DE19802540C1 - Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der Hyaluronsäure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der HyaluronsäureInfo
- Publication number
- DE19802540C1 DE19802540C1 DE19802540A DE19802540A DE19802540C1 DE 19802540 C1 DE19802540 C1 DE 19802540C1 DE 19802540 A DE19802540 A DE 19802540A DE 19802540 A DE19802540 A DE 19802540A DE 19802540 C1 DE19802540 C1 DE 19802540C1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- hyaluronic acid
- dendritic cells
- surface marker
- fragments
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 23
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 15
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 10
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 8
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 9
- 101150081923 IL4 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 abstract 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 abstract 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 12
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 6
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 5
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- MPBRYMWMMKKRGC-UHFFFAOYSA-M carbocyanin DBTC Chemical compound [Br-].C1=CC=CC2=C([N+](=C(C=C(C)C=C3N(C4=C5C=CC=CC5=CC=C4S3)CC)S3)CC)C3=CC=C21 MPBRYMWMMKKRGC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 241000561734 Celosia cristata Species 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100039622 Granulocyte colony-stimulating factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 108050009363 Hyaluronidases Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- AJFXNBUVIBKWBT-UHFFFAOYSA-N disodium;boric acid;hydrogen borate Chemical compound [Na+].[Na+].OB(O)O.OB(O)O.OB(O)O.OB([O-])[O-] AJFXNBUVIBKWBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940089982 healon Drugs 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
- C12N2501/905—Hyaluronic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die Bereitstellung von dendritischen Zellen (DZ) erlangt bei
der Therapie von verschiedenen Erkrankungen eine immer größer
werdende Bedeutung. Mit Hilfe der dendritischen Zellen ist es
möglich, hochaktive Immunmodulatoren bereitzustellen, die mit
verschiedenen Antigenen, insbesondere Tumorantigenen,
Viruspeptiden oder allergen wirkenden Verbindungen beladen
werden können. Diese Zellen werden dann in der adoptiven
Immuntherapie bei Patienten mit Tumoren, Viruserkrankungen oder
Allergien eingesetzt. Es besteht daher in der adoptiven
Immuntherapie ein erheblicher Bedarf an dendritischen Zellen,
wobei diese dendritischen Zellen vorzugsweise über
standardisierte, reproduzierbare und kostengünstige Verfahren
bereitgestellt werden sollen. Diese Verfahren müssen unter
GMP-/GLP-Bedingungen durchgeführt werden können.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur
Erzeugung von dendritischen Zellen aus Stammzellen bekannt (beispiels
weise DE 44 12 794 A1).
Aus dem Knochenmark oder dem peripheren Blut von mit
Granulozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF) behandelten
Chemotherapie-Patienten können hämatopoetische Stammzellen
isoliert werden, die den Oberflächenmarker CD34 aufweisen.
Diese Stammzellen werden unter Zugabe verschiedener Zytokine
kultiviert und die dendritischen Zellen werden nach einer
verhältnismäßig langen Kultivierungszeit erhalten.
Bei einem anderen Verfahren werden Monozyten aus peripherem
Blut isoliert, die mit GM-CSF und IL-4 kultiviert werden. Zur
vollständigen Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen
müssen am Ende der Differenzierungsphase weitere Zytokine
zugesetzt werden.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weisen
verschiedene Nachteile auf. Die verhältnismäßig lange
Kultivierungsdauer ist für den Einsatz in der Klinik nicht
geeignet. Darüber hinaus können die hohen Kosten der Zytokine
und die Chargenabhängigkeit der eingesetzten Zytokine
nachteilig sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren
zur Anreicherung von ausgereiften dendritischen Zellen, das
folgende Schritte umfaßt:
- a) aus Blut werden mononukleäre Zellen gewonnen,
- b) Zellen, die den Oberflächenmarker CD14 aufweisen, werden angereichert,
- c) die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen werden in einem Medium kultiviert, das die Zytokine GM-CSF und IL-4 beinhaltet, und
- d) die in Schritt c) erhaltenen Zellen werden mit Hyaluron säurefragmenten kultiviert, um die Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen zu veranlassen.
Mononukleäre Zellen können aus Blut mit Hilfe eines
Dichtegradienten gewonnen werden, wobei in bevorzugter
Ausführungsform ein Leukozytenkonzentrat über einen Ficoll-
Dichtegradienten aufgetrennt wird.
In dem zweiten Verfahrensschritt werden die den
Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen angereichert,
bevorzugt mit Hilfe von wenigstens einem gegen den
Oberflächenmarker CD14 gerichteten Antikörper. Zum Einsatz
kommen können hier die Magnet-aktivierte Zell-Sortierung (MACS)
oder die Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FACS). Eine
einfachere, jedoch nicht so effiziente Methode stellt die
Anreicherung über Plastikadhäsion dar.
