JPH08505855A

JPH08505855A - 炎症を促進する細胞の経内皮移動を調節する方法および関連するその測定方法

Info

Publication number: JPH08505855A
Application number: JP6516312A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムエイマーラー
Original assignee: ザロックフェラーユニヴァーシティ
Priority date: 1993-01-12
Filing date: 1994-01-12
Publication date: 1996-06-25
Also published as: EP0675735A1; AU6122894A; AU6799898A; WO1994015641A1; HU9502116D0; KR960700071A; CA2153776A1; HUT73462A

Abstract

(57)【要約】抗−ＰＥＣＡＭ−１の投与によって、急性及び／又は慢性の炎症の際の白血球及び他の細胞の経内皮移動を阻害することができる。特に、好中球及び単球ＴＥＭの阻害が、組換え可溶性ＰＥＣＡＭ又はモノクローナル抗−ＰＥＣＡＭ抗体の存在下で起こることから、経内皮移動は、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）の活性により媒介されていると思われる。経内皮移動を調節する方法及び対応する薬剤、並びに関連する診断方法及び薬剤発見検定法が開示される。この経内皮移動の阻害は炎症における器官の損傷の防止及び／又は軽減に役割を果たす。この方法は特に、慢性炎症の処置、及び急性炎症の処置に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】炎症を促進する細胞の経内皮移動を調節する方法および関連するその測定方法本発明につながる研究の一部は、ナショナルインスティチューツオブヘルス（ National Institutes of Health）からの承認番号HL-46849およびAI24775により提供された資金で行われた。発明の技術分野本発明は、一般的には内皮を横切る白血球および類似細胞の移動に関連し、より特定的にはこのような移行の調節およびその炎症に及ぼす効果に関するものである。発明の技術的背景炎症は、感染または傷害に対する、血管の分布する組織の応答である。臨床的に、この炎症は４つの標準的な徴候、即ち赤瘢、発熱、痛みおよび腫れを伴う。その経過は急性または慢性のいずれかであり得る。細胞レベルでは、炎症は、血管の内皮壁への白血球の付着およびその回りの組織への白血球の浸潤を含む（ハーラン（Harlan），1985）。急性の炎症は、多形核白血球（PMN）の付着および浸潤により特徴付けられる（ハーラン（Harlan），1987およびマレヒ＆ガリン（Malech and Gallin），1987）。組織へのPMNへの蓄積は、炎症性の剌激があった後2・1/2〜４時間の間に開始され、１〜２日後にそのピークに達するかあるいは停止される（ベビラッカ＆ギンブロン（Bevilacq ua and Gimbrone），1987）。慢性的炎症は、他の白血球、特に単球およびリンパ細胞の付着および浸潤により特徴付けられる。白血球は血管内皮の内腔表面に結合し、次いで体組織内の堅固にくっつき合った内皮細胞間を移動することにより、循環系から離れる（マーチェシ（Marchesi），1961；マーチェシ＆フローリー（Florey），1960）。この過程は幾つかの状況においては本質的なものである。例えば、単球は低頻度で該循環系を離れて、組織マクロファージとなる（ファンファース（van Furth），1986）。循環するリンパ細胞は、リンパ様組織中の分化された高内皮細静脈（HEV）と結合し、かつこれを横切って移動することにより、リンパ節に入る（ラスキー（Lasky），1992；スツールマン（Stoolman），1989）。この過程は、分化されたリンパ節により制限された該HEV上のカウンターレセプタの識別および該レセプタへのL-セレクチン（selectin）の結合を包含する（ガラチン（ Gallatin）等，1983；ガラチン（Gallatin），1986）。炎症の該過程中、白血球は大量に、該内皮上のサイトカイン誘起細胞付着分子（CAMs）を識別し、かつこれと結合することにより、該炎症サイトへ遊出する（スプリンガー（Springer），1990；オズボーン（Osborn），1990；ポバー＆コトラン（Pober and Cotran），1990）。単球が罹患した動脈の内膜下に選択的に遊出した場合には、じゅく腫形成初期に、一つの関連する過程が起こる可能性がある（ロス（Ross），1986）。正常な炎症において、浸潤する白血球は侵入した生物または死細胞を貧食し、組織の治癒および免疫応答においてある役割を果たす。しかしながら、発熱性の炎症の場合、浸潤する白血球は、重度のおよびしばしば致死的な損害を与える恐れがある。リウマトイド関節炎およびじゅく状硬化症は慢性的炎症性疾患の例であり、そこでは単核白血球が組織に浸潤し、かつ損傷を与える（ヒュー＆ソコロフ（Hough and Sokoloff），1985；ロス（Ross），1986）。多重器官傷害症候群、成人呼吸不全症候群（ARDS）および出血性再灌流傷害（ischemic reperfusion injury）は急性炎症であり、浸潤するPMNsが損傷を生ずる（ハーラン（Harlan ），1987；マレヒ＆ガリン（Malech and Gallin），1987）。重度の火傷と関連したもの等のショック後に起こる可能性のある、多重器官傷害症候群において、 PMN-媒介損傷は該傷害を悪化させる。ARDSにおいて、白血球の流入は、細胞間炎症に急性的並びに慢性的に寄与し、肺疾患をもたらす。組織が血液の供給を停止され、血液の突然の灌流を受けた場合（例えば、心臓発作、卒中、または四肢再付着（limb re-attachment）に起こる出血性再灌流傷害において、PMNの付着が重度の組織傷害を生ずる（ハーラン（Harlan），1987）。成人呼吸不全症候群（ARDS）は感染性または非−感染性両者の原因で生ずる可能性があり、いずれの場合もPMNの遊出の結果として、同様な病理をもたらす。肺炎球菌性髄膜炎の致死性は、髄膜の炎症の量と直接関連付けることができる（マックアリスター（McAllister）等，J．Infect．Dis.，1975，132，pp．355-36 0）。かくして、抗生物質での治療中に炎症を軽減する方法が、感染、特に内毒素によるショックおよび感染に関連するARDSの治療において有利であろう。上に述べたことは、白血球の組織への遊出が有害な病理の発端となるあるいは該病理の原因となる幾つかの特定の疾患および病理の例である。これまでの研究は白血球の付着に焦点が当てられ、また白血球の付着が浸潤の第一段階であるとの仮定に基いて、研究者等は現在まで、内皮細胞表面への白血球の結合のメカニズムに着目していた。これら研究は、この結合が内皮細胞およびレセプタおよびリガンドとして機能する白血球両者上の細胞表面分子によって媒介されることを示している（ハーラン（Harlan）等，1987；ダナ（Dana）等，1986；ベビラッカ（Bevilacqua）等，1987a）。炎症中に、幾つかの炎症性の薬物が白血球に作用して、これらを内皮に対して著しく付着性のものとする可能性がある。公知の炎症性薬物はロイコトリエン-B 4（LTB4）、捕因子5a（C5a）およびホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（FMLP）を包含する。これらの薬物は、現在β₂インテグリンとして知られる一群のタンパク質を活性化する。これらのインテグリン類はCD11およびCD 18タンパクのダイマーである。該β₂インテグリンの一種、CD11A/CD18（LFA1とも呼ばれる）はICAM1（細胞間付着分子）と呼ばれる内皮細胞上のレセプタに結合する。研究者等は、β₂インテグリンに対するモノクローナル抗体（mAbs）がインビトロでの、内皮へのPMNの付着を阻害することを示し（ハーラン（Harlan ）等，Blood，1985，66，p．167）、またこれらの同一または類似の抗体が、インビボでの同一の過程を阻止することを、後になって立証した（アルホルス（Ar fors）等，Blood，1987，69，p．338；テダー（Tedder）等，1988；トッド（Tod d），1989）。他の炎症性の薬物も、実質的に白血球の付着を増進するように、内皮細胞に直接作用する。これら薬物はサイトカイン、インターロイキン-1（IL-1）および腫瘍壊死因子（TNF）並びにバクテリア内毒素、リポポリサッカライド（LPS）を包含する。例えば、IL-1は、ヒト内皮細胞の単層に対するPMN、単球、および関連する細胞系、即ちHL-60（PMN-類似）およびU937（単球−類似）の付着を剌激することが示された。この作用は時間−依存性かつタンパク合成依存性である（ベビラッカ（Bevilacqua）等，1987a；ベビラッカ等，1987b）ベビラッカ等，1985 ）。これらのサイトカインは、表面付着分子に関して、内皮細胞に及ぼす幾つかの作用の一つをもつことができる。これらは付着分子の新たな合成を誘起でき、例えばIL-1およびTNFの場合には、E-セレクチンおよびVCAM1の発現を誘発する（オズボーン（Osborn），1990）。これらは、また予め存在する付着分子の発現、例えばこれら２種のサイトカインのICAM1への作用をも増進できる。これらは、例えばトロンビンまたはヒスタミンにより内皮細胞を剌激した後のP-セレクチンの表面発現の場合のように、予め存在する付着分子の、脱顆粒による細胞内区画から細胞表面への再配列をも起こすことができる。付着分子の研究は、ニューマン（Newman）等，Science，1990，247，pp．1157 -1264およびブラッドセンタオブサウスイースタンウイスコンシン社（Blood Cen ter of Southeastern Wisconsin，Inc.）の1991年７月25日付けのPCT公開No．WO 91/10683によって最初に同定された血小板／内皮細胞付着分子-1、即ちPECAM-1 （PECAM）として知られる特定の分子にまで拡張された。PECAMの配列は同定され、また組み換えヒトPECAM-1（mPECAM-1）が開示された。PECAM-1に対する抗体の参考資料をも含む、この開示の初期の目的は、該発見された分子の活性に関連している。というのは、これが血小板の内皮細胞膜に対する潜在的な結合に関連しているからである。かくして、PECAMの利用並びに活性は、血小板表面の認識および結合との関連で開示された。上記研究の大部分は、感染および潜在的な炎症の原位置に、白血球の補充および移動用の成分として結合する内皮細胞に関する基本的な考えを扱っているが、内皮を横切る白血球および類似の細胞の移行におけるPECAM-1の役割については何等開示していない。この開示に先立って、かかる移行の正確な特徴が、殆ど推測の域を出ておらず、従って該内皮を横切る白血球の移動の調節に関する考察はまだ与えられていなかった。本発明者は、該内皮の細胞間領域を横切る細胞の移動を研究し、またミューラー（Muller）等はJ．Exp．Med.，1989，170，pp．399-414において、内皮細胞間の接続部に高い濃度で存在する、ヒト内皮細胞膜タンパク質に対する二十日ネズミのモノクローナル抗体を生成した。しかしながら、当時、同定された原形質膜タンパク質によって演じられる正確な役割に関しては何も示されず、またこれに対して抗体が演じるであろう役割の重要性も見出し得なかった。 PECAMに関する更なる研究により、インビトロにおける強力な付着性媒介体が同定された。例えば、アルベルダ（Albelda）等はJ．Cell Biol.，1991，114（5 ）， pp．1059-1068において、PECAM-1につき更に論評し、PECAM-1が細胞−細胞付着を媒介することを指摘した。アルベルダ等は細胞間接合部におけるPECAM-1 の濃度を示し、かつPECAM-1が細胞−細胞付着に関与する可能性があるという一般的結論を示したが、このような役割の特定のメカニズムは依然未知のままである。即ち、アルベルダ等は、PECAM-1が特異抗体的、カルシウム−依存性様式で作用し、従って特異抗体的凝集を示す他の免疫グロブリン上科分子とは異なるように機能するものと考察した（同上，1066）。結果として、PECAMの機能の正確なメカニズムおよびその役割、内皮細胞付着において演じる可能性のあるその役割は依然不明である。シメンチ（Schimmenti）等は、J．CELL Phys.，1992，153，pp．417-428において、細胞−細胞付着におけるPECAM-1の役割に関するアルベルダの発見を取り上げ、相互に関するPECAM-トランスフェクション3T3の移動に及ぼす、細胞付着分子としてのPECAM-1の役割を研究した（同上，418）。PECAM-1がシート移動（s heet migration）率を阻害するという、シメンチ等の発見は、アルベルダ等の発見を補充するが、内皮細胞間の相互作用を越えて展開されることはなかった。 PECAMによって演じられる役割の更なる説明は、ミューラー（Muller）等J．Ex p．Med.，1992，175，pp．1401-1404では達成されなかった。この論文では、PEC AM-依存性凝集アッセイにおいて安定にトランスフェクションされたＬ細胞を使用した実験により、該PECAM-依存性凝集が異好性であり、かつ共存するマグネシウムおよびカルシウムイオンによって影響されることが結論された。PECAM-1の付着活性に関するこれら研究にも拘らず、該提案された分子に関する更なる生理的役割は見られなかった。ミューラー（Muller）等J．Exp．Med.，1992，176，pp．819-828は、インビトロアッセイによって単球の結合および移行の研究を記載しており、該アッセイではまず未活性化内皮単層を横切るMo経内皮移動活性を調べ、堅固な尖端表面結合がこのような移動における律速段階であり、またβ₂インテグリン鎖CD18に対する抗体がこの堅固な尖端表面結合の実質的部分を阻止するように機能するであろうことを結論付けた。上記ミューラー（Muller）等の研究は主として単球移動に向けられ、β₂インテグリンを含む付着が、単球TEMに優先するはずの主な事象であると結論付けた。そのまま、該著者等はCD11/CD18錯体およびそのレセプタが付着の大部分に対して応答可能になるものと結論付けた。ボーゲン（Bogen）等は「抗原剌激に伴う、移行性リンパ細胞との二十日ネズミCD31の結合」と題する論文（Am．J．Pathol.，1992，141，pp．843-854）において、2H8として同定されたモノクローナル抗体の調製およびこの抗体を含有する上澄への反応性二十日ネズミリンパ節の接種について論じている。この抗体は、本発明の実験の幾つかにおいて、本発明者により使用された。免疫細胞化学的手法を利用して、これら著者等は、移行性のリンパ細胞との関連で、2H8およびその抗原の効果を決定すべく研究した。ボーゲン（Bogen）等の論文に提示されたデータの殆どは、該2H8抗体および該抗体による二十日ネズミ型のCD31（PECAM ）の識別の立証に向けられている。該データの一部は、免疫化後の、2H8と反応性のリンパ節の消失におけるリンパ細胞の増加を証明するのに費やされている。しかしながら、CD31がこの過程において原因となる役割をもつことを立証しておらず、あるいはリンパ細胞サブセットのマーカー以外のなにかである。事実、ボーゲン（Bogen）等は本発明とはかけ離れたものを教示する証拠を提示している。例えば、彼等は免疫電子顕微鏡データを提示（ボーゲン等の論文の第４および５図を参照）しており、これらはリンパ細胞が内皮細胞境界を横切って移動すればする程、PECAMを発現しなくなることを示すものとして解釈されている。これは移行における負の調節的役割をもつPECAMの属性と一致する。というのは、これは、移行が生ずる前に、リンパ細胞自体がPECAMを開放する必要があることを示唆しているからである。ボーゲン等は、広義にPECAMが、該リンパ節および内皮を横切るリンパ細胞の結合または移行に幾分関与することを示唆しているが、この示唆を支持する該証拠はよくても二義的なものでしかない。モノクローナル抗体を使用して行った観察がPECAMに対して特異的であるか否か、あるいはこのような効果が任意の他の表面分子を伴っておこるか否かを決定する、直接的な実験的研究はない。PECAM なしにリンパ細胞が移動し得ないことを立証する直接的な証拠はなく、また抗-P ECAM抗体または可溶性の組み換えPECAMが該リンパ細胞の結合または移行を阻止するであろうことを示す証拠もない。同様に、他の研究者は、ヒトへその緒の静脈内皮細胞およびヒトリンパ細胞を用いたインビトロモデルを利用して、経内皮移動を観測したが、PECAM以外の付着分子を研究するためにこれらモデルを使用したのである。これらの研究は、該付着分子がインビトロにおける尖端の回転または付着に対して重要であることを立証し、これは後にインビボによる研究によって支持された。幾つかの実施例を含み、該実施例は、ガラスに付着した精製P-セレクチンが、炎症のあるサイトにおける内皮表面上でのリンパ細胞の回転挙動を連想させる、流動条件下での該表面上でのリンパ細胞の「回転（rolling）」を生じる弱い付着を媒介することを立証した（ローレンス（Lawrence）等，1991）。その後、P-セレクチン欠乏マウスが回転性に欠けることを見出した（マヤダス（Mayadas）等，1993）。更に、抗−セレクチン試薬が、幾つかの他のインビボモデルにおいて回転を阻止することを立証した（レイ（Ley）等，1991；フォンアンドリアン（von Andrian）等， 1991）。リンパ細胞インテグリンCD11/CD18錯体に対する抗体が、インビトロで、ヒトリンパ細胞のヒト内皮細胞への堅固な尖端付着を阻止することが立証された（ハーラン（Harlan）等，1985）。同一のまたは類似の抗体もインビボでのこの付着を阻害した（アーフォース（Arfors）等，1987）。更に、このCD18に遺伝子欠陥をもつヒトは、インビトロ実験により予測されるであろう表現型をもつ（ボーエン（Bowen）等，1982；ベティー（Beatty）等，1984）。