ES2214972A1 - Moleculas de adn que codifica para una gamma -tocoferol metiltransferasa de maiz y sus aplicaciones. - Google Patents
Moleculas de adn que codifica para una gamma -tocoferol metiltransferasa de maiz y sus aplicaciones.Info
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Abstract
Molécula de ADN que codifica para una gamma-tocoferol metiltransferasa de maíz y sus aplicaciones. Dicha molécula comprende (a) uña secuencia de ADN identificada por SEQ ID No. 1, o (b) una secuencia de ADN análoga a la misma que (i) es sustancialmente homóloga a ella, y/o que (ii) que codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por dicha molécula de ADN. Dicha molécula introducida en una planta productora de tocoferoles, principalmente maíz, por técnicas habituales en biotecnología, permite aumentar el contenido de vitamina E total en dicha planta, así como el contenido en {al} y {ga}{sup,-} tocoferol, entre otras aplicaciones.
Description
Molécula de ADN que codifica para una
\gamma-tocoferol metiltransferasa de maíz y sus
aplicaciones.
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la biotecnología.
Más específicamente, la invención se refiere a
una molécula de ADN que codifica para una
\gamma-tocoferol metiltransferasa
(\gamma-TMT) de maíz y al empleo de la misma para
modular la expresión de tocoferoles en semillas, especialmente de
maíz. La invención también se refiere al contenido de vitamina E
total, \gamma- y \alpha-tocoferol obtenido por
represión, expresión y traducción de dicha molécula de ADN.
Los radicales libres son compuestos altamente
reactivos producidos en los organismos vivos en procesos normales
como consecuencia del metabolismo del oxígeno. Unos niveles
normales de radicales libres en nuestras células tienen cierto
papel beneficioso en el organismo; en cambio, unos niveles elevados
son perjudiciales para la salud. Los radicales libres pueden atacar
a los ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos de membrana
y dañar así la estructura y funciones de las membranas celulares,
también causan daños al ADN y a las proteínas. Los radicales libres
conducen a un estrés oxidativo que está implicado en el desarrollo
de una serie de enfermedades relacionadas con la edad como la
debilitación cognitiva y la enfermedad de Alzheimer, la debilidad
del sistema inmune, cataratas, arteriosclerosis, cáncer y artritis
(Cross, 1987). Existen numerosos factores ambientales que pueden
inducir a una elevada producción de radicales libres; entre estos se
encuentran las radiaciones, los humos y los pesticidas (Jacobson,
1987; Halliwell, 1996), (los datos completos de éstas y las demás
citas bibliográficas, se dan al final de la descripción, para no
hacer demasiado farragosa la presente exposición).
Los seres vivos presentan varios mecanismos con
función antioxidante. Entre las diversas sustancias con capacidad
antioxidante se encuentra la vitamina E. Su papel como atrapador de
radicales libres es crucial en la prevención de la oxidación de los
ácidos grasos insaturados situados en la membrana plasmática y es
considerada la primera línea de defensa contra la peroxidación de
lípidos (Horwitt, 1986; Pecker et al, 1995; Halliwell, 1996).
La vitamina E es sintetizada sólo por las
plantas. Por tanto, se encuentra fundamentalmente en productos
vegetales (aceites vegetales, semillas...). Existen cuatro isómeros
de tocoferol con actividad vitamina E (\alpha, \beta, \gamma
y \delta-tocoferol). Todas las plantas superiores
tienen \alpha-tocoferol (hojas y otras partes
verdes), mientras que el \gamma-tocoferol (también
el \beta- y el \delta-tocoferol) está presente
en concentraciones muy inferiores (Combs, 1992). Las proporciones
individuales de los tocoferoles varían ampliamente entre los
diferentes aceites de semillas.
La vitamina E se distribuye por todos los tejidos
del cuerpo humano a través del plasma y elementos celulares de la
sangre, como eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Bajo ciertas
circunstancias la vitamina E es transportada por la linfa y la
sangre como tocoferol libre o unido a
\beta-lipoproteína (Bjoerneboe, 1990). La forma
predominante en plasma humano es
\alpha-tocoferol, que constituye el 90% de la
concentración total de vitamina E, y el resto está formado por
\gamma-tocoferol y
\beta-tocoferol en una proporción de 5:1. De
\delta-tocoferol y tocotrienoles se encuentran
solo trazas en plasma humano.
