrasa, en los ratones observados, en la edad de 3 semanas.

TABLA 1

Especie	Edad (semanas)	% de CD 44^{+} TCR-\alpha\beta^{+} en la población
		de timocitos HSA^{-}CD8^{-}
C57Bl/6	3	*25,1 \pm 0,8
	8	27,9 \pm 10,1
NOD	3	12,3 \pm 0,3
	8	25,3 \pm 7,0

Los resultados, representan la media y la desviación típica obtenida sobre 4 a 5 experimentaciones independientes.

*p < 0,001 versus el ratón NOD de una edad de 3 semanas (test de ensayo de Student).

La tabla 2, que se presenta abajo, a continuación, representa los resultados obtenidos sobre poblaciones de timocitos doble negativos (CD4^{-}CD8^{-}) y CD4^{+}, en los ratones NOD y C57BL/6, de una edad de 8 a 10 semanas. El nivel de la sub-población CD44^{+} TCR-\alpha\beta^{+}, en el ratón NOD, permanece disminuido a 8 semanas, comparado con los ratones no afectados de la enfermedad auto-inmune.

TABLA 2

Especie	% de CD44^{+} TCR-\alpha\beta^{+}, en
	CD4^{+}	CD4^{-}CD8^{-}
NOD	23 \pm 8	34 \pm 1
C57BL/6	26 \pm 10	*59 \pm 7

Media y desviación tipo, obtenidas sobre 3 a 4 experimentaciones diferentes.

*p < 0,001 versus especie NOD (test de ensayo de Student).

Se ha verificado igualmente el hecho de que, las células de timocitos caracterizadas por el fenotipo HSA^{-} CD8^{-} C44^{+} presentan, realmente, la restricción del género V\beta8 mencionado anteriormente, más arriba.

Al mismo tiempo, se ha verificado el hecho (véase la figura 1) de que, las células timocitos HSA^{-} CD8^{-} C44^{+} en los ratones testigo, producían IL-4, en cantidad importante, cuando se estimulan mediante un anticuerpo monoclonal anti-TCR-\alpha\beta^{+}, mientras que, en el ratón NOD, esta producción, cae, de una forma dramática, a 3 y 8 semanas, incluso teniendo en cuenta el número reducido de células HSA^{-} CD8^{-} C44^{+} (tabla 1).

Ejemplo 2 Corrección in vivo mediante la IL-7 de déficit funcional de la sub-población de timocitos en el ratón NOD

Si bien se mostrado ya el hecho de que, la IL-7, induce de forma específica la proliferación de la subpoblación de timocitos HSA^{-} CD8^{-} C44^{+}DN (J. Esp. Med., 1994, 180, 653 - 661), los resultados obtenidos representados por la figura número 1, muestran, sorprendentemente, de una forma particular, el hecho de que, la producción de IL-4, dosificada sobre los timocitos, después de un transcurso de tiempo de 48 horas de incubación, en presencia de IL-7 y de un anticuerpo anti-TCR-\alpha\beta, vuelve a ser normal en el ratón NOD adulto (de una edad de 8 semanas), comparado con el ratón C57BL/6, de una edad equivalente.

Ejemplo 3 Experiencias in vivo, que muestran el efecto protector de la IL-7, sobre la aparición de la diabetes, en los ratones NOD

Las dos experiencias descritas a continuación, muestran el hecho de que, las células linfoides que proceden de la glándula tímica del ratón NOD de una edad de 3 semanas, pueden proteger contra la aparición de la diabetes, en un modelo de cotransferencia. Precisamente, 50 millones de timocitos totales de ratones de 3 semanas de edad, inyectados simultáneamente con 5 a 10 millones de células esplénicas de ratones NOD diabéticos, a receptores NOD irradiados de 10 semanas, impiden la aparición de la diabetes normalmente observada cuando las células esplénicas se inyectan solas. La inyección de menos de 10 millones de timocitos, no tiene este aspecto protector. Mientras tanto, cuando los timocitos se han incubado previamente in vitro, en presencia de IL-7, durante un transcurso de tiempo de 60 horas, a una temperatura de 37ºC, un millón de timocitos, aseguran la protección en el modelo de co-tranferencia que se describe anteriormente arriba.

Además, se conoce el hecho de que, la inyección de cilofosfamida (200 mng/kg), provoca la aparición de una diabetes en los ratones NOD de 8 semanas de edad, con un retraso (de 10 a 20 días), con respecto al de la aparición espontánea de la dibetes (de 2 a 4 meses). Un tratamiento in vivo, mediante IL-7, consistente en 2 inyecciones de IL-7, administradas la víspera y al día siguiente de la inyección de ciclofosfamida, protege contra la aparición de la diabetes inducida por la ciclofosfamida.

Estas dos series de experiencias, indican el hecho de que, la IL-7, tiene un rol interpretativo protector, contra la aparición de una diabetes en los ratones genéticamente predispuestos.