同様に、ハッカート（Hakkart）等（1990）、スミス（Smith）等（1989）およびビーズリー（Be esley）等（1979）の発見は、上で論じたものと累積的なものである。これらの著者は経内皮移動を研究したが、公知技術は、該尖端付着および該移行過程に対して別の付着分子を必要とするものとして、経内皮移動の該過程を観察していなかった。具体的には、これらまたは上で論じたあらゆる研究から得られた結果の何れも、白血球、単球またはリンパ細胞の細胞間移動におけるPECAMの正の役割を示唆するものはなく、結局この概念を予測したものはいない。かくして、これら方法の何れも、本特許出願において開示する知見を進展することにより現時点で理解されているような、TEMの研究または数量化にとって不十分であろう。 PECAMの役割は、最初に本出願人により、現在継続中の1993年1月12日付けの米国特許出願第08/003,258号およびミューラー（Muller）等の対応する刊行物J．E xp．Med.，1993，178，pp．449-460で、明確に述べられた。PECAM-1の二十日ネズミ相同体の最近の特徴付けは、この親出願において同定され、具体化された該分子のインビボ完成を確認する機会を与えた。本明細書の以下におよび本出願人および他の著者による印刷中の原稿（ボーゲン（Bogen）等の「二十日ネズミのP ECAM-1に対するモノクローナル抗体（CD31）はインビボで急性炎症を阻止する」と題する論文、J．Exp．Med.，1994）に具体的にかつより詳細に記載されているように、炎症のインビボモデルを利用して実験を実施した。PECAM-1の二十日ネズミ相同体のクローニング（グジー＆ミューラー（Xie and Muller），1993）は、ヒトCD31との79％の相同をもつ予想されたアミノ酸配列を示した。Ｌ細胞を、 PECAM-1-依存的様式で凝集し、ヒトPECAM-1 トランスフェクタントと類似する、二十日ネズミのPECAM-1 cDNAでトランスフェクションした。CD31の二十日ネズミ型を識別する、ハムスター中で生成したモノクローナル抗体（mAb）（ボーゲン（Bogen）等，1992）はこの凝集を阻止した（グジー＆ミューラー（Xie and Mul ler），1993）。本出願人の特許出願に先行する該研究の背景に対して、経内皮移動のメカニズムおよび付着を含む他の細胞事象との関連は、これら事象の全てが白血球の移動およびその結果としての炎症に寄与するので、未知であった。従って、これら事象を更に解明し、そのような発見から、炎症事象を制御する新たなおよび有効な手段、それに随伴した測定手段およびかかる機能を監視する手段（有効な薬物の開発を包含する）を提案することに関連する需要がある。発明の要約本発明は、感染又は非感染状態の際に、急性及び／又は慢性の炎症部位に白血球のような細胞の経内皮移動を調節する方法であって、ＰＥＣＡＭに対する抗体、ＰＥＣＡＭ活性に対する拮抗物質、組換えヒトＰＥＣＡＭ-１（rhＰＥＣＡＭ −１）及びそれらの活性フラグメントからなる群から選ばれた薬剤又は組成物を投与することを特徴とする方法である。ＰＥＣＡＭ活性拮抗物質は、構造的にＰＥＣＡＭや抗−ＰＥＣＡＭ抗体に関連していないが、治療作用のベースとして、ここに定義したＰＥＣＡＭの機能を妨害する能力を有する、低分子、無機分子、ポリペプチド、及びそのフラグメント等を初めとする分子のような材料を含むことができる。このような拮抗物質は、存在するＰＥＣＡＭと相互作用し、従って、白血球又は内皮細胞と相互作用することができる。特定の抗−ＰＥＣＡＭ抗体は、モノクローナル抗体hec7を含み、特にＡＴＣＣに１９９２年１２月２３日に寄託されたＡＴＣＣNo.HB 11227のハイブリドーマh ec7.2から調製された抗体及び／又はそのフラグメントである。ハイブリドーマh ec7.2は、本発明者が製造した、４個のサブクローン、hec7.1-hec7.4の中の１つである。従って、本発明の範囲は、これらのサブクローンのいずれのものの使用にも及ぶものである。さらに本発明は、望ましくない炎症に関連する急性又は慢性の症状を有する患者の組織に、白血球が侵入するのを、そのような処置を必要とする患者に本発明の薬剤の１種の処置有効量を投与することによって阻害する方法及びそれに関連する材料に関する。好ましい抗体は、上記説明のとおりである。本発明はまた、感染性疾患のための抗感染剤を投与されている患者の炎症を解消又は軽減するための方法及び材料に関するものであり、この方法は、該抗感染剤の投与に先立ち、又は同時に、又は投与の後に、本発明の薬剤の１種の処置量を投与する工程を含む。抗感染剤と処置量の本発明の薬剤を含む投与形態も説明される。本発明はまた、ＰＥＣＡＭ機能の変化を診断する目的で経内皮移動を測定しモニターする方法及び関連する検定法にも及ぶものであり、この方法は、そのような検査の際に、患者から採取された白血球、血清又は血漿のような細胞作用物質の所定量を、培養ＨＥＣから生育したヒト内皮細胞の単層に沿って、配置する工程を含む。この細胞は、該単層と約１時間接触が保たれ、これは正常な経内皮移動が起こるのに十分である。次にこの単層を定着し、AgNO₃及びWight Giemsaステインで染色し、次いでNormarski又はHoffman光学計にかけて、細胞間ECジャンクション内に配置された細胞の正確な位置を空間的に視覚化し、その後、得られた結果を、正常から、診断又は観察によりその状態の存在に至るまでの種々の状態の患者から得られた所定の連続した測定結果と比較する。細胞を標識する方法は様々であり、白血球の放射標識、又は比色トレーサーの使用によるものを含む。この方法はまた、以下に詳細に説明するように自動化することができる。本発明はまた、レセプター検定を含むものであり、ＨＥＣのＰＥＣＡＭレセプターにより認識されるあらゆる抗原又は他の薬剤を同定することができ、その活性を測定することができる。更に、本発明はPECAM機能または発現を調節する特発性剌激または既知の剌激の能力に基いてそれらを検出する方法を含む。特に、剌激が白血球、例えば、単核細胞及び多形核細胞によりTEMを剌激または抑制するそれらの能力により同定され、検出し得る。例えば、この方法において、内皮細胞の試料が対照としての幾つかの既知の修飾薬剤、例えば、抗PECAM試薬、サイトカイン等で処理／暴露でき、一方、平行の細胞試料がこのような剌激を含むと考えられる物質の抽出物で処理または暴露し得る。次いで夫々の試料がインキュベートされ、その後、対照白血球がHEC単層に適用され、生じるTEMの存在及び／または程度につき分析し得る。本発明のアッセイは、炎症または関連の病状の潜在的なモジュレーターとして評価される薬剤の存在する効力を同等に正確に予想し得る白血球移行の正確な定量を与える。それ故、本発明はPECAM機能または発現の変化の発生の可能性、またはそれらを生じ、またはそれらから生じ得る症状を診断するため、またこのような炎症もしくはこのような症状、特に、炎症及びそれを生じる症状（この場合、有害な症状または病気は白血球、例えば、単核細胞、好中球、リンパ球、好酸球、及び／または好塩基球の経内皮移動により生じる）のモジュレーターとして有益であり得る薬剤の如き潜在的な治療薬を試験するための方法及び関連のアッセイ並びにキットに及ぶ。こうして、本発明の目的は、このような治療を要する患者に治療量の本発明の薬剤の一種を投与することを特徴とする、感染症または非感染症中の組織への単核細胞、好中球及びリンパ球を含む白血球の流入を抑制する方法を提供することである。本発明の別の目的は、或る量の白血球を内皮を複製する細胞基質と接触させて配置し、そして前記基質に或る量の本発明の薬剤を適用し、その後、前記基質中の前記白血球移動の程度及び空間位置を測定することにより内皮を通過する白血球の移動を測定する方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、前記測定方法の実施により感染症または非感染症により生じた患者の組織及び臓器中のPECAM発現及び／または機能の変化の可能性を診断することである。本発明の更に別の目的は、感染症または非感染症により生じた患者の組織及び臓器中の炎症のモジュレーターとして利用できる薬剤及びその他の治療薬の同定のためのアッセイを提供し、使用することであり、このアッセイは前記測定方法に基いている。本発明の更に別の目的は、このような治療を要する患者に治療量の本発明の薬剤の一種の投与により、感染症または非感染症により生じた炎症を有する患者の組織及び臓器の炎症を治療することである。本発明の更に別の目的は、PECAM活性の増進により経内皮移動のプロモーターとして機能する物質の投与により不十分な白血球移動に少なくとも一部起因し、または存在する症状を治療することである。本発明の別の目的は、治療量の抗PECAM抗体もしくは可溶性組換えPECAM、またはこれらの活性フラグメントを投与し、それにより冒された組織への白血球の流入の量を排除し、または大きく軽減することにより、随伴性の急性炎症、例えば、内毒素ショックまたは成人呼吸障害症候群を示す症状で冒された患者の治療方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、抗感染薬の投与の前、それと同時に、またはその後に治療量の本発明の薬剤の一種を投与し、それにより炎症を排除または軽減することにより、感染症の抗感染薬の患者への投与に起こりやすい、患者の組織またはその他の臓器への白血球の流入を排除または軽減することである。その他の目的及び利点は、下記の図面を参照して進行する以下の説明の考慮により明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、抗PECAM抗体が単球の経内皮通過を遮断することを示す複合の顕微鏡写真である。末梢血単核細胞（PBMC）がhec7 mAb（a）またはイソタイプ適合対照mAb（b，c）でインキュベートされ、未結合抗体を洗浄して除かれ、37℃で集密HEC単層に添加された。１時間後、単層がHBSS中１mMのEGTA中で３回洗浄されて、ゆるく付着した白血球を除去し、硝酸銀及びライト−ギムサ（Wright-Giems a）で染色され、次いでノマルスキィ干渉光学装置により試験された。a）hec7処理試料において、殆どの単核細胞（Mo）は細胞間接合部と会合してHEC表面にしっかりと付着されたままであり、これらは硝酸銀で黒色に染色する。これらのMo は全てHEC単層の頂端表面で病巣面にある。対照的に、対照Moは全て移行した。単核細胞は単層の頂端表面の平面中の病巣にはないが（b）、それらは全て単層の下のコラーゲンゲル中の種々の病巣面中で視覚化し得る（c）。白色の矢印は相当する顕微鏡写真（b）及び（c）中の二つのこのようなMoを示す。バー＝200 μm。図２は、hec7抗PECAM mAbが細胞間接合部中の単核細胞の移動を遮断することを示す複合の走査電子顕微鏡写真である。PBMCが20μg/mlのhec7または対照mAb を含む完全培地中で１時間インキュベートされ、次いでEGTA中で洗浄され、走査電子顕微鏡のために定着され、調製された。対照単層（a）は目視で頂端単核細胞を含んでいなかったが、一方、hec7処理PBMCに暴露された単層がMo（b）で覆われ、それらの殆どが細胞間接合部の上に結合されていることが明らかであった。標題の標本（c）の更に高い倍率で、hec7処理Moの多くは接合部に延びている偽ポッド（pseudopod）であることが見られたが、細胞の大部分が頂端表面に留まっていた。図３は、抗PECAM mAb hec7が同時培養の開始時に予備結合され、または添加されたMoの経内皮移動をかなり遮断することを示す。PBMCが20μg/mlのhec7（抗PE CAM）または対照（抗CD14）mAbで氷の上で30分間インキュベートされ（陰影線付きのバー）、洗浄されて未結合の抗体を除き、HEC単層に添加された。また、同数のPBMCが同濃度のmAbの存在下でHECに添加された（開放バー）。インキュベーションが１時間進行し、その時点で細胞が実験操作のようにして処理され、移行した単層と会合されて残存する細胞の比率（％）が評価された。示されたデータは夫々の実験試料の６回の反復試験の平均±標準偏差である。図４は、hec7がTEMを遮断する際にポリクローナル抗PECAMと同様に有効であることを示す。PBMCが20μg/mlのhec7または抗CD14、またはウサギ抗PECAM血清もしくは前免疫血清の1:100希釈液の存在下でHEC単層に添加された。移行が１時間進行し、細胞が図３のように処理された。図５は、hec7FabだけでなくIgGが低濃度でTEMをかなり遮断することを示す。同数のPBMCがHEC単層に添加され、その移行アッセイが培地M199（M199）または3 0μg/ml（3C10）の抗CD14mAb 3C10または示された濃度のhec7IgGもしくはFabで補補給されたM199中で37℃で１時間にわたって行われた。図６は、移行の遮断が抗PECAM mAbに特異的であることを示す。Mo表面抗原に結合するその他のmAbはTEMを遮断しない。同数のPBMCが20μg/mlの示されたmAb を含むM199中で１時間にわたってHEC単層に添加された。hec7のみがMoの移行をかなり減少する。図7A及び7Bは、hec7がMoまたはPMNの走化性を減少しないことを示す。PBMCまたはPMNが単離され、10μg/mlのhec7 IgGもしくはFab（a）または示された濃度のhec7 Fab（b）を用いて、またはこれらを用いずにM199+0.1％のHSA中で再度懸濁された。次いで白血球がa）M199またはホルミルノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニン（fNLLP）、またはb）通常の培地もしくは集密Hec培養液からのインフラネート（infranate）で含浸されたコラーゲンゲルに添加された。37℃ で１時間のインキュベーション後に、走化性が実験操作に記載されたようにして定量された。図８は、hec7によるTEMの抑制が長く持続し、かつ可逆性であることを示すグラフである。PBMCがhec7（閉じた正方形）または対照mAb（閉じた円形）を含む培地中でHECに添加され、移行の比率（％）が1.5時間までの時点で評価された。 1.5時間で、一組のhec7処理培養液がM199中で３回洗浄され、対照培地中の培養液に戻された（開いた正方形）。移行が夫々の試料につき６回の反復試験の培養液で通常の方法で評価された。図９は対照実験の結果を示し、この場合、hec7 Fabフラグメント及びhec1 Fab フラグメントが細胞間接合部に濃縮されたままである。20μg/mlのhec7（抗PECA M）またはhec1のFabフラグメントで補給された正常な培地が準集密HECに添加され、細胞が１週間で集密になる際に連続の栄養補給物で置換された。単層が徹底的に洗浄され、次いで蛍光顕微鏡の前に培地中の1:100のFITC標識ウサギ抗マウスIgG （hec7用）または1:400のウサギ抗マウスIgG続いて1:100希釈のローダミン接合ブタ抗ウサギIgG中で連続的にインキュベートされた。a）hec7 Fabの存在下で集密に達したHECの蛍光像は細胞間接合部中に濃縮されたhec7 Fabフラグメントを示す。b）hec1 Fabの存在下で集密に達したHECの蛍光像はhec7処理単層の外観に非常に似ている。図10は、移行がMo接合部またはHEC接合部の抗PECAM処理により遮断し得ることを示す。HEC単層が標準条件下（対照）または図９の脚注に記載されたhec7またはhec1 Fabの存在下で培養された。PBMCが両方とも20μg/mlの対照mAb 3C10（開いたバー）またはhec7（黒色のバー）、または１μg/mlもしくは10μg/mlの組換え可溶性PECAM（sPECAM、陰影線付きのバー）を含むM199中で再度懸濁され、移行が１時間進行し、hec7はそれがMoまたはHECのいずれに添加されたかを問わずにTEMを同等に遮断し、二つのアームが組み合わされた時に付加的な遮断はなかった（hec7 Fab/hec7）。可溶性組換えPECAMはhec7と同様に遮断し、再度、HEC に結合されたhec7 Fabでは加法的ではなかった（hec7 Fab/sPECAM）。図11は組換え可溶性PECAMの発現及び単離を示す。可溶性PECAMプラスミド（T ）または対照プラスミド（C）もしくはHEC（E）で移入されたCOS-1細胞が代謝標識され、培養上澄み（s）または細胞溶解産物（1）が方法に記載されたようにしてhec7で免疫沈殿にかけられた。SDS-PAGEゲルのフルオログラムは、上澄みではなくHEC溶解産物中に存在する真正PECAMを示す。移入COS細胞は予想されたようにMr約90kDの重度に標識されたタンパク質を分泌する。更に小さい前駆体バンドがこれらの細胞の洗剤溶解産物中に検出される。タンパク質は対照COS試料中で認められない。図12は、hec7がサイトカイン活性化HECを横切るMoの移行を遮断することを示す。HECが10ng/mlのTNFαの存在下で３時間培養することにより活性化されてVCA M-1を誘導し、ICAM-1をアップレギュレーションした。PBMCが20μg/mlのhec7または3C10 mAbの存在下で添加され、移行が１時間にわたって進行させられた。図13は、抗PECAM試薬が好中球の移行を遮断することを示す。HBC単層が10ng/m lのTNFαの存在下で２時間培養されてＬ−セレクチンだけでなくVCAM-1の発現を誘導し、ICAM-1発現（ミュラー及びワイグル、1992）を増進した。PMNが20μg/m lの3C10もしくはhec7、1:100の前免疫血清もしくはウサギ抗PECAM血清、または1 0μg/mlの組換え可溶性PECAMで補給された温かいM199中で再度懸濁され、活性化 HEC単層に１時間にわたって添加された。図14は、抗PECAM mAb力泊血球遊出を遮断することを示す一連のグラフである。マウスが横尾部静脈を介して示された投与量のmAb、正常なハムスターIgG（NH IgG）、または0.1mlのDPBS中のダルベッコのPBS（DPBS）を注射された。４時間後に、“No.Thio”対照を除く全てのマウスが方法に記載されたようにして１ml のチオグリコレートを腹腔内注射された。