Anschließend werden die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen in einem Medium kultiviert, das GM-CSF in einer
Konzentration von 5000 bis 10000 U/ml und IL-4 in einer
Konzentration von 100 bis 1000 U/ml aufweist. Gegebenenfalls
können noch weitere geeignete Zytokine zugesetzt werden.
Schließlich werden die in dem Kultivierungsschritt erhaltenen
Zellen mit Hyaluronsäurefragmenten kultiviert, wobei diese
Fragmente 1 bis 50 Grundbausteine der Hyaluronsäure aufweisen.
Ein Grundbaustein stellt ein Aminodisaccharid aus D-
Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin in ß1-3-glycosidischer
Bindung dar. Bevorzugt eingesetzt werden Hyaluronsäurefragmente
mit jeweils 1 bis 10 Grundbausteinen.
Die Kultivierung der den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen erfolgt in einem Medium, das GM-CSF und IL-4 enthält,
bevorzugt für eine Dauer von wenigstens 72 h bis 7 Tagen.
Hieran schließt sich die Kultivierung in Schritt d) für
wenigstens 48 Stunden mit Hyaluronsäurefragmenten an. Die
Hyaluronsäurefragmente liegen bevorzugt in einer Konzentration
von 1 bis 50 µg/ml und besonders bevorzugt in einer
Konzentration von 10 bis 30 µg/ml vor.
Die vorliegende Erfindung betrifft also die Verwendung von
niedermolekularen Hyaluronsäurefragmenten für die Ausreifung
von dendritischen Zellen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können dendritische Zellen
hergestellt bzw. angereichert werden. Die dendritischen Zellen
sind Antigen präsentierende Zellen, die auf die Initiation der
primären Immunantwort spezialisiert sind. In den verschiedenen
Stadien ihrer Entwicklung übernehmen sie unterschiedliche
Funktionen. In dem unreifen Zustand sind die dendritischen
Zellen sehr effektiv beim Prozessieren von nativen Protein-
Antigenen für den MHC Klasse II-Weg. Reife dendritische Zellen
sind dagegen weniger für die Aufnahme von neuen Proteinen für
die Präsentation geeignet, stimulieren aber dafür viel besser
die ruhenden CD4+ und CD8+ T-Zellen hinsichtlich des Wachstums
und der Differenzierung.
In vivo läuft die Reifung der dendritischen Zellen dann ab,
wenn die unreifen dendritischen Zellen von den Stellen der
Antigenaufnahme zu den T-Zell-Bereichen der lymphoiden Organe
wandern. In vitro kann die Reifung in Kulturen von frisch
isolierten dendritischen Zellen beobachtet werden. Die Reifung
der dendritischen Zellen schlägt sich auch in Änderungen der
Morphologie und des Phänotyps nieder. Die Charakterisierung und
Differenzierung der dendritischen Zellen erfolgt üblicherweise
über den Nachweis verschiedener Oberflächenmarker.
Aufgrund der natürlichen Funktionen sind die dendritischen
Zellen besonders geeignet, als natürliches Adjuvans bei der
Impfung und Immuntherapie, insbesondere bei der Tumortherapie,
eingesetzt zu werden. Dabei ist es für den angestrebten
therapeutischen Einsatz entscheidend, ausgereifte DZ's zu
verwenden, die sich nach Reinfusion in den Patienten nicht
wieder zu Makrophagen-ähnlichen Vorstadien zurückdifferenzieren
können.
Man geht nach derzeitigem Wissensstand davon aus, daß die
dendritischen Zellen im unreifen Zustand das Antigen
(beispielsweise ein Tumorantigen) aufnehmen und anschließend
das Antigen prozessieren. Dabei reifen die dendritischen Zellen
und wandern zu den T-Zell-reichen Bereichen der sekundären
lymphoiden Organe. Reife dendritische Zellen exprimieren in
hohem Maße MHC, co-stimulierende Moleküle und Adhäsionsmoleküle
auf ihrer Oberfläche, wodurch eine Interaktion zwischen den
dendritischen Zellen und den T-Zellen ermöglicht wird (T-cell
clustering). Co-stimulatorische Signale werden über B7-CD28 und
CD40-CD40-Liganden-Interaktionen übertragen und durch die
Produktion von Zytokinen, wie IFN-α, IFN-γ und IL-12, die
bekannterweise die zellulär vermittelte Immunität fördern,
verstärkt.
