DE60101849T2

DE60101849T2 - Pflanzensubstrat aus mineralwolle

Info

Publication number: DE60101849T2
Application number: DE2001601849
Authority: DE
Inventors: Daan Kuiper; Johannes Egbertus LUGTENBERG; Fong Thomas CHIN-A-WOENG; Vincent Guido BLOEMBERG
Original assignee: Rockwool International AS
Current assignee: Rockwool AS
Priority date: 2000-05-17
Filing date: 2001-05-17
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2021-05-18
Also published as: ES2215132T3; TR200400410T4; ATE258013T1; EP1282356A1; AU2001258925A1; EP1282356B1; DE60101849D1; PT1282356E; SI1282356T1; WO2001087070A1; DK1282356T3; EP1155617A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mineralwolle-Pflanzensubstrat, insbesondere ein Mineralwolle-Pflanzensubstrat, welches ein Fremdmaterial oder Fremdmaterialien enthält, um die Eigenschaften des Mineralwollesubstrats derart zu verbessern, dass es einen Nutzpflanzenschutz und/oder verbesserte Pflanzenleistung verwirklicht.
Mineralwolle ist hier als Glaswolle, Steinwolle, Gesteinswolle, vom Menschen hergestellte glasartige Fasern, Schlackenwolle und/oder Gemische hiervon zu verstehen.
Mineralwolle-Pflanzensubstrate für das Pflanzenwachstum sind in der Technik wohlbekannt und können aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle bestehen; sie können entweder in loser Form oder in körniger Form vorliegen. Mineralwollesubstrate, die aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle bestehen, sind bevorzugt.
Wenn ein Mineralwollsubstrat gewünscht wird, das aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle besteht, so wird eine solche kohärente Matrix ausgebildet, indem eine Schicht aus Mineralwollfasern zusammengefügt wird, die mit einem härtbaren Bindemittel versehen ist, so dass nach der Härtung die Mineralwollfasern weitestgehend nicht mehr gegeneinander verschiebbar sind.
Wenn es für die schnelle Aufnahme von Wasser erforderlich ist, kann diese kohärente Matrix aus Mineralwolle mit einem Benetzungsmittel versehen werden.
Die Fasern können einen durchschnittlichen Durchmesser aufweisen, der zwischen 1–10 μm variiert. Bei Gesteinswolle beträgt der Faserdurchmesser im Durchschnitt etwa 4 μm.
Die Dichte der kohärenten Matrix der Mineralwolle kann zwischen 10–200 kg/m³ betragen, im allgemeinen liegt sie im Bereich zwischen 40–80 kg/m³.
Eine solche kohärente Matrix aus Mineralwolle hat eine formerhaltende Eigenschaft, die ihr aufgrund der verwendeten anorganischen Ausgangsmaterialien eigen ist. Darüber hinaus ist das Wasser-rückhaltende Potential dieser Mineralwolle-Pflanzensubstrate sehr gut kontrollierbar und vorhersagbar.
Pflanzenzüchter, die Mineralwoll-Pflanzensubstrate verwenden, werden Pestizide anwenden müssen, wenn entsprechende Krankheitssymptome beobachtet wurden. Ein Problem besteht darin, dass kontinuierliche Überwachungen notwendig sind, und dass manchmal die Anwendung der Pestizide zu spät erfolgt.
Es ist eine Zielsetzung der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Mineralwolle-Pflanzensubstrat bereitzustellen, welches darauf abzielt, dieses Problem zu überwinden.
Gemäß der Erfindung wird ein Mineralwolle-Pflanzensubstrat gemäß Anspruch 1 bereitgestellt.
Der biologisch aktive Zusatzstoff kann jedwede, eine Wirkung gegen pathogene Pilze aufweisende Substanz sein, die einen vorteilhaften Effekt auf Pflanzen ausübt, indem sie verbesserte Wachstumsbedingungen schafft oder indem sie durch Pilze verursachte Erkrankungen bekämpft. Der biologisch aktive Zusatzstoff kann eine natürliche oder eine synthetische Substanz sein.
Aus der Gruppe der Substanzen, die eine Wirkung gegen pathogene Pilze besitzen, eine große Vielzahl unterschiedlicher Substanzen beinhaltend, sind die Phenazine besonders bevorzugt. Es sind zahlreiche Phenazinderivate und deren Synthesen bekannt. Viele Phenazine besitzen antibiotische Aktivität und insbesondere eine gegen Pilze gerichtete Aktivität. Zum Beispiel zeigt Phenazin-1-carboxamid (PCN) einen starken wachstumsinhibierenden Effekt auf zahlreiche pathogene Pilze, einschließlich Fusarium, Rhizoctonia, Pythium, Botrytis, Verticillium und Alternaria, sowie auf einige Bakterien, insbesondere Grampositive Bakterien.
So kontrolliert Phenazin-1-carboxamid z. B. effizient die Fuß- und Wurzelfäule bei Tomaten, die durch Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici verursacht wird. Phenazin-1-carboxamid besitzt einen starken wachstumsinhibierenden Effekt in einem weiten pH-Bereich, der zwischen pH 3,1 und 7,0 getestet wurde. PCN bekämpft außerdem effektiv das durch Pythium verursachte Absterben durch Pilzbefall vor und nach dem Aufgehen der Saat (z. B. bei Tomaten).
In einem weiteren Aspekt der Erfindung beinhaltet das Mineralwolle-Pflanzensubstrat in Bindung an die Mineralwolle einen Mikroorganismus, der einen biologisch aktiven Zusatzstoff gemäß obiger Definition produziert.
Insbesondere ist der Mikroorganismus ein Fungizid-produzierendes Bakterium. Eine Vielzahl von Bakterienarten produziert fungizide Substanzen. Beispiele hierfür sind Pseudomonas spp., Streptomyces spp., Microbispora spp., Brevibacterium spp., Streptosporangium spp., Sorangium spp., etc. Die fungizide Aktivität beruht auf der Produktion verschiedener Verbindungen einschließlich Phenazinderivaten. Vorzugsweise wird ein Mikroorganismus ausgewählt, der eine gute Befähigung zur Wurzelbesiedlung und/oder Mineralwollebesiedlung besitzt. Die Erfinder haben herausgefunden, dass die Besiedlung von Wurzeln und Mineralwolle eine wichtige Rolle bei der Biokontrolle spielt, vermutlich dadurch, dass ein Abgabesystem für gegen Pilze gerichtete Verbindungen bereitgestellt wird. Darüber hinaus wird ein Mikroorganismus, der eine gute Befähigung zur Wurzelbesiedlung und/oder Mineralwollebesiedlung besitzt, anhaften und an den Wurzeln verbleiben, wenn die Pflanzen auf frische Substrate überführt werden.
Ein Mikroorganismus der Pilz- und Bakterienerkrankungen sehr effizient kontrolliert, ist Pseudomonas chlororaphis PCL1391. Die fungizide Aktivität scheint auf der Produktion verschiedener Verbindungen zu beruhen, von denen Phenazin-1-carboxamid die bedeutendste ist. Der P. chlororaphis-Stamm PCL1391 ist am 16. Mai 2000 unter der Nummer CBS 102790 beim Centraalbureau Schimmelcultures in Baarn, NL hinterlegt worden.
PCL1391 schien ein effizienter Besiedler von Tomatenwurzeln und ein exzellenter Biokontrollstamm in einem F. oxysporum/Tomaten-Testsystem zu sein.
In einem weiteren Aspekt haben die Erfinder genetische Modifikationen von P. chlororaphis PCL1391 gefunden, die in einer Überproduktion von Phenazin-1-carboxamid resultieren. Dementsprechend werden derartige genetisch transformierte Formen von P. chlororaphis PCL1391 bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendet.

a. Die Produktion von Phenazin-1-carboxamid in P. chlororaphis PCL1391 steht unter der Kontrolle bakterieller Zell-Zell-Kommunikation (quorum sensing), bei der Acylhomoserinlactone (AHL) eine essentielle Rolle als Induktormoleküle spielen. Das Phenazinbiosynthese-Operon (phz) beinhaltet verschiedene Phenazinbiosynthesegene (phzA, phzB, etc.) und regulatorische Gene (phzR und phzI). Es ist gezeigt worden, dass multiple Kopien der Gene phzR und phzI, die in einer Überproduktion der AHLs resultieren, zu einer 3-fachen Überproduktion von Phenazin-1-carboxamid führen. Es wird in Erwägung gezogen, dass auch Bakterien im allgemeinen genetisch derart modifiziert werden können, dass sie multiple Kopien der Gene phzR und phzI beinhalten, was in einer Überproduktion an Antibiotikum resultiert.
b. Auch eine Mutation im lexA-Gen von PCL1391 resultiert in einer Überproduktion von AHLs und verursacht eine 10-fache Überproduktion von Phenazin-1-carboxamid durch PCL1391. Das lexA-Gen von PCL1391 ist ein Gen, das homolog zum lexA-Gen von P. aeruginosa ist. Die Erfinder sind die ersten, die herausgefunden haben, dass LexA an der Regulation der Antibiotikaproduktion beteiligt ist.

Wenn das Substrat der Erfindung verwendet wird, bei dem P. chlororaphis PCL1391 an die Mineralwolle gebunden ist, kann die Produktion von PCN gesteigert werden, indem die folgenden Bedingungen angewandt werden:

– Wachstum unter niedrigem Sauerstoffgehalt,
– Gegenwart von Glycerol, Fructose, Ribose oder Citronensäure im Nährmedium, und
– Gegenwart verschiedener Mineralien (Cu²⁺, Zn²⁺, Fe³⁺) im Nährmedium.

Es ist erkennbar, dass diese Faktoren die Expression der PCN-Biosynthesegene steigern.
Diese Erfindung zieht auch eine Überproduktion von Phenazinderivaten in Erwägung, die dadurch erreicht wird, dass eine Kombination von zwei oder mehr der obigen Maßnahmen, d. h. multiple Kopien der Gene phzR und phzI, eine Mutation im lexA-Gen und entsprechende Nährmediumsbedingungen kombiniert werden.
Mineralwolle-Pflanzensubstrate werden im allgemeinen produziert, indem Mineralwollefasern, die mit einem härtbaren Bindemittel versehen sind, vernetzt werden, was in einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle resultiert. Die Mineralwolle-Pflanzensubstrate der Erfindung, die aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle bestehen, können mittels verschiedener Verfahren hergestellt werden.
Nach Herstellung des aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle bestehenden Mineralwolle-Pflanzensubstrats kann dieses Substrat granuliert werden. Gemäß der Erfindung kann ein Mineralwolle-Pflanzensubstrat, bei dem die Mineralwolle in körniger Form vorliegt, ebenfalls verwendet werden.
Andere Mineralwolle-Pflanzensubstrate, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind Mineralwollesubstrate, die nicht aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle bestehen. In diesem Fall wird kein härtbares Bindemit tel bei der Herstellung der Mineralwolle-Pflanzensubstrate verwendet. Solche Substrate können entweder in loser oder in granulärer Form vorliegen.
Bei einem Aspekt der Erfindung wird der biologisch aktive Zusatzstoff oder der Mikroorganismus, der diesen Zusatzstoff produziert, direkt während der Herstellung des Mineralwollesubstrats zugegeben.
Dementsprechend stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Mineralwolle-Pflanzensubstrats der Erfindung bereit, bei dem der Zusatzstoff oder der Mikroorganismus, der diesen Zusatzstoff produziert, dem Mineralwolle-Pflanzensubstrat während der Herstellung dieses Substrats zugegeben wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Zusatzstoff oder der Mikroorganismus, der diesen Zusatzstoff produziert, Mineralwollefasern und einem härtbaren Binder zur Ausbildung eines Gemisches beigemischt und das besagte Gemisch gehärtet, um eine kohärente Matrix auszubilden.
