WO2018079988A1 - Trap1 저해제로서 유용한 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

Trap1 저해제로서 유용한 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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WO2018079988A1
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pyrazolo
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pyrimidin
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PCT/KR2017/007907
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강병헌
박혜경
이창욱
강수성
이지훈
홍기범
김다롱
이원석
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울산과학기술원
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    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to compounds that inhibit heat shock protein Hsp90 and its homologous proteins, and more particularly, compounds useful as inhibitors that simultaneously inhibit all Hsp90 homologous proteins (Hsp90, TRAP1, Grp94), in particular TRAP1. And it relates to an anticancer composition comprising the same. Background technology
  • Hsp90 heat shock protein
  • Hsp90 is an ATP-driven molecular chaperone that regulates the stability and activity of metastable proteins called their client proteins in cells and is overexpressed during the development of malignancies (Karagoz and Rudiger, Trends in biochemical sciences 40, 117-125; Lee, 2014, Glucose-regulated proteins in cancer: molecular mechani sms and therapeut ic potent ial. Nature reviews Cancer 14, 263-276).
  • Their client proteins include a variety of carcinogenic proteins involved in the multi-stage process of tumor formation, and Hsp90 is one of the most actively investigated proteins for anticancer drug development (Neckers, L.,. And Workman, P.
  • Hsp90 molecular chaperone 'inhibitors are we there yet? CI inical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 18, 64-76; Trepel, J., Mol lapour, M., Giaccone, G. , and Neckers, L. (2010) .Targeting the dynamic HSP90 com lex in cancer.Nat Rev Cancer 10, 537-549; Whitesel 1, L., and Lindquist, SL (2005) .HSP90 and the chaperoning of cancer.Nature reviews Cancer 5, 761-772).
  • Hsp90 inhibitors have already been developed to compromise the multiple tumor-generating signal pathways of Hsp90_saperone, some of which are already in clinical trials as therapeutics for cancer (Neckers, L., and Trepel, JB (2014)). Stressing the development of small molecules targeting HSP90.CI inical cancer research: an official journal of the American Assoc i at ion for Cancer Research 20, 275-277).
  • the 94 kDa glucose-regulated protein (Grp94) and TNF receptor-related protein 1 (TRAP1) are Hsp90 homologous proteins found in organelles, endoplasmic reticulum, and mitochondria (Chen, B., Piel, WH, Gui, L., Bruford, E., and Monteiro, A.
  • the organelle homologous protein has a structure similar to cytoplasmic Hsp90, in particular the ATP binding pocket located in the N-terminal domain (NTD) has greater similarity.
  • inhibitors that target the ATP pocket of Hsp90 NTD may have inhibitory activity against Grp94 and TRAP1 in vitro, and thus are often referred to as known Hsp90 family protein inhibitors Kang, BH, and Altieri, DC (2009 . Compartmentalized cancer drug discovery target ing mi tochondrial Hsp90 chaperones. Oncogene 28, 3681-3688; Patel, _ PD, Yan, P., Seidler, PM, Patel, HJ, Sun, W., Yang, C., Que, NS, Taldone, T., Finotti, P. Stephani, RA, et al. (2013).
  • Hsp90 inhibitors define tumor -speci f ic regulation of HER2. Nat Chem Biol 9, 677-684.). However, we have recently discovered that plate-Hsp90 inhibitors accumulate in the ineffective mitochondria of these drugs. It was confirmed that mitochondrial resistant TRAP1 could not be inactivated. (Kang, BH, Plescia, J., Song, ⁇ . ⁇ ., Meli, ⁇ ., Colombo, G., Beebe, K., Scroggins, B., Neckers, L., and Alt ier i, DC (2009 Combinatorial drug design targeting multiple cancer signaling networks controlled by mitochondrial Hsp90. J Clin Invest 119, 454-464; Lee, C., Park, H..
  • panvotinib-401 panantin-401
  • analogues thereof which are inhibitors capable of simultaneously inhibiting Hap90 homologous proteins in vivo.
  • the present invention has been made to solve the above problems, and aims to provide a novel compound or a 'pharmaceutically acceptable salt thereof, which exhibits inhibitory activity against Hsp90 and Hsp90 homologous proteins, preferably TRAP1, in tumor cells. do.
  • the present invention is a compound or an inhibitor thereof exhibiting inhibitory activity against the Hsp90 homologous protein and Hsp90 homologous protein, preferably TRAP1.
  • An object of the present invention is to provide an anticancer composition comprising a pharmaceutically acceptable salt.
  • the present invention relates to a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which exhibits Hsp90 and its homologous protein inhibitory activity:
  • Rl, R2, R3, R4 and R5 are independently H, Halo, Ci- 6 alkyl, C 2 — 6 alkenyl, cyano, 0R6, SR6 or NHR6,
  • Rl, R4 and R5 are independently H, Halo, d- 6 alkyl, C 2 — 6 alkenyl, cyano, OR, SR or NHR, R2 and R3 together are N, 0 and S To form a 4 to 7 membered heterocycle comprising 1 or 2 heteroatoms selected from the group consisting of:
  • R 6 is H or d-6 alkyl
  • the d- 6 alkyl, C 2 - 6 alkenyl may be optionally substituted with halo, or d-6-alkyl.
  • the Rl, R2, R3, R4 and R5 are independently, H, F, C1, Br, I, d- 4-alkyl, C 2 - 4 alkenyl, cyano, OR, or SR or NHR,
  • Rl, and R4, R5 are independently, H, F, CI, Br, I, d- 4-alkyl, C 2 - 4 alkenyl, cyano, and the furnace, 0R6, SR6 or NHR6, R2 and R3 is N, 0 with And a 5 or 6 membered heterocycle comprising 1 or 2 heteroatoms selected from the group consisting of ⁇ ;
  • R 6 is H or Ci-4 alkyl
  • the alkyl or C 2 - 4 alkenyl group is F, (: may be optionally substituted with 1, Br, or methyl.
  • the compound of the formula (I) according to the present invention has an effective permeability to mychondria due to the optimized activity on the Hsp90 family proteins, all of the cytoplasm, endoplasmic reticulum, and mitochondrial pool of Hsp90 family proteins such as TRAP1. Can be inactivated and inhibited, acting as a new mechanism compared to conventional ' Hsp90 inhibitors. It is very useful as an anticancer agent by enhancing excellent cancer-selective cytotoxic activity.
  • 2 is a result of analyzing the combination therapy mechanism and in vivo potency between DMAG and ant nitrile.
  • 2A shows the caspase activation results induced by drug combinations. HeLa cells were treated with drug as indicated and analyzed by western blotting.
  • Figure 2B shows the results of in vivo Apoptosi s induction by analyzing TUNEL staining of tumor tissues isolated from xenograft mice and fluorescence microscopy.
  • Figure 2C is a graph showing the change in body weight of the mouse according to the combination therapy between DMAG and ant nitrile.
  • Figure 2D is a photograph showing the results of histological analysis of normal tissue according to the combination therapy between DMAG and ant nitrile.
  • a to I are survival signals induced by DMAG in combination with drug administration.
  • HSF1 is inhibited by activating the calcineurin enzyme.
  • 4 is a result of confirming that the drug combination increases the calcium concentration of the cytoplasm and the mitochondria fragmented.
  • 4A shows the results of Fura-2 staining after treatment with PU-WS13 and gami tr inib, and analysis of the Fura-2 loaded HeLa cells using fluorescence microscopy.
  • 4B shows control or Grp94 s iRNA-transfected HeLa cells treated with 5 ⁇ gami tr inib for 6 hours and analyzed using fluorescence microscopy.
  • 4C shows the control or CypD siRNA-transfected HeLa cells treated with 5 ⁇ gami tr inib and 10 ⁇ DMAG for 6 hours and analyzed using fluorescence microscopy.
  • 4D shows control or RyR2 siRNA-transfected HeLa cells 6 h at 5 ⁇ gami tr inib and 10 ⁇ DMAG. Is processed and analyzed using a fluorescence microscope.
  • Figure 4E shows that after treatment with CypD siRNA, HeLa cells were incubated with gami tr inib and DMAG for 6 hours and analyzed using Western blotting
  • Figure 4F shows HeLa cells after treatment with RyR2 siRNA. Incubate with drug for 6 hours and analyze using Western blotting.
  • 4G accumulates mitochondria of Drpl.
  • 4H is a result confirming the inhibition of Mdivi-1 mitochondrial cleavage.
  • Fig. 41 shows that fission of mitochondria was induced by the combination of drugs.
  • 5 is a result showing that drug combination effectively kills cancer cells by reducing the expression of Hsp90 cl ient and mitochondrial disruption.
  • 5A shows the comparison of drug combination efficacy between DMAG and PU-WS13. HeLa cells were treated with drug as indicated for 24 hours and analyzed using ⁇ assay.
  • 5B is a graph showing a comparison result of the combination efficacy of antinib and Grp94 siRNA. HeLa cells were incubated with gami tr inib for 24 hours after knockdown of Grp94 siRNA. Cell viability was analyzed by siRNA knockdown efficiency by M T analysis (left) and Western blot ting (right).
  • 5C shows the results of the effects of Hsp90 and Grp94 inhibitors.
  • HeLa cells were treated with drug as indicated for 6 hours and analyzed by western blotting. 5D shows the results of mitochondrial cleavage by drug combinations. HeLa cells were treated with 5 ⁇ gami tr inib, 10 ⁇ DMAG and 20 ⁇ as indicated for 6 hours.
  • 6A to 6G show the mechanism of action and chemical formula of panbotinib and activity in vitro.
  • FIG. 7 is a diagram showing a binding structure between a similar inhibitor and TRAP1 and Hsp90.
  • FIG. 8 is a result of finding that the mechanism of action of panbotinib is the same as when the Hsp90 inhibitor and T AP1 inhibitors in combination.
  • Figure 8A confirms the immediate effect of the loss of mitochondrial membrane potential of panbotinib
  • Figure 8B confirms that triggered the discharge (di scharge) of cytochrome c
  • Figure 8C shows the effect of increasing the mitochondria of pantotinib mitochondria It is shown.
  • 8D is by panbotinib It is a graph confirming the effect of increasing CHOP expression
  • Figure 8E F is the result of confirming the protein expression pattern with panbotinib.
  • Figure 8G is a graph and pictures confirming the effect of increasing the cytoplasmic calcium concentration by panbotinib
  • Figure 8H is a graph confirming the increase of calcineurin activity by panbotinib.
  • FIG. 81 shows the results of Hsp70 expression when calcineurin is selectively inhibited by siRNA by panbotinib.
  • FIG. 8J is a photograph showing the effect of mitochondrial fragmentat ion inhibition by panbotinib.
  • FIG. 9 shows the results of the panbotinib activity in the in vivo.
  • FIG. 9A is a graph showing the potent cytotoxic activity in hepatocellular carcinoma, prostate cancer, cervical cancer, lung cancer, and brain tumor cells compared to other Hsp90 inhibitors
  • FIG. 9B is a cell death induction mechanism through apoptosis.
  • Figure 9C is a graph confirming the cytotoxicity against keratoconus and mouse hepatocytes compared to other Hsp90 inhibitors
  • Figure 9D is a graph confirming the significant tumor growth inhibitory effect of panbotinib in the prostate cancer xenograft experiment using mice.
  • . 9E is a graph confirming cell death due to apoptosis in tumor tissues.
  • Figure 9F is a graph showing the weight loss
  • Figure 9G is a graph confirming the reduction of Hsp90 cl ient protein, inhibition of Hsp70 expression and increase of CHOP expression in the
  • FIG. 10 shows the results of the effect analysis of Pan—401 (compound 1 of Formula la) on tumors and normal tissues in vivo.
  • Figure 10A is the result of observing cell death related to apoptosis in tumor tissue
  • Figure 10B confirms the histological organ toxicity symptoms.
  • R 1, R 2, R 3, R 4 and R 5 of Formula I are independently : H. F, CI, Br, I, methyl, ethyl, propyl, ethenyl, cyano, 0CH 3 , 0CF 3 , SCH 3 or NH 2 ,
  • Rl, R4 and R5 are independently H, F, C1, Br, I, methyl, ethyl, propyl, ethenyl, cyano, 0CH 3 ⁇ 0CF 3 , SCH 3 or NH 2, R 2 and R 3 together N, With 0 and S It is possible to form a 5 or 6 membered heterocycle comprising 1 or 2 heteroatoms selected from the group consisting of:
  • the invention may be any one compound selected from the group consisting of the following specific compounds:
  • the term "pharmaceutically acceptable salt” refers to a salt compound form generally used in the art, and may be an acid addition salt or a base addition salt.
  • salts which are acceptable in principle include salts with no additives such as hydrochloric acid, bromic acid, phosphoric acid or sulfuric acid; acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, maleic acid, fish acid, succinic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, mandelic acid, ascorbic acid or Salts with organic carboxylic acids, such as malic acid, or sulfonic acids, such as methanesulfonic acid or para-luenesulfonic acid; salts with alkali metals such as sodium, potassium or lithium; black may form other pharmaceutically acceptable salts.
  • the inventors have a structure of formula I I having a purine scaffold
  • Hsp90 a molecular chaperone
  • Hsp90 inhibitors can be effective against a wide variety of cancers.
  • Hsp90 homologous protein inhibitors such as Hsp90 and TRAP1, such as the compound of Formula I, may exhibit high selectivity for tumor cells.
  • the present invention relates to a "cancer medicament, i.e. anticancer agent composition (in a broader sense for the prevention) comprising a compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the general formula I.
  • the anticancer agent composition of the present invention can target Hsp90 of all kinds of cancer cells, specifically.
  • the carcinoma may be cancer selected from the group consisting of, but not limited to, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, liver cancer, lung cancer, hematologic cancer, brain tumor, and prostate cancer.
  • the anticancer composition of the present invention contains a therapeutically effective amount of a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and contains at least one inorganic or organic solid or liquid pharmaceutically acceptable additive.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can be administered to mammals (especially humans) by oral or parenteral (eg intramuscular or intravenous injection). Dosages and frequency of administration of the active ingredients depend on the species, weight, age and individual condition of the mammal.
  • a mammal eg, a human weighing approximately 70 kg
  • the daily dosage per person is preferably between about 100 mg and about 7 g.
  • the anticancer composition of the present invention comprises from about 95% to about 99.9% of the active ingredient (compound of the present invention).
  • compositions according to the invention may be in unit dosage forms such as ampoules, vials, suppositories, sugars, tablets or capsules.
  • the anticancer agent of the present invention may be prepared through conventional dissolution, lyophilization, mixing, granulation, or glycosylation processes in a known manner, and may be purchased and used commercially.
  • the additives included in the anticancer agent of the present invention may include, for example, a crab, a preservative, a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a solubilizer, a salt or buffer for controlling osmotic pressure, a binder, a diluent, a lubricant, and the like. have.
  • the anticancer composition of the present invention When the anticancer composition of the present invention is formulated in injection form, it may be prepared in a conventional manner under sterile conditions, and conventional methods may be used when the composition is introduced into an ampoule or vial and the container is sealed.
  • the anticancer agent composition of the present invention When the anticancer agent composition of the present invention is formulated for oral administration, the tablet combines the active ingredient with a solid carrier, granulates the resulting mixture if necessary, and optionally adds the combination after the addition of an appropriate excipient. It can be manufactured by processing.
  • 3 ⁇ 4 capsule may be a dry-filled capsule made of gelatin and a soft sealed made of gelatin and a plasticizer (for example, glycerol or sorbide).
