ES2213996T3 - Uso de himenialdisina o sus derivados en la fabricacion de medicamentos. - Google Patents
Uso de himenialdisina o sus derivados en la fabricacion de medicamentos.Info
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Abstract
El uso de himenialdisina o sus derivados de la fórmula 1 en la cual R1 y R2, idénticos o diferentes, representan H o Br, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para usar en las enfermedades neurodegenerativas que implican la desregulación de las cinasas dependientes de ciclina, GSK-3a y cinasa caseína 1.
Description
Uso de himenialdisina o sus derivados en la
fabricación de medicamentos.
La invención se refiere al uso de himenialdisina
o sus derivados en la fabricación de medicamentos capaces de
bloquear la división celular o la transducción intracelular de las
señales.
Más en particular se refiere al uso de
himenialdisina (denominada en lo sucesivo HD), o sus derivados, en
la fabricación de inhibidores de las cinasas proteína.
Las cinasas proteína están implicadas en la
regulación celular, en particular en la fosforilación de
proteínas.
Las proteínas cinasa dependientes de ciclina
(CDKs en forma abreviada) están implicadas en el control del ciclo
celular (CDK1, 2, 3, 4, 6 y 7), en la apoptosis de timocitos
(CDK2), en funciones neuronales (CDK5), en el control de la
transcripción (CDK7, 8 y 9) (en [1,2,3] se revisa la lista de
referencias que se incluyen al final de la descripción). En los
tejidos nerviosos la CDK5/p35 fosforila las proteínas tau asociadas
a los microtúbulos y MAP-1 B, a la cinasa Pak1 y a
las subunidades de neurofilamentos. En pocos años se ha
desarrollado un despistaje intensivo para identificar una serie de
inhibidores químicos de las CDKs, como olomoucina, roscovitina,
purvalanol, flavopiridol, indirrubinas o paulonas. Algunos de estos
compuestos muestran una notable selectividad y eficiencia. Muchos
han cristalizado simultáneamente con CDK2 y sus interacciones con
el bolsillo de unión del ATP de la cinasa se han analizado
minuciosamente (revisión en [4]).
También se ha descrito que la HD inhibe las
cinasas proteína C (WO 93 16703 y WO 95 31462).
Se ha demostrado ahora que dicho compuesto, y sus
derivados, son inhibidores potentes y selectivos de las CDKs 1, 2 y
5 y de otras dos cinasas proteína mayores implicadas en la
fosforilación de proteínas, por ejemplo, la cinasa sintasa de
glucógeno 3-\beta (GSK-3\beta y
en forma abreviada) y la cinasa caseína 1.
La invención se refiere por tanto al uso de
himenialdisina o sus derivados de la fórmula I
en la cual R^{1} y R^{2}, idénticos o
diferentes, representan H o Br, o una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento
para usar en enfermedades neurodegenerativas que implican la la
desrregulación de las cinasas dependientes de ciclina,
GSK-3\beta y cinasa caseína
1.
El término "derivados", tal como se usa en
la especificación, contiene las sales definidas anteriormente.
En un uso preferido, el compuesto es
4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-ilideno)-4,5,6,7-tetrahidropirrolo(2,3-c)azepin-8-ona,
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
En otro uso preferido, el compuesto es
4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-ilideno)-2-bromo-4,5,6,7-tetrahidropirrolo(2,3-c)azepin-8-ona,
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
Como se observa con otros inhibidores de las
CDKs, la HD y sus derivados actúan compitiendo con el ATP.
Interaccionan con el bolsillo de unión del ATP a través de tres
enlaces hidrógeno con los residuos Glu-81 y
Leu-83 de CDK2.
Los derivados de himenialdisina capaces de formar
enlaces hidrógeno con los residuos Glu-81 y
Leu-83 de CDK2 también forman parte de la
invención.
Como se ha mencionado anteriormente, dichos
compuestos inhiben fuertemente la CDK1, CDK2, CDK5,
GSK-3\beta y la cinasa caseína 1.
Los experimentos in vivo en varios modelos
han demostrado que la HD y sus derivados inhiben la CDK5/p35 como
se demuestra por la ausencia de fosforilación o regulación negativa
de la cinasa Pak1 en las neuronas corticales de la rata E18.
También inhiben la GSK-3\beta
in vivo, tal como se demuestra por la inhibición de la
fosforilación MAP-1 B en un locus específico de la
GSK-3\beta. También bloquean la fosforilación
in vivo de la proteína tau de unión a microtúbulos en los
loci en los que se hiperfosforila por GSK-3\beta y
CDK5/p35 en la enfermedad de Alzheimer.
Al actuar sobre dichas cinasas, que representan
las principales cinasas implicadas en la hiperfosforilación de los
sustratos implicados en las enfermedades neurodegenerativas, dichos
compuestos tienen un gran interés para la fabricación de
medicamentos para el tratamiento y la prevención de las afecciones
correspondientes.
En consecuencia, la invención se refiere al uso
de HD y sus derivados para la fabricación de medicamentos útiles
para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.
Dichos medicamentos se pueden usar para el
tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer. Se puede
mencionar la atrofia de múltiples sistemas, otros trastornos
neuronales, como la enfermedad de Parkinson, o la atrofia muscular
espinal canina hereditaria en los perros.
También se mencionarán la prevención y el
tratamiento de la diabetes, así como el tratamiento o la prevención
antiinflamatoria o del cáncer.
Los compuestos de la fórmula I se puede aislar de
invertebrados marinos [5].
Se ha encontrado HD en especies de esponjas
marinas que pertenecen a las familias Agelasidae,
Axinellidae y Halichondriidae. Estos animales contienen
varias sustancias que están claramente relacionadas desde el punto
de vista metabólico con HD (figura 1).
La adición de ácidos farmacéuticamente aceptables
forma sales de compuestos de la fórmula I con ácidos orgánicos o
inorgánicos según los métodos habituales.
Los ácidos adecuados son los ácidos acético,
ascórbico, maleico, fosfórico, salicílico y tartárico.
Los medicamentos incluyen una cantidad eficaz de
los compuestos mencionados anteriormente junto a un vehículo
farmacológicamente aceptable.
Dicho vehículo puede ser sólido o líquido,
dependiendo de la forma de administración.
Los medicamentos se pueden administrar en varias
formas: por vía parenteral, rectal, tópica, transdérmica u oral.
Más en particular, se administran por vía oral o inyectable.
Para la administración por vía oral se pueden
usar rombos, comprimidos, píldoras, tabletas, cápsulas, gotas,
jarabes, suspensiones o emulsiones. Estas composiciones contienen
para obtener el mayor beneficio 100 a 1000 mg del principio activo
por unidad de dosis, preferiblemente 300 a 600 mg.
Otras formas de administración son las soluciones
inyectables para uso por vía intravenosa, subcutánea o
intramuscular, formuladas en soluciones estériles o esterilizables.
También pueden ser suspensiones o emulsiones.
Estas formas inyectables contienen 100 a 1000 mg
de un compuesto de la fórmula I o una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, preferiblemente 300 a 600 mg, por
unidad de dosis.
A modo de indicación, la posología que se puede
usar en un paciente que necesite este tratamiento se corresponde
con las dosis siguientes: por ejemplo, 100 a 1000 mg/día se
administran de esta manera al paciente de 1 a 4 veces al día para
el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos.
La invención también se refiere a reactivos
biológicos cuyos principios activos consisten en los compuestos de
la fórmula I tal como se han definido anteriormente.
Estos reactivos se pueden usar como referencias o
estándares en estudios de división celular y mecanismos de
fosforilación. Otras características y ventajas de la invención se
describen en los ejemplos que se indican a continuación con
referencia a las figuras 1 a 13, en las cuales:
- La figura 1 representa la estructura de
himenialdisina y metabolitos relacionados aislados a partir de
esponjas marinas.
- La figura 2 muestra la actividad de la
CDK1/cinasa ciclina B en presencia de concentraciones crecientes de
HD y análogas.
