JP2006008705A - 二次的な組織変性のcxcl10処置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、中枢神経系損傷に関連する二次的な組織変性を有する被験体に、10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)に特異的な中和剤の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【選択図】 なし
Description
CNSは脳および脊髄からなり、これらは、神経細胞、支持細胞および神経線維を含む連続した系を形成する。脳は、明確な領域および層を有する認知器官であり、領域および層の各々は、感覚器官から受信される特定の刺激の受信および処理に関連する。ヒト脳は、3つの主要領域に分けられ、その各々は以下の明確な機能を有する:終脳(前脳)(forebrain (prosencephalon))、中脳(中脳)(mid−brain(mesencephalon))および後脳(菱脳)(hindbrain(rhombencephalon))。脊髄はセグメントに並び、このセグメントは、身体の上部における移動および感覚を制御するより高いにセグメント、ならびに身体の下部を制御するより低いセグメントを有する。CNS損傷の結果は、その構成器官の組織化に反映する。
な組織変性)を処置するためのさらなる方法を有する必要が存在する。本発明は、この必要性を満足させ、そして関係する利点も提供する。
(項目1)
被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、中枢神経系損傷に関連する二次的な組織変性を有する被験体に、10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)に特異的な中和剤の有効量を投与する工程を包含する、方法。
(項目2)
前記被験体が哺乳動物である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記被験体がヒトである、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記中枢神経系損傷が脊髄損傷である、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記中枢神経系損傷が脳損傷である、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)に特異的な中和剤が、抗CXCL10抗体である、項目1に記載の方法。
(項目7)
被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)に特異的に結合し得る抗体またはそのフラグメントの有効量を、それらを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目8)
前記中枢神経系損傷が、機械的損傷、脊髄挫傷、脊髄の圧迫損傷、脊髄の裂傷、脊髄の分断、および脱髄状態からなる群より選択される、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記脱髄状態が多発性硬化症である、項目8に記載の方法。
(項目10)
被験体における病理学的中枢神経系状態に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)に特異的に結合し得る抗体またはそのフラグメントの有効量を、それらを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目11)
前記病理学的状態がミエリン喪失である、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記ミエリン喪失が、急性播種性脳脊髄炎、感染後ミエリン喪失、ワクチン後ミエリン喪失、急性壊死性脳脊髄炎、および進行性壊死性ミエロパシーからなる群より選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記中和剤が、前記損傷の1時間以内に投与される、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記抗体またはそのフラグメントが、前記損傷の1時間以内に投与される、項目7に記載の方法。
(項目15)
前記抗体またはそのフラグメントが、前記状態の診断の1日以内に投与され、そして該投与が、さらに25日間まで毎日繰り返される、項目10に記載の方法。
(項目16)
前記中和剤が、少なくとも損傷の25日後まで毎日投与される、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記抗体またはそのフラグメントが、少なくとも損傷の25日後まで毎日投与される、請
求項7に記載の方法。
(項目18)
被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、細胞内の10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)の量を減少させ得るポリヌクレオチド剤の有効量を、それらを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目19)