腹膜細胞がチオグリコレート抗原投与の20時間後に回収された。2H8-ハムスター抗マウスPECAM（CD31）；5C6-ラット抗マウスMac-1（CD11b）。グラフは夫々の群（群当たり３匹のマウス）につき平均及び平均の標準偏差を示す。データが回収された白血球またはPMNの合計数、または腹膜洗浄液中のこれらの細胞の濃度として表される。図15A及び15Bは夫々、抗PECAM-1 mAbがチオグリコレート注射に応答して白血球遊出を遮断することを示す二つのグラフを示す。腹膜細胞が時間０で250μｇの示されたmAb、正常なハムスターIgG（N．Ham．IgG）、またはDPBS（なし），i .v.そして４時間の時点でチオグリコレートまたはDPBS i.p.を受けたマウスから 24時間の時点で回収された。７つのうちの代表的な二つの実験が示される。AKR/ Jマウスが図15Aに示された実験１に使用され、一方、CD2F₁マウスが実験２（図1 5B）に使用された。抗PECAM-1 mAb及び抗CD11b mAbはPMN及び単核細胞の流入を遮断する。バーは夫々の群（５匹のマウス／群）につき平均±s.e.m.を示す。図16A-16Eは、抗PECAM-1処理マウスからの腸間膜細静脈が内皮と明らかに接触する増大された数の管腔内の白血球を示すことを実証する。図15のようにして抗 PECAM-1 mAbで処理されたマウスは内皮と接触するランダムな部分に高比率の白血球（主としてPMN、矢じり形）を明らかにし（図16A）、一方、非遮断性抗CD18 mAbで処理されたマウスは、多くが移行したという事実にもかかわらず、内皮表面にめったにない白血球を示した（図16B）。腸間膜組織の凍結部分のイムノペルオキシダーゼ染色は、24時間前に注射された抗PECAM-1 mAbが血管構造中の内皮細胞に依然として局在化され（矢印、図16C）、一方、抗CD18 mAb（図16D）が血管（矢印）ではなく腸の陰か（矢じり形）及び基底膜（図示されていない）中のわずかに時折の星状細胞を染色したことを実証した。図16Eにおいて、群当たり５匹のマウスの夫々からの10のランダムな細静脈プロフィール中の400を越える白血球の定量化がグラフで示され、抗PECAM-1 mAb群のみが内皮と接触して残存する白血球のかなりの数を有することを明らかにした。データが細静脈壁と明らかに接触する合計の脈管内白血球の比率（％）（開いたバー）として、また１より大きい付着白血球に穴をあけるカウントされたプロフィールの数（マウス当たり10から）として表される。これらのデータが％に変換される。５匹のマウスの群に関する平均±s.d.が示される。（a,b）ｘ415，（c,d）ｘ260。（a）及び（b）中の矢印は内皮核を示す。Ｌ＝細静脈管腔、Ｓ＝小腸漿膜表面、Ｃ＝腸陰か。図17A及び17Bは、抗PECAM-1処理マウス中の排出腸間膜節の被膜下の洞中の単核細胞の相対的な欠乏を示す。チオグリコレート処理マウスからの腸間膜リンパ節が方法に記載されたようにして定着され、切開された。図17Aは正常なハムスターIgGで処理されたマウスからの代表的な節の被膜下の洞（アステリスク、垂直線が洞の幅を形成する）を示す。洞内の多数の単核細胞に注目されたい。これは求心性リンパ系を介してのそれらの最近の到達を示す。図17Bは2H8抗PEC-AM-1 で処理されたマウスからの同じ領域中の比較的少ない単核細胞を示し、これは腹膜洗浄から回収された減少された全腹膜細胞と相関関係がある。両方のパネルｘ 80。発明の詳細な説明本明細書において使用されるある種の用語は、次の意味を有する。 “アゴニスト”は、細胞コロニー、抗原、抗体又は他の部分のある種の活性をまねるか又は促進する化学物質、化合物、抗原又は類似の物質であり、“拮抗物質（又はアンタゴニスト）”は、その活性を妨害、阻害又は遮断する物質、化合物又は類似の物質である。“拮抗物質”なる用語は、詳細には、本明細書においてはＰＥＣＡＭに構造上関連がなく、ＰＥＣＡＭ活性を阻害し、そうすることにより本発明の物質に提案されるように治療上の活性を示す化合物、ＰＥＣＡＭに対する抗体以外の物質、小分子を含む分子、ポリペプチド、これらの断片等を含む物質に及ぶ。更に、“拮抗物質”の例としては、生物学的半減期が長い、リガンドに対する親和性が高い又は体内のある場所を標的にするべき能力のような追加の生物学的性質をＰＥＣＡＭ拮抗物質に付与するためにＰＥＣＡＭ−１又はその部分が免疫グロブリンの一部に共有結合したスズ系である融合タンパク質、補体調節タンパク質又は他の分子をが含まれるが、これらに限定されない。更に、“拮抗物質”なる用語は、コアタンパク質の翻訳後修飾に基づいて異なりかつ自然に又は試験管内で適切な生化学的操作によりそのように修飾されるＰＥＣＡＭ−１の別にグリコシル化された形態を企図する。そのようなグリコ体は、生物活性、生物学的半減期、組織分布及び機能が異なる。また、その拮抗物質として、グリコサミノグリカン種及び同様の構造を有する炭水化物も企図される。ＰＥＣＡＭ−１は、第２免疫グロブリンループ内にグリコサミノグリカン結合部位を有することが既知である。更に、この部位は、経内皮移動においてＰＥＣＡＭ−１の機能に起因すると考えられるＰＥＣＡＭ−１についての部位か又はそれに近い。（下記実施例１２参照）従って、代表例として含むがヘパリン及び硫酸ヘパランに限定されないグリコサミノグリカンは、この領域においてＰＥＣＡＭ−１に結合しかつ生物活性の拮抗物質として働くことが企図される。 “抗体”は、抗体及びその断片を含む特定のエピトープを結合する免疫グロブリンである。特にポリクローナル、モノクローナル及び米国特許第4,816,397号及び同第4,816,567号明細書に更に詳細に記載されているキメラ抗体を包含する。 “抗体結合部位”は、抗原を特異的に結合する重鎖及び軽鎖可変及び超可変領域からなる抗体分子の構造上の部分である。文法上種々の形の“モノクローナル抗体”なる語は、具体的な抗原と免疫反応することができる抗体結合部位の１種のみを有する抗体を意味する。即ち、モノクローナル抗体は典型的には免疫反応する抗原に対して単一の結合親和性を示す。モノクローナル抗体は、各々が種々の抗原に免疫特異的な多数の抗体結合部位を有する分子、例えば二特異的（キメラ）モノクローナル抗体としても工学的に処理される。 “モノクローナル抗体の断片”は、慣用的なＦａｂ及びＦ（ａｂ′）₂フラグメント並びに人体に適応された抗体及びその断片を含むＰＥＣＡＭ−１を認識及び結合する抗体のキメラ又は合成形態を意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ′）₂フラグメントは、周知の方法によって各々実質的に無傷の抗体分子についてパパイン及びペプシンのタンパク質分解反応によって調製される。例えば、Theofilopo lousらの米国特許第4,342,566号明細書参照。また、Ｆ（ａｂ′）₂抗体分子部分も周知であり、Ｆ（ａｂ′）₂部分から産生された後、メルカプトエタノールとのように２つの重鎖部分を結合するジスルフィド結合を還元し、次いで得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセタミドのような試薬でアルキル化する。 “ＰＥＣＡＭ−１の断片”は、無傷ＰＥＣＡＭ−１と同じアミノ酸配列を有するか又はその部分を含む分子の一部を意味する。これは、本明細書に記載されたもののようなＰＥＣＡＭ−１の可溶性組換え体、ＰＥＣＡＭ−１又はその一部の分離免疫グロブリンドメインに対応するポリペプチド及び無傷ＰＥＣＡＭ−１における関係と異なる線状又は３次元方法で結合したＰＥＣＡＭ−１の配列に由来する他のペプチドと結合したＰＥＣＡＭ−１又はその一部に対応するポリペプチドを含むがこれらに限定されない。“ＰＥＣＡＭ−１の断片”としては、上記分子の別のグリコ体（上記で定義された）も企図される。明細書及び請求の範囲に出てくる“活性断片”は、共に本発明によって企図されるＰＥＣＡＭに対する抗体／拮抗物質と同じである活性を示すか又は逆にＰＥＣＡＭ活性のプロモーターと同じ活性を示す本明細書において一般に定義された断片を意味する。同様に、“活性断片”は、適切なＰＥＣＡＭの可溶性断片、それに対する抗体の可溶性断片又はその拮抗物質の可溶性断片を企図しその範囲内に包含する。明細書及び請求の範囲に出てくる“白血球”は、好中球（多形核白血球（ＰＭＮ））、単球、リンパ球、好酸球及び好塩基球並びに具体的な種類の細胞を特に意味しない白血病及びリンパ腫に存在するその悪性変異体を含む任意の及び全ての白血球を循環する種類を意味する。 “炎症”は、傷害に対する新生血管生存細胞の応答及び特に急性あるいは慢性方法でその組織に白血球を循環する流入を意味する。炎症の例としては、感染の病巣、リウマチ性関節又は糖尿病性ランゲルハンス島のような自己免疫傷害、心筋梗塞、移植片拒絶反応、アテローム性動脈硬化症、創傷癒合、肉芽腫反応及び特発性炎症症状が含まれるが、これらに限定されない。 “ＰＥＣＡＭ”は、“ＰＥＣＡＭ−１”と交換可能で用いられる。 “経内皮移動”は“トランスマイグレーション（トランス移動）”と交換可能で用いられ、“ＴＥＭ”は並んだ内皮細胞間を通ることにより白血球が血管の内皮細胞列を横切って移動することによる過程を意味する。これは、炎症の過程において十分に許容された段階である。 “薬剤学的に許容しうる”なる語は、生理学的に許容しうる及び典型的にはヒトに投与された場合に胃障害、眩景等のアレルギー又は類似の具合の悪い反応を生じない分子部分及び組成物を意味する。 “薬剤学的に許容しうる”なる語は、本明細書においては白血球の炎症部位への移動の臨床上著しい変化を少なくとも約３０％、更に好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％まで生じるのに十分な量を意味するように用いられる。本発明は、以前に記載されたヒト内皮培養系に関する研究に由来し、炎症のメカニズムを更に解明する一部として分子レベルで白血球トランスマイグレーションの過程を調べ始めるものである。白血球の内皮への結合に寄与する数種のセレクチン及びインテグリンが既知である。本発明の基礎となる血小板内皮細胞接着分子又はＰＥＣＡＭ−１として既知の分子は、細胞間接合によるトランスマイグレーションの過程に重要であることが判明し、結果として炎症に治療上介在する重要な中心及び白血球移動を特徴とする他の結果を表すものである。従って、本発明の態様は、単球又はＰＭＮのような炎症の細胞アゴニストの経内皮移動を調節又は制御するために投与されるＰＥＣＡＭに対するモノクローナル抗体を含むＰＥＣＡＭに対する抗体、組換え可溶性ＰＥＣＡＭ、ＰＥＣＡＭ活性の拮抗物質及びこれらの活性断片からなる群より選ばれた物質を含む薬剤の発見に関する。本明細書に示されるように、抗ＰＥＣＡＭ抗体は、例えば、白血球移動を約７０〜約９０％遮断する。更に、抗体が白血球又は内皮接合を前処理するために用いられる場合には遮断し、ＰＥＣＡＭが白血球と内皮細胞間の同種親和性接着を仲介することを示す。内皮がサイトカイニンで活性化される場合には、抗ＰＥＣＡＭは単球及び好中球の双方の移動を更に遮断する。抗ＰＥＣＡＭは、標準分析において両細胞種の化学走性を遮断する。本明細書の後の方で更に詳細に述べられるように、光学及び電子顕微鏡によりトランスマイグレーションで阻害された白血球は内皮細胞の先端面及び正確には細胞間接合にしっかりと結合したままであることが明らかである。本発明は、第１態様においては、感染又は非感染症状の結果として白血球のような炎症の細胞アゴニストの組織及び器官への流入をその細胞アゴニストの経内皮移動を調節することができる薬剤の治療的用量をその治療を必要としている患者に投与することにより阻害することに関する。本発明によって企図された細胞アゴニストとしては、すべてＰＥＣＡＭ−１を表す単球（Ｍｏ）、好中球（ＰＭＮ）、Ｔリンパ球のある種亜型及び活性Ｔリンパ球の大部分及びある種悪性骨髄及びリンパ細胞系が含まれる。上記のように、グラム陽性及びグラム陰性細菌及びウィルス類、寄生生物、菌類を含めて、種々の感染物質によって生じ、また、外傷のような非感染源から生じる。例えば、含まれる感染には、ベータラクタム抗生物質により処置できるもの、例えば、インフルエンザ、髄膜炎、肺炎球菌感染、連鎖球菌感染、サルモネラ、ある種の細菌、等が挙げられる。具体的な感染物質には、Haemophilus infl uenzae B）N．meningitides b、Streptococcus pneumoniae、Escherichia coli 、Staphylococcus epidermidus、Staphylococcus aureus、群B Streprococci、及びPseudomonas aeruginosaが挙げられる。本発明が対象とする炎症を起こした組織又は器官は、上記薬剤により炎症になりやすいいかなる体の組織又は器官でありえる。従って、本発明は、例えば、肺、中央神経系、腎臓、関節、心内膜、目及び耳の治療に適用できる。同様に、本発明は、人工インプラント又は同種移植片、火傷、外科的手術、毒性化学品、骨折又は他の外傷から生じるＡＲＤＳのような感染以外の原因から生じる炎症にも適用できる。特定の患者において、ｈｅｃ７のようなモノクローナル抗体の慢性的な使用による潜在的な問題が存在するかもしれない。このことは、注射する外来蛋白の量を最小にするために、モノクローナル抗体の活性断片の使用により改善又は除去できる。別の方法は、抗体ｈｅｃ７の結合領域に、ヒト免疫グロブリンのコンスタント領域を結合させたキメラ抗体を調製するか、又は可溶性ｒｈＰＥＣＡＭ又はその活性断片を使用することがである。本発明のさらなる態様は、抗炎症剤の投与によって生じるかもしれないような医原性誘導炎症における白血球の流入を低下又は除去することである。この方法は、このような治療が必要な患者に、抗炎症剤を投与する前、投与時又は投与後に、治療量の本発明の薬剤の１つを投与することを含む。すでに述べたように、好ましい薬剤は可溶性組み換えヒトＰＥＣＡＭ−１である。例えば、白血球の移動は、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）の投与に関連する胃炎の進行に関与している。つまり、可能な治療には、このクラスの抗炎症性化合物に依存する患者に対して、抗ＰＥＣＡＭ剤の有効投与量を投与することを含む。他の例として、その治療活性のメカニズムにより、抗炎症剤及び特にベータラクタム抗生物質は、それらの治療効果の結果として別に炎症を引き起こす。このような抗感染剤は所定の感染を殺菌するが、それらは毒性産物を例えば細胞壁に放出したり及び／又は該感染剤の内毒素をもたらす。このような細菌性成分は炎症反応を開始させ、特に肺においては深刻である。多くの感染の長期継続の結果として肺に重大なダメージを与えるのがこの炎症である。炎症性疾患における炎症の低減又は除去により、そのような症状に伴うことの多い器官の損傷が減少する。本発明の薬剤は白血球の移動を阻害する能力を有するため、非伝染性の原因及び伝染性の原因の両方の治療に好適である。伝染性又は非伝染性の原因により慢性炎症が引き起こされ、それに続き本発明の薬剤の投与が有効であるような、説明のための非限定的な例又は条件には、次のものが含まれる：臓器移植の後遺症又は細胞異型移植；アテローム硬化（動脈硬化）；多発硬化、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化（強皮症）、強直性脊椎炎、多発筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、類天疱瘡、Ｉ型真正糖尿病、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、グッドパスチャー症、混合結合織疾患、硬化性胆管炎、限局性回腸炎（局所腸炎）及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、悪性貧血、及び炎症性皮膚症の一部を含む（これらに限定はされない）その性質が自己免疫として知られ又は仮定されている疾患；通常の間質性肺炎、アスベスト肺、けい肺、ベリリウム症、滑石沈着症、様々な形態の石炭じん肺、他の全ての形態のじん肺症、（肺及び他の任意の器官における）サルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、リンパ系間質性肺炎、巨大細胞間質性肺炎、細胞性間質性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、ウェジナー肉芽腫及び関連する形態の血管炎を含む（これらに限定はされない）間質性肺炎；側頭動脈炎及び結節性多発性動脈炎を含む（これらに限定はされない）動脈炎；自己免疫と推定されない炎症性皮膚症；慢性活動性肝炎；遅延型過敏反応（ツタウルシ皮膚炎等）。急性の炎症の例に対応する状態は、本発明の治療方法により治療することが可能である。以下の例が挙げられるがそれらに限定されるものではない。何かの原因による肺炎又は他の気道の炎症；何かの病因由来の成人呼吸器困難症候群（Ad ult Respiratory Distress Syndrome）（ARDS）；炎症性浮腫を伴う脳炎；即時型過敏症反応、例えば、喘息、枯草熱、皮膚アレルギー、急性アナフィラキシー、（これらに限定されない）；動脈炎、例えば側頭動脈炎及び結節性多発性動脈炎（これらに限定されない）；免疫複合体の急性沈着を含む疾患、例えばリウマチ熱、感染後（例えば連鎖球菌感染後）糸球体腎炎、全身性エリテマトーデスの急性再燃（これらに限定されない）；腎盂腎炎；蜂巣炎；膀胱炎；急性胆石症、胃腸管、膀胱、心臓または他の器官にそったいずれかの一過性虚血を生ずる状態、具体的には腹臥の裂傷（prone to rupture）；同種異系器官又は組織の移植後の急性の期間における同種異系移植片拒絶。感染性疾患において抗感染薬の投与により生じる、器官への医原性白血球の流入を減少するか除去する本薬剤の能力により、その薬剤は、投与に便利なように抗感染薬と単一の投与形態において組み合わせることができる。大抵の抗感染薬、特にベータラクタム抗生物質は、非経口投与、例えば静脈ルートを介した好適な化学的形態において入手可能なので、そのような投与形態は、静脈投与形態が最も好ましい。また、これは、本薬剤の投与の実行可能なルートでもある。一般的に、抗感染薬およびその薬剤は、単一のアンプル溶液において合わせることができる。