- La figura 3 muestra la autorradiografía
obtenida con una presenilina-MBP proteína de fusión
fosforilada in vitro con cinasa caseína 1 en presencia de
concentraciones crecientes de HD y separadas por electroforesis en
SDS-PAGE.
- La figura 3 muestra la autorradiografía
obtenida con una presenilina-MBP proteína de fusión
fosforilada in vitro con cinasa caseína 1 en presencia de
concentraciones crecientes de HD y separadas por electroforesis en
SDS-PAGE.
- La figura 4A representa la inhibición por HD de
la fosforilación Pak1 por CDK5/p35 in vitro e in vivo
(la figura 4A muestra el nivel de la fosforilación H4 después de
una electroforesis en SDS-PAGE del sustrato, y la
figura 4B las transferencias Western que muestran las cantidades de
Pak1 y p35).
- La figura 5A muestra la autorradiografía de
r-htau fosforilada in vitro con
GSK-3\beta en presencia de concentraciones
crecientes de HD y separadas por electroforesis en
SDS-PAGE, y la figura 5B los resultados de la
inmunotransferencia obtenidos por reacción con varios anticuerpos y
preparados de htau23, expuestos o no expuestos a los inhibidores de
las CDKs in vivo.
- La figura 6A muestra los datos cinéticos de las
determinaciones de la actividad de las cinasas proteína
CDK1/
ciclina B en diferentes concentraciones de HD, y la figura 6B muestra los resultados obtenidos cuando se expone la CDK1/ciclina B inmovilizada a HD y la transferencia Western con anticiclina B y anticuerpos anti-PSTAIRE.
ciclina B en diferentes concentraciones de HD, y la figura 6B muestra los resultados obtenidos cuando se expone la CDK1/ciclina B inmovilizada a HD y la transferencia Western con anticiclina B y anticuerpos anti-PSTAIRE.
- La figura 7 muestra una visión en tres
dimensiones del mapa de densidad de electrones de HD formando un
complejo con CDK2.
- La figura 8A muestra un diagrama en tres
dimensiones de la estructura refinada de la HD en el bolsillo de
unión del ATP de CDK2 y la figura 8B la ilustración esquemática de
las interacciones entre CDK2 y HD.
- La figura 9 muestra visiones en tres
dimensiones de la comparación entre la unión de
HD-CDK2 con la de otros ligandos CDK2.
- La figura 10 muestra los resultados obtenidos
por una tinción de inmunofluorescencia doble de las proteínas de
unión GAP-43 y MAP-1
B-P dependiendo de las concentraciones de HD
(A-H) y los resultados de la transferencia Western
con lisados celulares en respuesta al aumento de las dosis de
HD.
- La figura 11 muestra el efecto de HD en el
crecimiento de las células HT
29-18-C1.
- Las figuras 12 y 13 muestran los efectos
celulares de HD con la parada en fase S (figura 12) y en la
transición G2/M (figura 13).
Ortovanadato sódico, EGTA, EDTA, RNAse A, Mops,
\beta-glicerofosfato, fenilfosfato, fluoruro
sódico, glutatión-agarosa, ditiotreitol (DTT),
albúmina sérica bovina (BSA), nitrofenilfosfato, leupeptina,
aprotinina, microcistina, pepstatina, inhibidor de la tripsina de
soja, benzamidina, histona H1 (tipo 111-S),
proteína básica de mielina y caseína se obtuvieron en Sigma
Chemicals [\gamma-^{32}P]-ATP
(PB 168) en Amersham.
El péptido GS-1
(YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE) se obtuvo mediante síntesis.
Himenialdisina se aisló tal como se ha descrito
previamente [6,7] y se disolvió en una solución madre
10-50 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). Se diluyó
hasta 5-10 mM en Me_{2}SO inmediatamente antes de
usarse en tampones acuosos. La concentración final de DMSO en la
mezcla de reacción fue menor del 1% (v/v).
Axinohidantoína [7], el complejo
himenialdisina-platino, diacetilhimenialdisina,
diacetii-debromohimenialdisina, dibromofakelestatina
[6], agelastatina A [8], dibromoageliferina, clatrodina, himenidina
y dibromocantarelina [9] se prepararon en el laboratorio.
Agelongina [10], dispacamida B [11], esceptrina [12], oroidina [13]
y estevensina (odilina) [14,9] se purificaron a partir de especies
de Agelas.
La proteína GST del retinoblastoma se expresó en
bacterias y se purificó en cuentas de
glutatión-Sepharose, tal como se ha descrito
previamente [15]. Las cuentas de
p9^{CKShs1}-Sepharose se prepararon tal como se
ha descrito previamente [16].
Tampón de homogenización:
(\beta-glicerofosfato 60 mM,
p-mtrofenilfosfato 15 mM, Mops (pH 7,2) 25 mM, EGTA
15 mM, MgCl_{2} 15 mM, DTT 1 mM, vanadato sódico 1 mM, NaF 1 mM,
fenilfosfato 1 mM, leupeptina 10 \mug/ml, aprotinina 10
\muglml, inhibidor de la tripsina de soja 10 \mug/ml y
benzamidina 100 \muM.
Tampón A: MgCl_{2} 1 mM, EGTA 1 mM, DTT
1 mM, Tris-HCl 25 mM pH 7,5, heparina 50
\mug/ml.
Tampón C: Tampón de homogenización pero
con EGTA 5 mM, sin NaF y sin inhibidores de proteasa.
Tampón de lisis hipotónico (TLH):
Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 120 mM, glicerol al
10%, Nonidet-P40 al 1%, DTT 5 mM, EGTA 1 mM, NaF 20
mM, ortovanadato 1 mM, microcistina 5 \muM y 100 \mug/ml de
cada uno de los siguientes productos: leupeptina, aprotinina y
pepstatina.
Solución salina tamponada con
Tris-Tween-20 (TBST): Tris 50 mM
pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0.1%. Tampón
STM: Tris-HCl 10 mM pH 8,0, sacarosa 0,25 M,
MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM e inhibidores de proteasa y fosfatasa
[17].
Las actividades de las cinasas se determinaron en
el tampón A o C (a menos que se indique lo contrario), a 30°C. con
una concentración final de ATP de 15 \muM. Los valores del blanco
se restaron y las actividades se calcularon como pmoles de fosfato
incorporados durante una incubación de 10 minutos (expresados
habitualmente como % de la actividad máxima, es decir, sin
inhibidores). Los controles se realizaron con diluciones apropiadas
de Me_{2}SO. En algunos casos, se determinó la fosforilación del
substrato mediante autorradiografía después de electroforesis en
SDS-PAGE. Los valores de la CI_{50} se estimaron
a partir de las curvas de dosis-respuesta.
La CDK1/ciclina B se extrajo en el tampón
de homogenización a partir de oocitos de la estrella de mar
(Marthasterias glacialis) en fase M y se purificó mediante
cromatografía de afinidad en cuentas de
p9^{CKShs1}-Sepharose, a partir de la cual se
eluyó mediante p9^{CKShs1} libre, tal como se ha descrito [15,16].
La actividad de la cinasa se determinó en el tampón C, con 1 mg/ml
de histona H1, en presencia de ATP 15 \muM
[\gamma-^{32}P] (3.000 Ci/mmol; 1 mCi/ml) en un
volumen final de 30 \mul. Después de 10 minutos de incubación a
30°C se sembraron alícuotas de 25 \mul del sobrenadante en piezas
de 2,5 x 3 cm de papel de fosfocelulosa Whatman P81, y 20 segundos
más tarde se lavaron los filtros cinco veces (al menos durante 5
minutos cada vez) en una solución de 10 ml de ácido fosfórico/litro
de agua. Los filtros húmedos se contaron en presencia de 1 ml de
líquido de centelleo ACS (Amersham).
La GSK-3\beta se
purificó a partir de músculo de conejo o se expresó y purificó en
células Sf9 de insecto [18]. Se valoró después de una dilución 11100
en 1 mg de BSA/ml de DTT 10 mM, con 5 \mul del péptido
GS-1 40 \muM como sustrato, en el tampón A, en
presencia de ATP 15 \muM [\gamma-^{32}] (3.000
Ci/mmol; 1 mCi/ml) en un volumen final de 30 \mul. Después de 30
minutos de incubación a 30°C, se sembraron alícuotas de 25 \mul
del sobrenadante en papeles de fosfocelulosa P81 y se trataron como
se ha descrito anteriormente.
