ES2215132T3 - Substrato de lana mineral destinado para plantas. - Google Patents
Substrato de lana mineral destinado para plantas.Info
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Abstract
Substrato de lana mineral para plantas consistente en lana mineral y, unida a la lana mineral, una bacteria productora de un derivado de fenazina que tiene actividad fungicida, donde la bacteria está genéticamente modificada de tal forma que contiene múltiples copias de los genes phzR y phzI, dando lugar a una superproducción del derivado de fenazina.
Description
Substrato de lana mineral destinado para
plantas.
La presente invención se relaciona con un
substrato de lana mineral para plantas, más concretamente con un
substrato de lana mineral para plantas consistente en un material o
materiales extraños para mejorar las propiedades del substrato de
lana mineral para la protección de cultivos y/o para mejorar el
rendimiento de las plantas.
Como lana mineral hay que entender lana de
vidrio, lana de piedra, lana de roca, fibras vítreas hechas por el
hombre, lana de escorias y/o sus mezclas.
Los substratos de lana mineral para plantas para
el crecimiento de las plantas son bien conocidos en la técnica y
pueden consistir en una matriz coherente de lana mineral y pueden
estar en forma laxa o granular. Se prefieren los substratos de lana
mineral consistentes en una matriz de lana mineral.
En caso de desear un substrato de lana mineral
consistente en una matriz coherente de lana mineral, dicha matriz
coherente se forma recogiendo una capa de fibras de lana mineral
provistas de un ligante curable, de tal forma que, después del
curado, las fibras de lana mineral son substancialmente no
desplazables las unas con respecto a las otras. Si se requiere para
la rápida captación de agua, esta matriz coherente de lana mineral
puede estar provista de un agente humectante.
Las fibras pueden tener un diámetro medio de 1 a
10 \mum. Para la lana de roca, el diámetro de las fibras tiene una
media de aproximadamente 4 \mum.
La densidad de la matriz coherente de lana
mineral puede ser de entre 10 y 200 kg/m^{3}, en general de entre
40 y 80 kg/m^{3}.
Dicha matriz coherente de lana mineral tiene una
propiedad de retención de forma, que es inherente debido a los
materiales de partida inorgánicos empleados. Más aún, la capacidad
de retención de agua de estos substratos de lana mineral para
plantas es muy controlable y predecible.
Los cultivadores, al utilizar substratos de lana
mineral para plantas, tendrán que aplicar pesticidas si se han
observado síntomas de enfermedad. Un problema es que son necesarias
observaciones continuas y que a veces la aplicación de pesticida se
realiza demasiado tarde.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un substrato de lana mineral para plantas mejorado que
intenta resolver este problema.
Según la invención, se facilita un substrato de
lana mineral para plantas según la reivindicación 1.
El aditivo biológicamente activo puede ser
cualquier substancia con acción frente a hongos patógenos, que tenga
un efecto favorable sobre las plantas proporcionando mejores
condiciones de crecimiento o combatiendo enfermedades causadas por
hongos. El aditivo biológicamente activo puede ser una substancia
natural o sintética.
Entre el grupo de substancias con acción frente a
hongos patógenos que comprende una gran variedad de diferentes
especies, se prefieren las fenazinas en particular. Muchos derivados
de fenazina y síntesis son conocidos. Muchas fenazinas tienen
actividad antibiótica, y especialmente actividad antifúngica. Por
ejemplo, la fenazina-1-carboxamida
(PCN) muestra un fuerte efecto inhibidor del crecimiento sobre
muchos hongos fitopatógenos, incluidos Fusarium, Rhizoctonia,
Pythium, Botrytis, Verticillium y Alternaria, y sobre
algunas bacterias, especialmente bacterias
gram-positivas.
Por ejemplo, la
fenazina-1-carboxamida controla
eficientemente la podredumbre del pie y de la raíz del tomate
causada por Fusarium oxysporum f. sp. racicis
lycopersici. La
fenazina-1-carboxamida tiene un
fuerte efecto inhibidor del crecimiento en un amplio rango de pH,
estudiado entre un pH de 3,1 y de 7,0. La PCN controla también
eficientemente la muerte por exceso de humedad después y antes de la
emergencia (por ejemplo del tomate) causada por Pythium.
En otro aspecto de la invención, el substrato de
lana mineral para plantas contiene, unido a la lana mineral, un
microorganismo productor de un aditivo biológicamente activo como se
ha definido antes.
En particular, el microorganismo es una bacteria
productora de un fungicida. Una pluralidad de especies de bacteria
producen substancias fungicidas. Son ejemplos ilustrativos
Pseudomonas spp., Streptomyces spp.,
Microbispora spp., Brevibacterium spp.,
Streptosporangium spp., Sorangium spp, etc. La
actividad fungicida se debe a la producción de diversos compuestos,
incluyendo derivados de fenazina. Preferiblemente, se selecciona un
microorganismo que tiene buenas propiedades de colonización de las
raíces y/o buenas propiedades de colonización de la lana mineral.
Los inventores han visto que la colonización de las raíces y la
colonización de la lana mineral juegan un papel importante en el
biocontrol, presumiblemente aportando un sistema de administración
para compuestos antifúngicos. Más aún, un microorganismo que muestre
buenas propiedades de colonización de las raíces y/o buenas
propiedades de colonización de la lana mineral se adherirá y
permanecerá en las raíces cuando se transfieren las plantas a
substratos frescos.
Un microorganismo que controla muy eficientemente
enfermedades fúngicas y bacterianas es Pseudomonas
chlororaphis PCL1391. La actividad antifúngica parece ser debida
a la producción de diversos compuestos, de los cuales la
fenazina-1-carboxamida es el más
importante. La cepa de P. chlororaphis PCL1391 fue depositada
bajo el Nº CBS 102790 el 16 de Mayo de 2000 en el Centraalbureau
Schimmelcultures de Baarn, NL.
PCL1391 parecía ser un colonizador eficaz de las
raíces del tomate y una excelente cepa de biocontrol en un sistema
de ensayo F. oxysporum/tomate.
En otro aspecto, los inventores han hallado
modificaciones genéticas de P. chlororaphis PCL1391 que
resultan en la superproducción de
fenazina-1-carboxamida. En
consecuencia, dichos P. chlororaphis PCL1391 genéticamente
transformados son preferiblemente usados en la presente
invención.
a. La producción de
fenazina-1-carboxamida en P.
chlororaphis PCL1391 está bajo el control de un quórum de
sensibilidad, en donde las acil homoserina lactonas (AHL) tienen un
papel esencial como moléculas inductoras. El operón biosintético de
la fenazina (phz) consiste en varios genes biosintéticos de
la fenazina (phzA, phzB, etc.) y genes reguladores
(phzR y phzI). Se ha visto que múltiples copias de los
genes phzR y phzI, que dan lugar a la superproducción
de AHL, resultan en una superproducción tres veces mayor de
fenazina-1-carboxamida. Se contempla
que, también en general, las bacterias pueden ser genéticamente
modificadas de tal forma que contengan múltiples copias de genes
phzR y phzI, dando lugar a una superproducción de
antibiótico.
b. También una mutación en el gen lexA de
PCL1391 da lugar a la superproducción de AHL y causa una
superproducción diez veces mayor de
fenazina-1-carboxamida por PCL1391.
El gen lexA de PCL1391 es un gen que es homólogo del gen
lexA de P. aeruginosa. Los inventores son los primeros
en descubrir que LexA está involucrado en la regulación de la
producción de antibiótico.
Cuando se usa el substrato de la invención en
donde P. chlororaphis PCL1391 está unido a la lana mineral,
la producción de PCN puede aumentar empleando las siguientes
condiciones:
- -
- crecimiento bajo poco oxígeno,
- -
- presencia de glicerol, fructosa, ribosa o ácido cítrico en el medio nutritivo y
- -
- presencia de diversos minerales (Cu^{2+}, Zn^{2+}, Fe^{3+}) en el medio nutritivo.
Evidentemente, estos factores aumentan la
expresión de los genes biosintéticos de la PCN.
Esta invención también contempla la
superproducción de derivados de fenazina empleando una combinación
de dos o más de las medidas anteriores, es decir, múltiples copias
de los genes phzR y phzI, mutación del gen lexA
y condiciones del medio nutritivo.
Los substratos de lana mineral para plantas son
generalmente producidos curando fibras de lana mineral provistas de
un ligante curable, dando lugar a una matriz coherente de lana
mineral. El substrato de lana mineral para plantas de la invención
consistente en una matriz coherente de lana mineral puede ser
producido por varios métodos.
Una vez producido el substrato de lana mineral
para plantas consistente en una matriz coherente de lana mineral,
dicho substrato puede ser granulado. Según la invención, también se
puede usar un substrato de lana mineral para plantas donde la lana
mineral está en forma granular.
Además, otros substratos de lana mineral para
plantas que pueden ser usados según la invención son substratos de
lana mineral que no consisten en una matriz coherente de lana
mineral. En tal caso, no se usa un ligante curable en la producción
del substrato de lana mineral para plantas. Dichos substratos puede
estar en forma laxa o granular.
En un aspecto de la invención, se añade el
aditivo biológicamente activo o el microorganismo productor de dicho
aditivo directamente durante la producción del substrato de lana
mineral.
En consecuencia, la invención proporciona además
un procedimiento para producir un substrato de lana mineral para
plantas de la invención, donde se añade el aditivo o el
microorganismo producto de dicho aditivo al substrato de lana
mineral para plantas durante la producción de dicho substrato.
En una realización preferida, se mezcla el
aditivo o el microorganismo productor de dicho aditivo con fibras de
lana mineral y un ligante curable para formar una mezcla y se cura
dicha mezcla para formar una matriz coherente.
En dicha realización, el microorganismo debe ser
termorresistente en cierto grado, dependiendo de la temperatura real
de curado y del tiempo de curado empleados. Cuando más alta sea
dicha temperatura de curado y mayor sea dicho tiempo de curado, más
termorresistente debe ser el microorganismo. En una preparación
particular del substrato de lana mineral para plantas de la
invención, el microorganismo debe sobrevivir, por ejemplo, 2 minutos
a 230ºC máximo.