Bei einer solchen Ausführungsform sollte der Mikroorganismus in Abhängigkeit von der jeweiligen Härtungstemperatur und der Härtungsdauer bis zu einem gewissen Grad thermoresistent sein. Je höher die Härtungstemperatur und je länger die Härtungszeit, um so thermoresistenter sollte der Mikroorganismus sein. Bei einem bestimmten Herstellungsansatz des Mineralwolle-Pflanzensubstrats der Erfindung sollte der Mikroorganismus z. B. 2 Minuten bei einer Maximaltemperatur von 230°C überleben.
Thermoresistente Mikroorganismen gemäß der obigen Beschreibung sind aus dem Stand der Technik bekannt [siehe J. W. Kloepper, 1993, "Plant growth promoting rhizobacteria as biological control agents", in "Soil Microbial Ecology – Applications in Agricultural and Environmental Management", herausgegeben von F. B. Metting, Jr., Seiten 255–274 (Marcel Dekker, Inc., New York); und General Microbiology, 1995, durch R. Y. Stanier, M. Doudoroff & E. A. Adelberg, Macmillan Student Editions].
Neben der Auswahl einer bestimmten Art eines Mikroorganismus mit einem gewissen Ausmaß an Thermoresistenz muss weiterhin eine Auswahl hinsichtlich der Lebenszyklusform des Mikroorganismus getroffen werden. Zum Beispiel besitzen Mikrosporen oder getrocknete Bakterien eine signifikant höhere Thermoresistenz als andere Lebenszyklusformen.
Bei einem anderen Aspekt der Erfindung wird der Zusatzstoff oder der Mikroorganismus, der diesen Zusatzstoff produziert, einem fertigen Mineralwolle-Pflanzensubstrat zugegeben, d. h. nach der Herstellung des Mineralwollesubstrats.
Dementsprechend stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Mineralwolle-Pflanzensubstrats der Erfindung bereit, bei dem der Zusatzstoff oder der Mikroorganismus, der diesen Zusatzstoff produziert, einem fertigen Mineralwollepflanzensubstrat zugegeben wird.
Ein solches fertiges Mineralwolle-Pflanzensubstrat kann ein gehärtetes (vernetztes) Mineralwollesubstrat sein, das aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle besteht und entweder körnig oder nicht-körnig ist, oder es kann ein Mineralwollesubstrat sein, das nicht aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle besteht und das entweder in loser oder in körniger Form vorliegt.
Falls der Zusatzstoff oder der Mikroorganismus, der diesen Zusatzstoff produziert, dem Mineralwolle-Pflanzensubstrat während dessen Herstellung zugegeben wird, müssen einige Dinge berücksichtigt werden.
Einer dieser Aspekte betrifft die Zeitspanne zwischen der Herstellung des Mineralwolle-Pflanzensubstrats, bei welcher Herstellung der Mikroorganismus zugegeben wird, und der tatsächlichen Anwendung des Mineralwollesubstrates zur Pflanzenzucht. Während dieser Zeitspanne kann es z. B. nötig sein, das Mineralwollesubstrat zu lagern und zu transportieren. Zum Beispiel kann es erforderlich sein, dass der Mikroorganismus in dem Mineralwolle-Pflanzensubstrat eine Zeitspanne von sechs Wochen nach der Herstellung des Substrats über lebt, wobei diese Zeitspanne eine konventionelle Zeitspanne der Lagerung und des Transports abdeckt.
Dieses Überleben hängt vom Typ der Lebenszyklusform des Mikroorganismus und/oder der Gegenwart jedweder Nährstoffquelle im Mineralwollesubstrat und/oder jedweder möglicher Trockenheit im Mineralwollesubstrat ab.
Wenn z. B. Mikrosporen oder getrocknete Bakterien verwendet werden, können solche Mikroorganismen eine längere Zeitspanne ohne jegliche Nährstoffquellen überleben, als Mikroorganismen, die in anderen Lebenszyklusformen vorliegen. Ein weiteres Beispiel ist ein Mikroorganismus, der dazu befähigt ist, relativ lange Zeitspannen von Trockenheit zu überleben.
Optional kann dem Mineralwollesubstrat eine Nährstoffquelle während der Herstellung des Substrats zugegeben werden, das heißt, zusammen mit dem Mikroorganismus selbst. Eine solche Nährstoffquelle kann z. B. ein Gemisch sein, das anorganische ebenso wie organische Materialien und auch den Mikroorganismus, der zugegeben werden soll, beinhaltet.
Ein solches Gemisch würde verschiedenen Zwecken dienen. Zum ersten würde ein solches Gemisch aufgrund der Anwesenheit von organischem Material als Nährstoffreservoir für den Mikroorganismus dienen.
Ferner dient ein solches Gemisch als gutes Habitat für den Mikroorganismus. Ein gutes Habitat für Mikroorganismen ist in Materialien verfügbar, die Poren mit einer durchschnittlichen Größe von 6 μm oder weniger enthalten. Sehr gute Bedingungen werden bereitgestellt, wenn die Poren kleiner als die dreifache Größe des Mikroorganismus, aber immer noch größer als der Mikroorganismus selbst sind. Ton (wie etwa Bentonit) ist ein Beispiel für ein Material, das eine durchschnittliche Porengröße von < 6 μm aufweist. Die Porosität und durchschnittliche Porengröße von Ton ist nicht statisch, sondern fluktuiert beträchtlich infolge der Anschwellung und Schrumpfung von Ton, die u. a. vom pH-Wert, dem EC-Niveau und dem Wassergehalt beeinflusst wird.
Weiterhin dient ein solches Gemisch als Hitzeschutz für den Mikroorganismus. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn ein Mineralwollesubstrat hergestellt wird, das aus einer kohärenten Matrix aus Mineralwolle besteht, und zwar dergestalt, dass der Einfluss der normalerweise hohen, bei der Herstellung eines solchen Substrats verwendeten Härtungstemperatur auf den Mikroorganismus vermindert wird.
Ein Beispiel für ein Gemisch, das den oben genannten Zwecken gerecht wird, ist ein Gemisch von Tonbestandteilen (wie etwa Bentonit), das anorganische und organische Materialien und den Mikroorganismus beinhaltet. Der Anmelder hat herausgefunden, dass solche Tonbestandteile, die einem Gemisch von Mineralwollefasern und einem härtbaren Bindemittel vor der Härtung/Vernetzung der Fasen zugegeben werden, geringere Höchsttemperaturen während des Härtens erreichen als die Mineralwollmatrix selbst, die bei dieser Härtung ausgebildet wird. Dadurch wird der in diesen Tonbestandteilen enthaltene Mikroorganismus in erheblichem Maße von den relativ hohen Härtungstemperaturen abgeschirmt.
Weiterhin können pharmazeutische und wasserlösliche Kapseln während der Herstellung des Mineralwolle-Pflanzensubstrats als vorübergehender Lebensraum für Mikroorganismen dienen.
In Abhängigkeit von der Lebenszyklusform des Mikroorganismus (z. B. Mikrosporen oder getrocknete Bakterien) kann es erforderlich sein, den Mikroorganismus nach der Installation des Mineralwolle-Pflanzensubstrats an der Zuchtstelle zu aktivieren bzw. auskeimen zu lassen. Eine solche Aktivierung kann durch eine normale erste Befeuchtung erreicht werden.
Nach Aktivierung des Mikroorganismus sollten Nährstoffe für den Mikroorganismus verfügbar sein, um dessen normale Lebensfunktionen aufrecht zu erhalten, bis von den Wurzeln stammendes organisches Material als Nährstoffquelle für den Mikroorganismus dienen kann. In der Zeitspanne, in der kein hinreichendes, von den Wurzeln stammendes organisches Material verfügbar ist, sollte eine Nährstoffquelle zugegeben werden.
Wenn dem Mineralwollesubstrat während dessen Herstellung eine Nährstoffquelle zugegeben wurde, ist es jedoch auch möglich, dass diese Nährstoffquelle als Nährstoffquelle während der Zeitspanne dient, die unmittelbar nach der Aktivierung des Mikroorganismus beginnt. Wenn ein Mikroorganismus, der einen biologisch aktiven, gegen pathogene Pilze wirksamen Zusatzstoff produziert, einem Mineralwolle-Pflanzensubstrat entweder während oder nach der Produktion des Substrats zugegeben wird, und dabei eine oder mehrere der obigen Maßnahmen angewandt werden, so kann ein Mineralwolle-Pflanzensubstrat entsprechend der Erfindung hergestellt werden, bei welchem der Mikroorganismus in einer an die Mineralwolle gebundenen Form vorliegt, die für die Verwendung bei der Bekämpfung pathogener Pilze geeignet ist, wenn das Mineralwollesubstrat für das Heranzüchten von Pflanzen verwendet wird.
Beispiel
Bei diesem Beispiel wurde Pseudomonas chlororaphis PCL1391 einem fertigen (d. h. vernetzten/gehärteten) Gesteinswolle-Pflanzensubstrat, bestehend aus einer kohärenten Matrix aus Gesteinswolle (hier im folgenden bezeichnet als "Gesteinswollesubstrat Nr. 1") und einem Gesteinswollesubstrat, das identisch mit dem Gesteinswollesubstrat Nr. 1 war, jedoch in granuläre Form überführt worden war (hier im folgenden bezeichnet als "Gesteinswollesubstrat Nr. 2"), zugegeben; beide Typen der Gesteinswollesubstrate sind in der diesem Beispiel vorangehenden Beschreibung beschrieben worden.
Die Ziele dieses Beispiels bestehen darin, die Besiedlung des Wurzelsystems einer Gurkenpflanze und der Gesteinswollesubstrate Nr. 1 und Nr. 2 durch Pseudomonas chlororaphis PCL1391 und die Produktion von Phenazin-1-carboxamid durch P. chlororaphis PCL1391 in den Gesteinswollesubstraten Nr. 1 und Nr. 2 zu bestimmen.
P. chlororaphis PCL1391 wurde aus dem Wurzelsystem von Tomatenpflanzen isoliert, die auf einer kommerziellen Anbaufläche in Andalusien, Spanien, gezüchtet worden waren. Dieser Stamm schützt Tomatenpflanzen gegen die Fuß- und Wurzelfäule, die durch Fusarium oxysporum. f. sp. radicis-lycopersici verursacht wird. Der Stamm inhibiert auch das Wachstum anderer Pflanzenpathogene, einschließlich Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea und Gaeumannomyces graminis. Die für die Antipilzwirkung verantwortliche Verbindung wurde als Phenazin-1-carboxamid identifiziert.
Material und Methoden
Verwendete Stämme
Der Wildtyp-Stamm P. chlororaphis PCL1391 wurde für die Animpfung von Gurkenpflanzen-Nährlösung verwendet. Die Produktion der gegen Pilze wirksamen Verbindung Phenazin-1-carboxamid befähigt diesen Stamm, das Wachstum einer Anzahl von pflanzenpathogenen Pilzen zu inhibieren. Um diesen Stamm im Wurzelsystem und in der Nährlösung zu verfolgen, wurde außerdem PCL1392 verwendet. PCL1392 ist ein durch Zufallsinsertion des Transposons Tn5lacZ-markiertes Derivat des Wildtyps PCL1391 mit konstitutitiver lacZ-Expression. [siehe R. Simon et al., "A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria", Biotechnology, 1983, 1: 784–791; und T. F. C. Chin-A-Woeng et al., "Root colonization by phenazine-1-carboxamide-producing bacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is essential for biocontrol of tomato foot and root rot", Mol. Plant-Microbe Interact., 2000, 13: 1340–1345].
Samen und Wachstumsbedingungen
Die Nährlösung für das Wachstum der Gurkenpflanzen wurde gemäß dem Protokoll von Rockwool/Grodan hergestellt. Die Zusammensetzung dieser Nährlösung ist in Tabelle A angegeben. Die durch Verwendung dieser Nährlösung in der Wurzelumgebung erreichten Werte sind ebenfalls in Tabelle A angegeben. Gurkensamen des Typs Euphoria RZ wurden von Rockwool/Grodan zur Verfügung gestellt. Tomatensamen des Cultivars Carmello stammten von der Novartis Seeds B. V.
Tabelle A – Zusammensetzung der Nährlösung für das Wachstum von Gurkenpflanzen
Die ersten Versuche wurden sowohl mit dem Gesteinswollesubstrat Nr. 1 als auch mit dem Gesteinswollesubstrat Nr. 2 durchgeführt.
Es wurde ein Gurkensamen pro Topf ausgesät und die Töpfe mit einer Schicht von Vermiculit bedeckt. Der Ansatz wurde in einen Wuchscontainer eingebracht, und die Sämlinge bei 23°C für 12 bis 14 Tage in einer Wachstumskammer herangezogen (70% relative Luftfeuchtigkeit, 16/8 Stunden Tag/Nacht-Zyklen).
Animpfung von Nährlösung
Bakterien wurden zu der Gurkenpflanzennährlösung in einer Endkonzentration von 2 × 10⁶ CFU/ml hinzugegeben. Die Lösung wurde dann dazu benutzt, das Gesteinswollesubstrat zu befeuchten. Die Pflanzen wurden von der Unterseite aus bewässert.
Bestimmung der Bakterienanzahl
Die Bakterienanzahl wurde durch Verdünnungsplattierung auf King's Medium B bestimmt und als log der Kolonie-bildenden Einheiten pro ml (log₁₀ CFU/ml) ausgedrückt. Die Bakterienanzahl auf dem Wurzelsystem wurde bestimmt, indem 1 cm große Wurzelteile entnommen und unter Verwendung eines Eppendorf-Schüttlers in 1,0 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) geschüttelt wurden, gefolgt von Verdünnungsplattierung. Die jeweilige Bakterienanzahl auf der Wurzel wurde dann als log₁₀ CFU/cm der Wurzel ausgedrückt.
Extraktion und Bestimmung von Phenazin-1-carboxamid aus dem Gesteinswollesubstrat
Phenazin-1-carboxamid wurde aus dem Gesteinswollesubstrat und der Nährlösung mit einem der Nährlösung entsprechenden Volumen Toluol extrahiert. Die Toluolphase wurde durch Verdampfen entfernt und der Rückstand in 2 ml 50% Acetonitril gelöst. Es wurde jeweils ein Volumen von 50 μl der Probe mittels HPLC analysiert.
Ergebnisse
Wachstum von Gurken- und Tomatenpflanzen
Sowohl Gurken- als auch Tomatenpflanzen zeigten bei dem oben beschriebenen Versuchsaufbau ein gutes Wachstum.
Die Hauptwurzel kann sowohl von dem Gesteinswollesubstrat Nr. 1 als auch von dem Gesteinswollesubstrat Nr. 2 hinreichend intakt isoliert werden. Dies machte es möglich, die Anzahl an Bakterien zu bestimmen, die auf den verschiedenen Teilen der Hauptwurzel anwesend waren.
Im Vergleich dazu wuchsen Tomatenkeimlinge bei dem vorliegenden Aufbau nicht optimal, und das Wurzelsystem konnte nicht zur Überprüfung entnommen werden, da es zu zerbrechlich war.
Detektion von P. chlororaphis PCL1391 (PCL1392) auf der Gurkenwurzel und auf dem Gesteinswollesubstrat
Da der Versuchsaufbau kein keimabweisendes System darstellte, war es nicht überraschend, dass eine Kontamination durch andere Bakterien beobachtet wurde, nachdem eine Verdünnungsplattierung der Wurzelabschnitte oder der Nährlösung erfolgt war. Um PCL1391 von den residenten Bakterien zu unterscheiden, wurde PCL1392, ein mit Tn5lacZ-Tag versehenes Derivat von PCL1391 zur Überwachung der Versuche verwendet.
Effekt der Animpfung auf die Besiedlung mit PCL1391 (PCL1392)
Um die Verteilung der Bakterien auf dem Gurkenwurzelsystem und in der Nährlösung zu untersuchen, wurden 1 cm Wurzelabschnitte an der Basis der Hauptwurzel, in der Mitte der Wurzel und an der Wurzelspitze der Gurkensämlinge entfernt und die Anzahl der Bakterien bestimmt. Nach dem Wachstum wurden außerdem Proben aus der Nährlösung entnommen. (siehe Tabelle B).
Tabelle B Bakterienanzahl auf dem Hauptwurzelsystem von Gurkensämlingen und in der Nährlösung nach 14 Tagen Wachstum
Es gibt keinen signifikanten Anstieg der Bakterienzahlen auf dem Wurzelsystem, wenn das System nach einer Woche Wachstum zum zweiten Mal angeimpft wird (mit derselben Anzahl an Bakterien, die zusammen in 500 ml Nährlösung zur Verfügung gestellt werden).
Auswirkung der Animpfung mit P. chlororaphis PCL1391 (PCL1392) auf das Pflanzenwachstum
Das Wachstum der Gurkensämlinge wurde durch Bestimmung der Pflanzenmasse der Sämlinge ohne das Wurzelsystem bewertet. Nach 14 Tagen betrug die durchschnittliche Biomasse eines Sämlings, der in nicht-angeimpfter Nährlösung gewachsen war, 0,73 ± 0,15 g und die eines Sämlings, der in Gegenwart des Stammes PCL1392 gewachsen war, 1,04 ± 0,24 g (Anzahl der getesteten Pflanzen = 30).
Phenazin-1-carboxamid-Produktion im Gesteinswollesubstrat
Die HPLC-Analyse von Toluolextrakten sowohl der Nährlösung als auch der Gesteinswollesubstrate Nr. 1 und Nr. 2, von denen die Substrate das Wurzelsystem eines Gurkensämlings enthielten (Gesamtanzahl der getesteten Gurkensämlinge = 40), zeigten eine Verbindung, die mit einer Retentionszeit von etwa 16 min eluierte (siehe 11A). Das Spektrum und die Retentionszeit dieser Verbindung (siehe 11B) war identisch zu derjenigen von Standard- Phenazin-1-carboxamid (siehe 11C). Beide Spektren zeigten Absorptionsmaxima bei 251 und 370 nm, was charakteristisch für Phenazin-1-carboxamid ist (siehe "High performance liquid chromatographic analysis of Pseudomonas aeruginosa phenazines", J. Chromatogr. A, R. O. Fernandez und R. A. Pizarro, 1977, 771 (1–2): 99–104).
Die obigen Daten zeigen, dass die Verbindung in der Nährlösung und in der Gesteinswolle der Gesteinswollesubstrate Nr. 1 und Nr. 2 tatsächlich Phenazin-1-carboxamid ist.
Die Menge des produzierten Phenazin-1-carboxamids wurde unter Verwendung einer Eichkurve quantifiziert, die mittels bekannter Konzentrationen an Phenazin-1-carboxamid aufgetragen worden war. Es wurde für die Nährlösung, in der Gurkensämlinge gewachsen waren, eine produzierte Menge von 0,2 mg/l berechnet. Die HPLC-Analyse von Extrakten aus einem nicht-angeimpften Kontrollexperiment zeigte keine Anwesenheit von Phenazin-1-carboxamid an.
Schlussfolgerungen
Die Anzahl an P. chlororaphis- PCL1391 (PCL1392) Bakterien in den Gesteinswollesubstraten Nr. 1 und Nr. 2 bleibt bis mindestens 14 Tage nach der Animpfung stabil (längere Testphasen wurden nicht in dem Versuch verwendet).
Das Wurzelsystem, einschließlich neu gewachsener Wurzelteile, der getesteten Pflanzen wird von den besagten Bakterien gut besiedelt, wobei die meisten lebensfähigen Bakterien an die Wurzel angeheftet vorliegen, was anzeigt, dass die besagten Bakterien in den Gesteinswollesubstraten Nr. 1 und Nr. 2 überleben und sich vermehren.
Die besagten Bakterien produzieren unter den getesteten Wachstumsbedingungen Phenazin-1-carboxamid, wobei diese Verbindung das Wachstum der getesteten Pflanzen stimuliert (um etwa 30% im Vergleich zu der Kontrolle).
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Phenazin-1-carboxamid (und damit auch der Bakterienstamm, der dieses produziert) an die Gesteinswolle in den Gesteinswollesubstraten Nr. 1 und Nr. 2 gebunden ist.
Da der Bakterienstamm, der Phenazin-1-carboxamid produziert, an die Gesteinswolle gebunden ist, können präzisere Dosen des besagten Bakterienstamms appliziert werden. Da der Bakterienstamm an die Gesteinswolle gebunden ist, ist es weiterhin einfacher, diesen Bakterienstamm mit einer initialen Nährstoffquelle zu kombinieren, die der Gesteinswolle auch zugegeben werden kann, bevor das Gesteinswollesubstrat als Pflanzensubstrat verwendet wird. Weiterhin besteht die Möglichkeit, den getrockneten Bakterienstamm, der an die Gesteinswolle gebunden ist, auf kontrollierte Weise zu aktivieren.
Die folgenden Beispiele, umfassend "Versuchsdurchführung" und "Ergebnisse" sind für genetisch modifizierte Mikroorganismen angegeben, z. B. für genetisch modifizierte Mikroorganismen gemäß der obigen Beschreibung aus dem Beschreibungsteil, der dem obigen Beispiel vorangeht. Der Anmelder hat herausgefunden, dass diese genetisch modifizierten Mikroorganismen gut anstelle des Wildtyp Stammes P. chlororaphis PCL1391 für das obige Beispiel verwendet werden können, und dass mit diesen genetisch modifizierten Mikroorganismen sogar bessere Wachstumsresultate erzielt werden.
Versuchsdurchführung
Mikroorganismen und Medien
Die verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in Tabelle 1 aufgelistet. King's Medium B (KB) (King et al. 1954) wurde für die Routinekultivierung der Pseudomonas-Stämme verwendet. E. coli und Chromobacterium violaceum wurden in Luria-Bertani (LB)-Medium (Sambrook et al 1989) herangezogen. Agrobacterium tumefaciens wurde in YMB-Medium (Smit et al. 1987) herange zogen. Feste Wachstumsmedien enthielten 1,8% Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Kanamycin (50 μg/ml), Tetracyclin (80 μg/ml), Chloramphenicol (20 μg/ml) und Carbenicillin (50 μg/ml) wurden für die Antibiotikaselektion zugegeben, wo dies sinnvoll war.
DNA-Modifikationen
Verdaue mit Restriktionsendonucleasen, Ligation, sowie die Transformation von E. coli-Zellen mit Plasmid DNA wurden unter Verwendung molekularbiologischer Standardprotokolle (Sambrook et al. 1989) durchgeführt. Die Nucleotidsequenzierung wurde durch Eurogentec B. V. (Herstal, Belgien) unter Verwendung der auf AB1377-basierenden Fluoreszenzsequenziertechnik durchgeführt. Die Computeranalyse der Protein- und Nucleotidsequenzen wurde mittels des Wisconsin-Package, Version 10.0 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA) durchgeführt.
Bioassays auf Autoinduktor-Aktivität
Zur Detektion von Autoinduktor-Aktivität mittels des Chromobacterium violaceum N-AHL Reporter-Assay (Milton et al. 1997) wurden Übernachtkulturen von Chromobacterium in LB-Medium herangezogen, das mit Kanamycin (50 μg/ml) supplementiert war. LB-Agarplatten wurden mit einer Schicht aus 0,8% LB-Top-Agar, gemischt mit einer 16h-Kultur des Chromobacterium Indikatorstammes CV026 (200 μl/ml) (McClean et al. 1997) überschichtet. Es wurde ein Volumen von 20 μl einer 100 μl HPLC-Probe in in den Agar eingebrachten Vertiefungen auf Autoinduktor-Aktivität getestet. Die Aktivität der Fraktionen wurde nach 16-stündigem Wachstum bei 28°C anhand des Sichtbarwerdens eines violetten Hofes um die Vertiefung, verursacht durch die Produktion von Violascein als Ergebnis der Aktivierung der Reportergene in dem Chromobacterium-Stamm, beurteilt. Autoinduktor-Aktivität wurde bei der C18-Dünnschichtchromatographie (TLC) (Merck, Darmstadt, Deutschland), die in Methanol/Wasser (60/40 Vol/Vol) entwickelt wurde, detektiert, indem die TLC-Platte mit einer 0,8% Schicht aus LB-Top-Agar überschichtet wurde, die gemäß obiger Beschreibung CV026-Zellen enthielt, gefolgt von einer Inkubation bei 28°C für 16 Stunden und unter Analyse auf das Erscheinen violetter Flecken.
Autoinduktor-Indikator-Assays, basierend auf dem das Plasmid pSB401 verwendenden Photobacterium (lux)-System (Winson et al. 1998) und dem das Plasmid pSB1142 verwendenden P. aeruginosa Elastase (las)-Systems (T. Perehinec, Division of Food Sciences, Univ. of Nottingham, pers. Schriften) wurden in ähnlicher Weise wie der oben für Chromobacterium beschriebene Assay durchgeführt. Es wurde ein Volumen von 50 μl einer 16h-Kultur von DH5α[pSB401] oder DH5α[pSB1142] mit 3,0 ml 0,8% LB-Top-Agar gemischt und auf LB-Agarplatten gegossen, die Chloramphenicol (20 μg/ml) enthielten. Ein Volumen von 20 μl einer Probe wurde in die Probenvertiefungen eingebracht und die Platten für 16 h bei 28°C inkubiert. Lumineszenz wurde detektiert, indem ein photographischer Film (Fuji RX, Tokio, Japan) am Boden der Testplatten angebracht wurde.
Die Induktion des Agrobacterium tra-Systems wurde unter Verwendung des A. tumefaciens Stammes NT1 detektiert, der das Plasmid pJM749 enthält, welches einen mit einem tra-Gen fusionierten lacZ-Reporter aufweist, wobei die Expression des tra-Gens von TraR (lokalisiert auf dem Plasmid pSVB33) und der Gegenwart einer ausreichenden Konzentration an Autoinduktor abhängt (Piper et al. 1993). Agrobacterium wurde drei Tage nach dem Ausstreichen von den YMB-Platten abgekratzt und in sterilem Wasser bis auf eine optische Dichte (OD₆₂₀) von 0,1 resuspendiert. Ein Volumen von 100 μl der Bakteriensuspension wurde mit 3,0 ml Top-Agar gemischt und auf YMB-Platten, enthaltend 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactopyranosid (X-Gal), ausgegossen, um die Expression als blaue Färbung zu detektieren. Die Proben wurden gemäß der obigen Beschreibung für den Chromobacterium-Bioassay getestet. Blaue Zonen waren bei Inkubation bei 28°C nach 24–48 h sichtbar.
Reinigung von Autoinduktoren
Zur Isolierung von Autoinduktor-Aktivität wurden drei Volumina Dichlormethan zu sieben Volumina des Überstandes einer 72h KB-Kultur von PCL1119 hinzu gegeben und für eine Stunde geschüttelt (120 rpm). Nach dieser Extraktion wurde die organische Phase abgenommen und durch Verdampfung im Vakuum (McClean et al. 1997) getrocknet. Rohextrakte des Überstandes wurden erneut in 100 μl 100% Acetonitril gelöst und unter Verwendung entweder von C18-TLC oder Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) aufgetrennt. Die C18-TLC-Platten (Merck, Darmstadt, Deutschland) wurden in einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/Wasser (60 : 40 Vol/Vol) entwickelt. Nach der Entwicklung wurden die Platten getrocknet und mit einer Schicht aus Top-Agar, enthaltend einen der Indikatorstämme, überschichtet und für 16h bei 28°C inkubiert. Die HPLC wurde unter Verwendung einer Alltech Hypersil ODS 5 μm 250 × 4,6 mm Säule (Alltech Associates, Inc, Deerfield, IL, USA) und eines linearen 20% bis 90% (Vol/Vol) Gradienten aus Acetonitril in Wasser bei einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt. Nach der Selektion Aktivität enthaltender Fraktionen wurden die Proben vereint, erneut auf die Säule geladen und mittels eines isokratischen Gradienten aus 35% Acetonitril eluiert. Die UV-Detektion erfolgte unter Verwendung eines Pharmacia RSD 2140 Diodenarray-Detektors (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einer Analyse der Wellenlängen von 190 bis 400 nm. Es wurden Fraktionen von je 1,0 ml gesammelt und unter Verwendung des Chromobacterium Biosensors auf Gegenwart von Autoinduktor-Aktivität untersucht. Schließlich wurden die aktiven Fraktionen für massenspektrometrische Analysen vereint.
Analyse durch Nanoelektrospray-Vierpol-Flugzeit-Massenspektrometrie
Es wurden kollisions-induzierte Elektrospray-Dissoziations-Tandem-Massenspektren mit einem „Micromass Q-TOF hybrid quadrupole Time-of-Flight tandem mass spectrometer" (Wythenshawe, (UK)) erhalten, das mit einem Z-Spray Probeneingabe-System in einer Nanofluss-Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet war. Das Massenspektrometer wurde in der auf positiven Ionen basierenden Weise betrieben. Die Kegelspannung wurde auf etwa 25 V eingestellt und eine Kapillarspannung von 1,5 kV verwendet. Argon wurde als Kollisionsgas verwendet und die Spektren bei Verwendung einer Kollisionsenergie von 10 eV erhalten. Die Spektren wurden über den Tof-Analysator ermittelt und alle 2,4 Sekunden über den m/z-Bereich 35–250 integriert. Die Daten wurden aufgezeichnet und unter Verwendung der MassLynx Software, Version 3.1 weiterverarbeitet. Die Massen-Kalibrierung erfolgte durch mehrfache Ionen-Messung einfach geladener Natrium- und Caesiumiodid-Signale. Die Proben wurden in 10 μl Methanol gelöst, wobei hiervon zur Probenzufuhr 3 μl in die goldbeschichteten Nanospray-Glaskapillaren geladen wurden.
Isolierung von Mutanten mit Beeinträchtigung der PCN-Biosynthese
Eine aus 18.000 Transposon-Trägern bestehende Mutantenbibliothek von PCL1391 wurde unter Verwendung von pRL1063a (Wolk et al. 1991), beinhaltend ein Tn5-Transposon, das promotorfreie luxAB-Reportergene trägt, etabliert. Die Mutanten wurden auf Abwesenheit von, bzw. auf Veränderung hinsichtlich der Farbproduktion entweder auf LB-Agarplatten oder in 200 μl flüssigen KB-Kulturen, die in 96 Well-Mikrotiterplatten für 3 Tage gewachsen waren, selektiert. Die phänotypische Charakterisierung der Mutanten auf Produktion von PCN, Cyanwasserstoff, Chitinase oder Protease, sowie auf Motilität (Chin-A-Woeng et al. 1998) und auf Befähigung zur Besiedlung von Tomatenwurzeln (Simons et al. 1996) wurde gemäß bestehender Beschreibung durchgeführt.
Da das Tn5-Transposon in den Transkonjuganten einen Replikationsursprung enthält, der in E. coli funktionell ist (Wolk et al. 1991), wurden chromosomale DNA-Regionen, die das Transposon flankieren, aus dem Genom erhalten, indem ein Ausschneiden mit EcoRI, gefolgt von Zirkularisierung und Transfer in E. coli erfolgte sowie außerdem eine Analyse durch Nukleotidsequenzierung. Die Nukleotidsequenzierung der flankierenden Regionen wurde unter Verwendung der singulären Primer oMP458 (5'-TACTAGATTCAATGCTATCAATGAG-3') und oMP459 (5'-AGGAGGTCACATGGAATATCAGAT-3'), die auf das linke, bzw. rechte Ende des Tn5-Transposons gerichtet sind, durchgeführt.
Isolierung und Identifizierung von luxI und luxR Homologen
Eine Plasmidbibliothek chromosomaler Fragmente des Stammes PCL1391 wurde konstruiert, indem chromosomale DNA, die mit EcoRI verdaut worden war, in die multiple Klonierungsstelle von pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, USA) kloniert wurde. Nach der Elektroporation dieser Fragment-Bibliothek in einen E. coli lux-Reporterstamm, enthaltend pSB401, und Übernachtwachstum auf LB-Agarplatten, wurden Klone, die den Luciferase-Reporter induzierten, unter Verwendung eines photographischen Films identifiziert. Um den E. coli-Stamm von dem pSB401 Reporter-Konstrukt zu befreien, wurde die Chloramphenicol-Selektion weggelassen, während die Carbenicillin-Selektion aufrecht erhalten wurde. Die Nukleotidsequenz des chromosomalen Inserts in dem verbleibenden Plasmid wurde unter Verwendung von Standard-Primern, z. B. dem universellen und dem -40 reversen Primer, welche die multiple Klonierungsstelle von pBluescript flankieren, bestimmt.
Expression von biolumineszenten Tn5luxAB Reporter-Stämmen
Die Expression von mit Tn5luxAB Tag versehenen Genen wurde durch Quantifizierung der Biolumineszenz während der Kultur bestimmt. Zellen aus Übernacht-Kulturen wurden mit frischem Medium gewaschen und auf eine optische Dichte (OD₆₂₀) von 0,1 verdünnt. Die Kulturen wurden in LB-Medium in einem Volumen von 10 ml unter heftigem Schütteln herangezogen. Das Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte (OD₆₂₀) in regelmäßigen Intervallen verfolgt und dreifache 100 μl Proben entnommen, um die Lumineszenz zu quantifizieren. Es wurde ein Volumen von 100 μl einer n-Decyl-aldehyd Substratlösung [0,2% n-Decyl-aldehyd (Sigma, St. Louis, MO, USA) in einer 2,0% Rinderserum-Albumin (BSA)-Lösung] zugegeben. Nach gründlichem Mischen wurde die Biolumineszenz unter Verwendung eines Lumineszenz-Zählers (MicroBeta 1450 TriLux, Wallac, Turku, Finnland) bestimmt.
Die synthetischen N-AHL Moleküle N-Butanoyl-L-homoserin-lacton (BHL), N-Hexanoyl-L-homoserin-lacton (HHL), N-Octanoyl-L-homoserin-lacton (OHL), N-Decanoyl-L-homoserin-lacton (DHL), N-Dodecanoyl-L-homoserin-lacton (dDHL), N-oxo-Hexanoyl-L-homoserin-lacton (OHHL), N-oxo-Octanoyl-L-homoserin-lacton (OOHL) und N-oxo-Decanoyl-L-homoserin-lacton (ODHL) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von P. Williams, University of Nottingham) wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Tn5luxAB-Reporterstämme zu induzieren. Die Zellen wurden über Nacht in LB-Medium herangezogen, gewaschen und mit frischem Medium, das entweder mit synthetischem/synthetischen N-AHL(s)(5 μM) oder mit „benutztem" Wachstumsüberstand (10% Vol/Vol) supplementiert war, auf eine Zelldichte von 0,1 bei OD₆₂₀ resuspendiert und bis zur stationären Wachstumsphase vermehrt. Die Lumineszenz wurde mit jedem Anstieg der OD₆₂₀ um 0,1 Einheiten bestimmt und mit derjenigen der Kontrolle ohne zugesetztes N-AHL verglichen.
Konstruktion von gacS-Mutanten
Gerichtete Mutagenese in dem gacS homologen Gen wurde unter Verwendung von pMP6014, einem plC20R-Suizidkonstrukt, enthaltend ein internes 0,3 kb PCR-Fragment des gacS-homologen Gens von Stamm PCL1391 und eine Tetracyclin-Resistenzkassette, durchgeführt. Die PCR-Primer enthielten KpnI- und EcoRI- Restriktionsstellen (unterstrichen) und paarten mit den Nukleotidpositionen 1084 bis 1103 (5'-CCGGAATTCGAGCCACGAAATCCGTACCC-3') bzw. 1294 bis 1313 (5'-CGGGGTACCTCAGGGTGTCCTGCAACAGG-3') des gacS homologen Gens von Stamm PCL1391. Das Konstrukt wurde mittels Elektroporation in den Stamm PCL1391 und dessen Derivate transformiert, und resistente Kolonien, die aus der chromosomalen Integration resultierten, wurden auf LB-Agarmedium, das für PCL1391 mit Tetracyclin (160 μg/ml) oder für die Derivate mit Kanamycin (50 μg/ml) und Tetracyclin supplementiert war, selektiert. Die Transformanten wurden mittels Southern Hybridisierung auf korrekte Rekombination analysiert. Die Auswirkung einer Mutation im gacS-Gen auf die Expression der Gene wurde bestimmt, indem die Biolumineszenz des luxAB-Reporters während der Kultur in mit 100 μM FeCl₃ supplementiertem KB-Medium quantifiziert wurde.
Konstruktion von lexA-Mutanten
Eine ähnliche Mutagenesestrategie wie die oben beschriebene wurde zur Einführung einer Mutation in das lexA homologe Gen verwendet. Das lexA-Fragment für die Konstruktion des Suizid-Plasmids pMP6015 wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer oMP506 (5'-CCCAAGCTTCCGCCTGACAAACACTTG-3') und oMP507 (5'-CCCAAGCTTATTTCGATCGCGCCCTTG-3') aus dem lexA homologen Gen des Stammes PCL1391 erhalten.
Mikroorganismen und Medien
King's Medium B (KB)(King et al. 1954) wurde routinemäßig für die Kultur der Pseudomonas-Stämme verwendet. Die Medien wurden, wenn erforderlich, mit 1,8% Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) verfestigt. Kanamycin (50 μg/ml) wurde dort, wo es sinnvoll war, zur Antibiotika-Selektion zugegeben. Die Expression der PCN- Biosynthesegene wurde in Medium nach Definition von Vogel-Bonner (Smit et al. 1987) und in KB-Medium bestimmt.
In vitro Expression der Tn5luxAB-Reporterstämme
Die Expression der mit Tn5luxAB-Tag versehenen Gene wurde durch Quantifizierung der Biolumineszenz während des Wachstums in den Flüssigkulturen bestimmt. Zellen aus Übernachtkulturen, die in dem getesteten Medium vorgezüchtet worden waren, wurden mit frischem Medium gewaschen und auf eine optische Dichte (OD₆₂₀) von 0,1 verdünnt. Die Zellen wurden in einem Volumen von 10 ml unter intensiver Belüftung herangezogen. Auf die Zellvermehrung folgte die Messung der optischen Dichte (OD₆₂₀) in regelmäßigen Zeitabständen. Es wurden dreifache 100 μl-Proben entnommen, um die Lumineszenz zu quantifizieren. Als Substrat wurde der Probe ein Volumen von 100 μl einer 0,2% Lösung von n-Decyl-aldehyd (Sigma, St. Louis, MO) in 2,0% Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben. Nach gründlichem Mischen wurde die Biolumineszenz unter Verwendung eines Lumineszenzzählers (MicroBeta 1450 TriLux, Wallac, Turku, Finnland) bestimmt.
Um den Einfluss von Komponenten aus Wurzelausscheidungen zu testen, wurden Äpfelsäure, L-pyro-Glutaminsäure, Fumarsäure, Citronensäure, Propionsäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Glucose, Ribose, Xylose, Sucrose, Fructose oder Maltose jeweils einzeln bei einer Endkonzentration von 2 μM als Kohlenstoffquelle in Vogel-Bonner-Medium verwendet. Das Medium wurde mit 1,0% Proteose-Pepton supplementiert, da ansonsten weder der Reporterstamm PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) noch der parentale Wildtyp-Stamm PCL1391 eine OD₆₂₀ von 1,0 in Minimalmedium erreichen würden. Das Wachstum in 1,0% Proteose-Pepton wurde als Kontrolle verwendet.
Die Quantifizierung der Expression der PCN-Biosynthesegene unter dem Einfluss von Metallionen erfolgte in Vogel-Bonner-Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle, enthaltend 100 μM FeCl₃, Thiamin (2 mg/l) und Biotin (2 mg/l). Standard Vogel-Bonner-Medium enthält ZnSO₄(5 μM), CuSO₄ (2 μM), MnSO₄ (30 μM) und NaMoO₄ × H₂O (20 μM). Um den Einfluss der Gegenwart von einzelnen Metallionen auf die phzB-Expression zu bestimmen, wurden einzelne Ionen entweder weggelassen oder in einer zehnfach (Cu²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, MoO₄ ^–) oder hundertfach (Fe³⁺) erhöhten Konzentration zugegeben.
Um den Einfluss einer niedrigen Sauerstoffspannung zu testen, wurden Stämme in 40 ml KB-Medium in geschlossenen Glasröhrchen unter einem kontinuierlichen Durchfluss von 1,0% Sauerstoff und 99% Stickstoff gemäß der Beschreibung von Camacho et al. (eingereicht) oder als Kontrolle in normaler Luft herangezogen. Die Messung der Biolumineszenz erfolgte wie oben beschrieben.
Ergebnisse
Reinigung und Identifizierung von durch P. chlororaphis produzierten Autoinduktoren
Die Produktion von PCN im P. chlororaphis Stamm PCL1391 (Tabelle 1) schien abhängig von der Zelldichte zu sein und war daher vermutlich dem quorum sensing (Chin-A-Woeng et al., eingereicht) unterworfen. Um die Produktion von Autoinduktor(en) durch den Stamm PCL1391 zu analysieren, wurde ein Dichlormethan-Rohextrakt von benutztem Kulturmedium einer 72h-Kultur des Stammes PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) (Chin-A-Woeng et al. 1998) verwendet. Der Stamm PCL1119, ein PCL1391-Derivat, der aufgrund einer Mutation in dem biosynthetischen Gen phzB (Chip-A-Woeng et al. 1998) nicht dazu befähigt ist, PCN zu produzieren, wurde für die Autoinduktor-Reinigung verwendet, um das Problem einer gemeinsamen Reinigung von PCN und Autoinduktor(en) im Wildtyp-Stamm zu überwinden. PCL1119 zeigte im Vergleich zum Wildtyp-Stamm keine Veränderung hinsichtlich der Autoinduktor-Produktion. Extrakte von Kulturüberständen des Stammes PCL1119 wurden auf Induktion einer Anzahl von Reporter-Systemen des quorum sensing getestet, einschließlich denen für Chromobacterium violaceum Pigmentierung (McClean et al. 1997), Photobacterium fisheri Lumineszenz (lux) (Stevens und Greenberg 1997), Pseudomonas aeruginosa Elastase (las) (Pearson et al. 1997) und Agrobacterium tumefaciens Konjugation (tra) (Hwang et al. 1995). Nach Auftrennung unter Verwendung von C18 Dünnschichtchromatographie (TLC) wurden drei Flecke in dem Chromobacterium Überschichtungssystem detektiert (1, Spur 4). Ein wesentlicher Fleck mit dem R_f-Wert 0,4 wanderte zu der gleichen Position wie synthetisches HHL (1, Spur 2). Wenn eine große Menge der Probe auf die TLC-Platte aufgebracht wurde, wurde ein zweiter Fleck mit einem R_f-Wert von 0,57 entdeckt, der zu der gleichen Position wanderte wie synthetisches BHL (1, Spur 1). Ein dritter Fleck mit einem R_f-Wert von 0,13 wurde als co-migrierend mit synthetischem OHL (1, Spur 3) beobachtet. Extrakte von benutztem Kulturüberstand waren außerdem dazu in der Lage, das lux-System zu induzieren, während sie in den las- und tra-Systemen nur schwache Signale induzierten (Daten nicht dargestellt). Keines der Reportersysteme wurde durch Dichlormethanextrakte nicht angeimpfter KB oder LB Wachstumsmedien induziert.
Die Verbindung, die mit einem R_f-Wert von 0,4 migriert, wurde mittels HPLC gereinigt und unter Verwendung von auf positiven Ionen basierender Nanoelektrospray Kollisionsinduzierter Dissoziations (CID)-Tandem-Massenspektrometrie auf einem Hybrid-Vierpol-Flugzeit-Massenspektrometer analysiert, der in der Tandem-Funktionsweise außerordentliche Empfindlichkeit ermöglicht. Die Instrumenteneinstellungen wurden unter Verwendung einer Lösung eines HHL-Standards (1,3 ng/μl) optimiert, wobei diese Lösung eine Konzentration aufwies, die etwa einem Zehntel dessen entsprach, was zur Erzeugung einer Antwort in dem Bioassay entsprechend dem Assay für die aus Stamm PCL1391 isolierte Fraktion notwendig gewesen wäre. Nach der Optimierung wurde ein CID-Spektrum des Standards aufgenommen, wobei hier eine Fragmentierung durch Kollision mit einem positiven Argon-Druck induziert wurde (2A). Die Nadel, die den Standard enthielt, wurde dann verworfen. Es wurde dann ein CID-Spektrum für dieselbe Vorläufer-Ionenmasse aufgenommen, wobei aber nur Lösungsmittel eingeführt wurde, um sicherzustellen, dass keine Kontamination des Instruments mit dem Standard erfolgt war und um jegliche aus dem Lösungsmittel stammende Hintergrundsignale zu identifizieren. Es wurden in diesem Leerspektrum keine HHL entsprechenden Ionen beobachtet, obwohl ein Ion bei m/z 107, das auch im HHL-Spektrum beobachtet wurde, anwesend war. Die bioaktive Fraktion wurde dann über eine frische Nadel in das Massenspektrometer eingeführt und ein Massenspektrum aufgezeichnet. Sehr schwache pseudomolekulare Ionen wurden bei m/z 200 (M + H⁺) und 222 (M + Na⁺) für eine Spezies mit einer HHL entsprechenden Molekülmasse beobachtet. Die Erkennbarkeit dieser Ionen lag kaum über derjenigen des Hintergrunds. Dennoch wurde ein CID-Spektrum des M + H⁺ Ions bei m/z 200 aufgezeichnet und ergab ein Spektrum guter Qualität (2B), welches demjenigen sehr ähnlich ist, das für den HHL-Standard erhalten wurde (2A). Die Signale der Fragment-Ionen von HHL wurden bei m/z 99, 102, 172 und 182 beobachtet (2A, s. auch eingefügtes Bild). Die Ionen bei m/z 99 und 102 werden bei Fragmentierung der Amidbindung zwischen dem Hexanoyl-Anteil und dem Homoserin-Lacton erzeugt, wobei das Ion bei m/z 99 dem Hexanoyl-Substituenten entspricht, und das Ion bei m/z 102 charakteristisch für das Homoserin-Lacton ist. Die Ionen bei m/z 172 und 182 entstehen durch den Verlust kleiner neutraler Anteile (m/z 172 = M + H⁺ -C₂H₄; m/z 182 = M + H⁺ -H₂O). Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Komponente in der wesentlichen bioaktiven Fraktion N-hexanoyl-L-homoserin-lacton (HHL) ist.