La CDK5/p25 se reconstituyó mezclando cantidades
iguales de CDK5 recombinante y p25 expresadas en E. coli
como proteínas de fusión GST
(Glutatión-S-transferasa) y se
purificaron por cromatografía de afinidad en
glutatión-agarosa (p25 es una versión truncada del
activador CDK5). Su actividad se determinó en el tampón C como se
ha descrito en el caso de CDK1/ciclina B.
La CDK2/ciclina A, la CDK2/ciclina
E, la CDK3/ciclina E, la CDK4lciclina D1, la
CDK6/ciclina D2, erk1 y erk2 marcado con His,
las isoformas de las cinasas proteína C, la subunidad
catalítica de las cinasas proteína dependientes de cAMP, las
cinasas proteína dependientes de cGMP, la cinasa de la
cadena ligera de la miosina, las cinasas caseína 1 y 2,
ASK-y (un homólogo vegetal de
GSK-3), el dominio de cinasa tirosina del
receptor de insulina (CIRK-41),
c-raf, MAPKK, la cinasa
N-terminal c-jun (obtenida de
Promega), la cinasa c-src y la cinasa
v-abl se determinaron tal como se ha descrito
[15].
Las proteínas unidas a las cuentas de
p9^{CKSns1}-Sepharose (CDK1/ciclina B de estrella
de mar) se desnaturalizaron con tampón de muestra Laemmli 2X. Las
muestras se analizaron en geles de
SDS-poliacrilamida al 10%. Las proteínas se
transfirieron desde el gel a una hoja de nitrocelulosa de 0,1 pm en
un sistema milliblot-SDE (Millipore) durante 30
minutos a 2,5 mA/cm^{2} en tampón de transferencia.
Posteriormente, el filtro se bloqueó con leche baja en grasa al 5%
en TBST durante 1 hora. El filtro se lavó a continuación con TBST y
se incubó durante 1 hora con los primeros anticuerpos
(anti-PSTAIRE, 1:2000; anticiclina B, 1:1000).
Después de 4 lavados (1 X 20 minutos, 3 X 5 minutos) con TBST, la
hoja de nitrocelulosa se trató durante 1 hora con anticuerpos
secundarios acoplados a peroxidasa de rábano diluidos en TBST
(1:1000). El filtro se lavó a continuación 5 veces (1 X 20 minutos,
4 X 5 minutos) con TBST y se analizó por quimioluminescencia
potenciada con reactivos de detección ECL e hiperfilm MP.
La CDK2 humana se purificó y cristalizó tal como
se ha descrito previamente [19]. Para prevenir el agrietamiento de
los cristales se utilizó un procedimiento que implica la
reticulación química. Los cristales se sumergieron primero en una
solución que contiene ATP 0,5 mM y MgCl_{2} 1 mM durante 2 horas,
después se reticularon con glutaraldehído al 0,1% durante 1 hora a
4°C. Después de un lavado exhaustivo los cristales se transfirieron
a una solución de inhibidor en HEPES 0,2 M, etilenglicol al 5% y
DMSO al 1%. Este protocolo permitía que los cristales se sumergieran
en concentraciones del inhibidor hasta 0,5 mM durante varios días
sin mostrar daño alguno.
Los datos de difracción de rayos X hasta una
resolución de 2,1 A se obtuvieron en un solo cristal de CDK2/HD
usando un sistema de detección con placa de imagen
R-Axis II montado en un generador Rigaku con
rotación del ánodo. Los datos se recogieron a 120 K para prevenir
el daño por radiación de los cristales. Inmediatamente antes de la
congelación el cristal se transfirió a una solución crioprotectora
que contenía etilenglicol al 25%. La congelación rápida se
consiguió en un chorro de nitrógeno seco usando un criodispositivo
de Molecular Structure Corporation. La congelación alteró
ligeramente las dimensiones de la célula unitaria y aumentó la
diseminación del mosaico de 0,2° a 0,6°. La reticulación no alteró
significativamente por sí misma las características de difracción.
Los datos de intensidad se procesaron utilizando los programas
DENZO y SCALEPACK [20]. Para obtener el grupo final de las
amplitudes del factor de la estructura se usó el programa TRUNCATE,
tal como se ha introducido en la serie CCP4 [21]. En la Tabla 3 se
muestra un resumen de las estadísticas del procesamiento de datos.
El refinamiento del complejo CDK2/HD comenzó a partir de las
coordenadas del modelo CDK2/ATP muy refinado. Todos los pasos del
refinamiento se realizaron usando el programa X- PLOR [22]. Para
reorientar y reposicionar satisfactoriamente la molécula de CDK2 en
la célula unitaria del cristal congelado fue necesario utilizar la
sustitución molecular seguida por el refinamiento rígido del cuerpo.
El modelo se refinó aún más usando varias tandas de minimización de
la energía de gradiente conjugada. Después de esta etapa, la
densidad clara de los electrones, calculada a partir de los mapas
de Fourier 2F_{o},-F_{c} y F_{o}-F_{c},
indicó el modo de unión del inhibidor de himenialdisina. Las
coordenadas iniciales y los términos de la limitación geométrica de
himenialdisina se obtuvieron a partir de la estructura molecular
pequeña de Mattia y cols. [23]. El modelo de refinamiento de
CDK2/HD se buscó a continuación con varias tandas de minimización
de la energía limitada de rayos X y por la dinámica molecular,
alternadas ambas con la construcción del modelo. Hacia el final del
refinamiento se añadieron al modelo varias moléculas de agua y
algunas moléculas de etilenglicol. La estereoquímica del modelo
CDK2/HD se verificó usando el programa informático PROCHECK
[24].
El gran bucle hidrofílico de
presenilina-2 que se encuentra entre los dominios
de transmembrana 6 y 7 se expresó en E. coli como una
proteína de fusión de la proteína de unión
presenilina-bucle 2-maltosa (MBP)
[25]. Después de purificarla con una cromatografia de afinidad la
presenilina-2-MBP se usó como
sustrato de la CK1. Después de una incubación de 30 minutos en
presencia de varias concentraciones de HD se interrumpió la reacción
de la cinasa añadiendo el tampón de muestra Laernmli.
MBP-presenilina-2 se separó por
electroforesis en SDS-PAGE y su nivel de
fosforilación se visualizó por autorradiografía.
La CDK5/p35 se obtuvo por precipitación inmune a
partir de cortezas de rata P02 usando el anticuerpo Santa Cruz
C-terminal (400 \mug de proteínas totales por
determinación de cinasa). El precipitado inmune se dividió en
alícuotas iguales y las determinaciones de cinasa se realizaron
utilizando GST-Pak1 K299 como sustrato. Se añadió a
las cuentas roscovitina, HD o DMSO inmediatamente antes de la
determinación de la cinasa, tal como se ha descrito [17]. La
fosforilación se monitorizó por autorradiografía.
La HD se añadió a neuronas cultivadas procedentes
de cortezas de embriones de rata E18 cuando los cultivos tenían 4
días de antigüedad. Como control se usó DMSO hasta el volumen
máximo del fármaco utilizado (7,5 \mul). El fármaco se dejó
actuar sobre las células durante 1 hora. Las células se lisaron a
continuación en hielo en tampón STM y la fracción de membrana se
aisló con STM que contenía NP-40 al 0,5% [17].
Las inmunoprecipitaciones de Pak1 se realizaron
usando un anticuerpo policlonal específico, seguido por
determinaciones de cinasa usando la histona H4 como sustrato. La
cantidad de fosforilación de H4, que refleja el nivel de actividad
Pak1, se determinó midiendo la intensidad de las bandas en la
película de autorradiografía y cuantificando con el programa de
adquisición de imágenes NIH.
Como controles de carga se realizaron
transferencias Western Pak1 y p35. La cantidad de esta última
proteína aumenta con el nivel de inhibición de la cinasa
CDK5/p35.