これが可能でない場合は、その抗感染薬及び薬剤は、別々に詰めることができ且つ注射の直前に混合することができる。同様に、投与は、どのような標準的投与溶液、即ち、通常の生理食塩液との混合物を介することもできる。同様に、本薬剤は、慢性療法の形態を一般的基準として、好ましくは局所又は経口投与により、自己投与することができる。投与形態における抗感染薬の量は、利用される特定の抗感染薬及び扱われる特定の感染による。利用される本薬剤の投与形態における量は、約1〜約1,000mg、かなり好ましくは投与単位あたり10〜100mgである。適量は、感染が存続するかぎりは連続した治療とともに１日あたり１〜４回投与することができる。当然のことながら、投与単位の投与方法は、患者の状態及び治療される感染症のきびしさにより治療する医師により変更してもよい。本発明による付加的な治療プロトコールは、感染又は類似の悪性状態、例えば、宿主が白血球不活性に関する免疫不全又は機能障害を示す場合におけるように、白血球、単球及びリンパ球の活性及び移動に基づく。本発明は、PECAMが経内皮移動に必要であることを示すので、PECAM機能又は活性を高めたり又は向上させる薬剤は、これらの状態を軽減することができる。従って、PECAM又は毎時の経内皮移動のプロモーター、若しくはPECAM発現、機能又は活性を増大又は向上させる薬剤を含有する適当な組成物は、かかる治療が必要な患者又は宿主に投与することができよう。PECAMのプロモーターは、より多くの量で表面で発現された又は配置された機能的PECAMを有する白血球を含有するであろう。付加的なPEC AMの送達は、増大した翻訳又は転写による増大した発現の促進、リポソームカプセル化を介するPECAMの白血球表面への送達、又は本発明の範囲内で企図される類似の他の手段によるであろう。投与方法には、当業者によって通常採用されるような非経口技術を含め、公知の方法が含まれる。投与量及び投与プロトコールは、同様に種々の態様が含まれる。このプロトコールに有利な代表的状態は以下のものである：慢性炎症状態（特に免疫無防備状態の宿主におけるもの）、例えば結核；AIDSを患うか骨髄に対する化学治療、放射線治療による免疫無防備状態の人における急性及び／又は慢性炎症のプロセス、白血病又は先天性免疫系機能不全；皮膚における創傷治癒、具体的には糖尿病または四肢の虚血を患う人におけるうっ帯性潰瘍、胃及び十二指腸消化性潰瘍の治癒；創傷、潰瘍の治癒又はいずれかの器官又は組織の柔組織及び／又は下層の支質の破壊により特徴付けられるいずれかの損傷（そこにおいて通常の治癒は肉芽組織を通して進むはずであり、慢性炎症細胞の流入が必要とされる。）。また、感染性器官又は非感染性原因による急性状態、特に免疫無防備状態の宿主におけるもの（例えば、多量のステロイド剤を投与した患者、癌の化学療法に続く患者、AIDS又は白血病を患う患者）、例えば、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、蜂巣炎、肺炎、胸膜炎、肺炎、心膜炎、心筋炎、心内膜炎、静脈洞炎、咽頭炎、網膜炎、耳炎、食道炎、胃炎、急性感染性腸炎、上行性胆管炎、肝炎、腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、うっ血性潰瘍及びうっ血性皮膚炎、肺炎球菌、ハエモフィルス族インフルエンザB、N．meningitides b及びEscherichia coli、グループB St reptococcus、Staphylococci及びPseudomonasから生じるものを含む感染によるいずれかの組織における膿瘍形成があげられる。初めのほうに述べたように、経内皮白血球の移動を加減することができる薬剤、それらの類似化合物、結合パートナー又は他のリガンド又はその薬剤に対する擬態又は拮抗のいずれかを示す薬剤は、組織感染を有する患者又は他の病理障害、例えば好中球、単球及びリンパ球を含む白血球を含む免疫系機能障害を有する患者に、好適な担体と共に且つそれらの治療用に様々な手段による投与に効果的な抵抗力において医薬組成物として製造してもよい。多様な投与技術は、それらの中でも軟膏剤におけるような局所適用又は外科用及び他の局所適用、例えば外科用スポンジ、包帯、ガーゼパッド等、及び経口に有効な処方として利用してもよい。また、そのような組成物は、非経口技術、例えば、身体の損傷部位を洗浄するために使用する洗浄液、カテーテル等における送達を含む皮下、静脈及び腹腔内注射により投与してもよい。薬剤の平均量は変更してもよく、特に、適格な医師又は獣医の勧告及び処方に基づくべきである。本発明の治療方法の実施に有用な代表的な治療組成物は、混合物として、薬学的に許容し得る賦形剤（キャリヤー）と、活性成分としてここで記述したような経内皮移動モジュレーター（薬剤）／モジュレーター（薬剤）アンタゴニスト、又はそのアナログの１以上とを含むことができる。具体的な治療組成物は、更に薬剤／薬剤アンタゴニスト又はそのアナログの効果的量及び、以下の活性成分：抗生物質、ステロイドの１種以上を含むことができる。例示的な配合組成は、以下で説明する実施例１２に示される。既述の通り、本発明は、PECAMを介して経内皮移動を制御する能力に基づいて特発性の又は公知は剌激を検出する方法を含む。特に、侵襲性の剌激は、白血球のうような細胞アゴニストによるＴＥＭを剌激するか又は抑制する能力によって特定でき、かつ検出することができる。従って、これらのアゴニスト、本発明の薬剤の１種、又はその結合相手を、種々の診断プロトコールに利用することができよう。記載された材料は、検出できるラベルにより標識してもよく、例えば、患者の状態をモニターしたり、調べたり、若しくは可能な新薬を研究したり、評価するために、本発明の経内皮移動アッセイのようなアッセイに使用することができよう。例示的な診断プロトコールについて、以下で説明するが、これらは、限定的なものではない。これらのプロトコールは、特定の試料の直接的な検査から、複数の試料及びそれに対応する参照例の調製及び比較並びに前者及び後者の間及び相互の直接比較におけるような結果の相関に及ぶ。このように、直接的な診断、並びにモニター及び薬剤の発見が企図され、本発明の範囲内である。第１のプロトコールは、一般に白血球の経内皮移動（migration）を測定する方法に関し、以下の工程を含有する。Ａ．ヒト内皮細胞のコロニーから試験基体（substrate）を準備する。Ｂ．白血球を含むと考えられる哺乳動物から生物学的試料を入手する。Ｃ．工程Ｂの生物学的試料を前記試験基体とともに、その白血球のトランス移動（transmigration）が生じるに充分な時間温置（インキュベート）する。Ｄ．前記試験基体の細胞間領域に結合している白血球の位置及び数をカウントすることにより、工程Ｃの温置材料を調べる。第２のプロトコールは、哺乳動物における経内皮移動及びそこにおけるPECAM の役割を調べる方法に関し、以下の工程を含有する。Ａ．ヒト内皮細胞のコロニーから試験基体を準備する。Ｂ．白血球を含む哺乳動物から生物学的試料を入手する。Ｃ．工程Ｂの生物学的試料のアリコートの部分を前記試験基体とともに、PECA Mアンタゴニストの不存在下においてその白血球のトランス移動が生じるに充分な時間温置（インキュベート）する。Ｄ．工程Ｂの生物学的試料の別のアリコート部分を前記試験基体及び白血球の経内皮移動を制御できる剤とともに、前記工程Ｃと同一時間温置することによって、対照例を準備する。この場合、前記剤は、PECAMに対する抗体、PECAM活性のアンタゴニスト、組換えヒトPECAM-1（rhPECAM-1）、PECAM活性のアゴニスト、及びその活性フラグメントからなる群から選択される。Ｅ．工程Ｃの温置材料を検査し、その結果を工程Ｄの温置材料と比較することにより、白血球の経内皮移動に関するPECAM機能を測定する。第３のプロトコールは、哺乳動物におけるPECAM機能の循環モジュレーターを検出する方法に関し、以下の工程を含有する。Ａ．ヒト内皮細胞のコロニーから試験基体を準備する。Ｂ．白血球を含む哺乳動物から、血漿、血清及び他の体液から選択される生物学的試料を入手する。Ｃ．同一又は別の哺乳動物からの白血球を、工程Ｂの生物学的試料のアリコート部分とともに又はそのようなアリコート部分を併用しないで、かつ前記試験基体とともに、前記白血球のトランス移動が生じるに充分な時間、PECAMアンタゴニストの不存在下において温置することによって少なくとも１つの試験インキュベーションを準備する。Ｄ．試験哺乳動物又は別の哺乳動物からの白血球の別のアリコート部分を、前記試験基体とともにかつ白血球の経内皮移動を制御できる剤とともに又はそのような剤を併存することなく、工程Ｃと同一の時間温置することによって少なくとも１つの対照例を準備する。この場合、前記剤は、PECAMに対する抗体、PECAM活性のアンタゴニスト、組換えヒトPECAM-1（rhPECAM-1）、PECAM活性のアゴニスト、及びその活性フラグメントからなる群から選択される。Ｅ．工程Ｃ及びＤの温置材料を検査し、工程Ｃの試験インキュベーション間及び工程Ｄの試験インキュベーション間で比較を行い、そして前記試験インキュベーションを前記対照例と比較することによって、前記白血球の経内皮移動についてPECAM機能を調べる。例えば、ここで有用な周知の免疫学的操作には、細胞アゴニスト、本発明の剤、又はそれらのアンタゴニスト若しくは検出し得るラベルで標識された他の結合相手の何れかが使用される。各場合において、細胞アゴニスト又はTEMモジュレーターは、結合相手と複合体を形成し、複合体の１成分は、検出し得るラベルで標識される。複合体が形成する事実及び所望の場合にはその量は、ラベルの検出に適用される公知の方法によって測定することができる。これらの研究に最も共通に使用されるラベルは、放射性元素、酵素、紫外線に暴露されると蛍光する化学物質等である。多数の蛍光物質が公知であり、ラベルとして使用することができる。これらの物質としては、例えば、フルオレッセイン、ローダミン及びオーラミンが挙げられる。コンジュゲートの例としては、羊で調製されかつイソチオシアネートによりフルオレッセインとコンジュゲートされた蛍光抗PECAM抗体が挙げられる。細胞アゴニスト又はTEMモジュレーター又はその結合相手も、放射性元素又は酵素で標識することができる。放射性ラベルは、現在利用可能なカウント操作により検出することができる。好ましいアイトソープとしては、³H、¹⁴C、³²P、³⁵ S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、及び¹⁸⁶Re が挙げられる。酵素ラベルも同様に有用であり、現在利用される、比色技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流測定技術、又はガス計量技術のいずれかによって検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等の架橋分子と反応させることによって選択された粒子に結合される。これらの方法に使用できる多くの酵素は公知であり、利用することができる。好ましいものは、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ、更にはアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第 3,654,090号、同3,850,752号及び同4,016,043号明細書は、別の標識材料及び方法の例として示される。本発明によって発展され、利用される特定のアッセイシステムは、レセプターアッセイとして公知である。レセプターアッセイにおいては、分析される材料は適当に標識され、次いで特定の細胞又は固相生化学標的は、標識された及び未標識の材料両者と温置され、その後、結合研究を行い、標識材料が特異的に細胞レセプターと結合する程度を調べる。このようにして、材料間における親和性の相違を確認することができる。共通に使用される変更態様においては、検出及び分析しようとする試験試料中の分子が結合する材料は、固体表面に結合され、試験試料が適用され、適当な温置及び洗浄の後、結合した分子の量は、標識したデテクターを添加し、そして公知標準に対して定量することによって、測定する。従って、白血球のような細胞アゴニスト又はTEMモジュレーターの何れかの精製量を放射性標識することができ、次いで、結合研究を行う。次いで、細胞アゴニスト又はTEMモジュレーター及びHEC細胞試料を次いで温置するか否かに係わらず、種々の量の標識化又は未標識化材料を含有する溶液を調製し、そして、温置する。得られた細胞モノレーヤーを洗浄し、溶解し、次いで、標準誤差＜５％となるに充分な時間ガンマカウンター中でカウントする。これらのデータをスカッチャード分析に掛けると、材料の活性に関する観察及び結論を導くことができる。以上の説明は例示的なものであり、分析した材料の細胞結合能を識別できる特性として作用できる場合におけるように、レセプターアッセイが実施できかつ利用できる態様を説明したものである。本発明の別の態様においては、医学専門家が使用するのに適した商業的試験キットを調製して、特定の哺乳動物宿主における経内皮的白血球移入の程度を特定することができる。上記で議論した試験技術に従えば、かかるキットの１グループは、少なくとも、標識化TEMモジュレーター又はその結合相手、例えば、それに特異的なアンタゴニストと、応答を検量し、評価するための予め決定されている標準と、及び勿論選択した方法に依存する指針とを含む。キットは、また、バッファー、安定剤、患者の白血球を標識するための指示、等の周辺材料を含有する。また、上述したように、ここで記述した方法は、細胞アゴニスト及び／又は TEMモジュレーターとの相互作用能に関して潜在的薬物を試験するのに使用して、経内皮移動及び付随する炎症に効果を及ぼすことができる。本発明のさらなる実施態様において、ある種の細胞の経内皮移動を測定及びモニターして、患者がPECAM療法に応答する見込みを測定し、あるいはTEMを調節することにより炎症を制御するのに有用な可能性を持つ薬物を試験することができる。本明細書中で開示されるTEMを測定する具体的な方法は、上記され及び後に現れる実施例中で説明される視覚による技術により達成される正確な測量を提供する。説明されたアッセイは、ヒト内皮細胞の単層を渡るヒト白血球の移行の in vitroアッセイであり、それはin vivoに存在する多くの条件を反映するように開発された。このモデルの内皮細胞は表現型的に、生体の血管に並ぶ内皮細胞と同様であり、休止状態及びサイトカイン活性化状態下においてそれらの間の接合点でPECAM-1を発現する。 HECを渡るリンパ球移行の対応するアッセイは、適切なリンパ球細胞モデルを使用して実施することができる。特に、活性化Ｔ細胞、並びに骨髄及びリンパ腫瘍細胞株から採取されるような細胞（Ohtoら、1985年；Goyertら、1986年を参照）は、それらの表面にPECAM-1を発現することが知られていて、この能力により目的にかなう。移行の定量は、ホフマンモデュレーションコントラストオプティクス（ Hoffman Modulation Contrast Optics）を使用して実施することができ、それは直接個々のHEC単層を可視化して、その最上にある、またはその中にはまり込んだ、またはHEC単層を通って移行した白血球のパーセンテージを数える。このアッセイの最後に、その単層をEGTAで、次いでDPBSで洗浄し、その後硝酸銀で染色してHEC接合点の輪郭をはっきりさせる。これは、HEC単層の平面を規定し、HEC の間にどの白血球が捕獲されたかを識別することをより容易にする。その単層はその後、10％中性緩衝化ホルマリン又はカコジル酸塩緩衝液中の２％グルタルアルデヒドで固定し、ライト−ギムザ（Wright-Giemsa）染料で染色する。該ホフマンオプティクスは、HEC単層に関する白血球の空間的な配向を正確に識別することを可能にする。HEC単層の上及び下にある白血球（即ち、コラーゲンゲル中に入り込んでいて、その上でHEC単層が成長する）は、例えば実験方法において記載される３つの操作手順のいずれかによって識別され、幾つかのランダムな領域（より大きい培養皿において）又は96ウェルの培養プレートの各ウェルの中央の領域で（再現性のため）計数される。データは、HEC単層の下の白血球のパーセンテージとして表される。本発明の上記のアッセイは、オートメション化して実施されることができる。例えば、ロゼットアッセイにおいて上記したIgG被覆羊赤血球（E-IgG）は、蛍光標識（例えばカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE））で標識することができ、該単層により保持される蛍光は、ロゼット形成したE-Ig Gの数、即ち残存する先端の白血球の数に比例する。蛍光は、標準の蛍光プレートリーダー（Millipore Cytofluor 2300）によって培養プレート中の全てのウェルについて自動的に読まれる。あるいはまた、該E-IgGは⁵¹Crまたは¹¹¹インジウムオキシキノリン（Muller及びWeigl，1992年）といった放射性標識で予備標識されて、保持される放射能がロゼット形成したE-IgGの数、即ち残存する先端の白血球の数に比例する。放射能は、計数のために培養物をチューブに物理的に取り出すことによってガンマカウンターにより、あるいは96−ウェルの組織培養プレートから直接読むためにガンマカウンターを適応させることにより査定する。さらなる別のプロトコールにおいて、培養物を低浸透圧または非イオン洗剤で溶解し、保持されるE-IgGは、例えばヘモグロビンといった赤血球−特異的マーカーの直接的化学測定又は免疫学的アッセイによるバンド３の分析により定量される。先端の白血球は、E-IgG以外の非永久的なマーカーに結合するそれらの能力により査定される。これらは限定されないが、次のものが挙げられる。ａ）蛍光または放射性標識で標識され、及び白血球属、単球、好中球、リンパ球の１またはそれ以上に特異的に結合する抗体またはリガンドと結合させたポリエステルラテックスビーズ、ｂ）蛍光または放射性標識で標識され、及び白血球属、単球、好中球、リンパ球の１またはそれ以上に特異的に結合する抗体またはリガンドと結合させた磁性ミクロスフェア、ｃ）蛍光または放射性標識を組み込まれ、その表面に白血球属、例えば単球、好中球、リンパ球の１またはそれ以上、あるいはそれらの部分集合体に特異的に結合する抗体またはリガンドを担持するホスホリピッド小胞。