  • GAPDH glycer aldehyde phosphate dehydrogenase
  • MTT 3 (4,5-dimethyl-thyzoyl-2-yl) 2,5 di henyltetrazol ium bromide; NTD, N-terminal domain;
  • TRAPl tumor necrosis factor receptor-associated protein 1
  • TRAPl ⁇ NM C-terminal deleted TRAPl
  • PU-H71, BIIB021, 17-AAG, AUY922, and 17—DMAG were purchased from Tocris, Toronto Research Chemicals, or Sigma—Aldr ich. DN320 was prepared according to the method disclosed in WO02Q05028434.
  • CH 2 C1 2 was added to separate the organic material layer, which was dried over Na 2 S0 4 , filtered and concentrated under reduced pressure. The resulting residue was dissolved in CH 2 C1 2 (100 mL) and angled to -2 ° C. Sequentially add 4 N HC1 (38 mL, 150 mmol) in dioxane to the solution. Added and the mixture was stirred at -2 ⁇ C for 13 h. The resulting precipitate was collected by filtration, washed with CH 2 C1 2 , isopropyl ether, and CH 2 C1 2 and finally dried.
  • Hydrochloride (2) was obtained as a white solid (2.3 g, 82%).
  • Triethylamine solution A solution (1.2 mL, 8.4 ⁇ l) dissolved in CH 2 C1 2 (3.0 mL) ((6-bromobenzo [d] [1.2] dioxol-5-yl) methyl) hydrazine hydro 2-ami no-4, 6-di ch 1 or opyr imidi en-5-car ba 1 dehyde (0.4 g, 2.1) in chloride (2) (0.8 g, 2.5 ⁇ L ol) and CH 2 C1 2 (10 mL) ⁇ ol) was added dropwise to the mixed solution at o ° C. for about 15 minutes. The resulting mixture was stirred at 0 ° C. for 1.5 h.
  • HSF1-GFP fusion constructs include Addgene (Plasmid #: 32538; Wang, X., Grammatikakis, N., Siganou, A., and Calderwood, SK (2003) .Regulation of molecular chaperone gene transcript ion involves the serine phosphorylat ion, 14 -3-3 epsi Ion binding, and cytoplasmic sequestration of heat shock factor 1. Molecular and ⁇ were purchased from cellular biology 23, 6013- 6026).
  • Anti-CHOP, ant i-prohibi tin, and ant i-caspase3 are cell signaling; ant i-calcineur in subunit B is Sigma; ant i -RyR, anti A Akt, anti ⁇ Grp94, anti ⁇ Chkl, ant i-lamin B, and anti—PARPl are described in Santa Cruz Biotechnology; ant i-cyclophol in D (CypD) is Calbiochem; ant i-eIF2 a [pS52] is Invitrogen; anti ⁇ ⁇ ⁇ actin was supplied or received from MP Biomedicals, and anti-TRAPl, anti-HSFl, anti-Drpl, and anti-Hsp70, respectively, from BD Biosciences.
  • HeLa Human of cervix
  • breast MDA-MB-231
  • ovary SK-0V3
  • liver SK-HEP-1
  • brain T98G
  • lung H460
  • prostate PC3 and 22Rvl Cancer cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) and maintained according to the supplier's manual.
  • Cells were cultured in a humidified atmosphere of 37 ° C., 5% CO 2 (GIBC0) in DMEM or RPMI medium containing 10% fetal bovine serum (FBS; GIBC0) and 1% penicillin / streptomycin (GIBCO).
  • Human corneal cells were purchased from ATCC and cultured in ATCC corneal medium (ATCC) according to the manufacturer's manual.
  • mice Primary hepatocytes were BALB / c at 8 weeks of age. The mice were isolated (Lee et al., 2015) according to the method disclosed in the prior art and cultured in a humidified atmosphere of 37 ° C., 5% CO 2 in M199 / EBSS medium (Hyclone) containing 10% FBS. 1-2) Cell calcineurin activity assay
  • Cellular calcineurin activity was measured using the calcineurin phosphate assay kit (ENZ0 Life Sciences) according to the manufacturer's instructions. Colorimetric assays were performed using a microplate spectrophotometer (TECHAN Infinite M200) at a wavelength of s 620 nm. Absorbance values were normalized to protein concentration and calcineurin activity was shown in comparison to DMS0-treated samples.
  • siRNAs for TRAP1, RyR2, IP3R, and CHOP were constructed as described in the prior literature in Genolut ion (Korea) (Park et al., 2014).
  • siRNAs targeting cyclophi 1 in D (CypD) and calcineur in regulatory subunit B (CNB) were synthesized on the Genolut ion (Korea) using the following sequence: CypD- # 15 '-GGCAGATGTCGT ⁇ CCCAAAG-3 ' 'and CypD- # 2 5' -GATAAGGGC CGGCTACA-3 '; CNB- # 1 5' -GCCTGAGTTA-CAACAGAATCCTTTA-3 'and CNB- # 2 5' -GGAACAATCTGAAAGATACACAGTT-3 ' '; control 5 '-ACUCUAUCUGCACGCUGAC-3' .
  • Cell viability was determined using Cell viability was determined using 3 (4,5-dimethyl-thyzoyl-2-yl) 2,5 di henyltetrazol ium bromide (MTT) assay, which was determined using the Infinity M200 microplate reader (TECAN) at 595 ⁇ .
  • MTT Infinity M200 microplate reader
  • TECAN Infinity M200 microplate reader
  • Intracellular calcium concentrations were determined according to the methods described in the literature.
  • HeLa cells were labeled with 5 ⁇ Fura-2 for 30 minutes, containing 154 mM NaCl, 5.6 mM KC1, 3.2 mM MgC12, 5 mM HEPES, 10 mM glucose, and 0.2 mM EGTA (pH 7.4). Incubated at 37 ° C., 5 »C0 2 , in a calcium-free Locke's solution. After treatment with the drug, the change in fluorescence was measured every 5 minutes using a 1 ⁇ 81 ZDC microscope (Olympus) at 510 nni radiation with dual excitation at 340 nm and 380 Hz.
  • 340/380 fluorescence ratio images were generated and analyzed using the Xcellence software package (Olympus).
  • HeLa cells were transfected using lipofectamine transfection reagent (Invitrogen) and HSF-GFP plasmid according to the manufacturer's instructions. After transfection for 24 hours, cells were treated with the indicated drug and analyzed using 1 ⁇ 81 ZDC (Olympus).
  • To visualize the mitochondrial structure HeLa cells were stained using 200 nM MitoTracker for 20 minutes, treated with drug and then analyzed using LSM 780 confocal microscope (Zeiss).
  • RNA Extraction and Reverse Transcriptase Chain Reaction (RT-PCR)
  • Recombinant TRAP1 and Hsp90 were prepared as described in the prior document.
  • the fluorescence probe PU-H71-FITC3 was synthesized as described in the prior art (Taldone et al., 2011) and 10 nM PU-H71-FITC2 and 100 nM of protein were 10 nM for 24 hours.
  • Inhibitors in FP buffer containing 1 mM DTT, 2 mM MgCl 2 , 0.1 mg / niL BSA, and 0.05% NP40 (pH 7.3) were incubated at various concentrations. Fluorescence polarization finally yields a SYNERGY NE0 microplate reader (BioTek Instruments, Inc.). Measured using.
  • the complexes were then crystallized using a hanging drop diffusion method by mixing a reservoir buffer of protein 1 ⁇ 1 and 1 ⁇ 1 at room temperature. Crystals of the TRAP1-DN320 complex were grown in a reservoir buffer containing 100 mM sodium cacodylate (pH 6.76), 14% -16% 8K polyethylene glycol (PEG), and .100 mM calcium acetate. Crystals of the most diffracted TRAPl-Pan® 401 complex were obtained in a reservoir buffer containing 14% -16% 20K PEG instead of 8K PEG. The crystals were then protected by immersion in a crystallization solution with 30% glycerol added and rapidly immersed in liquid nitrogen.
  • a R merge 100 X hi I 7i (h>- ⁇ / (h)> II h ⁇ / (h)>, where / i (h) is the / th measurement and ⁇ / (h)> is the Miller indices h Is the weighted average of all measurements of / (h) for.
  • V 1/2 X (width) 2 X length.
  • organs including brain, heart, kidney, liver, spleen, stomach and tumors were collected for histological analysis and western blotting. Collected organ specimens were fixed with 10% formalin and embedded in paraffin for histological analysis. In short, each section is (5 urn) Placed on a highly adhesive slide and stained using H & E and observed by magnification 20 times using Dot slide system (Olympus). For Western blot analysis, tissue samples were magnification.
  • tissue samples were homogenized in RIPA buffer containing 50 mM Tr is (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40, and 0.25% N-deoxycholate and homogenized in RIPA buffer And phosphatase inhibitor cocktails (Calbiochem), and soluble fractions (Park, HK, Lee, JE, Lim, J., and Kang, BH (2014) .Mitochondrial Hsp90s suppress calcium-mediated stress signals propagating from mitochondria to the ER in cancer cells.Mol Cancer 13, 148).
  • Hsp90 inhibitors for inactivating Hsp90 family proteins located in the cytoplasm and ER (Patel, PD, Yan, P., Seidler, PM, Patel, HJ, Sun, W., Yang, C., Que, NS, Tal clone, T., Finotti, P., Stephani, R. 'et al. (2013).
  • Par a log ⁇ selective Hsp90 inhibitors define tumor ⁇ speci f ic regulation of HER2.
  • This combination of drugs effectively inhibits tumor growth in 22Rvl sc implanted nude mice (FIGS. 1D and 2B).
  • the drug combination increased apoptosis induction without significant weight loss (FIG. 2C) and organ toxicity (FIG. 2D) in histological analysis (FIG. 1E, FIG. 2B).
  • Hsp90 inhibitor-induced heat shock response (Sittler, A., Lurz, R., Lueder, G., Priller, J ⁇ , Lehrach, H., Hayer-Hartl, MK, Hartl, FU, and Wanker, EE (2001) .Geldanamycin activates a heat shock response and inhibits hunt ingt in aggregation in a cell culture model of Huntington's disease.Human molecular molecular genes ics 10, 1307-1315; Zou, J., Guo, Y., Guettouche, T., Smith, DF, and Voellmy, R. (1998).
  • Hsp90 inhibitors are known to trigger a heat shock response through activation of the transcription factor heat shock factor l (HSFl) (Chen et al., 2013; Zou et al., 1998), and their inactivation is associated with Hsp90 inhibitors.
  • HSFl transcription factor heat shock factor l
  • TRAP1 can set cell death thresholds beyond cellular stress by mitochondria and ER calcium discharge dependent on cyclophilin D (CypD) and lyanodine receptors (Park et al. , 2014).
  • CypD cyclophilin D
  • lyanodine receptors Park et al. , 2014.
  • cytoplasmic chest growth can be inhibited by genetic knockdown of mitochondrial CypD or ER lianodine receptor 2 (RyR2) in HeLa cells (FIGS. 4C, 4D).
  • panbotinib-401 Simply Pan-401. Folds were developed (FIG. 6B).
  • the para log selectivity of panbotinib was about ⁇ , 76 ⁇ , 524 ⁇ for TRAPl, Hsp90, and Grp94, respectively, which resulted in strong TRAP1 / Grp94 binding and relatively low Hsp90 inhibition (FIG. 6C).
  • DN320 a pyrazolopyrimidine compound derived from BI IB-02K6-chloro-9-[(4-methoxy-3,5-dimethyl-2-pyridinyl) methyl] -9 ⁇ purin-2-amine) (FIG. 6C)
  • DN320 showed more superior inhibitory activity compared to ⁇ —021 (FIG. 6C).
  • DN320 stabilizes Phe2 () l. Changing the three-dimensional arrangement of the Met 163 side chain and, TRAP1 active site The number of Asnl pyrazol-N-2 having an amide group in the - to build-mediated hydrogen bonds (Fig. 6D and E; F.).
  • Purine Scaffold BI IB-021 did not stably react with either Phe side chains or water molecules, and exhibited different side chain origins of Met in TRAP1, and, like other Purine scaffold inhibitors, the PU—H group, Hsp90 and Together they were found continuously in some complex structures (FIG. 7).
  • DN320 was still strong in binding to Hsp90, the present inventors next synthesized Pan-401 having more improved TRAP1 inhibitory activity and lower Hsp90 inhibitory activity than DN320.
  • Pan—4 substituted pyridine of DN320 with bromobenzodioxol FIG.
  • Pan-4 tetrabromodioxosol fits better than the pyridine of DN320 in the hydrophobic pocket of the TRAP1 active site (FIG. 6G) to improve binding of the inhibitor to TRAP1.
  • Pan-401 In order to confirm the action principle of Pan—401, the inhibitory activity of mitochondria against Hsp90 (TRAP1) was first identified. Pan-401 immediately loses the mitochondrial membrane potential and discharges cytochrome c Triggered (FIG. 8A, B), which is consistent with previous reports on mitochondrial-accumulated Hsp90 inhibitors (Kang et al., 2009; Lee et al., 2015). R0S in mitochondria increased within 4 hours of Pan-401 treatment (FIG. 8C), which corroborates the role of inhibitory TRAP1 in R0S production (Hua, G., Zhang, Q., and Fan, Z. (2007).
  • Heat shock protein 75 antagonizes reactive oxygen species generation and protects eel Is from granzyme M-mediated apoptosis.
  • the Journal of biological chemistry 282, 20553-20560; Im, CN, Lee, JS, Zheng, Y., and Seo, JS (2007) .Iron chelation study in a normal human hepatocyte cell line suggests that tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAPl) regulates product ion of reactive oxygen species-Journal of eel hilar biochemistry 100, 474-486; Vo 1 oboueva , LA, Duan, M., Ouyang, Y., Emery, J.
  • Pan-401 treatment increased CHOP expression (FIG. 8D).
  • depolarization, cytochrome c discharge, CHOP expression, and R0S overproduction of mitochondrial membranes were not induced after 24 hours of treatment with the Hsp90 inhibitor AUY922 ( Figures 8A-D) and therefore, Pan-4 () 1 inhibited mitochondrial TRAP1 similar to the conventional TRAP1 inhibitor antinib.
  • client protein degradation and increased Hsp70 expression were examined to confirm the inhibitory activity of cytoplasmic Hsp90.
  • Pan—401 degraded Hsp90 client proteins to levels similar to other Hsp90 inhibitors, but did not increase the expression of Hsp70 unlike conventional Hsp90 inhibitors (FIG.
  • Pan-4 () 1 has a stronger cytotoxic activity when compared to conventional Hsp90 inhibitors.
  • Prostate cancer, cervical cancer. Lung cancer, brain tumor cells are shown (Fig. 9A), this cell death induction mechanism was confirmed through apoptosis (Fig. 9B).
  • FIG. 9C In all normal human cornea and mouse hepatocytes, it was confirmed that the cytotoxicity was significantly lower than that of the conventional Hsp90 inhibitors (FIG. 9C).
  • FIG. 9D At this time, it was confirmed that cell death due to apoptosis in tumor tissues treated with Pan-4 () 1 (Fig. 9E, Fig. 10A).
  • ATPase activity was measured using a Pilor Lock Gold Phosphate Detect ion Kit (Innova Bioscience).
  • 200 nM TRAP1 was added to various concentrations of compounds and assay buffer (lOOmMTris, 20mMKCl, and 6 niM MgCl 2 , After incubation at 37 ° C for 30 min at pH 7.0), 3 hours with 0.2 mM ATP. I responded.