La mayor parte de la vitamina E procede de la
toma diaria de aceites y margarina. La absorción de la vitamina E
depende de la habilidad del cuerpo para absorber grasas; por tanto,
alguna enfermedad que afecte a la digestión, absorción o transporte
de estas grasas puede conducir a deficiencias en vitamina E. Una
deficiencia severa y crónica puede dar lugar a un característico
síndrome neurológico de neuropatía progresiva, con ausencia o
disminución de reflejos, debilidad de los miembros, alteración en
la marcha y pérdida sensorial en brazos y piernas. En los roedores,
el déficit de vitamina E produce esterilidad, parálisis y distrofia
muscular (Sokol, 1988). El exceso en el consumo de vitamina E no
parece producir efectos nocivos.
Estudios recientes que comparan la vitamina E
natural con la forma sintética sugieren que la biodisponibilidad de
la forma natural es dos veces superior a la de la vitamina E
sintética. La vitamina E natural y la sintética muestran las
siguientes diferencias (Horwitt, 1986; Cheng et al, 1987; Ingold et
al, 1987):
- 1.
- La vitamina E natural es derivada de aceites vegetales, principalmente de aceite de soja. La vitamina E sintética se produce a partir de derivados del petróleo.
- 2.
- La vitamina E natural es un estereoisómero. La vitamina E sintética es una mezcla de ocho estereoisómeros.
- 3.
- La vitamina E natural es más biodisponible que la forma sintética.
- 4.
- La vitamina E natural queda retenida durante más tiempo, en tejidos del cuerpo que la forma sintética.
En la actualidad existe un gran interés en el uso
de antioxidantes en la industria alimentaria, farmacéutica y de
cosmética (Combs, 1992; Halliwell et al, 1992). Esto produce una
gran demanda de antioxidantes estables, a lo que hay que añadir la
preferencia por parte de los consumidores y de las autoridades
sanitarias por los de carácter natural, básicamente vitamina C
(ácido ascórbico), vitamina E (tocoferoles y tocotrienoles) y
extractos relativamente complejos de varias especies de plantas
(Rosmarinus officinalis, Nerium oleander y Myrtus
communis).
Los trabajos de Chapault y colaboradores
(Chipault et al, 1952, 1955, 1956) fueron los precursores de muchos
estudios sobre la capacidad antioxidante de un número de extractos
de plantas con aplicaciones potenciales como conservantes en
industrias alimentarias, farmacéuticas y de cosmética (Taga et al,
1984; Written et al, 1984; Wu et al, 1984; Economou et al, 1991;
Mallet et al, 1994; Daood et al, 1996; Schwants et al, 1996).
La planta de maíz es un producto alimenticio muy
apreciado, de amplia aceptación e interés comercial, constituyendo
en los EEUU, la mayor fuente alimenticia. Sería muy conveniente
disponer de semillas de maíz que, a la vez que mantuvieran sus
propiedades organolépticas, fueran muy ricas tanto en el contenido
de vitamina E total como en \gamma- y/o
\alpha-tocoferol y, por tanto, dispusieran de
mayores niveles de antioxidantes naturales.
La \gamma-tocoferol
metiltransferasa (EC 2.1.1.95) es la enzima que cataliza la
metilación del \gamma-tocoferol a partir de la
S-adenosilmetionina (SAM) para dar
\alpha-tocoferol.
Una alternativa para obtener semillas de maíz con
mayor capacidad antioxidante sería el desarrollo de semillas
transgénicas que tuvieran unos niveles elevados de ARNm
correspondientes a la \gamma-TMT con el fin de
aumentar su capacidad antioxidante. Para ello, es necesario
identificar, aislar y caracterizar el ADN genómico (ADNg) o
complementario (ADNc), que codifica para la
\gamma-TMT de maíz y/o el ARNm correspondiente a
dicha enzima. Igualmente, la obtención de organismos caracterizados
por una alta producción de \gamma-tocoferol puede
plantearse mediante estrategias antisentido que permitan disminuir
la expresión del gen de la \gamma-tocoferol
metiltransferasa. Del mismo modo, también podría verse favorecido
mediante la sobreexpresión del gen de la
\rho-HPPD
(\rho-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa), habida
cuenta de los resultados mostrados por Shintani y DellaPenna
(1998), en los que los niveles totales de vitamina E no se
incrementan en transformantes antisentido carentes de actividad
\gamma-tocoferol metiltransferasa, y en los que
solo se ve afectada la proporción relativa de los distintos
isómeros del tocoferol.