3.1 Protección de la diabetes mediante timocitos incubados en presencia de interleucina-7, en uno modelo de co-tranferencia

Se procedió a preparar timocitos, a partir de un timo (thymus) de ratones NOD, hembras, de una edad de 3 semanas. Estos timocitos, se incubaron in vitro, durante un transcurso de tiempo comprendido dentro de unos márgenes de 60 a 72 horas, a una temperatura de 37ºC, en un medio RPMI que contenía un 10% de suero de ternero fetal, y al que se le había adicionado (500-100 U/ml). Al término de esta incubación, se inyectaron, simultáneamente, 4, 2 ó 1 millon(es) de estos timocitos y 5 ó 10 millones de células esplénicas de ratones NOD, convertidos recientemente en diabético, a ratones NOD, machos, de una edad de 10 semanas, irradiados mediante una dosificación de 700 rad. La aparición de la diabetes, se siguió tres veces por semana, mediante la búsqueda de una glicosuria, y se confirmó cuando se observó la glicosuira, mediante la evidenciación por mediación de un hiperglicemia.

Los resultados que se indican en la tabla 3, la cual se facilita a continuación, muestran el hecho de que, los timocitos incubados en presencia de IL-7, protegen contra la diabetes, a dosis que no son protectoras cuando se utilizan timocitos no incubados en presencia de IL-7.

TABLA 3 Efecto protector de los timocitos totales tratados con IL-7, en un modelo de diabetes inducido por transferencia pasiva de células procedentes de ratones diabéticos

1

NT: no sometido a test de ensayo

3.2 Protección contra la diabetes inducida por una inyección de ciclofosfamida mediante inyecciones de interleucina-7

Se procedió a tratar ratones NOD, hembras, de una edad de 6 a 7 semanas, de tal forma que éstos recibieran una inyección de 200 mg/kg de ciclofosfamida, encuadrada en los días -1 y +1, por una inyección intravenosa de 1 \mug de IL-7, mediante una inyección intravenosa de 1 \mug de IL-7. La aparición de una diabetes, se detecta mediante la búsqueda de una glicousuria y de una hiperglicemia, según las modalidades indicadas en el ejemplo 1.

Los resultados que se muestran el la figura 4, indican el hecho de que, el tratamiento mediante IL-7, previene significativamente la aparición de la diabetes, con relación a los ratones que han recibido ciclofosfamida sin IL-7.

TABLA 4 Efecto protector de IL-7 en el modelo de diabetes inducido por la ciclofosfamida

Tratamiento	Número de ratones	Número de ratones diabéticos después
		haber seguido 2 semanas la inyección
		de ciclofosfamida
-	10	8
IL-7	10	2

El conjunto de estos resultados, muestra el hecho de que, los ratones NOD, presentan, de una forma precoz, un déficit de una sub-población de células timocitarias HSA^{-}CD8TCR-\alpha\beta^{+}, que expresan el marcador CD44, con la restricción V\beta8, y que tienen la capacidad de producir IL-4 (denominadas células TNK1^{+}, recientemente identificada en las cepas no-autoinmunes). Este régimen numérico, se asocia, de una forma sorprendente, a un déficit funcional expresado por una reducción importante de la producción de IL-4.

Los resultados, indican el hecho de que, la anomalía de este déficit, en los ratones NOD, que tocan a la vez las sub-poblaciones de timocitos CD4^{-}CD8^{-} (DN) y CD4^{+} (simple positivo), se corrige in vivo mediante la utilización de la IL-7.

Por otra parte, las experiencias llevadas a cabo in vivo, bien ya sea mediante la inyección de células previamente incubadas, en presencia de IL-7, o bien ya sea mediante la inyección directa de una cantidad eficaz de IL-7, en los ratones, muestran el hecho de que, la utilización de la IL-7, tiene un efecto protector contra el desencadenamiento de la enfermedad auto-inmune como, en particular, la diabetes.

Ejemplo 4

El tratamiento in vivo mediante la IL-7, potencializa la producción de la IL-7, mediante las células T esplénicas (figura 2). Este efecto de la IL-7, se obtiene, en el conjunto de las cepas de ratones sometidas a tests de ensayo (C57BL/6, BALB/6, BALB/C, NOD), y éste es máximo en el ratón autoinmune NOD, que presenta un déficitt de producción de IL-4, en la periferia (leyenda de la figura 2). La ausencia del aumento de la producción de IL-4 en los ratones C57BL//6 desprovistos del gen de la \beta2-microglobulina, y por lo tanto, deficientes en células T NK1^{+}, sugiere el hecho de que, la acción de la IL-7, se centraliza, como diana, en las células TNK1^{+}.