Se conocen microorganismos termorresistentes
tales como los descritos anteriormente por la técnica anterior
[véase J.W. Kloepper, 1993, "Plant growth promoting rhizobacteria
as biological control agents", en "Soil Microbial Ecology -
Applications in Agricultural and Environmental Management", ed.
F.B. Metting, Jr., pp. 255-274 (Marcel Dekker, Inc.,
New York), y General Microbiology, 1995, de R.Y. Stanier, M.
Doudoroff y E.A. Adelberg, Macmillan Student Editions].
Además de la elección de una especie específica
de microorganismo que tenga un cierto grado de termorresistencia, se
ha de elegir la forma de ciclo vital del microorganismo. Por
ejemplo, las microesporas o las bacterias desecadas tienen una
termorresistencia significativa mayor que la de otras formas de
ciclos vitales.
En otro aspecto de la invención, se añade el
aditivo o el microorganismo productor de dicho aditivo a un
substrato de lana mineral para plantas acabado, por lo tanto después
de la producción del substrato de lana mineral.
En consecuencia, la invención proporciona también
un procedimiento para producir un substrato de lana mineral para
plantas de la invención, donde se añade el aditivo o el
microorganismo productor de dicho aditivo a un substrato de lana
mineral para plantas acabado.
Dicho substrato de lana mineral para plantas
acabado puede ser un substrato de lana mineral curado consistente en
una matriz coherente de lana mineral, que se granula o no, o puede
ser un substrato de lana mineral que no consiste en una matriz
coherente de lana mineral y que está en forma laxa o granular.
En caso de que se añada el aditivo o el
microorganismo productor de dicho aditivo al substrato de lana
mineral para plantas durante la producción de dicho substrato, hay
que tomar varias cosas en consideración.
Una de ellas se relaciona con el período entre la
producción del substrato de lana mineral para plantas, durante cuya
producción se añade el microorganismo, y el uso real del substrato
de lana mineral para plantas en crecimiento. Durante dicho período,
el substrato de lana mineral puede, por ejemplo, tener que ser
almacenado y transportado. Por ejemplo, el microorganismo dentro del
substrato de lana mineral para plantas necesita sobrevivir durante
un período de seis semanas tras la producción de dicho substrato,
cuyo período cubre un período de tiempo convencional de
almacenamiento y transporte.
Dicha supervivencia depende del tipo de forma de
ciclo vital del microorganismo y/o de la presencia de cualquier
fuente nutriente en el substrato de lana mineral y/o de cualquier
desecación posible en el substrato de lana mineral.
Por ejemplo, cuando se usan microesporas o
bacterias desecadas, dichos microorganismos pueden sobrevivir
durante más tiempo sin ninguna fuente nutriente que microorganismos
que están presentes en otras formas de ciclos vitales. Otro ejemplo
es un microorganismo que es capaz de soportar períodos relativamente
largos de desecación.
Eventualmente, se puede añadir una fuente
nutriente al substrato de lana mineral durante la producción de
dicho substrato, es decir, junto al propio microorganismo. Por
ejemplo, dicha fuente puede ser una mezcla consistente en material
inorgánico así como orgánico y que contiene el microorganismo que se
ha de añadir.
Dicha mezcla debe servir a varios propósitos.
Primero de todo, dicha mezcla funciona como reservorio de alimento
para el microorganismo, debido a la presencia de material
orgánico.
Además, dicha mezcla funciona como un buen
hábitat para el microorganismo. Se dispone de un buen hábitat para
microorganismos en materiales que contienen poroso con un tamaño
medio de 6 \mum o menos. Se obtienen condiciones muy buenas cuando
los poros son menores de 3 veces el tamaño de los microorganismos,
pero aún mayores que los organismos. La arcilla (tal como bentonita)
es un ejemplo de material que contiene un tamaño medio de poro <
6 \mum. La porosidad y el tamaño medio de poro de la arcilla no
son estáticos, sino que fluctúan considerablemente debido al
comportamiento de hinchamiento y encogimiento de la arcilla, que
está influido, entre otras cosas, por el nivel de pH, el nivel de EC
y el contenido acuoso.
Aún más, dicha mezcla funciona como escudo
térmico para el microorganismo. Esto es especialmente ventajoso en
caso de que se produzca un substrato de lana mineral consistente en
una matriz coherente de lana mineral, en el sentido de que se reduce
la influencia de la temperatura de curado normalmente alta usada en
la producción de dicho substrato sobre el microorganismo.
Un ejemplo de una mezcla que cumple con los fines
antes mencionados es una mezcla de elementos de arcilla (tal como
bentonita) consistentes en un material inorgánico y orgánico y que
incluyen el microorganismo. El Solicitante ha visto que dichos
elementos arcillosos, añadidos a una mezcla de fibras de lana
mineral y un ligante curable antes de curar estas fibras, alcanzan
temperaturas máximas durante el curado menores que la matriz de lana
mineral que se forma tras dicho curado. De este modo, el
microorganismo contenido en los elementos arcillosos queda protegido
frente a la temperatura de curado relativamente alta en gran
medida.
Además, las cápsulas farmacéuticas e
hidrosolubles pueden actuar como hábitat transitorio para
microorganismos durante la producción del substrato de lana mineral
para plantas.
Dependiendo de la forma de ciclo vital del
microorganismo (por ejemplo, microesporas o bacterias desecadas), el
microorganismo puede tener que ser activado/germinado después de la
instalación del substrato de lana mineral en una localización de
cultivo. Se puede conseguir dicha activación por la humectación
inicial normal.
Habiendo activado el microorganismo, la nutrición
para el microorganismo debe estar disponible para soportar sus
procesos normales, hasta que el material orgánico derivado de la
raíz pueda actuar como fuente nutriente para el microorganismo.
Durante el período en el que no hay suficiente material orgánico
derivado de la raíz, se debe añadir una fuente nutriente. Sin
embargo, también es posible que, en caso de haber añadido una fuente
nutriente al substrato de lana mineral durante la producción de
dicho substrato, dicha fuente nutriente funcione como fuente
nutriente durante el período que comienza inmediatamente después de
la activación del microorganismo.
Cuando, al añadir un microorganismo productor de
un aditivo biológicamente activo con acción frente a hongos
patógenos a un substrato de lana mineral para plantas, ya sea
durante la producción de dicho substrato o después, se toman una o
más de las medidas anteriores, se puede preparar un substrato de
lana mineral para plantas de la invención en el que el
microorganismo se une a la lana mineral de un modo adecuado para ser
usado para combatir hongos patógenos cuando se usa dicho substrato
de lana mineral para el cultivo de plantas.
En este ejemplo, se añadió Pseudomonas
chlororaphis PCL1391 a un substrato de lana de roca para plantas
acabado (es decir, curado) consistente en una matriz coherente de
lana de roca (en adelante se hará aquí referencia a él como
"substrato de lana de roca Nº 1") y a un substrato de lana de
roca que era idéntico al substrato de lana de roca Nº 1, pero que
había sido granulado (en adelante, se hará aquí referencia a él como
"substrato de lana de roca Nº 2"), estando descritos ambos
tipos de substratos de lana de roca en la descripción que antecede a
este Ejemplo.
Los objetivos de este Ejemplo son determinar la
colonización por Pseudomonas chlororaphis PCL1391 del sistema
de la raíz de una planta de pepino y de los substratos de lana de
roca Nº 1 y Nº 2 y determinar la producción de
fenazina-1-carboxamida por P.
chlororaphis PCL1391 en los substratos de lana de roca Nº 1 y Nº
2.
P. chlororaphis PCL1391 fue aislado del
sistema de la raíz de plantas de tomate cultivadas en un campo
comercial en Andalucía, España. La cepa protege a las plantas del
tomate frente a la podredumbre del pie y de la raíz causada por
Fusarium oxysporum f.sp.
radicis-lycopersici. La cepa también inhibe
el crecimiento de otros patógenos de plantas, incluyendo
Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea y
Gaeumannomyces graminis. El compuesto antifúngico responsable
de la actividad antifúngica fue identificado como
fenazina-1-carboxamida.
Se usó la cepa de tipo salvaje P.
chlororaphis PCL1391 para inoculación de la solución nutriente
de los pepinos. La producción del compuesto antifúngico
fenazina-1-carboxamida permite a
esta cepa inhibir el crecimiento de una serie de hongos patógenos de
plantas. Para poder hacer un seguimiento de esta cepa en el sistema
de la raíz y en la solución nutriente, también se usó PCL1392.
PCL1392 es derivado aleatorio marcado con el transposón
Tn5lacZ de la PCL1391 de tipo salvaje con expresión
lacZ constitutiva [véase R. Simon y col., "A broad host
range mobilization system for in vivo genetic engineering:
transposon mutagenesis in Gram negative bacteria", Biotechnology,
1983, 1: 784-791, y T.F.C.
Chin-A-Woeng y col., "Root
colonization by
phenazine-1-carboxamide-producing
bacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is
essential for biocontrol of tomato foot and root rot", Mol.
Plant-Microbe Interact., 2000, 13:
1340-1345].
Se preparó la solución nutritiva para el
crecimiento del pepino según un protocolo proporcionado por
Rockwool/Grodan. En la Tabla A se da la composición de dicha
solución nutritiva. Los valores conseguidos en el ambiente de la
raíz usando esta solución nutritiva también son mostrados en la
Tabla A. Se obtuvieron semillas de pepino Euphoria RZ de
Rockwool/Grodan. Las semillas de tomate cv. Carmello eran de
Novartis Seeds B.V.
Los experimentos iniciales fueron realizados
tanto en substrato de lana de roca Nº 1 como en substrato de lana de
roca Nº 2.
Se sembró una semilla de pepino por maceta y se
cubrieron las macetas con una capa de vermiculita. Se puso el
montaje en un recipiente de crecimiento y se hizo crecer a los
plantones a 23ºC en una cámara de crecimiento (humedad relativa del
70%, ciclo día/noche de 16/8 horas) durante 12-14
días.
