DE19802540C1 - Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der Hyaluronsäure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der HyaluronsäureInfo
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Description
Die Bereitstellung von dendritischen Zellen (DZ) erlangt bei
der Therapie von verschiedenen Erkrankungen eine immer größer
werdende Bedeutung. Mit Hilfe der dendritischen Zellen ist es
möglich, hochaktive Immunmodulatoren bereitzustellen, die mit
verschiedenen Antigenen, insbesondere Tumorantigenen,
Viruspeptiden oder allergen wirkenden Verbindungen beladen
werden können. Diese Zellen werden dann in der adoptiven
Immuntherapie bei Patienten mit Tumoren, Viruserkrankungen oder
Allergien eingesetzt. Es besteht daher in der adoptiven
Immuntherapie ein erheblicher Bedarf an dendritischen Zellen,
wobei diese dendritischen Zellen vorzugsweise über
standardisierte, reproduzierbare und kostengünstige Verfahren
bereitgestellt werden sollen. Diese Verfahren müssen unter
GMP-/GLP-Bedingungen durchgeführt werden können.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur
Erzeugung von dendritischen Zellen aus Stammzellen bekannt (beispiels
weise DE 44 12 794 A1).
Aus dem Knochenmark oder dem peripheren Blut von mit
Granulozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF) behandelten
Chemotherapie-Patienten können hämatopoetische Stammzellen
isoliert werden, die den Oberflächenmarker CD34 aufweisen.
Diese Stammzellen werden unter Zugabe verschiedener Zytokine
kultiviert und die dendritischen Zellen werden nach einer
verhältnismäßig langen Kultivierungszeit erhalten.
Bei einem anderen Verfahren werden Monozyten aus peripherem
Blut isoliert, die mit GM-CSF und IL-4 kultiviert werden. Zur
vollständigen Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen
müssen am Ende der Differenzierungsphase weitere Zytokine
zugesetzt werden.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weisen
verschiedene Nachteile auf. Die verhältnismäßig lange
Kultivierungsdauer ist für den Einsatz in der Klinik nicht
geeignet. Darüber hinaus können die hohen Kosten der Zytokine
und die Chargenabhängigkeit der eingesetzten Zytokine
nachteilig sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren
zur Anreicherung von ausgereiften dendritischen Zellen, das
folgende Schritte umfaßt:
- a) aus Blut werden mononukleäre Zellen gewonnen,
- b) Zellen, die den Oberflächenmarker CD14 aufweisen, werden angereichert,
- c) die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen werden in einem Medium kultiviert, das die Zytokine GM-CSF und IL-4 beinhaltet, und
- d) die in Schritt c) erhaltenen Zellen werden mit Hyaluron säurefragmenten kultiviert, um die Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen zu veranlassen.
Mononukleäre Zellen können aus Blut mit Hilfe eines
Dichtegradienten gewonnen werden, wobei in bevorzugter
Ausführungsform ein Leukozytenkonzentrat über einen Ficoll-
Dichtegradienten aufgetrennt wird.
In dem zweiten Verfahrensschritt werden die den
Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen angereichert,
bevorzugt mit Hilfe von wenigstens einem gegen den
Oberflächenmarker CD14 gerichteten Antikörper. Zum Einsatz
kommen können hier die Magnet-aktivierte Zell-Sortierung (MACS)
oder die Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FACS). Eine
einfachere, jedoch nicht so effiziente Methode stellt die
Anreicherung über Plastikadhäsion dar.
Anschließend werden die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen in einem Medium kultiviert, das GM-CSF in einer
Konzentration von 5000 bis 10000 U/ml und IL-4 in einer
Konzentration von 100 bis 1000 U/ml aufweist. Gegebenenfalls
können noch weitere geeignete Zytokine zugesetzt werden.
Schließlich werden die in dem Kultivierungsschritt erhaltenen
Zellen mit Hyaluronsäurefragmenten kultiviert, wobei diese
Fragmente 1 bis 50 Grundbausteine der Hyaluronsäure aufweisen.
Ein Grundbaustein stellt ein Aminodisaccharid aus D-
Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin in ß1-3-glycosidischer
Bindung dar. Bevorzugt eingesetzt werden Hyaluronsäurefragmente
mit jeweils 1 bis 10 Grundbausteinen.