In Dichlormethan-Extrakten von benutzten Kulturüberständen lagen die beiden anderen Aktivitäten in geringen Mengen vor und reichten nicht für massenspektrometrische Analysen aus; sie wurden deshalb, basierend auf ihrem TLC-Migrationsverhalten und ihren biologischen Aktivitäten in den lux-, las- und tra- Reportersystemen versuchsweise N-butanoyl-L-homoserin-lacton (BHL) und N-Octanoyl-L-homoserinlacton (OHL) zugeordnet.
Isolierung und Charakterisierung von Mutanten, die hinsichtlich der PCN-Biosynthese verändert sind
Der Test von 18.000 Tn5luxAB/PCL1391-Transkonjuganten auf Agar-Platten und in Flüssigkulturen resultierte in der Isolierung von acht Mutanten, die, nach Beurteilung anhand ihrer veränderten Pigmentierung, in ihrer PCN-Produktion verändert waren. Es wurden vier Mutanten identifiziert, bei denen das Transposon nicht in ein PCN-Biosynthesegen inseriert war. Die Regionen, die die Tn5-Insertion bei den vier Mutanten PCL1103 (phzI::Tn5luxAB), PCL1104 (phzR::Tn5luxAB), PCL1123 (gacS::Tn5luxAB) und PCL1111 (lexA::Tn5luxAB) flankieren, wurden in den Plasmiden pMP6003, pMP6004, pMP6006 bzw. pMP6005 gewonnen. Nukleotidsequenz-Analysen dieser flankierenden Regionen zeigten, dass die Transposons in diesen Mutanten in Homologen der Gene luxI, luxR, gacS bzw. lexA inseriert waren.
Charakterisierung von phzI- und phzR-Mutanten
Die Produktion von PCN durch diese Stämme wurde nach Extraktion der Kulturüberstände mit Toluol unter Verwendung von TLC und HPLC bestimmt. PCN wurde in den Toluolextrakten von PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) und PCL1104 (phzR::Tn5luxAB) nicht detektiert (Daten nicht gezeigt), noch wurden irgendwelche Autoinduktoren in Dichlormethan-Extrakten dieser Stämme detektiert (3). Die PCN-Produktion wurde bei der phzI-Mutante, nicht jedoch bei der phzR-Mutante durch Zugabe entweder von benutztem Wachstumsmedium von PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) oder von synthetischem HHL wiederhergestellt (Daten nicht gezeigt). Die Mutanten phzI und phzR waren hinsichtlich der Produktion von HCN, Protease oder Chitinase nicht verändert (Tabelle 2). Ebenso zeigte keine Mutante eine Beeinträchtigung hinsichtlich ihrer Motilität oder ihrer Fähigkeit, den Wurzelbereich von Tomatenpflanzen in Konkurrenz mit einem parentalen Stamm zu besiedeln, wie im Wettbewerb mit einem mit lacZ-Tag versehenen Derivat des Wildtypstammes PCL1391 getestet wurde (Daten nicht gezeigt). Die Stämme PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) und PCL1104 (phzR::Tn5luxAB) waren nicht dazu befähigt, das Wachstum von F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici zu inhibieren, wie mit einem in vitro anti-Pilz-Test gezeigt wurde (Daten nicht dargestellt), was mit dem beobachteten Fehlen der PCN-Produktion übereinstimmt.
Isolierung und Charakterisierung der luxI und luxR-Homologe von Stamm PCL1391
Um ein chromosomales Fragment von PCL1391 zu isolieren, das Homologe von luxI und luxR enthält, wurde eine chromosomale EcoRI-Bibliothek in DH5α enthaltendes pSB401 transformiert, ein von N-AHL abhängiges Reporter-Konstrukt, das auf dem Photobacterium lux-System (McClean et al. 1997) basiert. Das Plasmid pMP6007 schien den Reporter zu induzieren und enthielt ein 4,5 kb großes chromosomales Fragment von PCL1391. Eine partielle Sequenzierung dieses Klons zeigte die vollständigen Gene phzI und phzR und den Start von phzA (4), des ersten Gens des PCN-Biosynthese-Clusters (Kapitel 4).
E. coli-Stämme, die pMP6007 enthalten, induzierten das DH5α[pSB401] und den Chromobacterium -Reporterstamm CV026, wenn sie in der Nähe des Reporters ausgestrichen wurden, was die Produktion von diffusionsfähigem N-AHL anzeigt. Um zu testen, ob phzI und phzR für die Synthese von HHL verantwortlich sind, wurden Kulturüberstände von E. coli DH5α mit und ohne pMP6007 mit Dichlormethan extrahiert und der TLC-Analyse unterzogen. Autoinduktor-Aktivitäten mit R_f-Werten, die mit denen aus wildtypischen PCL1391-Kulturüberständen identisch waren, wurden nur bei Stämmen detektiert, die pMP6007 enthielten, wogegen bei der DH5α-Kontrolle keine Aktivität detektiert wurde (Daten nicht gezeigt).
Um die Gene phzI und phzR in mutante PCL1391-Derivate zu übertragen, wurde das Plasmid pMP6008 konstruiert, indem das 4,5 kb große chromosomale EcoRI-Fragment mit den Genen phzI und phzR des Stammes PCL1391 von pMP6007 auf pME6010 übertragen wurde, wobei letzteres Plasmid ein „shuttle vector" (Schaukelvektor/Klonierungsvektor, der in verschiedenen Organismen replizieren kann) ist, der in Pseudomonas-Arten stabil aufrecht erhalten wird (Heeb et al. 2000). Nach Einführung von pMP6008 in die Stämme PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) und PCL1104 (phzR::Tn5luxAB) wurde die PCN-Produktion in beiden Mutanten wiederhergestellt, wie mittels TLC-Analyse von Kulturüberständen gezeigt wurde (Daten nicht dargestellt). Dies und die zuvor beschriebenen Mutanten-Studien zeigen, dass PhzI und PhzR an der Synthese der Autoinduktoren BHL, HHL und OHL beteiligt sind.
Die Sequenzanalyse der ORFs zeigt, dass die Gene phzI und phzR gegenläufig transkribiert werden, wobei phzI in derselben Richtung transkribiert wird wie das phz Biosynthese-Operon (4A). In den Promotorregionen der Gene phzI und phzA wurden Sequenzen identifiziert, die homolog zu der lux-Box in Photobacterium fisheri sind, die eine putative Binderegion für den Transkriptitionsaktivator luxR darstellt (4B).
Die phzI- und phzR-homologen Gene von PCL1391 zeigten die stärkste Homologie (85 bis 95%) mit anderen phzI (4C) und phzR (4D) -Genen in den PCA-produzierenden Pseudomonas-Stämmen P. fluorescens 2–7.9 und P. aureofaciens 30–84. Die Homologie mit anderen LuxI und LuxR-Homologen bei anderen Pseudomonas-Arten und anderen Bakterienarten war viel geringer (20 bis 40%).
Einfluss exogener Autoinduktoren auf die Expression der Gene phzI, phzR und das Biosynthese-Operon
Es ist zuvor eine Anzahl von Biosynthesemutanten identifiziert worden, von denen die Mutante PCL1119 einen promotorfreien luxAB-Reporter in dem phzB-Gen enthält und für Expressionsstudien im Wurzelbereich der Tomatenpflanze (Chin-A-Woeng et al. 1998) verwendet wurde. Dieser Stamm wurde verwendet, um die Expression des PCN-Biosyntheseoperons während des Wachstums in Flüssigkulturen zu quantifizieren. Da die promotorfreien luxAB-Gene in derselben Orientierung inseriert waren, die auch der Transkriptionsrichtung der in PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) und PCL1104 (phzR::Tn5luxAB) mutierten Gene phzI und phzR entsprach, wurden diese Stämme weiterhin dazu verwendet, die Expression dieser Gene zu quantifizieren. Die Expression des phzI-Gens in dem mutanten PCL1103 blieb während des Wachstums auf basalem Niveau, was anzeigt, dass die induzierende Aktivität ohne ein funktionales phzI abwesend ist. Die Zugabe von synthetischem HHL oder benutztem Wachstumsmedium einer Übernachtkultur von PCL1391 zu einer Zellkultur niedriger Dichte (OD₆₂₀ gleich 0,1) von PCL1103 resultierte in einer Induktion der phzI-Expression, sobald die Zellkultur auf eine OD₆₂₀ von 0,6 oder mehr herangewachsen war (5A). Die Expression von phzR in der Mutanten PCL1104 war sowohl in Anwesenheit von exogenem HHL als auch in Abwesenheit von endogenen Autoinduktoren konstitutiv (5B). Die Expression des PCN-Biosynthesegen-Clusters (phzB::Tn5luxAB) in PCL1119 wurde in der späten exponentiellen/frühen stationären Wachstumsphase in großem Maße gesteigert, und der Moment der Induktion konnte durch Zugabe von synthetischem HHL vorgezogen werden (5C), nicht jedoch durch andere synthetische N-AHLs.
Die Zugabe von zellfreiem, benutztem Kulturmedium des N-AHL produzierenden Stammes PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) zu einer frischen Kultur des Stammes PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) führte zu einer viel früheren und stärkeren Induktion des phzI-Gens als die Zugabe von synthetischem HHL. Obwohl die Zugabe von benutztem Kulturmedium einer Übernacht-Kultur des Stammes PCL1103 als solche das phzI-Gen nicht induzierte, wurde ein synergistischer Effekt beobachtet, wenn es zusammen mit HHL zugegeben wurde. Die Induktion der Expression in Gegenwart von Kulturüberstand des Stammes PCL1103 erfolgte schon in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase (OD₆₂₀ gleich 0,35), viel früher als in Gegenwart von HHL alleine (5D). Kombinationen von Autoinduktoren, die von dem Stamm PCL1391 produziert wurden, wurden auf ihren möglichen synergistischen Effekt auf die Expression getestet. Keine der Kombinationen BHL/HHL, HHL/OHL oder BHL/HHL/OHL resultierte in einem unterschiedlichen Niveau oder Zeitpunkt des Einsetzens der Induktion als es bei Zugabe von HHL alleine beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt).
Analyse von Mutanten eines gacS-Homologen
Toluolextrakte von Kulturüberständen des Stammes PCL1123 (gacS::Tn5luxAB) enthielten den TLC- und HPLC-Auftrennungen nach zu urteilen kein PCN. Die Produktion von Autoinduktor in diesem Stamm war im Vergleich zu der des Wildtyps stark reduziert, wenn man der TLC-Analyse von Extrakten aus zellfreiem Wachstumsüberstand drei Tage alter Kulturen nach urteilte (3, Spur 4). Die Produktion von PCN konnte nicht durch Zugabe von benutztem Wachstumsmedium von PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) oder von synthetischem HHL wieder hergestellt werden (Daten nicht gezeigt). Der Stamm PCL1123 (gacS::Tn5luxAB) war im Hinblick auf die Produktion von HCN nicht verändert; er wies jedoch keine Produktion von Protease und Chitinase auf (Tabelle 2). Die Mutante war in ihrer Motilität oder ihrer Befähigung, den Wurzelbereich von Tomaten in Konkurrenz mit einem, einen lacZ-Tag enthaltenden Derivat des Wildtyp-Stammes zu besiedeln, nicht beeinträchtigt (Daten nicht gezeigt). Ebenso wie die Stämme PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) und PCL1104 (phzR::Tn5luxAB), war PCL1123 nicht dazu in der Lage, das Wachstum von F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici in einem in vitro anti-Pilz-Test zu inhibieren (Daten nicht gezeigt).