前記薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群より選択され、ここで、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムはCXCL10をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する、項目18に記載の方法。
(項目20)
被験体における病理学的中枢神経系状態に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、細胞内の10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)の量を減少させ得るポリヌクレオチド剤の有効量を、それらを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目21)
前記薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群より選択され、ここで、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムはCXCL10をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記薬剤が、該薬剤によって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含有する組成物で投与される、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記抗体またはそのフラグメントが、該抗体またはそのフラグメントによって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含む組成物で投与される、項目7に記載の方法。
(項目24)
前記抗体またはそのフラグメントが、該抗体またはそのフラグメントによって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含む組成物で投与される、項目10に記載の方法。
(項目25)
前記抗体またはそのフラグメントが、該抗体またはそのフラグメントによって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含む組成物で投与される、項目18に記載の方法。
(項目26)
前記抗体またはそのフラグメントが、該抗体またはそのフラグメントによって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含む組成物で投与される、項目20に記載の方法。
(項目27)
中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させるのに使用するための組成物であって、該組成物は、CXCL10中和剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
(項目28)
中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法において使用するための、CXCL10中和剤および指示書を備える、キット。
本発明は、CNS損傷に関連する二次的な組織変性を有するか、またはそれを発症する危険性のある被験体に、10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)に特異的な中和剤の治療有効量を投与することによって、被験体における中枢神経系(CNS)損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法を提供する。本発明の方法は、脊髄損傷および脳損傷の両方の処置のために有用である。
本発明は、10kDAのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)を特定の中和剤を用いて中和することにより、脊髄損傷および脳損傷を含む、CNS損傷を処置および/または軽減する方法に関する。本発明はまた、CNS損傷または外傷と関連する二次的な組織変性を逆転させる方法、ならびに特定の中和剤を用いて10kDAのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)を中和することにより、神経細胞再生および再ミエリン化を促進する方法を提供する。
部および肢へのシグナルを制御する。最後に、S1〜S5といわれる、仙骨セグメントは、中背内の腰セグメントの直ぐ下にあり、そして鼠径部、足指、および肢のいくつかの部分へのシグナルを制御する。異なるセグメントでの脊髄損傷の影響は、この構成を反映する。
炎を含む急性の播種性脳脊髄炎(ADE)、急性の壊死性出血性脳脊髄炎、および進行性(壊死性)のミエロパシーが挙げられる。