Die Kultivierung der den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen erfolgt in einem Medium, das GM-CSF und IL-4 enthält,
bevorzugt für eine Dauer von wenigstens 72 h bis 7 Tagen.
Hieran schließt sich die Kultivierung in Schritt d) für
wenigstens 48 Stunden mit Hyaluronsäurefragmenten an. Die
Hyaluronsäurefragmente liegen bevorzugt in einer Konzentration
von 1 bis 50 µg/ml und besonders bevorzugt in einer
Konzentration von 10 bis 30 µg/ml vor.
Die vorliegende Erfindung betrifft also die Verwendung von
niedermolekularen Hyaluronsäurefragmenten für die Ausreifung
von dendritischen Zellen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können dendritische Zellen
hergestellt bzw. angereichert werden. Die dendritischen Zellen
sind Antigen präsentierende Zellen, die auf die Initiation der
primären Immunantwort spezialisiert sind. In den verschiedenen
Stadien ihrer Entwicklung übernehmen sie unterschiedliche
Funktionen. In dem unreifen Zustand sind die dendritischen
Zellen sehr effektiv beim Prozessieren von nativen Protein-
Antigenen für den MHC Klasse II-Weg. Reife dendritische Zellen
sind dagegen weniger für die Aufnahme von neuen Proteinen für
die Präsentation geeignet, stimulieren aber dafür viel besser
die ruhenden CD4+ und CD8+ T-Zellen hinsichtlich des Wachstums
und der Differenzierung.
In vivo läuft die Reifung der dendritischen Zellen dann ab,
wenn die unreifen dendritischen Zellen von den Stellen der
Antigenaufnahme zu den T-Zell-Bereichen der lymphoiden Organe
wandern. In vitro kann die Reifung in Kulturen von frisch
isolierten dendritischen Zellen beobachtet werden. Die Reifung
der dendritischen Zellen schlägt sich auch in Änderungen der
Morphologie und des Phänotyps nieder. Die Charakterisierung und
Differenzierung der dendritischen Zellen erfolgt üblicherweise
über den Nachweis verschiedener Oberflächenmarker.
Aufgrund der natürlichen Funktionen sind die dendritischen
Zellen besonders geeignet, als natürliches Adjuvans bei der
Impfung und Immuntherapie, insbesondere bei der Tumortherapie,
eingesetzt zu werden. Dabei ist es für den angestrebten
therapeutischen Einsatz entscheidend, ausgereifte DZ's zu
verwenden, die sich nach Reinfusion in den Patienten nicht
wieder zu Makrophagen-ähnlichen Vorstadien zurückdifferenzieren
können.
Man geht nach derzeitigem Wissensstand davon aus, daß die
dendritischen Zellen im unreifen Zustand das Antigen
(beispielsweise ein Tumorantigen) aufnehmen und anschließend
das Antigen prozessieren. Dabei reifen die dendritischen Zellen
und wandern zu den T-Zell-reichen Bereichen der sekundären
lymphoiden Organe. Reife dendritische Zellen exprimieren in
hohem Maße MHC, co-stimulierende Moleküle und Adhäsionsmoleküle
auf ihrer Oberfläche, wodurch eine Interaktion zwischen den
dendritischen Zellen und den T-Zellen ermöglicht wird (T-cell
clustering). Co-stimulatorische Signale werden über B7-CD28 und
CD40-CD40-Liganden-Interaktionen übertragen und durch die
Produktion von Zytokinen, wie IFN-α, IFN-γ und IL-12, die
bekannterweise die zellulär vermittelte Immunität fördern,
verstärkt.