  • 20 uL of Pi Color Lock Gold reagent and 100: 1 ratio accelerator were mixed with 80 TRAPl-ATP reaction product to induce color development at 25 ° C for 5 minutes, and the reaction was stopped by adding 10 iiL stop solution. The maxima were measured for absorbance at 620 nm using an Infinity M200 microplate reader (Tecan).
  • PU-H71-FITC3 a fluorescence probe for FP analysis, was synthesized with reference to previous reports (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 5347-5352). 10 nM PU-H71-FITC3, 100 nM TRAPl (Hsp90) was added with various concentrations of inhibitor in FP buffer (135 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 4.3 mM Na 2 HP0 4) 1.4 mM KH 2 P0 4 , 1 mM DTT, 2mMMgCl 2) 0.1 mg / niL BSA, and 0.05% NP40 (pH 7.3)) was incubated at 4 ° C for 24 hours. FP was measured using a SYNERGY NEO microplate reader (BioTek Instruments, Inc.). As a result, compounds 2 to 28 TRAP1 inhibitory effect is shown in Table 2 below.

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Abstract

본 발명은 열 충격 단백질 (heat shock protein) Hsp90및 TRAP1과 같은 Hsp90 상동단백질을 동시에 저해하는 화합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 화학식 I의 구조를 갖는 Hsp90 및 이의 상동단백질 저해제로서 유용한 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다:

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
TRAP1 저해제로서 유용한 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물 【기술분야】
본 발명은 열 충격 단백질 (heat shock protein) Hsp90 및 이의 상동 단백질을 저해하는 화합물에 관한 것으로서， 보다 상세하게는 모든 Hsp90 상동 단백질 (Hsp90, TRAP1, Grp94) , 특히 TRAP1을 동시에 억제하는 저해제로서 유용한 화합물 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 【배경기술]
90kDa의 열 충격 단백질 (Hsp90)은 세포 내에서 이들의 클라이언트 단백질이라 불리는 준안정 상태 단백질의 안정성 및 활성을 조절하는 ATP— driven 분자 샤페론으로 악성종양으로 발달해 가는 과정에서 과발현된다 (Karagoz and Rudiger , 2015， Hsp90 interact ion with clients. Trends in biochemical sciences 40, 117-125； Lee, 2014, Glucose-regulated proteins in cancer： molecular mechani sms and therapeut ic potent ial . Nature reviews Cancer 14, 263-276) . 이들의 클라이언트 단백질들은 종양생성의 다단계 과정 내에 관여하는 다양한 발암유발단백질을 포함하고， 항암제 개발에 대하여 가장 활발하게 조사되고 있는 단밸질 중의 하나로 Hsp90이 있다 (Neckers, L . , . and Workman, P. (2012) . Hsp90 molecular chaperone 'inhibitors: are we there yet? CI inical cancer research： an official journal of the American Association for Cancer Research 18, 64-76； Trepel , J . , Mol lapour , M.， Giaccone , G. , and Neckers , L. (2010) . Targeting the dynamic HSP90 com lex in cancer . Nat Rev Cancer 10, 537-549； Whitesel 1 , L. , and Lindquist , S. L. (2005) . HSP90 and the chaperoning of cancer . Nature reviews Cancer 5, 761-772). 많은 Hsp90억제제들이 이미 Hsp90_사페론의 다중 종양 생성 시그널 경로를 손상시키기 위해 개발되어왔고, 이들중 몇몇은 이미 암의 치료제로서 임상 시험 중에 있다 (Neckers, L. , and Trepel, J. B. (2014). Stressing the development of small molecules targeting HSP90. CI inical cancer research： an official journal of the American Assoc i at ion for Cancer Research 20, 275-277) . 94 kDa의 글루코오스 -조절 단백질 (glucose-regulated protein, Grp94) 및 TNF 수용체 관련 단백질 1 (TRAP1)은 세포소기관， 소포체， 및 미토콘드리아 내에서 발견된 Hsp90상동 단백질이다 ( Chen, B.， Piel , W. H. , Gui , L. , Bruford, E.， and Monteiro, A. (2005). The HSP90 family of genes in the human genome: insights into their divergence and evolut ion. Genomics 86, 627-637). 상기 세포소기관 상동 단백질은 세포질 Hsp90와 유사한 구조를 가지며， 특히 N-말단 도메인 (NTD)에 위치하고 있는 ATP 결합 포켓은 더욱 큰 유사성을가지고 있다. (Doll ins, D. E.， Warren, J. J. , Immormino, R. M.， and Gewirth, D. T. (2007). Structures of GRP94-nucleot ide complexes reveal mechanist ic differences between the hsp90 chaperones. Mol Cell 28, 41-56； Lavery , L. A. , Partridge, J. R. , Ramelot , T. A. , Elnatan, D. , Kennedy , M. A. , and Agard, D. A. (2014) . Structural asymmetry in the closed state of mitochondrial Hsp90 (TRAPl) supports a two-step ATP hydrolysis mechanism. Mol Cell 53, 330-343； Lee, C. , Park, H. K. , Jeong, H. , Lim, J. , Lee, A. J., Cheon, K. Y. , Kim, C. S.， Thomas , A. P. , Bae, B. , Kim, N. D., et al . (2015) . Development of a Mitochondriaᅳ Targeted Hsp90 Inhibitor Based on the Crystal Structures of Human TRAPl. Journal of the American Chemical Society 137, 4358-4367). 따라서,， Hsp90 NTD의 ATP 포켓을 표적화하는 저해제들은 인 비트로에서 Grp94 및 TRAP1에 대한 저해 활성을 가질 수 있고， 따라서 , 이들은 종종 판ᅳ Hsp90 패밀리 단백질 저해제로 불린다 Kang, B. H.， and Altieri , D. C. (2009) . Compartmentalized cancer drug discovery target ing mi tochondrial Hsp90 chaperones . Oncogene 28, 3681-3688； Patel , _ P. D. , Yan, P. , Seidler, P. M.， Patel, H. J. , Sun, W. , Yang, C. , Que, N. S. , Taldone, T. , Finotti , P. Stephani , R. A. , et al. (2013). Paralog-select ive Hsp90 inhibitors define tumor -speci f ic regulation of HER2. Nat Chem Biol 9， 677-684.). 그러나， 본 발명자들은 최근 판 -Hsp90 저해제들은 이러한 약물들의 비효율적인 미토콘드리아 내의 축적때문에. 미토콘드리아 저항성의 TRAP1을 불활성화하지 못하는 것을 확인하였다. (Kang, B. H. , Plescia, J. , Song, Η. Υ. , Meli , Μ.， Colombo, G.， Beebe, K.， Scroggins, B. , Neckers, L. , and Alt ier i , D. C. (2009) . Combinatorial drug design targeting multiple cancer signaling networks controlled by mitochondrial Hsp90. J Clin Invest 119, 454-464； Lee, C. , Park, H. . , Jeong, H. , Lim, J:, Lee, A. J . , Cheon , K. Y. , Kim, C. S. , Thomas , A. P., Bae, B. , Kim, N. D. , et al. (2015) . Development of a Mitochondria-Targeted Hsp90 Inhibitor Based on the Crystal Structures of Human TRAPl. Journal of the American Chemical Society 137, 4358-4367). 따라서， 기존 Hsp90 저해제들의 세포독성효과는 세포질 및 ER에 위치한 Hsp90 패밀리 단백질의 불활성화에 기원하는 것으로 예상된다. 본 발명자들은 서로 다른 세포소기관에 위치한 모든 Hsp90 패밀리 단백질들을 동시에 불활성할때 증강된 세포독성 활성을 나타냄을 확인하였다. 나아가, 아는 심지어 기존 Hsp90 저해제가 가지고 있는 문제점으로 제시된 Hsp70의 증가와 같은 열 충격 반응의 유도를 억제함을 확인하였다. 이러한 데이터는 Hsp90 저해제의 항암활성이 미토콘드리아 투과성을 높인 저해제의 개발에 의해 현저하게 개선될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 소분자 미토콘드리아 투과성 Hsp90 저해제의 개발에 예의 노력한 결과， 인비보에서 Hap90 상동단백질들을 동시에 억제할 수 있는 저해제인， 판보티닙 -401(panvotinib-401 (Pan-401)및 이의 유사체돌을 개발하였고， 이는 미토콘드리아에 투과가능하고 인 비보에서 세포질， ER, 미토콘드리아에 존재하는 Hsp90상동단백질 모두, 특히 TRAP1를 비활성화시킬 수 있어 종래 Hsp90 저해제들에 비해 탁월하게 암-선택적 세포독성 활성을 증강시킴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명은 상기한 문제점들을 해결하기 위한 것으로, 종양세포에서 증가하는 Hsp90 및 Hsp90 상동단백질， 바람직하게 TRAP1에 대한 억제 활성을 나타내는 신규한 화합물 또는 이의 '약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 Hsp90 상동단백질 및 Hsp90 상동단백질， 바람직하게 TRAP1에 대한 억제 활성을 나타내는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는， 항암용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서， 본 발명은 Hsp90 및 이의 상동단백질 억제 활성을 나타내는, 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
Figure imgf000006_0001
상기 식에서 , Rl, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로， H, 할로 (Halo), Ci-6 알킬， C2— 6알케닐， 시아노， 0R6, SR6 또는 NHR6이거나，
Rl, R4 및 ,R5는 독립적으로, H, 할로 (Halo), d-6 알킬， C2— 6알케닐， 시아노， OR, SR 또는 NHR이고， R2 및 R3는 함께 N, 0 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2의 헤테로원자를 포함하는 4원 내지 7원의 헤테로사이클을 형성할 수 있고;
R6는 H 또는 d-6알킬이며,
상기 d-6알킬 , C2-6알케닐은 선택적으로 할로 또는 d-6알킬로 치환될 수 있다.
바람직하게， 상기 Rl, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로， H, F, C1， Br, I， d-4알킬, C2-4알케닐， 시아노， OR, SR 또는 NHR이거나，
Rl, R4 및 ,R5는 독립적으로， H, F, CI, Br, I， d-4알킬， C2-4알케닐, 시아노, 0R6, SR6 또는 NHR6이고, R2 및 R3는 함께 N, 0 및 ≤로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원의 헤테로사이클을 형성할 수 있고;
상기 R6는 H 또는 Ci-4알킬이고;
상기 알킬 또는 C2-4알케닐은 F， (： 1， Br， 또는 메틸로 선택적으로 치환될 수 있다. 【유리한 효과】
이상과 같이, 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물은 Hsp90 패밀리 단백질들에 대한 최적화된 활성으로 인해 미콘드리아에 대한 효과적인 투과능을 가져 , TRAP1과 같은 Hsp90 패밀리 단백질의 세포질， 소포체， 및 미토콘드리아 풀 모두를 불활성화 시켜 억제할 수 있어, 종래의 'Hsp90 저해제들에 비해 새로운 기전으로 작용하면서. 탁월한 암-선택적 세포 독성 활성을 증강시켜 항암제로서 매우 유용하다.
【도면의 간단한 설명】
도 1A 내지 E는 Hsp90 억제제와 TRAP1 억제제인 개미트리닙을 병용한 경우의 인간 암 세포주에서의 상승 효과를 확인한 도면이다.
도 2는 DMAG와 개미트니립간의 병용요법 기전 및 인비보효능을 분석한 결과이다. 도 2A는 약물 조합에 의해 유도된 카스파제 활성화 결과를 나타낸 것이다. HeLa 세포를 지시된 대로 약물로 처리하고 웨스턴 블랏팅으로 분석 하였다. 도 2B는 생체 내 Apoptosi s 유도 결과를 이종 이식 마우스로부터 격리 된 종양 조직을 TUNEL 염색.으로 분석하고 형광 현미경으로 검사 한 결과이다. 도 2C는 DMAG와 개미트니립간의 병용요법에 따른 마우스 체중의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 2D는 DMAG와 개미트니립간의 병용요법에 따른 정상 조직의 조직학적 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 3 A.내지 I는 약물의 병용 투여가 DMAG에 와해 유도된 생존신호인
HSF1을 칼시뉴린 효소를 활성화하여 억제한다는 것을 확인한 도면이다.
도 4은 약물병용투여가 세포질의 칼슘농도를 높이고 미토콘드리아가 조각나도록 함을 확인한 결과이다. 도 4A는 PU-WS13 및 gami tr inib로 처리 한 후 Fura-2 염색하여 이를 Fura-2 로딩 된 HeLa 세포를 형광 현미경을 사용하여 분석한 결과이다. 도 4B는 대조군 또는 Grp94 s iRNA- 트랜스펙션된 HeLa 세포를 5 μΜ gami tr inib로 6 시간 동안 처리하고 형광 현미경을 사용하여 분석한 결과이다. 도 4C는 대조군 또는 CypD siRNA- 형질 감염된 HeLa 세포를 5 μΜ gami tr inib 및 10 μΜ DMAG로 6 시간 동안 처리하고 형광 현미경을 사용하여 분석한 결과이다. 도 4D는 대조군 또는 RyR2 siRNA-형질 감염된 HeLa세포를 5 μΜ gami tr inib및 10 μΜ DMAG로 6시간 동안 처리하고 형광 현미경을 사용하여 분석한 결과이다. 도 4E는 CypD siRNA로 처리 한 후， HeLa 세포를 gami tr inib 및 DMAG와 함께 6 시간 동안 배양하고 웨스턴 블랏팅을 사용하여 분석한 결과이고, 도 4F는 RyR2 siRNA로 처리한 후， HeLa 세포를 지시 된대로 6 시간 동안 약물과 함께 배양하고 웨스턴 블랏팅을 사용하여 분석한 결과이다. 도 4G는 Drpl의 미토콘드리아 축적. 도 4H는 Mdivi-1 미토콘드리아 분열의 억제를 확인한 결과이다. 도 41는 약물의 병용에 의한 미토콘드리아의 분열 ( f i ssion)을 유도한 것을 확인한 것이다.
도 5는 약물병용투여가 Hsp90 cl ient의 발현 감소 및 미토콘드리아 기능교란으로 암세포를 효과적으로 죽임을 보여주는 결과이다. 도 5A는 DMAG와 PU-WS13 사이의 약물 조합 효능의 비교 결과를 나타낸 것이다. HeLa 세포를 24 시간 동안 지시 된 바와 같이 약물로 처리하고 ΜΊΤ 분석을 사용하여 분석 하였다. 도 5B는 개미트리닙과 Grp94 siRNA의 조합 효능의 비교 결과를 나타낸 그래프이다. HeLa 세포는 Grp94 siRNA의 넉다운 후 24 시간 동안 gami tr inib와 함께 배양되었다. 세포 생존력은 M T분석 (왼 )과 Western blot t ing (오른쪽)에 의한 siRNA knockdown효율로 분석 하였다. 도 5C는 Hsp90 및 Grp94 억제제의 효과를 나타낸 결과이다. HeLa 세포를 6 시간 동안 지시 된 바와 같이 약물로 처리하고 웨스턴 블랏팅으로 분석 하였다. 도 5D는 약물 조합에 의한 미토콘드리아 분열 결과를 나타낸 결과이다. HeLa 세포는 6시간 동안 지시 된 바와 같이 5 μΜ gami tr inib, 10 μΜ DMAG및 20 μΜ
PU-WS13으로 처리하였고 공초점 현미경으로 분석 하였다.
도 6Α 내지 6G는 판보티닙의 작용기전 및 화학구조식과 인비트로에서의 활성을 제시한 결과이다.