61(1):106−119(1991))(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)。CNS損傷または外傷後の二次的な組織変性と関連するCXCL10が媒介する神経細胞死としては、壊死、アポトーシス、パラトーシス(paraptosis)または細胞死の任意のさらなる形態(例えば、筋萎縮性側索硬化症のトランスジェニックマウスモデルに記載されている(CantoおよびGurney,American Journal of Pathology 145:1271−1279(1994)(これは、本明細書中で参考として援用される))ような、神経変性細胞死)を含む、任意の機構による死が挙げられ得る。
、そして、第2に、標的細胞上の特定のGタンパク質共役細胞表面レセプターに結合することによって、細胞移動および細胞活性化を誘導する。10を超える別個のケモカインレセプター(各々は、異なるサブセットの白血球上で発現されている)が、同定されている。ケモカインレセプターは、いくつかの細胞上で構成的に発現されており、その一方で、それらのケモカインレセプターは、他の細胞上では誘導性である。CXCR3(CXCL10によって認識されているレセプター)は、Tヘルパー型1(Th 1)表現型の活性化Tリンパ球およびナチュラルキラー(NK)細胞上で発現されている。重要なことに、二次的な組織変性に関連する神経炎症の病理における主要な機構は、損傷または病巣である部位に対する活性T細胞の移動である。
を含む)を測定することによって、CNS損傷に関わる二次的な組織変性の重篤度を決定するために使用され得る。
法によって同定される、抗体、アンチセンス核酸または他の化合物を含む)は、CNS損傷に関わる二次組織損傷の重篤度を処置または低減するのに有用である。
mechanical lesions in the CNS:differences between brain and spinal cord」,Eur J Neurosci 11(10):3648−58)。脊髄損傷に対するこの強い炎症応答の制御および結果は、十分には知られていない。神経免疫相互作用の十分な理解が多発性硬化症の研究の分野において見出され得、ここで、これは、多発性硬化症のMHVモデルにおける脱髄の病理に対するTリンパ球応答の減衰が異常組織発生および挙動欠陥を減少させることを近年、実証した(Liu,M.T.,H.S.Keirstead,et
al.(2001),「Neutralization of the chemokine cxc110 reduces inflammatory cell invasion and demyelination and improves neurological function in a viral model of multiple sclerosis」,J Immunol 167(7):4091−7)。脊髄損傷の部位においてTリンパ球が優勢であり(McTigue,D.M.,M.Tani,et al.(1998),「Selective chemokine
mRNA accumulation in the rat spinal cord after contusion injury」,J Neurosci Res
53(3):368−76)、そして、最近の研究によって、これらが脊髄外傷の構造上かつ機能上の結果における中心的な役割を担っていることを示唆されており(Hauben,E.,O.Butovskyら(2000),「Passive or active immunization with myelin basic protein promotes recovery from spinal cord contusion」,J Neurosci 20(17):6421−30)(Hauben,E.,U.Nevoら(2000),「Autoimmune T cells a
s potential neuroprotective therapy for spinal cord injury」,Lancet 355(9200):286−7)、脊髄損傷部位にTリンパ球をリクルートメントすることを阻害する結果がさらに調べられた。Tリンパ球化学誘引剤CXCL10に対する抗体を機能的にブロックし得ること(Liu,M.T.,H.S.Keirsteadら(2001),「Neutralization of the chemokine cxc110 reduces
inflammatory cell invasion and demyelination and improves neurological function
in a viral model of multiple sclerosis」,J Immunol 167(7):4091−7)が、脊髄外傷の部位に対するTリンパ球の補充におけるこのケモカインの役割、および外傷後の異常組織発生および挙動欠陥に対するTリンパ球の寄与を試験する機会を提供した。本明細書中のデータによって、CXCL10が成体哺乳動物の脊髄損傷後にアップレギュレートされた(図1)こと、および損傷動物におけるCXCL10の抗体媒介性中和は、脊髄損傷後に通常は発生する劇的なTリンパ球浸潤を減少したこと(図5)を明瞭に実証した。これらのデータは、樹立されたウイルス誘導性脱髄を有するマウスに対する抗CXCL10抗血清のCNSへの投与がCD4+ Tリンパ球浸潤を有意に減少し、そしてTH1関連プロ炎症性(proinflammatory)サイトカインIFN−gの発現を減少させる(Liu,M.T.,H.S.Keirsteadら(2001),「Neutralization of the chemokine cxc110 reduces inflammatory cell invasion and demyelination and improves neurological function in a viral model of multiple sclerosis」,J Immunol