Las células granulares cerebelosas se aislaron de
ratones recién nacidos y se purificaron según el método de Hallen
[26] usando gradientes de Percoll. Las células se sembraron en
placas recubiertas con poli-D-lisina
(100 \mug/ml) y laminina (50 \muglml) y crecieron en medio sin
suero durante 1 día, tratándose a continuación los cultivos con HD
(1-100 \muM) durante 20 h. Los cultivos se
fijaron con formaldehído al 4% en PBS y se almacenaron en PBS a
4°C. Las células se permeabilizaron con metanol al 100% y se
incubaron con anticuerpos primarios frente a GAP-43
y MAP-1B-P (SMI-31,
Afinito) toda la noche a 4°C. Se usaron los anticuerpos secundarios
conjugados FIAC y Texas Red (Vector). Para el análisis de
transferencia Western, las células se lisaron en el tampón de
muestra y se analizaron mediante una electroforesis en
SDS-PAGE al 8%. Las proteínas se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo frente
a MAP-1B-P (SMI-31)
diluido en la solución de bloqueo (Tween-20 al 0,1%
y leche descremada en polvo al 3% en TBS) durante 2 h a temperatura
ambiente. Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP
(Amersham) y las proteínas se visualizaron con un sistema ECL
(Pierce). Las transferencias se escanearon usando un escáner de
lecho plano (UMAX Astra 1200S).
Células y virus. Las células Sf9
(InVitrogen, San Diego, CA) crecieron 27°C en un cultivo monocapa
en medio de Grace (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) suplementado con
suero fetal bovino al 10% y 50 \mug de gentamicina/ml y 2,5
\mug de anfotericina/ml. BaculoGold se obtuvo en PharMingen (San
Diego, CA) y el pVL1392 en InVitrogen.
Transfección tau. El gen de htau23, la
isoforma tau más corta en el hombre [27] se escindió del vector de
expresión bacteriano pNG2 [28] con Xbal y BamHI, y se insertó en el
vector de transferencia baculovirus pVL1392 cortado con las mismas
endonucleasas de restricción. El sistema BaculoGold se usó para
construir el vector que contiene el baculovirus tau. El BaculoGold
DNA es un tipo de baculovirus modificado que contiene una supresión
letal. La transfección simultánea del BaculoGold DNA con un vector
de transferencia baculovirus complementario rescató la supresión
letal de este virus de ADN y reconstituyó partículas viables del
mismo que transportaban la secuencia de codificación htau23. El
plásmido de ADN usado para la transfección se purificó usando
cartuchos QIAGEN (Hilden, Alernania). Las células Sf9 crecidas en
monocapas (2x10^{6} células en una placa de cultivo celular de 60
mm) se transfectaron simultáneamente con el baculovirus de ADN (0,5
\mug de BaculoGold ADN) y con derivados del vector de pVL1392 (2
\mug) usando el método de precipitación simultánea con fosfato
cálcico. La presencia de la proteína recombinante se examinó en las
células infectadas 5 días después de la infección mediante
electroforesis en SDS-PAGE y transferencia
Western.
Para determinar los efectos de los inhibidores de
la cinasa sobre la fosforilación tau, las células Sf9 infectadas
con baculovirus que expresan htau23 se trataron a las 36 h tras la
infección con HD 50 \muM o flavopiridol durante 5 h antes de ser
cosechadas. Para obtener las muestras tau de control con una
fosforilación potenciada, las células Sf9 que expresan htau23 se
trataron con ácido okadaico 0,2 \muM durante 5 h antes de la
cosecha.
Las células Sf9 se infectaron con virus
recombinante con un MOI de 1-5. Los lisados de
células se prepararon en tampón de lisis hipotónico (HLB). Después
de 15 minutos de centrifugación a 16.000 g, el sobrenadante se
recuperó y su concentración de NaCI se aumentó hasta 500 mM. A
continuación se hizo hervir durante 10 minutos y se volvió a
centrifugar a 16.000 g durante 15 minutos. Las proteínas (3 \mug)
se separaron por electroforesis en SDS-PAGE, se
transfirieron a una membrana de PVDF y se efectuó la transferencia
Western con los siguientes anticuerpos: AT-8
(1:2000), AT-180 (1:1000), AT-100
(1:500), PHF-1 (1:600) y el anticuerpo policlonal
anti-tau K9JA.
La fosforilación tau in vitro se
realizó usando GSK-3\beta purificada y
tau-32 recombinante como sustrato. Después de una
incubación de 30 minutos en presencia de varias concentraciones de
HD, en las condiciones de determinación de GSK-38
descritas anteriormente, la reacción de la cinasa se detuvo
añadiendo el tampón de muestra Laemmli. Las proteínas tau se
separaron por electroforesis en SDS-PAGE y su nivel
de fosforilación se visualizó por autorradiografía.
Las actividades enzimáticas se determinaron tal
como se describe en la sección de Procedimientos experimentales, en
presencia de concentraciones crecientes de HD. Las CI_{50} se
calcularon a partir de las curvas de
dosis-respuesta. -, sin efecto en la dosis más alta
estudiada (entre paréntesis). Los resultados se muestran en la
Tabla 1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En presencia de ATP 15 \muM se encontró que HD
inhibe CDK1/ciclina B, CDK2/ciclina A, CDK2/ciclina E, CDK3/ciclina
E y CDK5/p35 con unas CI_{50} de 22, 70, 40, 100 y 28 nM,
respectivamente (Tabla 1). Como se observa con olomoucina [29],
roscovitina [15],
indirrubina-3'-monoxima [30],
kenpaulona [31] y, al contrario que flavopiridol [32], HD tuvo un
efecto limitado sobre CDK4/ciclina D1 y CDK6/ciclina D2 (CI_{50}
de 600 y 700 nM, respectivamente).
HD se probó a continuación en varias cinasas
altamente purificadas (Tabla 1). Las actividades de la cinasa se
estudiaron con los sustratos apropiados (histona H1, caseína,
proteína básica de mielina, péptidos,... etc.), con ATP 15 \muM
(concentración elegida por razones prácticas: comparación con
artículos publicados previamente; la alta especificidad del ATP y en
presencia de concentraciones crecientes de HD. Los valores de la
CI_{50} también se presentan en la Tabla 1. La mayoría de las
cinasas probadas se inhibieron mal o no se inhibieron (CI_{50}
> l \muM). Sin embargo, dos cinasas, la cinasa sintasa de
glucógeno-3\beta (GSK-3\beta) y
cinasa caseína 1 (CK1) fueron muy sensibles a HD (CI_{50} de 10 y
35 nM, respectivamente).
La CDK1/ciclina B se estudió tal como se describe
en la sección de Procedimientos experimentales en presencia de
concentraciones crecientes de HD y sus análogos. La actividad se
presenta como el % de la actividad máxima, es decir, medida en
ausencia de inhibidores. Los resultados se muestran en la figura
2.
Las cinasas sensibles a HD también se estudiaron
in vitro con sustratos relevantes desde el punto de vista
fisiológico: un fragmento de presenilina-2 [25]
para cinasa caseína 1, Pak1 [17] para CDK5/p35, el sustrato
IRS-1 del receptor de insulina [33] o tau para
GSK-3\beta. Los resultados se muestran en las
figuras 3-5.
La figura 3 muestra el efecto inhibidor de HD
sobre la fosforilación de presenilina-2 mediante la
cinasa caseína 1 in vitro. Una proteína de fusión expresada
por bacterias entre presenilina-2 y la proteína de
unión a maltosa (PS-2.MBP) se fosforiló in
vitro con la cinasa caseína 1 en presencia de concentraciones
crecientes de HD y se separó por electroforesis en
SDS-PAGE, seguida por autorradiografía.