該アッセイに使用できる抗体またはリガンドとして、制限されるわけではないが、白血球の全てのクラスに対する抗−CD45、単球またはPMNに対する抗−CD14 、Ｔリンパ球に対する抗−CD３、CD４＋Ｔ細胞に対する抗−CD４、CD８＋Ｔ細胞に対する抗−CD８、単球、PMN及びナチュラルキラー細胞に対する抗−CD16、Ｂ細胞に対する抗−ヒトIgGなどがある。オートメーション化アッセイは上述のように、蛍光的に或いは放射性に標識されたE-IgGで実施する。下記の非限定的な実施例は本発明の方法及び調製を説明する。材料及び実験方法をまず最初に述べる。当然に、以下に挙げる具体的な材料及び技術は単に例示であって、変動させることができ、下記は説明として挙げるものであって、本発明を限定するものではない。実験の操作手順（材料及び方法）実施例１−８細胞ヒトの臍帯血管内皮細胞（HEC）をMuller等，1989年に記載されるように、単離し、コラーゲンゲル上で培養した。幾つかの実験では、HECは組み換えヒトTNF α（培地中、10μg/ml）の存在下で、図の説明に示されるような時間、培養することにより活性された。TNF αは、E-セレクチン（Bevilacquaら、1987）及びVC AM-1（Osbornら、1989）のような内皮細胞接着分子の発現を誘導し、これらE-セレクチン、VCAM-1はこの培養系においてHECによっては発現されない（Muller及びWeigl,1992）。抹消血単核細胞（PBMC）及び多形核白血球（PMN）をMuller及びWeigl，1992に記載れるように健康なボランティアから新たに取った静脈血から単離した。抗体ヒトPECAM-1に結合するマウスモノクローナル抗体（mAb）hec7、IgG2aを記載れるように作った（Mullerら，1989）。ハイブリドーマhec７はアメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、MD、に1992年12月23日に寄託して、AT CC寄託番号HB 11227が与えられた。先に述べたように、ハイブリドーマhec7.2は、hec7.1-hec7.4と識別された４つの同一の活性のあるサブクローンの１つで、具体的に寄託されている。MAb hec1は、この研究室で同じ起源の融合から作られたIgG2aである。それは、PECAMからはっきりと区別される接合的に制限された HEC完全膜蛋白質を識別する。両mAbを分泌するクローンは、無血清培地（Nutrid oma NS、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ、インジアナポリス、IN ）における成長に適合し、硫酸アンモニウムによりIgGが選択的に沈澱した。IgG を再溶解し、PBS中で透析し、及び膜濾過により滅菌した。固定化パパイン及びペプシンとともにインキュベートすることにより、それぞれFab及びF（ab'）₂フラグメントを作った（Pierce Chemical社、ロックフォード、IL）。未消化抗体及びFcフラグメントを、プロテインＡ−セファロース（ファルマシア、ピスカタウェイ、NJ）を通過させることにより取り除いた。非−還元条件下で実施される SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、フラグメントが適切に切断されたことを立証した。サンプル過量のSDS-PAGEは、すべてのIgG及び活性フラグメントサンプルが純粋であることを示した；クマシーブルー染色で、異質のバンドは存在しなかった。この研究に使用された他のmAb、それらの抗原、及び源は、ロックフェラー大学のS．D．ライト博士からのIB4及び3C10、各々、抗−CD18及びCD14；アメリカンタイプカルチャーコレクションからのＷ6/32、抗−クラスＩ MHC；9.3C 9（=9.3CF10）、この部門（ATCC No.HB 180）から作られた抗-MHCクラスII（HLA -DR及びHLA-DQ）；ワシントン州立大学、シアトル、エドワードクラーク博士からのLB-2、抗-ICAM-1、及びメダレッス（Medarex）W．Lebanon，NHからの3G8 、抗-FcγRIIIであった。ウサギ抗−PECAM血清及び予備免疫血清は、血小板から精製したPECAM-1に対して作った（Albeldaら、1991）。組み換え溶解性PECAM-1 シグナル配列及び６つの細胞外イムノグロブリンループのうち51/2を含むPECA Mの形態をエンコードするｃＤＡＮをベクターpcDM8（Mullerら、1992）中に存在する完全な長さのPECAM cDHAクローンから構築した。このプラスミドを制限酵素 Hind III及びNoeIで切断し、PECAMの外部ドメインをエンコードする1850bpフラグメントをアガロースゲルで精製し、及び該完全なプラスミドを示すHindIII及びXbaIで予め消化され最初のXbaI部位からHind III部位までの多重クローニングドメインがなくなっているpcDM8のゲル−精製4056bpフラグメントとリゲーションした。XbaI及びNheIは天然に同一の付着末端を発生するので、アニールされたプラスミドは、pcDM8中に発現にとって適正な配向で挿入された、切り詰められたPECAMをエンコードするDNAの該フラグメントを首尾よく含む。PECA M及びpcDM8の両者の単一のBamH1部位は、トランスフォームされたE．coliMC 106 1/p3の制限消化により、このことの確認を可能にした。精製されたプラスミドはこれらの培養物から標準方法によるCsCl勾配（Sambrookら、1989）で得られた。 COS-1細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）は、20μgのプラスミドとともにジーンパルサー（バイオ−ラッドラボラトリーズ、リッチモンド、CA）で240mV、960μF、通路の長さ４mmのキュベットで、0.5mlのダルベッコの変性イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM）中、10⁷ 細胞のエレクトロポレーションにより瞬時にトランスフェクトされた。エレクトロポレートされた細胞は、DMEM+10%FCS中で一夜培養し、翌日トリプシン処理に通し、死滅細胞を除去し、再びDMEM+10%FCS中で培養した。溶解性PECAMの発現は調節された培地からの免疫沈降法及び３日目のCOS細胞の免疫蛍光法により確認した。組み換え可溶性PECAMの精製免疫親和性マトリックスを、製造者の説明書に従い、hec7mAbを、濃度3.8mg/m lのAffi-gel 10（Bio-Rad Laboratories）に共有性カップリングすることにより調製した。前記構築物で一時にトランスフェクションしたCOS-1細胞から得られ、遠心分離により細胞を除いた５日目の調製培地を集め、この培地を0.3ml/分の割合でhec7-Affi-gelの３ml容量カラムに通した。このカラムを、カラムの10倍容量のSA緩衝液、８容量倍の洗浄性緩衝液及び20倍容量のSA緩衝液で洗浄した（ Muller and Gimbrone，1986）。可溶性PECAMを、0.05Ｍジエチルアミン（pH11.5）５mlで溶出し、１Ｍトリスイクロ濃縮装置（Amicon Division，Beverly，MA）を用いて濃縮した。精製物を SDS-PAGE、続いてコーマシーブルー（Coomassie blue）又は硝酸銀染色して評価した。タンパク質濃度をBCSアッセイ（Pierce Chemicals）を用いて測定した。組み換え可溶性PECAM40μgを前記調製培地約350mlから精製した。代謝ラベリング、免疫沈降及びSDS-PAGE これらの処理工程は、既に記載されているとおりに行った（Mullerらの論文、 1989）。これらの実験に独自の変形は、図面の説明に記載されている。トランスエンドセリアルマイグレーションアッセイ（Transendothelial migrationassay）最近の刊行物に記載されている方法（Muller and Weigl，1992）の有効な変形方法を使用した。要約すると、精製したPBMC又はPMNを、温めた培地199（M199）又は完全な培養培地（M199、20％の通常人血清を含む。）に、２又は１×10⁶/ml となるようにそれぞれを再懸濁し、94個の窪みを有するトレイで、水和コラーゲンゲル上に育成したHECの融合性単層上に載せた。ほとんどの実験において、抗P ECAM mAb、他の抗PECAM試薬、又はコントロールmAbを同時に加えた。トランスエンドセリアルマイグレーションを37℃で、通常１時間行った。本来の工程は、頂HEC表面に単純に結合した細胞からトランスマイグレートした細胞を分離する為に、EGTAの存在下で培養物を逆転遠心分離する必要がある。最大の光学的分割を保持するため、この工程を、１mM EGTA中で３回手作業で洗浄し、続いてDPBS （Ca⁺⁺とMg⁺⁺を含むDulbecco's PBS）中で３回手作業で洗浄する工程と置き換えた。幾つかの実験において、前記単層をAgNO₃で染色し、細胞間接合を視覚化した（Mullerの論文、1989）。この単層及び残留白血球を、次いで、グルタルアルデヒド2.5%を含む0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中で、固定した。定量分析を行う前に、前記単層をライトギエムサ（Wright-Giemsa）を用いて染色した。３種の分離法を使用してトランスエンドセリアルマイグレーションを定量した。同じ実験の分析に使用した場合、この３種の方法は全て同様の結果を示した。最初に記載した方法により若干良好な分析結果が得られた。したがって、ここで提供された殆どの定量データは、この方法を用いた実験から得られたものである。1）冷M199に入れたIgG被覆羊赤血球を、グルタルアルデヒド固定工程直前に、PMA（好中球用fMLP）とともに、実験の終了時にそのトランスマイグレーションアッセイに加え、白血球Fcγレセプターを完全に活性化した（Wright，1986）。４℃で30分間インキュベートした後、非結合赤血球を洗い流し、この培養物をグルタルアルデヒド中で固定し、HEC単層、コラーゲンゲル及び全ての結合白血球からなる全培養系を、ガラス片に完全に移し、ノマルスキ光学器具（Nomarski optics ）により500倍で調べた。白血球が、焦点の面において、３Ig被覆羊赤血球よりもHEC単層において上で、かつ結合（修飾）されていれる場合に、白血球を頂として数えた。2）96個の窪みを有するトレイの各窪みを、位相顕微鏡の低倍率対物レンズ上に順次移し、続いて、各ウェルの中心部位を、ホフマン調節コントラスト光学器（Hoffman modulation contrast optics，Hoffman 1977）を使用して 400倍で、単層の頂表面を明瞭に規定する、銀染色HEC接合を調べた。頂表面の焦点にある全ての白血球は、トランスマイグレートされていないものとして数えた。これは、接合部に延ばした小さな擬足を有する細胞を含んでいる。単層の平面下で焦点にあるこれらの白血球は、トランスマイグレートされているものとして数えた。3）全培養系をウェルから除き、前記No.１に関し、任意の部位をノマルスキ干渉光学器のもとで500倍で調べ、前記No.２について、頂かつトランスマイグレートされた白血球を数えた。データはトランスマイグレートしたと見られる総細胞の割合で表す。ほとんどの試料において、各部位において、おおよそ100 個の白血球を検討した。少なくとも６個の複製培養の平均及び標準偏差で示した。図において代表的な実験を示す。すべての実験を少なくとも３回繰り返し、通常、同様な結果が６回以上得られた。走査電子顕微鏡写真の定量前記のトランスマイグレートアッセイに続き、培養物を、2.5%ＥＭグレードグルタルアルデヒドを含む0.1Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）（Polyscie nces，Warrington，PA）で固定した。白血球及びコラーゲンゲルと結合した固定 HEC単層を、96個の窪みを有するトレイから物理的に取り除き、臨界点の乾燥及び金被覆を行い、走査ＥＭ用に処理した（Phillips and Bourinbaiar，1992）。試料を、ETEC走査電子顕微鏡で調べた。量的評価のために、各試料を、低出力ビームの中心に置き（ca．20X拡大）、次いで、単核白血球を、中心部又はその近くの、重複しない1,000倍の部位の（各部位はほぼ10,323μm²）、少なくとも任意の10カ所で数えた。頂単核白血球が、少なくとも１個の擬足を有する、大きな、殆ど広がった細胞として観察された。白血球類似細胞のみが、１時間及び３時間試料において頂表面上に極稀に見られた。５時間後、頂付着白血球が、コントロール及び抗PECAM処理試料と同じ密度（部位当たり約２）で観察され、数えることができなかった。データは、1,000X部位当たりの頂単核白血球の平均±標準偏差として表した。化学配列分析化学的誘引剤溶液200μlとともに、組織培養インキュベーター内で、37℃で一晩、インキュベートし、培養に用いるものと同じ水和コラーゲンゲルを、化学的誘引剤で飽和させた。蛍光ラベルしたIgGを用いたコントロール実験では、ゲル内部の蓄積及びゲルからの溶出物の間で、６時間以内に（t_1/2-45分）、平衡が達成されたことが示された。このようなゲルをM199で３回洗浄した。人血清アルブミン0.1％を含むM199に10⁶/mlの割合で再懸濁した白血球をウェルに入れ（100 μl/ウェル）、このゲルに対するマイグレーションを１時間行わせた。ゲルに侵入できなかった細胞をEGTAにおける逆転遠心分離により取り除いた（Muller and Weigl，1992）。陥没したゲルをライト−ギエムサで染色し、その中に捕らえた白血球を、各ウェルの中央200×部位で数えた。データを、６個の複製ウェルの白血球の平均数±標準偏差として表した。実施例１単核白血球に結合した抗PECAM抗体のトランスエンドセリアルマイグレーションのブロックこれらの研究は、最近報告された、単核白血球の選択的なインビトロ−トランスマイグレーションアッセイの僅かな変形である（Muller and Weigl，1992）。このアッセイにおいて、新鮮な分離人抹消血単核細胞（PBMC）を、静脈エンドセリアル細胞（HEC）の集合単層に加えた場合、単核白血球は、選択的かつ定量的に移動し、一方、白血球は、殆ど結合せず、実際、PBMCから単核白血球を精製する必要を伴わず、トランスマイグレーションを示さなかった。通常の提供者から分離したPBMCを、抗PECAM-1 mAb hec7（Mullerらの論文、19 89）又はアイソタイプ適合コントロールmAbとともに、４℃で20分間インキュベートし、未結合抗体を洗浄除去し、標準トランスマイグレーションアッセイにおけるHEC単層に加えた（Muller and Weigl，1992）。以前に報告したように（Mul ler and Weigl，1992）、40〜60分間のインキュベートの後、コントロール試料におけるすべての単核白血球（Mo）は、HEC単層にトランスマイグレートし、一方、残った白血球は、未結合又は緩く結合し、かつ１mM EGTAで洗浄することにより容易に除去された。抗PECAM抗体で処理された試料の全てのMoも、EGTAにおける複数回の洗浄に耐え、HEC単層とともに残った。しかし、Moが明らかにトランスマイグレートしたコントロール試料に対して（図1b，1c，及び（Muller and Weigl，1992））、抗PECAM抗体で処理されたMoの殆どは、HEC単層の頂表面に結合して残り、細胞間結合で蓄積した（図1a.）。この現象を超構造的なレベルで調査した。コントロール及びPBMC処理hec7に５時間まで晒したHEC単層の走査電子顕微鏡調査は、著しい相違を示した。極僅かなコントロールMoが単層表面（図2a）で観察されたのに対し、多くのhec7処理Mo が単層の頂表面に付着して残った（図2b）。高出力により調査すると、これらの Moは十分に付着し、ほとんどエンドセリア表面に広がっており、そこでは、これらの細胞が、並んでいるHEC間の細胞間接合に結合していた。ほとんどの細胞は、接合部に少なくとも１つ擬足を有しているのが明らかになった（図2c）。実施例２トランスマイグレーション阻止の定量このような単層におけるMoの位置を、HEC単層の表面に関連して、ホフマン調節コントラスト光学器（Hoffman，1977）及び／又はノマルスキ光学器を使用し定量し、単層の面を規定した。幾つかの実験において、Fcレセプターを介して抗体被覆羊赤血球を修飾する能力により、単層の頂表面上に残る単核白血球を、基部HEC表面近くに残るトランスマイグレートMoから識別した（Wright，1986）。３種全ての方法から得られたデータは同様であった。 PBMCを、hec7（抗PECAM-1 mAb）又はコントロールmAb 20μg/mlとともに、氷の上で30分間インキュベートし、未結合抗体を洗浄除去し、HEC単層に加えた。3 7℃で１時間インキュベートした後、実質的に全てのコントロールMoは、HEC下で明らかに良好であり、一方、20％未満の抗PECAM処理Moはトランスマイグレートした（図３）。80以上の分離実験において、通常hecは、70％〜90％の割合でMo のトランスマイグレーションを阻止した。トランスマイグレーションアッセイを抗体の連続的存在下で実施した場合、同じ結果が得られた（図３）。先の結果は、既に集合を達成したHEC単層に加えられたhec7 mAbが接合部を崩壊させないことを示している。したがって、連続的に存在する該mAbのこの実験における効果は単にMoにだけであると推定される。モノクローナル抗体hec7、10〜20μg/mlは、ブロッキングＴＥＭのウサギ抗PE CAM血清の1:100と同じく有効である（図４）。抗PECAM mAb hec7は、１μg/ml程度の濃度で十分にＴＥＭをブロックし、約10μg/mlで最大の効果を示す。hec7の効果は、単核白血球のFcレセプター上の効果を介して発揮されるのではない。he c7のFab〔及びF（ab'）フラグメント（図示せず。）〕も、1〜10μg/mlの範囲で十分な阻害活性を示す（図５〕。トランスエンドセリアルマイグレーションの阻害物質として、PECAM-1を特定した。単核白血球表面抗原に対する数種の他のmAb（クラスＩ MHC抗原、クラスII MHC抗原、Fcγレセプター及びCD14を含む）を同じ濃度で使用したが、ＴＥＭに影響を及ぼすことはできなかった（図６）。しかし、CD18に対するモノクローナル抗体IB4、白血球β₂インテグリン鎖、約70％までのHECに対するMoのブロックされた付着（これらは以前に見いだされている。（Muller and Weigl，1992 ））：それらのIB4存在下で単層を結合して残っているMoは、通常、明らかにトランスマイグレートした。実施例３抗ＰＥＣＡＭｍＡｂは、走化性に影響を及ぼさない。組織中でのＴＥＭの抑制は、単核細胞の走化性におけるｍＡｂの効果には依存しない。走化性分析は、化学的誘引剤で含浸した生のコラーゲンゲル中へロイコサイトを移動させる事により開発した。比較実験（表示せず）は、蛍光性ＩｇＧ程の大きさの分子が、６時間でその様なゲル中で平衡に達した事を示した。その様なゲル中への非活性Ｍｏの移動は無視される（Fig．７）ゲルに添加されたMoは、最も一般的なボイデンチャンバーアッセイ（Ｂｏｙｄｅｎｃｈａｍｂｅｒａｓｓａｙ）（Muller and Weigl，1992）と同様に、投与依存法でゲル中に移動するホルミル化ペプチドで含浸した。mAb hec7でのPBMC の培養は、この走化性に効果はなかったし、化学的誘引剤無しで、ゲル中への低い水準での不規則な移動にもなんら効果を持たなかった。様々な化学的誘引剤に対する好中球（PMN）の類似の移動は、hec7 mAbのその濃度では影響されなかった（Fig．７）。実施例４トランス移動におけるhec7 mAbの効果は、長期に継続するが、可逆的である。 hec7 mAbでのTEMの抑制は、少なくとも６時間（最長間点で試験した）、培地に維持され、PBMCは、mAbの連続した存在の中にあった（Fig．８）。然しながら、その培地の上澄み液からhec7を除去する事により、トランス移動の閉塞が無くなり、Moは、１時間後にトランス移動を開始した。調整培地へ戻した後、１時間半で、全てのMoがトランス移動した。（Fig．８）。この様に、抗ＰＥＣＡＭｍＡｂは、トランス移動工程を単にゆっくりと移動するものではなく、TEMにとって必要な重要なシグナルの認識及び応答への単核細胞の能力に、永久に影響を及ぼすものではない。実施例５ＨＥＣ中でＰＥＣＡＭに結合したｈｅｃ７モノクローナル抗体は、ブロック単核細胞を接合する。培養されたＨＥＣ上のＰＥＣＡＭの８５％以上は、内部細胞接合点に集中される（Muller 1989）。然しながら、この配置では、全てが生体の頂上表面に適用されたhec7 mAbに対して受容可能であっても、融合性単一層は貧弱である。事実、hec7及び内皮細胞表面（ICAM-1を含む）で膜蛋白質を認識する幾つかの他のmA bは、HEC単一層が、37℃で、１時間そのmAbで予備培養され、次いでPBMCの添加前にフリーの未結合の抗体を洗浄した場合、ブロックトランス移動に失敗した（データは示さず）。 HEC接合点でのPECAMが、TEMの工程中で演じる役割を研究する為に、hec7を内部細胞接合点へ運ぶ為の方法を考案した。半融合性HECへのhec7 Fabフラグメントの添加は、期待通り、反復調整培地に関わる融合性を達成する為に必要な時間を増加させた。（Muller，1992；Albelda，et al.，1990）。然しながら、一度、単一層が融合的になると、それは、位相顕微鏡で比較単一層から区別できなかった。免疫蛍光顕微鏡観察を、隣接HEC間の接合点に対して、hec7 FabフラグメントをIocalizedした生体の単一層で行った（Fig．9a）。未処理PBMC又は比較mAbの存在下でのPBMCが、その様な単一層（Fig．10，中央のグループ“hec7 Fab”）に添加されると、トランス移動が阻止された。Fig．1 0で示された実験では、幾つかの類似の実験同様に、TEMの抑制程度は、比較単一層上で同じ供与PBMCに添加されたhec7 IgGで達成する事のできたものと等しかった（Fig．10，左のグループ“比較”）。hec7 Fabの効果は、単に抗体フラグメントでの内部細胞接合点の阻害による立体効果ではなかった。この為の比較として、HEC単一層をmAb hec1のFabフラグメントの存在下に培養した。hec1は、この実験室で培養したmAbで、新規な、完全な膜蛋白質の：130kD を認識し、これは、PECAM-1同様に、HECの接合点に豊富で、PECAMとは違って、ロイコサイト或いは血小板上で発現しない。さらに、hec1は、hec7に対して同基準標本対である。 hec1のFabフラグメントは、HEC内部細胞接合点に集積した（Fig．9b）。然しながら、hec1 Fabの予備処理は、未処理単核細胞のトランス移動に効果を持たなかった（Fig．10，右のグループは“hec1 Fab”）。見られるとおり、hec7が、h ec7 Fab予備処理単一層（Fig．10，充填棒，hec7 Fabグループ）に曝露した単核細胞に添加されても、この抗PECAM試薬を、単核細胞（（Fig．10，充填棒，比較及びhec1 Fabグループ）又はHEC（（Fig．10，空白棒，hec7 Fabグループ）単独のいずれかに添加して達成された場合よりも、トランス移動の大きな抑制は達成されなかった。これは、単核細胞上のPECAMが、内皮細胞上でPECAMと同性方法で結合している相互作用を、hec7が阻害しているとする解釈と一致する。 hec7 Fabによるトランス移動の閉塞は、HEC単核細胞又は半内皮コラーゲンの外に浸出し、単核細胞PECAMに結合しているFabに依存しない。比較実験では、Fa b予備処理HEC培地は、Fig．10の実験で使用したそれと同じ方法で処理した。上澄み液は、37℃、１時間後にその培地から集め、単離したPBMCを新たに再懸濁する為に使用した。単離したPBMCは、次いでトランス移動分析に掛けられた。比較或いはhec7 Fab処理培地からの上澄み物は、いずれもMoのトランス移動を抑制しなかった（各々、96.8%±2.6%及び97.6±2.3%トランス移動）。実施例６組換え可溶性ＰＥＣＡＭは、ロイコサイトのトランス内皮移動を妨害する。 hec7が、単核細胞及び／又は内皮細胞ＰＥＣＡＭに結合し、同性接着の何れか又は両側を妨害してトランス移動を邪魔しているとすれば、Mo及びこの様なブロックトランス移動の為に、内皮ＰＥＣＡＭと競合する可溶形態の分子の使用を可能とするかもしれない。この仮説を試す為に、可溶性組替え形態のＰＥＣＡＭ− １を調製した。これは、六番目の免疫グロブリンドメインの真中で切断したものである。ＣＯＳ細胞中に発現するこの構造体は、培地に隠され、予測された９０ｋＤのＭｒにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに移動する。可溶性ＰＥＣＡＭは、この構造体と共に一時的に移されたＣＯＳ細胞で調整された培地から、hec7−セファローズ親和性カラムで精製された。この精製物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の期待した位置で単一帯として使用する。１μｇ／ｍｌと低い濃度で可溶性ＰＥＣＡＭが、標準分析でＰＢＭＣに添加されると、単核細胞のトランス移動を顕著に抑制する（Fig．10，斜線棒，比較及びhec1 Fab）。10μｇ／ｍｌの濃度では、hec7 IgGの最適濃度と同様に抑制し、 TEMをブロックしている幾つかの実験（表示しない）では、比較値の10％に低下した。培地における可溶性ＰＥＣＡＭの存在は、HEC接合点で、hec Fabで効果を受けたトランス移動の抑制を立証せず（Fig．10，斜線棒，hec7 Fab）、可溶性ＰＥＣＡＭは、同性的PECAM-PECAM相互作用をブロックしていると言う仮説と一致する。実施例７抗ＰＥＣＡＭｍＡｂは、サイトカイン活性化ＨＥＣ単一層を横切るＭｏのトランス移動を妨害する。この研究で使用した、in vitroでのトランス移動分析は、HEC単一層を使用し、外因性のサイトカイン又はエンドトキシンによって活性化されていない。内皮細胞は、VCAM-1又はE-セレクチン同様、サイトカイン誘起接着分子を発現せず、 ICAM-1の基底水準を有する（Muller and Weigt，1992）。単核細胞が、その様な接着分子を発現する為にサイトカインよって誘発される場合、Moのトランス移動は、基底条件下よりも尚一層早く、20〜30分以内で、半内皮コラーゲンを入れている Moの100%である（未発表のデータ）。それ故、hec7が、その条件下でトランス移動している単核細胞に劇的な効果を持つかどうかを決定する事が関心事であった。Fig．12で見る事ができる様に、それを行う。実施例８抗ＰＥＣＡＭ剤は、好中球（neutrophilis）のトランス移動を妨害する。 hec7は、HEC及びMoを結合する様に、PMNで表示される形態に対して結合しないけれども（未発表の観察）、好中球（PMN）は、また表面PECAMを運ぶ（Ohto et al.，1985；Goyert et al.，1986；Stockinger et al.，1990）。好中球は、組織中では静止しているHEC単核細胞を横切って容易には移動しない（Muller and Weigt，1992）。然しながら、それらは、サイトカイン活性化単核細胞を容易にトランス移動させる（未発表）。１時間後に、比較抗体の存在下で、97%のPMNが、TNF α-活性化HEC単一層の下に移動した。hec7 mAbは、約40%でトランス移動をブロックしたが、この分子の好中球形態への比較的弱い結合と一致する。然しながら、PECAMに対するポリクローナル兎免疫血清及び10μg/mlの可溶性組替えP ECAMは、比較水準の20%以下にまでトランス移動をブロックした（Fig．13）。この様に、PECAMは、それが単核細胞に対して行う様に、好中球のトランス移動において同様の役割を明らかに演じる。実施例９〜１１の為の材料と方法動物雌の二十日ネズミＣＤ２Ｆ₁、種の重量は凡そ20gを、チャールスリバーラボラトリー（Charles River Laboratories）（Boston，MA）から購入し、ロックフェラーユニバースティーラボラトリー動物研究センター（The Rockefeller University Lboratory Animal Reseach Center）で飼育した。雌の二十日ネズミ AKR/J種を、ジョンソンラボラトリー（Jackson Laboratories）（BarHarbor，ME ）から購入し、ボストン大学の医薬研究室動物科学センター（Boston Universit y School of Medicine Laboratory Animal Science Center）で飼育した。全ての動物の経歴は、ロックフェラー大学とボストン大学（Rockefeller University とBoston University School of Medicine IACUC）で証明された。動物は、“Gu ide for the Care and Use of Laboratory Animals”及び“Animal Welfare Act ”に示されるガイドラインに沿って取り扱われた。二十日ネズミは、標準の籠で一緒に飼育され、食物及び水は自由に摂取出来る様にした。モノクローナル抗体モノクローナル抗体（mAb）2H8 ハムスター抗ネズミ科のPECAM-1を、開示（Bogen et al.，）の通りに造り、25mMの2-［N-Morpholino ］etanesulfonic acid（MES）で負荷しながら、500mMのNH₄SO₄+5mMのKH₂PO₄の線状10%〜60%勾配で溶出させながら、pH6.7で、JT Baker ABx semi-preparative c olumnを使用するHPLCで精製した。変性条件下での2H8 mAbの精製は、in vivoでは効果が少な抗体調製となった。2H8 mAbは、Limulus amebocyte lysateassay（ Sigma，St．Louis，MO）による毒性にたいして陰性であった。ハムスター抗ネズミ科CD18 mAb 2E6は、ロックフェラー大学（Rockefeller University）（Metlay etal.，1990）でもともと造られたもので、Endogen Inc．（Boston，MA）により供与された。ハイブリドーマライン産生mAb 5C6（Hybridoma lines producing m Ab 5C6）（rat anti-murine CD11b）（Rosen and Gordon 1987）は、Dr．Hugh R osen（Merck，Sharp&Dohme Reseach Laboratories，Rahway，NJ）によって用意された；IgGは、前に述べられた様に細胞上澄み液から精製された（Muller et a l.，1993）。通常のハムスターIgGは、ジャックソン免疫研究所（Jackson Immun o Resarch Lboratories，Inc.）（West Grove，PA）から購入した。全てのmAbは、flow cytometry及び／又はimmunohistochemistryにより、それらの特定抗原確認の為に例示された。免疫組織化学白血球を、ヘパリンを加えたシリンジで心臓に孔を開けて採取した血液のバッフィーコート（軟膜）から単離した。ピロゲンを含まない蒸留水９容量に該バッフィーコートペレットを再懸濁したものにより、赤血球細胞を、氷上で６０秒間溶解した。１０ＸＰＢＲを１容量加え、該懸濁物を遠心分離し、白血球含有ペレットをＨＢＳＳで洗浄した。マウス組織の凍結物、又は単離した末梢血白血球若しくは腹膜浸出細胞のサイトスピン（sytospin）調製物を、上述したように（ミュラー（Muller）ら1989；ボーゲン（Bogen）ら1992）間接イミュノパーオキシダーゼ組織化学により染色した。簡単に説明すると、外因性パーオキシダーゼ活性をＨ₂Ｏ₂との反応によりとらえ、上記マウス組織の凍結物をＰＢＳ／オヴァルブミンで希釈した第１のｍＡｂを用い、室温で３０分間培養し、ＰＢＳ／オヴァルブミンで洗浄し、次いで西洋ワサビのパーオキシダーゼ−結合ヤギ抗−ハムスターＩｇＧ（Accurate Scien tific，Westbury，NY）の１：２００希釈物中、室温で３０分間培養し、洗浄及びジアミノベンジジン−Ｈ₂Ｏ₂で現像した。実験手順チオグリコレートブロスの腹腔内（i.p.）注射に応答するマウス腹膜腔（periteneal cavity）へのＰＭＮの移動は、急性の炎症の十分確立されたモデルである（レウインソーン（Lewinsohn）ら、1987；ワトソン（WAtson）ら、1 991）。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で最終容量が約１００μ ｌになるように希釈した種々のモノクローナル抗体を、マウスに外側尾静脈から静脈（i.v.）注射した。いく匹かのコントロールマウスには、ＤＰＢＳ単独か又は正常ハムスターＩｇＧの当量を注射した。４時間後、マウスに４％のブレワーのチオグリコレートブロス（Difco，Detroit，MI）１mlを腹腔内（i.p.）注射した。該ｍＡｂを注射してから２４時間後に、マウスをＣＯ₂に晒して殺した。標準手順（ミュラー（Muller）ら、1980）を用い、２価カチオンを含有しないハンクのバランスした塩溶液（ＨＢＢＳ，Gibco，Grand Island，NY）５mlで洗浄することにより、氷上のチューブ内に腹腔内細胞を集めた。ヘパリンを加えた血液を、心臓にあけた孔又は後眼窩（retro-orbital sinus）から収集した。ヘマサイトメーターを用いて、それぞれのマウスからの試料について腹腔内細胞及び末梢白血球の数を数えた（ウノペットエリスロサイト（Unopette erythrocyte）溶解キット（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）を用いた）。ライト／ジームサ（Wright/Giemsa）染色サイトスピン調製物（腹腔内細胞について）及び末梢血液標本について白血球百分率を測定した。腹腔及び胸腔について、異変の兆候を調べた。腸間膜リンパ節を採取し、４％パラホルムアルデヒド、２％グルタルアルデヒドを含む0.1Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.4）中に固定した。肝臓及び脾臓を完全に切取り、重量を測定した。小腸及び大腸のほとんどとともにこれらの組織を、中性にバッファーしたホルマリン中に固定した。代表的な部分をパラフイン又はメチルメタクリレート中に埋め込んだ。一部を切り、メタトキシリン及びエオシン（eosin H&E）で染色した。実施例９これまでの実施例は、定量in vitro移動検定（ミュラー（Muller）ら、1993）において、単球と好中球とが休止状態でサイトカイン−活性化ＨＥＣを横切って移動するのにＰＥＣＡＭ−１を必要とすることを実証し、炎症及び感染のような侵入剌激に応答して白血球の移動が生じる他の条件において、ＰＥＣＡＭが中心的役割を果たすといった観察や結論を示唆するものであった。次ぎに示す実験では、急性腹膜炎のネズミ科動物モデルを用いて、静脈内（i. v.）に投与した抗−ネズミＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂが急性炎症をブロックするか否かを試験した。以下に示す結果は、抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂが炎症反応における重要な接着分子として、ほぼバックグラウンドレベルにしたＰＥＣＡＭ−１に対して好中球と単核白血球が移動するのを阻止することを具体的に示している。ネズミＰＥＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の急性炎症のブロックについてＰＥＣＡＭ−１がin vivoにおいて急性炎症にたいして重要な役割を演じるか否かを調べるために、チオグリコレートブロスの腹腔内（i.p.）