ES2212984T3 - Utilizacion del acido hialuronico o de los fragmentos de este para la preparacion de un medicamento para la regulacion de la diferenciacion hematopoyeica. - Google Patents

Abstract

Utilización de un polímero que comprenda una cantidad eficaz de unidades disacarídicas compuestas cada una por una molécula de estructura N-acetil-D-glucosamina ligada por unión O-glucosídica /1, 4 a una molécula con estructura de ácido glucorónico para la fabricación de un medicamento destinado a inducir o estimular la diferenciación de células tomadas entre células leucémicas y células madre CD14-CD15-.

Description

Utilización del ácido hialurónico o de los fragmentos de éste para la preparación de un medicamento para la regulación de la diferenciación hematopoyéica.

La presente invención se refiere, de una forma general, a unos medios que permiten la regulación de la diferenciación de células hematopoyéicas. De una manera destacable, los medios de regulación según el invento se aplican a la diferenciación de células cuya diferenciación no corresponda a un perfil normal y en especial a células cuya diferenciación esté bloqueada (células leucémicas y, en particular blastos de leucemias agudas mieloblásticas. Según otro aspecto destacable, los medios de regulación según el invento se aplican igualmente a la diferenciación de células hematopoyéticas). Los medios de regulación según el invento permiten, en efecto, inducir o estimular la diferenciación de células leucémicas, y de blastos LAM en particular, así como la de células madre según la vía granulocitaria todo como según la vía monocitaria.

Puede identificarse diferentes tipos de leucemias: las leucemias linfoblásticas, que comprenden en especial las leucemias agudas linfoblásticas (LAL) o linfomas, y las leucemias mieloblásticas que comprenden en especial las leucemias agudas mieloblásticas (LAM). Las LAM representan alrededor de la mitad de las leucerias, o sea, unos 1000 nuevos casos al año en Francia y 6500 en los USA, coro una incidencia que crece excepcionalmente pasados los 40 años. Las LAM corresponden a un bloqueo de la diferenciación de las células mieloides a un estadio inmaduro y se manifiestas por el desvanecimiento de la médula ósea y de la sangre que circula por células blásticas, cuyas características citológicas definen los diferentes subtipos de LAM clasificados de M1 a M7(clasificación franco-americana-británica), siendo los más frecuentes los tipos M1 a M5 (ver figura 1A).

A pesar de los espectaculares avances terapéuticos en el transcurso de los últimos años, las LAM siguen siendo una patología grave puesto que la primera remisión, aunque sea inductible en el 70% de los casos, no suele superar la duración de un año, y que el 60% de los pacientes recaen en los 5 años siguientes. Los tratamientos de las LAM en recaída, que recurren ampliamente al injerto de médula ósea, tienen importantes limitaciones a razón de la rareza de los donantes aparentes, y de un límite de edad de 45 años.

Recientemente, la inducción de la diferenciación de los blastos leucémicos y granulocitos maduros por la administración de ácido retinoico (AR, o ácido todo-transretinoico ATRA) ha mejorado espectacularmente la evolución clínica de los pacientes afectados por la LAM M3, cuyo índice de curación alcanza en la actualidad el 70% a 5 años. Sin embargo, este tratamiento diferenciador solamente es aplicable a pacientes afectados de LAM del subtipo M3, un subtipo raro que únicamente representa aproximadamente el 10% de las LAM, y plantea problemas de resistencia in vivo. Este tratamiento sigue siendo ineficaz para los demás tipos de LAM.

El presente invento suministra por sí mismo unos medios de regulación de la diferenciación de células hematopoyéticas que, de una manera particularmente notable, pueden aplicarse a los casos de células cuya diferenciación está bloqueada, tal como células leucémicas y, de una manera destacable, de los blastos LAM. Los medios de regulación según la invención permiten efectivamente inducir o estimular la diferenciación de células leucémicas, y en especial de células LAM, y son, de una manera destacable:

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eficaces sobre blastos leucémicos directamente salidos de pacientes (blastos LAM, especialmente): efectivamente, son eficaces no simplemente sobre líneas celulares modelo, es decir, sobre líneas de estudio concebidas de forma que se puedan auto-proliferar cómodamente in vitro, sino que, de una manera notable, son eficaces contra células leucémicas directamente salidas de pacientes, es decir, células que sean poco o nada capaces de dividirse in vitro, y cuya supervivencia en tales cultivos esté limitada en el tiempo (en general, menos de una semana), y

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eficaces contra no uno solo sino varios subtipos de LAM: permiten, en especial, inducir la diferenciación de blastos LAM M1/2, M3, M4 y M5, que son los subtipos más frecuentes. No se excluye que se puedan utilizar contra los subtipos menos frecuentes de LAM, y los LAME y/o LAM7 en particular.

Los medios de regulación según el invento son eficaces contra diferentes subtipos de LAM, comprendido contra los subtipos para los que aun no se había podido realizar ningún tratamiento diferenciador (subtipos M1/2, M4 y M5). En efecto, no solamente permiten inducir la diferenciación según la vía granulocitaria en blastos bloqueados a nivel M3, sino que permiten igualmente 1) estimular la diferenciación según las vías granulocitaria y monocitaria de blastos bloqueados a un nivel muy inmaduro (nivel M1/M2) y de blastos bloqueados al nivel M4 y 2) inducir la diferenciación según la vía monocitaria de blastos a nivel M5.

Ventajosamente, los medios de regulación según el invento permiten no solo inducir o estimular la diferenciación de células leucémicas directamente salidas de pacientes, y de células LAM en particular, sino que pueden utilizarse también para inhibir la proliferación in vivo de tales células leucémicas.

Los medios según el invento son igualmente eficaces para regular la diferenciación de células hematopoyéticas normales muy inmaduras (no completamente diferenciadas), y en especial la de células madre que no presenten ningún antígeno de diferenciación tales como las células hematopoyéticas normales CD14^{-} CD15^{-} (células CD34^{+}, o bien CD34^{-}). Permiten su diferenciación no solamente según la vía monocitaria, sino también según la vía granulocitaria, y son eficaces sobre células salidas de pacientes, e igualmente in vivo.

Los medios de regulación según el invento presentan igualmente el interés de ser poco o nada susceptibles de toxicidad para el paciente, hasta dosis de varios mg, lo que constituye una gran ventaja para el paciente, y lo que permite la utilización del producto con dosis eficaces.

El presente invento se dirige a la fabricación de un medicamento destinado a inducir o estimular la diferenciación de células elegidas entre el grupo constituido por células leucémicas y células madre CD14^{-} CD15^{-}; caracterizado en que comprende al menos un polímero que comprende una cantidad eficaz de unidades disacarídicas compuestas cada una por una molécula de estructura N-acetil-D-glucosamina ligada por unión O-glucosídica \beta1,4 a una molécula de estructura de ácido glucorónico. En la figura 1B se presenta una unidad disacarídica. Puede notarse que el término "polímero" cubre, en la presente solicitud, tanto a oligómeros como a polímeros, y que los términos "médicamente" y "tratamiento" cubren, en la presente solicitud, toda forma de control de un estado considerado patológico o inapropiado, comprendida la terapia, la prevención del agravamiento del estado patológico, la paliación o la suavización de las condiciones de vida del paciente. Ventajosamente, la utilización de dicho polímero según el invento permite la fabricación de un médicamente que, aparte de sus capacidades para inducir o estimular la diferenciación de células leucémicas, se puede utilizar para inhibir la proliferación de tales células leucémicas. Por "cantidad eficaz" se entiende, en la presente solicitud, un número de unidades disacarídicas que permitan al polímero resultante inducir o estimular la diferenciación de las células leucémicas de una manera significativa. Los ejemplos de medios que permiten testar si un polímero contiene un número apropiado de unidades disacarídicas comprenden la puesta en contacto de este polímero con las células leucémicas previstas, y especialmente con tales células extraídas de humanos, bajo condiciones fisiológicas. Los ejemplos de tales puestas en contacto son conocidas por los expertos, algunas figuran más adelante en la parte "ejemplos". Brevemente, por condiciones fisiológicas entendemos, en la presente solicitud, unas condiciones in vivo, o bien unas condiciones in vitro emulando lo mejor posible el in vivo (en el caso de un medicamento destinado al hombre, por ejemplo: medio que permita el cultivo de células leucémicas tal como RPMI 1640/10%, suero (suero de vaca fetal SVF o suero autólogo), temperatura adaptada a los cultivos celulares considerados, es decir, comúnmente del orden de unos 37ºC, atmósfera saturada de humedad y que contenga aire y CO_{2} en proporciones apropiadas para los cultivos celulares considerados). Por células leucémicas extraídas de humanos, entendemos, en la presente solicitud, células frescamente extraídas, y/o células que se hayan conservado por congelación tras la extracción. Tales células leucémicas se pueden obtener, especialmente, por extracción sanguínea o por extracción de células de la médula ósea, luego por recuperación de los glóbulos blancos, con eventual eliminación de los linfocitos. Por células madre CD14^{-} CD15^{-} entendemos particularmente células hematopoyéticas normales capaces de progenie y de auto-replicación, y que no presenten ningún antígeno de diferenciación tales como CD14, CD15, es decir, células madre CD14^{-}, CD15^{-} que son CD34^{+}, o incluso CD14^{-}.