Se añadieron bacterias a la solución nutriente de
los pepinos a una concentración final de 2 x 10^{6} UFC/ml. Se usó
luego la solución para humedecer el substrato de lana de roca. Se
regaron las plantas desde el fondo.
Se determinaron los recuentos bacterianos por
plaqueo de diluciones en medio B de King y se expresaron en log de
unidades formadoras de colonias/ml (log_{10} UFC/ml). Se
determinaron los recuentos bacterianos en el sistema de la raíz
tomando partes de raíces de 1 cm, agitándolas en 1,0 ml de solución
salina tamponada con fosfatos ("PBS") usando un agitador
Eppendorf, seguido de plaqueo de diluciones. Los recuentos de la
raíz son expresados en log_{10} UFC/cm de raíz.
Se extrajo
fenazina-1-carboxamida del substrato
de lana de roca y de la solución nutriente con un volumen de tolueno
como solución nutriente. Se eliminó la fase toluénica por
evaporación y se disolvió el residuo en 2 ml de acetonitrilo al 50%.
Se analizó un volumen de 50 \mul de la muestra usando HPLC.
Tanto el pepino como el tomate crecieron bien en
el montaje experimental antes descrito.
La raíz principal puede ser aislada
razonablemente intacta del substrato de lana de roca Nº 1 o del
substrato de lana de roca Nº 2. Esto hizo posible determinar el
número de bacterias presentes en diversas partes de la raíz
principal.
Como comparación, los plantones de tomate no
crecieron de manera óptima en el montaje actual y el sistema de la
raíz no pudo ser extraído para su examen, ya que era demasiado
frágil.
Dado que el montaje experimental no es un sistema
axénico, no era sorprendente que se observara contaminación con
otras bacterias después del plaqueo de diluciones de secciones de
raíz o de solución nutriente. Para discriminar PCL1391 de la
bacteria residente PCL1392, se usó un derivado marcado con
Tn5lagZ de PCL1391 para monitorizar los experimentos.
Para estudiar la distribución de bacterias en el
sistema de la raíz del pepino y la solución nutriente, se tomaron
secciones de raíz de 1 cm en la base de la raíz media, a la mitad de
la raíz, y la punta de la raíz de los plantones de pepino y se
determinó el recuento bacteriano. También se tomaron muestras de la
solución nutriente después del crecimiento (véase la Tabla B).
| Parte de la raíz | Recuento bacteriano |
| (Nº de plantas estudiadas = 8) | |
| Base | 6,6 \pm 0,32 log_{10} UFC/cm |
| Mitad | 6,4 \pm 0,46 log_{10} UFC/cm |
| Punta | 6,1 \pm 0,80 log_{10} UFC/cm |
| Solución nutriente | 6,1 log_{10} UFC/ml |
| (Nº de soluciones estudiadas = 2) |
No hay aumento significativo en los recuentos
bacterianos en el sistema de la raíz cuando se inocula el sistema
por segunda vez (con el mismo número de bacterias en 500 ml de
solución nutriente) después de una semana de crecimiento.
Se evaluó el crecimiento de los plantones de
pepino determinando la masa vegetal de los plantones sin el sistema
de la raíz. Después de 14 días, la biomasa media de un plantón
crecido en solución nutriente no inoculada era de 0,73 \pm 0,15 g
y la de un plantón crecido en presencia de la cepa PCL1392 de 1,04
\pm 0,24 g (Nº de plantas estudiadas
= 30).
= 30).
El análisis de HPLC de los extractos toluénicos
de la solución nutriente y de los substratos de lana de roca Nº 1 y
Nº 2, cuyos substratos contenían el sistema de la raíz de un plantón
de pepino (número total de plantones de pepino estudiados = 40),
mostró un compuesto que eluía con un tiempo de retención de
aproximadamente 16 minutos (véase la Fig. 11A). El espectro y el
tiempo de retención de este compuesto (Fig. 11B) eran idénticos a
los de la fenazina-1-carboxamida
estándar (véase la Fig. 11C). Ambos espectros muestran máximas de
absorción a 251 y 370 nm, que son características de la
fenazina-1-carboxamida (véase
"High performance liquid chromatographic analysis of
Pseudomonas aeruginosa phenotiazines". J. Chromatogr.
A., R.O. Fernández y R.A. Pizarro, 1977, 771
(1-2): 99-104).
Los datos anteriores muestran que el compuesto en
la solución nutriente y en la lana de roca de los substratos de lana
de roca Nº 1 y Nº 2 es ciertamente
fenazina-1-carboxamida.
La cantidad de
fenazina-1-carboxamida producida fue
cuantificada usando una curva de calibración representada a partir
de concentraciones conocidas de
fenazina-1-carboxamida. La cantidad
que se calcula se produce en la solución nutriente en la que se
cultivaron los plantones de pepino era de 0,2 mg/l. El análisis por
HPLC de los extractos de un experimento control no inoculado no
indicó la presencia de
fenazina-1-carboxamida.
El número de bacterias P. chlororaphis
PCL1391 (PCL1392) en los substratos de lana de roca Nº 1 y Nº 2
permanece estable al menos hasta 14 días después de la inoculación
(no se usaron mayores períodos de estudio en el Ejemplo).
El sistema de la raíz, incluyendo partes de la
raíz de crecimiento reciente, de las plantas estudiadas es bien
colonizado por dichas bacterias y la mayor parte de las bacterias
viables están unidas a la raíz, lo que indica que dichas bacterias
sobreviven en los substratos de roca Nº 1 y Nº 2 y se propagan ellos
mismos.
Dichas bacterias producen
fenazina-1-carboxamida en las
condiciones de crecimiento estudiadas, cuyo compuesto estimula el
crecimiento de las plantas estudiadas (en aproximadamente un 30% con
respecto al control).
Estos resultados muestran que la
fenazina-1-carboxamida (y, por lo
tanto, también la cepa de bacteria que la produce) se une a la lana
de roca en los substratos de lana de roca Nº 1 y Nº 2.
Como la cepa bacteriana productora de la
fenazina-1-carboxamida se une a la
lana de roca, se pueden administrar dosificaciones más precisas de
dicha cepa bacteriana. Además, como dicha cepa bacteriana se une a
la lana de roca, es más fácil combinar dicha cepa bacteriana con una
fuente nutritiva inicial, que también se puede añadir a la lana de
roca antes de usar el substrato de lana de roca como substrato para
plantas. Además, existe la oportunidad de activar la cepa bacteriana
desecada, unida a la lana de roca, de un modo controlado.
A partir de ahora, se dan ejemplos, que
comprenden "Procedimientos experimentales" y "Resultados",
sobre microorganismos genéticamente modificados, por ejemplo los
microorganismos genéticamente modificados descritos anteriormente en
la parte de la descripción que precede al Ejemplo anterior. El
Solicitante ha visto que estos microorganismos genéticamente
modificados bien pueden ser usados en el anterior Ejemplo, en lugar
de la cepa de tipo salvaje P. chlororaphis PCL1391, y que,
con estos microorganismos genéticamente modificados, se pueden
obtener resultados incluso mejores.
En la Tabla 1 se indican las cepas bacterianas y
los plásmidos. Se usó medio B de King (KB) (King y col., 1954) para
el cultivo rutinario de cepas de Pseudomonas. E. coli
y Chromobacterium violaceum crecieron en medio de
Luria-Bertani (LB) (Sambrook y col., 1989).
Agrobacterium tumefaciens creció en medio YMB (Smit y col.,
1987). Los medios sólidos de crecimiento contenían un 1,8% de agar
(Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.). Se añadieron kanamicina
(50 \mug/ml), tetraciclina (80 \mug/ml), cloranfenicol (20
\mug/ml) y carbenicilina (50 \mug/ml) para la selección
antibiótica cuando fuera aplicable.
Se realizaron las digestiones con endonucleasas
de restricción, la ligación la transformación de células de e.
coli con ADN plasmídico usando protocolos de biología molecular
estándar (Sambrook y col., 1989). La secuenciación de nucleótidos
fue realizada por Eurogentec B.V. (Herstal, Bélgica) usando
tecnología de secuenciación fluorescente basada en AB1377. Se
consiguió el análisis por ordenador de las secuencias de proteínas y
de nucleótidos con el Paquete Wisconsin Versión 10.0 (Genetics
Computer Group (GCG), Madison, WI, EE.UU.).
Para la detección de la actividad autoinductora
con el ensayo indicador de Chromobacterium violaceum
N-AHL (Milton y col., 1997), se hicieron crecer durante la
noche cultivos de Chromobacterium en medio LB suplementado
con kanamicina (50 \mug/ml). Se recubrieron las placas de agar LB
con una capa superior de agar LB al 0,8% mezclada con un cultivo de
16 h de la capa indicadora de Chromobacterium CV026 (200
\mul/ml) (McClean y col., 1997). Se estudió un volumen de 20
\mul de una muestra de HPLC de 100 \mul en cuanto a actividad
autoinductora en pocillos perforados en el agar. Se juzgó la
actividad de las fracciones después de 16 h de crecimiento a 28ºC
por la aparición de un halo violeta alrededor del pocillo provocado
por la producción de violasceína como resultado de la activación de
los genes indicadores en la cepa de Chromobacterium. Se
detectó actividad autoinductora en cromatografía de capa fina
("TLC") C18 (Merck, Darmstadt, Alemania), revelada en
metanol-agua (60/40, vol/vol), por recubrimiento de
la placa de TLC con una capa superior de agar LB al 0,8% que
contenía células CV026 según se ha descrito antes, seguido de
incubación a 28ºC durante 16 h, y se analizó en cuanto a la
aparición de manchas violetas.