167(7):4091−7)という本発明者らの最近の実証を確定付けた。抗CXCL10処置後の脊髄損傷部位に対するTリンパ球の浸潤の減衰は、脊髄損傷の間のCXCL10が特に重要なTリンパ球化学誘引剤であり、CXCR3レセプターの発現(Rollins,B.J.(1997),「Chemokines」,Blood 90(3):909−28)と矛盾しないという強力な証拠を提供する(Luster,A.D.,J.C.Unkelessら(1985),「Gamma−interferon transcriptionally regulates an early−response gene containing homology to platelet
proteins」,Nature 315(6021):672−6)。
「Retraining the injured spinal cord」,J Physiol 533(Pt 1):15−22)。損傷した脊髄におけるシナプス形成(synaptogenesis)に関連するデータは殆ど存在しなかったが、脱神経された歯状回の良好に記録されたモデルを使用する定量的電子顕微鏡写真研究によって、実質的に多くの数の新規のシナプスが損傷後10日までに脱神経されたニューロンにおいて形成される(Steward,O.,S.L.Vinsantら(1988),「The
process of reinnervation in the dentate
gyrus of adult rats:an ultrastructural study of changes in presynaptic terminals as a result of sprouting」,J Comp Neurol 267(2):203−10)ことを示している。現在の研究における挙動の回復の機構は未知であるが、本明細書中で開示されたデータは、抗CXCL10処置が脊髄損傷後の神経学的欠陥を低減することを明瞭に示している。
dorsal hemisection of the rat spinal cord」Eur J Neurosci 6(5):712−24)(Blight,A.R.(1985)「Delayed demyelination and macrophage invasion: a candidate for secondary cell damage in spinal cord injury」Cent
Nerv Syst Trauma 2(4):299−315)(Popovich,P.G.,P.Weiら(1997)「Cellular inflammatory
response after spinal cord injury in Sprague−Dawley and Lewis rats」J Comp Neurol 377(3):443−64))。
(3):443−64)。実際に、活性化した単球食細胞は、外傷性CNS損傷の後に神経毒を放出し(Giulian,D.,M.Corpuzら(1993),「Reactive mononuclear phagocytes release neurotoxins after ischemic and traumatic injury to the central nervous system」J Neurosci Res 36(6):681−93)、NMDAレセプタター媒介性神経毒性を誘導し(Paini,D.,K.Frei,ら(1991)「Murine brain
macrophages induce NMDA receptor mediated neurotoxicity in vitro by secreting glutamate」Neurosci Lett 133:159−162)、そして活性化した白血球が、広範な種々の溶解酵素ならびに反応性酸素中間体および反応性窒素中間体を放出する(Martiney,J.A.,C.Cuffら(1998),「Cytokine−induced inflammation in the central nervous system revisited」Neurochem Res
23(3):349−59)。
ば、CXCR3レセプター)との相互作用を阻害する分子であり得る。さらに、インテグリン、増殖因子レセプターおよびケモカインレセプターのような細胞表面レセプター、ならびにCXCL10を結合するかまたは活性を低減するのに十分な親和性で結合するように作製され得る、任意の他のレセプターまたはそのフラグメントもまた、本発明の方法を実施するために有用な中和剤である。さらに、例えば、CXCL10もしくはそのレセプターの発現を阻害するレセプター、増殖因子、サイトカインまたはケモカインもまた、本発明の方法を実施するために有用な中和剤である。さらに、転写因子およびDNA複製因子のようなDNA結合性ポリペプチドは、これらがCXCL10に対する選択的な結合活性、CXCL10の発現もしくは活性を制御する調節分子、またはCXCL10の発現を制御する遺伝子領域を有する限り、用語結合分子の規定内に含まれるようである。最終的に、ランダムライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーより選択されるような、ポリペプチド、核酸および化合物はまた、それら分子が活性を低下させるのに十分な親和性でCXCL10を結合する限り、その用語の規定内に含まれる。