La invención proporciona una solución a la
necesidad existente de conseguir clonar un gen de maíz, así como el
correspondiente ADNc, que codifica para una
\gamma-TMT de maíz.
El principal objeto de esta invención lo
constituye una molécula de ADN que codifica para una
\gamma-TMT de maíz.
Un objeto adicional de esta invención lo
constituye el empleo de dicha molécula de ADN para modular la
expresión de la \gamma-TMT en semillas,
preferentemente de semillas de maíz.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye una construcción de ADN que comprende la totalidad o una
parte de dicha molécula de ADN, así como un vector que contiene
dicha molécula o construcción de ADN y una célula transformada con
dicho vector.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye el empleo de dicha molécula de ADN, o de dicha
construcción de ADN, en la obtención de plantas transgénicas que
expresan una actividad enzimática \gamma-TMT
modulada, por ejemplo, plantas transgénicas que posean unos niveles
de ARNm correspondientes a la \gamma-TMT elevados
o inexistentes. Las plantas transgénicas resultantes constituyen
otro objeto adicional de esta invención.
La presente invención proporciona una molécula de
ADN que codifica para una \gamma-tocoferol
metiltransferasa (\gamma-TMT) de maíz, en adelante
molécula de ADN de la invención, seleccionada entre:
- a)
- una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID No. 1;
- b)
- una secuencia de ADN análoga a la secuencia definida en a) que
- i)
- es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN definida en a) y/o que
- ii)
- codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de ADN definida en a).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análogo/a" pretende incluir a cualquier secuencia de
ADN que codifica para una enzima que posee, al menos, actividad
\gamma-TMT que tiene las propiedades
i)-ii) arriba mencionadas. Típicamente la secuencia
de ADN análoga:
- se puede aislar de otra especie que produce una
\gamma-TMT en base a la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEQ ID No. 1, o
- se construye en base a la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 1, por ejemplo, mediante la
introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas, es
decir, que dan lugar a la misma secuencia de aminoácidos de la
\gamma-TMT que la codificada por la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 1, pero que corresponde al
empleo de codones del organismo hospedador destinado a la
producción de la proteína, o bien mediante la introducción de
sustituciones de nucleótidos que dan lugar a una secuencia de
aminoácidos diferente y, por tanto, posiblemente a una estructura
proteica diferente que pudiera dar lugar a una proteína mutante con
propiedades diferentes a las de la proteína nativa. Otros ejemplos
de posibles modificaciones incluyen la inserción de uno o más
nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, la
adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la
secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier
extremo o en el interior de la secuencia. Por ejemplo, la secuencia
de ADN análogo puede ser una sub-secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 1.
En general, la secuencia de ADN análoga es
sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos identificada
como la SEQ ID No. 1. En el sentido utilizado en esta descripción,
la expresión "sustancialmente homóloga", aplicada a secuencias
de nucleótidos, significa que las secuencias de nucleótidos en
cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 70%
preferentemente de al menos, un 85%, o más preferentemente de al
menos, un 95%.
La molécula de ADN de la invención puede proceder
de cualquier variedad de maíz (por ejemplo Zea mays L.) o bien de
un organismo hospedador transformado con dicha molécula de ADN.
Alternativamente, la molécula de ADN de la
invención puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a
partir de ADN de cualquier otra especie mediante el empleo de
sondas o de oligonucleótidos preparados a partir de la información
sobre la secuencia de ADN proporcionada en esta descripción.
En una realización particular, la molécula de ADN
de la invención es una molécula de ADNc del ARNm correspondiente
al gen de la \gamma-TMT de maíz, relacionado con
la biosíntesis de los tocoferoles, que se ha caracterizado
molecular y fisiológicamente cuya secuencia de nucleótidos
comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 1.
El análisis comparativo de la secuencia deducida de la proteína ha
puesto de manifiesto que este gen corresponde a un gen que codifica
para una \gamma-TMT. La SEQ ID No. 1 corresponde
a la secuencia completa del ADNc del ARNm de la
\gamma-TMT de maíz.