La figura 4 muestra el efecto inhibidor de HD en
la fosforilación Pak1 por CDK5/p35 in vitro e in
vivo. Las neuronas corticales de embriones de rata se
expusieron a varias concentraciones de HD durante 1 h. A
continuación se procedió a la precipitación inmune de Pak1 y se
midió su actividad de cinasa hacia la histona H4. El panel superior
muestra el nivel de fosforilación H4 después de la electroforesis
en SDS-PAGE del sustrato. Los números corresponden
a la cuantificación de la autorradiografía. Las transferencias
Western muestran las cantidades de Pak1 (panel inferior) y de p35,
con un aumento de las concentraciones de p35 como consecuencia de
la inhibición de CDK5. La figura 5 muestra el efecto inhibidor de
la fosforilación mediante la fosforilación tau por
GSK-3\beta in vitro e in vivo.
La figura 5A muestra los resultados de los
siguientes experimentos: la proteína tau recombinante humana
expresada por bacterias fue fosforilada in vitro con
GSK-3\beta en presencia de concentraciones
crecientes de HD y se separó por electroforesis en
SDS-PAGE, seguida por autorradiografía.
En los experimentos cuyos resultados se muestran
en la figura 5B, las células Sf9 que expresan htau23 se dejaron sin
tratamiento (-) o expuestas a ácido okadaico (OA), himenialdisina
(HD) o fiavopiridol (FL) durante 5 h. Los lisados celulares (3
\mug de htau23) se separaron mediante electroforesis en
SDS-PAGE, se tiñeron con azul de Coomassie o se
procedió a la transferencia inmune con varios anticuerpos: K9JA (un
pan-anticuerpo frente a tau) reconoce todos los
preparados que contienen tau: AT8, AT180 y PHF1 son específicos de
los diferentes motivos fosforilados de SP o TP; AT100 reconoce la
tau fosforilada en T212 y S214, una reacción muy específica de la
tau del Alzheimer.
La sensibilidad de las cinasas hacia HD se
mantuvo bastante comparable a la sensibilidad de las mismas cinasas
valoradas con sustratos más artificiales.
Se probaron algunos compuestos naturales
relacionados con la HD aislados a partir de esponjas marinas y
algunos análogos de HD modificados sintéticamente sobre
CDK1/ciclina B, CDK5/p35, GSK-3\beta y CK1. Los
resultados se muestran en la figura 2 y en la Tabla 2. Los números
se refieren a las estructuras que se muestran en la figura 1. Las
actividades enzimáticas se estudiaron tal como se describe en la
sección de Procedimientos experimentales, en presencia de
concentraciones crecientes de HD. Las CI_{50} se calcularon a
partir de las curvas de dosis-respuesta. Cuando no
se observó ningún efecto inhibidor (-), se indica entre paréntesis
la concentración más alta probada.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
HD seguía siendo el compuesto más activo. Es interesante que la
dibromocantarelina (10) mostró un efecto\cr inhibidor significativo
hacia GSK-3 \beta (CI _{50} de 3 \mu M).
Himenidina (13) fue selectiva para
CDK5.\cr}
Para investigar el mecanismo de acción de la HD
se realizaron experimentos cinéticos variando tanto los niveles de
ATP como las concentraciones de HD (figura 6A). Se efectuó un
trazado recíproco doble de los datos cinéticos de los análisis de
la actividad de las cinasas proteína CDK1/ciclina B en diferentes
concentraciones de himenialdisina. Las actividades enzimáticas se
estudiaron tal como se describe en la sección de Procedimientos
experimentales. Resultados que se muestran en la figura 6A: trazado
primario de 1/v frente a 1/ATP. Las concentraciones de ATP en la
mezcla de la reacción variaron desde 0,05 a 0,25 mM, la
concentración de histona H1 se mantuvo constante en 0,7 mg/ml. El
gráfico del recuadro muestra los nuevos trazados secundarios de las
pendientes frente a la concentración de los trazados primarios. La
constante de inhibición aparente (Ki) está indicada por la flecha.
Resultados que se muestran en la figura 6B: himenialdisina no
libera ciclina B a partir de CDK1. La CDK1/ciclina B inmovilizada en
p9^{CKShs1}-sepharose se expuso a HD durante 30
minutos, se lavó y se analizó por transferencia Western con
anticuerpos anticiclina B y anti-PSTAIRE.
Los datos demuestran que HD actúa como un
inhibidor competitivo de ATP. La linealidad de los nuevos trazados
de la pendiente frente a la concentración de HD cualifica a la HD
como un inhibidor lineal (figura 6A, recuadro). La constante de
inhibición aparente (Ki) fue de 50 nM. HD no actúa desplazando la
ciclina B de la CDK1 (figura 6B): la CDK1/ciclina B inmovilizada
sobre p^{CKSns1}-sepharose se expuso a
concentraciones altas de HD; las cuentas se lavaron exhaustivamente
antes del análisis por transferencia Western. Ambas subunidades aún
eran detectables juntas.
La estructura de un cristal de CDK2 sumergido en
HD se determinó y refinó con una resolución de 2,1 \ring{A}. El
tratamiento con un agente reticulante antes de la inmersión fue
necesario para prevenir que el cristal se agrietase. Los detalles
de determinación de la estructura se muestran en la Tabla 3.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
* \+ R _{sym} = \Sigma I I(h)-< 1(h)>
1/ \Sigma I(h), con I(h), intensidad observada y
<I(h) intensidad media de la reflexión\cr \+ h en todas
las mediciones de I(h).\cr ** \+ R _{factor} =
\Sigma F _{0} - F _{c} 1/ \Sigma (F _{0} ), tomándose las sumas
a lo largo de todas las reflexiones con un punto de corte\cr \+
F/ \sigma (F)> 1.\cr \ding{61} \+ R _{libre} =
R _{factor} para el 10% de los datos, que no se incluyeron durante
el refinamiento cristalográfico.\cr # \+ Valores B = Media de los
valores B para todos los átomos distintos de
hidrógeno.\cr}
El modelo final consiste en 274 residuos de
aminoácidos, una HD ligada, 85 moléculas de disolvente y cuatro
moléculas de etilenglicol, con un factor R cristalográfico de 19,2%
(R_{libre} del 26,7%) y una buena geometría. Los residuos
36-44 y 149-163 de CDK2, que forman
parte de dos bucles altamente flexibles, se dejaron fuera del
modelo final debido a su densidad de electrones débil o nula. Todos
los residuos no glicina del modelo de CDK2 tienen unos ángulos de
torsión de la cadena principal que quedan dentro de las regiones
energéticamente favorables del trazado de Ramachandran [26], excepto
en el caso de dos residuos, Glu-73 y
Arg-126, que tienen conformaciones de su esqueleto
que quedan inmediatamente fuera de la región "adicional
permitida" en el espacio \phi -\psi.
En la figura 7 se muestra una visión en tres
dimensiones de la densidad de electrones de HD. La HD podría
localizarse sin dudas en un mapa de diferencias de Fourier, lo que
confirma que este inhibidor también se une en el bolsillo de unión
del ATP (figura 7A). En las figuras 7B y 8 se muestra una
representación esquemática de las interacciones que se producen en
el locus de unión.
La figura 7A es un diagrama en tres dimensiones
que muestra la estructura refinada de HD en el bolsillo de unión
del ATP de CDK2. Los enlaces hidrógeno deducidos se muestran como
líneas finas de puntos.
La figura 7B es una ilustración esquemática de
las interacciones entre CDK2 y HD. Los contactos de la cadena
lateral de la proteína están indicados por las líneas que unen con
el cuadro de residuos respectivos, mientras que las interacciones
con los átomos de la cadena principal se muestran como líneas hacia
el átomo específico de la cadena principal. Los contactos de Van der
Waals están indicados por líneas de puntos y los enlaces de
hidrógeno por líneas discontinuas.