도 7은 유사 저해물질과 TRAP1 및 Hsp90간의 결합구조를 나타낸 도면이다.
도 8은 판보티닙의 작용기전이 Hsp90 저해제와 T AP1 저해제를 병용처리 하였을때와 동일함을 규명한 결과이다. 도 8A는 판보티닙의 즉시 미토콘드리아 막 전위의 손실 효과를 확인한 것이고， 도 8B는 cytochrome c의 방전 (di scharge)을 촉발하였음을 확인한 결과이고, 도 8C는 판보티닙의 미토콘드리아의 R0S 증가 효과를 나타낸 것이다. 도 8D는 판보티닙에 의한 CHOP 발현 증가효과를 확인한 그래프이고， 도 8E, F는 판보티닙에 와한 단백질 발현 양상을 확인한 결과이다. 도 8G는 판보티닙에 의한 세포질 칼슘 농도의 증가 효과를 확인한 그래프 및 사진이고, 도 8H는 판보티닙에 의한 칼시뉴린 활성의 증가를 확인한 그래프이다. 도 81는 판보티닙에 의한 siRNA로 칼시뉴린을 선택적으로 억제하였을 때의 Hsp70 발현을 확인한 결과이고， 도 8J는 판보티닙에 의한 미토콘드리아 fragmentat ion 억제 효과를 확인 사진이다.
도 9은 인비보에서의 판보티닙 활성을 규명한 결과이다. 도 9A는 다른 Hsp90저해제들에 대비한 간암세포， 전립선암，자궁경부암， 폐암， 뇌종양 세포들에서의 강하 세포독성 활성을 나타낸 그래프이고， 도 9B는 상기와 같은 세포죽음 유도 기전이 아포토시스를 통한 것임을 확인한 그래프이다. 도 9C는 다른 Hsp90 저해제들에 대비한 민간 각막 및 마우스 간세포에 대한 세포 독성을 확인한 그래프이며， 도 9D는 실험쥐를 활용한 전립선암 xenograft 실험에서 판보티닙의 현저한 종양성장 억제효능이을 확인한 그래프이다. 도 9E는 종양조직에서 아포토시스에 의한 세포죽음을 확인한 그래프이다. 도 9F는 몸무게의 감소를 나타낸 그래프이고, 도 9G는 실험쥐의 종양조직에서 Hsp90 cl ient 단백질의 감소， Hsp70 발현증가의 억제와 CHOP 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 10은 인비보에서 종양 및 정상조직에 대한 Pan— 401(화학식 la의 화합물 1)의 효과분석 결과이다. 도 10A는 종양조직에서의 아포토시스에 관한 세포죽음을 관찰한 결과이고， 도 10B는 조직학적인 기관 독성 증상을 확인한 것이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명을 좀 더 상세히 설명한다. 더욱 바람직하게， 상기 화학식 I의 Rl , R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 : H. F, CI , Br , I , 메틸， 에틸, 프로필， 에테닐， 시아노， 0CH3 , 0CF3 , SCH3또는 NH2이거나,
Rl , R4 및 R5는 독립적으로， H, F, C1， Br , I， 메틸， 에틸， 프로필， 에테닐， 시아노， 0CH3ᅳ 0CF3 , SCH3또는 NH2이고， R2및 R3는 함께 N, 0및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원의 해테로사이클을 형성할 수 있다.
더욱 바람직한 양태에서， 본 발명은 하기 구체적인 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물일 수 있다:
(1)
1-((6-브로모벤조 [d][l,3]다이옥솔 -5-일)메틸) 4-클로로 -1H-피라졸로 [3,4-d ]피리미딘ᅳ 6-아민 (Pan-401);
(2) 1-벤질— 4-클로로 -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민
(DN200219-1);
(3)
1- (벤조 [d] [1,3]다이옥솔— 5-일메틸 )-4-클로로 -1H—피라졸로 [3,4-d]피리미딘- 6-아민 (DN200263-1);
(4)
4-클로로 -1-(3 , 4—디클로로벤질 ) -1H-피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -6-아민
(DN200318-1);
(5)
4-클로로 -1-((6-클로로벤조 [d][l,3]다이옥솔 -5-일)메틸) -1H-피라졸로 [3,4-d ]피리미딘 -6-아민 (DN202782-1);
(6)
4-클로로 -1-( (6-아이오도벤조 [d] [1， 3]다이옥솔 -5-일 )메틸) -1H-피라졸로 [3， 4 -d]피리미딘 -6-아민 (DN202961-1)；
(7)
4-클로로-1-((6-메틸벤조[ [1,3]다이옥솔-5—일)메틸)-1}ᅵ-피라졸로[3,4-01] 피리미딘 -6-아민 (DN203143-1);
(8) 4-클로로-1-(3-메록시벤질)-111-피라졸로[3，4-(1]피리미딘-6-아민
(DN203372-1);
(9) 4-클로로—1— (3-메틸벤질) -1H-피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203373-1);
( 10) 1-(4-브로모벤질 ) -4-클로로 -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203374-1); 4-클로로 -l-(4-클로로 -3-플루오로벤질 )-1Η-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203375-1);
(12)
1-(2-브로모 -5—메록사벤질) -4—클로로 -1H—피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203376-1);
(13) ^-브로모벤질；卜^클로로-：！！！-피라졸로 ，^ 피리미딘 -아민 (DN203377-1);
( 14) 4—클로로 -1-(2-클로로벤질 ) -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203378-1);
(15)
4—클로로 -1-(3， 4-디플루오로벤질 ) -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203379-1);
(16) 4-클로로 -1-(4-비닐벤질) -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203381-1);
(17)
3- ( (6-아미노 -4-클로로 -1H-피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -1-일 )메틸 )벤조나이트 릴 (DN203487-1);
(18)
4-클로로— 1-(4- (트리플루오로메틸)벤질) -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아 민 (DN203488-1);
(19)
4一클로로 -1-(2， 6-디플루오로 -3-메특시벤질 )— 1H-피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -6- 아민 (DN203489-1);
(20)
4-클로로 -1-(2-클로로 -4-플루오로벤질) -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203490-1);
(21) 4—클로로 -1-(4-메틸벤질) -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203491-1)；
(22) 4-클로로 -l-(2-메특시 -4- (트리플루오로메틸 )벤질 ) -1Hᅳ피라졸로 [3 , 4-d]피리 미딘— 6-아민 (DN203492— 1) ;
(23)
4-클로로 -1— (4- (트리플루오로메톡시 )벤질) -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6- 아민 (DN203493-1) ;
(24)
1ᅳ(2-브로모 -3-플루오로벤질 )-4-클로로 -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203494-1) ;
(25)
1ᅳ (4-브로모 -2-플루오로벤질 )-4-클로로 -1H-피라졸로 [3， 4_d]피리미딘 -6-아민 (DN203495-1) ;
(26)
4-클로로 -1-(5-플루오로 -2-메록시벤질) -1H-피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203633-1) ;
(27)
4-클로로 -1-(2 -풀루오로 -5-메틸벤질 )-1Η-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203634-1) ;
(28)
4-클로로 -1-(4-(메틸티오)벤질) -1H-피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -6-아민
(DN203635-1) . 본 발명에서， 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염''이란 이 분야에서 일반적으로 사용되고 있는 염 화합물 형태를 의미하며， 산 부가염 또는 염기 부가염일 수 있다. 구체적으로， 화학식 I에 따른 화합물의 약학적으로 허용가능한 염의 예로는， 염산， 브름산， 인산 또는 황산과 같은 무가산과의 염; 아세트산， 트리플루오로아세트산, 구연산， 말레인산, 수산， 호박산， 벤조산, 주석산, 푸마르산， 만델산, 아스코르브산 또는 말산과 같은 유기 카르복실산이나, 메탄설폰산 또는 파라-를루엔설폰산과 같은 설폰산과의 염; 나트륨, 칼륨 또는 리륨과 같은 알카리 금속과의 염; 흑은 기타 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있는 것으로 알려진 다양한 산과의 염 등을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 일 실시 양태에서， 본 발명자들은 퓨린 스캐폴드를 갖는 하기 화학식 I I의 구조를 갖는
BI IB-02K6-클로로 -9- [ (4-메특시 -3， 5-디메틸 -2-피리딘일)메틸] -9^퓨린 -2- 아민; CAS No. 848695-25-0)로부터 본 '발명에 따른 화학식 la의 구조를 갖는 판보티닙 (Pan-401) 화합물 등을 비롯한 다수의 화합물 (화합물 1 내지 28)을 제조하였다.
[화학식 I I ]
Figure imgf000013_0001
Pan-401
분자 샤페론 (molecular chaperone)인 Hsp90은 암세포를 작동하게 하는 기구 (machinery)의 핵심 구성요소로서， 암세포의 성장과 생존을 촉진하는 여러 가지 돌연변이성 또는 과다발현성 신호전달 단백질이 기능을 발휘하는데 필요하다. 이는 Hsp90 저해제가 상당히 다양한 암에 대하여 효과를 가질 수 있음을 의미한다. 더욱이 Hsp90은 종양세포에서 특이적으로 활성화될 뿐 아니라 고친화적 형태로 존재하므로， 상기 화학식 I의 화합물과 같은 Hsp90 및 TRAP1과 같은 Hsp90 상동단백질 저해제는 종양세포에 대해 높은 선택성을 나타낼 수 있다.
특히， 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물은 종래 알려진
BI IB-021이나 PU-H기과 같은 퓨린 스캐폴드 억제제와는 달리 피라졸로피리미딘 스캐폴드를 가지면서 이러한 피라졸로피리미딘 환의 1번 위치의 N에 연결된 치환기가 브로모벤조디옥솔이라는 구조적인 특징을 가짐으로 인해, 미토콘드리아를 투과하여 TRAP1을 효과적으로 억제할 수 있고， 동시에 Hsp90 단백질 및 Grp94를 억제함으로써， in vivo pan-Hsp90 저해제 활성을 가짐. 이로 인해 탁월한 항암 활성을 나타낼 수 있으며， 특히， Hsp90 저해제의 가장 큰 단점으로 제시된 열 충격 인자 Kheat shock factor 1， HSF1) 의 활성화를 수반하지 않는다.
또 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 '암 치료용 (더 넓은 의미로는 예방용) 약제， 즉 항암제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항암제 조성물은 모든 종류의 암세포의 Hsp90를 타겟으로 할 수 있고， 구체적으로. 암종은 이에 제한되는 것은 아니나，유방암， 난소암，자궁경부암， 간암， 폐암, 혈액암ᅳ 뇌종양， 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 암일 수 있다. 본 발명의 항암제 조성물은 활성 성분으로서 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이들의 염을 치료학적으로 유효한 양만큼 함유하고, 1종 이상의 무기 또는 유기의 고체 또는 액상의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하거나 혼합하는 흔합물이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 포유동물 (특히， 인간)에게 경구 또는 비경구 (예를 들어， 근육 내 또는 정맥 내 주사)로 투여할 수 있다. 활성 성분의 투여량 및 투여횟수는 포유동물의 종， 체중， 연령 및 개개의 상태에 따라 달라진다. 본 발명의 화합물 또는 제약상 허용가능한 이들의 염을 포유동물， 예를 들어 대략 70kg 체중의 인간에게 투여할 때， 1인당 1일 투여량은 바람직하게는 대략 lOOOmg 내지 대략 7 g이다. 본 발명의 항암제 조성물은 활성 성분 (본 발명의 화합물)을 대략 95% 내지 대략 99.9% 포함한다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 앰플, 바이알, 좌제， 당제, 정제 또는 캡슬제 형태 등 과 같은 단위 투여 형태일 수 있다. 본 발명의 항암제는 공지된 방식인 통상적인 용해， 동결건조, 흔합, 과립화 또는 당제화 공정 등을 통해 제조될 수 있고， 시판되는 것을 구입해서 사용할 수도 있다. 본 발명의 항암제에 포함되는 첨가제로， 예를 들어， 부형게, 보존제 , 안정화제， 습윤제， 유화제， 가용화제， 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충액， 결합제， 희석제， 활택제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 항암제 조성물이 주사 형태로 제형화되는 경우， 멸균 조건하에서 통상적인 방식으로 제조될 수 있으며， 상기 조성물을 앰플 또는 바이알에 도입하고 용기를 밀폐할 때에도 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 항암제 조성물이 경구 투여용으로 제형화되는 경우， 정제는 활성 성분을 고체 담체와 배합하고， 필요하다면 생성된 혼합물을 과립화하며， 필요에 따라서는 적절한 부형제를 첨가한 후에 상기 흔합물을 가공하여 제조할 수 있다. 본 발명의 경구 투여용 항암제로서 ¾슐제는 젤라틴으로 제조된 건조-충전된 캡슐제 및 젤라틴과 가소제 (예를 들어, 글리세를 또는 소르비를)로 제조된 연질 밀봉된 것을 사용할 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】 이하， 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 하나， 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의하여 한정되는 것^ 아니다. 본 실시예에서 사용되는 약어는 다음과 같다
CNB, calcineur in regulatory subunit B;
CypD, cyclophi 1 in D;
DMAG, 17- ( d i me t hy 1 am i noe t hy 1 am i no ) - 17-deme t hoxyge 1 danamyc i n； ER, endo lasmic reticulum;'
Drpl, dynam in-related protein 1;
GAPDH , glycer aldehyde phosphate dehydrogenase;
Grp94, 94 kDa glucose-regulated protein; .
*73HSF1, heat shock factor 1；
Hsp90, 90 kDa heat shock protein!
MTT, 3(4,5-dimethyl-thyzoyl-2-yl )2,5 di henyltetrazol ium bromide; NTD, N-terminal domain;
RyR, ryanodine receptor；
SDS-PAGE , sodium dodecyl sulfate polyacryl amide gel electrophoresis! TPP， tr i heny 1 phosphon i urn；
TRAPl, tumor necrosis factor receptor-associated protein 1； TRAPlᅳ NM, C-terminal deleted TRAPl;
CNB, calcineur in regulatory subuni t B. 제조예 1: Pan-40 (화학식 la, 화합물 1)화합물의 제조
1-1) Hsp90 inhibitor의 준비
PU-H71, BIIB021, 17-AAG, AUY922, 및 17— DMAG는 Tocris, Toronto Research Chemicals, 또는 Sigma—Aldr ich로부터 구입하였다. DN320는 W02Q05028434에 개시된 방법에 따라 제조하였다.
L-2) Pan-401합성을위한 Scheme 및 실험 공정
Figure imgf000016_0001
(1) ((6-브로모벤조 [d] [1,3]다이옥솔 -5-일)메틸)하이드라진 하이드로클로라이드의 제조
Hydrazine monohydrate (6.33 mL, 130 ' mmol)를 5-bromo-6-(chloromethyl )benxo[i] [l,3]dioxole (1) (2.5 g, 130 隱 ol)의 메탄을 용액 (40 mL) 내에 부가하였고, 이를 0° C에서 30분간 교반하였다. 제조된 혼합물은 60° C까지 가열한 후 같은 은도에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 이후 상기 흔합물들을 상온으로 넁각시키고， 물 24mL를 부가하였다. 용매를 감압하에서 약 55mL까지 증발시키고,수득한 잔사에 2 N NaOH (aq. 160 mL)를 부가하였다. 이에 CH2C12을 첨가하여 유기 물질 층을 분리하였고， 이를 Na2S04에서 건조시키고，여과한 후 감압하에서 농축시켰다. 결과적으로 생산된 잔사는 CH2C12 (100 mL)에 용해시키고, 이를 -2° C로 넁각시켰다. 순차적으로 디옥산 내의 4 N HC1 (38 mL, 150 mmol)를 용액에 부가하고， 그 혼합물을 -2ά C에서 13 시간동안 교반하였다. 생성된 침전물을 여과로 수집하고， CH2C12, 이소프로필에테르 (isopropyl ether), 및 CH2C12 로 세적하였고 마지막으로 건조시켜
( (6-브로모벤조 [d] [ 1.2]다이옥솔 -5-y)메틸 )하이드라진
하이드로클로라이드 (2) 를 흰색 고체로 수득하였다 (2.3 g, 82%).