Se desarrollaron ensayos de indicadores de
autoinducción basados en el sistema de Photobacterium (lux)
usando el plásmido pSB401 (Winson y col., 1998) y el sistema de la
elastasa de P. aeruginosa (las) usando el plásmido
pSB1142 (T. Perehinec, Division of Food Sciences, Univ. of
Nottingham, comunicación personal) de forma similar al ensayo antes
descrito para Chromobacterium. Se mezcló un volumen de 50
\mul de un cultivo de 16 h de DH5\alpha[pSB401] o
DH5\alpha[pSB1142] con 3,0 ml de agar LB al 0,8% en
posición superior y se vertió sobre placas de agar LB que contenían
cloranfenicol (20 \mug/ml). Se puso un volumen de 20 \mul de una
muestra en los pocillos y se incubaron las placas durante 16 h a
28ºC. Se detectó la luminiscencia poniendo una película fotográfica
(Fuji RX, Tokyo, Japón) contra el fondo de las placas de ensayo.
Se detectó la inducción del sistema
Agrobacterium tra usando la cepa NT1 de A. tumefaciens
que albergaba el plásmido pJM749, que contenía un indicador
lacZ fusionado a un gen tra, cuya expresión es
dependiente de TraR (localizado en el plásmido pSVB33) y en
presencia de una concentración suficiente de un autoinductor (Piper
y col., 1993). Se raspó el Agrobacterium de placas de YMB a
los tres días de la extensión y se resuspendió en agua estéril a una
densidad óptica (DO_{620}) de 0,1. Se mezcló un volumen de 100
\mul de la suspensión bacteriana con 3,0 ml de agar superior y se
vertió en placas de YMB que contenían
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactopiranósido
(X-Gal) para detectar la expresión como pigmentación
azul. Se estudiaron las muestras como se ha descrito antes para el
bioensayo de Chromobacterium. Eran visibles zonas azules
después de 24-48 h de incubación a 28ºC.
Para el aislamiento de la actividad
autoinductora, se añadieron tres volúmenes de diclorometano a siete
volúmenes de sobrenadante de un cultivo en KB de 72 h de PCL1119 y
se agitó durante una hora (120 rpm). Después de la extracción, se
eliminó la fase orgánica y se secó por evaporación a vacío (McClean
y col., 1997). Se redisolvieron los extractos brutos de sobrenadante
en 100 \mul de acetonitrilo al 100% y se fraccionaron usando TLC
C18 o cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC"). Se
revelaron las placas TLC C18 (Merck, Darmstadt, Alemania) en una
mezcla solvente de metanol-agua (60:40, vol/vol).
Después del revelado, se secaron las placas y se recubrieron con una
capa de agar superior que contenía una de las cepas indicadoras y se
incubaron durante 16 h a 28ºC. Se realizó la HPLC usando una columna
Alltech Hypersil ODS 5 \mum 250 x 4,6 mm (Alltech Associates,
Inc., Deerfield, IL, EE.UU.) y un gradiente lineal del 20 al 90%
(vol/vol) de acetonitrilo en agua y una velocidad de flujo de 1
ml/min. Después de seleccionar las fracciones activas, se reunieron
las muestras y se volvieron a aplicar a la columna eluyendo con un
gradiente isocrático de acetonitrilo al 35%. Se realizó la detección
UV usando un detector de disposición de diodos RSD 2140 de Pharmacia
(Pharmacia, Uppsala, Suecia) con un barrido de longitud de onda de
190 a 400 nm y se recogieron fracciones de 1,0 ml y se analizaron en
cuanto a la presencia de actividad autoinductora usando el biosensor
Chromobacterium. Finalmente, se juntaron las fracciones
activas para los análisis de espectrometría de masas.
Se obtuvieron espectros de masas en tándem de
disociación inducida por colisión por electropulverización en un
espectrómetro de masas en tándem de tiempo de vuelo tetrapolar
híbrido Micromass Q-TOF (Wythenshawe, (UK)),
equipado con un sistema de introducción de muestras de pulverización
en Z en una fuente de iones de electropulverización de nanoflujo. Se
operó el espectrómetro de masas en el modo de iones positivos. Se
fijó el voltaje del cono a aproximadamente 25 V y se usó un voltaje
capilar de 1,5 kV. Se usó argón como gas de colisión y se obtuvieron
los espectros usando una energía de colisión de 10 eV. Se
adquirieron los espectros por medio del analizador Tof y se
integraron cada 2,4 segundos a lo largo del intervalo m/z de
35-250. Se registraron los datos y se procesaron
usando el programa MassLynx, versión 3.1. Se realizó la calibración
por monitorización de iones múltiples de señales de yoduro de sodio
y cesio de una sola carga. Se disolvieron las muestras en 10 \mul
de metanol, 3 \mul de los cuales fueron cargados en el capilar de
vidrio revestido de oro por nanopulverización para la administración
de la muestra.
Se estableció una librería mutante de PCL1391
consistente en 18.000 transposantes usando pRL1063a (Wolk y col.,
1991), que albergaba un transposón Tn5 portador de genes indicadores
luxAB sin promotor. Se seleccionaron los mutantes en cuanto a
la ausencia de, o al cambio en, la producción de pigmento en placas
de agar LB o en 200 \mul de cultivos en KB líquido crecidos en
placas de microtitulación de 96 pocillos durante tres días. Se
realizó la caracterización fenotípica de los mutantes en cuanto a la
producción de PCN, cianuro de hidrógeno, quitinasa o proteasa; en
cuanto a la motilidad (Chin-A-Woeng
y col., 1998), y en cuanto a la capacidad de colonización de la raíz
del tomate (Simons y col., 1996), como se ha descrito
previamente.
Como el transposón Tn5 en los transconjugantes
contiene un origen de replicación que funciona en E. coli
(Wolk y col., 1991), se recuperaron regiones de ADN cromosómico que
flanqueaban al transposón del genoma por excisión con EcoRI,
seguido de circularización, transferencia a E. coli y
análisis por secuenciación de nucleótidos. Se realizó la
secuenciación de nucleótidos de las regiones flanqueantes usando
cebadores únicos oMP458 (5' TACTAGATTCAATGCTATCAATGAG 3') y OMP459
(5' AGGAGGTCACATGGAATATCAGAT 3') dirigidos a los extremos izquierdo
y derecho del transposón Tn5, respectivamente.
Se construyó una librería plasmídica de
fragmentos cromosómicos de la cepa PCL1391 clonando ADN cromosómico
digerido con EcoRI en el sitio de multiclonación de
pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Después de la
electroporación de esta librería de fragmentos en una cepa
indicadora de E. coli lux que contenía pSB401 y crecer
durante la noche en placas de agar LB, se identificaron los clones
que inducían al indicador de luciferasa usando una película
fotográfica. Para curar la cepa de E. coli del constructo
indicador pSB401, se omitió la selección con cloranfenicol, mientras
que se mantenía la selección con carbenicilina. Se determinó la
secuencia nucleotídica de la inserción cromosómica en el plásmido
restante usando cebadores estándar, por ejemplo el cebador universal
y el inverso -40, que flanquean el sitio de clonación múltiple de
pBluescript.
Se determinó la expresión de genes marcados con
Tn5luxAB por cuantificación de la bioluminiscencia durante el
cultivo. Se lavaron células de cultivos de una noche con medio
fresco y se diluyeron a una densidad óptica (DO_{620}) de 0,1. Los
cultivos crecieron en medio LB en un volumen de 10 ml con agitación
vigorosa. A continuación del cultivo, se midió la densidad óptica
(DO_{620}) a intervalos regulares y se tomaron muestras de 100
\mul por triplicado para cuantificar la luminiscencia. Se añadió
un volumen de 100 \mul de una solución de substrato
n-decilaldehído [n-decilaldehído al 0,2%
(Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) en una solución de seroalbúmina
bovina ("BSA") al 2,0%]. Después de mezclar bien, se determinó
la bioluminiscencia usando un contador de luminiscencia (MicroBeta
1450 TriLux, Wallac, Turku, Finlandia).
Se estudiaron las moléculas sintéticas
N-AHL
N-butanoil-L-homoserina
lactona (BHL),
N-hexanoil-L-homoserina
lactona (HHL),
N-octanoil-L-homoserina
lactona (OHL),
N-decanoil-L-homoserinalactona
(DHL),
N-dodecanoil-L-homoserina
lactona (dDHL),
N-oxohexanoil-L-homoserina
lactona (OHHL),
N-oxooctanoil-L-homoserina
lactona (OOHL) y
N-oxodecanoil-L-homoserina
lactona (ODHL) (amablemente proporcionadas por P. Williams,
Universidad de Nottingham) en cuanto a su capacidad para inducir
cepas indicadoras Tn5luxAB. Las cepas crecieron durante la
noche en medio LB, se lavaron y se resuspendieron a una densidad
celular de 0,1 a DO_{620} en medio fresco suplementado con
N-AHL(s) sintético(s) (5 \muM) o con
sobrenadante gastado del crecimiento (10%, vol/vol) y crecieron
hasta la fase estacionaria. Se determinó la luminiscencia después de
cada aumento en 0,1 unidades en la DO_{620} y se comparó con la
del control sin N-AHL añadido.
Se realizó la mutagénesis dirigida a sitio en el
gen homólogo gacS usando pMP6014, un constructo suicida
pIC20R que contenía un fragmento de PCR interno de 0,3 kb del gen
homólogo gacS de la cepa PCL1391 y una cassette de
resistencia a la tetraciclina. Los cebadores de PCR contenían sitios
de restricción KpnI y EcoRI (subrayados) y se
hibridaban con las posiciones nucleotídicas 1084 a 1103 (5'
CCGGAATTCGAGCCACGAAATCCGTACCC 3') y 1294 a 1313 (5'
CGGGGTACCTCAGGGTGTCCTGCAACAGG 3') del gen homólogo
gacS de la cepa PCL1391. Se transformó el constructo en la
cepa PCL1391 y sus derivados por electroporación y se seleccionaron
las colonias resistentes resultantes de la integración cromosómica
en medio agar LB suplementado con tetraciclina (160 \mug/ml) para
PCL1391 o kanamicina (50 \mug/ml) y tetraciclina para los
derivados. Se analizaron los transformantes en cuanto a la correcta
recombinación usando hibridación Southern. Se determinó el
efecto de una mutación en el gen gacS sobre la expresión de
genes cuantificando la bioluminiscencia del indicador luxAB
durante el cultivo en medio KB suplementado con 100 \muM de
FeCl_{3}.