El sistema pirroloazepina de doble anillo de la
HD llena un bolsillo hidrofóbico superficial formado por
Ile-10, Val-18,
Ala-31, Val-64,
Phe-80, y Leu-134, estableciendo
varios contactos de Van der Waals con los átomos de la cadena
lateral en estos residuos. Además, se forman tres enlaces hidrógeno
con el esqueleto de CDK2, entre el átomo N1 del anillo pirrol y el
oxígeno carbonilo de Leu-83, entre el oxígeno
carbonilo O1 del anillo azepina y la amida del esqueleto de
Leu-83, y entre la amida N2 del anillo azepina y el
oxígeno carbonilo de Glu-81. El átomo de bromo
unido al anillo pirrolo de HD señala hacia el exterior del bolsillo
de unión del ATP, donde está parcialmente expuesto al disolvente
pero también se envuelve frente a los oxígenos carbonilo de la
cadena principal de Ile-10 e Hís-84,
y las cadenas laterales de He-10 y
Leu-134. La unión del sistema de anillo guanidina de
la HD implica algunos contactos de Van der Waals, principalmente
con la cadena lateral de Val-18, además de un enlace
de directo de hidrógeno y dos mediados por agua. El enlace directo
de hidrógeno se forma entre el grupo amino N5 de la guanidina y un
oxígeno de la cadena lateral de Asp-145. Los dos
enlaces hidrógeno mediados por agua se encuentran entre el O2 de HD
y la cadena principal NH de Asp-145, y entre el N5
de HD y el carbonilo de la cadena principal de
Gin-131. La comparación con las estructuras de la
apo-CDK2 y CDK2/ATP revela un gran movimiento de
Asp-145 cuando se une a HD, constituye en una
desviación de 1 \ring{A} del átomo de C\alpha, y una rotación de
la cadena lateral de aproximadamente 90° alrededor del enlace de
C\alpha-C\beta lejos del anillo guanidina de la
HD. Todos los demás residuos que entran en contacto con el
inhibidor tienen conformaciones muy similares a las observadas en
las estructuras apo-CDK2 y CDK2/ATP.
Para proporcionar una base estructural para
entender la potencia de la HD, la estructura del complejo CDK2/HD
se comparó con las estructuras de CDK2 que ha formado el complejo
con ATP, estaurosporina, flavopiridol y con los análogos de purina
olomoucina, roscovitina y purvalanol, así como con la estructura
del complejo ciclina A/CDK2/ATP. Las visiones en tres dimensiones
que muestran esta comparación se muestran en la figura 9.
La figura 9A muestra la superposición HD (enlaces
negros) en el ATP (enlaces blancos) en la apo-CDK2
y en el ATP (enlaces amarillos) en la ciclina
A-CDK2.
La figura 9B muestra la superposición de HD en
olomoucina (blanco) y purvalanol.
La figura 9C muestra la superposición de HD en
flavopíridol. Los átomos del esqueleto de CDK2 de los residuos
81-84, y la cadena lateral de
Asp-145 en el complejo CDK2/HD se muestran en la
representación de bolas y varillas con los enlaces negros. Los
mismos residuos del complejo superpuesto
CDK2-ligando se muestran como enlaces. En A), los
enlaces finos se refieren a la apoenzima y los enlaces gruesos a
los dímeros de ciclina A-CDK2.
El sistema de doble anillo hidrofóbico de HD se
une aproximadamente en la misma posición en CDK2 que el anillo
purina de ATP en el complejo CDK2/ATP, similar a las posiciones de
los sistemas de doble anillo en los otros complejos CDK2/inhibidor
(figura 9). Aunque la orientación de los distintos sistemas de doble
anillo varía significativamente entre los diferentes inhibidores,
está limitada por la necesidad de proporcionar la forma óptima
complementaria al bolsillo de unión superficial de
ATP-purina mientras que se permite la formación de
varios enlaces hidrógeno con el esqueleto de los residuos
81-83 en la conexión cruzada en CDK2. Las
interacciones de unión al hidrógeno en el complejo CDK2/HD parecen
ser las más favorables entre todos los complejos CDK2/inhibidor
estudiados hasta la fecha. Los enlaces hidrógeno entre N2 y el
oxígeno del péptido de Glu-81, y entre O1 y la amida
del péptido de Leu-83 se parecen estrechamente a
los que se encuentran entre la base de adenina de ATP y la CDK2 y
los que hay en los complejos CDK2/inhibidor con estaurosporina y
flavopiridol. El tercer enlace hidrógeno en el complejo CDK2/HD con
el carbonilo de la cadena principal de Leu-83 está
ausente en estos complejos y se puede observar únicamente en los
complejos con los tres inhibidores con base de purina olomoucina,
roscovitina y purvalanol. Como la HD, estos tres últimos
inhibidores también forman tres enlaces hidrógeno con la conexión
cruzada pero su interacción con el oxígeno del péptido
Glu-81 es mucho más débil, lo que implica un
extraño enlace hidrógeno C-H- - -O con
el átomo ácido de C8 del anillo purina.
El átomo de bromo de HD se une cerca de una
región en CDK2 que en los otros complejos CDK2/inhibidor está
ocupada por un grupo bencilo. La unión de un grupo hidrofóbico en
esta región, donde se puede envolver frente a las cadenas laterales
de Ile-10, Phe-82 y el esqueleto de
los residuos 82-84, es importante para aumentar la
especificidad de los inhibidores de CDK2. Aunque el bromo de HD no
puede proporcionar el mismo número de interacciones que el anillo
bencilo, es probable que la presencia de este átomo en la HD
contribuya significativamente a su afinidad y especificidad de unión
hacia la CDK2, como se puede ver a partir de las actividades
inhibidoras de varios análogos de HD en la Tabla 2 y en la figura
2.
También es interesante la región de la CDK2
ocupada por el anillo guanidina de la HD. Una superposición con los
otros complejos CDK2/inhibidor muestra que sólo los inhibidores de
flavopiridol y estaurosporina tienen grupos unidos en esta región
de la CDK2, que en parte se superpone con el bolsillo en el que se
une el \alpha-fosfato del ATP. La comparación de
la estructura del complejo CDK2/HD con la del complejo de
CDK2/flavopiridol [34] revela un número de similitudes llamativas
entre los modos de unión de estos inhibidores estructuralmente
diversos. El oxígeno carbonilo O2 de HD se localiza cerca de la
posición del grupo hidroxilo O7 del flavopiridol, que deriva del
anillo benzopirano unido en el bolsillo de unión de
ATP-purina. En ambos inhibidores los átomos de
oxígeno construyen un enlace hidrógeno mediado por agua con la
amida de la cadena principal de Asp-145. Además, el
grupo amino N5 en el anillo guanidina de HD se localiza cerca de la
posición del grupo amino de carga positiva del anillo piperidinilo
en el complejo CDK2/flavopiridol. Ambos átomos se encuentran a una
distancia del enlace hidrógeno con el carboxilato de la cadena
lateral de Asp-145. La interacción energéticamente
favorable entre el grupo amino de carga positiva del flavopiridol y
el carboxilato de carga negativa de Asp-145 tendría
una contribución importante a la fuerza de unión de este inhibidor
con la CDK2. Parece posible una interacción similar en el complejo
CDK2/HD, como sucede en las condiciones fisiológicas en las que es
probable que el anillo guanidina esté protonado, al menos en parte,
en N3, lo que aporta una carga positiva (parcial) deslocalizada
entre N3, C11, N4 y N5. También se conserva el movimiento de
Asp-145 en ambos complejos CDK2/inhibidor. También
se ve en la estructura
indirrubina-5-sulfonato/CDK2.
Asp-145 forma parte del motivo DFG conservado que se
encuentra en la mayoría de las cinasas proteína. Aunque
significativamente diferentes de las del complejo CDK2/ATP, la
posición y conformación de Asp-145 en ambos
complejos CDK2/inhibidor son, en realidad, muy similares a las del
complejo ciclina A/CDK2/ATP, funcionalmente más relevante (figura
9A).
También se investigaron los efectos de HD en la
fosforilación in vitro e in vivo de varios sustratos
proteicos relevantes para la enfermedad de Alzheimer. El gran bucle
hidrofílico de presenilina-2 entre los dominios de
transmembrana 6 y 7 es un sustrato para ambas cinasas caseína 1 y 2
in vitro; este dominio se fosforila in vivo [25].
Usando una proteína de fusión
presenilina-2-MBP como sustrato
in vitro para CK1 se observó una inhibición dependiente de
la dosis de la fosforilación de presenilina-2
mediante HD (figura 3). La MBP sola no se fosforila por CK1.