Nach derzeitigem Wissensstand scheint es wesentlich zu sein,
daß für die Induktion von primärer T-Zellantwort spezialisierte
Antigen präsentierende Zellen vorhanden sind, da die
Präsentation von Antigenen an T-Zellen in Abwesenheit eines
zweiten Signals (Co-Stimulation) entweder das Absterben der T-
Zellen oder eine Antigen-spezifische Toleranz bewirken kann.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher
insbesondere darin zu sehen, daß die dendritischen Zellen
relativ einfach bereitgestellt werden können. Außerdem müssen
nur verhältnismäßig geringe Konzentrationen an kostspieligen
Zytokinen eingesetzt werden. Das erfindunsgemäße Verfahren
ermöglicht die Bereitstellung einer Zellpopulation, die ganz
überwiegend aus dendritischen Zellen besteht und, die sich in
einem verhältnismäßig einheitlichen (synchronen)
Reifungszustand befinden. Wenn die dendritischen Zellen für die
Präsentation von Antigenen eingesetzt werden sollen, können die
geeigneten Antigene zu einem geeigneten Zeitpunkt zu den
dendritischen Zellen zugegeben werden und die Antigene können
dann von den dendritischen Zellen im Laufe des
Reifungsprozesses prozessiert werden. Die Antigene können
entweder als Proteine, in Form von abgetöteten Zellen oder
Zellpräparationen oder auch in Form von gentechnologisch
modifizierten Zellen zugegeben werden. Wenn sich die
dendritischen Zellen in dem gewünschten Zustand befinden,
können sie für die Therapie verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Bereitstellung von
autologen dendritischen Zellen geeignet. Der Begriff "autolog"
bedeutet, daß die Ausgangszellen einem Spender (Patienten)
entnommen werden. Diese Zellen werden dann in vitro
erfindungsgemäß behandelt, um dendritische Zellen zu gewinnen.
Die angereicherten dendritischen Zellen werden dann
gegebenenfalls nach Kontakt mit dem Antigen demselben Spender,
von dem sie ursprünglich herstammen, zurückgegeben.
Alternativ hierzu kann das Verfahren auch für die
Bereitstellung von "allogenen" dendritischen Zellen verwendet
werden. Hierbei werden die Zellen von einem Spender oder auch
aus Blutkonserven, die von Blutspendediensten erhalten werden
können, hergestellt und dann an andere Empfänger zurückgegeben.
Hierdurch können standardisierte dendritische Zellen
bereitgestellt werden, die beispielsweise optimal mit einem
Tumorantigen beladen sind. Insbesondere bei viralen Infektionen
(HIV) kann so die zelluläre Immunität effektiv gesteigert
werden.
Erfindungsgemäß werden zur Ausreifung der dendritischen Zellen
Fragmente von Hyaluronsäure (HA) eingesetzt. Die Hyaluronsäure
ist ein makromolekulares Polysaccharid, das als körpereigene
Substanz vor allem in der Dermis zur Wasserspeicherung dient.
Hyaluronsäure wird vor allem von Keratinozyten in den basalen
Schichten der Oberhaut (Epidermis) sowie von Fibroblasten des
Unterhaut-Bindegewebes produziert. Hyaluronsäure findet sich
auch im Glaskörper von Augen, der Synovialflüssigkeit der
Gelenke und ist ein Bestandteil des Bindegewebes. Bei niedrigen
Konzentrationen bildet Hyaluronsäure eine hochviskose wäßrige
Lösung. Die Hyaluronsäure ist eine hochmolekulare Verbindung
mit einem Molekulargewicht zwischen 50000 Dalton und mehreren
Millionen Dalton. Der Grundbaustein der Hyaluronsäure ist ein
Aminodisaccharid, das aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-
Glucosamin in ß1-3-glycosidischer Bindung besteht. Dieser
Grundbaustein ist mit der nächsten Einheit ß1-4-glycosidisch
verbunden. Diese unverzweigte Kette der Hyaluronsäure besteht
aus etwa 2000 bis 10000 derartiger Grundeinheiten. Durch
Hyaluronidasen werden β-glucosidische Bindungen hydrolisiert
und die Hyaluronsäure wird so zu kleineren Bruchstücken
abgebaut. Erfindungsgemäß werden bevorzugt die Hyaluronidase
aus Bullenhoden oder die aus Streptococcus hyaluronicus
isolierte Hyaluronidase verwendet. Die erfindungsgemäß
eingesetzten Hyaluronsäurefragmente werden bevorzugt zunächst
mechanisch durch Scherkraft und/oder Ultraschall zerkleinert
und anschließend erfolgt ein weiterer Abbau des Polysaccharids
mit Hilfe einer geeigneten Hyaluronidase. Die gewünschten
Fragmente mit bevorzugt 1 bis 50 Grundeinheiten werden
anschließend durch geeignete Trennverfahren isoliert.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgend
beschriebenen Beispiele weiter erläutert. Bei der Durchführung
der Beispiele wurde besonders auf Verunreinigungen der
Reagenzien mit Lipopolysacchariden (LPS) geachtet.