Se usó estrategia de mutagénesis similar a la
descrita anteriormente para la introducción de una mutación en el
gen homólogo lexA. Se obtuvo el fragmento lexA para la
construcción del plásmido suicida pMP6015 por PCR usando los
cebadores oMP506 (5' CCCAAGCTTCCGCCTGACAAACACTTG 3') y oMP507
(5' CCCAAGCTTATTTCGATCG CGCCCTTG 3') del gen homólogo
lexA de la cepa PCL1391.
Se usó medio B de King (KB) (King y col., 1954)
rutinariamente para cultivar cepas de Pseudomonas. Se
solidificaron los medios con agar al 1,8% (Difco Laboratories,
Detroit, MI) cuando fue necesario. Se añadió kanamicina (50
\mug/ml) para la selección antibiótica cuando fue aplicable. Se
determinó la expresión de los genes biosintéticos de la PCN en medio
definido de Vogel-Bonner (Smit y col., 1987) y medio
KB.
Se determinó la expresión del gen marcado con
Tn5luxAB por cuantificación de la bioluminiscencia durante el
crecimiento en cultivos líquidos. Se lavaron las células de cultivos
de una noche pre-crecidas en el medio estudiado con
medio fresco y se diluyeron a una densidad óptica (DO_{620}) de
0,1. Los cultivos crecieron en un volumen de 10 ml con aireación
vigorosa. Se siguió el crecimiento por medición de la densidad
óptica (DO_{620}) a intervalos de tiempo regulares y se tomaron
muestras de 100 \mul por triplicado para cuantificar la
luminiscencia. Se añadió un volumen de 100 \mul de
n-decilaldehído al 0,2% (Sigma, St. Louis, MO) en una
solución de seroalbúmina bovina (BSA) al 2,0% como substrato a la
muestra. Después de mezclar bien, se determinó la bioluminiscencia
usando un contador de luminiscencia (MicroBeta 1450 TriLux, Wallac,
Turku, Finlandia).
Para estudiar la influencia de los componentes de
los exudados de la raíz, se usaron individualmente ácido málico,
ácido L-piroglutámico, ácido fumárico, ácido
cítrico, ácido propiónico, ácido oxálico, ácido succínico, glucosa,
ribosa, xilosa, sacarosa, fructosa o maltosa a una concentración
final de 2 \muM como fuente de carbono en medio
Vogel-Bonner. Se suplementó el medio con un 1,0% de
proteosa peptona, ya que de lo contrario ni la cepa indicadora
PCL1119 phzB::tn5luxAB ni la cepa parental de tipo
salvaje PCL1391 podrían alcanzar una DO_{620} de 1,0 en medio
mínimo. Se usó el crecimiento en un 1% de proteosa peptona como
control.
Se cuantificó la expresión de los genes
biosintéticos de PCN bajo la influencia de iones metálicos en medio
Vogel-Boner con glucosa como única fuente de carbono
que contenía 100 \muM de FeCl_{3}, tiamina (2 mg/l) y biotina (2
mg/l). El medio Vogel-Bonner estándar contiene
ZnSO_{4} (5 \muM), CuSO_{4} (2 \muM), MnSO_{4} (30 \muM)
y NaMoO_{4}\cdotH_{2}O (20 \muM). Para determinar la
influencia de la presencia de iones metálicos simples sobre la
expresión de phzB, se omitieron iones individuales o se
añadieron en una concentración diez veces (Cu^{2+}, Mn^{2+},
Zn^{2+}, MoO_{4}^{-}) o cien veces (Fe^{3+}) mayor.
Para estudiar la influencia de una baja tensión
de oxígeno, se hizo crecer a las cepas en 40 ml de medio KB en tubos
de vidrio cerrados bajo un flujo continuo a través de un 1,0% de
oxígeno y un 99% de nitrógeno, según describen Camacho y col.
(presentado) o en aire normal como control. Se midió la
bioluminiscencia como se ha descrito anteriormente.
La producción de PCN en la cepa de P.
chlororaphis PCL1391 (Tabla 1) parecía ser dependiente de la
densidad celular y, por lo tanto, estaba probablemente sometida a
quórum de sensibilidad
(Ching-A-Woeng y col., presentado).
Para analizar la producción de autoinductor(es) por la cepa
PCL1391, se usó un extracto bruto en diclorometano del medio de
cultivo gastado de un cultivo de 72 horas de la cepa PCL1119
(phzB::tn5luxAB)
(Ching-A-Woeng y col., 1998). Se usó
la cepa PCL1119, un derivado de PCL1391 incapaz de producir PCN
debido a una mutación en el gen biosintético phzB
(Chin-A-Woeng y col., 1998) para la
purificación de los autoinductores para resolver el problema de la
copurificación de PCN y de autoinductor(es) en la cepa de
tipo salvaje. PCL1119 no cambió en su producción de autoinductores
en comparación con la cepa de tipo salvaje. Los extractos de los
sobrenadantes de cultivo de la cepa PCL1119 fueron estudiados en
cuanto a la inducción de una serie de sistemas indicadores de quórum
de sensibilidad, incluyendo los de la pigmentación de
Chromobacterium violaceum (McClean y col., 1997), los de la
luminiscencia de Photobacterium fisheri (lux) (Stevens
y Greenberg, 1997), los de la elastasa de Pseudomonas
aeruginosa (las) (Pearson y col., 1997) y los de la
conjugación de Agrobacterium tumefaciens (tra) (Hwang
y col., 1995). Tras la separación usando cromatografía en capa fina
(TLC) C_{18}, se detectaron tres manchas en el sistema de
sobrecapa de Chromobacterium (Fig. 1, banda 4). Una mancha
mayor con un valor de R_{f} de 0,4 migró a la misma posición que
la HHL sintético (Fig. 1, banda 2). Cuando se aplicó una gran
cantidad de muestra a la placa de TLC, se detectó una segunda mancha
con un valor de R_{f} de 0,57 que migraba a la misma posición que
la BHL sintética (Fig. 1, banda 1). Se vio que una tercera mancha
con un valor de R_{f} de 0,13 comigraba con la OHL sintética (Fig.
1, banda 3). Los extractos de sobrenadante de cultivo gastado eran
también capaces de inducir el sistema lux, mientras que
inducían sólo débiles señales en los sistemas las y
tra (datos no mostrados). Ninguno de los sistemas indicadores
fue inducido por extractos en diclorometano de medio de crecimiento
KB o LB no inoculado.
Se purificó el compuesto que migraba con un valor
de R_{f} de 0,4 usando HPLC y se analizó usando espectrometría de
masas en tándem de disociación inducida por colisión ("CID")
por nanoelectropulverización en modo de iones positivos en un
espectrómetro de masas híbrido de tiempo de vuelo tetrapolar, que
permite una sensibilidad excepcional en el modo tándem. Se
optimizaron las condiciones instrumentales usando una solución de
HHL estándar (1,3 ng/\mul), que tenía una concentración de
aproximadamente una décima parte de la necesaria para dar una
respuesta en el bioensayo similar a la de la fracción aislada de la
cepa PCL1391. Después de la optimización, se registró un espectro
CID, en donde se induce la fragmentación al colisionar con una
presión positiva de argón, del patrón (Fig. 2A). Se desechó entonces
la aguja que contenía el patrón. Se registró luego un espectro CID
de la misma masa de iones precursores, pero introduciendo solamente
solvente, para asegurarse de que no se había producido ninguna
contaminación del instrumento con el patrón y para identificar
cualquier señal de fondo que surgiera del solvente. No se observaron
iones correspondientes a HHL en este espectro blanco, aunque estaba
presente un ion a m/z 107, también observado en el espectro
HHL. Se introdujo entonces la fracción bioactiva en el espectrómetro
de masas en una aguja nueva y se registró un espectro de masas. Se
observaron iones pseudomoleculares muy débiles a m/z 200
(M+H^{+}) y 222 (M+Na^{+}) para una especie con una masa
molecular correspondiente a HHL. Estos iones eran apenas
discernibles por encima del fondo. Sin embargo, se registró un
espectro CID del ion M+H^{+} a m/z 200 y generó un espectro
de buena calidad (Fig. 2B), que es muy similar al obtenido del HHL
estándar (Fig. 2A). Se observaron iones fragmentarios
característicos de HHL a m/z 99, 102, 172 y 182 (inserción de
la Fig. 2A). Los iones a m/z 99 y 102 se generan al
fragmentarse en enlace amida entre el resto de hexanoílo y la
homoserina lactona, correspondiendo el ion a m/z 99 al
substituyente hexanoílo y siendo el de m/z 102 característico
de la homoserina lactona. Los iones a m/z 172 y 182 surgen
por la pérdida de pequeños puntos neutros (m/z 172 =
M+H^{+}-C_{2}H_{4}; m/z 182 =
M+H^{+}-H_{2}O). Estos resultados demuestran
claramente que el componente en la fracción bioactiva mayor es
N-hexanoil-L-homoserina
lactona (HHL).
En los extractos en diclorometano del
sobrenadante de cultivo gastado, estaban presentes las otras dos
actividades en pequeñas cantidades y no eran suficientes para los
análisis espectrométricos de masas y son, por lo tanto, asignadas
provisionalmente como
N-butanoil-L-homoserina
lactona (BHL) y
N-octanoil-L-homoserina
lactona (OHL) en base a su comportamiento migratorio en TLC y a sus
actividades biológicas en los sistemas indicadores lux, las y
tra.
El estudio selectivo de 18.000 transconjugantes
Tn5luxAB PCL1391 en placas de agar y en cultivos líquidos dio
lugar al aislamiento de ocho mutantes alterados en la producción de
PCN, según se juzgó por su pigmentación alterada. Se identificaron
cuatro mutantes cuyo transposón no estaba insertado en un gen
biosintético de PCN. Las regiones flanqueantes de la inserción
Tn5 en los cuatro mutantes, PCL1103
(phzI::tn5luxAB), PCL1104
(phzR::tn5luxAB), PCL1123
(gacS::tn5luxAB) y PCL1111
(lexA::tn5luxAB) fueron recuperadas en los plásmidos
pMP6003, pMP6004, pMP6006 y pMP6005, respectivamente. Los análisis
de las secuencias de nucleótidos de las regiones flanqueantes
mostraron que los transposones en estos mutantes estaban insertados
en homólogos de genes luxI, luxR, gacS y lexA,
respectivamente.