Nach derzeitigem Wissensstand scheint es wesentlich zu sein,
daß für die Induktion von primärer T-Zellantwort spezialisierte
Antigen präsentierende Zellen vorhanden sind, da die
Präsentation von Antigenen an T-Zellen in Abwesenheit eines
zweiten Signals (Co-Stimulation) entweder das Absterben der T-
Zellen oder eine Antigen-spezifische Toleranz bewirken kann.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher
insbesondere darin zu sehen, daß die dendritischen Zellen
relativ einfach bereitgestellt werden können. Außerdem müssen
nur verhältnismäßig geringe Konzentrationen an kostspieligen
Zytokinen eingesetzt werden. Das erfindunsgemäße Verfahren
ermöglicht die Bereitstellung einer Zellpopulation, die ganz
überwiegend aus dendritischen Zellen besteht und, die sich in
einem verhältnismäßig einheitlichen (synchronen)
Reifungszustand befinden. Wenn die dendritischen Zellen für die
Präsentation von Antigenen eingesetzt werden sollen, können die
geeigneten Antigene zu einem geeigneten Zeitpunkt zu den
dendritischen Zellen zugegeben werden und die Antigene können
dann von den dendritischen Zellen im Laufe des
Reifungsprozesses prozessiert werden. Die Antigene können
entweder als Proteine, in Form von abgetöteten Zellen oder
Zellpräparationen oder auch in Form von gentechnologisch
modifizierten Zellen zugegeben werden. Wenn sich die
dendritischen Zellen in dem gewünschten Zustand befinden,
können sie für die Therapie verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Bereitstellung von
autologen dendritischen Zellen geeignet. Der Begriff "autolog"
bedeutet, daß die Ausgangszellen einem Spender (Patienten)
entnommen werden. Diese Zellen werden dann in vitro
erfindungsgemäß behandelt, um dendritische Zellen zu gewinnen.
Die angereicherten dendritischen Zellen werden dann
gegebenenfalls nach Kontakt mit dem Antigen demselben Spender,
von dem sie ursprünglich herstammen, zurückgegeben.
Alternativ hierzu kann das Verfahren auch für die
Bereitstellung von "allogenen" dendritischen Zellen verwendet
werden. Hierbei werden die Zellen von einem Spender oder auch
aus Blutkonserven, die von Blutspendediensten erhalten werden
können, hergestellt und dann an andere Empfänger zurückgegeben.
Hierdurch können standardisierte dendritische Zellen
bereitgestellt werden, die beispielsweise optimal mit einem
Tumorantigen beladen sind. Insbesondere bei viralen Infektionen
(HIV) kann so die zelluläre Immunität effektiv gesteigert
werden.
Erfindungsgemäß werden zur Ausreifung der dendritischen Zellen
Fragmente von Hyaluronsäure (HA) eingesetzt. Die Hyaluronsäure
ist ein makromolekulares Polysaccharid, das als körpereigene
Substanz vor allem in der Dermis zur Wasserspeicherung dient.
Hyaluronsäure wird vor allem von Keratinozyten in den basalen
Schichten der Oberhaut (Epidermis) sowie von Fibroblasten des
Unterhaut-Bindegewebes produziert. Hyaluronsäure findet sich
auch im Glaskörper von Augen, der Synovialflüssigkeit der
Gelenke und ist ein Bestandteil des Bindegewebes. Bei niedrigen
Konzentrationen bildet Hyaluronsäure eine hochviskose wäßrige
Lösung. Die Hyaluronsäure ist eine hochmolekulare Verbindung
mit einem Molekulargewicht zwischen 50000 Dalton und mehreren
Millionen Dalton. Der Grundbaustein der Hyaluronsäure ist ein
Aminodisaccharid, das aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-
Glucosamin in ß1-3-glycosidischer Bindung besteht. Dieser
Grundbaustein ist mit der nächsten Einheit ß1-4-glycosidisch
verbunden. Diese unverzweigte Kette der Hyaluronsäure besteht
aus etwa 2000 bis 10000 derartiger Grundeinheiten. Durch
Hyaluronidasen werden β-glucosidische Bindungen hydrolisiert
und die Hyaluronsäure wird so zu kleineren Bruchstücken
abgebaut. Erfindungsgemäß werden bevorzugt die Hyaluronidase
aus Bullenhoden oder die aus Streptococcus hyaluronicus
isolierte Hyaluronidase verwendet. Die erfindungsgemäß
eingesetzten Hyaluronsäurefragmente werden bevorzugt zunächst
mechanisch durch Scherkraft und/oder Ultraschall zerkleinert
und anschließend erfolgt ein weiterer Abbau des Polysaccharids
mit Hilfe einer geeigneten Hyaluronidase. Die gewünschten
Fragmente mit bevorzugt 1 bis 50 Grundeinheiten werden
anschließend durch geeignete Trennverfahren isoliert.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgend
beschriebenen Beispiele weiter erläutert. Bei der Durchführung
der Beispiele wurde besonders auf Verunreinigungen der
Reagenzien mit Lipopolysacchariden (LPS) geachtet.