Entre los sustratos fisiológicos de CDK5/p35 se
encuentra la cinasa neuronal Pak1 [17]. Tanto Pak1 como p35 se
asocian a la Rac, una pequeña GTPasa de la familia Rho. La
fosforilación de Pak1 mediante CDK5/p35 da lugar a una inhibición
de la actividad de cinasa de Pak1. Roscovitina inhibe la CDK5/p35 y
la regulación negativa resultante de Pak1 tanto in vitro como
in vivo. Estos experimentos se repitieron con HD (figura 4).
Primero se procedió a la precipitación inmune de CDK5/p35 a partir
de las cortezas de rata P02 y su actividad de cinasa hacia
GST-Pak1 K299 (mutante Pak1 muerto por cinasa) en
presencia de HD, roscovitina o DMSO se determinó como [17]. Se
observó una inhibición dependiente de la dosis de CDK5 mediante HD
(CI_{50} entre 10 y 100 nM) (figura 4A). A continuación se
realizaron experimentos ín vivo usando neuronas cultivadas
obtenidas a partir de cortezas de embriones de rata E18 (figura
4B). La HD se añadió cuando los cultivos tenían una antigüedad de 4
días y se dejó sobre las células durante 1 hora. El DMSO se usó como
control. Las células se lisaron a continuación sobre hielo en
tampón STM y la fracción de membrana aislada [17]. A continuación
se procedió a la precipitación inmune de Pak1 y se analizó usando
histona H4. La cantidad de fosforilación de H4, mediada por la
intensidad de las bandas en la película de la autorradiografía, se
cuantificó con el programa de adquisición de imágenes NIH. Como
controles de la carga se realizaron las transferencias Western
anti-Pak1 y anti-p35. Tal como se ha
demostrado previamente [35], aumenta la cantidad de p35 con el
alcance de inhibición de la cinasa CDK5/p35. Se observó un
incremento de la actividad de Pak1, compatible con una inhibición
de la actividad de CDK5 endógena (figura 4B).
GSK-3\beta se inhibe tanto por
WNT-7a como por litio en las neuronas celulares
granulares cerebelosas [49,50]. WNT-7a y litio
inducen el remodelado axonal y la pérdida de una forma fosforilada
de MAP-1 B, una proteína asociada al microtúbulo
implicada en el crecimiento exocéntrico axonal. Como la
GSK-3\beta fosforila la MAP-1 B en
un lugar reconocido por el anticuerpo SM 1-31, la
inhibición de GSK-3R mediante WNT o litio da lugar a
la pérdida de una MAP-1 B o MAP-1
B-P fosforilada. Para examinar el efecto de HD en la
morfología neuronal y en la fosforilación MAP-1B
las células granulares cerebelosas se cultivaron con distintas
concentraciones de HD.
Los resultados se muestran en la figura 10. La
tinción doble por inmunofluorescencia para GAP-43 y
MAP-1B-P muestra que
MAP-1B-P se encuentra a lo largo del
axón (A y B). El tratamiento durante 20 h con HD 10 \muM no tiene
un efecto evidente sobre la morfología celular (C) o la
MAP-1B-P (D). Las flechas indican
las mismas células. El tratamiento con HD 50 \muM induce la
diseminación axonal, el acortamiento del axón (E) y la pérdida de la
MAP-1B-P de los procesos axonales
(F). Las flechas indican las mismas células. El tratamiento con HD
100 \muM provoca un cambio más espectacular en la morfología
celular con la diseminación y ramificación a lo largo del axón, un
número aumentado de filopodia y el acortamiento del axón (G). La
MAP-1B-P se pierde de la mayoría de
los procesos axonales (H). Las flechas indican los axones en los
que se pierde la MAP-1B-P. Barra =
20 \muM.
El análisis de transferencia Western de los
lisados celulares muestra un descenso gradual de la
MAP-1B-P en respuesta a las dosis
crecientes de HD (I).
En las células control con procesos largos y muy
poca filopodia (figura 10A), la
MAP-1B-P se encuentra a lo largo de
todo el axón (figura 10B). Con concentraciones bajas (1 \muM, 10
\muM, 25 \muM) no tuvo ningún efecto notable sobre la
morfología de las células (figura 10C) o la distribución de la
MAP-1B-P (figura 10D). Sin embargo,
el tratamiento con HD 50 \muM indujo la diseminación y
ramificación axonal y el acortamiento de la longitud del axón
(figura 10E), con la pérdida concomitante de la
MAP-1B-P de la mayoría de los
procesos axonales (figura 10F). El tratamiento de los cultivos con
HD 100 \muM provocó un cambio más espectacular en la morfología
celular caracterizada por una ramificación y diseminación más
extensas, y se observó el acortamiento de la longitud del axón y un
aumento del número de filopodia (figura 10G), junto a la pérdida de
la MAP-1B-P de los procesos (figura
10H). El remodelado axonal observado se asoció a la pérdida de
microtúbulos estables en las áreas diseminadas de los axones. La HD
induce la pérdida de la MAP-1B-P de
forma dependiente de la dosis según se determina por la
transferencia Western (figura 10I). Este efecto es similar al
observado durante el tratamiento con litio o con
WNT-7a [37]. Como se demostró que HD inhibía la
GSK-3\beta directamente, dichos resultados
indican que la pérdida de la
MAP-1B-P y el remodelado axonal
inducido por la HD es consecuencia de la inhibición de la
GSK-3\beta en las neuronas cultivadas.
La proteína tau de unión a microtúbulos es el
sustrato de varias cinasas, como la GSK-3\beta y
la CDK5/p35. La proteína tau recombinante humana expresada por
bacterias se fosforiló en realidad in vitro mediante
GSK-3\beta y esta fosforilación se inhibió de
forma dependiente de la dosis mediante HD, con una CI_{50}
alrededor de 33 nM (figura 5A). A continuación se investigó el
efecto de HD sobre la fosforilación ir, vivo de la proteína tau23
humana expresada en las células Sf9 (figura 5B). Las células se
dejaron sin tratamiento (-) o se expusieron a ácido okadaico 0,2
\muM (OA), HD 50 \muM o flavopiridol 50 \muM (FL), un
inhibidor de la CDK que también inhibe la GSK30. La Htau23 se
separó por electroforesis en SDS-PAGE seguida por la
inmunotransferencia con varios anticuerpos. K9JA (un pananticuerpo
frente a tau) reconoce todos los preparados que contienen tau. AT8,
AT180 y PHF1 son específicos de diferentes motivos SP o TP
fosforilados, respectivamente Ser202 y Thr205, Thr231 y Ser235 y
Ser396 y Ser404 (corno se numeran en htau40, la isoforma tau humana
de mayor longitud). La AT100 reconoce la tau fosforilada en T212 y
S214; esta reacción es altamente específica de la proteína tau del
Alzheimer pero también se produce en las células Sf9, siempre que
ambos loci estén fosforilados. La desaparición de la señal AT100
después del tratamiento con HD o flavopiridol indica que ambos
cornpuestos son capaces de inhibir la actividad de tipo
GSK-3\beta en las células Sf9.
Se prepara una suspensión o solución de HD
añadiendo 100 a 1000 mg de HD a un vehículo líquido, como etanol,
glicerina, un disolvente no acuoso como polietilenglicol, aceites o
agua con un agente suspensor, un conservante, un saborizante o un
colorante, ajustándose la cantidad del vehículo líquido para
obtener la concentración requerida del principio activo.
El derivado 2 bromo HD se incorpora a un
vehículo, como estearato de magnesio, almidón, lactosa, sacarosa o
celulosa, y se comprime.
Las cantidades respectivas se eligen dependiendo
de la concentración deseada del principio activo.
Se cultivaron sesenta líneas celulares tumorales
humanas con 9 tipos tumorales (Boyd y Paull, 1995) durante 24 h
antes de una exposición continua de 48 h a roscovitina
0,01-100 \muM. Para estimar la citotoxicidad se
utilizó una determinación de la proteína sulforrodaminina B.