Lipopolysaccharide sind Bestandteile aus der Zellwand Gramm
negativer Bakterien. Schon kleinste Verunreinigungen mit
Lipopolysacchariden reichen aus, um Monozyten bzw. CD14+-
Stammzellen des peripheren Blutes irreversibel zu aktivieren.
Daher wurde bei den erfindungsgemäß durchgeführten Versuchen
darauf geachtet, einen Schwellenwert von 0,01 ng/ml
Lipopolysaccharid zu unterschreiten, der erfahrungsgemäß keinen
Einfluß auf Monozyten, CD14+ Stammzellen oder dendritische
Zellen hat.
- a) Gewinnung von mononukleären Zellen (PBMC)
Ein Leukozytenkonzentrat (Buffy coat) von einem gesunden, humanen Spender wurde über einem Dichtegradienten mit Ficoll- Hyperpaque plus (Pharmacia, Uppsala, Schweden) durch Zentrifugation aufgetrennt. Die mononukleären Zellen (PBMC) lagern sich dabei in der Interphase des Gradienten ab, rote Blutkörperchen (Erythrozyten) sowie neutrophile Granulozyten befinden sich unter dem Gradienten und wurden verworfen. Ficoll-Hyperpaque plus ist ein Gemisch von makromolaren Zuckern zellulärer Herkunft, ist aber vom Hersteller auf den LPS-Gehalt getestet (Endotoxin-Gehalt < 0,001 ng/ml). Dieser Wert konnte in eigenen Tests bestätigt werden. - b) Markierung der CD14-positiven Zellen
Zur weiteren Aufreinigung der Monozyten wurden die PBMC für 45 min. mit anti-CD 14-mAK inkubiert. Daraufhin wurde mit PBS gewaschen und das Zellpellet in 2 ml MACS-Puffer resuspendiert. MACS® (Miltenyi, Biotech, Bergisch Gladbach) = Magnetic activated Cell sorting; Eine Methode zur Aufreinigung von Zellen über an Metallkügelchen gebundene Antikörper; Markierte Zellen bleiben in der magnetischen Säulenmatrix hängen. [PBS w/o Ca2+/Mg2+ (Gibco) mit 5 mM Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) und Rinder-Serumalbumin (BSA); pH 7,2 durch Zugabe von HCl eingestellt). Durch Zugabe von EDTA wird das Klumpen der Zellen verhindert, was wichtig für die Aufreinigung in der Säule ist. Nun wurden die Zellen mit 50 µl Ziege-anti-Maus-IgG Microbeads unter den gleichen Bedingungen inkubiert, anschließend mit MACS-Puffer gewaschen, zentrifugiert und in 5 ml MACS-Puffer resuspendiert. - c) Anreicherung der CD14-positiven Zellen über MACS
Die Anreicherung erfolgte bei 4°C. Die VS + ®Säule wurde in den MACS-Magneten (beides Miltenyi) eingesetzt und zunächst mit 5 ml MACS-Puffer gewaschen. Zur Gewinnung einer Einzelzellsuspension wurden die Zellen durch ein Zellsieb (30 µm Maschenweite; Miltenyi) passiert und auf die Säule aufgetragen. Die Negativfraktion aus unmarkierten Zellen, die magnetisch nicht in der Säulenmatrix festgehalten wurden, liefen durch und wurden verworfen. Die Säule wurde noch zweimal mit jeweils 5 ml MACS-Puffer gewaschen, um eine möglichst reine Positivfraktion zu erhalten. Anschließend wurde die Säule aus den Magneten genommen und die spezifisch über Microbeads in der Matrix festgehaltenen Zellen unter Druck mit 5 ml Puffer in ein steriles Röhrchen gespült. Die erhaltenen Zellen wurden in der Neubauerkammer ausgezählt. In der Regel konnten durch diese Methode aus einem Buffy-coat 3 - 5 × 107 CD14-positive Zellen (Monozyten) gewonnen werden, mit einer Reinheit < 90%. Diese Zellen lassen sich vollständig durch Zytokinzugabe in DZ umwandeln.