抗体であり得る。さらに、本明細書中に記載されるように、抗CXCL10抗体は、本発明の方法を実施するために有用な中和剤である。さらに、CXCL10は特異的なT細胞レセプターに結合することが公知の分泌タンパク質であるので、本発明の実施に有用な中和剤は、レセプターの免疫グロブリンスーパーファミリーのうちの、いずれかの結合性ポリペプチド、レセプターまたはそのフラグメントであり得る。あるいは、CXCL10に特異的なさらなる中和剤を同定するためのランダムなペプチド集団の集団を使用することが、所望され得る。当業者は、どの型のアプローチおよびどの型の中和剤が、CNS損傷に関連した二次的な組織変性に罹患した被験体において、CNS損傷に関連した二次的な組織変性の重篤度を低減するために、本発明の方法を実施するのに適切であるかを、認知するかまたは決定し得る。
びヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントを含む、天然には存在しない抗体を包含する。
づいて選択される。適切な動物としては、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターが挙げられる。これらの動物は、1回の採血につき最大で25mL、100〜200μL、および1〜2mLの血清を産生する(HarlowおよびLane、前出、1988)。ウサギは、ポリクローナル抗血清の産生のために非常に有用である。なぜなら、ウサギは、安全にそして繰り返して採血され得、かつ高容量の抗血清を産生し得るからである。例えば、フロイント完全アジュバントのような適切なアジュバント中にある15〜50μgの抗原を用いて、2〜4週間の間隔をあけて2回注射した後で、血液が収集され得、そして抗血清の分析がなされ得る。
レームワーク−CDRのコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって、機能について最適化された構造を有するモノクローナル抗体の同定が可能となる(抗原が、モノクローナル抗体においてコンフォメーション変化を誘導する場合を含む)。ヒト化を増強された改変体は、当該分野で公知の連続的なインビトロでのヒト化および親和性成熟によってヒト化された抗体よりも、少ない非ヒトフレームワーク残基を含む。
プターの特定の例としては、例えば、CXCL10を認識するCXCR3レセプターのようなT細胞レセプターまたはNK細胞レセプターが挙げられる。当該分野で公知の他のリガンドおよびリガンドレセプターが同様に、CXCL10に特異的な免疫接着物中和剤の抗原結合ドメインに使用され得る。さらに、多価および多重特異性の免疫接着物が、CXCL10中和剤として使用されるために構築され得る。CXCL10特異的中和剤として使用され得る、二重特異性抗体、免疫接着物、二重特異性免疫接着物および他のヘテロマルチマー性ポリペプチドの構築は、例えば、米国特許第5,807,706号および同第5,428,130号(これらは、本明細書中で参考として援用される)の主題である。
ションに対する利用可能性を試験することによって評価され得る。本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、核酸分子の合成に関する分野で公知の任意の方法によって調製され得る。
ックス中で投与され得、この徐放性マトリックスは、全身投与のために移植され得るかまたは標的組織部位に移植され得る。治療化合物の制御放出のために有用な企図されるマトリックスは、当該分野で周知である。そのようなマトリックスとしては、材料(例えば、DepoFoamTM、生体ポリマー、マイクロポンプなど)が挙げられる。
質からなるリポソームは、作製および投与するのが比較的簡単である、非毒性で生理学的に受容可能で代謝可能なキャリアである。
する工程を包含する。あるいは、併用療法は、CXCL10に特異的な中和剤が異種タンパク質(例えば、治療タンパク質)に結合している、融合タンパク質からなる。
してそのRNA濃度を決定した。マルチプローブセットmCK−5を使用して、CXCL10 mRNA転写物を検出した。このマルチプローブセットは、RNAローディングについてのコントロールとして使用するためにL32についてのプローブを含んだ。分析は、10μgタンパク質に対して実施した。フラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そしてフィルムオートラジオグラフィーにより可視化した。オートラジオグラフをスキャンし、画像化ソフトウェアを使用して、そのバンドを定量した。
RANTES in virus−induced central nervous
system inflammation and demyelination」J