Der Teil der Nukleotidsequenz, der das Transposon im analysierten Stamm PCL1123 flankiert, weist eine Gesamtlänge von 999 bp auf und ist zu 90% identisch zu der Sequenz des Gens gacS (zuvor bekannt als lemA) von P. fluorescens (Whistler et al. 1998) und besitzt eine 84%ige Identität mit dem gacS-Gen von P. syringae (Rich et al. 1994).
Eine gacS-Mutante, die unabhängig mittels homologer Rekombination konstruiert wurde, indem man ein plC20R Suizid-Konstrukt benutzte, das eine Tertracyclin-Resistenz-Kassette und ein PCR-Fragment eines internen Fragments des gacS homologen Gens enthielt (pMP6014), ergab Mutanten mit demselben Phänotyp wie PCL1123, was bestätigt, das der bei dem Stamm PCL1123 beobachtete Phänotyp auf der Transposon-Insertion in gacS beruhte.
Die gacS-Mutante wurde hinsichtlich der Produktion von PCN, Protease und Chitinase durch Einführung von pEMH97, einem pLAFR3-Derivat, welches das Gen lemA von P. syringae enthält (Hrabak und Willis 1992), komplementiert. Die Einführung des pEMH97-Konstrukts in die phzI-Mutante PCL1103 und in die phzR-Mutante PCL1104 führte nicht zu einer Wiederherstellung der PCN-Produktion, ebenso wenig wie die Einführung von pMP6008, welches die Gene phzI und phzR enthält, die PCN-Produktion in der gacS-Mutante wiederherstellte.
Einfluss einer gacS-Mutation auf phzI-, phzR- und phzB-Mutanten
Um den Effekt einer gacS-Mutation auf die Expression von phzI, phzR und phzB zu untersuchen, wurde bei den Reporterstämmen PCL1103 (phzI::Tn5luxAB), PCL1104 (phzR::Tn5luxAB) und PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) unter Verwendung homologer Rekombination eine Mutation in dem gacS homologen Gen eingeführt. Analysen der luxAB-Expression dieser Stämme zeigten, dass die für einen „quorum sensing"-Regulationsmechanismus charakteristische Antwort durch eine zusätzliche gacS-Mutation beseitigt wird (6A, B und C). Während phzI in PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) auf zugegebenes, synthetisches HHL reagiert, wird phzI bei der Doppelmutante PCL1147 (phzI::Tn5luxAB, ΔgacS) nicht durch die Zugabe von Autoinduktor induziert (6A). Das basale Expressionsniveau des Gens phzR wird durch ein zusätzliches defektes gacS-Gen reduziert (6B). Die Expression des biosynthetischen phzB-Gens wird in einem gacS-Hintergrund vollständig abgeschaltet (6C), ebenso wie die PCN-Produktion bei der gacS-Mutante PCL1123 (Daten nicht gezeigt).
Charakterisierung der PCN-überproduzierenden lexA-Mutante
Die Mutation von lexA in PCL1111 resultierte in einer mehr als zehnfachen Überproduktion von PCN (Tabelle 2 und unveröffentlichte Ergebnisse). Es wurde eine gesteigerte Produktion von Autoinduktor beobachtet, wenn man der erhöhten Intensität des Flecks für HHL und der eindeutigen Anwesenheit von BHL nach urteilte, wobei letzteres normalerweise nur detektiert wird, wenn größere Mengen an Probe mittels der TLC analysiert werden. Diese offensichtliche Überproduktion an Autoinduktor stimmt mit den höheren Expressionsraten von PCN in der lexA-Mutante überein. Es wurden in dem für lexA mutanten Stamm keine Veränderungen in der Produktion von HCN, Protease und Chitinase detektiert. Die Mutante war hinsichtlich ihrer Motilität und ihrer Befähigung, das Wurzelsystem von Tomaten zu besiedeln, nicht beeinträchtigt, wie in Konkurrenz mit einem, einen lacZ-Tag aufweisenden Derivat des Wildtyp-Stammes PCL1391 getestet wurde (Daten nicht gezeigt).
Die Analyse von 1,5 kb der Nukleotidsequenz, die das Transposon bei der Mutante PCL1111 flankiert, zeigte eine Transposon-Insertion in einem Gen, das homolog zu den lexA-Genen von P. aeruginosa (90%), P. putida (87%) (Garriga et al. 1992) und E. coli (41%) (Brent und Ptashne 1981; Little et al. 1981; Calero et al. 1993) war. In der Promotor-Region des lexA-Homologen wurden zwei putative LexA-Repressorbindungsstellen, beginnend an den relativen Nukleotidpositionen -26(5'-CTGTATAAAAAGACAG-3') und -45(5'-CTGTATATAATTCCAG-3') identifiziert, wobei der Abstand zwischen diesen Bindungsstellen 3 bp betrug (7).
Eine unabhängig konstruierte lexA-Mutante, die durch homologe Rekombination unter Verwendung eines plC20R-Suizidkonstrukts hergestellt worden war, das eine Tetracyclin-Resistenzkassette und ein PCR-Fragment eines Teils des lexA-Gens enthielt (pMP6015), ergab eine Mutante mit demselben Phänotyp wie PCL1111 (lexA::Tn5luxAB). Die Überproduktion von PCN wurde auch bei dieser unabhängigen Mutante beobachtet, was bestätigt, dass der in PCL1111 beobachtete Phänotyp auf der Transposon-Insertion in lexA beruht.
Einfluss einer lexA-Mutation auf die Gene phzI, phzR, phzB und gacS
Es wurde eine lexA-Mutation in PCL1103, PCL1104, PCL1119 und PCL1123 eingeführt, indem unter Verwendung von pMP6015 eine homologe Rekombination durchgeführt wurde. Erstaunlicherweise stellt die Einführung einer lexA-Mutation in die für phzI oder phzR mutanten Stämme PCL1103 bzw. PCL1104 die PCN-Pigmentproduktion dieser Stämme auf nahezu wildtypischem Niveau wieder her. Dies wurde durch HPLC-Auftrennung von Kulturüberstand-Extrakten (Daten nicht dargestellt) sowie durch die Beobachtung von Kolonien auf Agar-Platten (Daten nicht dargestellt) gezeigt. Die Expression von phzI und phzB in einer lexA-Mutante wurde unter Verwendung des Tn5luxAB-Reporters bestimmt (6D, F). Überraschender Weise wurde phzI::Tn5luxAB in PCL1140 (ΔlexA, phzI::Tn5luxAB) zu Beginn der stationären Phase induziert, sogar in Abwesenheit von Autoinduktoren (6D). Das basale Expressionsniveau von phzI und folglich von phzB (6F), war höher als das Niveau des pa rentalen Stammes PCL1103. Ein geringfügiger positiver Effekt wurde im Hinblick auf die Expression von phzR::Tn5luxAB der lexA-Mutante beobachtet (6E). Eine zusätzliche lexA-Mutation bei der gacS-Mutante PCL1123 (PCL1162) führte, anders als bei den phzI- und phzR-Mutanten beobachtet, nicht zu einer Wiederherstellung der PCN-Produktion und resultierte im selben Phänotyp wie PCL1160 (lexA::Tn5luxAB; ΔgacS).
Obwohl die Auswirkung einer gacS-Mutation auf die Expression des lexA-Stammes PCL1160 aufgrund der inkorrekten Insertion des Reportergens nicht durch Messung der Lumineszenz bestimmt werden konnte, produzierte die lexA/gacA-Doppelmutante kein PCN, wie anhand der TLC-Analyse von Extrakten von benutztem Kulturmedium gezeigt wurde.
Einfluss von Komponenten aus Wurzelauscheidungen auf die Expression des PCN-Biosyntheseoperons
Der Stamm PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) ist ein Derivat des Stammes PCL1391, bei dem ein promotorfreies Tn5luxAB-Transposon in das phzB-Gen inseriert ist. Dieser biolumineszierende Reporter-Stamm kann verwendet werden, um die Expression des PCN-Biosyntheseoperons (Chin-A-Woeng et al. 1998) zu analysieren. Der Einfluss der in Wurzelausscheidungen der Tomate (Lycopersicon esculentum Mill. Cultivar Carmello) enthaltenen Komponenten Äpfelsäure, L-pyro-Glutaminsäure, Fumarsäure, Citronensäure, Propionsäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Glucose, Ribose, Xylose, Sucrose, Fructose und Maltose auf die Expression des PCN-Biosyntheseoperons wurde getestet. Die meisten der getesteten einzelnen Wurzelausscheidungskomponenten hatten keine signifikante Wirkung (8A) auf die Expression von phzB, und ebenso wenig auf den Zeitpunkt des Einsetzens der Induktion (Daten nicht gezeigt). Jedoch schien die Anwesenheit von Fructose, Ribose oder Citronensäure die Expression des PCN-Biosyntheseoperons im Vergleich zur Kontrolle signifikant zu steigern (8A). Glycerol, dessen Anwesenheit in den Wurzelausscheidungen nicht gezeigt wurde, schien die Kohlenstoffquelle zu sein, die den größten Anstieg der Expression bewirkte. Die Wirkung dieser Kohlenstoffquellen wurde als Funktion des Wachstums weiterverfolgt (8B). Das Kontrollmedium und das Medium, dem Äpfelsäure zugegeben worden war, wurden als Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Expression am Ende der logarithmischen Wachstumsphase und wärend der stationären Phase am höchsten war. Ein eindeutiger Anstieg der Expression wurde für Fructose, Ribose und Citronensäure beobachtet, wenn zum Vergleich Äpfelsäure oder das Kontrollmedium herangezogen wurde.
Einfluss von Metallionen auf die Expression des PCN-Biosyntheseoperons
Um die Wirkung einer Begrenzung oder einer zehn- oder hundertfachen Erhöhung der Konzentration von Zn²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, MoO₄ ^– und Fe³⁺ auf die Expression des PCN-Biosyntheseoperons in Vogel-Bonner-Medium zu testen, wurden diese Ionen weggelassen oder in zehn- oder hundertfach erhöhter Konzentration in Vogel-Bonner-Medium zugegeben (9). Die Abwesenheit von Cu²⁺ (9B), Zn²⁺ (9D) oder MoO₄ ^– (9E) verzögerte die Expression von phzB, wogegen die Begrenzung von Fe³⁺ in einer offenbaren Verzögerung und in verringerter Expression resultierte (9A). Es wurde keine Auswirkung für das Weglassen von Mn²⁺ detektiert (9C). Ein Überschuss an Fe³⁺ (9A), Cu²⁺ (9B), Zn²⁺ (9D) oder MoO₄ ^– (9E) hatte keine signifikante Wirkung. Überraschender Weise jedoch führte ein Überschuss an Molybdat, ebenso wie dessen Limitierung, zur Unterdrückung der Expression von phzB.