Captación de timidina. Las células
HT29-18-C1 se cultivaron en una
placa de 24 pocillos con una densidad celular de 2.105 células/500
\mul de medio/pocillo. Las células subconfluentes se aclararon y
colocaron en medio libre de suero durante 48 h para su deprivación
y sincronización. La interrupción de la parada del crecimiento se
efectuó por adición de suero al 5% en presencia de HD. A
continuación se añadieron 2 \muCi de metil-3H
timidina (actividad específica: 50 Ci/mMol) (ICN Biornedical) a
cada pocillo durante las últimas 4 h de un periodo de tratamiento
de 24 h. Las células se lavaron a continuación con PBS y se
trataron con ácido tricloroacético frío al 5% durante 45 minutos a
4°C. Las células se aclararon con agua y se solubilizaron con NaOH
0,3 M durante 1 h a 37°C. La radiactividad se midió con un contador
beta Beckman. Cultivo celular y tratamientos.
HT29-18-C1, un subclon de la línea
celular de adenocarcinoma de colon humano HT29 se cultivó en el
medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco-BRL)
suplementado con FCS al 10%, L-glutamina 2 mM
(Eurobio) y 50 mg/ml de gentamicina (Gibco-BRL) a
37°C, con CO_{2} al 10%. Las células se sincronizaron mediante la
deprivación de suero durante 48 h. A continuación se interrumpió la
parada de crecimiento mediante la adición de suero fetal bovino
(FCS) al 5%. La HD, preparada en DMSO, se añadió inmediatamente al
medio durante 24 h y con concentraciones finales entre 0 y 80
\muM. En algunos experimentos se añadió HD 22 h después de la
adición de suero durante otro periodo adicional de 24 h. En otros
experimentos se añadió HD a células no sincronizadas. Las células
se lavaron a continuación y se cultivaron en un medio con FCS al 5%
y se contaron o analizaron mediante FACS en distintos tiempos.
Recuentos celulares y citometría de flujo del
ciclo celular. Las células se contaron con un hemocitómetro. La
distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de
flujo. Las células adherentes (1.10^{6}) se trataron con tripsina
y se fijaron en etanol en frío al 70% durante 4 h. Las células
fijadas se lavaron con PBS, se incubaron con 5 \mug de RNAsa A
(Sigma Chemicals) por ml y se tiñeron con 25 \mug/ml de yodo
propidio (Aldrich) durante 1 h a 37°C. Las células teñidas se
analizaron en un citómetro de flujo FACScan usando el programa
cellFit Software (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).
Se estudió el efecto de HD
(0,01-100 \muM; exposición de 48 h) en un
despistaje in vitro orientado a la enfermedad NCI, es decir,
con 60 líneas celulares tumorales humanas con 9 tipos tumorales
(leucemia, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de colon, cáncer
del sistema nervioso central, melanoma, cáncer de ovario, cáncer
renal, cáncer de próstata y cáncer de mama). Todas las líneas
mostraron una sensibilidad similar a la HD. La CI_{50} media fue
de 15,1 \muM (roscovitina: 16 \muM (Meijer y cols., 1997);
olomoucina: 60,3 \muM (Abraham y cols., 1995)). No se observó
correlación entre la sensibilidad de las líneas celulares a
roscovitina y la presencia de p53 de tipo salvaje o mutado.
Inhibidor de la proliferación
celular
Las células
HT29-18-CI se sincronizaron en GI
mediante deprivación de suero. Se añadió FCS al 5% en el tiempo 0 y
las células se trataron simultáneamente (o) o no (o) con la
exposición a HD 10 \muM durante 24 h y después se cultivaron en
medio con FCS al 5%. El número de células se determinó cada 12 h
durante un periodo de 72 h utilizando un hemocitómetro. La cinética
de la inhibición del crecimiento se muestra en la figura 9A. El
tratamiento con HD dio lugar a una importante inhibición del
crecimiento, tal como se ve por la reducción del incremento del
número celular en el periodo de 72 h comparado con los controles.
Las células tratadas con suero (tiempo 0) se expusieron a
concentraciones diferentes de HD y se contaron después de 24 h. Los
resultados se muestran en la figura 9B. El número de células no
estimuladas con suero (*) se indica como comparación. El efecto
inhibidor dependió de la dosis de HD, con una CI_{50} de 5 \muM
(figura 9B). La exclusión con colorante azul de tripano indicó una
escasa toxicidad asociada con HD en concentraciones de 10 \muM y
80 \muM en 24 h (viabilidad > 95% y 90%, respectivamente).
Este efecto antiproliferativo de HD parece ser reversible. De
hecho, las células comenzaron lentamente a proliferar de nuevo
después de 72 h de cultivo.
Los resultados sobre la distribución del ciclo
celular de las células tratadas con HD se muestran en la figura
10A. Las células HT29-18-C1 se
mantuvieron con ayuno de suero durante 48 h; se añadió suero al 5% a
continuación (tiempo 0) y las células se trataron simultáneamente o
no con HD 5 \muM o 40 \muM durante las siguientes 24 h. Las
células se fijaron a continuación y su estado de fase de ciclo
celular se determinó por análisis FACscan según se describe en la
sección de Procedimientos experimentales. Los números indican el %
de células que se encuentran en las distintas fases del ciclo
celular. La figura 10B muestra la cinética de acumulación en fase S
de las células tratadas con HD. El suero se añadió en el tiempo 0 a
las células HT29-18-C1 con ayuno de
suero que simultáneamente recibieron tratamiento o no con HD 10
\muM durante las siguientes 24 h. La distribución del ciclo
celular se analizó cada 24 h durante un periodo de 72 h.
Un análisis más breve de las células activadas
por fluorescencia (FACs) reveló que el tratamiento con HD provoca
la acumulación de células en fase S en relación con las células no
tratadas. En ausencia de HD las células estimuladas con suero
proceden rápidamente a entrar en la fase G2/M (figura 10A). Por el
contrario, las células tratadas con HD no continúan hacia la fase
G2/M después de la estimulación con suero, sino que se mantienen
paradas en la fase S.
El efecto de HD en la distribución del ciclo
celular del cultivo de HT29-18-C1 se
investigó también a lo largo del tiempo (figura 10B). Las células
sincronizadas se introdujeron en un medio con FCS al 5% en presencia
o ausencia de HD 10 \muM durante 24 h. Las células se cultivaron
a continuación en un medio con FCS al 5% durante otras 48 h.
Coincidiendo con los recuentos celulares, se observó que la HD
inhibe la proliferación celular a lo largo de 72 h de cultivo
celular con una acumulación de células en fase S (figura 10B).
En otro tipo de experimentos, las células
HT29-18-C1 se mantuvieron con ayuno
de suero durante 48 h. Se añadió suero al 5% en el tiempo 0 y HD 10
\muM 22 h más tarde. La distribución del ciclo celular se
determinó 14 h después, es decir, 36 h después de la estimulación
con suero, mediante análisis FACscan tal como se describe en la
sección de Procedimientos experimentales. En este caso, las células
tenían una posibilidad de entrar en la fase S y el tratamiento con
HD provocó la acumulación de células en fase G2/M (figura 11).
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Claims (7)
1. El uso de himenialdisina o sus derivados de la
fórmula 1
en la cual R1 y R2, idénticos o diferentes,
representan H o Br, o una de sus sales farmacéuticamente
aceptables, en la fabricación de un medicamento para usar en las
enfermedades neurodegenerativas que implican la desregulación de
las cinasas dependientes de ciclina, GSK-3\beta y
cinasa caseína
1.
2. El uso según la reivindicación 1, en el cual
el compuesto es
4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-ilideno)-4,5,6,7-tetrahidropirrolo(2,3-c)azepin-8-ona,
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
3. El uso según la reivindicación 1, en el cual
el compuesto es
4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-ilideno)-2-bromo-4,5,6,7-tetrahidropirrolo(2,3-c)azepin-8-ona,
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
4. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, para la prevención y el tratamiento de las
enfermedades neurodegenerativas.
5. El uso según la reivindicación 4, para la
prevención y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
6. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual dichos medicamentos se preparan
para una administración por vía oral.
7. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual dichos medicamentos se preparan
para una administración por una vía inyectable.
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