La molécula de ADN de la invención puede
obtenerse utilizando métodos convencionales conocidos por loe
técnicos en la materia, mediante un procedimiento que comprende la
extracción del ARNm correspondiente a la transcripción del gen que
codifica para la \gamma-TMT a partir de un
organismo productor de dicha enzima, la obtención de una primera
cadena de ADNc por transcripción inversa del correspondiente ARNm,
la síntesis de una segunda cadena de ADNc, complementaria a la
primera, para obtener un ADNc de doble cadena, la unión de unos
enlazantes para su inserción en plásmidos o fagos para su
propagación en, por ejemplo, un sistema bacteriano y la
identificación de los clones que portan el ADNc deseado.
En una realización particular (véase el Ejemplo
1), se ha obtenido un clon parcial de ADNc correspondiente al ARNm
de la \gamma-TMT de plántulas de maíz, mediante un
procedimiento que comprende aplicar la técnica
RT-PCR (Retrotranscriptase-PCR) a
ARNm procedentes de plántulas etioladas de maíz de 4 días a partir
de la germinación, así como de plántulas verdes de 9 días. Para
ello, se extrajeron los ARNm de dichas plántulas, se sometieron a
una reacción de transcripción inversa (RT) para obtener los
correspondientes ADNc de cadena simple. Los productos de la
amplificación (que se correspondían con los ARNm expresados en
ambos tejidos y contenían la secuencia de nucleótidos que
codificaba para la \gamma-TMT de maíz) se
subclonaron en unos vectores apropiados que se utilizaron para
transformar bacterias. Seguidamente se extrajo el ADN
correspondiente al plásmido recombinante, que se purificó y
secuenció. La secuencia obtenida (SEQ ID No. 1) se comparó con las
secuencias depositadas en la base de datos utilizando el programa
BLAST del National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Estados Unidos). La comparación de las secuencias puso de
manifiesto que la secuencia de ADN obtenida presentaba una
relativamente elevada homología de secuencia única y exclusivamente
con otras secuencias de plantas superiores que codifican para una
\gamma-TMT.
Utilizando la secuencia de este ADNc se diseñaron
dos oligonucleótidos específicos (SEQ ID No. 3, SEQ ID No.4) que
permitieron el aislamiento de un gen \gammaTMT que se secuenció
completamente (SEQ ID No. 1). La comparación entre la secuencia del
gen \gammaTMT y las secuencias presentes en las bases de datos
puso de manifiesto una identidad de secuencia a nivel de
aminoácidos significativa con secuencias correspondientes a
\gammaTMT de plantas.
La invención proporciona, además una construcción
de ADN, en adelante, construcción de ADN de la invención, que
comprende la totalidad de la molécula de ADN de la invención o un
fragmento de, al menos, 8 nucleótidos consecutivos de la molécula
de ADN de la invención y una región iniciadora de la transcripción
funcional en plantas. En dicha construcción, cualquiera de los
extremos (3' ó 5') de la totalidad o del fragmento de la molécula de
ADN de la invención puede estar unido al extremo 3' de dicha región
iniciadora de la transcripción. La construcción de ADN de la
invención también puede contener, operativamente enlazada, una
secuencia de terminación de la transcripción. En una realización
particular, dicha región iniciadora y terminadora de la
transcripción sería funcional en plantas de maíz.
La molécula de ADN de la invención, o la
construcción de ADN de la invención, puede ser insertada en un
vector apropiado. Por tanto, la invención también se refiere a un
vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha
molécula de ADN, o una construcción que la contiene. La elección
del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a
introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se
introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector
que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en
el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o
cromosomas) en el (o en los que) se ha integrado.
En el vector proporcionado por esta invención, la
molécula de ADN de la invención estará conectada operativamente a
un promotor y a una secuencia terminadora. El promotor puede ser
cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en
la célula hospedadora elegida y puede derivar bien de genes que
codifican para proteínas homólogas o heterólogas de la célula
hospedadora. Los procedimientos utilizados para ligar la secuencia
de ADN de la invención al promotor y a la secuencia terminadora,
respectivamente, y para insertar dicha construcción en un vector
son bien conocidos por los técnicos en la materia y han sido
descritos, por ejemplo, por Sambrok et al. (1989).
La invención también proporciona una célula que
comprende una secuencia de ADN de la invención, o una construcción
de ADN que contiene a dicha secuencia o dicho vector mencionado más
arriba. Las células hospedadoras que se pueden transformar con la
secuencia de ADN de la invención pueden ser células procarióticas
o, preferentemente eucarióticas, tales como células de tejidos
vegetales. La transformación de células de tejidos vegetales también
puede realizarse por métodos convencionales. Para una revisión de
la transferencia génica a plantas, incluyendo vectores, métodos de
transferencia de ADN, etc, véase, por ejemplo, el libro titulado
"Gene Transfer to Plants" de I. Potrykus y G. Spangenberg, Ed.