Die isolierten CD14-positiven Zellen wurden in 12 ml c-RPMI
[(cRPMI: "RPMI 1640" (Gibco, Paisley, Schottland) mit 10%
Hitze-inaktiviertem fötalen Kälberserum, 1% L-Glutamin und 1%
Penicillin-Streptomycin), alle Bestandteile enthalten weniger
als 0,025 internationale Endotoxineinheiten/ml (Richtwert für
Aqua ad injectabilia)] aufgenommen. Um sie zu dendritischen
Zellen (DCs) ausreifen zu lassen, wurde ihnen humanes GM-CSF
für die klinische Anwendung (Leukomax 400®, Sandoz AG,
Nürnberg) in einer Konzentration von 8000 Einheiten/ml Medium
und IL-4 (Genzyme, Rüsselsheim, Charge auf LPS-Gehalt getestet:
< 0,001 ng/ml) in einer Konzentration von 500 Einheiten/ml
Medium zugegeben. Dann wurde die Zellsuspension in einer
Six-Well-Platte zu jeweils 2 ml auspipettiert und im
Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Am vierten Tag
wurden nochmals 2 ml/well c-RPMI mit GM-CSF und IL-4
dazugegeben.
- a) Fraktionierung von Hyaluronsäure und Auftrennung der
Fragmente
Aufgereinigte Hyaluronsäure (HA) aus Hahnenkämmen (Healon®; Pharmacia, für den klinischen Einsatz bestimmt, Endotoxin- Gehalt < 0,001 ng/mg) wurde zunächst mit einem Ultraschallgerät (Branson Sonifier) für 2 min. in größere Bruchstücke gespalten. Um diese Bruchstücke weiter zu zerkleinern, wurde ihnen Hyaluronidase (Typ 1 aus Rinderhoden; Sigma) zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde mit Natriumacetat auf pH 5 eingestellt, bei 37°C für 12 Std. inkubiert und anschließend durch Erhitzen auf 90°C inaktiviert. Die erhaltenen Fragmente wurden nun nach ihrer Größe aufgetrennt. Dazu wurden sie in einer 1,5 m langen Glassäule auf ein Polyacrylamidgel (Bio-Gel P-10, Bio-Rad, München) geschichtet. Als Spülflüssigkeit diente Aqua bidestillata, unter der Säule nahm ein Fraktionssammler (Pharmacia) alle 20 min. die Fraktionen auf. Die Röhrchen wurden verschlossen, kühl und lichtgeschützt gelagert. - b) Detektion der Größe der Hyaluronsäurefragmente
- 1. größere Bruckstücke nach Ultraschallzerkleinerung
Sonifizierte HA wurde in einem 5%igen Agarosegel mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Polysaccharidbanden wurden im Gel durch Färbung mit Stains-all (3,3'-Diethyl-9-methyl- 4,5,4',5'-dibenzothiacarbo-cyanin; Sigma) sichtbar gemacht. Die so erhaltenen Fragmente haben eine Größe von 10.000 bis 50.000 kDa. - 2. kleine Fragmente nach zusätzlicher Hyaluronidaseverdauung
ANTS-Markierung:
Zunächst mußten die einzelnen Proben mit dem Fluorophor ANTS markiert werden [ANTS-Lösung: 0,15 M 8-Aminonaphtalen-1,3,6- Trisulfonsäure Dinatriumsalz in Essigsäure/Wasser (3/17, v/v), durch langsames Erhitzen auf 60°C gelöst]. ANTS markiert jedes Zuckermolekül am Kettenende. Die kleinen Fragmente wurden ebenfalls mittels Gelelektrophorese unter Verwendung eines 30 Acrylamidgels aufgetrennt. Das Gel konnte nun unter UV-Licht (ANTS-Farbstoff) sichtbar gemacht und photographisch dokumentiert werden.
- 1. größere Bruckstücke nach Ultraschallzerkleinerung
- c) Quantitative Bestimmung der Hyaluronsäurekonzentration nach
der Fragmentierung und Auftrennung
Es wurden von jeder Probe 0,1 ml abgenommen und im Eisbad mit 0,6 ml Färbelösung (5,2 g di-Natrium-Tetraborat in 1 l konzentrierter Schwefelsäure) gemischt. Nun wurden jeweils 0,02 ml 0,1% Carbazol in Ethanol zugegeben, gemischt und abermals 10 min. lang gekocht. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur konnte die HA-Konzentration photometrisch bei 520 nm bestimmt werden. Als Leerwert diente Aqua dest., als Standard 0,2 µM HA/ml in Aqua dest.