注射の４時間前に、ハムスター抗−ネズミＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂ２Ｈ８（ボーゲン（Gogen）ら、1992）又は適当な陽性若しくは陰性のコントロールｍＡｂを静脈内（i.v.）投与した（図１４及び１５）。急性腹膜炎のこの十分確立されたモデルにおいて、腹腔内チオグリコレートは、最初の２時間以内に腹膜腔への好中球の流入を誘導する（レウインソーン（Lewinsohn）ら、1987；ワトソン（WAtson）ら、1991 ）。炎症の程度を、チオグリコレート注射の２０時間後に腹腔内洗浄により測定した。実施した７つの実験のうち７つについて、抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂは、腹膜腔への白血球の移動を阻止した。いくつかの代表的な実験を図１４及び１５に示す。特異的な２つの実験を図１５Ａ及び１５Ｂに示す。全ての場合において、抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂの効果は、すでにこのモデル（ローゼンとゴードン1987）において急性炎症をブロックすることが示されている陽性コントロールｍＡｂ５Ｃ６（抗−ＣＤ１１ｂ）の効果に匹敵するものであった。２Ｈ８の活性Ｆａｂ又はＦ（ａｂ'）₂断片の製造と精製は、技術的に問題があることがわかった。従って、図１５Ｂに示した実験及び他の同様な実験において、ハムスター抗−マウスＣＤ１８（２Ｅ６）はコントロールとして働いたが、これはネズミ白血球に強固に結合するが、インテグリン（integrin）機能の比較的弱いブロッカー（メトレー（Metlay）ら、1990）であるからである。このｍＡｂが移動をブロックしないことは、抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂに見られるブロックに応答する結合ｍＡｂの非特異的又はＦｃ誘導効果を支配する。２Ｅ６で処理したネズミからの末梢血の免疫染色から、ネズミを殺した時にこのｍＡｂが容易に検出可能なレベルで依然として白血球が結合していることがわかる（データ示さず）。図１４及び１５は別個にＰＭＮ浸出物及び全浸出細胞（リンパ球とマクロファージを含む）についてのデータを示している。抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂによりもたらされるＰＭＮの蓄積の減少は、特にドラルチックであり、それは、これらの細胞が通常腹腔内にないからである。追加の実験から、ｍＡｂ２Ｈ８による炎症の重要な抑制を、５０μｇ／ネズミ（試験した最も少ない投与量、図１４）といった低い投与量で達成したこと及び抑制効果が少なくとも４８時間継続したこと（データ示さず）が明らかになった。この時間における経過は、抗−ＣＤ１１ｂ遮断（ローゼンとゴードン1987）について述べたのと同様であり、Ｌ−セレクチン（ワトソン（Watson）ら）の遮断又はＰ−セレクチン（マヤダス（Mayadas ）ら）のノックアウトによりこのモデルで見られる４時間の抑制よりも遥に低い。実施例１０抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂは粘着性白血球の移動を阻止するようであるこれらの抗体の投与は、循環している白血球の数を減少させなかった。ＰＭＮが循環系に補充されているが、炎症部位への移動がブロックされているといった仮説に合致して、事実、ネズミを殺した時、抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂ（表１）を投与したこれらのネズミには、顆粒球増加症が見られた。組織学的実験から、脾臓又は肝臓での白血球の異常な蓄積が生じていないことが明らかとなった（データ示さす）血小板の絶対数は数えなかったが、実験した群には、血小板の数における差異や末梢血流の状態における差異は観察されなかった。表中の^*は、末梢白血球の数。データは、平均値±平均値の標準偏差として示した。^**多形白血球の％。数えた１００以上の細胞からの（好中球）／リンパ球／単球。正常なネズミのＷＢＣ白血球百分率は、リンパ球が多いことに留意のこと。チオグリコレートを投与されたネズミは、好中球にクループ化される未成熟形態を含むミエロイド形態の％が増加した。N．Ham．IgG^***は正常ハムスタ−ＩｇＧである。抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂを投与されたネズミの腸間膜の組織学的実験からコントロールに比べて、細静脈におけるリンパ管内のＰＭＮの数が増加することが分かった。これらのＰＭＮＨは内皮表面に接触しているように思われるが（図１６）、in vitroにおいて観測された移動のブロックと同様に、血管を横切って移動するのが阻止されている（ミュラー（Muller）ら1993）。図１６Ａにこの現象が生じているより極端な例の１つを示すが、抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂで処理したネズミにおけるランダムな腸間膜細静脈のプロフィールの約６０％が粘着性白血球を有しているように思われる（図１６Ｅ）。この現象は、ＰＭＮの移動の部位でもある若干大きな細静脈と同様にポスト（post）毛細細静脈において観察される（コトラン（Cotran）、1965）。内皮に隣接する真の非粘着性白血球を発見するチャンスは、これらの大きな直径の細静脈においてはほとんどないので、このような細静脈（５０−１５０μｍの直径）のランダムな１０の部位について、それぞれのネズミからの標識したスライドについて調べ、血管の壁に接触しているか又は循環中にはない白血球の数を数えた。コントロール動物（チオグリコレート投与せず）又は２Ｈ８以外のｍＡｂを投与された動物については、ほんのわずかな白血球が内皮に接触していた（図１６Ｂ及び１６Ｅ）。細静脈間に変動があるが、抗−ＰＥＣＡＭ−１処理したネズミの細静脈において観察される全ての白血球の３４％が明らかに内皮に接触していた。これらのネズミの免疫組織学的実験から、抗−ＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂは、腸間膜細静脈を含む血管構造中の内皮によって依然として保持されていることが分かった。これらの血管は脂肪組織に見られ、凍結部位により貧弱に切断されるので、この現象は腸壁内の血管に現れる（図１６とＣＤ）。循環ＰＭＮにおける残留２Ｈ８は免疫パーオキシダーゼ技術を用いたところ検出できなかった。しかしながら、このことは２４時間の間におけるＰＭＮの交代及び／又はＰＭＮ膜からのネズミＰＥＣＡＭ−１の脱落によるものであろう。実施例１１抗PECAM-1 mAbが単核細胞の移動を阻害する多くの単核細胞及びPMNが、チオグリコレート注入後２０時間で、腹腔に補充される。図１４及び１５から、腹腔滲出細胞中の増加が、PMN中の増加によってのみでは説明できないことがわかる。抗PECAM-1 mAb 2H8も腹腔への単核細胞の流入を阻害した（図１５、右）。 PECAM-1の阻害が、単核細胞の動き（trafficking）に影響を与えたか否かを決定するために、腹腔に引き出す腸間膜リンパ節を調べた。他のリンパ腺床中で、腸間膜叢（mesenteric plexus）によって、腹腔が引き出される。輸入リンパ管中の腹腔単核細胞は被膜下洞を経て、引出しリンパ節に入るであろう。腸間膜節を調べることにより、チオグリコレートで剌激を与えたマウス中の被膜下洞を経て進入する大量の単核細胞の数が明らかにされたが、これと比較してチオグリコレートの前に抗PECAM-1 mAbを与えたマウスの被膜下洞中ではほとんどなかった（図１７）。被膜下洞中の単核細胞の不足は、単核細胞が腹腔に入る阻害性に対して直接影響を与える。これらのデータは図１４及び１５のデータと一致しており、単核細胞の断片を選択的に表している。PMNは、一般的には引出しリンパ管に再循環することはなく、これらのマウスのリンパ節の被膜下洞には見られない。さらに、ある実験では、抗PECAM-1処理したマウスにとってのチオグリコレート導出腹腔滲出細胞数は、チオグリコレートで剌激していないコントロールマウスにとってのものより少なかった（図１４及び図１５、右側）。これから、PECA M-1が、腹腔を通る単核細胞の本質的な動きにとって、及び、チオグリコレート導出移動にとって必要であることが示唆された。ヒト白血球及び内皮細胞を用いるイン・ビトロ（in vitro）モデルで、抗PECAM- 1又は溶解性再結合PECAM-1は、付着（attachment）に影響を及ぼさないが、単球及びPMNの移動を阻害する（ミューラー（Muller）ら、1993年）。ここで、PMNは、細胞間結合の先端表面、即ち内皮PECAM-1が濃縮されている細胞間結合の部位に強く結合している（ミューラー（Muller）ら、1989年）。経内皮移動（transe ndothelial migration）中のPECAM-1の機能は、セレクチン−媒介ローリング及び内皮細静脈（venular endothelium）の先端表面へのβ2インテグリン−媒介付着とは遠いものである。本研究の結果（特に図１６を参照のこと）から、抗PECAM-1 mAbによって腹腔への進入を阻害された白血球は、内皮細静脈の管腔表面に明らかに拘束されたので、PECAM-1は生体内で（in vivo）同じ役割を果たしていることが示唆される。影響を受けた静脈の管腔表面の大部分は、白血球がなく、かつ、顆粒球増加症が持続することから、内皮表面でのこの拘束は、過渡的なものであると仮定される。抗PECAM-1 mAbによって影響を受ける移動阻害は、抗CD11-bによる阻害とは異なるメカニズムを含んでいるようである。後者の場合、顆粒球増加症は末梢血では見られず、PMNの腹腔への移動は阻害されるが、白血球が静脈壁に明らかに接触しているのは見られない。このことは、内皮表面に強く付着することを媒介する β2インテグリンについて提案された役割とつじつまが合う（フォン・アンドリアン（von Andrian）ら、1991年；ローレンス（Lawrence）ら、1991年；ロー（L o）ら、1991年）。イン・ビトロ（in vitro）モデルで、白血球の移行（transmigration）は、白血球又は内皮細胞のいずれかを抗PECAM-1試薬で処理することによって同様に阻害することができる。我々は、2H8 mAbが、白血球、内皮、又はその両者においてP ECAM-1を阻害することによって白血球の移行を阻害するのか否かを知らなかった。抗PECAM-1 mAbは、生体内（in vivo）PMNと同様に単核細胞の移動（emigration ）を阻害したので、PECAM-1は、経内皮移動の方法に必要である、すべてのタイプの白血球に共通の機能を媒介することができる。また、阻害は、少量の抗PECA M-1 mAbの投与により影響を受け（ある実験において５０μｇ／マウス）、１回の注入で４８時間まで継続した。これらの観察結果から、PECAM-1が抗炎症治療のターゲットに好適な分子としての役割を有していることを支持している。さらに、上記の結果から、生体内の環境におけるPECAMの作用がわかる。実施例９で提示された腹膜炎のネズミのモデルから、実施例１−８で例示した炎症での PECAM-1/CD31の役割が確認された。チオグリコレート・ブイヨンを腹腔内注射する４時間前に、ネズミのPECAM-1に特異なモノクローナル抗体を静脈注射すると、腹腔への白血球の移動を４８時間阻害した。コントロールのモノクローナル抗体（その機能を阻害せずにネズミCD18に結合するものを含む）は、同じか、又はより高濃度で用いたとき、移動を阻害しない。抗PECAM-1抗体とともに見られる移動の減少は、肺、脾臓、又は他の内臓器官の好中球減少又は好中球滞留によるものである。なお、末梢血白血球数は、これらのマウスでは減少していない。抗 PECAM-1モノクローナル抗体で処理したマウスの腸間膜静脈で、白血球はしばしば血管の管腔表面と結合しているのが見られるが、移動（emigrate）しているようではなかった。よって、イン・ビトロ（in vitro）モデルで先に見られた、白血球の経内皮移動におけるPECAM-1の必要性は、急性炎症のこの生体内モデルにも妥当であることがわかる。さらに、バポーシャン（Vaporciyan）と共同研究者（バポーシャンら、1993年）によって最近発表されたある発見が、本発明の前提及び結論に、さらに確証を与える。ミューラーら（1993年）の結果、及び経内皮移動におけるPECAM-1の重要な役割を例示する、上記概述の非発表データに基づいて、バポーシャンらは、炎症の３つの異なるモデルによりPECAM-1の作用を研究し、これら３つのモデル全てにおいて、PECAMは好中球移動の増進に活性的な役割を示すことを見出した（バポーシャンら、1993年の参考文献９及び１９を参照のこと）。特に、著者らは、ヒトPECAM-1と反応活性であり、かつラットPECAM-1と交叉活性のウサギ・ポリクローナル抗体を調製し、その特異性を確立した後に、ラットにおける２つの区画でその作用を試験した。即ち、腹腔に導入したグリコーゲンによって誘導した好中球蓄積における効果、及び肺における免疫グロブリンＧ（Ig G）免疫複合体の沈着、及び重症複合型免疫不全症（SCID）に伴うヒト皮をマウスに移植する際における効果を試験した。第１のモデルで、グリコーゲンの点滴時、及びその後定期的に抗PECAM-1抗体をラットに静脈注射すると、グリコーゲン誘導腹腔好中球の蓄積を７５％まで阻害した。第２のモデルで、抗体を、免疫複合体による損傷（injury）の開始の２．５時間後から開始して３０分の間隔をおいて、静脈注入した。再度、好中球増加において７５％の減少が観察された。第３のモデルの植皮をTNF-αによって移植後４週間、免疫性をテストした。抗体を受け入れるこれらの植皮は、好中球の増加及び移動に減少が見られた。これらのテストの結果から、PECAM作用に関するこの発見に確証を与え、さらに、本発明のモジュレーターの治療上の有用性の確認をすることができる。実施例１２ PECAM-1分子の外部領域の部分を有するPECAM-1の溶解性形態が、白血球の経内皮移動を阻害するのに有効である（図１０及び１３、及びミューラーら、1993年）ことがわかったので、また、阻害性mAb hec7が、PECAM-1分子の領域１及び２の間でPECAM-1と結合することがわかったので、宿主に適切に導出できたとき、例えばPECAMの領域１及び２に対応する、より小さなポリペプチド断片を、経内皮移動を阻害するのに用いることできることがわかる。そのような使用の１つの例として、PECAM-1の領域に結合するリガンドに対応するポリペプチドを、又は例えば、PECAM-1の領域１及び２を含む２１０個のアミノ酸ペプチドを、慢性的な炎症の状態（例えば、全身性紅斑性狼瘡）が勃発するのに悩んでいる患者に非経口投与することができる。溶解性ペプチドは、経内皮移動が阻害され、白血球（炎症部位への内皮結合を交差できない）が内皮の先端表面で少しの間拘束された後、循環系に戻る（抗PECAM mAbが、ネズミのモデルの炎症（図１４−１６）で非経口投与されたときに生ずる）ような、白血球及び内皮細胞のＰＥＣＡＭ−ＰＥＣＡＭ相互作用を阻害するであろうと予想される。炎症の勃発（例えば、腎臓疾患）が心身に与える有害な影響は改良されるであろうと予想される。これは、例えば、この場合、腎臓機能の標準臨床測定によって、モニターすることができる。さらに、一種又は複数の、構造的にPECAM-1とは無関係な、しかしその活性領域の構造を模倣しているか又はそれに相補的な分子が、結合によってPECAM機能を抑制するか、又は天然のリガンドの結合を競争的に抑制することが予想される。接着性分子の二次構造の変換が、ある場合において、これらの分子を機能させるのに極めて重要であることが示されてきた。そのため、そのような状況がPECAM- 1において見出されるならば、適する構造変換の形成又は保持を、抑制又は促進する分子を、PECAM機能を、それぞれ阻害又は増加させるのに使用してもよい。そのような阻害又は増加させる分子は、ペプチド、小さな有機分子、並びに金属イオン及びその錯体のような無機分子でもよい。前述したものは、抗PECAM抗体又は完全長の可溶性PECAM-1以外の分子が、本発明においてどのように使用されるかの非限定例である。実施例１３次に示すのは、本発明の治療方法に従う例において使用される代表的な処方である。静脈注射用の処方Ｉ成分ｍｇ／ｍｌセフォタキシム 250.0 モノクローナル抗体hec7 10.0 デキストロースUSP 45.0 亜硫酸水素ナトリウムUSP 3.2 エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムUSP 0.10 水を加えた後の全量 1.00ml静脈注射用の処方II 成分ｍｇ／ｍｌアンピシリン 250.0 rhPECAM-1 10.0 亜硫酸水素ナトリウムUSP 3.2 エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムUSP 0.1 水を加えた後の全量 1.00ml静脈注射用の処方III 成分ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（硫酸塩を使用） 40.0 モノクローナル抗体hec7 10.0 亜硫酸水素ナトリウムUSP 3.2 エチレンジアミン四酢酸ニナトリウムUSP 0.1 水を加えた後の全量 1.00ml静脈注射用の処方IV 成分ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗体hec7 10.0 デキストロースUSP 45.0 亜硫酸水素ナトリウムUSP 3.2 エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムUSP 0.10 水を加えた後の全量 1.00ml静脈注射用の処方Ｖ成分ｍｇ／ｍｌ rhPECAM-1 10.0 亜硫酸水素ナトリウムUSP 3.2 エチレンジアミン四酢酸ニナトリウムUSP 0.1 水を加えた後の全量 1.00ml 既に述べたように、本発明は脳膜炎のような、体のどの部分でも起こる能動型の感染症を含む様々な炎症の処置に使用することができる。また、体の離れた部分において起きた一次的炎症により二次的に抗原の沈着が起きた部分において発生しうる急性又は慢性の二次炎症のような状態も含まれる。特にこれらの状態として、例えば、脳膜炎、脳炎、関節炎、ぶどう膜炎、大腸炎、腸／クローン病のような炎症、糸球体腎炎、皮膚炎、及び乾せんが挙げられる。また、敗血症に伴って起こる呼吸窮迫症候群のような感染症の際に白血球移動の変質から起こる炎症も含む。その他の炎症を起こす病気としては、免疫不全、及びＴ細胞及び／又はマクロファージの付着／認識に関する状態も含み、例えば、移植片対宿種反応のような急性及び遅延過敏症、悪性貧血のような一次自己免疫病、Ｉ型糖尿病のような自己免疫病に関する感染症、リューマチ関節症による発赤、多発性硬化症のような白血球の血管外遊出症を含む病気、上記に挙げたある種の二次感染症を含む抗原 −抗体錯体を媒体とする病気、及び移植拒絶反応が挙げられる。呼吸窮迫症候群やリパーフュージョン（reperfusion）障害のような毒性のショック又は外傷による炎症、及び白血球の悪液質及び転移のような腫瘍性の症状による炎症は、同様にここに述べた観点に含まれる。上記に加えて、本発明は、病気ではない状態、特に診断及び治療目的における白血球の移行抑制に適用可能である。これは例えば、色素又は画像増強剤を組織内に導入する際に起きる白血球の移入を防止したり、化学療法の場合において治療剤を選択的に導入させたり、又は患者からの白血球の採取を増加させることが挙げられる。次に示すのは、前述の明細書において引用した文献の略書したリストである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＧＡＢＸＡＣＣＡＣＤＡＣＫＡＤＰＡＤＱＡＤＵＡＥＤ 39/395 ＡＢＥＮ 9284−4ＣＡＣＶＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｋ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2ＪＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦＡＢＸＡＤＰＡＥＤＡＣＣＡＣＤＡＤＱＡＣＫＡＤＵＡＡＢ 9281−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．感染又は非感染状態の哺乳動物の急性及び／又は慢性の炎症部位への白血球の経内皮移動（transendothelial migration（TEM））を調節する方法であって、ＰＥＣＡＭに対する抗体、ＰＥＣＡＭ活性に対する拮抗物質、組換えヒトＰＥＣＡＭ−１（rhＰＥＣＡＭ−１）及びそれらの活性フラグメントからなる群から選ばれたＴＥＭ調節量の薬剤を投与することを特徴とする方法。２．抗−ＰＥＣＡＭ抗体が、抗−ＰＥＣＡＭ−１である請求の範囲１記載の方法。３．抗−ＰＥＣＡＭ抗体が、モノクローナル抗体hec7、又はその活性フラグメントである請求の範囲１記載の方法。４．モノクローナル抗体又はその活性フラグメントが、ハイブリドーマhec7.2， ATCC No．HB 11227から調製されたものである請求の範囲３記載の方法。５．白血球の経内皮移動が、感染に関連している請求の範囲１記載の方法。６．白血球の経内皮移動が、非感染性外傷に関連している請求の範囲１記載の方法。７．白血球の経内皮移動が、内毒素ショックに関連している請求の範囲１記載の方法。８．白血球の経内皮移動が、成人呼吸障害症候群に関連している請求の範囲１記載の方法。９．感染が、髄膜炎、日本脳炎、関節炎、ブドウ膜炎、大腸炎、皮膚炎、及び成人呼吸障害症候群からなる群から選ばれた病態に関連している請求の範囲５記載の方法。 10．白血球の経内皮移動が、器官移植又は組織同種移植片の続発症；アテローム性動脈硬化症（動脈硬化症）；多発性硬化症、全身性狼瘡紅斑、リウマチ関節炎、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症（硬皮症）、強直脊椎炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、類天疱瘡、タイプＩ糖尿病、重症筋無力症、甲状腺炎、バセドウ病、グッドパスチャー症候群、混合結合組織病、硬化性胆管炎、クローン病（限局性回腸炎）及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸炎、若年性悪性貧血、炎症性皮膚炎；通常の間質性肺炎、石綿症、珪肺症、ベリリウム中毒、滑石沈着症、様々な全ての塵肺症、サルコイドーシス（肺及び他の器官の）、落屑性間質性肺炎、リンパ様間質性肺炎、巨大細胞間質性肺炎、細胞性間質性肺炎、外因性アレルギー性歯槽炎、ウェジナー肉芽腫症、及び関連する脈管炎；動脈炎；一時的動脈炎及び多発性動脈炎ノドサ（nodosa）；自己免疫とは思われない炎症性皮膚炎；慢性活性肺炎；遅延性過敏性反応（例えば、毒アイビー皮膚炎）；何らかの原因に基づく肺炎又は他の呼吸管炎症；何らかの病因による成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）；炎症性浮腫を伴う日本脳炎；喘息、枯草熱、皮膚アレルギー、急性アナフィラキシー、等の直接過敏性反応；一時的動脈炎及び多発性動脈炎ノドサ、等の動脈炎；何らかの病因に基づくリウマチ熱、急性及び／又は慢性糸球体腎炎、等の免疫複合体の急な沈積を含む疾病、例えば、感染後の（例えば、ストレプトコッカス感染後の）糸球体腎炎、全身性狼瘡紅斑の急性増悪；腎盂腎炎；蜂巣炎；膀胱炎；急性胆嚢炎；及び胃腸管、膀胱、心臓、又は他の器官、特に破裂し易い器官に沿って一過性の虚血を生じる状態；同種器官又は組織の移植後の時期における同種移植片拒絶反応、からなる群から選ばれた状態に基づくものである請求の範囲１記載の方法。 11．炎症及びそれに通常関連している状態の処置のために、白血球の経内皮移動を阻害する、請求の範囲１記載の方法。 12．前記哺乳動物における免疫妥協状態の改善ために、白血球の経内皮移動を促進する、請求の範囲１記載の方法。 13．白血球の経内皮移動が、医原性状態に基づくものである、請求の範囲１記載の方法。 14．感染又は非感染状態により起こされた、患者の組織及び器官の炎症を処置する方法であって、ＰＥＣＡＭに対する抗体、ＰＥＣＡＭ活性に対する拮抗物質、組換えヒトＰＥＣＡＭ−１（rhＰＥＣＡＭ−１）及びそれらの活性フラグメントからなる群から選ばれた処置有効量の薬剤を、その処置を必要とする患者に投与することを特徴とする方法。 15．抗−ＰＥＣＡＭ抗体が、抗−ＰＥＣＡＭ−１である請求の範囲14記載の方法。 16．抗−ＰＥＣＡＭ抗体が、モノクローナル抗体hec7、又はその活性フラグメントである請求の範囲15記載の方法。 17．モノクローナル抗体又はその活性フラグメントが、ハイブリドーマhec7.2， ATCC No．HB 11227から調製されたものである請求の範囲３記載の方法。 18．薬剤が静脈注射により投与される請求の範囲14記載の方法。 19．薬剤が経口投与される請求の範囲14記載の方法。 20．薬剤が非経口投与される請求の範囲14記載の方法。 21．炎症が、感染に関連している請求の範囲14記載の方法。 22．炎症が、非感染性外傷に関連している請求の範囲14記載の方法。 23．炎症が、内毒素ショックに関連している請求の範囲14記載の方法。 24．炎症が、髄膜炎、日本脳炎、関節炎、ブドウ膜炎、大腸炎、皮膚炎、及び成人呼吸障害症候群からなる群から選ばれた病態に関連している請求の範囲21記載の方法。 25．炎症が、器官移植又は組織同種移植片の続発症；アテローム性動脈硬化症（動脈硬化症）；多発性硬化症、全身性狼瘡紅斑、リウマチ関節炎、シェークルン症候群、進行性全身性硬化症（硬皮症）、強直脊椎炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、類天疱瘡、タイプＩ糖尿病、重症筋無力症、ハシモト甲状腺炎、バセドウ病、グッドパスチャー症候群、混合結合組織病、硬化性胆管炎、クローン病（限局性回腸炎）及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸炎、若年性悪性貧血、炎症性皮膚炎；通常の間質性肺炎、石綿症、珪肺症、ベリリウム中毒、滑石沈着症、様々な全ての塵肺症、サルコイドーシス（肺及び他の器官の）、落屑性間質性肺炎、リンパ様間質性肺炎、巨大細胞間質性肺炎、細胞性間質性肺炎、外因性アレルキー性歯槽炎、ウェジナー肉芽腫症、及び関連する脈管炎；動脈炎；一時的動脈炎及び多発性動脈炎ノドサ（nodosa）；自己免疫とは思われない炎症性皮膚炎；慢性活性肺炎；遅延性過敏性反応（例えば、毒アイビー皮膚炎）；何らかの原因に基づく肺炎又は他の呼吸管炎症；何らかの病因による成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）；炎症性浮腫を伴う日本脳炎；喘息、枯草熱、皮膚アレルギー、急性アナフィラキシー、等の直接過敏性反応；一時的動脈炎及び多発性動脈炎ノドサ、等の動脈炎；何らかの病因に基づくリウマチ熱、急性及び／又は慢性糸球体腎炎、等の免疫複合体の急な沈積を含む疾病、例えば、感染後の（例えば、ストレプトコッカス感染後の）糸球体腎炎、全身性狼瘡紅斑の急性増悪；腎盂腎炎；蜂巣炎；膀胱炎；急性胆嚢炎；及び胃腸管、膀胱、心臓、又は他の器官、特に破裂し易い器官に沿って一過性の虚血を生じる状態；同種器官又は組織の移植後の時期における同種移植片拒絶反応、からなる群から選ばれた状態に基づくものである請求の範囲14記載の方法。 26．抗感染剤を投与されている患者の炎症を解消又は軽減するための、請求の範囲14記載の方法であって、該抗感染剤の投与に先立ち、又は同時に、又は後に、処置を必要とする患者に、白血球の経内皮移動を調節するのに有効な、処置量の薬剤を投与する工程を含み、該薬剤が、ＰＥＣＡＭに対する抗体、ＰＥＣＡＭ活性に対する拮抗物質、組換えヒトＰＥＣＡＭ−１（rhＰＥＣＡＭ−１）及びそれらの活性フラグメントからなる群から選ばれたものであることを特徴とする方法。 27．抗−ＰＥＣＡＭ抗体が、抗−ＰＥＣＡＭ−１である請求の範囲26記載の方法。 28．抗−ＨＥＣ抗体が、モノクローナル抗体hec7又はその活性フラグメントである請求の範囲26記載の方法。 29．抗感染剤が、ベータラクタム系抗生物質である請求の範囲26記載の方法。 30．薬剤が静脈注射により投与される請求の範囲26記載の方法。 31．薬剤が経口投与される請求の範囲26記載の方法。 32．炎症が、内毒素ショックに関連している請求の範囲26記載の方法。 33．炎症が、感染源の成人呼吸障害症候群に関連している請求の範囲26記載の方法。 34．炎症が、髄膜炎、日本脳炎、関節炎、ブドウ膜炎、大腸炎、ＡＲＤＳ、及び皮膚炎からなる群から選ばれた病態に関連している請求の範囲26記載の方法。 35．炎症が、器官移植又は組織同種移植片の続発症；アテローム性動脈硬化症（動脈硬化症）；多発性硬化症、全身性狼瘡紅斑、リウマチ関節炎、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症（硬皮症）、強直脊椎炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡、類天疱瘡、タイプＩ糖尿病、重症筋無力症、甲状腺炎、バセドウ病、グッドパスチャー症候群、混合結合組織病、硬化性胆管炎、クローン病（限局性回腸炎）及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸炎、若年性悪性貧血、炎症性皮膚炎；通常の間質性肺炎、石綿症、珪肺症、ベリリウム中毒、滑石沈着症、様々な全ての塵肺症、サルコイドーシス（肺及び他の器官の）、落屑性間質性肺炎、リンパ様間質性肺炎、巨大細胞間質性肺炎、細胞性間質性肺炎、外因性アレルギー性歯槽炎、ウェジナー肉芽腫症、及び関連する脈管炎；動脈炎；一時的動脈炎及び多発性動脈炎ノドサ（nodosa）；自己免疫とは思われない炎症性皮膚炎；慢性活性肺炎；遅延性過敏性反応（例えば、毒アイビー皮膚炎）；何らかの原因に基づく肺炎又は他の呼吸管炎症；何らかの病因による成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）；炎症性浮腫を伴う日本脳炎；喘息、枯草熱、皮膚アレルギー、急性アナフィラキシー、等の直接過敏性反応；一時的動脈炎及び多発性動脈炎ノドサ、等の動脈炎；何らかの病因に基づくリウマチ熱、急性及び／又は慢性糸球体腎炎、等の免疫複合体の急な沈積を含む疾病、例えば、感染後の（例えば、ストレプトコッカス感染後の）糸球体腎炎、全身性狼瘡紅斑の急性増悪；腎盂腎炎；蜂巣炎；膀胱炎；急性胆嚢炎；及び胃腸管、膀胱、心臓、又は他の器官、特に破裂し易い器官に沿って一過性の虚血を生じる状態；同種器官又は組織の移植後の時期における同種移植片拒絶反応、からなる群から選ばれた状態に基づくものである請求の範囲 26記載の方法。 36．白血球の経内皮移動を測定する方法であって、Ａ．ヒトの内皮細胞のコロニーからの試験基質を提供する工程；Ｂ．前記哺乳動物から所定量の白血球を含むと考えられる生物学的試料を採取する工程；Ｃ．工程Ｂの生物学的試料を前記試験基質と共に前記白血球の経内皮移動が起こるのに十分な時間インキュベートする工程；及びＤ．工程Ｃのインキュベートした材料を、前記試験基質の細胞間領域に付着した前記白血球の場所と数を数えることによって、検査する工程；を含む上記方法。 37．哺乳動物における経内皮移動、及びその際のＰＥＣＡＭの役割を測定する方法であって、Ａ．ヒトの内皮細胞のコロニーからの試験基質を提供する工程；Ｂ．前記哺乳動物から白血球を含む生物学的試料を採取する工程；Ｃ．工程Ｂの生物学的試料の一部を前記試験基質と共に、ＰＥＣＡＭ拮抗物質の不存在下に、前記白血球の経内皮移動が起こるのに十分な時間インキュベートする工程；Ｄ．工程Ｂの生物学的試料の他の一部を前記試験基質、及び白血球の経内皮移動を調節できる薬剤と共に、工程Ｃと同じ時間インキュベートすることにより、コントロールを調製する工程、但し該薬剤は、ＰＥＣＡＭに対する抗体、ＰＥＣＡＭ活性に対する拮抗物質、組換えヒトＰＥＣＡＭ−１（rhＰＥＣＡＭ−１）、ＰＥＣＡＭ活性の作用物質、及びそれらの活性フラグメントからなる群から選ばれたものである；及びＥ．工程Ｃのインキュベートした材料を検査し、前記白血球の経内皮移動についてＰＥＣＡＭの機能を測定し、工程Ｄのインキュベートした材料についての結果と比較する工程；を含む上記方法。 38．哺乳動物におけるＰＥＣＡＭ機能の循環調節剤を検出する方法であって、Ａ．ヒトの内皮細胞のコロニーからの試験基質を提供する工程；Ｂ．前記動物から、血漿、血清及び他の体液からなる群から選ばれる生物学的試料を採取する工程；Ｃ．同一又は異なる哺乳動物からの所定量の白血球を、前記試験基質と共に、又は前記試験基質及び工程Ｂの生物学的試料の一部と共に、ＰＥＣＡＭ拮抗物質の不存在下に、前記白血球の経内皮移動が起こるのに十分な時間インキュベートすることによって、少なくとも１個の試験インキュベーションを調製する工程；Ｄ．前記試験哺乳動物又は異なる哺乳動物からの更に所定量の白血球を、前記試験基質と共に、又は前記試験基質及び白血球の経内皮移動を調節することができる薬剤と共に、工程Ｃと同じ時間インキュベートすることによって、少なくとも１個のコントロールを調製する工程、但し該薬剤は、ＰＥＣＡＭに対する抗体、ＰＥＣＡＭ活性に対する拮抗物質、組換えヒトＰＥＣＡＭ−１（rhＰＥＣＡＭ− １）、ＰＥＣＡＭ活性の作用物質、及びそれらの活性フラグメントからなる群から選ばれたものである；及びＥ．工程Ｃ及びＤのインキュベートした材料を検査し、前記白血球の経内皮移動についてＰＥＣＡＭの機能を測定し、工程Ｃの試験インキュベーション間の比較、及び工程Ｄのコントロール間の比較、及び前記試験インキュベーションと前記コントロールとの比較する工程；を含む上記方法。 39．生物学的試料が、炎症が発現し易いと思われる哺乳動物、発現しつつあると思われる哺乳動物、又は発現が進行中である哺乳動物であって、ＰＥＣＡＭ機能の変化が推測される哺乳動物から採取されたものである請求の範囲37又は38記載の方法。 40．工程Ｃ及びＤのインキュベーション時間が、ＰＥＣＡＭの不存在下では白血球の経内皮移動が起こるのに不十分な時間であり、かつ前記方法が、前記ＰＥＣＡＭ作用物質の存在及び量の検出及び／又は測定に及ぶ請求の範囲37又は38記載の方法。 41．前記コントロールが、工程Ｄの薬剤と共にインキュベートされた正常な哺乳動物から採取された生物学的試料、工程Ｄの薬剤と共にインキュベートされなかった正常な哺乳動物から採取された生物学的試料、及び工程Ｄの薬剤と共に及び／又は該薬剤なしにインキュベートされたＰＥＣＡＭ活性の変化が公知の標準化白血球からなる群から選ばれた材料を用いて前記方法を実施することにより調製される請求の範囲37又は38記載の方法。 42．試験中の哺乳動物から採取された生物学的試料が、正常な哺乳動物から採取された生物学的試料、ＰＥＣＡＭ機能が異常であることが知られている異常な白血球を含む生物学的試料と共にインキュベートし、かつ工程Ｄのコントロールを公知の阻害剤及び／又は正常な白血球と共にインキュベートしたＰＥＣＡＭ機能のアクチベータを使用して調製される、請求の範囲37又は38記載の方法。 43．生物学的試料が、炎症及び／又は炎症を起こすことが知られている状態が存在している哺乳動物から採取され、前記方法が、規則的かつ周期的に行われ、その期間中、ＰＥＣＡＭ機能の変化及び前記哺乳動物の前記炎症及び／又は前記状態の程度をモニターする、請求の範囲37又は38記載の方法。 44．炎症の発現の見込み及び／又は有意の経内皮移動を評価する工程を含む請求の範囲37又は38記載の方法。 45．工程Ｃにおいて、生物学的試料を、前記試験基質、又は前記試験基質及び経内皮移動を調節することができると考えられる薬剤と共に、インキュベートし、かつ前記方法が、前記薬剤をスクリーニングして、その一般的な効果を測定し及び／又は特定の患者の処置におけるその効果を測定するための検定を含んでいる請求の範囲37又は38記載の方法。 46．薬物及び／又は処置薬が、他の状態に作用する効果又は前記経内皮移動に影響することが知られている薬剤の効果をモニターするために、前記生物学的試料及び前記試験基質と組み合わせて、前記薬物及び／又は処置薬をインキュベートする工程をさらに含んでいる請求の範囲37又は38記載の方法。