Se determinó la producción de PCN por estas cepas
usando TLC y HPLC después de la extracción de los sobrenadantes de
cultivo con tolueno. No se detectó PCN en los extractos toluénicos
de PCL1103 (phzI::tn5luxAB) y PCL1104
(phzR::tn5luxAB) (datos no mostrados), ni se detectó
ningún autoinductor en los extractos de diclorometano de estas cepas
(Fig. 3). Se restauró la producción de PCN en el mutante
phzI, pero no en el mutante phzR, por adición de medio
de crecimiento gastado de PCL1119 (phzB::tn5luxAB) o
de HHL sintética (datos no mostrados). Los mutantes phzI y
phzR no estaban alterados en cuanto a la producción de HCN,
proteasa o quitinasa (Tabla 2). Ninguno de los mutantes tenía
alteraciones en la motilidad o en su capacidad para colonizar
compitiendo con la cepa parental la rizosfera del tomate, según se
estudió en competencia con un derivado marcado con lacZ de la
cepa de tipo salvaje PCL1391 (datos no mostrados). Las cepas PCL1103
(phzI::tn5luxAB) y PCL1104
(phzR::tn5luxAB) eran incapaces de inhibir el
crecimiento de F. oxysporum f.sp.
radicis-lycopersici, según se vio con un
ensayo antifúngico in vitro (datos no mostrados), lo cual es
consistente con la falta observada de producción de PCN.
Para aislar un fragmento cromosómico PCL1391 que
contiene homólogos luxI y luxR, se transformó una
librería cromosómica EcoRI en DH5\alpha que albergaba
pSB401, un constructo indicador dependiente de N-AHL basado
en el sistema lux de Photobacterium (McClean y col.,
1997). El plásmido pMP6007 parecía inducir el indicador y contenía
un fragmento cromosómico de 4,5 kb de PCL1391. La secuenciación
parcial de este clon reveló los genes phzI y phzR
completos y el inicio de phzA (Fig. 4), el primer gen del
grupo biosintético de PCN (Capítulo 4).
Cepas de E. coli que albergaban pMP6007
inducían la cepa indicadora DH5\alpha[pSB401] y
Chromobacterium CV026 cuando se extendieron en proximidad al
indicador, lo que indica la producción de un N-AHL difusible.
Para estudiar si phzI y phzR son responsables de la
síntesis de HHL, se extrajeron los sobrenadantes de cultivo de E.
coli DH5\alpha con y sin pMP6007 con diclorometano y se
sometieron a análisis por TLC. Sólo se detectaron actividades
autoinductoras con valores de R_{f} idénticos a los de los
sobrenadantes de cultivo de PCL1391 de tipo salvaje en cepas que
albergaban pMP6007, mientras que no se detectó actividad alguna en
el control DH5\alpha (datos no mostrados).
Para transferir los genes phzI y
phzR a derivados mutantes de PCL1391, se construyó el
plásmido pMP6008 por transferencia del fragmento cromosómico
EcoRI de 4,5 kb que contenía los genes phzI y
phzR de la cepa PCL1391 de pMP6007 a pME6010, un vector
lanzadera establemente mantenido en especies de Pseudomonas
(Heeb y col. 2000). Después de la introducción de pMP6008 en cepas
PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) y PCL1104
(phzR::Tn5luxAB), Se restauró la producción de PCN en
ambos mutantes, según se demostró por análisis de TLC de
sobrenadantes de cultivo (datos no mostrados). Esto y los estudios
de mutantes antes descritos muestran que PhzI y PhzR están
implicados en la síntesis de los autoinductores BHL, HHL y OHL.
El análisis de secuencia de los ORF (marcos
abiertos de lectura) muestra que los genes phzI y phzR
se transcriben de forma opuesta, transcribiéndose phzI en la
misma dirección que el operón biosintético phz (fig. 4A). En
las regiones promotoras de los genes phzI y phzA, se
identificaron secuencias que son homólogas a la caja lux en
Photobacterium fisheri, que constituyen una región putativa
de unión para el activador transcripcional luxR (Fig.
4B).
Los genes homólogos phzI y phzR de
PCL1391 eran los más homólogos (85 a 95%) a otros genes phzI
(Fig. 4C) y phzR (Fig. 4D) en las cepas de Pseudomonas
productoras de PCA P. fluorescens 2-79 y
P. aureofaciens 30-84. La homología con otros
homólogos LuxI y LuxR en otras especies de Pseudomonas y
otras especies bacterianas era mucho menor (20 a 40%).
Previamente, se habían identificado una serie de
mutantes biosintéticos, de los cuales el mutante PCL1119 contiene un
indicador luxAB sin promotor en el gen phzB y se usó
para estudios de expresión en la rizosfera del tomate
(Chin-A-Woeng y col., 1998). Se usó
esta cepa para cuantificar la expresión del operón biosintético de
PCN durante el crecimiento en cultivos líquidos. Como los genes
luxAB sin promotor se insertaban en la misma orientación que
la dirección de la transcripción de lo genes phzI y
phzR mutados en PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) y
PCL1104 (phzR::Tn5luxAB), estas cepas fueron también
usadas para cuantificar la expresión de estos genes. La expresión
del gen phzI en el mutante PCL1103 permanecía a un nivel
basal durante el crecimiento, lo que indica que la actividad
inductora está ausente sin un phzI funcional. La adición de
HHL sintética o de medio de crecimiento gastado de un cultivo de una
noche de PCL1391 a un cultivo celular de baja densidad (DO_{620}
0,1) de PCL1103 dio lugar a una inducción de la expresión de
phzI una vez hubo crecido el cultivo celular a una DO_{620}
de 0,6 ó más (fig. 5A). La expresión de phzR en el mutante
PCL1104 era constitutiva tanto en presencia de HHL exógena como en
ausencia de autoinductores endógenos (Fig. 5B). La expresión del
grupo de genes para la biosíntesis de PCN
(phzB::tn5luxAB) en PCL1119 estaba muy aumentada en la
fase exponencial tardía/estacionaria precoz y se pudo anticipar el
momento de inducción por adición de HHL sintética (Fig. 5C), pero no
de otras N-AHL sintéticas.
La adición de medio de cultivo gastado libre de
células de la cepa productora de N-AHL PCL1119
(phzB::
Tn5luxAB) a un cultivo fresco de la cepa PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) dio lugar a una inducción mucho más precoz y mayor del gen phzI que la adición de HHL sintética. Aunque la adición de medio de cultivo gastado de un cultivo de una noche de la cepa PCL1103 como tal no indujo al gen phzI, se observó un efecto sinérgico cuando se añadió junto con HHL. La inducción de la expresión en presencia de sobrenadante de cultivo de la cepa PCL1103 estaba ya en crecimiento en fase medio-exponencial (DO_{620}0,35), mucho antes que en presencia sólo de HHL (Fig. 5D). Se estudiaron combinaciones de autoinductores producidos por la cepa PCL1391 en cuanto a su posible sinérgico sobre la expresión. Ninguna de las combinaciones BHL/HHL, HHL/OHL o BHL/HHL/OHL dio un nivel o punto de aparición de la inducción diferente al observado tras la adición sólo de HHL (datos no mostrados).
Tn5luxAB) a un cultivo fresco de la cepa PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) dio lugar a una inducción mucho más precoz y mayor del gen phzI que la adición de HHL sintética. Aunque la adición de medio de cultivo gastado de un cultivo de una noche de la cepa PCL1103 como tal no indujo al gen phzI, se observó un efecto sinérgico cuando se añadió junto con HHL. La inducción de la expresión en presencia de sobrenadante de cultivo de la cepa PCL1103 estaba ya en crecimiento en fase medio-exponencial (DO_{620}0,35), mucho antes que en presencia sólo de HHL (Fig. 5D). Se estudiaron combinaciones de autoinductores producidos por la cepa PCL1391 en cuanto a su posible sinérgico sobre la expresión. Ninguna de las combinaciones BHL/HHL, HHL/OHL o BHL/HHL/OHL dio un nivel o punto de aparición de la inducción diferente al observado tras la adición sólo de HHL (datos no mostrados).
Los extractos toluénicos de sobrenadantes de
cultivo de la cepa PCL1123 (gacS::tn5luxAB) no
contenían PCN, según se juzgó después de las separaciones por TLC y
HPLC. La producción de autoinductor en esta cepa estaba muy reducida
en comparación con la de tipo salvaje, según se juzgó por análisis
de TLC de extractos de sobrenadante de crecimiento libre de células
de cultivos de tres días (Fig. 3, banda 4). La producción de PCN no
pudo ser restaurada por adición de medio de crecimiento gastado de
PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) o de HHL sintética (datos no
mostrados). La cepa PCL1123 (gacS::Tn5luxAB) no se
alteraba en cuanto a la producción de HCN, pero carecía de
producción de proteasa y de quitinasa (Tabla 2). El mutante no
estaba alterado en cuanto a motilidad o a capacidad para colonizar
la rizosfera del tomate en competición con un derivado marcado con
lacZ de la cepa de tipo salvaje (datos no mostrados). Como
las cepas PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) y PCL1104
(phzR::Tn5luxAB), PCL1123 no era capaz de inhibir el
crecimiento de F. oxysporum f.sp.
radicis-lycopersici en un ensayo antifúngico
in vitro (datos no mostrados).
La parte de la secuencia nucleotídica que
flanquea el trasposón en la cepa PCL1123 que se analizó tiene una
longitud total de 999 pb y es idéntica en un 90% a la secuencia del
gen gacS (antes conocido como lemA) de P.
fluorescens (Whistler y col., 1998) y tiene una identidad del
84% con el gen gacS de P. syringae (Rich y col.,
1994).