Zur Stimulation wurden den Zellen am vierten Tag der
Kultivierung unterschiedliche HA-Fragmente in einer
Konzentration von 0,025 mg/ml (25 µg/ml) Medium zugesetzt. Als
Positivkontrolle dienten Lipopolysaccharide (LPS) von
Escherichia coli Serotyp 0177 (Sigma).
Um die vermehrte Expression von Oberflächenmolekülen
funktionell darzustellen, wurden die DZ vorstimuliert und für
5 Tage mit aufgereinigten naiven allogenen T-Zellen inkubiert,
die ebenfalls aus Leukozytenkonzentrat (buffy coats) gewonnen
wurden (sog. mixed leukocyte reaction, MLR). Je nach
stimulatorischer Kapazität der DZ's kommt es dabei zu mehr oder
weniger ausgeprägter T-Zellproliferation, die mittels Einbau
von radioaktiven 3H-Thymidin bestimmt wurde. Es wurden die
radioaktiven Counts per minute (Cpm) der einzelnen Proben
dargestellt, die direkt mit der stattgefundenen T-
Zellproliferation korrelieren. Man sieht, daß DZ's, die mit
kleinen HA-Fragmenten behandelt wurden, deutlich potentere
APC's sind, vergleichbar mit dem für LPS-Stimulation erhaltenen
Wert (dargestellt in Tabelle 4B).
Auch dieses Beispiel belegt, daß erfindungsgemäß mit kleinen
HA-Fragmenten zwischen 2-12 UDP-Zuckermolekülen eine deutliche
Ausreifung von DC erhalten wird, die durchaus vergleichbar ist
mit publizierten Daten anderer Methoden. Eine strenge
Abhängigkeit von einem einzelnen Zucker erscheint
unwahrscheinlich, jedoch haben größere Moleküle (20-30 UDP-
Zucker) offensichtlich keinen Einfluß, da die erfindungsgemäß
eingesetzten Fraktionen keine Unterschiede in der Wirkung
zeigen, auch wenn sie größere Fragmente enthalten. Geschallte
HA hat ebenfalls keinen Effekt.
Interessanterweise ist der erfindungsgemäße Effekt
offensichtlich spezifisch für DZ's, da mit Interferon-gamma
(IFNγ) behandelte Monozyten, die zu Makrophagen ausreifen,
keine Steigerung ihrer stimulatorischen Kapazität nach
Behandlung mit HA-Fragmenten zeigen (siehe Tabelle 4A).
Ergebnisse:
- 1. Auftrennung der erhaltenen Fragmente mittels Gelelektrophorese und ANTES-Färbung. Die erfindungsgemäß verwendeten Fragmente weisen eine Größe von 2 bis hin zu 12- fach-Zuckern auf. Die Konzentrationsmessung ergab Werte von etwa 1 mg/ml gespaltene HA. Eine weitere Aufspaltung dieser Fraktion in einzelne Zucker ist prinzipiell mittels einer HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) möglich. Die Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß besonders die kleinen Fragmente für die Stimulation verantwortlich sind.
- 2. Einfluß der DC-Stimulierung mittels HA-Fragmenten auf die Expression von Oberflächenmarkern.
Über die FACS Abbildungen kann die Oberflächendichte
verschiedener Rezeptoren mittels Antikörper festgestellt
werden. Integriert man die Fläche unter den Kurven, erhält man
die sogenannte MFI (Mean fluorescence intensity). Diese Werte
sind in der Tabelle 1 für verschiedene Rezeptoren aufgelistet.
Tabelle 1
Zur Bedeutung der einzelnen, in Tabelle 1 aufgeführten
Oberflächenmarker:
ICAM-1 ist ein fast ubiquitär vorkommendes InterCelluläres
AdhäsionsMolekül. Die Ergebnisse zeigen eine leichte
Aufregulation, wie sie bei verschiedensten Arten der
Zellaktivierung beobachtet wird. CD1a ist ein Marker für
dendritische und Langerhanszellen der Haut; während Monozyten
ausschließlich CD14 exprimieren, kommt es im Laufe der
Ausreifung immer mehr zum Verlust von CD14 und Expression von
CD1a. LPS, HA-Fragmente und MCM-Medium drängen diesen Prozeß
wieder leicht zurück, funktionelle Konsequenzen dieser
Regulation sind aber nicht bekannt.
Tabelle 2:
Tabelle 2 zeigt die Stimulierung anderer Oberflächenmarker
(CD44s, CD83 und CD115). Weiteres Anzeichen der DZ-Ausreifung
sind eine Herunterregulation von CD115 (dem G-CSF Rezeptor)
sowie eine Aufregulation von CD83, eine funktionelle Relevanz
dieser Veränderungen ist noch nicht bekannt. In der Tabelle 2
ist deutlich zu sehen, daß die Kriterien der DZ-Ausreifung
durch Stimulation mit kleinen HA-Fragmenten voll erfüllt
werden.