Ventajosamente, una cantidad eficaz de dichas unidades sacarídicas según el invento corresponde a un número de unidades disacarídicas superior o igual a alrededor de 3. Por debajo de 3 unidades, la eficacia de la utilización según el invento parece en efecto mucho menos rentable industrialmente. Un polímero que responda a tales características corresponde especialmente al ácido hialurónico (AH), molécula gruesa a 2500-5000 unidades disacarídicas (fórmula GIcAU((\beta1-3)-(GIcNAc(\beta1-4)GIcAU(\beta1-3)_{n}-GIcNAc), o a un fragmento de AH que comprenda al menos tres unidades disacarídicas (a partir de AH-6). Preferencialmente, dicha cantidad eficaz corresponde a un número de unidades disacarídicas comprendido entre 3 y 10 (extremos incluidos). Una utilización preferida según el invento comprende pues la utilización para la fabricación de dicho medicamento de fragmentos de AH, 3 como menos y como más 10 unidades disacarídicas (de AH-6 a AH-20): AH-6 y/o AH-12, por ejemplo. Según los efectos deseados, también se dispone de productos de interés entre los polímeros que comprendan más de 10 de dichas unidades disacarídicas. En especial, los polímeros que presenten de 10 a 100 unidades disacarídicas son igualmente eficaces. La utilización de fragmentos que presenten un pequeño número de unidades disacarídicas es preferible por simples razones de facilidad de producción. El experto podrá optimizar la elección de un número de unidades disacarídicas y la elección de cantidades eficaces. El experto dispone de varias fuentes de un polímero apropiado para una utilización según el invento: por ejemplo, puede extraerse de fuentes naturales (para AH: cordón umbilical humano, estreptococo, cresta de gallo, en especial) y, eventualmente sometido a una digestión enzimática (ver parte "ejemplos", digestión de AH por hialuronidasa) y/o directamente comprado a proveedores tales como ICN Pharmaceuticals, Sigma (AH, fragmentos de AH, por ejemplo). Dicho polímero también se puede utilizar en estado de sal, tal como el hialuronato de sodio o de potasio en forma de polvo, o disuelto en solución salina. Este polímero también puede presentar modificaciones químicas destinadas especialmente a modular la especificidad de dicho polímero frente a las células leucémicas previstas (células LAM en particular) a modular su duración de vida y/o su biodisponibilidad.

Una utilización según el invento puede comprender especialmente una utilización de dicho polímero para la fabricación de un medicamento cuya dosis unitaria esté comprendida entre 1 y 10 mg/kg, ventajosamente entre 2 y 5 mg/kg y en especial del orden de 3 mg/kg. Esta dosis se puede aumentar o disminuir (dosis unitaria) y/o repetir (en el tiempo) para optimizar la eficacia de dicho producto. Al no ser a priori tóxico el polímero utilizado según el invento, su posología se puede adaptar efectivamente al paciente considerado en función, por ejemplo, de los resultados del seguimiento de la enfermedad. El invento proporciona a este título un método in vitro que permite predecir, para un paciente dado, la eficacia terapéutica, especialmente antileucémica, de un medicamento obtenido por una utilización según el invento. El método in vitro de predicción según el invento comprende, en especial:

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la puesta en contacto, en condiciones fisiológicas (por ejemplo alrededor de 37ºC, medio adaptado al cultivo celular previsto tal como RPMI 1640/10% suero (suero de vaca fetal SVF o suero autólogo), atmósfera saturada de humedad y que contenga aire y CO_{2} en proporciones adaptadas), del medicamento testado con células caracterizadas por el estado patológico o inapropiado, salidas del paciente dado, y en el caso de un paciente leucémico, con blastos leucémicos salidos de dicho paciente,

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la observación in vitro de la existencia o de la ausencia significativa del efecto terapéutico deseado con relación al testigo negativo, y en el caso de un paciente leucémico, la observación de la existencia o de la ausencia de al menos un efecto diferenciador significativo sobre dichas células con relación al testigo negativo (ver a continuación y en la parte "ejemplos" las ilustraciones de tales efectos),

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la predicción de una buena eficacia terapéutica (en particular antileucémica) in vivo del medicamento testado para el paciente considerado en el caso de que dicho(s) efecto(s) terapéutico(s), en particular diferenciador(es) sea(n) observado(s) como presente(s) in vitro.

También puede utilizarse un modelo experimental animal.

Tales métodos de predicción según el invento constituyen un buen útil para adaptar la posología de administración (dosis unitaria, frecuencia) de un medicamento según el invento.

Según un modo variante de realización, una utilización según el invento puede comprender la utilización de un agente mimético de dicho polímero (mimético del ácido hialurónico o de un fragmento de este ácido en especial), y de un agente agonista en particular, tal como el obtenido por cribado en un banco químico y/o biológico. Los medios de realizar tales cribados o selecciones son bien conocidos por los expertos: en especial, se pueden realizar mediante cribado funcionales y/o diferenciales, por citometría de flujo, por ejemplo (selección de compuestos capaces de unirse a los mismos objetivos celulares que dicho polímero, y a CD44 en especial, y capaces de producir al menos un efecto diferenciador y/o antiproliferativo equivalente al menos en naturaleza) Tal agente mimético o agonista se puede utilizar, según el invento, como alternativa de la utilización de dicho polímero arriba presentada, o bien como complemento de esta utilización. Se utilizan ventajosamente aquellos miméticos o agonistas que no sean tóxicos para el hombre y/o que no sean susceptibles de inducir unas reacciones antigénicas inapropiadas. Así, si el banco cribado es un banco de anticuerpos (especialmente monoclonales), se podrían tomar ventajosamente, para la fabricación de dicho medicamento unos anticuerpos (monoclonales) humanos o humanizados (ver ejemplos).

Una utilización según el invento también puede comprender, aparte de dicho polímero o mimético, otros agentes activos para la inducción y/o la estimulación de la diferenciación de células hematopoyéticas, y/o de células leucémicas, para la inducción y/o la estimulación de la diferenciación de células hematopoyéticas, y/o de células leucémicas, y/o de células LAM en particular, tales como, por ejemplo, citóquinas. Estos otros agentes activos pueden incorporarse al medicamento, o ser administrados paralelamente a dicho medicamento y presentarse bajo forma de kit que comprenda por una parte estos otros agentes y, por otra parte, dicho polímero. Dicho polímero o mimético es pues, en el medicamento según el invento, un agente activo que se puede utilizar a título de co-agente activo.

Dicha utilización también puede comprender, aparte de la utilización de dicho polímero o mimético, la utilización de un compuesto adyuvante capaz de estimular la unión de dicho polímero a su objetivo celular, tal como un anticuerpo anti-CD44 capaz de estimular tal unión, o un fragmento (Fab, (Fab')_{2}, Fv, CDR) de tal anticuerpo. A este respecto, podemos subrayar que todo producto en general, y anticuerpo en particular, considerado como activador de un objetivo celular tal como CD44 no constituye obligatoriamente un producto de actividad diferenciadora y/o anti-proliferativa por unión a su objetivo y a CD44 en particular, y que todos los productos (especialmente anticuerpos) considerados como diferenciadores y/o anti-proliferativos por unión a un objetivo celular tal como CD44 no constituyen necesariamente un producto capaz de estimular la unión de dicho polímero o mimético a este objetivo: algunos anticuerpos diferenciadores anti-CD44 se oponen, e inhiben, a la unión de AH a CD44 (ver parte "ejemplos"). El experto dispone, no obstante, de medios (citometría de flujo por ejemplo) que permiten determinar si un compuesto es o no capaz de estimular, de una manera satisfactoria para las aplicaciones previstas, la unión de dicho polímero o mimético a su objetivo celular, y a CD44 en particular.

Una utilización de dicho polímero según el invento permite la fabricación de dicho medicamento bajo toda formulación galénica adaptada a la administración deseada, y en especial bajo forma de comprimidos, gránulos, cápsulas, polvos, suspensión, solución bebestible, solución inyectable, patch. Esta adaptabilidad técnica constituye una notable ventaja de la utilización según el invento. Una utilización de dicho polímero según el invento permite la realización de solución, y en especial de solución salina. Tales fabricaciones se realizan bajo unas condiciones adaptadas a las propiedades físico-químicas del polímero o mimético utilizado, y especialmente unas condiciones de pH, concentraciones que le son adaptadas. Una utilización según el invento comprende, aparte de la utilización de dicho polímero o mimético la utilización de cualquier compuesto o excipiente adaptado a la formulación deseada, y en especial cualquier vehículo farmacéuticamente inerte apropiado. Una solución inyectable, en especial por vía intravenosa, parece ser una formulación interesante fácilmente realizable ya que dicho polímero es fácilmente soluble en una solución salina equilibrada. Esta solubilidad representa una ventaja con relación al ATRA, que no es soluble en solución salina.

Ventajosamente, una utilización según el invento conduce a un medicamento cuya puesta en contacto, en condiciones fisiológicas, con un número estadísticamente representativo de muestras de células leucémicas (blastos) extraídas de humanos se traduce, a nivel de dichas células, por al menos un efecto diferenciador significativo tal como la inducción o la estimulación de una reducción del nitro-azul de tetrazolio, y/o una creciente expresión de antígenos específicos de células hematopoyéticas en maduración tales como CD14 (vía monocitaria) o CD15 (vía granulocitaria), y/o la inducción o la estimulación de características citológicas específicas de células hematopoyéticas en maduración (tales como disminución de la relación núcleo/citoplasma, disminución del número de nucleolos, condensación de la cromatina, segmentación del núcleo, número restringido de granulaciones azurófilas, contornos citoplásmicos irregulares). Otros efectos diferenciadores significativos comprenden un acontecimiento molecular marcador de una diferenciación hematopoyética tal como la degradación de la oncoproteina PML.RAR\alpha, y/o una inducción o una estimulación defosforilaciones de tirosinas intracelulares, y/o una inducción o estimulación de al menos un mensajero de factor de diferenciación tal como una citoquina diferenciadora (por ejemplo, G-CSF, M-CSF). De una manera ventajosa, la puesta en contacto en condiciones fisiológicas de un medicamento según el invento con un número estadísticamente representativo de muestras de células leucémicas (blastos) extraídas de humanos se traduce, por otro lado, a nivel de dichas células, por una inhibición significativa de su proliferación. Los medios para realizar tales puestas en contacto, de tales condiciones fisiológicas y de tales células leucémicas son conocidas por los expertos, se han dado más arriba unos ejemplos y más adelante se presentan en la parte "ejemplos". Por número estadísticamente representativo de muestras entendemos, en la presente solicitud, un número de muestras que permita un análisis estadístico válido de los resultados, y en especial un número superior a unas 10 muestras, por ejemplo del orden de 20-30 muestras aproximadamente. Por efecto significativo entendemos un efecto medio estadísticamente significativo con relación a los testigos negativos: por ejemplo, un efecto que no sea significativamente observado, por término medio, en los testigos negativos y que sea significativamente observado, por término medio, en al menos el 75% de las muestras del test.

Al ser el rol de dicho polímero el objeto de la utilización según el invento, es un rol directo. Dicho polímero actúa en efecto por unión a una molécula en la superficie de dichas células, que actúa entonces como un receptor transductor de una señal pro-diferenciadora y/o anti-proliferativa. Dicho polímero es capaz de presentar esta actividad en ausencia de cualquier otro producto diferenciador. Por ejemplo, es capaz de ejercer su acción diferenciadora in vitro en un medio a base de suero (suero de vaca fetal (SVF) o suero autólogo) sin adición de citoquina. En presencia de células hematopoyéticas normales, tales como células CD34^{+} progeneradoras, es capaz de ejercer su acción diferenciadora in vitro en un medio sin suero. Los medios de observar tales capacidades son conocidos por los expertos. Se dan ejemplos en la parte "ejemplos" más abajo.

Esta actividad de dicho polímero sobre las células hematopoyéticas se ejerce en especial por activación del receptor CD44. No se excluye que pueda ejercerse (de manera independiente y conjunta) por medio de cualquier receptor membranal capaz de fijar dicho polímero (AH, fragmento de AH, por ejemplo) y de inducir una señal diferenciadora a la célula que exprese este receptor. Tal receptor candidato puede elegirse ventajosamente entre las moléculas de la familia de las hialaderinas (RHAMM, hyaluronctino). Los expertos disponen de numerosos medios que permiten testar si un receptor candidato puede ser reconocido por dicho polímero, y si este receptor transduce entonces una señal de diferenciación celular. Tales medios comprenden especialmente.

i.

la búsqueda, con ayuda de técnicas de citometría de flujo, por ejemplo, de una unión de dicho polímero (AH y/o fragmentos de AH al menos 3 unidades disacarídicas, en especial) con células que expresen dicho receptor candidato y una ausencia de unión de este (estos) polímero(s) a estas mismas células cuando el acceso a dicho receptor candidato está específicamente bloqueado y/o

ii.

la búsqueda de al menos un efecto diferenciador sobre células que expresen el receptor candidato puestas en presencia de dicho polímero (AH y/o fragmentos de AH a al menos 3 unidades disacáridas, en especial), por comparación con el mismo tipo de células colocadas en unas condiciones equivalentes pero en ausencia de este (estos) mismo(s) polímero(s). Ejemplos de tales efectos diferenciadores y/o anti-proliferativos pueden encontrarse especialmente a continuación en la parte "ejemplos".

Por el contrario, con el fin de evitar la eventual unión inapropiada de dicho polímero a moléculas en la superficie de células no previstas, por ejemplo la eventual unión de dicho polímero (AH y/o fragmentos) al receptor ICAM1 a nivel de los senos hepáticos, una utilización según el invento puede comprender además la utilización de compuestos que bloqueen dichas moléculas no previstas, por ejemplo, compuestos anti-ICAM1 que bloqueen la unión de dicho polímero a ICAM1, tal como anticuerpos monoclonales anti-ICAM1, o la condroitina sulfato que al unirse a ICAM1 bloquea la accesibilidad de ICAM1 a AH. Según otro modo de realización del invento, se puede utilizar además, un compuesto capaz de prevenir la unión a un objetivo celular inapropiado de dicho polímero o molécula mimética. Unos ejemplos de tales compuestos comprenden unos anticuerpos monoclonales anti-ICAM1, o un fragmento (Fab, (Fab')_{2} Fv, CDR) de tales anticuerpos.

Según una disposición ventajosa del invento, dichas células leucémicas son células de leucemia mieloblásticas (blastos) y células de leucemia aguda mieloblástica en particular. Especialmente puede tratarse de blastos LAM1/2 y/o LAM3 y/o LAM4 y/o LAM5. La utilización según el invento, en efecto, se destina ventajosamente a la fabricación de un medicamento anti-leucemia mieloblástica, y anti-LAM1/2 y/o anti-LAM3 y/o anti-LAM4 y/o anti-LAM5 y/o anti-LAM7 en particular.

Como arriba se precisa y como se ilustra en los ejemplos, la utilización de dicho polímero según el invento permite pues la fabricación de una medicamento que se destina a estimular o a inducir la diferenciación de células cuya diferenciación esté bloqueada, en particular de las células leucémicas, y de una manera destacable, de los blastos LAM. Dicho médicamente así obtenido según el invento no es menos capaz, en condiciones fisiológicas, de estimular o inducir la diferenciación de células madre hematopoyéticas normales (no completamente diferenciadas), sin inhibir su proliferación: en efecto, puede estimular o inducir la diferenciación de células madre hematopoyéticas humanas sanas (CD14^{-} CD15^{-} CD34^{+}, e incluso CD34^{-}). Por consiguiente, la utilización según el invento permite así igualmente la fabricación de un medicamento que pueda administrarse a pacientes diagnosticados leucémicos con el fin de estimular o de inducir la diferenciación de sus células madre humanas normales. Permite también la fabricación de un medicamento que se pueda administrar a pacientes no leucémicos con el fin de estimular o inducir la diferenciación de sus células hematopoyéticas normales (no completamente diferenciadas) y esto especialmente con objeto de un tratamiento de una aplasia, o de una neutropenia. El presente invento tiene pues por objeto, de una forma general, la utilización de un polímero que comprenda una cantidad eficaz de unidades disacarídicas compuestas cada una por una molécula de estructura N-acetil-D-glucosamina ligada por unión O-glucosídica \beta 1,4 a una molécula con estructura de ácido glucorónico para la fabricación de un medicamento destinado a inducir o estimular la diferenciación de células madre CD14^{-} CD15^{-} o de células leucémicas y de blastos LAM en particular.

El presente invento es ilustrado por los ejemplos siguientes. El presente invento comprende igualmente toda variante de modo de realización que los expertos puedan poner en práctica, sin experimentación indebida, a partir de la enseñanza dada por la presente solicitud (descripción, ejemplos, reivindicaciones y figuras incluidos) y de los medios anteriores.

En la parte "ejemplos" que sigue, se hace referencia a las siguientes figuras:

- en la figura 1A, los más frecuentes subtipos de LAM (clasificación FAB: LAM M1/M2 o LAM M1/2, LAM M3 o LAM3; LAM M4 o LAM4; LAM M5 o LAM5) se indican a nivel del estadío de diferenciación mieloide al bloqueo del que corresponden,

- la figura 1B da una representación esquemática de la molécula de superficie celular CD44, y de moléculas de ácido hialurónico (AH), que son capaces de unirse a CD44: ácido hialurónico humano AHh a 2500-5000 unidades disacarídicas, fragmento de AHh a 6 unidades disacarídicas (AH-12) y fragmento de AHh a 3 unidades disacarídicas (AH-6).

- Las figuras 2A y 2B ilustran el hecho de que el ácido hialurónico (AH) es capaz de inducir la diferenciación de todos los subtipos de blastos LAM:

\circ Figura 2A: gráficos que representan el número de células CD14^{+} y CD15^{+} inducidas por utilización de AH sobre LAM1/2, 3, 4 y 5, en función de la intensidad de fluorescencia (curvas negras: utilización de AH; curvas grises más a la izquierda: testigos negativos)

\circ Figura 2B: clichés que ilustran la inducción sobre blastos LAM por AH (activación d,e CD44) de características citológicas específicas de células maduras,

- las figuras 3A y 3B ilustran el carácter dosis-dependiente y tiempo-dependiente de la diferenciación inducida por el ácido hialurónico (AH)

\circ figura 3A: intensidad media de fluorescencia (MFI CD14) medida sobre blastos LAM5 en función de la dosis de (\mug/ml) AH-12 (gráfico de la izquierda) y en función del tiempo de incubación en presencia de AH-12 (gráfico de la derecha),

\circ figura 3B: unión de AH-FITC e inhibición de esta unión, tal como se ilustra por el número de células en función del log de la intensidad de fluorescencia para (curvas identificadas de izquierda a derecha para cada gráfico):

\sqbullet

gráfico de la izquierda: células no marcadas y blastos LAM incubados con AH-FITC solo,

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gráfico central: células no marcadas, blastos LAM incubados con AH no marcado después con AH-FITC, blastos LAM incubados por AH-FITC solo,

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gráfico de la derecha: células no marcadas, blastos LAM incubados con anticuerpos monoclonales (Acm) anti-CD44, luego con AH-FITC, blastos LAM incubados con AH-FITC solo,

- las figuras 4A, 4B y 4C ilustran los acontecimientos moleculares que marcan la inducción por AH (activación de CD44) de la diferenciación de blastos LAM:

\circ figura 4A: degradación de la oncoproteina PML-RAR\alpha (bandas de arriba a 110 kDa) entre blastos LAM M3, 24 horas después del tratamiento con AH, y mantenimiento de la proteína salvaje RAR\alpha (bandas de abajo a alrededor de 50kD), tal como se detectan con ayuda del sistema químico-luminiscente ECL (pista 1: testigo negativo, pista 2: blastos tratados al AH, pista 3: testigo positivo (blastos tratados al AR),

\circ figura 4B: inducción por AH de la síntesis de transcritos M-CSF entre blastos LAM M5 (dos fotos agrupadas: M-CSF arriba del grupo, marcador GAPDH abajo), tal como se visualiza por electroforesis del ARN total sobre gel de agarosa e hibridaciones específicas (para cada gel: pista 1 = testigo negativo, pista 2 = blastos tratados al AH),

\circ Figura 5: inducción por fragmentos de AH de la diferenciación de células hematopoyéticas normales muy inmaduras (células madre CD34^{+} CD14^{-} CD15^{-}) según la vía granulocitaria.

Ejemplo 1 Inducción por AH y vía especialmente CD44, de la diferenciación de blastos LAM Materiales y métodos

Pacientes LAM. Unas muestras de sangre periférica o de médula ósea leucémica se han extraído en el momento del diagnóstico, tras consentimiento informado, en 36 pacientes afectados por leucemia aguda mieloide (LAM). El diagnóstico de la enfermedad y su clasificación responden a los criterios de la clasificación franco-americana-británica (FAB). Todos los pacientes han presentado más del 60% de blastos en la sangre periférica.

Separación de los blastos LAM. Unas células LAM frescas o congeladas han sido enriquecidas por centrifugación según el gradiente de densidad en presencia de Ficoll, y lavadas en el medio RPMI 1640 conteniendo un 10% de suero de vaca fetal (SVF). Las células congeladas han sido descongeladas a temperatura ambiente en el medio RPMI 1640 conteniendo el 50% de SVF, después lavadas dos veces en el medio RMPI 1640 adicionadas con SVF al 10%. Se ha eliminado de todas las muestras los linfocitos B y T, así como los monocitos en el caso de muestras LAM1/2 y LAM3. Esta eliminación se ha efectuado por inmunoabsorción específica de las bolas Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) cubiertas de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los antígenos de superficie específicos CD2 y CD19 (linfocitos) y más del 95% de blastos LAM.

Anticuerpos monoclonales (Acm) anti-CD44

Diferentes Acm anti-CD44 se han utilizado en los tests de inducción de una diferenciación: F10-44-2 (IgG2a, Serotec, Kidlington Oxford, UK) y Hermes-1 (IgG2a, hibridomo disponible en Developpemental Studies Hybridoma Bank, Iowa) especialmente. Estos Acm son los dos capaces de transmitir una señal de activador. Para los testigos negativos, estos Acm han sido sustituidos por los IgG murinas (no anti.CD44) del mismo isotipo. Para los tests de unión AH-FITC a CD44 se han empleado diferentes anticuerpos monoclonales anti-CD44 en especial el Acm J173 (Coulter-Immunotech, Marsella-Luminy, Francia).

El Acm 6D12 (IgG1, Couter-Immunotech) ha sido utilizado en los tests de fosforilación de proteínas sobre residuos de tiroxina.

Ácido Hialurónico (AH) y testigos

El ácido hialurónico obtenido de cordón umbilical humano (AHh, ref 362421) se ha obtenido o en ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA), disuelto a 5 mg/mi en agua destilada y hervida durante 10 minutos. Se han utilizado varias formas moleculares del ácido hialurónico (AH): ácido hialurónico humano Ahh, (forma de alta masa molecular (500 a 2000 kDa, y dos tipos de fragmentos oligosacarídicos AH-6 y AH-12, obtenidos tras la digestión de Ahh por la hialurodinasa (Sigma, St Louis, MO), a 37ºC durante 6 horas y aislamiento según las técnicas clásicas sobre una columna de cromatografía sobre gel AcA202 (Biosepara, Villeneuve La Garenne, Francia). AHh y AH-12 están compuestos por 2.10^{3}-10^{4}, 6 y 12 unidades sacarídicas respectivamente. Todas las preparaciones de ácido hialurónico están desprovistas de endotoxina. La figura 1B da una representación esquemática de la molécula de ácido hialurónico humano (AHh, 2500-5000 unidades disacarídicas), fragmento de Ahh a 6 unidades disacarídicas (AH-12), fragmento de Ahh a 3 unidades disacarídicas (AH-6) y una representación esquemática de la molécula de superficie celular CD44, a la que es capaz de unirse el AH. Cada unidad disacarídica está compuesta por una moléculas de ácido D-glucurónico ligada a una molécula de N-acetil-D-glucosamina. El ácido hialurónico se une a la molécula CD44 a nivel de una región situada en el extremo N-terminal del campo extracelular.

A título de testigos negativos, los blastos LAM han sido cultivados en presencia de sulfato de condroitina (Sigma), una glicosaminoglicana sulfatada con una estructura próxima a la del ácido hialurónico y que es susceptible de unirse a CD44. Además, los blastos leucémicos salidos de LAM3 han sido tratados con el ácido todo-transretinoico (AR) a título de testigos positivos de diferenciación para este subtipo de LAM.

Tratamiento de los blastos LAM con AH. Unas suspensiones celulares conteniendo más del 95% de blastos LAM se ha depositado por triplicado a razón de 2.10^{5} células por ml de RPMI 1640/SVF 10% en unas placas de cultivo de tejidos (CostarCorp., Cambridge, MA) en 96 pozos conteniendo cada uno 150 \mul de medio, y colocados en incubación durante 5 días en presencia de 20 \mug/ml de ácido hialurónico (AHh, AH-6 o AH-12). El AH se ha añadido a las concentraciones especificadas y el sulfato de condroitina se ha añadido a los testigos negativos. Las placas han sido colocadas en una incubadora a 37ºC en atmósfera húmeda durante 6 días, y las células han sido sometidas a los estudios de diferenciación como se describe a continuación.

Evaluación de la diferenciación mieloide

Se ha buscado la diferenciación analizando 3 criterios: 1) capacidad de efectuar una reacción de oxido-reducción en respuesta a un ester de forbol: esta reacción de óxido-reducción es detectada por la reducción del azul de nitrotetraslitio NBT, 2) la expresión de antígenos específicos de la diferenciación (CD14 específico de monocitos y CD15 específico de los granulocitos) y 3) unos cambios citológicos específicos. Todos estos criterios son específicos de células granulocitarios o monocitarios diferenciados normales.

Test de reducción al azul de nitrotetrazolio (NBT): La capacidad de reducir el NBT se ha medido según las técnicas clásicas. Brevemente, 2.10^{5} células han sido puestas en suspensión en 900 \mul de medio RPMI 1640 y se han incubado en presencia de 0,2 \mug/ml de 12-O-tetradecanileforbol-13-acetato (TPA, Sigma) y de 0,5 mg/ml de NBT (Sigma) durante 30 minutos a 37ºC. La reacción se ha detenido a 4ºC, las células han sido citocentrifugadas y sometidas al colorante de May-Grünwald-Giemsa. El porcentaje de células que contienen depósitos negros de reducción del NBT ha sido determinado por duplicado, bajo microscopio óptico, tras el examen de 300 células.

Análisis por citometría en flujo de la expresión de CD14 y CD15: los blastos LAM han sido puestos en suspensión, a razón de 10^{5} blastos/ml de medio RPMI 1640 conteniendo 0,02% de albúmina de suero bovino y 0,02% de NaN_{3} a 10^{5} células por ml, después se han incubado a 4ºC durante 30 minutos en presencia de Acm, conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC), y dirigidos contra CD14 (IgG2b 5 \mug/ml, Coulter Immunology, Hialeah, FL) o dirigidos contra CD15 (IgM \mug/ml), Becton Dickinson, San José, CA). Los Acm han sido utilizados en las concentraciones de saturación. Los IgM y IgG2b conjugados con FITC proceden de Coulter. Immunotech (Coulter-Immunotech, Inc. Westbrook, Maine) se han utilizado diluidos a 1:50. La unión de los Acm dirigidos contra CD14 y CD15 se ha cuantificado midiendo, por citometría de flujo, la fluorescencia celular relativa a la de células marcadas por IgG-FITC. Se ha efectuado la medida utilizando un FACSvantage (Becton Dickinson) equipado con un láser de iones de argón INNOVA70-4 (Coherent Radiation, Palo Alto, CA) regulado sobre 488 nm y funcionando a 500 mW. El citómetro de flujo se ha calibrado con ayuda de bolas fluorescentes (Becton Dickinson). Cada medida se ha realizado sobre 3000 células.

Estudio citológico: Los frotis celulares, preparados por triplicado, se han coloreado con la coloración de May-Grünwald-Giemsa, y su citología ha sido examinada con microscopio óptico.

Análisis de la degradación de la oncoproteina PML-RAR\alpha: Las proteínas celulares totales se han extraído de los blastos tratados y testigos, separadas sobre gel de 8% de acrilamida en dodecil sulfato de sodio (SDS) y se han electrotransferido sobre una membrana de nitrocelulosa (Laboratorios BioRad). Tras el bloqueo de los sitios de fijación no específicos con leche descremada a 5% en tampón de fosfato salino (PBS), se han incubado las transferencias durante una noche, en presencia de una disolución a 1:2000 de un anticuerpo de conejo policlonal anti-RAR\alpha (Blood 88: 2826-2832, 1996 Raelson y al.). Tras tres lavados durante 20 minutos en PBS, la fijación del Ac policlonal anti-RAR\alpha se ha revelado por incubación con un anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con peroxidasa, después por quimioluminiscencia (sistema de detección ECL, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)

Análisis de la fosforilación de las proteínas sobre residuos de tiroxina

Inducción de fosforilación de proteína sobre residuo tiroxina: AH-12 (50 \mug/ml) se ha añadido al tiempo t = 0 a 2.10^{5} blastos LAM puestos en suspensión, a temperatura ambiente, en 200 \mul de medio RPMI 1640 conteniendo un 10% de SVF. A t = 1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 200 \mul de Permeafix Ortho (Coulter Immunotech Inc. Westbrook, Maine), se han añadido para detener las fosforiilaciones y permeabilizar las células. Tras 40 minutos de incubación a temperaturas ambiente, y tres lavados en PBS, las proteínas fosforizadas a nivel de residuo de tiroxina se han marcado de forma específica con el Acm 6D12 (utilizado a 2 \mug/ml) conjugado con el FITC, y la intensidad del marcado se han medido por citometría de flujo por referencia al testigo isotípico (células marcadas por IgG1 conjugado con FITC), como se describe más arriba.

Inhibición de las fosforilaciones de tiroxina por la ginesteina: 2.10^{5} blastos LAM, puestos en suspensión en 200 \mul de medio RPMI 1640/SVF al 10%, se han incubado en presencia de 50 nM/l de ginesteina (Calbiochem-Novablochem, San Diego, CA) durante 1 hora a 37º C, y luego en presencia de AH durante una hora (para los estudios relativos a la expresión de los transcritos de citoquina), o bien cinco días (para los estudios relativos a la diferenciación). El test de exclusión del azul de Trypan ha mostrado que los tratamientos no son citotóxicos, siendo la viabilidad de las células superior al 95%.

Unión de AH-FITC: Se ha realizado una preparación de AH-FITC con AHh (ácido hialurónico humano) y FITC según las técnicas clásicas. Las células han sido lavadas tres veces en un tampón de fosfato salino (PBS), incubadas con AH-FITC a 2,5 \mug/ml en PBS durante 30 minutos sobre hielo, y lavadas en un PBS que contiene SVF al 2% y ácido de sodio al 0,02% (Medio de Marcado). La unión de AH-FITC ha sido medida por citometría de flujo, arriba descrito, por referencia a células no marcadas. Para asegurarse de que el marcaje observado es específico de AH, las células han sido preincubadas a +4ºC con AH no fluorescente (100 \mug/ml) y se ha buscado la abrogación de la fijación de AH/FITC. La implicación del CD44 en la fijación de AH-FITC se ha demostrado investigando los Acm anti-CD44, tal como especialmente J173 (25 \mug/ml) inhiben esta fijación.

Estudio por RT-PCR de la expresión de transcritos de citoquinas: el ARN total ha sido extraído de 5.10^{5} células con ayuda del reactivo de Trizol (Life Technologies, Cergy Pontoise, Francia), seguido de una extracción al fenolcloroformo y una precipitación al isopropanol. Un microgramo de ARN total calentado a 70ºC durante 10 minutos ha sido el utilizado como matriz para la síntesis de la primer a rama de ADN complementaria (ADNc), por adición de transcriptasa inversa y de hexámeros aleatorios (Life Technologies). El transcrito del gen de control de la gliceraldeido fosfodeshidrogenasa (GAPDH) ha sido utilizado como marcador interno de la reacción PCR (producto de amplificación 0,24 kb). Se han utilizado unas cantidades equilibradas de ADNc para la amplificación por PCR de los transcritos de citoquina, Los esbozos utilizados para la PCR han sido los siguientes:

Factor Estimulante de la formación de colonias de macrófagos (Macrophage Colony Stimulating Factor)

M-CSF: 5'-CATGACAAGGCCTGCGTCCGA-3' (SEQ ID Nº 1)

y

5'-GCCGCCTCCACCTGTAGAACA-3' (SEQ ID Nº 2);

Factor estimulante de la formación de colonias granulocitarias: (Granulocyric Colony Stimulation factor):

G-CSF: 5'-TTGGACACACTGCAGCTGGACGTCGCCGACTTT-3 (SEQ ID Nº3) y 5'-ATTGCAGAGCCA
GGGCTGGGGAGCAGTCATAGT-3' (SEQ ID Nº 4) (Genset, Ivry, Francia).

El protocolo PCR ha consistido en 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, utilizando un termociclador (Perkin Elmercetus, Norwalk, CT). Para cada experimento dos testigos negativos han sido sometidos a la totalidad de las etapas. Los productos de amplificación por PCR (M-CSF: 395 pb, G-CSF: 470 pb) han sido separados por electroporosis sobre gel de 1% de azarosa, y se han visualizado por coloración al bromuro de etidio. Con el fin de demostrar la especificidad de la amplificación, los productos de amplificación PCR han sido transferidos sobre una membrana Immobilon-S (Millipore Inc. Francia) e hibridazos en sondas oligonuclotídicas marcadas en el extremo 5' con ^{32}P:

M-CSF 5'- TCAGCAAGAACTGCAACAACAGC-3' (SEQ ID Nº 5);

G-CSF 5'-GTGAGGAAGATCCAGGGCGA-3' (SEQ ID Nº 6) Genset, Ivry, Francia)

Resultados y discusiones Inducción por AH de una diferenciación de los blastos leucémicos de LAM

Se han aislado unos blastos leucémicos de la sangre o de la médula ósea de pacientes que presentaban diferentes subtipos de LAM (n = 24, Cuadro I) y se han cultivado en presencia de ácido hialurónico (AH) durante 5 días (ver materiales y métodos). Los resultados se resumen a continuación en el cuadro I.

CUADRO I

Diferenciación de blastos LAm inducida por AH
Subtipo de LAM	Número de casos analizados	Número de casos de diferenciación
LAM1/2	7	5
LAM3	16	12
LAM4	4	3
LAM5	6	6
Número total	35	26, o sea, el 74%

Los subtipos de LAM se definen por los criterios de clasificación franco-americana-británica (FAB). La figura 1A indica esquemáticamente, para los subtipos de LAM más frecuentes (LAM1/2, LAM3, LAM4 y LAM5), el nivel de diferenciación mieloide a cuyo bloqueo corresponde cada subtipo.

Los resultados obtenidos muestran que el AH estimula la diferenciación de blastos leucémicos en todos los subtipos de LAM (5/7 de los LAM 112, 12/16 de los LAM3, 3/4 de los LAM4 y 6/8 de los LAM5) Además, la extensión de esta diferenciación medida por el test NBT ha sido tan elevada en los LAM3 y LAM5 como la alcanzada tras el tratamiento de los LAM3 por el AR (ácido todo-transretinoico).

La figura 1B da una representación esquemática de moléculas de ácido hialurónico (AH): ácido hialurónico humano Ahh a 2500-5000 unidades disacarídicas, fragmento de AHh a 6 unidades disacarídicas (AH-12) y fragmento de Ahh a 3 unidades disacarídicas (AH-6). De manera notable, el ácido hialurónico constituye en el compartimento hematopoyético un ligand de la molécula de superficie celular CD44.

Estos resultados de diferenciación de los blastos LAM han sido notablemente visualizados por (ver materiales y métodos):

-

inducción de una capacidad de reducir el nitro-azul de tetrasolio,

-

una creciente expresión de antígenos específicos de líneas, a saber CD15 específico de la diferenciación granulocitaria y CD 14 específico de la diferenciación monocitaria,

-

la inducción de características citológicas específicas.

En primer lugar, la capacidad de producir una reacción de óxido-reducción ha sido analizada utilizando el test de reducción del nitro-azul de tetrazolio (NBT^{+}). El siguiente cuadro II ilustra los porcentajes de blastos NBT positivos observados entre blastos extraídos de pacientes LAM1/2, LAM3, LAM4 y LAM5, tras el tratamiento al AH o después del tratamiento testigo negativo como se describe en materiales y métodos (para los LAM3: testigo positivo tratado al AR).

CUADRO II

2

Como se esperaba en los grupos de testigos negativos, menos del 5% de los blastos extraídos de LAM1/2, LAM3 y LAM5 se observan NBT^{+}. Por contraste, tras la incubación en presencia de AH (ver materiales y métodos), la proporción de blastos NBT^{+} ha aumentado de una manera significativa en todos los subtipos, lo que indica que se diferencian. En efecto, en 12 casos de LAM3 de 16, el % de células NBT^{+} está comprendido entre el 20% y el 80% (valor medio 42%). Además, entre 6 de ellos, el % observado es tan elevado como el obtenido por tratamiento al ácido todo-transretinoico (más del 50% de las células son NBT^{+}). De manera similar, en 6 casos sobre 8 de LAM5, el 8% de las células NBT^{+} está comprendido entre el 32% y el 72% (valor medio 52%). En 5 de los 7 casos de LAM1/2, el % de células NBT^{+} ha aumentado hasta alcanzar 20-25% (valor medio 22%). Este valor es superior de forma significativa al observado en los testigos negativos, pero menor que los observados en el caso de LAM3 y LAM5, lo que indica que la maduración de estos blastos particularmente inmaduros (LAM1/2) ha sido, con las dosis y los tiempos aquí aplicados, más limitada que en los casos de LAM3 y LAM5. En el caso de LAM4, que son casos de blastos más maduros, del 10% al 38% (valor medio 18%) de los testigos negativos han sido observados como NBT^{+}. Tras el tratamiento, esta proporción aumenta para alcanzar del 43% al 90% (valor medio 55%, es decir, 3 veces más alto que en los testigos). Estos resultados indican que las moléculas activadoras de CD44 tales como el ácido hialurónico, o sus fragmentos hasta AH-6, provocan la diferenciación de los blastos LAM entre todos los subtipos.

En segundo lugar, hemos medido por citometría de flujo el nivel de expresión de antíqenos específicos de líneas sobre blastos LAM

La expresión de CD15 ha sido utilizada para seguir la diferenciación de blastos LAM3 (subtipo promielocitario) puesto que es específica de la línea granulocitaria.

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CUADRO III

3

El anterior cuadro III ilustra los porcentajes de blastos CD15 positivos y CD14 positivos medidos por citometría de flujo, como se describe en materiales y métodos, entre blastos tratados con AH o blastos testigos negativos que han sido coloreados con anticuerpos conjugados a FIAC dirigidos contra CD15 (antígeno específico de la vía granulocitaria) o contra CD14 (antígeno de la vía monocitaria). Estos porcentajes han sido determinados por referencia a los testigos isotópicos.

Los cambios en los MFI (valor medio de intensidades de fluorescencia, unidades arbitrarias) son ilustrados por la figura 2A, donde se representa el número de células CD14+ y CD15+ inducidas por utilización de AH sobre LAM1/2, 3, 4 Y 5 en función de la intensidad de fluorescencia (FIAC), de izquierda a derecha y de arriba abajo: gráfico CD14 LAM1/2, gráfico CD15 LAM1/2, gráfico CD15 LAM3, gráfico CD14 LAM4, gráfico CD15 LAM4, gráfico CD14 LAMS (curvas negras: utilización de AH; curvas grises, más a la izquierda: testigos negativos).

LAM3: En los testigos negativos, CD15 estaba moderadamente expresado (gama de valores de intensidad media de fluorescencia (MFI): 7 a 223) entre 28 y 87% de los blastos LAM3 (valor medio 69%, excepción hecha de 2 muestras que han aparecido CD15 negativas). Tras el tratamiento con AH (activación de CD44), el % de células CD15+ ha aumentado en 12 de las 16 muestras hasta alcanzar valores del 42 al 90% (valor medio 78%) y de una manera tan elevada como con el ácido todo-transretinoico administrado en 8 casos. Además, los valores de MFI han aumentado alrededor de 3 veces (ver figura 2A), y son tan altos, o más altos que con el ácido todo-transretinoico.

LAM5: Para 6 muestras LAM5, CD14 no ha sido detectable en los testigos negativo: en cinco de estas muestras, hasta el 50%-91% de las células leucémicas se han manifestado CD14+ tras el tratamiento con AH (activación de CD44), ver cuadro III. Además, otras dos muestras LAM5 han presentado unas cantidades significativas de CD14 en los testigos negativos: en una de estas dos muestras, el nivel de CD14 había aumentado de manera significativa tras el tratamiento con AH (activación de CD44), con un valor de MFI que alcanzaba 340 comparado con el 102 de los testigos negativos (ver figura 2A, gráfico abajo a la derecha).

Estos resultados indican que los blastos LAM3 y LAM5 maduran hacia las líneas granulocitaria y monocitaria respectivamente. Para 8 de los 12 casos de LAM3 (66%), la maduración ha sido tan marcada como después del tratamiento con el ácido todo-transretinoico.

LAM1/2: La expresión de CD14, así como la de CD15, han sido medidas sobre los LAM1/2 puesto que estos subtipos de células leucémicas mieloblásticas muy inmaduras pudieran haber conservado la capacidad de diferenciarse hacia las dos líneas granulocitaria y monocitaria, al igual que las células progenitoras mieloides inmaduras normales. La expresión de CD14 y CD15 (a la vez) ha aumentado para 6 de los 8 casos de LAM112 tras el tratamiento con AH (activación de CD44). Tanto para CD14 como para CD15, la proporción de células que expresan estos antígenos de diferenciación ha aumentado: proporción de células positivas CD14+: menos del 10% en los testigos, 42% a 100% en los grupos tratados; proporción de células positivas CD15+: 0% a 56% en los testigos, 22% a 100% en los grupos tratados (ver cuadro III). La intensidad de expresión de estos antígenos (mean fluorescente intensity) aparece igualmente aumentada con respecto a los valores de MFI que se han multiplicado por un factor de aproximadamente 2 (ver

\hbox{figura 2A).}

LAM4: Finalmente, los balastos LAM4 que presentan espontáneamente unas características del fenotipo granulo-monocitario, se diferencias igualmente a lo largo de las líneas monocitaria y granulocitaria, como lo muestra el aumento del % de células que expresan los antígenos de diferenciador CD14 y de CD15 (% de células positivas multiplicado por un factor de 2, ver el cuadro III) y el aumento de los valores de MFI que se multiplican por un factor de 3 (ver figura 2A).

Así, tal y como muestra el test de reducción del NBT, la medida de la expresión CD14 y/o CD15 indica que la implicación de CD44 con moléculas activadoras tales como el ácido hialurónico induce a la diferenciación de todos los subtipos de blastos LAM.

En tercer lugar, se ha estudiado la inducción de características citolóqicas específicas de células maduras. Estos resultados están ilustrados en la figura 2B que presenta seis coloraciones de May-Grünwald-Giemsa, de izquierda a derecha, fotos de arriba: testigos negativos sobre LAM3, blastos LAM3 tratados 5 días con AH, blastos LAM3 tratados con AR (testigos positivos); fotos de abajo: testigos negativos sobre LAM5, blastos LAM5 tratados con AH, blastos LAM1 tratados con AH (células NBT+).

En el caso de LAM3 (figura 2B, línea de arriba) los testigos negativos (blastos no tratados en el extremo izquierdo) presentan un fenotipo promielocitario inmaduro caracterizado por una relación núcleo-citoplásmica elevada, unos nucleolos numerosos y abundantes granulaciones citoplásmicas azurófilas; se observan (flecha) unos cuerpos de Auer que son típicos de los LAM M3. Tras el tratamiento con AH (figura 2B, fotos central y derecha, línea de arriba), los LAM3 presente un núcleo segmentado, una escasa relación núcleo-citoplásmica, raros nucleolos, algunas granulaciones azurófilas, que son típicas de las células granulocitarias diferenciadas (células de bandas y metamielocitos). Estas características son similares a las de los blastos tratados con ácido todo-transretinoico (foto de la derecha, línea de arriba), que constituyen el testigo positivo de la diferenciación LAM3. Se pueden observar (flecha) unas estructuras citoplásmicas semejantes a estructuras dañadas de cuerpos de Auer.

En el caso de balastos LAM5 (figura 2B, línea de abajo), los testigos negativos (foto izquierda) presentan una elevada relación núcleo-citoplásmica, una cromatina finamente reticulada con numerosos nucleolos y una forma regular, característica de las células monoblásticas inmaduras. Tras el tratamiento con AH (activación por CID44) (figura 2B, línea de abajo, foto central), los balastos LAM5 muestran una disminución de la relación núcleo/citoplasma, una disminución del número de nucleolos, una condensación de la cromatina y unos contornos citoplásmicos irregulares, siendo todas estas características típicas de los monocitos maduros.

En el caso de los LAM1 (figura 2B, línea de abajo, foto de la derecha), las células NBT+, tras el tratamiento con AH, son fácilmente reconocibles por la coloración citoplásmica oscura debida a la reducción del NBT (x 100).

El examen citológico muestra pues que los balastos LAM3 y LAM5 se diferencian hasta los niveles terminales de la granulopoyesis y de la monopoyesis, respectivamente, después del tratamiento con AH (activación de CD44). En efecto, tras el tratamiento con AH, los balastos LAM3 presentan un núcleo segmentado., algunos nucleolos y un número restringido de granulaciones azorófilas. Estas características citológicas, que son similares a las observadas tras el tratamiento con el ácido todo-transretinoico son características de células granulocitarias diferenciadas (metamielocitos y polimorfos segmentacios). Además, las LAM5 presentan, tras el tratamiento con AH, una disminución de la relación núcleo/citoplasma, una disminución del número de nucleolos, una condensación de la cromatina, y presentan unos contornos citoplásmicos irregulares, siendo todos estos rasgos típicos de monocitos maduros. Estas características citológicas corroboran las precedentes observaciones hechas para los LAM3 y los LAM5 según los criterios funcionales y antigénicos de diferenciación. No se ha observado ningún cambio citológico en los LAM1 /2 después del tratamiento con AH, tal como se ha realizado, puesto que los blastos de LAM1/2 son muy inmaduros: sus diferenciaciones terminales requieren más de 6 días de incubación y/o la acción de otras moléculas diferenciadoras tales como citoquinas para acabar su diferenciación hasta el nivel terminal in vitro.

Modos de acción de AH

Mostramos igualmente que la intensidad de la diferenciación está directamente ligada a la dosis de moléculas activadoras utilizadas y al tiempo de incubación puesto en práctica. La figura 3A ilustra los resultados obtenidos incubando, como se describe en métodos, unos blastos LAM5 en presencia de las concentraciones indicadas de AH-12 (figura 3A, gráfico de la izquierda), o en presencia de 15 \mug/ml de AH-12 durante 3, 5 y 6 días (figura 3A, gráfico de la derecha). Los datos representan la media de las intensidades de fluorescencia (MFI + diferencia tipo) de muestras realizadas por triplicado y extraídas de un elemento representativo de tres experiencias.

La intensidad de diferenciación inducida por AH está pues ligada a la dosis de moléculas activadoras utilizadas; hasta 15 \mug/ml de AH, en el caso de LAM5, como se muestra en la figura 3A.

Además, la capacidad de ligandos del CD44, y de anticuerpos anti-CD44 en particular; para inhibir fuertemente la unión de AHh a los blastos LAM confirma que esta unión de AHh se realiza al menos por medio de CD44. Esto se ilustra en la figura 3 B donde se representan, en función del log de intensidad de fluorescencia, e identificando para cada gráfico las curvas de izquierda a derecha, el número de células testigo negativas y de células tratadas con AH-FITC solo (gráfico de la izquierda), el número de células testigo negativas, de células tratadas con AH no marcado y después tratado con AH-FITC y de células tratadas con AH-FITC solo (gráfico central), así como el número de células testigo negativas, de células tratadas con Acm anti-CD44 y luego con AH-FITC, y de células tratadas con AH-FITC solo (gráfico de la derecha).

La capacidad diferenciadora de diferentes anticuerpos monoclonales (Acm) anti-CD44 ha sido testada in vitro sobre células extraídas de pacientes LAM, como se ha procedido para AH. Todos los Acm anti-CD44 activadores testados no han sido capaces de inducir una diferenciación de los balastos LAM en estas condiciones: entre éstos, podemos citar el Acm murin, Hermès 1, que se declara ineficaz utilizado solo. Por el contrario, otros Acm anti-CD44 activadores se han revelado como eficaces de una manera equivalente al ácido hialurónico: el Acm murin F10-44-2, por ejemplo. Además, se puede notar que a partir de los Acm anti-CD44 de actividad diferenciadora, se puede realizar, con ayuda de las técnicas clásicas, unos productos cuya actividad es comparable a la del AH, o de fragmentos de AH (AH6-AH2O). Cuando estos productos son Acm de origen no humano, puede resultar ventajoso, por ejemplo, humanizarlos (injertos de fragmentos CDR, Fab o (Fab')2 sobre un anticuerpo matriz humano, por ejemplo) con el fin de prevenir reacciones antigénicas.

Con respecto a los mecanismos por los que AH ejerce su acción diferenciadora, se ha notado que, de una manera destacable, los Acm anti-CD44 de actividad diferenciadora reacciones de manera cruzada con AH sobre CD44, contrariamente a los Acm anti-CD44 de actividad no diferenciadora. Estos diferentes resultados ponen en evidencia la existencia sobre CD44 de al menos un epitopo específicamente implicado en la diferenciación mieloide. Este epitopo ligado a la diferenciación se localiza en el interior del campo de unión de AH a CD44. Puede ser identificado por los expertos con ayuda de tests ELISA, tras digestión enzimática de CD44 en fragmentos peptídicos. Presentamos a continuación, delimitadas por flechas, la secuencia oligonucleotídica (SEQ ID Nº 7), secuencia entre dos corchetes, líneas de arriba) de dicho campo de unión de AH sobre CD44, así como su secuencia peptídica (SEQ ID Nº 8, secuencia entre dos corchetes, líneas de abajo).

4

Igualmente se ha podido constatar que algunos Acm anti-CD44 diferenciadores, cuando se utilizan en presencia de AHh o de fragmentos de AHh, son capaces de estimular la unión de AHh (o de un fragmento de AHh) con su objetivo, mientras que otros, por el contrario, se oponen a ello e inhiben así el efecto diferenciador (éste es el caso especialmente del Acm J173).

Igualmente se ha podido constatar que unos Acm anti-CD44 no diferenciadores son capaces de inhibir la unión de AH a CD44. Éste es el caso, por ejemplo, de Hermes 1. Este resultado sugiere que el reconocimiento por AH de un epitope específico sobre CD44 podría no ser suficiente para inducir la diferenciación observada.

En una minoría de casos de LAM (9/36), la diferenciación no ha sido inductible por ligando de CD44 tales como AH. En estos casos, el análisis por citometría de flujo ha puesto en evidencia que los anticuerpos monoclonales que bloquean de forma cruzada con AH no se unen a CD44. No obstante, CD44 se expresaba sobre estos blastos puesto que esta molécula ha sido marcada por anticuerpos anti-CD44 conjugados con FIAC. Estos resultados sugieren que la accesibilidad del epitope(s) implicada en la diferenciación podría ser impedida por una conformación particular de la proteína CD44, o por motivos de glicosilación particulares sobre la molécula CD44, como puede observarse en varios casos de LAM.

Más allá de una o varias secuencias de CD44 implicadas en la diferenciación intervienen pues igualmente, para que la diferenciación se desarrolle con normalidad, unos condicionamientos de conformación de esta molécula.

Acontecimientos moleculares

Para ir más allá en los acontecimientos moleculares ligados a la diferenciación inducida por CD44, se ha buscado la degradación de la oncoproteina PML-RAR\alpha en los blastos LAM3 bajo la acción de AH, como se ha podido constatar con el ácido todo-transretinoico. Con este fin, unos extractos proteicos de blastos LAM3 (tratados con AH, tratados por AR o blastos de testigos negativos) han sido sometidos a electroforesis, transferidos y confrontados con un anticuerpo monoclonal específico anti-RAR\alpha como se describe en materiales y métodos. Los resultados están ilustrados por la figura 4 A en la que la banda a 110 kD correspondiente a PML-RAR\alpha (blastos testigo negativos) aparece fuertemente disminuida 24 horas después de la activación de CD44 por AH (pista 2), es decir, tan eficazmente como con AR (ácido todo-transretinoico, pista 3), mientras que la proteína RAR\alpha de tipo salvaje (banda a unos 5okD) no cambia.

Se ha demostrado también que la diferenciación inducida por CD44 implica:

1)

fosforilaciones de tiroxina, y

2)

en varios casos, pero no en todos, la inducción de la expresión de mensajeros de citoquina, es decir, de los acontecimientos clave de la diferenciación granulomonocitaria normal.

En primer lugar, los inventores han demostrado que la fosforilación de proteínas a nivel de las tiroxinas es crucial en la diferenciación de LAM3 y LAM5 inducida por CD44 (tratamiento con AH), puesto que la ginesteina, un inhibidor específico de las tiroxinas quinasas inhibe esta diferenciación. Para corroborar este resultado, los inventores han evidenciado, utilizando un anticuerpo (6D12) conjugado con FIAC, y la citometría de flujo como se describe en métodos, que las fosforilaciones de tiroxinas intracelulares ya son inducidas tras un minuto de tratamiento. Esto viene ilustrado por la figura 4C, en la que se representa la intensidad media de fluorescencia de tiroxinas fosforiladas en función del tiempo, para blastos tratados con AH (curva de arriba: 1 caso representativo de LAM5), por comparación con blastos testigo negativos (curva de abajo).

En segundo lugar, las citoquinas siguientes son conocidas para ser actores específicos de la inducción de una diferenciación granulo-monocitaria normal GM-CSF (Factor Estimulante de la formación de Colonias Granulomonocitaria), G-CSF y M-CSF. Utilizando la reacción por polimerasis en cadena semi-cuantitativa con ayuda de la transcriptasa inversa (RT-PCR), 1 hora después de la activación de CD44 (tratamiento con AH), los transcritos M-CSF son detectados entre los LAM M1/M2 (1 caso de 3) y un transcrito de M-CSF se detecta en los LAM M5 (1 caso de 3). Esto se ilustra en la figura 4B que presenta geles de agorasa obtenidos tras la coloración al bromuro de etidio de los blastos LAM5 (fotos de la izquierda: gel de arriba M-CSF, gel de abajo: marcador GAPDH; pista 1: testigos, pista 2: tratado con AH.