Lipopolysaccharide sind Bestandteile aus der Zellwand Gramm
negativer Bakterien. Schon kleinste Verunreinigungen mit
Lipopolysacchariden reichen aus, um Monozyten bzw. CD14+-
Stammzellen des peripheren Blutes irreversibel zu aktivieren.
Daher wurde bei den erfindungsgemäß durchgeführten Versuchen
darauf geachtet, einen Schwellenwert von 0,01 ng/ml
Lipopolysaccharid zu unterschreiten, der erfahrungsgemäß keinen
Einfluß auf Monozyten, CD14+ Stammzellen oder dendritische
Zellen hat.
- a) Gewinnung von mononukleären Zellen (PBMC)
Ein Leukozytenkonzentrat (Buffy coat) von einem gesunden, humanen Spender wurde über einem Dichtegradienten mit Ficoll- Hyperpaque plus (Pharmacia, Uppsala, Schweden) durch Zentrifugation aufgetrennt. Die mononukleären Zellen (PBMC) lagern sich dabei in der Interphase des Gradienten ab, rote Blutkörperchen (Erythrozyten) sowie neutrophile Granulozyten befinden sich unter dem Gradienten und wurden verworfen. Ficoll-Hyperpaque plus ist ein Gemisch von makromolaren Zuckern zellulärer Herkunft, ist aber vom Hersteller auf den LPS-Gehalt getestet (Endotoxin-Gehalt < 0,001 ng/ml). Dieser Wert konnte in eigenen Tests bestätigt werden. - b) Markierung der CD14-positiven Zellen
Zur weiteren Aufreinigung der Monozyten wurden die PBMC für 45 min. mit anti-CD 14-mAK inkubiert. Daraufhin wurde mit PBS gewaschen und das Zellpellet in 2 ml MACS-Puffer resuspendiert. MACS® (Miltenyi, Biotech, Bergisch Gladbach) = Magnetic activated Cell sorting; Eine Methode zur Aufreinigung von Zellen über an Metallkügelchen gebundene Antikörper; Markierte Zellen bleiben in der magnetischen Säulenmatrix hängen. [PBS w/o Ca2+/Mg2+ (Gibco) mit 5 mM Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) und Rinder-Serumalbumin (BSA); pH 7,2 durch Zugabe von HCl eingestellt). Durch Zugabe von EDTA wird das Klumpen der Zellen verhindert, was wichtig für die Aufreinigung in der Säule ist. Nun wurden die Zellen mit 50 µl Ziege-anti-Maus-IgG Microbeads unter den gleichen Bedingungen inkubiert, anschließend mit MACS-Puffer gewaschen, zentrifugiert und in 5 ml MACS-Puffer resuspendiert. - c) Anreicherung der CD14-positiven Zellen über MACS
Die Anreicherung erfolgte bei 4°C. Die VS + ®Säule wurde in den MACS-Magneten (beides Miltenyi) eingesetzt und zunächst mit 5 ml MACS-Puffer gewaschen. Zur Gewinnung einer Einzelzellsuspension wurden die Zellen durch ein Zellsieb (30 µm Maschenweite; Miltenyi) passiert und auf die Säule aufgetragen. Die Negativfraktion aus unmarkierten Zellen, die magnetisch nicht in der Säulenmatrix festgehalten wurden, liefen durch und wurden verworfen. Die Säule wurde noch zweimal mit jeweils 5 ml MACS-Puffer gewaschen, um eine möglichst reine Positivfraktion zu erhalten. Anschließend wurde die Säule aus den Magneten genommen und die spezifisch über Microbeads in der Matrix festgehaltenen Zellen unter Druck mit 5 ml Puffer in ein steriles Röhrchen gespült. Die erhaltenen Zellen wurden in der Neubauerkammer ausgezählt. In der Regel konnten durch diese Methode aus einem Buffy-coat 3 - 5 × 107 CD14-positive Zellen (Monozyten) gewonnen werden, mit einer Reinheit < 90%. Diese Zellen lassen sich vollständig durch Zytokinzugabe in DZ umwandeln.