Virol,(2000)74(3):1415〜24)。簡単に述べると、脳を取り出し、その組織を破砕することによって、単一細胞懸濁物を得た。すべての技術は、氷上の滅菌組織培養プレート上で実施した。このプレートは、10%ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地を含んだ。細胞懸濁物を15ml三角チューブに移し、Percoll(Pharmacia,Uppsala,Sweden)を、最終濃度30%添加した。1mlの70% Percollを下層に置き、そして細胞を、4℃にて1300×gで30分間遠心分離した。細胞を境界面から取り出し、そして2回洗浄した。フルオレセインイソチオシアネート結合体化(FITC)ラット抗マウスCD4および(フィコエリトリン結合体化PE)ラット抗マウスCD8(Pharmingen,San Diego,CA)を使用して、それぞれ、浸潤性CD4+ T細胞および浸潤性CD8+ T細胞を検出した。コントロールとして、アイソタイプが一致するFITC抗体およびPE抗体を使用した。細胞を、40℃で1時間、抗体とともにインキュベートし、洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中に固定し、そしてFACStar(Becton Dickinson、Mountain View,Calif.)上で分析した。CNS中に浸潤する細胞の割合を、Cell questフローサイトメトリーソフトウェアにて決定した。ポジティブの細胞を、バックグラウンドサンプルおよびコントロールサンプルの蛍光から実験サンプルの蛍光を差し引くことによって、決定した。CD4 T細胞およびCD8 T細胞の総数を、ゲートを通る集団内のポジティブ細胞の割合に、脊髄から単離した細胞の数を乗算することによって、決定した。データは、平均+標準誤差平均として提示する。
スし、そしてABC溶液(Vector Laboratories)中で室温にて30分間インキュベートした。DAB基質溶液(Vector Laboratories)を使用して、抗体の結合を可視化した。切片を増加するアルコール中で脱水した。Permount(Fisher Scientific)を、封入のために使用した。一次抗体を除去した場合に、何の免疫反応も観察されなかった。以下の改変を含んで、同じ手順を使用してニューロンを染色した:切片を一晩ブロックし、そして使用した一次抗血清はマウス抗NeuNモノクローナル(Chemicon,1:100希釈)であった。使用した二次抗体は、ビオチン化ラット吸着ウマ抗マウス抗体(Vector Laboratories,1:200希釈)であった。損傷の各側1ml中のニューロンおよびCD4ポジティブT細胞を、10×倍率で計数した。明確に標識された細胞のみを計数した。
(CNS損傷後のCXCL10レベルおよびT細胞数のアップレギュレーション)
この実施例は、CNS損傷後のCXCL10レベルおよびT細胞数のアップレギュレーションを記載する。
(CNS損傷後の損傷部位内および損傷部位周辺の、CXCL10レベルが低下したT細胞蓄積の中和)
背側ヘミセクション損傷後の抗IP−10処置の効果を決定するために、ヘミセクション損傷された成体マウスに、損傷の1日前で開始し、そして1日おきに損傷の7日後まで継続する、抗IP−10抗体(約0.5mg/ml)の腹腔内注射0.5mlを行った。このマウスを、損傷の3日後または14日後に屠殺し、そして損傷部位が解剖した組織内に中心に位置するように、脊髄を解剖した。中心管が明らかに見える縦断面を選択し、そしてデジタル化した。細胞計数について、損傷部位のいずれかの側に1ミリメートル延びた総組織面積内のCD4免疫陽性細胞の数を、立体解析を使用して決定した。上記実施例Iに記載されるように、明らかに識別可能なヘキスト染色された核を有する、免疫標識された細胞のみを、スコア付けした。
NeuNモノクローナル抗体(MAB377、Chemicon、Temecula、CA)を、製造業者の指示に従って使用した。明らかに識別可能なヘキスト染色された核を有する、免疫標識された細胞のみを、スコア付けした。NeuNを免疫染色した縦組織断面の定量的分析は、NeuN+ニューロンが、未処置のヘミセクション損傷マウスと比較して、抗CXCL1010処置したヘミセクション損傷マウスにおける損傷部位のいずれかの側に1mm延びた領域内に、増加した密度で存在することを示した。
(リンパ球浸潤に対するCXCL10抗体の効果)
CXCL10 mRNAレベルは、成体マウス脊髄に対するヘミセクション損傷の後に増大した。総RNAを、損傷後6時間目(n=3)、12時間目(n=3)、18時間目(n=3)、24時間目(n=3)、3日目(n=3)、7日目(n=3)および14日目(n=3)にて、ヘミセクション損傷脊髄から抽出し、そしてCXCL10 mRNA転写物のレベルを、CK−1ケモカインプローブセットを使用するリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)(Lane,Liuら、「A central role for CD4(+)T cells and RANTES in virus−induced central nervous system inflammation and demyelination」、J.Virol.、(2000)74(3):1415−24)によって、各時点について決定した。mRNA転写物の量を、走査型オートラジオグラフィーによって決定して、内部L32コントロールと比較して、個々のバンドの強度を決定した。CXCL10 mRNAレベルは、損傷後6時間までに、74.8±21.78の平均レベルまで上昇し、次いで徐々に減衰し、損傷の14日後でさえも基底レベルを上回ったままであり、41.57±1.80の平均レベルである(図1)。CXCL10 mRNAは、未損傷の脊髄組織においては検出不能であった。