Estas inducciones de diferenciación han implicado pues unas fosforilaciones de tiroxinas, puesto que están abrogadas por el tratamiento con la ginesteina. Es importante notar que, en numerosos casos de LAM, los transcritos de GM-CSF, G.CSF y M-CSF no han sido detectados o bien se han expresado de una manera constitutiva. Esto sugiere que esas citoquinas no están implicadas de una manera necesaria en la diferenciación inducida por CD44 (tratamiento con AH).

En conclusión, los inventores han demostrado que la diferenciación de blastos LAM puede ser inducida y/o estimulada por AH o sus fragmentos (a partir de AH-6), en especial vía CD44, para todos los subtipos de LAM. En los LAM3, la diferenciación inducida por AH es comparable a la obtenida con el ácido retinoico. Los resultados presentados permiten esencialmente el desarrollo de nuevas terapias para la diferenciación de LAM, en especial para el conjunto de sus subtipos M1A M5, utilizando moléculas de estructura de ácido hialurónico, y/o la fijación de la molécula CD44 por otras moléculas agonistas.

Ejemplo 2 Realización de un medicamento destinado a estimular o inducir la diferenciación de células hematopovéticas humanas

El ácido hialurónico (AH) utilizado en el anterior ejemplo 1 ha sido purificado a partir de cordón umbilical humano (ICN Pharmaceuticals, Sigma). Para la realización industrial de medicamentos, el AH puede purificarse igualmente a partir de tejidos no humanos: cresta de gallo (producido por la sociedad Pharmacia bajo la denominación comercial Healon) o estreptococo, por ejemplo. Estas moléculas de AH presentan una elevada masa molecular. Ahora bien, son las moléculas de AH de pequeño tamaño las que se pueden obtener especialmente por la digestión enzimática de la forma de alto peso molecular, que presentan las mejores capacidades diferenciadoras según el invento. Una utilización según el invento comprende ventajosamente la utilización de moléculas "fragmentos de AH" compuestas por 3 a 10 disacarídicas (AH-6 a AH-20, ver figura 1 B). La utilización de estas pequeñas moléculas presenta también una ventaja para la producción farmacéutica, ya que son menos susceptibles de ser captadas por el hígado que las moléculas AH de alto peso molecular.

Puede preverse toda forma galénica para el medicamento según el invento. Como el AH es muy hidrosoluble, puede realizarse fácilmente una preparación bajo forma disuelta en una solución salina equilibrada.

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Como los tejidos hematopoyéticos (médula ósea, bazo, ganglios) presentan una fuerte afinidad para AH, la administración de esta solución puede realizarse eficazmente mediante inyección por vía intravenosa. Unas dosis de administración del orden de 1A 10 mg de AH/kg, con preferencia del orden de 2 a 5 mg de AH/kg, y en especial del orden de 3 mg de AH/kg se presentan como ventajosas.

Si es necesario, y especialmente a la vista de los resultados del seguimiento de la evolución de la enfermedad en el paciente, las dosis pueden ser aumentadas (en dosis unitaria) y/o repetidas (en el tiempo): el AH presenta, en efecto, la notable ventaja de no ser tóxico y de permitir así una posología de administración perfectamente adaptada al paciente considerado.

Por último, puede ser beneficioso disminuir la importante fijación del AH a nivel de los senos hepáticos. En este órgano, el AH es fijado por la molécula de superficie ICAM1, y reo por el CD44. El bloqueo preventivo de esta fijación puede preverse eventualmente inyectando condroitina sulfato que saturaría los sitios receptores ICAM-1.

La capacidad de fijar AH del CD44 es variable, a veces escasa en estado constitutivo, pero considerablemente activable por ciertos cuerpos monoclonales (AcM) anti-CD44 de tipo activador (ver ejemplo 1). Por esta razón, tales AcMs pueden incorporarse, de una manera particularmente ventajosa, al medicamento según el invento a título adyuvante(s) de la diferenciación inducida por AH. Por tanto, se puede prever inyectarlos al mismo tiempo que el AH. Sobre la base de las dosis de anticuerpos monoclonales actualmente en la terapia citotóxica de los LAM, parecen indicadas unas dosis del orden de 5 a 10 mg/m2 de AcM anti-CD44 activadores.

Ejemplo 3 Acción diferenciadora del ácido hialtirónico sobre los prolzenitetirs CD34^{+} de la médula ósea humana normal Material y Métodos

Las células progenitoras CD34+ se aíslan de la médula ósea normal por inmunoabsorción sobre bolas magnéticas recubiertas de anticuerpos anti-CD34. Estas células se siembran a razón de 500 células/200\muL en un medio de cultivo sin suero (Sterncell médium) adicionado con citoquinas IL-1 (1000/mL), IL-3 (2ng/mL) y SCF (10ng/mL) y 50 \mug/mL de AH (moléculas compuestas por de 10 a 50 sacáridas). El AH no se añade a los grupos controlados. Tras 7 días de incubación a 37ºC la expresión de los antígenos de diferenciación CD15 (granulocitaria) y CD14 (monocitaria) se analiza por citometría de flujo.

El mismo experimento se realiza con células hematopoyéticas CD34^{+} aisladas de sangre del cordón umbilical.

Resultados

Se mide por intensidad de fluorescencia el número de células CD15^{+} y CD14^{+} en los diferentes tratamientos. Los resultados obtenidos para las células hematopoyéticas CD34^{+} aisladas de médula ósea se ilustran en la figura 5. Los resultados obtenidos para las células hematopoyéticas aisladas de sangre del cordón umbilical son comparables. En los dos casos, se observa una proporción significativamente superior de células CD15^{+} y CD14^{+} en los lotes tratados con los fragmentos de AH.

Conclusión

Los fragmentos de AH estimulan la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+} aisladas de la médula ósea humana, es decir, de células madre muy inmaduras (CD15^{-}, CD14^{-}, y no solamente según la vía monocitaria, sino igualmente según la vía granulocitaria.

Ejemplo 4 Fragmentos de AH presentando más de 10 unidades disacarídicas

Procediendo de una manera comparable al ejemplo 1, puede observarse que hemos demostrado que unos fragmentos de AH compuestos de 20 a 100 unidades sacáridas y utilizados a razón de 50 \mug/mL inducen la diferenciación terminal de los balastos LAM1 y LAM2. Esta diferenciación ha sido demostrada:

- por el aumento de la expresión de los antíqenos de diferenciación CD14 y CD15:

LAM1: 13% de células CD14+ en el grupo tratado comparado a menos del 5% en el grupo control; 72% de células CD15^{+} (intensidad de fluorescencia relativa de 56) en el grupo tratado comparado al 55% de células CD15^{+} (intensidad de fluorescencia relativa 21) en el grupo de control.

LAM2: 35% de células CD14^{+} en el grupo tratado comparado a menos del 5% en el grupo control.

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- Por la inducción de células NBT^{+}: 50% en el grupo tratado (LAM1) comparado a menos del 5% en el grupo control.

- Por la introducción de características citológicas específicas de monocitos maduros.

Claims (12)

1. Utilización de un polímero que comprenda una cantidad eficaz de unidades disacarídicas compuestas cada una por una molécula de estructura N-acetil-D-glucosamina ligada por unión O-glucosídica \beta1,4 a una molécula con estructura de ácido glucorónico para la fabricación de un medicamento destinado a inducir o estimular la diferenciación de células tomadas entre células leucémicas y células madre CD14^{-}CD15^{-}.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha cantidad eficaz corresponde a un número de unidades disacarídicas superior o igual a 3.

3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha cantidad eficaz corresponde a un número comprendido entre 3 y 10.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha cantidad eficaz corresponde a un número comprendido entre 10 y 100.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicho polímero es elegido entre el grupo constituido por el ácido Hialurónico y los fragmentos de este ácido.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicho polímero se utiliza para la fabricación de dicho medicamento con una dosis comprendida entre 1 y 10 mg/kg, ventajosamente entre 2 y 5 mg/kg, en especial del orden de 3 mg/kg.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicho polímero se utiliza bajo forma de solución, preferiblemente de solución inyectable por vía intravenosa.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende, además, la utilización de un compuesto adyuvante capaz de estimular la unión de dicho polímero a un objetivo celular, tal como un anticuerpo monoclonal anti CD44, o un fragmento de un tal anticuerpo.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende, además, la utilización de un compuesto capaz de prevenir la unión de dicho polímero con un objetivo celular inapropiado, y en particular un anticuerpo monoclonal anti-ICAM1 o un fragmento de un tal anticuerpo.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dichas células leucémicas son células de leucemia aguda mieloblástica LAM1/2 y/o LAM3 y/o LAM4 y/o LAM5 y/o LAM6 y/o LAM7.

11. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polímero se encuentra bajo la forma de un agente mimético o agonista.

12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque el agente mimético o agonista es un anticuerpo humano o humanizado.