Die isolierten CD14-positiven Zellen wurden in 12 ml c-RPMI
[(cRPMI: "RPMI 1640" (Gibco, Paisley, Schottland) mit 10%
Hitze-inaktiviertem fötalen Kälberserum, 1% L-Glutamin und 1%
Penicillin-Streptomycin), alle Bestandteile enthalten weniger
als 0,025 internationale Endotoxineinheiten/ml (Richtwert für
Aqua ad injectabilia)] aufgenommen. Um sie zu dendritischen
Zellen (DCs) ausreifen zu lassen, wurde ihnen humanes GM-CSF
für die klinische Anwendung (Leukomax 400®, Sandoz AG,
Nürnberg) in einer Konzentration von 8000 Einheiten/ml Medium
und IL-4 (Genzyme, Rüsselsheim, Charge auf LPS-Gehalt getestet:
< 0,001 ng/ml) in einer Konzentration von 500 Einheiten/ml
Medium zugegeben. Dann wurde die Zellsuspension in einer
Six-Well-Platte zu jeweils 2 ml auspipettiert und im
Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Am vierten Tag
wurden nochmals 2 ml/well c-RPMI mit GM-CSF und IL-4
dazugegeben.
- a) Fraktionierung von Hyaluronsäure und Auftrennung der
Fragmente
Aufgereinigte Hyaluronsäure (HA) aus Hahnenkämmen (Healon®; Pharmacia, für den klinischen Einsatz bestimmt, Endotoxin- Gehalt < 0,001 ng/mg) wurde zunächst mit einem Ultraschallgerät (Branson Sonifier) für 2 min. in größere Bruchstücke gespalten. Um diese Bruchstücke weiter zu zerkleinern, wurde ihnen Hyaluronidase (Typ 1 aus Rinderhoden; Sigma) zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde mit Natriumacetat auf pH 5 eingestellt, bei 37°C für 12 Std. inkubiert und anschließend durch Erhitzen auf 90°C inaktiviert. Die erhaltenen Fragmente wurden nun nach ihrer Größe aufgetrennt. Dazu wurden sie in einer 1,5 m langen Glassäule auf ein Polyacrylamidgel (Bio-Gel P-10, Bio-Rad, München) geschichtet. Als Spülflüssigkeit diente Aqua bidestillata, unter der Säule nahm ein Fraktionssammler (Pharmacia) alle 20 min. die Fraktionen auf. Die Röhrchen wurden verschlossen, kühl und lichtgeschützt gelagert. - b) Detektion der Größe der Hyaluronsäurefragmente
- 1. größere Bruckstücke nach Ultraschallzerkleinerung
Sonifizierte HA wurde in einem 5%igen Agarosegel mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Polysaccharidbanden wurden im Gel durch Färbung mit Stains-all (3,3'-Diethyl-9-methyl- 4,5,4',5'-dibenzothiacarbo-cyanin; Sigma) sichtbar gemacht. Die so erhaltenen Fragmente haben eine Größe von 10.000 bis 50.000 kDa. - 2. kleine Fragmente nach zusätzlicher Hyaluronidaseverdauung
ANTS-Markierung:
Zunächst mußten die einzelnen Proben mit dem Fluorophor ANTS markiert werden [ANTS-Lösung: 0,15 M 8-Aminonaphtalen-1,3,6- Trisulfonsäure Dinatriumsalz in Essigsäure/Wasser (3/17, v/v), durch langsames Erhitzen auf 60°C gelöst]. ANTS markiert jedes Zuckermolekül am Kettenende. Die kleinen Fragmente wurden ebenfalls mittels Gelelektrophorese unter Verwendung eines 30 Acrylamidgels aufgetrennt. Das Gel konnte nun unter UV-Licht (ANTS-Farbstoff) sichtbar gemacht und photographisch dokumentiert werden.
- 1. größere Bruckstücke nach Ultraschallzerkleinerung
- c) Quantitative Bestimmung der Hyaluronsäurekonzentration nach
der Fragmentierung und Auftrennung
Es wurden von jeder Probe 0,1 ml abgenommen und im Eisbad mit 0,6 ml Färbelösung (5,2 g di-Natrium-Tetraborat in 1 l konzentrierter Schwefelsäure) gemischt. Nun wurden jeweils 0,02 ml 0,1% Carbazol in Ethanol zugegeben, gemischt und abermals 10 min. lang gekocht. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur konnte die HA-Konzentration photometrisch bei 520 nm bestimmt werden. Als Leerwert diente Aqua dest., als Standard 0,2 µM HA/ml in Aqua dest.