Un mutante gacS independientemente
construido por recombinación homóloga usando un constructo suicida
pIC20R que contenía una cassette de resistencia a la tetraciclina y
un fragmento de PCR de un fragmento interno del gen homólogo
gacS (pMP6014) dio mutantes con el mismo fenotipo que
PCL1123, lo que confirma que el fenotipo observado en la cepa
PCl1123 se debía a la inserción del transposón en gacS.
Se complementó el mutante gacS para la
producción de PCN, proteasa y quitinasa tras la introducción de
pEMH97, un derivado de pLAFR3 que contenía el gen lemA de
P. syringae (Hrabak y Willis, 1992). La introducción del
constructo pEMH97 en el mutante phzI PCL1104 y el mutante
phzR PCL1104 no restauró la producción de PCN, ni la
introducción de pMP6008, que contenía los genes phzI y
phzR, restauró la producción de PCN en el mutante
gacS.
Para analizar el efecto de una mutación
gacS sobre la expresión de phzI, phzR y phzB,
se introdujo una mutación en el gen homólogo gacS en las
cepas indicadoras PCL1103 ((phzI::Tn5luxAB), PCL1104
(phzR::Tn5luxAB) y PCL1119
(phzB::Tn5luxAB) usando recombinación homóloga. Los
análisis de la expresión de luxAB en estas cepas mostró que
la respuesta característica de un mecanismo de regulación de quórum
de sensibilización resulta abolida por una mutación gacS
adicional (Fig. 6A, B y C). Mientras que phzI en PCL1103
(phzI::Tn5luxAB) responde a la adición de HHL
sintética, phzI en el doble mutante PCL1147
(phzI::Tn5luxAB, \DeltagacS) no resulta inducido por
la adición de autoinductor (Fig. 6A). El nivel basal de expresión
del gen phzR se reduce con un gen gacS defectuoso
adicional (Fig. 6B). La expresión del gen phzB biosintético
queda completamente abolida en un fondo gacS (Fig. 6C), al
igual que la producción de PCN del mutante gacS PCL1123
(datos no mostrados).
La mutación de lexA en PCL1111 dio lugar a
una superproducción más de diez veces mayor de PCN (Tabla 2 y
resultados no publicados). Se observó una mayor producción de
autoinductor, según se juzgó por la mayor intensidad de la mancha
para HHL y la clara presencia de BHL, que normalmente sólo se
detecta cuando se analizan cantidades mayores de muestra por TLC.
Esta superproducción aparente de autoinductor es consistente con los
mayores niveles de expresión de PCN en el mutante lexA. No se
detectaron alteraciones en la producción de HCN, proteasa y
quitinasa en la cepa mutante lexA. El mutante no estaba
alterado en cuanto a motilidad o a capacidad para colonizar el
sistema de la raíz del tomate, según se estudió en competición con
un derivado marcado con lacZ de la cepa de tipo salvaje
PCL1391 (datos no mostrados).
El análisis de 1,5 kb de la secuencia
nucleotídica que flanquea el transposón en el mutante PCL1111 reveló
una inserción de transposón en un gen homólogo a los genes
lexA de P. aeruginosa (90%), P. putida (87%)
(Garriga y col., 1992) y E. coli (41%) (Brent y Ptashne,
1981; Little y col., 1981; Calero y col., 1993). En la región
promotora del homólogo lexA, se identificaron dos sitios
putativos de unión del represor LexA que comienzan en las posiciones
nucleotídicas relativas -2
(5'-CTGTATAAAAAGACAG-3') y -45
(5'-CTGTATATAATTCCAG-3'), siendo la
distancia entre ellos de 3 pb (Fig. 7).
Un mutante lexA construido
independientemente, producido por recombinación homóloga usando un
constructo suicida pIC20R que contiene una cassette de resistencia a
la tetraciclina y un fragmento de PCR de una parte del gen
lexA (pMP6015), dio un mutante con el mismo fenotipo que
PCL1111 (lexA::Tn5luxAB). También se observó la
superproducción de PCN en este mutante independiente, lo que
confirma que el fenotipo observado en PCL1111 se debe a la inserción
de transposón en lexA.
Se realizó una mutación lexA en PCL1103,
PCL1104, PCL1119 y PCL1123 por recombinación homóloga usando
pMP6015. Sorprendentemente, la introducción de una mutación
lexA en las cepas mutantes phzI o phzR PCL1103
y PCL1104 restaura la producción de pigmento PCN en estas cepas a
casi los niveles del tipo salvaje. Esto quedó demostrado en la
fraccionación por HPLC de extractos del sobrenadante de cultivo
(datos no mostrado) y por las observaciones de colonias en las
placas de agar (datos no mostrados). Se determinó la expresión de
phzI y phzB en un mutante lexA usando los
indicadores Tn5luxAB (Fig. 6D, F). Sorprendentemente, se
indujo phzI::Tn5luxAB en PCL1140 (\DeltalexA,
phzI::Tn5luxAB) al inicio de la fase estacionaria,
incluso en ausencia de autoinductores (Fig. 6D). El nivel básico de
expresión de phzI, y en consecuencia de phzB (fig.
6F), era mayor que el de la cepa parental PCL1103. Se observó un
pequeño efecto positivo sobre la expresión de
phzR::TnluxAB en la mutación lexA (Fig. 6E).Una
mutación lexA adicional en el mutante gacS PCL1123
(PCL1162) no restauró la producción de PCN observada para los
mutantes phzI y phzR y dio lugar al mismo fenotipo que
PCL1160 (lexA::Tn5luxAB, \DeltagacS).
Aunque no se pudo determinar el efecto de una
mutación gacS sobre la expresión de una cepa lexA
PCL1160 midiendo la luminiscencia debido a la inserción incorrecta
de los genes indicadores, el doble mutante lexA/gacA no
produjo PCN, según se demostró por el análisis de TLC de extractos
de medio de cultivo gastado.
La cepa PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) es
un derivado de la cepa PCL1391 en donde se inserta un transposón
Tn5luxAB sin promotor en el gen phzB. Esta cepa
indicadora bioluminiscente puede ser usada para analizar la
expresión del operón biosintético de PCN
(Chin-A-Woeng y col., 1998). Se
estudió la influencia de los componentes del exudado de la raíz del
tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Carmello) ácido
málico, ácido L-piroglutámico, ácido fumárico, ácido
cítrico, ácido propiónico, ácido oxálico, ácido succínico, glucosa,
ribosa, xilosa, sacarosa, fructosa y maltosa sobre la expresión del
operón biosintético de la PCN. La mayor parte de los componentes
simples del exudado de la raíz estudiados no tenían efecto
significativo (Fig. 8A) sobre la expresión de phzB, ni
tampoco sobre el punto de aparición de la inducción (datos no
mostrados). Sin embargo, la presencia de fructosa, ribosa o ácido
cítrico parecía aumentar la expresión del operón biosintético de PCN
significativamente en comparación con el control (Fig. 8A). El
glicerol, cuya presencia en el exudado de la raíz no había sido
demostrada, parecía ser la fuente de carbón que provocaba el mayor
aumento en la expresión. El efecto de estas fuentes de carbono fue
seguido además en función del crecimiento (Fig. 8B). Se usaron el
medio de control y medio al que se añadió ácido málico como
controles. Los resultados indican que la expresión era mayor al
final de la fase de crecimiento logarítmico y durante la fase
estacionaria. Se observó un claro aumento en la expresión para la
fructosa, la ribosa y el ácido cítrico en comparación con el ácido
málico o el medio de control.
Para estudiar el efecto de la limitación o de una
concentración diez veces o cien veces mayor de Zn^{2+}, Cu^{2+},
Mn^{2+}, MoO_{4}^{-} y Fe^{3+} sobre la expresión del operón
biosintético de PCN en medio Vogel-Bonner, se
omitieron estos iones o se añadieron en una concentración diez o
cien veces mayor en medio Vogel-Bonner (Fig. 9). La
ausencia de Cu^{2+} (Fig. 9B), Zn^{2+} (Fig. 9D) o
MoO_{4}^{-} (fig. 9E) retrasó la expresión de phzB,
mientras que la limitación de Fe^{3+} dio lugar a un retraso
aparente y a una menor expresión (Fig. 9A). No se detectó influencia
de la omisión de Mn^{2+} (Fig. 9C). El exceso de Fe^{3+} (Fig.
9A), Cu^{2+} (Fig. 9B), Zn^{2+} (Fig. 9D) o MoO_{4}^{-}
(Fig. 9E) no tuvo efecto significativo. Sorprendentemente, el exceso
de molibdato, como la limitación para este ion, suprimió la
expresión de phzB.
La creación de condiciones microaerobias por
cultivos en crecimiento de la cepa P. chlororaphis de tipo
salvaje PCL1391 sin agitación dio como resultado una mayor
producción de PCN, tal como se vio en la fraccionación por HPLC de
extractos de sobrenadantes de cultivo (datos no mostrados). El
patrón de expresión del operón biosintético de la PCN en condiciones
de limitación de oxígeno fue determinado en un sistema cerrado en el
que se hicieron crecer células de la cepa PCL1119 bajo aireación con
un 1,0% de oxígeno y un 99% de nitrógeno. Ciertamente, en
condiciones pobres en oxígeno, la expresión de phzB se
inducía mucho antes en la curva de crecimiento que el cultivo de
referencia crecido bajo aireación con aire (Fig. 10).
Fig. 1. Análisis de TLC de fase invertida C18 de
las N-acil-L-homoserina
lactonas producidas por la cepa PCL1391 de Pseudomonas
chlororaphis visualizadas usando el ensayo indicador de
Chromobacterium violaceum. Banda 1: patrón de BHL sintética;
banda 2: patrón de HHL sintética; banda 3: patrón de OHL sintética;
banda 4: perfil autoinductor de la cepa PCL1391. Habría que hacer
notar que la mancha mayor visible en la banda 4 se movía exactamente
a la misma posición que HHL cuando se aplicaron cantidades menores
de muestra.
Fig. 2. Identificación estructural del compuesto
mayor con actividad autoinductora producido por Pseudomonas
chlororaphis PCL1391 por espectrometría de masas. Panel A.