Springer Lab. Manual (1995).
La invención también proporciona una proteína con
actividad \gamma-tocoferol metiltransferasa, en
adelante \gamma-TMT de la invención, que tiene
una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
- a)
- una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No. 2,
- b)
- la secuencia de aminoácidos deducidos a partir de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 1,
- c)
- una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga y funcionalmente definidas en a) o en b).
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homóloga" significa que las
secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad
de, al menos, un 70%, preferentemente de al menos, un 85%, y, más
preferentemente de al menos un 95%.
Asimismo, en el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "funcionalmente equivalente"
significa que la proteína en cuestión tiene una actividad
\gamma-tocoferol metiltransferasa.
En una realización particular, la
\gamma-TMT de la invención es una
\gamma-TMT de maíz (Zea mays) que tiene una
secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEQ ID No. 2. La SEQ ID No. 2 corresponde a la
secuencia de aminoácidos de un fragmento de una
\gamma-TMT de maíz y ha sido deducida a partir de
la secuencia de nucleótidos del fragmento parcial del ADNc del
ARNm correspondiente al gen de la \gamma-TMT de
maíz mostrada en la SEQ ID No. 1. La comparación entre la SEQ ID
No. 1 y las secuencias presentes en las bases de datos puso de
manifiesto una identidad de secuencia a nivel de aminoácidos
significativa únicamente con secuencias correspondientes a
\gammaTMT de plantas superiores. El análisis por computador de la
ORF del gen \gammaTMT mostró una proteína deducida de 352
aminoácidos.
La \gamma-TMT de la invención
puede obtenerse mediante un método que comprende cultivar una
célula hospedadora adecuada que contiene la molécula de ADN de la
invención, o una construcción de ADN de la invención, bajo
condiciones que permiten la producción de la proteína y su
recuperación del medio de cultivo.
La \gamma-TMT de la invención
puede obtenerse, alternativamente, a partir de un organismo
productor de la misma mediante un procedimiento que comprende el
cultivo del organismo productor, por ejemplo, plántulas verdes de
maíz, bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha
enzima, y, posteriormente, recuperar dicha enzima.
La invención también se refiere al uso de una
preparación enzimática resultante de romper la célula u organismo
hospedador que contiene la molécula o construcción de ADN de la
invención, así como al resultante de someter a esta preparación a
diversos pasos de purificación o enriquecimiento por los métodos
conocidos por los técnicos en la materia. Una preparación
resultante de mezclar la preparación anterior con otros componentes
también es objeto de la invención.
La \gamma-TMT de la invención
tiene importancia en la industria alimenticia, en particular, en la
industria del procesado de conservación de alimentos, tales como
atún, sardinas, etc. El empleo de la \gamma-TMT
de la invención en la industria alimenticia podría dar lugar a
alimentos con unos niveles superiores de antioxidantes naturales
otorgando así un valor añadido a dichos productos alimenticios
puesto que se podría aumentar el tiempo de conservación de los
mismos. La molécula de ADN de la invención puede ser utilizada en
procesos de mejora de la conservación de diferentes alimentos,
modulando la expresión por sobreexpresión o represión de la
\gamma-TMT, alterando con ello por un lado la
mayor capacidad vitamínica de los alimentos así como la capacidad
de deterioro de dichos alimentos. En una realización particular, la
molécula de ADN de la invención se utiliza en la obtención de
plantas transgénicas que posean unos niveles de ARNm
correspondientes muy elevados o muy reducidos o inexistentes. Para
la obtención de estas plantas transgénicas se puede proceder con
las técnicas convencionales de ARNm antisentido y/o sobreexpresión
(silenciamiento en sentido), u otras.
La invención también se refiere a una célula
transgénica de una planta, o a la planta que contiene al menos una
de estas células, que comprende una construcción de ADN de la
invención que contiene un promotor, funcional en dicha planta,
operativamente enlazado a una sub-secuencia de ADN
de, al menos 8 nucleótidos, derivada de una molécula de ADN de la
invención, estando unida dicha sub-secuencia de ADN
al promotor en una orientación directa a la de su expresión. Y en
una realización particular esta planta tendría unos niveles
superiores de \alpha-tocoferol o bien de vitamina
E total.
Por tanto, la invención también se refiere a una
célula transgénica de una planta que comprende una construcción de
ADN de la invención que tiene un promotor, funcional en dicha
planta, operativamente enlazado a una sub-secuencia
de ADN de, al menos, 8 nucleótidos, derivada de una molécula de ADN
de la invención, estando unida dicha sub-secuencia
de ADN al promotor en una orientación opuesta a la de su
expresión.
Una planta transgénica que comprende, al menos,
una de dichas células transgénicas, constituye un objeto adicional
de esta invención. En una realización particular, dicha planta
transgénica es una planta de maíz. En otras realizaciones
particulares, las plantas transgénicas son plantas que producen
diferentes niveles tanto de \gamma-tocoferol como
de \alpha-tocoferol.
La utilización de la molécula de ADN de la
invención, en particular, de una molécula de ADNc que codifica para
una \gamma-TMT de maíz, de longitud completa o
parcial, mediante cualquier tipo de técnica, puede generar plantas
transgénicas que tengan alterados los niveles de tocoferoles o de
vitamina E total, con la consiguiente ventaja en la calidad del
fruto de maíz, así como de la planta entera, lo que redunda en un
valor económico añadido a los mismos.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
presente invención y no deben ser considerados como limitativos del
alcance de la misma.
Se ha clonado el gen \gammaTMT, que codifica
para una \gamma-TMT de maíz, relacionado con la
biosíntesis de la vitamina E y se ha caracterizado molecular y
fisiológicamente. El análisis comparativo de la secuencia deducida
de la proteína ha puesto de manifiesto que este gen corresponde a
un gen que codifica para una \gamma-TMT.
Para obtener el gen \gammaTMT se siguió una
estrategia que comprendía el empleo de la técnica
RT-PCR, amplificando por PCR los fragmentos de ADNc
obtenidos a partir de ARNm que se expresaban en plántulas etioladas
y verdes de maíz. Los productos amplificados se subclonaron en unos
vectores y con dichos vectores se transformaron células de
Escherichia coli, seleccionándose las células transformantes
que contenían el vector con el inserto de ADNc correspondiente a
la \gamma-TMT de maíz, que se aisló, purificó y
secuenció. La secuencia obtenida se comparó con otras secuencias de
ADN que codifican para \gamma-TMT de otros
organismos. Seguidamente se explica con detalle este proceso:
Para la obtención del ARNm correspondiente a la
transcripción del gen que codifica para la \gammaTMT de maíz se
extrajo el ARN total procedente tanto de plántulas etioladas como
de plántulas verdes de maíz. Para la extracción de ARN total se
siguió el método descrito por Dellaporta et al. (1983).
Una vez extraído el ARN total de ambos tejidos se
sometieron a una reacción de transcripción inversa
(RT-PCR). Para ello se utilizó el kit comercial
PowerScript Reverse Trancriptase (Clontech, CA, Palo Alto). Las
condiciones de la RT-PCR incluyen: síntesis de las
subpoblaciones ancladas de ADNc de simple cadena, amplificación de
las mismas por PCR utilizando iniciadores arbitrarios; separación y
comparación de las poblaciones resultantes de ADNc de doble cadena
mediante electroferesis en geles de agarosa; recuperación, desde el
gel, de los fragmentos de ADNc amplificados; las condiciones fueron
las que se indican en el manual de uso del citado kit
"PowerScript Reverse Trancriptase".
"PowerScript Reverse Trancriptase".
Una vez amplificados por PCR los fragmentos de
ADNc, éstos se purificaron de la mezcla de PCR mediante el kit
"High Pure PCR Product Purification Kit" de la casa comercial
ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, siguiendo la metodología descrita en su
manual de instrucciones.
Posteriormente, los productos de la
amplificación, que se correspondían con los ARNm expresados en los
distintos tejidos, y contenían la secuencia de nucleótídos que
codificaba para la \gamma-TMT de maíz, se
subclonaron en un vector pGEM-Teasy de la casa
comercial PROMEGA CORPORATION (Madison, Estados Unidos) siguiendo
las instrucciones del fabricante.
Los fragmentos de ADNc contenidos en el plásmido
recombinante se secuenciaron en un secuenciador automático ABI 310
utilizando el kit Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing de
APPLIED BIOSYSTEMS (California, Estados Unidos), obteniéndose la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 1 (que
corresponde a la secuencia de ADN que codifica para una
\gamma-TMT de maíz).
A continuación, se transformaron células de E.
Coli con dicho vector, comprobándose que las células
transformantes contenían el vector con el inserto de ADNc
correspondiente a la \gamma-TMT de maíz, mediante
técnicas convencionales descritas en Sambrok et al., (1989).
Seguidamente se extrajo el ADN correspondiente al plásmido
recombinante, se purificó y secuenció utilizando un secuenciador
automático de ADN mediante técnicas convencionales descritas en
Sambrok et al. (1989). La secuencia obtenida SEQ ID No. 1 se
comparó con las secuencias depositadas en las bases de datos
utilizando el programa BLAST del National Center for Biotechnology
Information (NCBI, Estados Unidos). La comparación de las
secuencias puso de manifiesto que la secuencia de ADN obtenida que
codifica para la \gamma-TMT de maíz presentaba una
relativamente alta homología de secuencia única y exclusivamente
con otras secuencias de diferentes organismos que codifican para
una \gamma-TMT.
El ADNc correspondiente al gen \gammaTMT de
maíz se aisló utilizando la técnica SMART™ RACE cDNA Amplification
Kit (Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript) (Clontech,
CA, Estados Unidos) utilizando dos poblaciones diferentes de ARN de
plántulas de maíz correspondientes a plántulas crecidas en la
oscuridad (etioladas) y plántulas crecidas en luz. Para ello se
utilizaron dos oligonucleótidos específicos Zm3 y Zm2 así como dos
oligonucleótidos iniciadores procedentes del kit comercial.
El uso de estos oligonucleótidos permitió
amplificar fragmentos con una región solapante (Fig. 1). El
oligonucleótido Zm3 (SEQ ID No. 3) se utilizó para amplificar el
extremo 3' obteniéndose un fragmento de ADNc de un tamaño aparente
de 570 pb. Con el oligonucleótido Zm2 (SEQ ID No. 4) se amplificó
un fragmento de 1350 pb del extremo 5'. Estos dos fragmentos del
ADNc se clonaron a continuación en el vector pBluescript® II KS
(+/-) (Stratagene, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del
fabricante y se secuenciaron completamente. Esto permitió comprobar
que la suma de los dos fragmentos de ADNc abarcaba la totalidad de
la región codificante del ADNc de la \gamma-TMT.
La reconstrucción del ADNc completo (pTMT) se realizó por digestión
de ambos clones en la región común, con la enzima EcoRV, y
posterior ligación de los fragmentos.
De acuerdo con lo anterior, se ha conseguido
clonar mediante RACE-PCR el ADNc que codifica para
la \gamma-tocoferol metiltransferasa. Esto
permitió la reconstrucción de un ADNc de 1301 pb que codifica para
una \gamma-tocoferol metiltransferasa
(\gamma-TMT). La fase abierta de lectura desde el
codón de inicio al codón de terminación codifica un péptido de 352
aminoácidos con un peso molecular calculado de 38349 Da, un punto
isoeléctrico de 8,28 y una carga neta de -5,51 a pH 7,0.
La clonación y caracterización del gen de la
\gamma-tocoferol metiltransferasa de Zea mays
constituye un paso previo para la obtención de organismos
transgénicos con los niveles de tocoferoles alterados.
Seguidamente se proporciona una relación
detallada de las referencias bibliográficas que se han ido citando
a lo largo de la exposición anterior:
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\vskip0.333000\baselineskip
<110> Universidad de Córdoba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Molécula de ADN que codifica para una
\gamma-tocoferol metiltransferasa de maíz y sus
aplicaciones
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\vskip0.333000\baselineskip
<130> 2002-1174
\vskip1.000000\baselineskip
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<140>
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
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\vskip0.333000\baselineskip
<160> 4
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\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1301
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Maíz
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 351
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<212> PRT
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<213> Maíz
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Maíz
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<400> 3
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\dddseqskipgaaatacgga gcgcagtgca c
\hfill21
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\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Maíz
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<400> 4
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgctccaggct tgcgacaggt gatga
\hfill25
Claims (22)
1. Una molécula de ADN que codifica para una
\gamma-tocoferol metiltransferasa
(\gamma-TMT) de maíz que comprende una secuencia
de nucleótidos seleccionada entre:
- a)
- una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID No. 1;
- b)
- una secuencia de ADN análoga a la secuencia definida en a) que
- i)
- es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN definida en a) y/o, que
- ii)
- codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de ADN definida en a).
2. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en
la que dicho ADN es ADNc.
3. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en
la que dicho ADN es ADN genómico (ADNg).
4. Una construcción de ADN que comprende (i) una
secuencia de ADN seleccionada entre una molécula de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento de, al
menos, 8 nucleótidos consecutivos de dicha molécula de ADN, y (ii)
una región iniciadora de la transcripción funcional de plantas.
5. Construcción de ADN según la reivindicación 4,
en la que el extremo 3' de dicha secuencia de ADN está unido al
extremo 3' de dicha región iniciadora de la transcripción.
6. Construcción de ADN según la reivindicación 4,
en la que el extremo 5' de dicha secuencia de ADN está unido al
extremo 3' de dicha región iniciadora de la transcripción.
7. Construcción de ADN según las reivindicaciones
4 a 6, que comprende, además, una secuencia de terminación de la
transcripción.
8. Un vector recombinante que comprende una
molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o
una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 4
a 7.
9. Una célula que comprende una molécula de ADN
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una construcción
de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 o un vector
según la reivindicación 8.
10. Una proteína con actividad
\gamma-tocoferol metiltransferasa, obtenible por
expresión de una molécula de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
11. Una proteína con actividad
\gamma-tocoferol metiltransferasa que tiene una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
- a)
- una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No. 2,
- b)
- la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 1 y
- c)
- una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga y funcionalmente equivalente a las secuencias de aminoácidos definidas en a) o en b).
12. Un método para la producción de una proteína
con actividad \gamma-tocoferol metiltransferasa
según cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, que comprende
cultivar una célula según la reivindicación 9 bajo condiciones que
permitan la producción de dicha proteína con actividad
\gamma-tocoferol metiltransferasa y recuperarla
del medio de cultivo.
13. Una preparación enzimática que comprende, al
menos, una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 10 y
11.
14. Preparación enzimática según la
reivindicación 13, que comprende entre 0,01% y 100% en peso de una
proteína según cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11.
15. Preparación enzimática según la
reivindicación 14, que comprende, además una o más proteínas con
actividades enzimáticas diferentes.
16. Un método para aumentar el contenido de
vitamina E total que comprende introducir en una planta productora
de tocoferoles una construcción de ADN que tiene un promotor,
funcional en dicha planta, operativamente enlazado a una
sub-secuencia de ADN de, al menos, 8 nucleótidos
derivada de una molécula de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, estando unida dicha
sub-secuencia de ADN al promotor de una orientación
directa a la de su expresión.
17. Un método para aumentar el contenido de
vitamina E total que comprende introducir en una planta de maíz una
construcción de ADN que tiene un promotor funcional en dicha
planta, operativamente enlazado a una sub-secuencia
de ADN de, al menos, 8 nucleótidos, derivada de una molécula de ADN
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, estando unida dicha
sub-secuencia de ADN al promotor en una orientación
directa a la de su expresión.
18. Un método para aumentar el contenido de
\alpha- y \gamma-tocoferol que comprende
introducir en una planta de maíz un construcción de ADN que tiene
un promotor, funcional en dicha planta, operativamente enlazado a
una sub-secuencia de ADN de, al menos, 8
nucleótidos, derivada de una molécula de ADN según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, estando unida dicha
sub-secuencia de ADN al promotor de una orientación
opuesta a la de su expresión.
19. Una célula transgénica de una planta que
comprende una construcción de ADN que tiene un promotor, funcional
en dicha planta, operativamente enlazado en una
sub-secuencia de ADN de, al menos, 8 nucleótidos,
derivada de una molécula de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, estando unida dicha
sub-secuencia de ADN al promotor en una orientación
opuesta a la de su expresión.
20. Una célula transgénica de una planta que
comprende una construcción de ADN que tiene un promotor, funcional
en dicha planta, operativamente enlazado a una
sub-secuencia de ADN de, al menos, 8 nucléotidos,
derivada de una molécula de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, estando unida dicha
sub-secuencia de ADN al promotor en una orientación
directa a la de su expresión.
21. Una planta transgénica que comprende, al
menos, una célula transgénica según las reivindicaciones 19 y
20.
22. Planta transgénica según la reivindicación
21, en la que dicha planta es una planta de maíz.
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