spinal cord after contusion injury」J.Neurosci.Res.,(1998)53(3):368〜76)。
少したことを示した。
(組織スペアリングおよび機能欠失に対するCXCL10処置の効果)
外傷性の脊髄創傷に応答して減弱したCD4+Tリンパ球が、組織スペアリングまたは機能的欠失の減少に関与したか否かを決定するために、ヘミセクションした成体マウスに、抗CXCL10抗体を、創傷1日前から創傷9日後まで1日おきに腹腔内注射し、そして創傷14日後に屠殺した(n=11)。ヘミセクション創傷後の組織スペアリングは、処置しなかったヘミセクション創傷マウスと比較して、抗CXCL10抗体で処置したマウスで、有意により大きかった(n=8)。中心管が明瞭に見える縦方向の組織切片の形態学的分析を、Zhangら、(1996)(Zhang,Fujikiら,「Genetic influence on cellular reactions to spinal cord injury:a wound−healing response present in normal mice is impaired in
mice carrying a mutation(Wlds)that causes delayed Wallerian degeneration,」J.Comp.Neurol.,(1996)371(3):485−95)に記載されるようなMCID分析システムを用いて行った。処置していないヘミセクション創傷マウスは、創傷していないコントロール脊髄と比較して、創傷のいずれか一方の側が1mm拡張している組織領域全体で平均49.4%の減少を有した(図3)。対照的に、抗CXCL10抗体処置したヘミセクション創傷マウスの形態計測分析は、創傷していないコントロール脊髄と比較して、創傷のいずれか一方の側が1mm拡張している組織領域全体で20.9%の減少を示し、組織の喪失においては、処置していないヘミセクション創傷マウスと比較して、68%の減少を示す(図3)。
一方の側が1mm拡張している領域内のNeuN+ニューロンの平均総数が、267+/−72であることを示した。対称的に、抗CXCL10抗体で処置したヘミセクション創傷マウスからの縦方向の組織切片を免疫染色したNeuNの定量分析は、創傷14日後において、創傷部位のいずれか一方の側が1mm拡張している領域内のNeuN+ニューロンの平均総数が、1170+/−184であることを示し、処置していないヘミセクション創傷動物よりも438%多くのニューロンが存在している。
(挙動性欠損に対する抗CXCL10抗体処置の効果)
抗CXCL10抗体で処置したマウスにおけるヘミセクション創傷後の挙動欠損は、処置しなかったコントロールと比較して、漸進的に減少した。処置したヘミセクション創傷マウスおよび処置しなかったヘミセクション創傷マウス、ならびに非創傷コントロールマウス(n=8)を、ヘミセクション創傷1〜13日後から、処置群について盲目である2人の観察者による毎日の運動学的分析に供した。動物を、規定の1cmグリッド線を有する、3’×1’プレキシガラス表面の低部からビデオ撮影し、ビデオ編集ソフトウェアを用いて記録を分析した。4つの運動学的パラメータを評価した;前後肢のスライド長、前後肢のスライド、前後肢の回転および前後肢のつま先の広がり。これらの分析は、抗CXCL10抗体で処置した全てのヘミセクション創傷マウスが、創傷14日後における、処置しなかったヘミセクション創傷コントロールマウスよりも有意により大きな、前後肢のスライド長、有意に少ない前後肢のスライド、前後肢のつま先の広がりおよび前後肢の回転を有することを示した(図2)。進行性の挙動の改善を、創傷後の初めの3日間にわたる全ての動物についてデータ点を、創傷後の最後の3日間にわたる全ての動物についてのデータ点と、各々の運動学的パラメータについて比較することによって評価した。処置しなかったヘミセクション創傷マウスは、回復期間の間、運動学的パラメータにおいて、変化を示さなかった(p>0.05)。対称的に、処置したヘミセクション創傷マウスは、回復期間の間、全ての運動学的パラメータにおいて、統計的に有意な進行性の改善を示した(p<0.01)。創傷14日後までに、処置したヘミセクション創傷マウスの4つの全ての挙動学的パラメータについて、挙動スコアは、非創傷コントロールマウスと有意に違わなかった。
Claims (1)
- 被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、中枢神経系損傷に関連する二次的な組織変性を有する被験体に、10kDaのインターフェロン誘導性タンパク質(CXCL10)に特異的な中和剤の有効量を投与する工程を包含する、方法。
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