Espectro CID obtenido de una solución estándar de 1,3 ng/\mul de
HHL. Inserción: esquema de fragmentación para HHL. Panel B. Espectro
CID obtenido de la fracción con un R_{f} de 0,4 tras la
purificación por HPLC.
Fig. 3. Análisis de TLC de fase invertida C18 de
las N-acil-L-homoserina
lactonas producidas por la cepa PCL1391 de Pseudomonas
chlororaphis y derivados. Perfil autoinductor de los mutantes
Tn5 de la cepa PCL1391 de
Pseudomonas chlororaphis. Banda 1: PCL1391 de tipo salvaje; banda 2: PCL1103 (phzI::Tn5luxAB); banda 3:
PCL1104 (phzR::Tn5luxAB); banda 4: PCL1123 (gacS::Tn5luxAB); banda 5: PCL1111 (lexA::Tn5luxAB); banda 6: PCL1119 (phzB::Tn5luxAB); banda 7: patrón de HHL sintética. Se extrajo un volumen de 100 ml de un sobrenadante de cultivo KB de tres días de las cepas con diclorometano y se estudió en el ensayo de sobrecapa por TLC de Chromobacterium (véase los procedimientos experimentales).
Pseudomonas chlororaphis. Banda 1: PCL1391 de tipo salvaje; banda 2: PCL1103 (phzI::Tn5luxAB); banda 3:
PCL1104 (phzR::Tn5luxAB); banda 4: PCL1123 (gacS::Tn5luxAB); banda 5: PCL1111 (lexA::Tn5luxAB); banda 6: PCL1119 (phzB::Tn5luxAB); banda 7: patrón de HHL sintética. Se extrajo un volumen de 100 ml de un sobrenadante de cultivo KB de tres días de las cepas con diclorometano y se estudió en el ensayo de sobrecapa por TLC de Chromobacterium (véase los procedimientos experimentales).
Fig. 4. Localización cromosómica, elementos
reguladores y homología de genes que regulan la producción de PCN en
P. chlororaphis PCL1391. Panel A. Análisis genético de
mutantes alterados en la producción de PCN de Pseudomonas
chlororaphis cepa PCL1391. Las posiciones del transposón
Tn5luxAB de las cepas PCL1103, PCL1104 y PL119 están
indicadas con flechas. Además, se muestran los dos primeros genes
del operón biosintético, phzA y phzB. Se identificaron
secuencias homólogas a las cajas lux de Photobacterium
fisheri en la región promotora de los genes phzI y
phzA. Panel B. Identificación de secuencias homólogas a la
caja lux de P. fisheri en las regiones promotoras
phzI y phzA. La caja lux está doblemente
subrayada y se indican los codones de iniciación ATG de phzI
y phzA. Panel C. Árbol de homología de las proteínas PhzI de
la cepa P. aureofaciens 30-84 (P. aur.
PhzI), P. fluorescens 2-79 (P. flu.
PhzI), P. aeruginosa PAO1 (P. aer. PhzI, VsmI, RhlI,
LasI), P. syringae pv. Syringae (P. syr. AhlI),
P. fisheri (P. fis. LuxI), E. carotovora
(E. car. ExpI, CarI), A. tumefaciens (A. tum.
TraI) y Rhizobium etli (R. etl. RaiI). Panel D. Árbol
de homología de las proteínas PhzR de P. aureofaciens
30-84 (P. aur. PhzR), P. fluorescens
2-79 (P. flu. PhzR), P. aeruginosa
PAO1 (P. aer. PhzR, Vsmr, RhlR, LasR), P. fisheri
(P. fis. LuxR), E. carotovora (e. car. ExpR),
A. tumefaciens (A. tum. TraR) y Rhizobium etli
(R. etl. RaiR).
Fig. 5. Estudios de expresión del gen
phzI, del gen phzR y del operón biosintético de PCN de
Pseudomonas chlororaphis cepa PCL1391. Las cepas crecieron en
medio LB. Se añadió HHL a una densidad óptica (DO_{620}) inicial
de 0,1. Los valores que aparecen en los paneles son valores para la
luminiscencia medida en cuentas por segundos (cps) por unidad de
densidad celular durante el crecimiento en el tiempo. Panel A.
Inducción de phzI en la cepa PCL1103
(phzI::Tn5luxAB) en ausencia y en presencia de 5 m) en
ausencia y en presencia de 5 \muM de HHL sintética. Panel B.
Cuantificación de la expresión de phzR en ausencia y en
presencia de 5 \muM de HHL sintética usando la cepa PCL1104
(phzR::Tn5luxAB). Panel C. Expresión del operón
biosintético de PCN de la cepa PCL1119
(phzR::Tn5luxAB) en ausencia y en presencia de 5
\muM de HHL sintética. Panel D. Inducción de phzI por HHL
sintética, por sobrenadante de cultivo gastado libre de células de
la cepa PCL1103, por sobrenadante de crecimiento gastado de la cepa
PCL1119 y por una combinación de sobrenadante de crecimiento gastado
de PCL1103 y HHL.
Fig. 6. Expresión del gen phzI, del gen
phzR y del operón biosintético de PCN de la cepa
Pseudomonas chlororaphis PCL1391 en cepas mutantes
lexA y gacS. Paneles A-C. Estudios de
expresión de phzI, de phzR y de los genes
biosintéticos de PCN en un fondo deficiente en gacS usando
los indicadores phzI::Tn5luxAB (PCL1103),
phzR::Tn5luxAB (PCL1104) y
phzB::Tn5luxAB (PCL1119), respectivamente. Paneles
D-F. Expresión de phzI, de phzR y de
los genes biosintéticos en un fondo deficiente en lexA usando
los indicadores phzI::Tn5luxAB (PCL1103),
phzR::Tn5luxAB (PCL1104) y
phzB::Tn5luxAB (PCL1119), respectivamente. Se midió la
bioluminiscencia según se describe en la leyenda de la Fig. 5.
Fig. 7. Identificación de secuencias homólogas a
los sitios de unión para LexA (cajas SOS) en la región promotora de
lexA en la cepa de Pseudomonas chlororaphis
PCL1391.
Fig. 8. Influencia de los componentes del exudado
de la raíz sobre la expresión del operón biosintético de PCN de
Pseudomonas chlororaphis. La cepa de P. chlororaphis
PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) creció en medio
Vogel-Bonner modificado en el que estaban presentes
las fuentes de carbono indicadas. El panel A muestra la expresión
máxima del operón biosintético de PCN. El panel B muestra la
expresión del operón biosintético de PCN durante el crecimiento en
una selección de carbono y ácidos orgánicos, que muestra una clara
elevación en la expresión según se muestra en el panel A. Se detectó
la bioluminiscencia según ha descrito en Materiales y métodos.
Fig. 9. Influencia de cantidades limitadas y
excesivas de iones metálicos en el medio de crecimiento sobre la
expresión del operón biosintético de PCN. Se hizo crecer a
Pseudomonas chlororaphis cepa PCL1119
(phzB::Tn5luxAB) en medio Vogel-Bonner
modificado según se ha descrito en Materiales y métodos. La
concentración media es la concentración estándar en medio
Vogel-Bonner. Se omitieron o añadieron los iones
metálicos seleccionados en una concentración diez o cien veces
mayor. Se detectó la bioluminiscencia como se ha descrito en
Materiales y Métodos.
Fig. 10. Efecto de las bajas tensiones de oxígeno
sobre la expresión de phzB. Se hizo crecer a Pseudomonas
chlororaphis PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) en
condiciones de un 21% (aire) o un 1,0% de oxígeno. Se detectó la
bioluminiscencia según se ha descrito en Materiales y métodos.
Fig. 11. Identificación de
fenazina-1-carboxamida en el
substrato de crecimiento y la solución nutriente de plantones de
pepino. La Fig. 11A muestra el cromatograma de HPLC (siendo el
tiempo de retención del pico indicado de 16,525 minutos). La Fig.
11B muestra el espectro del pico indicado en el cromatograma de la
Fig. 11A. La Fig. 11C muestra el espectro de
fenazina-1-carboxamida estándar.
Claims (10)
1. Substrato de lana mineral para plantas
consistente en lana mineral y, unida a la lana mineral, una bacteria
productora de un derivado de fenazina que tiene actividad fungicida,
donde la bacteria está genéticamente modificada de tal forma que
contiene múltiples copias de los genes phzR y phzI,
dando lugar a una superproducción del derivado de fenazina.
2. Substrato según la reivindicación 1, donde el
derivado de fenazina es
fenazina-1-carboxamida.
3. Substrato según la reivindicación 2, donde la
bacteria consiste en Pseudomonas chlororaphis PCL1391.
4. Substrato según la reivindicación 3, donde la
bacteria consiste en una Pseudomonas chlororaphis PCL1391
genéticamente modificada que tiene una mutación en el gen
lexA que da lugar a una superproducción de
fenazina-1-carboxamida.
5. Substrato según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el substrato consiste en una
matriz coherente de lana mineral y, unida a la matriz, dicha
bacteria.
6. Substrato según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la lana mineral está en forma
granular.
7. Uso de un substrato según se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el
crecimiento de cultivos, donde la producción del derivado de
fenazina aumenta empleando una o más de las siguientes
condiciones:
- crecimiento en condiciones pobres en
oxígeno,
- presencia de glicerol, fructosa, ribosa o ácido
cítrico en el medio nutriente y
- presencia de diversos minerales (Cu^{2+},
Zn^{2+}, Fe^{3+}) en el medio nutriente.
8. Un procedimiento para producir un substrato de
lana mineral para plantas según se ha definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde se añade la bacteria al
substrato de lana mineral para plantas durante la producción de
dicho substrato.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8,
donde se mezcla la bacteria con fibras de lana mineral y un ligante
curable para formar una mezcla y se cura dicha mezcla para formar
una matriz coherente.
10. Un procedimiento para producir un substrato
de lana mineral para plantas según se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde se añade la bacteria a
un substrato de lana mineral para plantas acabado.
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