Zur Stimulation wurden den Zellen am vierten Tag der
Kultivierung unterschiedliche HA-Fragmente in einer
Konzentration von 0,025 mg/ml (25 µg/ml) Medium zugesetzt. Als
Positivkontrolle dienten Lipopolysaccharide (LPS) von
Escherichia coli Serotyp 0177 (Sigma).
Um die vermehrte Expression von Oberflächenmolekülen
funktionell darzustellen, wurden die DZ vorstimuliert und für
5 Tage mit aufgereinigten naiven allogenen T-Zellen inkubiert,
die ebenfalls aus Leukozytenkonzentrat (buffy coats) gewonnen
wurden (sog. mixed leukocyte reaction, MLR). Je nach
stimulatorischer Kapazität der DZ's kommt es dabei zu mehr oder
weniger ausgeprägter T-Zellproliferation, die mittels Einbau
von radioaktiven 3H-Thymidin bestimmt wurde. Es wurden die
radioaktiven Counts per minute (Cpm) der einzelnen Proben
dargestellt, die direkt mit der stattgefundenen T-
Zellproliferation korrelieren. Man sieht, daß DZ's, die mit
kleinen HA-Fragmenten behandelt wurden, deutlich potentere
APC's sind, vergleichbar mit dem für LPS-Stimulation erhaltenen
Wert (dargestellt in Tabelle 4B).
Auch dieses Beispiel belegt, daß erfindungsgemäß mit kleinen
HA-Fragmenten zwischen 2-12 UDP-Zuckermolekülen eine deutliche
Ausreifung von DC erhalten wird, die durchaus vergleichbar ist
mit publizierten Daten anderer Methoden. Eine strenge
Abhängigkeit von einem einzelnen Zucker erscheint
unwahrscheinlich, jedoch haben größere Moleküle (20-30 UDP-
Zucker) offensichtlich keinen Einfluß, da die erfindungsgemäß
eingesetzten Fraktionen keine Unterschiede in der Wirkung
zeigen, auch wenn sie größere Fragmente enthalten. Geschallte
HA hat ebenfalls keinen Effekt.
Interessanterweise ist der erfindungsgemäße Effekt
offensichtlich spezifisch für DZ's, da mit Interferon-gamma
(IFNγ) behandelte Monozyten, die zu Makrophagen ausreifen,
keine Steigerung ihrer stimulatorischen Kapazität nach
Behandlung mit HA-Fragmenten zeigen (siehe Tabelle 4A).
Ergebnisse:
- 1. Auftrennung der erhaltenen Fragmente mittels Gelelektrophorese und ANTES-Färbung. Die erfindungsgemäß verwendeten Fragmente weisen eine Größe von 2 bis hin zu 12- fach-Zuckern auf. Die Konzentrationsmessung ergab Werte von etwa 1 mg/ml gespaltene HA. Eine weitere Aufspaltung dieser Fraktion in einzelne Zucker ist prinzipiell mittels einer HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) möglich. Die Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß besonders die kleinen Fragmente für die Stimulation verantwortlich sind.
- 2. Einfluß der DC-Stimulierung mittels HA-Fragmenten auf die Expression von Oberflächenmarkern.
Über die FACS Abbildungen kann die Oberflächendichte
verschiedener Rezeptoren mittels Antikörper festgestellt
werden. Integriert man die Fläche unter den Kurven, erhält man
die sogenannte MFI (Mean fluorescence intensity). Diese Werte
sind in der Tabelle 1 für verschiedene Rezeptoren aufgelistet.
Tabelle 1
Zur Bedeutung der einzelnen, in Tabelle 1 aufgeführten
Oberflächenmarker:
ICAM-1 ist ein fast ubiquitär vorkommendes InterCelluläres
AdhäsionsMolekül. Die Ergebnisse zeigen eine leichte
Aufregulation, wie sie bei verschiedensten Arten der
Zellaktivierung beobachtet wird. CD1a ist ein Marker für
dendritische und Langerhanszellen der Haut; während Monozyten
ausschließlich CD14 exprimieren, kommt es im Laufe der
Ausreifung immer mehr zum Verlust von CD14 und Expression von
CD1a. LPS, HA-Fragmente und MCM-Medium drängen diesen Prozeß
wieder leicht zurück, funktionelle Konsequenzen dieser
Regulation sind aber nicht bekannt.