Einfluss niedriger Sauerstoffspannung auf die Expression des PCN-Biosyntheseoperons
Die Erzeugung mikro-aerober Bedingungen durch das Heranzüchten von Kulturen des wildtypischen P. chlororaphis-Stammes PCL1391 ohne Schütteln resultierte in einer höheren Produktion an PCN, wie bei der HPLC-Auftrennung von Extrakten von Kulturüberständen gezeigt wurde (Daten nicht dargestellt). Das Expressionsmuster des PCN-Biosyntheseoperons unter Bedingungen der Sauerstoffbegrenzung wurde in einem geschlossenen System bestimmt, bei dem Zellen des Stammes PCL1119 unter Belüftung mit 1,0% Sauerstoff und 99% Stickstoff herangezogen wurden. Tatsächlich erfolgte die Induktion der phzB-Expression unter Bedingungen niedriger Sauerstoffkonzentration viel früher in der Wachstumskurve als bei der Referenzkultur, die unter Belüftung mit (normaler) Luft herangezogen wurde (10). Tabelle 1: Mikroorganismen und Plasmide

Tabelle 2: Eigenschaften von P. chlororaphis PCL1391 Transposon-Derivaten

+: Wildtyp-Niveau;
+++++: zehnfache Steigerung;
–: nicht vorhanden.

Legende zu den Figuren
1: C18-Reversphase-TLC Analyse der von Pseudomonas chlororaphis Stamm PCL1391 produzierten N-Acyl-L-Homoserin-Lactone, sichtbar gemacht unter Verwendung des Chromobacterium violaceum -Reporter-Assays. Spur 1: synthetischer BHL-Standard; Spur 2: synthetischer HHL-Standard; Spur 3: synthetischer OHL-Standard; Spur 4: Autoinduktor-Profil von Stamm PCL1391. Es ist anzumerken, dass der in Spur 4 zu sehende Hauptfleck zu exakt der gleichen Position wandert wie HHL, wenn kleinere Mengen Probe aufgetragen werden.
2: Strukturelle Identifizierung der von Pseudomonas chlororaphis PCL1391 produzierten Hauptverbindung mit Autoinduktor-Aktivität mittels Massenspektrometrie. Tafel A: CID-Spektrum, erhalten aus 1,3 ng/μl Standardlösung von HHL. Eingefügtes Bild: Schema der Fragmentierung von HHL. Tafel B: CID-Spektrum, erhalten von der Fraktion, die nach der HPLC-Reinigung einen R_f von 0,4 aufwies.
3: C18-Reversphase-TLC Analyse der von Pseudomonas chlororaphis Stamm PCL1391 und Derivaten produzierten N-Acyl-L-Homoserin-Lactone. Autoinduktor-Profile von Tn5-Mutanten von Pseudomonas chlororaphis Stamm PCL1391. Spur 1: PCL1391 Wildtyp; Spur 2: PCL1103 (phzI::Tn5luxAB); Spur 3: PCL1104 (phzR::Tn5luxAB); Spur 4: PCL1123 (gacS::Tn5luxAB); Spur 5: PCL1111 (lexA::Tn5luxAB); Spur 6: PCL1119 (phzB::Tn5luxAB); Spur 7: synthetischer HHL-Standard. Es wurde ein Volumen von 100 ml eines drei Tage alten KB-Kulturüberstandes der Stämme mit Dichlormethan extrahiert und in dem Chromobacterium TLC-Überschichtungstest (overlay assay) getestet (siehe Versuchsdurchführung).
4: Chromosomale Position, regulatorische Elemente und Homologie der Gene, die die PCN-Produktion in P. chlororaphis PCL1391 regulieren. Tafel A: Genetische Analyse von Mutanten, die im Vergleich zur PCN-Produktion von Pseudomonas chlororaphis Stamm PCL1391 verändert sind. Die Positionen der Tn5luxAB-Transposons der Stämme PCL1103, PCL1104 und PCL1119 sind mit Pfeilen angezeigt. Zusätzlich sind die beiden ersten Gene des Biosynthese-Operons, phzA und phzB, dargestellt. Sequenzen, die homolog zu den lux-Boxen von Photobacterium fisheri sind, wurden in der Promotor-Region der Gene phzI und phzA identifiziert. Tafel B: Identifizierung von Sequenzen, die homolog zu der P. fisheri lux-Box in den phzI- und phzA-Promotorregionen sind. Die lux-Box ist doppelt unterstrichen und das ATG-Startcodon von phzI und phzA jeweils angegeben. Tafel C: Baum der Homologie der PhzI-Proteine von Stamm P. aureofaciens 30–84 (P. aur. PhzI), P. fluorescens 2–79 (P. flu. PhzI), P. aeruginosa PAO1 (P. aer. PhzI, VsmI, RhII, LasI), P. syringae pv. syringae (P. syr. AhII), P. fisheri (P. fis. LuxI), E. carotovora (E. car. ExpI, CarI), A. tumefaciens (A. tum. Tral) und Rhizobium etli (R. etl. Rail). Tafel D: Baum der Homologie der PhzR-Proteine von P. aureofaciens 30–84 (P. aur. PhzR) P. fluorescens 2–79 (P. flu PhzR), P. aeruginosa PAO1 (P. aer. PhzR, VsmR, RhlR, LasR), P. fisheri (P. fis. LuxR), E. carotovora (E. car. ExpR), A. tumefaciens (A. tum. TraR) und Rhizobium etli (R. etl. RaiR).
5: Expressionsstudien der Gene phzI und phzR und des PCN-Biosyntheseoperons von Pseudomonas chlororaphis Stamm PCL1391. Die Stämme wurden in LB-Medium herangezogen. HHL wurde bei einer anfänglichen optischen Dichte (OD₆₂₀) von 0,1 zugegeben. Die in den Tafeln dargestellten Werte sind Lumineszenz-Werte, die in Zählimpulsen pro Sekunde (counts per seconds, cps) pro Zelldichte-Einheit während des Wachstums im Zeitverlauf gemessen wurden. Tafel A: Induktion von phzI im Stamm PCL1103 (phzI::Tn5luxAB) in Abwesenheit und Anwesenheit von 5 μM synthetischer HHL. Tafel B: Quantifizierung der phzR-Expression in Abwesenheit und Anwesenheit von 5 μM synthetischem HHL unter Verwendung des Stammes PCL1104 (phzR::Tn5luxAB). Tafel C: Expression des PCN-Biosynthese-Operons von Stamm PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) in Abwesenheit und Anwesenheit von 5 μM synthetischem HHL. Tafel D: Induktion von phzI durch synthetisches HHL, durch zellfreien, benutzten Kulturüberstand von Stamm PCL1103, durch benutzten Wachstumsüberstand von Stamm PCL1119 und durch eine Kombination von benutztem Wachstumsüberstand von PCL1103 und HHL.
6: Expression der Gene phzI, phzR und des PCN-Biosynthese-Operons des Stammes Pseudomonas chlororaphis PCL1391 in für lexA und gacS mutanten Stämmen. Tafeln A–C: Expressionsstudien von phzI, phzR und den Genen der PCN-Biosynthese in einem gacS-defizienten Hintergrund unter Verwendung der Reporter phzI::Tn5luxAB (PCL1103), phzR::Tn5luxAB (PCL1104) bzw. phzB::Tn5luxAB (PCL1119). Tafeln D–F: Expression von phzI, phzR und der Biosynthesegene in einem lexA-defizienten Hintergrund unter Verwendung der Reporter phzI::Tn5luxAB (PCL1103), phzR::Tn5luxAB (PCL1104) bzw. phzB::Tn5luxAB (PCL1119). Die Biolumineszenz wurde wie in der Legende zu 5 beschrieben, gemessen.
7: Identifizierung von Sequenzen, die homolog zu den Bindestellen für LexA (SOS-Boxen) in der Promotor-Region von lexA im Pseudomonas chlororaphis-Stamm PCL1391 sind.
8: Einfluss von Komponenten aus Wurzelausscheidungen auf die Expression des PCN-Biosynthese-Operons von Pseudomonas chlororaphis. Der P. chlororaphis-Stamm PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) wurde in modifiziertem Vogel-Bonner-Medium herangezogen, in dem die angegebenen Kohlenstoffquellen vorhanden waren. Tafel A zeigt die maximale Expression des PCN-Biosynthese-Operons. Tafel B zeigt die Expression des PCN-Biosynthese-Operons während des Wachstums in einer Auswahl von Kohlenstoffverbindungen und organischen Säuren, die einen eindeutigen Anstieg der in Tafel A dargestellten Expression zeigten. Die Bestimmung der Biolumineszenz erfolgte gemäß der Beschreibung in „Material und Methoden".
9: Einfluss von begrenzten und exzessiven Mengen an Metallionen im Wachstumsmedium auf die Expression des PCN-Biosyntheseoperons. Der Pseudomonas chlororaphis-Stamm PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) wurde gemäß der Beschreibung in „Material und Methoden" in modifiziertem Vogel-Bonner-Medium herangezogen. Die mittlere Konzentration entspricht der Standard-Konzentration im Vogel-Bonner-Medium. Ausgewählte Metallionen wurden weggelassen oder in einer zehnfach oder hundertfach erhöhten Konzentration zugegeben. Die Detektion der Biolumineszenz erfolgte gemäß der Beschreibung in „Material und Methoden".
10: Auswirkung von niedrigen Sauerstoffspannungen auf die phzB-Expression. Pseudomonas chlororaphis PCL1119 (phzB::Tn5luxAB) wurde unter Bedingungen von 21% Sauerstoff (Luft) oder 1,0% Sauerstoff herangezogen. Die Biolumineszenz wurde gemäß der Beschreibung in „Material und Methoden" detektiert.
11: Identifizierung von Phenazin-1-carboxamid in Wachstumssubstrat und in der Nährlösung von Gurkensämlingen. 11A zeigt das HPLC-Chromatogramm (die Retentionszeit des angezeigten Peaks beträgt 16,525 Minuten). 11B stellt das Spektrum des Peaks dar, der im Chromatogram aus 11A gezeigt ist. 11C stellt das Spektrum des Phenazin-1-carboxamid-Standards dar.

Claims

Mineralwolle-Pflanzensubstrat umfassend Mineralwolle und ein an die Mineralwolle gebundenes Bakterium, das ein Phenazinderivat mit pilztötender Aktivität produziert, wobei das Bakterium derartig genetisch modifiziert ist, dass es mehrfache Kopien der Gene phzR und phzI umfasst, was zu einer Überproduktion des Phenazinderivats führt.
Substrat nach Anspruch 1, wobei das Phenazinderivat Phenazin-1-carboxamid ist.
Substrat nach Anspruch 2, wobei das Bakterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 umfasst.
Substrat nach Anspruch 3, wobei das Bakterium ein genetisch transformiertes Pseudomonas chlororaphis PCL1391 umfasst, das eine Mutation in dem lexA Gen aufweist, was zu einer Überproduktion von Phenazin-1-carboxamid führt.
Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Substrat eine kohärente Matrix von Mineralwolle und das an die Matrix gebundene Bakterium umfasst.
Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mineralwolle in körniger Form ist.
Verwendung eines Substrats nach einem der Ansprüche 1–6 bei dem Wachstum von Nutzpflanzen, wobei die Produktion des Phenazinderivats durch Einsatz von einer oder mehreren der nachfolgenden Bedingungen erhöht wird: – Wachstum unter niedrigem Sauerstoffgehalt – die Anwesenheit von Glycerol, Fructose, Ribose oder Citronensäure in dem Nährstoffmedium, und – die Anwesenheit von verschiedenen Mineralien (Cu²⁺, Zn²⁺, Fe³⁺) in dem Nährstoffmedium.
Verfahren zum Produzieren eines Mineralwolle-Pflanzensubstrats nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Bakterium dem Mineralwolle-Pflanzensubstrat während der Produktion des Substrats zugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Bakterium Mineralwollefasern und einem härtbaren Bindemittel zugemischt wird, um eine Mischung zu bilden, und die Mischung ausgehärtet wird, um eine kohärente Matrix zu bilden.
Verfahren zum Produzieren eines Mineralwolle-Pflanzensubstrats nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Bakterium einem fertigen Mineralwolle-Pflanzensubstrat zugefügt wird.