El protocolo de inyección de la IL-7, por vía subcutánea, comprende dos dosis de 2 \mug, por día, durante un transcurso de tiempo de 4 a 7 días consecutivos. Se procede a tratar ratones de control, mediante un volumen idéntico de solución de excipiente (albúmina de suero bovino). La producción de IL-4, aumenta, después de una única inyección (1,33 \mug), por vía intravenosa de un anticuerpo dirigido específicamente contra la molécula CD3 murina (anti-CD3, clon 145-2C11, IgG de hamster). Los animales, se sacrifican 90 minutos después de la inyección de anticuerpos anti-CD3; se toman a continuación muestras de las ratas y, las células esplénicas, se ponen en cultivo durante un transcurso de tiempo de 90 minutos, en ausencia de toda estimulación (Yoshimoto y colegas, J. Exp. Med. 179, 1285-1295). El medio RPMI que contiene suero de ternero fecal descomplementado (10%), \beta-mercaptoetanol (0,05 mM) y antibióticos, (penicilina 100 Ul/ml y estroptomicina (100 \mug/ml) se utiliza, para el conjunto de las experiencias de cultivo celular. Los sobrenadantes, se recogen y, su contenido en IL-4, se determina mediante test de ensayo biológico CT 4S, una línea dependiente de la IL-4 (HuLi y colegas., J. Immunol. 142, 800-807). La concentración de IL-4, se expresa en U/ml (una unidad, corresponde, aproximadamente, a 1 pg), según una curva estándar establecida con las diluciones seriadas de IL-4 recombinante murino. El límite de sensibilidad del test de ensayo, es de aproximadamente 10 U/ml.

La ausencia de producción de la IL-4 en la periferia, mediante células T NK1^{+}, en el ratón NOD, podría explicar el déficit de la función Th2 que se acompaña de la emergencia de células diabetógenas del tipo Th1, responsables de la enfermedad autoinmune en esta cepa.

Estos resultados, los cuales constituyen la demostración de los principios de un efecto in vivo farmacológico de la IL-7, sobre la producción de IL-4, mediante las células TNK1^{+}, abren las perspectivas sobre el rol interpretativo protector de la IL-7, con respecto a la aparición de la diabetes auto-inmune. De una forma más general, estos datos experimentales, permiten el proponer la utilización de IL-7 como arma terapéutica de desviación de la respuesta inmune a favor de un perfil de tipo Th2.

Claims

1. Utilización de la interleucina-7 o de linfocitos T, previamente incubados en presencia de IL-7, para la preparación de un medicamento o de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

2. Utilización, según la reivindicación 1, generándose, la citada enfermedad autoinmune, por un defecto de producción de IL-4, por las células Th2.

3. Utilización, según la reivindicación 1 ó 2, generándose, la citada enfermedad autoinmune, por un defecto de producción de IL-4, ligado a un déficit cuantitativo y funcional de células T de los subtipos HSA^{-}, CD4^{+}CD8^{-} o CD4^{-}CD8^{-}, CD44^{+}, TCR-\alpha\beta^{+}, V\beta8^{+}, NK 1,1^{+}.

4. Utilización, según la reivindicación 1, 2 ó 3, eligiéndose, la citada enfermedad auto-inmune, entre la diabetes mellitus insulinodependiente, la encéfalo-mielitis autoinmune, la artritis reumatoide auto-inmune, la poliartritis, las hepatitis auto-inmunes del tipo 2, la gastritis auto-inmune, la esclerosis auto-inmune, la sialoadenitis, la adrenalitis, la ooforitis, las glomerulonefritis, la tiroiditis auto-inmune, y los mecanismos patogénicos de tipo auto-inmune, en una terapia asociada al tratamiento del SIDA.

5. Utilización, según la reivindicación 1, 2, ó 3, siendo, la citada enfermedad autoinmune, diabetes mellitus insulinodependiente.

6. Utilización, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, siendo, los citados linfocitos T, células autólogas o singénicos de células del paciente al cual se destina la composición farmacéutica.

7. Procedimiento de fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades auto-inmunes, que comprende la mezcla de los linfocitos T autólogos o singénicos de las células del paciente al cual se destina la composición, habiéndose incubado previamente, los citados linfocitos T, en presencia de IL-T, con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, eventualmente, en asociación con otros principios activos.

8. Procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un enfermedad auto-inmune según la reivindicación 7, generándose, la citada enfermedad auto-inmune, por un defecto de producción de IL-4, por las células Th2.

9. Procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un enfermedad autoinmune según la reivindicación 7 u 8, generándose, la citada enfermedad auto-inmune, por un defecto de producción de IL-4, ligado a un déficit cuantitativo y funcional de células T, de los tipos HSA^{-}, CD4^{+}CD8^{-} o CD4^{-}CD8^{-}, CD44^{+}, TCR-\alpha\beta^{+}, V\beta\beta^{+}, NK 1,1^{+}.

10. Procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad auto-inmune, según la reivindicación 7, 8 ó 9, siendo, la citada enfermedad auto-inmune, la diabetes mellitus insulinodependiente.