Tabelle 2:
Tabelle 2 zeigt die Stimulierung anderer Oberflächenmarker
(CD44s, CD83 und CD115). Weiteres Anzeichen der DZ-Ausreifung
sind eine Herunterregulation von CD115 (dem G-CSF Rezeptor)
sowie eine Aufregulation von CD83, eine funktionelle Relevanz
dieser Veränderungen ist noch nicht bekannt. In der Tabelle 2
ist deutlich zu sehen, daß die Kriterien der DZ-Ausreifung
durch Stimulation mit kleinen HA-Fragmenten voll erfüllt
werden.
CD44 ist ein Adhäsionsmolekül, eine beschriebene Funktion ist
die Bindung von HA.
Tabelle 3
Tabelle 3 zeigt die Expression von weiteren Oberflächenmarkern.
Neben den Reifungsmarkern sind hier Faktoren dargestellt, die
für die Funktion der Antigen-Präsentation, d. h. der Stimulation
von T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle spielen. Hierzu
zählen das MHC Klasse II Molekül HLA-DR sowie die beiden
kostimulatorischen Faktoren B7-1 und B7-2. Ohne die
Aufregulation dieser Faktoren ist auch ein Einsatz der DZ in
den oben beschriebenen Anwendungen nicht sinnvoll.
Erfindungsgemäß wurde eine deutliche Aufregulation aller
Faktoren nach Behandlung mit HA-Fragmenten gefunden,
vergleichbar mit der maximalen Stimulation nach LPS-Gabe.
Tabelle 4
Claims (9)
1. Verfahren zur Anreicherung von dendritischen Zellen, das
folgende Schritte umfaßt:
- a) aus Blut werden mononucleäre Zellen gewonnen,
- b) Zellen, die den Oberflächenmarker CD14 aufweisen, werden angereichert,
- c) die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen werden in einem Medium kultiviert, das die Zytokine GM-CSF und IL-4 beinhaltet, und
- d) die in Schritt c) erhaltenen Zellen werden mit Hyaluron säurefragmenten kultiviert, um die irreversible Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen zu veranlassen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
mononucleären Zellen aus Blut mit Hilfe eines Dichtegradienten,
insbesondere eines Ficoll-Dichtegradienten aus einem
Leukozytenkonzentrat gewonnen werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen mit Hilfe wenigstens eines gegen den Oberflächenmarker
CD14 gerichteten Antikörper angereichert werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen in einem Medium kultiviert werden, das GM-CSF in einer
Konzentration von 5000 bis 10000 U/ml und IL-4 in einer
Konzentration von 100 bis 1000 U/ml aufweist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Zellen in Schritt d) mit
Hyaluronsäurefragmenten kultiviert werden, die 1 bis
50 Grundbausteine der Hyaluronsäure aufweisen, wobei der
Grundbaustein ein Aminodisaccharid aus D-Glucuronsäure und N-
Acetyl-D-glucosamin in ß1-3-glykosidischer Bindung ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
Hyaluronsäurefragmente jeweils 1 bis 10 Aminodisaccharide
aufweisen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen zwischen 72 Stunden und 7 Tagen in einem Medium
kultiviert werden, das GM-CSF und IL-4 enthält.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Zellen in Schritt d) für wenigstens
48 Stunden mit Hyaluronsäurefragmenten kultiviert werden.
9. Verwendung von niedermolekularen Hyaluronsäurefragmenten
für die Anreicherung von dendritischen Zellen.
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|---|---|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2000012122A2 (de) * | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Universitätsklinikum Freiburg | Niedermolekulare fragmente der hyaluronsäure zur herstellung von impfstoffen |
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| DE4412794A1 (de) * | 1994-04-14 | 1995-12-14 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, so erhaltene Zellen und Behälter zur Durchführung dieses Verfahrens |
-
1998
- 1998-01-23 DE DE19802540A patent/DE19802540C1/de not_active Expired - Fee Related
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