¾丽 R (400 MHz, d6-DMS0) δ 7.21 (s, 1H), 7.11 (s, 1H)， 6.07 (s, 2H) , 5.74 (br , 3H)， 4.03 (s, 2H)； 13C NMR (100 MHz, d6-DMS0) 148.3, 147.6, 128.2, 114.2, 112.9, 110.7， 102.6, 52.9； MS (ESI, m/z) calculated for C8H10BrN202 [M+l]+ 246.08, found 246.50.
(2) l-((6-브로모벤조 [d][l,3]다이옥솔 -5-일)메틸) -4-클로로 -l^
-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (Pan-401)의 제조
CH2C12 (3.0 mL)에 녹아있는 트리에틸아민 용액 A solution (1.2 mL, 8.4 隱 ol)을 ((6-브로모벤조 [d] [1.2]다이옥솔 -5-일)메틸)하이드라진 하이드로클로라이드 (2) (0.8 g, 2.5 画 ol) 및 CH2C12 (10 mL) 중의 2-ami no-4 , 6-d i ch 1 or opyr i m i d i en-5-car ba 1 dehyde (0.4 g, 2.1 圍 ol) 흔합용액에 o° C 에서 약 15분 동안 적가하였다. 생성되는 흔합물을 1.5 시간동안 0° C에서 교반하였다. 반응 후에 , 0.2NHC1 (aq)를 상기 흔합물에 붓고, 이 혼합물을 C¾C12 (X3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 브라인으로 세척하고 이후 MgS04로 건조하였다. 생산된 잔사는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였고 (C¾C12 to 1:4 Et0Ac/CH2Cl2) 그 결과 목적 화합물인 Pan-401 를 흰색 고체로 수독하였다 (0.79 g, 99%).
¾ NMR (400 MHz, d6-DMS0) δ 8.04 (s, 1H)， 7.39 (s, 2H), 7.25 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.04 (s, 2H) , 5.32 (sᅳ 2H); 13C NMR (100 MHz' cl6— DMSO) δ 161.4, 155.9, 153.5, 147.7, 147.2, 132.8, 128.6， 112.5, 112.3, 108.9, 106.0, 102.0， 49.49； MS (ESI， m/z) calculated for C13H10BrClN502 [M+l]+ 383.6, found 384.0. 제조예 2내지 28: 화합물 2내지 28의 제조
하기의 일반적인 제조 공정에 따라 화합물 2 내지 28을 제조하였다. <일반적인 제조
Figure imgf000018_0001
4-클로로 -1H-피라졸로 [3, 4-d]피리미딘 -6—일아민 (0.5 隱 ol ) , 다양하게 R치환된 벤질할라이드 (0.5瞧 ol ) , 및 and K2C03 ( 1 mmol ) 를 건조된 DMF (3 mL)에 넣고 12시간 동안 60°C에서 교반하였다. 이후 이를 상온으로 넁각시킨 후, 제조된 반웅흔합물을 AcOEt (20 mL)로 희석시키고, 이후 이를 브라인 (br ine) 20mL 로 2회 세척하였다. 유기층은 무기 MgS04 를 사용하여 건조시킨 후 여과하였다. 용매의 제거 후에， 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 목적 화합물을 수득하였다ᅳ 상기 벤질 할라이드는 1 내지 4개의 R로 치환되는 것으로， 이때 R은 Rl , R2 , R3 또는 R4를 의미한다. 제조예 2: 1-벤질 -4-클로로 -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민
(DN200219-1, 화합물 2)
Figure imgf000018_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 78%， ¾ NMR (400 MHz , CDC13) δ 7.90 (s , 140， 7-^36 - - 7.264m -, )—,— 5.44— ( s , 2H— )，됴 .-3.0 ( - tt)_;_.MS calccLiQr__Ci2HioC LN5. (M+H)+: 259.06, found 260.15 제조예 3: 1- (벤조 [d] [1.2]다이옥솔 -5-일메틸 )-4-클로로 -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN200263-1, 화합물 3)
Figure imgf000019_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여, 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 57%, ¾ NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.88 (s, IH), 6.83 (d, /= 9.7 Hz, 2H)， 6.74 (d, /= 7.7 Hz, IH), 5.92 (s, 2H) , 5.33 (s, 2H), 5.22 (s, 2H) ; MS calcd for C13H10C1N502 (M+H)+: 303.05, found 304.10 제조예 4：
4-클로로 -l-(3， 4-디클로로벤질 )-1Η-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민
(DN200318-1, 화합물 4)
Figure imgf000019_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여, 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다.수율: 53%, NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.96 (s, IH) , 7.48 (d, /= 8.4 Hz, 2H) , 7.20 (d, /= 8.2 Hz, IH), 5.43 (s, 2H); MS calcd for Ci2H8ClN5 (M+H)+: 328.58 found 328.05 제조예 5: 4-클로로 -l-((6-클로로벤조 [d] [1,3]다이옥솔 -5-일)메틸) - 피—라졸로 [3 , 4-dl피리피딘 -6회 -민— (-DN202782-1, 화합물—5:1
Figure imgf000019_0003
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다.수율: 60%, ^NMR OO丽 ζ, MeOD) δ 7.97 (s, IH), 6.93 (s, 1H), 6.48 (s, 1H)， 5.97 (s, 2H) , 5.45 (s, 2H)； MS calcd for C13H9Cl2N502 (M+H)+: 337.01, found 338.20 제조예 6: 4-클로로 -l-( (6-아이오도벤조 [d] [1,3]다이옥솔 -5-일)메틸) -1H-피 아민 (DN202961-1, 화합물 6)
Figure imgf000020_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 62%， ¾ NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.95 (s, 1H)ᅳ 7.27 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.93 (s, 2H), 5.40 (s, 2H) , 5.29 (s, 2H)； MS calcd for C13H9C1N5()2 (M+H)+: 429.60, found 430.00 제조예 7： 4-클로로 -l-((6-메틸벤조 [d] [1,3]다이옥솔 -5-일)메틸) -
1H-피라졸로 [3 , -d]피리미딘 -6-아민 (DN203143-1， 화합물 7)
Figure imgf000020_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 50%， ¾ NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7.91 (s, 1H), 6.66 (s' 1H), 6.61 (s, 1H)， 5.89 (s, 2H), 5.41 (s, 2H) , 5.33 (s, 2H)， 2.35 (s, 3H); MS calcd for Ci4H12ClN502 (M+H)+: 317.06, found 318.30 제조예 8: 4-클로로 -l-(3-메톡시벤질) -IH-피라졸로 [3，4— d]피리미딘 -6-아민 (DN203372-1, 화합물 8)
Figure imgf000021_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 51%， ¾匪 R (400 MHz, CDC13) δ 7.90 (s, IH), 7.23 (t, J 7.8 Hz, IH), 6.87 (d, J = 7.7 Hz, IH), 6.85 - 6.78 (m, 2H), 5.41 (s, 2H), 5.31 (s, 2H) , 3.77 (s, 3H)； MS calcd for Ci3H12ClN50 (M+H)+: 289.07, found 290.00 쎄조예 9: 4-클로로 -l-(3-메틸벤질) -IH-피라졸로 [3,4-d]피리미딘
-6-아민 (DN203373— 1, 화합물 9)
Figure imgf000021_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 59%， ¾ NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7.90 (s, IH), 7.23 - 7.17 (m, IH), 7.09 (d, / = 7.1 Hz, 3H), 5.41 (s, 2H) , 5.40 (s, 2H), 2.31 (s, 3H); MS calcd for C13H12C1N5 (M+H)+: 273.07, found 274.05 제조예 10: l-(4-브로모벤질) -4-클로로 -IH-피라졸로 [3,4-d]피리미딘
-6-아민 (DN203374-1, 화합물 10)
Figure imgf000021_0003
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 58%, JH NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.90 (s, IH), 7.44 (d, J= 8.3 Hz, 2H)， 7.18 (d, 8.3 Hz, 2H)， 5.38 (s, 2H), 5.29 (s. 2H); MS calcd for C12¾BrClN5 (M+H)+: 338.59, found 339.90 제조예 11： 4-클로로 -l-(4-클로로 -3-플루오로벤질 )-1Η-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203375-1, 화합물 11)
Figure imgf000022_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 65%, ¾ NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.91 (s, 1H), 7.34 (t, J = 7.8 Hz, 1H) , 7.12 - 7.01 (m, 2H) , 5.39 (s, 2H) , 5.30 (s, 2H); MS calcd for C12¾C12FN5 (M+H)+: 311.01， found 311.95 제조예 12: l-(2-브로모 -5-메특시벤질) -4-클로로 -IH-피라졸로
[3, 4-d]피리미딘「6-아민 (DN203376-1, 화합물 12)
Figure imgf000022_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여, 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 61%， ¾ NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7.97 (s,
IH), 7.47 (d, J = 8.8 Hz, IH) , 6.70 (dd. J = 8.8, 3.0 Hz, IH)， 6.35 (d,
J = 2.9 Hz, IH), 5.50 ,(s, 2H), 5.31 (s, 2H) , 3.68 (s, 3H);.MS calcd for dsHnBrClNsO (M+H)+: 368.61, found 369.85 제조예 13: l-(2-브로모벤질) -4-클로로 -IH-피라졸로 [3,4-d]피리미딘
-6-아민 13)
Figure imgf000022_0003
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 67%, ¾ NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.97 (s. IH), 7.59 (dd, J 7.8, 1.2 Hz, IH) . 7.22 (td, J = 7.5, 1.2 Hz, IH), 7.15 (td, J 7.7, 1.7_Hz, IH), 6.80 (d, J = 7.6 Hz, IH), 5.55 (s, 2H) , 5.29 (s, 2H); MS calcd for C12¾BrClN5 (M+H)+: 336.97, found 337.90 제조예 14： 4-클로로 -l-(2-클로로벤질) -IH—피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203378-1 화합물
Figure imgf000023_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 65%， ¾ NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7.96 (s, IH), 7.40 (dd, /= 7.9, 1.2 Hz, IH) , 7.23 (dd, J= 7.8, 1.7 H , IH) , 7.17 (td, J = 7.5, 1.3 Hz, IH), 6.91 ― 6.85 (m, IH)， 5.58 (s, 2H) , 5.26 (s, 2H); MS calcd for Ci2¾Cl2N5 (M+H)+: 293.02, found 293.95 제조예 15: 4-클로로 -l-(3,4-디플루오로벤질) -IH-피라졸로
[3， 4-d] 79-1, 화합물 15)
Figure imgf000023_0002
일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다.수율: 60%， ¾NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.83 (s, 1Η)， 7.11 (cldd, J = 16.6, 9.1， 5.3 Hz, 2H), 7.04 - 6.92 (m, IH) , 5.30 (s, 2H)； S calcd for C12H8C1F2N5 (M+H)+: 295.04, found 296.00 제조예 16: 4-클로로 -l-(4-비닐벤질) -IH-피라졸로 [3,4-d] 피리미딘 -6-아민 (DN203381-1, 화합물 16)
Figure imgf000024_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 6¾, ¾丽 R (400 MHz, CDC13) δ 7.90 (s, IH), 7.35 (d, /= 8.2 Hz, 2H), 7.30 - 7.22 (m, 2H) 6.67 (dd, J = 17.6 10.9 Hz, IH), 5.75 ― 5.65 (m, IH), 5.42 (s, 2H) 5.33 (s, 2H) , 5.23 (d, J = 10.9 Hz, IH); MS calcd for C14H12C1N5 (M+H)+: 285.07, found 286.05 제조예 17: 3-( (6-아미노—4-클로로 -IH-피라졸로 [34-d]피리미딘 -1-일)메틸)벤조나이트릴 (DN203487-1, 화합물 17)
Figure imgf000024_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅올 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 55% ¾ NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7.92 (s, IH), 7.56 (d, J = 15.5 Hz, 3H) 7.44 (t, = 7.8 Hz, IH) , 5.46 (s, 2H) , 5.28 (s, 2H); MS calcd for C13H9C1N6 (M+H)+: 284.05, found 285.05 제조예 18 4-클로로 -l-(4- (트리폴루오로데틸 )벤질) -1H-피라졸로 [34-d]피리미딘 -6-아민 (DN203488-1, 화합물 18)
Figure imgf000024_0003
제조 공정에 따라 반웅을ᅳ 수행하여, 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 68%， ¾ NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.92 (s, 1H), 7.58 (d, /= 8.0 Hz, 2H)， 7.40 (d, /= 7.9 Hz, 2H), 5.49 (s, 2H) , 5.37 (s. 2H); MS calcd for C13H9CIF3N5 (M+H)+: 327.69， found 327.95 제조예 19: 4-클로로 -l-(2, 6-디플루오로 -3-메록시벤질) -1H-피라졸로
[3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN20389-1, 화합물 19)
Figure imgf000025_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 58%, ¾ NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7.87 (s, 1H), 6.88 (dq, J= 26.5， 8.8 Hz, 2H) , 5.51 (s, 2H), 5.33 (s, 2H), 3.85 (s, 3H); MS calcd for Ci3H10ClF2N50 (M+H)+: 325.05, found 325.95 제조예 20: 4-클로로 -l-(2-클로로 -4-플루오로벤질 )-1Η-피라졸로
[3, 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203490-1, 화합물 20)
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅올 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 58%, ¾醒 R (400 MHz, CDCI3) δ 7.94 (s, 1H), 7.16 (d, J = 6.5 Hz, 1H) , 7.00 - 6.86 (m, 2H)， 5.52 (s, 2H), 5.29 (s, 2H); MS calcd for C12H8C12FN5 (M+H)+:311.01, found 311.95 제조예 21: 4-클로로 -l-(4-메틸벤질) -1H-피라졸로 [3, 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203491-1, 화합물 21)
Figure imgf000026_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 56%， ¾匪 R (400 MHz, CDC13) δ 7.89 (s, 1H), 7.21 (d, /= 7.9 Hz, 2H)， 7.12 (d, /= 7.7 Hz, 2H) , 5.39 (s, 2H) , 5.28 (s, 2H), 2.31 (s, 3H); MS calcd for C13H12C1N5 (M+H)+: 273.07, found 274.05 제조예 22： 4-클로로 -l-(2-메록시 -4- (트리플루오로메틸)벤질) -
1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203492-1, 화합물 22)
Figure imgf000026_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 65%， ¾ NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.95 (s, 1H), 7.12 (d, /= 7.9 Hz, 1H) , 7.09 (s, 1H) , 6.91 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 5.51 (s, 2H), 5.33 (s, 2H), 3.91 (s, 3H)； MS calcd for C14HnClF3N50 (M+H) + :357.06, found 358.00 제조예 23: 4-클로로 -l-(4- (트리플루오로메록시)벤질) -1H- 피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203493-1, 화합물 23)
Figure imgf000026_0003
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 53%， ¾ NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.91 (s, IH), 7.34 (d, /= 8.0 Hz, 2H) , 7.16 (d, /= 8.0 Hz, 2H)， 5.43 (s, 2H), 5.24 (s, 2H); MS calcd for C13H9CIF3N5O (M+H)+: 343.04, found 344.00 제조예 24: l-(2-브로모 -3-플루오로벤질 )-4-클로로 -IH-피라졸로
[3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203494-1, 화합물 24)
Figure imgf000027_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여, 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 55%, ¾丽 R (400丽 z, CDCls) δ 7.96 (s, IH), 7.19 (dd, J 13.3, 7.9 Hz, IH), 7.06 (t, J = 7.7 Hz, IH) , 6.60 (d, J: 7.7 Hz, IH)., 5.57 (s, 2H)， 5.24 (s, 2H); MS calcd for C12H8BrClFN5 (M+H) + : 354.96, found 355.85 제조예 25: l-(4-브로모 -2-플루오로벤질 )-4-클로로 -IH-피라졸로
[3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203495-1, 화합물 25)
Figure imgf000027_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 60%, ¾丽 R (400 MHz, CDC13) δ 7.91 (s, IH), 7.22 (d, /= 8.4 Hz, 2H)， 7.02 (t, /= 8.0 Hz, IH)， 5.45 (s, 2H), 5.27 (s, 2H);MS calcd for Ci2H8BrClFN5 (M+H)+: 354.96, found 355.90 제조예 26: 4-클로로 -l-(5-플루오로 -2-메특시벤질) -IH-피라졸로
[3,4-(0피리미딘 -6-아민 (DN203633-1, 화합물 26)
Figure imgf000028_0001
상기 일반 제조 공정에 따라 반응을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 65%, ¾ NM (400 MHz, CDC13) δ 7.94 (s, 1H), 6.92 (td, /= 8.5， 3.0 Hz, 1H)， 6.81 (dd, 9.0, 4.3 Hz, 1H), 6.55 (dd, /= 8.8， 2.9 Hz, 1H)， 5.46 (s, 2H) , 5.25 (s, 2H) , 3.84 (s, 3H); MS calcd for CiaHnClFNsO (M+H)+: 307.06， found 308.00 제조예 27: 4-클로로 -l-(2-플루오로 -5-메틸벤질) -IH-피라졸로
[3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203634-1, 화합물 27)
Figure imgf000028_0002
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 66%, ¾ NMR (400 MHz, CDC13) δ 7.92 (s, IH), 7.09 一 7.02 (ni, IH) , 6.96 (d, J= 9.1 Hz, IH) , 6.94― 6.83 (m, IH), 5.46 (s, 2H), 5.37 (s, 2H) , 2.24 (s, 3H)； MS calcd for C13HUC1FN5 (M+H)+: 291.71, found 292.05 제조예ᅳ -28： 4-클로로 -l-(— 4- (메틸—티오 -)—벤질) -IH-파라졸로
[3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203635-1, 화합물 28)
Figure imgf000028_0003
상기 일반 제조 공정에 따라 반웅을 수행하여， 흰색 고체 형태의 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 65%, ¾丽 R (400 MHz, CDC13) δ 7.89 (s, 1H), 7.24 (d, /= 8.4 Hz, 2H)， 7.19 (d, /= 8.4 Hz, 2H), 5.39 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 2.44 (s, 3H); MS calcd for C13H12C1N5S (M+H)+: 305.05, found 305.95 실시예 1: 사용되는물질 및 방법
1-1) 화학물질, 플라스미드 및 항체
Mi toTr acker 및 Fura—2는 Molecular Probes로부터 구입하였고， 다른 모든 화학물질들은 Sigma로부터 구입하였다. HSF1-GFP 융합 구축물은 Addgene (Plasmid #:32538; Wang, X. , Grammatikakis, N.， Siganou, A. , and Calderwood, S. K. (2003) . Regulation of molecular chaperone gene transcript ion involves the serine phosphorylat ion, 14-3-3 epsi Ion binding, and cytoplasmic sequestration of heat shock factor 1. Molecular and ■ cellular biology 23, 6013— 6026)으로부터 구입하였다. Anti -CHOP, ant i-prohibi tin, 및 ant i-caspase3 는 Cell Signaling; ant i-calcineur in subunit B는 Sigma; ant i -RyR , anti一 Akt, antiᅳ Grp94, antiᅳ Chkl, ant i-lamin B, 및 anti—PARPl는 Santa Cruz Biotechnology; ant i-cyclophol in D (CypD)는 Calbiochem; ant i-eIF2 a [pS52] 는 Invitrogen; antiᅳ βᅳ actin 는 MP Biomedicals, 및 anti-TRAPl, anti-HSFl, anti-Drpl, 및 anti-Hsp70 는 BD Biosciences로부터 각각 구빕하거나 제공받았다.
1-2) 세포 및 배양조건
자궁경부 (HeLa), 유방 (MDA-MB-231) , 난소 (SK-0V3), 간 (SK-HEP-1), 뇌 (T98G) , 폐 (H460), 및 전립선 (PC3 and 22Rvl)의 인간 암 세포들은 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 구입하였고， 공급자의 매뉴얼에 따라 유지하였다. 세포들은 10% fetal bovine serum (FBS; GIBC0) 및 1% penicillin/streptomycin (GIBCO)을 함유하는 DMEM 또는 RPMI 배지에서 (GIBC0) 37° C, 5% CO2의 humidified atmosphere에서 배양하였다. 인간 각막 세포는 ATCC로부터 구입하였고， 이를 ATCC corneal medium (ATCC)에서 제조사의 매뉴얼에 따라 배양하였다. Primary hepatocyte는 8주령의 BALB/c 마우스로부터 선행문헌에 개시된 방법에 따라 (Lee et al . , 2015) 분리하였고 이를 10% FBS를 함유하는 M199/EBSS medium (Hyclone) 에서 37° C, 5% C02의 humidified atmosphere에서 배양하였다. 1-2) 세포칼시뉴린 활성 분석
세포 칼시뉴린 활성은 칼시뉴린 포스파테이트 어세이 키트 (ENZ0 Life Sciences)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. Colorimetric assay는 s 620nm의 파장에서 microplate spectrophotometer (TECHAN Infinite M200)를 사용하여 수행하였다. 흡광도 수치는 단백질 농도로 정규화되었고， 칼시뉴린 활성은 DMS0-처리된 샘플에 비교하여 나타내었다.
1-3) siRNA처리
TRAP1, RyR2, IP3R, 및 CHOP에 대한 Small interfering RNAs (siRNA) Genolut ion (Korea)에서 선행문헌에서 설명한 바에 .따라 제작되었다 (Park et al., 2014) . cyclophi 1 in D (CypD) 및 calcineur in regulatory subunit B (CNB)를 표적화하는 siRNA들은 다음과 같은 서열을 사용하여 Genolut ion ( Kor ea )에서 합성하였다: CypD-# 15 ' -GGCAGATGTCGTᅳ CCCAAAG-3 ' ' and CypD-#2 5 ' -GATAAGGGC CGGCTACA-3 '； CNB-#1 5 ' -GCCTGAGTTA-CAACAGAATCCTTTA-3 ' 및 CNB-#2 5 ' -GGAACAATCTGAAAGATACACAGTT-3' '； control 5 ' -ACUCUAUCUGCACGCUGAC-3 ' .
세포들은 6—웰 플레이트에 50 내지 75%의 컨플루언스가 될때까지 배양하였고, 이를 48시간 동안 G-Fectin (Genolut ion)과 흔합된 20 nM siRNA 를 사용하여 형질감염시켰다. 이후， 약물을 사용하여 나타낸 바와 같이 처리하였다.
1-4) 세포 생존율 및 아품토시스유도분석
세포 생존율은 Cell viability was determined using 3(4,5-dimethyl-thyzoyl-2-yl )2,5 di henyltetrazol ium bromide (MTT) 어세이를 사용하여 결정하였고， 이를 595 皿에서 Infinity M200 microplate reader (TECAN)을 사용하여 테트라졸륨 다이의 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 흡광도 수치는 DMSO control에 대하여 정규화하였고, 데이터는 퍼센트 생존율로 나타내었다. 아품토시스 유도를 측정하기 위해， DNA 내용물 (propidium iodide) 및 세포의 카스파제 활성 (DEVDase activity)을 CaspaTag in situ apoptosis detect ion kits (Millipore)를 사용하여 측정하였다. 레이블링된 세포들은 FACS Calibur™ system (BD Biosciences)을 사용하여 정량화하였다. 데이터는 FlowJo software (TreeStar)를 사용하여 프로세싱하였다.
1-5) 간세포 이미징
세포질내 칼슘 농도는 선행문헌에서 설명된 방법에 따라 결정되었다
(Park et al. , 2014) . 간단하게， HeLa 세포들을 5 μΜ Fura-2 를 사용하여 30분간 레이블링 하였고， 이를 154 mM NaCl , 5.6 mM KC1 , 3.2 mM MgC12, 5 mM HEPES, 10 mM glucose, 및 0.2 mM EGTA (pH 7.4)를 함유하는， 칼슘 비함유 Locke's solution에서 37° C, 5»C02하에서 배양하였다. 약물을 처리한 후에 , 형광의 변화를 340 nm 및 380 誦에서 이중 여기 (dual exc it at ion)하는 510 nni의 방사파장에서 1X81 ZDC microscope (Olympus)를 사용하여 5분 마다 측정하였다. 340/380 형광 비율 이미지는 Xcellence software package (Olympus)를 사용하여 생성 및 분석하였다. HSF-GFP local izat ion을 관찰하가 위해， HeLa 세포들은 리포펙타민 형질감염 시약 (Invitrogen) 및 HSF-GFP plasmid를 사용하여 제조사의 지침에 따라 형질감염시켰다. 24 시간 동안 형질감염시킨 후에， 세포들을 표기된 약물로 처리하고, 1X81 ZDC (Olympus)를 사용하여 분석하였다. 미토콘드리아 구조를 가시화하기 위해， HeLa 세포들은 20분 동안 200 nM MitoTracker를 사용하여 염색하였고， 이를 약물을 사용하여 처리하고， 이후 LSM 780 공초점 현미경 (Zeiss)을 사용하여 분석하였다.
1-6) RNA추출 및 역전사중합효소 연쇄반웅 (RT-PCR)
' 총 RNA는 RNeasy mini kits (QIAGEN)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 배양된 세포들로부터 준비하였고 cDNA를 oligo(dT) primer 및 ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit (New England Biolabs)를 사용하여 생산하였다. PCR반웅은 Mastercycler PCR machine (Eppendorf)에서 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다:
GAPDH, 5 ' -CGGGAAGCTTGTCATCAATGG-3' ' 및
5 ' -GGCAGTGATGGCATGGACTG-3' ' (서열번호 1, 2)；
Hsp27, 51 -GAGTGGTCGCAGTGGTTAGG-3' '및
5 ' -ACAGGGAGGAGGAAACnGG-3' ' (서열번호 3， 4)；
Hsp40, 5'-GGMAGAGCATTCGMACGA— 3'및
5 ' -ATGCCAGGCCTGATAACATC-3' ' (서열번호 5, 6)；
Hsp70, 5 ' -CCAGCTGAAGAAGGGTCAAG-3' ' 및 5 ' -TTTTCTGCTGGTGTCTGCTG-3' ' (서열번호 7. 8)；
Hsp90, 5'-CTGGGTTTCCTCAGG AT-3' ' 및
5 ' -TACCGGATTTTGTCCAATGC-3' ' (서열번호 9 및 10).
1-7) 재조합단백질 제조 및 형광편광분석
재조합 TRAP1 및 Hsp90 를 선행문헌에 기술된 바와 같이 제조하였다
(Lee et al . , 2015). 인간 Grp94 (residues 22-804)는 N-말단에서 glutathione S-transferase (GST)와 융합되어 E. co// BL21(DE3)세포 내에서 발현되었다. 수득된 박테리아 세포들은 이후 50 niM Tris-HCl， 150 mM NaCl， 및 5 niM MgCl2 (pH 7.4)를 함유하는 lysis buffer 내에서 초음파 처리하였고， 분해가능한 분획은 glutathione-sepharose 4B (GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 흔합하였다. GST-Grp94융합 단백질은 이후 50 niM Tris-HCl 및 20 mM의 환원된 글루타치온 에 7.4)을 포함하는 elution buffer를 사용하여 유출시키고， 이후 추가적으로 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
형광 편광 분석을 위해， 형광 프로브 PU-H71-FITC3를 선행문헌에서 기술한 바에 따라 합성하였고 (Taldone et al. , 2011)， 10 nM PU-H71-FITC2및 100 nM 의 단백질을 24 시간동안 10 nM PU-H71-FITC2 및 100 nM 의 단백질을 24시간 동안 4° C에서 135mMNaCl, 2.7mMKCl, 4.3 mM Na2HP04 , 1.4 mM KH2P04. 1 mM DTT, 2 mM MgCl2, 0.1 mg/niL BSA, 및 0.05% NP40 (pH 7.3)를 함유하는 FP buffer 내의 저해제를 다양한 농도로 하여 배양하였다. 형광 편광은 최종적으로 SYNERGY NE0 microplate reader (BioTek Instruments, Inc.)를 사용하여 측정하였다.
1-8) 결정화 및 구조 결정
C-말단 도메인 결손 인간 TRAP1 (residues 60-561 , hTRAPl-NM) 단백질 제조든 선행문헌에 기술된대로 수행하였다 (Jeong et al. , 2014； Lee et al. , 2015). hTRAPl-NM 및 저해제 복합체를 결정화하기 위해, 20 mg/nil의 정제된 hTRAPl 도메인 50 μ ΐ 를 DMS0 중의 10 Mm의 저해제 3.7 μ ΐ와 얼음 상에서 1시간 동안 흔합하였고， DMS0 농도를 4% 감소시키기 위해 25 mM Tris—Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl , and 5 mM DTT를 함유하는 완충액을 사용하여 최종 부피가 90 μ 1되도록 조절하였다. 복합체들은 이후 상온에서 단백질 1 μ 1와 1 μ 1 의 reservoir buffer 를 흔합하는 것에 의해 현적 확산법 (hanging drop diffusion method)를 사용하여 결정화하였다. TRAP1-DN320 복합체의 결정은 100 mM sodium cacodylate (pH 6.76), 14%— 16% 8K polyethylene glycol (PEG) , 및 .100 mM calcium acetate를 포함하는 reservoir buffer 내에서 성장시켰다. 가장 심하게 회절되는 TRAPl-Panᅳ 401 복합체의 결정은 8K PEG 대신 14%- 16% 20K PEG를 포함하는 reservoir buffer 내에서 수득되었다 ·. 결정들은 이후 30% glycerol이 부가된 결정화 용액 내에서 넁각시켜 보호되었고, 액체 질소 내에서 급속 넁각되었다. χ-ray 회절 데이터는 Pohang Accelerator laboratory (PAL)의 5C beamline에서 수집되었고， 데이터들은 HKL2000 software (Otwinowski and Minor, 1997)를 사용하여 가공되었다. 양 결정들은 TRAP1-PU-H71 complex crystal에 관하여 선행문헌에서 보고된 바와 같이 (Lee et al. , 2015) 모두 거의 동일한 스페이스 그룹 (Ρ^^^ 및 유닛 셀 (a = b = 69.5 A, c = 253.0 A)을 가지고 있었다. 저해제돌의 전자 밀도는 TRAP1-PU-H71 (PDB 4Z1F; Lee, C.， Park, H. K. , Jeong, H. , Lim, J. , Lee, A. J. , Cheon, K. Y. , Kim, C. S. , Thomas , A. P. , Bae, B. , Kim, N. D. , et al. (2015) . Development of a Mitochondria—Targeted Hsp90 Inhibitor Based on the Crystal Structures of Human TRAP1. Journal of the American Chemical Society 137, 4358—4367)로부터 리간드가 없는 TRAP1 구조를 사용한 Fourier 법을 사용하여 계산되었고， 순차적으로 Coot (Ems ley, P., Lohkamp, B. , Scott : W. G. , and Cowtan, . (2010) . Features and development of Coot . Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486-501)를 사용하여 잔여 전자 밀도를 구축하였다. Final models for TRAPl-Pan-401 및 TRAP1-DN320 에 대한 최종 모델은 Phenix (Adams, P. D.， Afonine, P. V. , Biinkoczi , G. , Chen, V. B. , Davis, I. W. , Echols, N.， Headd, J. J. , Hung, L. W. , Kapral, G. J. , Grosse- unstleve, R. W. , et al . (2010) . PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solut ion. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213— 221)를 사용하여 2.4 및 2.7 A 해상도로 각각 가공되었다. 결정학적 통계를 하기 표 1에 표기하였다.