CD44 ist ein Adhäsionsmolekül, eine beschriebene Funktion ist
die Bindung von HA.
Tabelle 3
Tabelle 3 zeigt die Expression von weiteren Oberflächenmarkern.
Neben den Reifungsmarkern sind hier Faktoren dargestellt, die
für die Funktion der Antigen-Präsentation, d. h. der Stimulation
von T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle spielen. Hierzu
zählen das MHC Klasse II Molekül HLA-DR sowie die beiden
kostimulatorischen Faktoren B7-1 und B7-2. Ohne die
Aufregulation dieser Faktoren ist auch ein Einsatz der DZ in
den oben beschriebenen Anwendungen nicht sinnvoll.
Erfindungsgemäß wurde eine deutliche Aufregulation aller
Faktoren nach Behandlung mit HA-Fragmenten gefunden,
vergleichbar mit der maximalen Stimulation nach LPS-Gabe.
Tabelle 4
Claims (9)
1. Verfahren zur Anreicherung von dendritischen Zellen, das
folgende Schritte umfaßt:
- a) aus Blut werden mononucleäre Zellen gewonnen,
- b) Zellen, die den Oberflächenmarker CD14 aufweisen, werden angereichert,
- c) die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden Zellen werden in einem Medium kultiviert, das die Zytokine GM-CSF und IL-4 beinhaltet, und
- d) die in Schritt c) erhaltenen Zellen werden mit Hyaluron säurefragmenten kultiviert, um die irreversible Ausreifung der Zellen zu dendritischen Zellen zu veranlassen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
mononucleären Zellen aus Blut mit Hilfe eines Dichtegradienten,
insbesondere eines Ficoll-Dichtegradienten aus einem
Leukozytenkonzentrat gewonnen werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen mit Hilfe wenigstens eines gegen den Oberflächenmarker
CD14 gerichteten Antikörper angereichert werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen in einem Medium kultiviert werden, das GM-CSF in einer
Konzentration von 5000 bis 10000 U/ml und IL-4 in einer
Konzentration von 100 bis 1000 U/ml aufweist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Zellen in Schritt d) mit
Hyaluronsäurefragmenten kultiviert werden, die 1 bis
50 Grundbausteine der Hyaluronsäure aufweisen, wobei der
Grundbaustein ein Aminodisaccharid aus D-Glucuronsäure und N-
Acetyl-D-glucosamin in ß1-3-glykosidischer Bindung ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
Hyaluronsäurefragmente jeweils 1 bis 10 Aminodisaccharide
aufweisen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die den Oberflächenmarker CD14 aufweisenden
Zellen zwischen 72 Stunden und 7 Tagen in einem Medium
kultiviert werden, das GM-CSF und IL-4 enthält.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Zellen in Schritt d) für wenigstens
48 Stunden mit Hyaluronsäurefragmenten kultiviert werden.
9. Verwendung von niedermolekularen Hyaluronsäurefragmenten
für die Anreicherung von dendritischen Zellen.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19802540A DE19802540C1 (de) | 1998-01-23 | 1998-01-23 | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der Hyaluronsäure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19802540A DE19802540C1 (de) | 1998-01-23 | 1998-01-23 | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der Hyaluronsäure |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19802540C1 true DE19802540C1 (de) | 1998-11-19 |
Family
ID=7855479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19802540A Expired - Fee Related DE19802540C1 (de) | 1998-01-23 | 1998-01-23 | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der Hyaluronsäure |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19802540C1 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000012122A2 (de) * | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Universitätsklinikum Freiburg | Niedermolekulare fragmente der hyaluronsäure zur herstellung von impfstoffen |
| DE19853066A1 (de) * | 1998-11-17 | 2000-05-25 | Univ Ludwigs Albert | Niedermolekulare Fragmente der Hyaluronsäure zur Herstellung von Impfstoffen |
| WO2000047163A2 (fr) * | 1999-02-11 | 2000-08-17 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Utilisation de l'acide hyaluronique ou des fragments de celle-ci pour la regulation de la differenciation hematopoietique |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4412794A1 (de) * | 1994-04-14 | 1995-12-14 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, so erhaltene Zellen und Behälter zur Durchführung dieses Verfahrens |
-
1998