【표 1】
Figure imgf000034_0001
*가장 높은 해상도 쉘은 괄호로 나타내었다.
. aRmerge = 100 X hi I 7i(h> - </(h)> I I h</(h)> , 이때， /i(h) 는 /t.h 측정치이고 </(h)>는 Miller indices h에 대한 /(h) 의 모든 측정치의 가중 평균이다.
b target geometries 로부터의 Rootᅳ meanᅳ squared deviation (r.m.s.
Δ )
CR- fact or = 100 x |FP - FP(calc)|/ FP.
'Rfree 는 데이터의 5%를 사용하여 계산되었다. 모든 구조적인 그림은 PyMOL (http://www.pymol.com)을 사용하여 그렸다.
1-9) 종양 이종이식 시험
동물을 비롯한 모든 실험은 UNIST (IACUC-12-003-A)에 승인을 받았다. 암세포 (7 106 22Rvl 또는 1 x 107 PC3)는 200 μ 1 의 PBS에 현탁하고， 6주령의 BALB/c nu/nu 웅성 마우스 (Charles River Laborator ies)의 양쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양은 이후 약 100 mm3 의 크기가 될때까지 성장시켰고， 동물은 무작위로 그룹을 지었다 (two tumors/mouse, five mice/group). 계속해서， vehicle (DMSO) , DMAG, 및. gamitrinib을 PBD내의 20% Cremophor EL (Sigma)에 용해시켰고， 10 mg/kg의 DMAG 및 /또는 gamitrinib을 하루 걸러 복강내 투여하였다. Pan-4()1의 인 비보 .항종양 효과를 평가하기 위해， 상기 약물을 프로필렌글리콜 및 DMS0 (1:1)에 용해시키고， 매일 복강 내 투여하였다 (30 mg/kg). 종양들은 캘리퍼스를 이용하여 측정하였고， 종양 크기는 다음의 식에 따라 계산하였다.
V = 1/2 X (너비 )2 X 길이 . 실험 마지막에 동물들을 마취시켰고， 뇌， 심장, 신장， 간, 비장, 위 및 종양을 비롯한 기관들을 조직학적 분석 및 웨스턴 블러팅을 위해 수집하였다. 수집한 기관 표본들은 10% 포르말린으로 고정시켰고， 이를 조직학적 분석을 위해 파라핀 내에 매립하였다. 간략하게， 각 섹션들은 (5 urn) 고접착성 슬라이드 상에 놓고 H&E를 사용하여 염색하고 이를 Dot slide system (Olympus)을 사용하여 20 배로 확대하여 관찰하였다. 웨스턴 블랏 분석을 위해, 조직 샘플들은 magnification. For Western blot analyses, tissue samples were homogenized in RIPA buffer containing 50 mM Tr is (pH 8.0)， 150 mM NaCl, 1% NP-40, 및 0.25% N-deoxycholate를 포함하는 RIPA 완충액 내에서 균질화되었고, 프로테아제 저해제 및 포스파타제 저해제 칵테일 (Calbiochem), 및 용해가능한 분획들을 선행문헌 (Park, H. K.， Lee, J. E. , Lim, J., and Kang, B. H. (2014) . Mitochondrial Hsp90s suppress calcium-mediated stress signals propagating from mitochondria to the ER in cancer cells. Mol Cancer 13， 148)에 개시된 바에 따라 분석하였다.
1- 10) 통계적 분석
MTT 시험은 중복하여 시험하였고, 각각 최소한 3번에 걸쳐 수행하였다. 통계적인 분석은 Prism 5:0 (GraphPad) 프로그램을 사용하여 수행하였다. 편차는 unpaired t— tests를 사용하여 확인하였고， p < 0.05인 때에 유의적인 것으로 판단하였다. 실시예 2: 결과
2- 1) 패럴로그 (paralog)의 동시적 비활성화에 의한 세포사의 상승적 증가
미토콘드리아성 TRAP1저해제， 가미트리닙 (Kang, B. H. (2012). TRAPl regulation of mitochondrial life or death decision in cancer eel Is and m i t ochondr i a- 1 ar get ed TRAPl inhibitors. BMB Rep 45, 1-6； Lee, C. , Park, H. K. , Jeong, H. , Lim, J., Lee , A. J., Cheon, K. Y. , Kim, C. S. , Thomas , A. P., Bae, B. , Kim, N. D. , et al . (2015). Development of a Mi t ochondr i a-Targeted Hsp90 Inhibitor Based on the Crystal Structures of Human TRAPl. Journal of the American Chemical Society 137, 4358-4367)과 세포질 및 ER 에 위치한 Hsp90 패밀리 단백질을 비활성화 하기 위한 대표적 Hsp90 저해제들 (Patel, P. D.， Yan, P., Seidler, P. M. , Patel , H. J. , Sun, W. , Yang, C. , Que, N. S.， Tal clone, T.， Finotti, P. , Stephani, R. . ' et al. (2013). Par a log一 selective Hsp90 inhibitors define tumor一 speci f ic regulation of HER2. Nat Chem Biol 9, 677-684； Ta 1 done , T. , Gomes-DaGama , E. M. , long, H.， Sen. S. , Al augh, M. L. , Zatorska, D. , Alonso-Sabadel 1 , R. , Guzman , M. L. , and Chiosis, G. (2011) . Synthesis of pur ine-scaf fold fluorescent probes for heat shock protein 90 with use in f low cytometry and fluorescence microscopy. Bioorg Med Chem Lett 21, 534그 5352)의 병용 치료는 아폽토시스의 유도를 통해 (도 1C 및 도 2A) 다양한 암세포에서 개선된 세포독성을 나타낸다 (도 1A 및 B). 이러한 약물의 조합은 22Rvl s.c. implanted 누드 마우스에서 효과적으로 종양 성장을 저해한다 (도 1D 및 도 2B). 상기 약물 조합은 조직학적 분석에서 유의적인 체중 감소 (도 2C) 및 기관 독성 (도 2D) 없이도 아폽토시스 유도를 증가시켰다 (도 1E, 도 2B).
2-2) 칼시뉴린 활성화에 의한 HSF1의 억제
약물 상승효과의 메커니즘을 이해하기 위해, Hsp90 억제에 의해 촉발되는 클라이언트 단백질 분해 및 열 충격 반응을 분석하였다 (Trepel, J . , Mol lapour , M.， Giaccone, G. , and Neckers , L. (2010) . Target ing the dynamic HSP90 com lex in cancer . Nat Rev Cancer 10, 537-549) . 종래 보고된 바와 같이 (Kang, B. H. , Plescia, J. ' Song, H. Y.. Meli , M.， Colombo, G. , Beebe, K. , Scroggins, B. , Neckers, L.， and Altieri , D. C. (2009). Combinatorial drug design target ing multiple cancer signaling networks control led' by mitochondrial Hsp90. J Clin Invest 119, 454-464) , DMAG는 클라이언트 단백질 분해 및 Hsp70 증가를 유도하였으나, 이에 반해 가미트리닙은 이들 중 어느 것에도 영향을 미치지 않았다 (도 3A). DMAG 및 가미트리닙의 병용 치료는 클라이언트 단백질을 분해시키나， 놀랍게도 열 충격 단백질의 발현을 증가시키지 않았고 (도 3A 및 B). 이는 Hsp90 저해제-촉발된 열 충격 반응의 부재를 나타낸다 (Sittler, A. , Lurz, R. , Lueder , G. , Priller, Jᅳ， Lehrach, H. , Hayer-Hartl , M. K.， Hartl , F. U. , and Wanker , E. E. (2001) . Geldanamycin activates a heat shock response and inhibits hunt ingt in aggregation in a cell culture model of Huntington's disease. Human molecular genet ics 10, 1307-1315； Zou, J. , Guo, Y. , Guettouche, T. , Smith, D. F. , and Voellmy, R. (1998). Repression of heat shock transcript ion factor HSFl activation by HSP90 (HSP90 com lex) that forms a stress-sensitive complex with HSFl. Cell 94, 471-480) . Hsp90 저해제들은 열 충격 반응을 전사인자인 열 충격 인자 l(HSFl) 의 활성화를 통해 촉발시킴이 알려져 있는데 (Chen et al. , 2013； Zou et al. , 1998) , 이들의 비활성화는 Hsp90 저해제에 대해 암세포가 감작된다는 것을 나타낸다 (Home et al., 2015； Neckers, L.， and Workman, P. (2012) . Hsp90 molecular chaperone inhibitors: are we . there yet? Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 18, 64-76； Zaarur et al. , 2006). DMAG 치료는 종래 보고된 바와 같이 HSFl의 핵국재화 (nuclear localization)를 증가시키는 반면에， DMAG-가미트리닙의 조합은 HSF1이 세포질에 위치하도록 하였다 (도 3C 및 D). 게다가 약물들의 병용치료는 약간 빠르게 이동하는 HSFKslightly fast-migrating HSFl)을 겔 내에서 ' 생성하였고 (도 3D), 이는 종래 보고된 번역 후 수식 (posttranslational modification)을 시사하는 것이다 (Akerfelt , M. , Mor imoto, R. I., and Sistonen, L. (2010) . Heat shock factors： integrators of cell stress, development and lifespan. Nature reviews Molecular cell biology 11, 545-555) . 본 발명자들은 인산화 및 칼슘 의존적인 포스파타제 칼시뉴린의 HSF1 조절 내에서의 기여를 조사하였고， 그 결과 칼시뉴린 저해제인 FK506이 약물 병용 후의 HSF1의 번역 후 수식 및 핵국재화를 증가시키는데 활성이 있음을 확인하였다 (도 3D). 칼슘의 증가만으로도 DMAG에 의한 Hsp70발현증가웅 억제할수 있었고 (도 3E), 실제 병용처리로 세포질내의 칼슘증가를 확인하였다 (도 3F). 이러한 발견과 일치하게， 칼시뉴린 활성은 약물의 병용에 의해 현저하게 증가하였다 (도 3G). Hsp70 발현상의 약물 병용의 억제적 효과는 siRNA에 의한 칼시뉴린 조절 서브유닛 B(CNB)의 넉다운에 의해 차단되었다 (도 3H). 약물 병용의 상승적인 세포독성은 또한 칼시뉴린 siRNA 치료에 와해 저해되었다 (도 31).
2-3) 세포질 칼슴 증가가 칼시뉴린을 활성화시키고 미토콘드리아 fission을촉진한다 가미트리닙 및 DMAG 병용은 세포질 칼슘 농도를 증가시켰다 (도 4A). 가미트리닙과 Grp94 특이적 저해제인 PU-WS13 (Patel et al. , 2013), 또는 siRNA와의 병용 치료는 비교가능한 세포질 칼슘 증가를 보여주기에 충분하였고 (도 3A, 3B, 및 도 5A), 이는 ER 및 미토콘드리아의 Hsp90, Grp94 및 TRAP1 이 칼슘 흐름에 원인이 있는 것을 시사한다. 종래에， 본 발명자들은 TRAP1이 사이클로필린 D(CypD) 및 리아노딘 수용체 의존적으로 미토콘드리아 및 ER 칼슘 분비 (Calcium discharge)에 의해 세포적 스트레스를 넘어 세포사 한계점을 설정할 수 있다는 점을 제안하였다 (Park et al. , 2014). 마찬가지로， 세포질 칼슴 증가는 HeLa 세포에서 미토콘드리아의 CypD 또는 ER 리아노딘 수용체 2 (RyR2)의 유전적 녹다운에 의해 저해될 수 있다 (도 4C, 4D).
게다가， CypD 또는 RyR2의 결여에서 약물의 병용에 의한 Hsp70의 발현이 전혀 감소되지 않았다는 것을 고려하면， 미토콘드리아 및 ER로부터 연관된 칼슘 분비는 열 충격 반응의 억제에서 중요하다 (도 4E, 4F). Inactivation of Grp94 및 TRAP1과 PU-WS13/가미트리닙 조합의 비활성화는 세포사.유도를 증강시키기는 하지만 (도 3D 및 3E), DMAG-가미트리닙 조합에 의한 세포질， ER, 미토콘드리아의 Hsp90 비활성화가 ER 및 미토콘드리아의 Hsp90 억제를 할 경우와 비교하여 더욱 강력한 세포사를 촉발한다 (도 5A, 도 , 5B) . 이는 아마도 생명유지에 필수적인 암 세포의 Hsp90 클라이언트 단백질의 분해 때문인 것으로 판단된다 (도 5C). 칼시뉴린 활성화는 미토콘드리아 fragment at ion을 유도하는 Drpl을 활성화 시킬수 있는데, 실제 미토콘드리아 fragment at ion이 약물병용처리시 관찰되었으며 (도 5D), Drpl 선택적인 억제제인 Mdivi-1을 처리하게 되면 미토콘드리아 fragment at ion이 억제가 되었다 (도 4H). 더불어 칼시류린을 siRNA로 억제한 경우에도 약물병용에 의한 미토콘드리아 fragment at ion을 억제하였다 (도 41).
2-4) 인 비보 판 -Hsp90 억제제， 판보티닙 -4이의 개발
본 발명자들의 시험에 따르면 고효능 Hsp90 저해항암약물 개발을 위해서는 TRAP1에 대한 저해활성올 끌어올려야 한다는 것을 알 수 있었다. 이를 실현하고자， TRAP1 결합력은 극대화하고, 반면에 Hsp90 억제활성을 적정한 수준으로 낮춰서， 세포질에 과량으로 존재하는 (전체 단백질의
2~3%수준) Hsp90에 의해 trap되어 미토콘드리아로까지 도달하지 못하는 Hsp90 저해제의 근본적인 문제를 해결하고자 (도 6A) , 판보티닙 -401(간단히， Pan-401)로 명명한 피라졸로피리미딘 스캐폴드를 개발하였다 (도 6B) . 판보티닙의 para log 선택성은 TRAPl , Hsp90 , Grp94에 대한 각각의 IC50값은 약 δΟηΜ, 76 ηΜ, 524 ηΜ로써， 강한 TRAP1/Grp94 결합력을 확보하였고 상대적으로 Hsp90 저해능은 낮추었다 (도 6C) .
첫 번째로， 본 발명자들은
BI IB-02K6-클로로 -9-[ (4-메특시 -3 , 5-디메틸 -2-피리딘일)메틸] -9^퓨린 -2- 아민)로부터 유래된 피라졸로피리미딘 화합물인 DN320을 합성하였고 (도 6C) DN320는 ΒΠΒ— 021에 비해 더욱 탁월한 저해 활성을 나타내었다 (도 6C) . DN320는 Phe2()l을 안정화시키고. Met 163 측쇄의 입체 배치를 변경시키고， TRAP1 활성 자리 내에서의 Asnl기의 아마이드를 갖는 피라졸 N-2의 수-매개성 수소 결합을 구축한다 (도 6D 및 E ; . F) . 대조적으로 퓨린 스캐폴드 BI IB-021는 Phe 측쇄 또는 물 분자 어느 쪽과도 안정적으로 반웅하지 않고， TRAP1내의 Met의 서로 다른 측쇄 기원을 나타내었으며 , 다른 퓨린 스캐폴드 억제제인 PU— H기과 마찬가지로 Hsp90과 함께 몇몇 복잡한 구조 내에서 지속적으로 발견되었다 (도 7) . 그러나， DN320은 Hsp90에 대한 결합력이 여전히 강하였기 때문에， 다음으로 본 발명자들은 DN320에 비해 더욱 개선된 TRAP1 저해 활성 및 낮은 Hsp90 억제활성을 가지는 Pan-401를 합성하였다. Pan— 4이은 DN320의 피리딘을 브로모벤조디옥솔로 치환하였으며 (도 6B) , 그 결과 이 화합물은 TRAP1 및 Hsp90에 대한 결합력이 원하는 수준으로 개선되었다 (도 6C) . Pan— 4이의 브로모벤조디옥솔은 TRAP1 활성 자리의 소수성 포켓 내에 DN320의 피리딘보다 더 잘 맞아서 (도 6G) 억제제의 TRAP1에 대한 결합을 개선시킨다.
2-5) Pan-401의 작용 원리
Pan— 401의 작용 원리를 확인하기 위해， 미토콘드리아의 Hsp90 (TRAP1)에 대한 억제 활성을 우선 확인하였다. Pan-401은 즉시 미토콘드리아 막 전위의 손실 및 cytochrome c의 방전 (di scharge)을 촉발하였고 (도 8A, B), 이는 미토콘드리아-축정되는 Hsp90 억제제에 대한 종래의 보고와 합치한다 (Kang et al . , 2009; Lee et al. , 2015). 미토콘드리아의 R0S는 Pan-401 처리 4 시간 내에 증가하였고 (도 8C)， 이는 R0S생산에서 억제적 TRAP1의 역할에 상웅한다 (Hua, G. , Zhang, Q. , and Fan, Z. (2007) . Heat shock protein 75 (TRAPl) antagonizes reactive oxygen species generation and protects eel Is from granzyme M-mediated apoptosis. The Journal of biological chemistry 282, 20553-20560； Im, C. N. , Lee, J. S. , Zheng , Y. , and Seo , J. S. (2007) . Iron chelation study in a normal human hepatocyte cell line suggests that tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAPl) regulates product ion of reactive oxygen species - Journal of eel hilar biochemistry 100, 474-486； Vo 1 oboueva , L. A. , Duan , M. , Ouyang , Y. , Emery, J . F. , Stoy, C. , and Gi f fard, R. G. (2008) . Overexpression of mitochondrial Hsp70/Hsp75 protects astrocytes against ischemic injury in vitro. J Cereb Blood FlowMetab 28, 1009-1016) . TRAPl 비활성화는 미토콘드리아의 펼쳐진 단백질 반웅을 촉발시키고, CHOP 발현을 유도하는 것으로 보고되고 있다 (Parket al. , 2014； Siegelin, M. D.， Dohi , T. , Raskett, C. M.， Orlowski , G. M.， Powers, C. M.， Gilbert, C. A. , Ross, A. H. , Plescia, J. , and Altieri , D. C. (2011). Exploiting the mitochondrial unfolded protein response for cancer therapy in mice and human cells. J Clin Invest 121, 1349-1360). 이와 유사하게 , Pan-401치료는 CHOP 발현을 증가시켰다 (도 8D). Pan-401과 대조적으로, 미토콘드리아 막의 탈분극， cytochrome c 방전， CHOP 발현， 및 R0S 과생산은 Hsp90 억제제 AUY922의 24시간 동안의 처치 후에 유도되지 않았고 (도 8A-D)， 따라서， Pan-4()1은 기존의 TRAP1억제제인 개미트리닙과 유사하게 미토콘드리아 TRAP1을 억제함을 확인할 수 있었다. 그 다음， 세포질 Hsp90의 억제 활성을 확인하기 위해 클라이언트 단백질 분해 및 Hsp70 발현 증가를 조사하였다. Pan— 401는 다른 Hsp90 억제제들과 유사한 수준으로 Hsp90 클라이언트 단백질을 분해시켰으나， 기존 Hsp90 저해제들과 달리 Hsp70의 발현을 증가시키지는 않았다 (도 8D, E). 더불어， Pan-4()1을 처리하여， 기존 Hsp90 저해제들이 유도하는 Hsp70 발현을 억제할수 있는 것을 확안하여 (도 8F), Hsp70 발현이 Pan-401에 의해 적극적으로 억제되고 있음을 규명하였다. Pan-401을 처리하는 것은 개미트리닙 및 DMAG를 병용처리할 때와 유사하게 세포질 칼슘 농도를 증가시켰고 (도 8G). 칼시뉴린 활성을 증가시켰다 (도 8H). siRNA로 칼시뉴린을 선택적으로 억제하였을 때, Hsp70 발현 억제도 저해시켰고 (도 81)， 미토콘드리아 fragment at ion도 억제하였다 (도 8J).
2-6) Pan-4이의 강력한 항암 활성
Pan-4()1은 기존와 Hsp90 저해제와 비교하였을 때， 더욱 강한 세포독성 활성을 간암세포. 전립선암， 자궁경부암. 폐암， 뇌종양 세포들에 대해서 나타내었고 (도 9A), 이런 세포죽음 유도기전은 아포토시스를 통한 것으로 확인하였다 (도 9B). 모든 정상 인간 각막 및 마우스 간세포 모두에서 기존 Hsp90 저해제와 비교하여 세포독성이 현저하게 낮음을 확인하였다 (도 9C>. 실험쥐를 활용한 전립선암 xenograft 실험에서 Panᅳ 401은 현저한 종양성장 억제효능이 있음을 확인하였다 (도 9D). 이때, Pan-4()1이 처리된 종양조직에서 아포토시스에 의한 세포죽음을 확인하였다 (도 9E, 도 10A). Pan-401에 의한 실험쥐의 몸무게 변화는 전혀 없고. (도 9F), 조직학적인 기관 독성 증상도 확인할 수 없어서 (도 10B) 실험쥐에 대한 독성도 없는 것으로 확인하였다. 반면에， 실험쥐의 종양조직에서는 인비트로에서와 동일한 Hsp90 client 단백질의 감소， Hsp70 발현증가의 억제와 CHOP 발현증가를 확인하여 (도 9G), 종양모델 실험쥐에서의 약물 작용기전도 암세포를 활용한 실험과 동일함을 규명하였다. 실시예 3: 화합물 2-28의 TRAP1 억제 활성 확인
상기 제조예 2 내지 28에서 제조된 화합물 2 내지 28의 TRAPr억제 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 시험하였다.
TRAP1 ATPase 활성분석 .
ATPase 활성은 Pi Co lor Lock Gold Phosphate Detect ion Kit ( Innova Bioscience)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면， 200 nM TRAP1을 다양한 농도의 화합물과 assay buffer (lOOmMTris, 20mMKCl, and 6 niM MgCl2, pH 7.0)에서 30 분 37° C에서 incubation한 후， 0.2 mM ATP와 3 시간. 반웅시켰다. 20 uL의 Pi Color Lock Gold reagent와 100:1비율의 accelerator를 80 의 TRAPl-ATP 반웅물과 섞어 5분간 25° C에서 발색반응을 유도하였고, 10 iiL stop solution을 ᅳ첨가하여 반웅을 중단시켰다. 최총반웅물들은 620 nm에서 Infinity M200 microplate reader (Tecan)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
Fluorescence polarization (FP) 분석
FP 분석을 위한 형광 probe인 PU-H71-FITC3은 기존의 보고를 참조하여 합성하였다 (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011， 21, 5347-5352). 10 nM PU-H71-FITC3, 100 nM TRAPl(Hsp90)를 다양한 농도의 저해제와 함께 FP buffer (135 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 4.3 mM Na2HP04) 1.4 mM KH2P04, 1 mM DTT, 2mMMgCl2) 0.1 mg/niL BSA , and 0.05% NP40 (pH 7.3 ) )에서 24시간동안 4° C에서 incubation하였다. FP는 SYNERGY NEO microplate reader (BioTek Instruments, Inc.)를 이용하여 측정하였다. 그 결과， 화합물 2 내지 28꾀 TRAP1 억제효과를 하기 표 2에 기재하였다.
【표 2】 화합물 2 내지 28의 TRAP 1 의쎄효과
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Z.06Z.00/Z.l0ZHM/X3d 8866Z.0/810Z OAV

Claims

【청구범위】 【청구항 1】 TRAP1 억제 활성을 나타내는， 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : [화학식 I] 상기 식에서， Rl, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로， H, 할로 (Halo), Ci-6알킬， C2-6알케닐 시아노， 0R6， SR6 또는 NHR6이거나， Rl, R4 및 ,R5는 독립적으로， H, 할로 (Halo), d-6 알킬， C2-6알케닐， 시아노, 0R/SR 또는 NHR이고， R2 및 R3는 함께 N, 0 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2의 헤테로원자를 포함하는 4원 내지 7원의 헤테로사이클을 형성할 수 있고; R6는 H 또는 d-6알킬이며， 상기 d-6 알킬， C2-6 알케닐은 선택적으로 할로 또는 d-6 알킬로 치환될 수 있다. 【청구항 2] 저 U항에 있어서, 상기 Rl, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로， H, F, CI , Br, I， d-4알킬， C2-4알케닐, 시아노, OR, SR또는 NHR이거나, Rl, R4및 및 R5는 독립적으로， H, F, C1， Br, I, d-4알킬， C2-4알케닐, 시아노, 0R6, SR6또는 NHR6아고， R2 및 R3는 함께 N, 0 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2의 해테로원자를 포함하는 5원 또는 6원의 헤테로사이클을 형성할 수 있고; 상기 R6는 H 또는 d-4알킬이고; 상기 Ci-4알킬 또는 C2-4알케닐은 F, CI, Br, 또는 메틸로 선택적으로 치환될 수 있는 것인， 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염. [청구항 3】 제 1항에 있어서, 상기 Rl, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로， H, F, CI , Br， I , 메틸， 에틸，프로필 . 에테닐 시아노， 0CH3, 0CF3, SC¾또는 NH2이거나, Rl, R4및 R5는 독립적으로， H, F, CI, Br, I, 메틸， 에틸， 프로필， 에테닐, 시아노， 0CH3, 0CF3, SCH3또는 NH2이고， R2및 R3는 함께 N, 0및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1또는 2의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원의 헤테로사이클을 형성할 수 있는 것인, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염. 【청구항 4】 제 1항에 있어세 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인， 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염：
(1)
1一((6-브로모벤조 [d][l,3]다이옥솔 -5-일)메틸) -4—클로로 -1H-피라졸로 [3,4-d ]피리미딘 -6-아민 (Pan-401);
(2) 1-벤질 -4—클로로 -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (N200219-1);
(3)
1- (벤조 [d] [ 1， 3]다이옥솔 -5-일메틸 ) -4-클로로 -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘ᅳ 6-아민 (DN200263-1)；
(4) 4-클로로 -1-(3, 4-디클로로벤질)— 1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN200318-1);
(5)
4-클로로 -1-((6—클로로벤조 [d][l,3]다이옥솔— 5-일)메틸) -1H-피라졸로 [3,4-d
]피리미딘—6-아민 (DN202782-1);
(6)
4-클로로-1-((6-아이오도벤조[ [1，3]다이옥솔—5-일)메틸)-1—피라졸로[3,4 -d]피리미딘 -6-아민 (DN202961-1);
(7)
4-클로로 -1-((6_메틸벤조 [d][l,3]다이옥솔— 5-일)메틸) -1H—피라졸로 [3,4-d] 피리미딘 -6-아민 (DN203143-1);
(8) 4-클로로-1-(3-메톡시벤질)-^-피라졸로[3，4ᅳ 피리미딘-6-아민 (DN203372-1);
(9) 4—클로로 -l-(3-메틸벤질 )-1Η-피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203373-1);
( 10) 1— (4-브로모벤질 )-4-클로로 -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘ᅳ 6—아민 (DN203374-1);
(11)
4-클로로 -1-(4-클로로ᅳ 3-플루오로벤질 )-1Η-피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -6-아민
(DN203375-1);
(12)
1-(2-브로모 -5-메톡시벤질 ) -4-클로로 1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6ᅳ아민 (DN203376-1);
(13) 1— (2-브로모벤질 ) -4-클로로 -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203377-1);
(14) 4-클로로 -1-(2—클로로벤질) -1H-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘— 6-아민 (DN203378-1);
( 15) 4-클로로 -1-(3， 4-디플루오로벤질 )-1Η—피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203379-1);
( 16) 4-클로로 -1-(4-비닐벤질 )-1Η-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203381-1);
(17)
3_( (6-아미노 -4-클로로 -1H-피라졸로 [3， 4— d]피리미딘— 1-yl )메틸 )벤조나이트 릴 (DN203487-1);
(18)
4-클로로 -1-(4- (트리플루오로메틸)벤질) -1H-피라졸로 [3?4-d]피리미딘 -6-아 민 (DN203488-1);
(19)
4—클로로 -1-(2， 6-디플루오로 -3-메특시벤질) -1H—피라졸로 [3 , 4-d]피리미딘 -6- 아민 (DN203489-1);
(20)
4-클로로 -1-(2ᅳ클로로 -4-플루오로벤질 )-1Η-피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203490-1);
(21) 4-클로로 -l-(4-메틸벤질) -1Hᅳ피라졸로 [3, 4-d]피리미딘 -6-아민
(DN203491-1);
(22)
4-클로로-1-(2-메톡시-4-(트리플루오로메틸)벤질)-11-피라졸로[3,4세피리 미딘 -6-아민 (DN203492— 1);
(23)
4-클로로 -1-(4- (트리플루오로메록시 )벤질) -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6- 아민 (DN203493-1);
(24)
1-(2-브로모 -3-플루오로벤질 )-4-클로로 -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민
(DN203494-1);
(25)
1'-(4—브로모 -2-플루오로벤질 )-4-클로로 1H—피라졸로 [3， 4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203495-1);
(26)
4-클로로 -1— (5-플루오로 -2-메톡시벤질 ) -1H-피라졸로 [3， 4— cl]피리미딘 -6-아민
(DN203633-1);
(27)
4—클로로 -1-(2-플루오로 -5-메틸벤질) -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민 (DN203634-1); 및
(28) 4-클로로 -1— (4— (메틸티오)벤질) -1H-피라졸로 [3,4-d]피리미딘 -6-아민
(DN203635-1).
T청—구항 5】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.
【청구항 6]
제 5항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함하는 것인, 항암제 조성물.
【청구항 7]
제 5항에 있어서， 상기 암은 TRAP1의 활성과 관련된 암인 것인， 항암제 조성물.
【청구항 8】
거 15항에 있어서， 상기 암은 유방암， 난소암. 자궁경부암， 전립선암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 항암제 조성물.
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