- 1998-01-23 DE DE19802540A patent/DE19802540C1/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4412794A1 (de) * | 1994-04-14 | 1995-12-14 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, so erhaltene Zellen und Behälter zur Durchführung dieses Verfahrens |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000012122A2 (de) * | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Universitätsklinikum Freiburg | Niedermolekulare fragmente der hyaluronsäure zur herstellung von impfstoffen |
| WO2000012122A3 (de) * | 1998-08-27 | 2000-06-22 | Universitaetsklinikum Freiburg | Niedermolekulare fragmente der hyaluronsäure zur herstellung von impfstoffen |
| US6838086B1 (en) | 1998-08-27 | 2005-01-04 | Universitaetsklinikum Freiburg | Composition comprising low molecular weight hyaluronic acid fragments |
| DE19853066A1 (de) * | 1998-11-17 | 2000-05-25 | Univ Ludwigs Albert | Niedermolekulare Fragmente der Hyaluronsäure zur Herstellung von Impfstoffen |
| WO2000047163A2 (fr) * | 1999-02-11 | 2000-08-17 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Utilisation de l'acide hyaluronique ou des fragments de celle-ci pour la regulation de la differenciation hematopoietique |
| FR2789587A1 (fr) * | 1999-02-11 | 2000-08-18 | Inst Nat Sante Rech Med | Moyens pour la regulation de la differenciation hematopoietique |
| WO2000047163A3 (fr) * | 1999-02-11 | 2001-04-26 | Inst Nat Sante Rech Med | Utilisation de l'acide hyaluronique ou des fragments de celle-ci pour la regulation de la differenciation hematopoietique |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5849589A (en) | Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells | |
| DE69328481T2 (de) | In vitro bildung von dentritischen zellen | |
| DE69729455T2 (de) | Methode und zusammensetzungen zum erlangen reifer dendritischer zellen | |
| WO1995028479A1 (de) | Verfahren zur herstellung von dendritischen zellen, so erhaltene zellen und behälter zur durchführung dieses verfahrens | |
| Weigt et al. | Synthetic mycoplasma-derived lipopeptide MALP-2 induces maturation and function of dendritic cells | |
| DE69734989T2 (de) | Antigenpräsentierende zellen, ein verfahren zur deren herstellung und deren verwendung als zelluläre impfstoffen | |
| Moser et al. | Interleukin-4 induces tissue eosinophilia in mice: correlation with its in vitro capacity to stimulate the endothelial cell-dependent selective transmigration of human eosinophils | |
| DE60209915T2 (de) | Prozess zur herstellung reifer dendritischer zellen und eines impfstoffes | |
| KB | Milk protein droplet formation in the Golgi apparatus of the C3H/Crgl mouse mammary epithelial cells. | |
| EP4394031A1 (de) | Mesenchymale stammzelle und exosom davon durch behandlung von mindestens zwei zytokinen von il4, il21 und il27 sowie verwendung davon | |
| Jakobovits et al. | Acquisition of mitogenic responsiveness by nonresponding lymphocytes upon insertion of appropriate membrane components. | |
| Sato et al. | Prevention of spontaneous degeneration of mouse oocytes in culture by ovarian glycosaminoglycans | |
| JP5860871B2 (ja) | 新規免疫アジュバント化合物およびその使用 | |
| JP2002514408A (ja) | 新規アポトーシス小体、それを含有する単球由来細胞、それらの調製方法、及びワクチンとしてのそれらの使用 | |
| US9410143B1 (en) | Biological molecules produced by electromagnetically stimulating living mammalian cells | |
| WO2000012122A2 (de) | Niedermolekulare fragmente der hyaluronsäure zur herstellung von impfstoffen | |
| US20110177036A1 (en) | Whole blood cultures comprising stimulated immune cells, and use thereof as medicaments | |
| US20130131009A1 (en) | Compositions Comprising High Molecular Weight Hyaluronic Acid and Methods For Producing Same | |
| Squaiella et al. | In vivo and in vitro effect of killed Propionibacterium acnes and its purified soluble polysaccharide on mouse bone marrow stem cells and dendritic cell differentiation | |
| DE19802540C1 (de) | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der Hyaluronsäure | |
| DE60117167T2 (de) | Verfahren zur herstellung von submikropartikel-suspensionen pharmazeutischer substanzen | |
| JP5172864B2 (ja) | 抗腫瘍ワクチン、抗腫瘍ワクチンの調製方法及び抗腫瘍免疫療法の実行方法 | |
| DE60111490T2 (de) | Herstellung von vakzinen unter der verwendung von hybrid-zellen | |
| DE19839113A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen mit niedermolekularen Fragmenten der Hyaluronsäure | |
| WO2024045404A1 (zh) | 一种骨髓上清液及其在细胞培养中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8100 | Publication of patent without earlier publication of application | ||
| D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |