KR20120052312A

KR20120052312A - Ａｖｂ５ 인테그린과 결부된 질환의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20120052312A
Application number: KR1020127003723A
Authority: KR
Inventors: 딘 셰퍼드; 조지 슈; 암하 애타킬릿
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2010-07-26
Publication date: 2012-05-23
Also published as: IL217406A0; AU2010275367A1; KR101752515B1; WO2011011775A1; IN2012DN00303A; JP2013500269A; CN102481347A; JP5755647B2; BR112012001463A2; IL217406A; US10087252B2; EP2456460A1; CA2767409C; AU2010275367B2; US20120328604A1; CA2767409A1; EP2456460A4

Abstract

본 발명은 ανβ5 인테그린에의 결합을 차단함으로써 ανβ5 인테그린과 결부된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, ανβ5 인테그린에 특이적인 항체는 패혈증의 예방, 치료 및 역전에 유용하다.

Description

ＡＶＢ５ 인테그린과 결부된 질환의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING AND PREVENTING DISEASE ASSOCIATED WITH AVB5 INTEGRIN}

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 2009년 7월 24일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/228,416의 우선권을 주장하는데, 상기 미국 가특허 출원의 개시내용은 그 전체가 참고로 포함된다.

미국 연방 정부에 의해 후원된 연구 개발 하에 행해진 발명에 대한 권리에 대한 진술

이 과제는 NIH Rol HL083950 "인테그린 ανβ5에 의한 혈관 투과성의 조절(Regulation of vascular permeability by integrin ανβ5)"에 의해 부분적으로 지원받았다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 소정의 권리를 갖는다.

[배경기술]

패혈증 증후군은 감염성 유기체와, 숙주 면역 응답, 염증 응답 및 응고 응답 사이의 복합적인 상호작용에 의해 개시되는 지나친 염증 캐스케이드(cascade)에서 생긴다(문헌[Hotchkiss and Karl(2003) N Engl J Med 348:138). TNF-α 및 트롬빈을 비롯하여 패혈증 동안 상승된 염증성 작동제는 내피 단층에서의 투과성을 증가시킨다. 증가된 전신적 혈관 투과성은 유체 및 용질이 혈관외 구획으로 재분배되게 하여 혈량 저하, 혈액 농축, 및 지혈이 되게 한다.

1년에 650,000이 넘는 패혈증 사례가 진단되며 이때 사망률이 20 내지 50%인데, 이는 패혈증이 비-관상질환 집중 관리 유닛의 입원 환자들 중에서 가장 일반적인 사망 원인이 되게 한다. 숙주 응답(다수의 세포 유형, 염증성 매개자 및 응고 인자를 포함함)이 패혈증-결부된 사망률을 결정함이 일반적으로 용인되지만, 임상 실험은 대체로 효과적인 치료 표적을 확인하지 못하였다. 패혈증의 발병 및 유지의 기저가 되는 분자적 기작은 여전히 잘 이해되지 않은 채이며, 이들 중증 질환 증후군의 효과적인 약리학적 표적은 확인되지 않았다.

상기에 나타낸 바와 같이, 패혈증은 지나친 염증성 캐스케이드에 응답하여 혈관 투과성이 증가하는 것을 특징으로 한다. 용질은 세포간극 경로(paracellular pathway)를 통하여 또는 수용체-매개된 트랜스사이토시스(transcytosis)를 통하여 내피 장벽을 통과한다(문헌[Michel(1992) Am Rev Respir Dis 146:S32]; 문헌[Renkin(1985) J Appl Physiol 58:315). 현재 일반적으로 합의된 것은 세포간극 경로가 급성 염증성 질환 상태에서 관찰되는 혈관 투과성 증가에 주로 책임이 있다는 것이다(문헌[Groeneveld(2002) Vascul Pharmacol 39:247]; 문헌[Bernard et al.(1994) Am J Respir Crit Care Med 149:818]). 하나의 빈번하게 인용된 모델은 세포골격, 부착성 세포-세포, 및 세포-매트릭스 힘 사이의 경쟁 불균형으로 인하여 세포간극 갭이 형성됨을 시사한다. 이 모델에서, 세포골격 필라멘트(F)-액틴은 형태적으로 독특한 스트레스 섬유로 중합되는데, 상기 스트레스 섬유는 세포 연접부(cell junction)와 초점 부착부(focal adhesion, FA) 사이에 액토마이오신-생성된 장력을 전달한다. 초점 부착부(FA)는 액틴 세포골격를 세포외 매트릭스(extracellular matrix, ECM)에 연결시키고 신호전달 단백질을 인테그린 결합 및 클러스터링(clustering) 부위로 국소화시키는 큰 거대분자 어셈블리이다.

본 발명은 염증성 작동제에 응답하는 내피 장벽 기능의 중요한 조절자로서 인테그린 ανβ5 및 ανβ3을 개시한다. 놀랍게도, 이러한 밀접하게 관련된 인테그린들은 투과성-유도(ανβ5 및 액틴 스트레스 섬유) 및 장벽-향상(ανβ3 및 피질 액틴) 세포골격 구조체를 차별적으로 조직화하는 반대되는 세포 기작을 지지한다. 본원에서 본 출원인은 패혈증에 있어서 혈관 투과성의 조절에서의 인테그린 ανβ5 및 ανβ3의 예기치 못한 독특한 역할을 보고한다.

발명의 간단한 개요

본 발명은 ανβ5 인테그린을 포함하는 질환, 예컨대 패혈증을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 포유류 대상체(예를 들어, 영장류, 예컨대 인간, 원숭이 또는 침팬지; 개과 동물; 고양이과 동물; 또는 가축 동물, 예컨대 말, 소 또는 양)에 있어서 패혈증을 치료하거나 역전시키거나 예방하는 방법을 제공한다. ανβ5 인테그린의 길항제의 치료적 양 또는 예방적 양이 대상체에 투여된다.

일부 실시양태에서, 상기 길항제는 ανβ5 인테그린의 활성 또는 발현을 억제하는 에이전트(agent)이다. 일부 실시양태에서, 상기 에이전트는 ανβ5 특이적 항체, ανβ5 인테그린의 소분자형 억제제, 또는 ανβ5 인테그린의 폴리뉴클레오티드 억제제, 예컨대 안티센스 분자로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 에이전트는 ανβ3, β3, ανβ6, β6, ανβ8 또는 β8 중 적어도 하나의 활성 또는 발현을 억제하지 않는다.

일부 실시양태에서, 상기 길항제는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체, scFv, Fab, 또는(Fab')2이다. 일부 실시양태에서, 항체는 유의하게 ανβ3 인테그린에 결합되지 않거나 ανβ3 인테그린에의 리간드 결합을 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 ανβ3, β3, ανβ6, β6, ανβ8 또는 β8 중 적어도 하나에 유의하게 결합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 ανβ3, β3, ανβ6, β6, ανβ8, 또는 β8에 유의하게 결합되지 않는다.

일부 실시양태에서, 항체는 ανβ5 인테그린에의 특이적 결합에 대하여 ALULA(ATCC 기탁 번호 PTA-5817로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 항체)와 특이적으로 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ALULA와 동일한 ανβ5 인테그린 에피토프에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 ALULA의 CDR로부터 유도되며 실질적으로 유사한 CDR 아미노산 서열(예를 들어, ALULA의 CDR에 대하여 90, 95, 97, 98, 99, 또는 100%의 동일성)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 ALULA V 영역의 아미노산과 실질적으로 유사한 V 영역을 포함한다(예를 들어, ALULA의 V 영역에 대하여 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 동일성). 항체는 ALULA 그 자체, 인간화 ALULA, 키메라 ALULA, 예를 들어 ALULA의 scFv, Fab 및(Fab')2를 포함하는 ALULA의 단편, 또는 ανβ5 인테그린에의 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 또 다른 항체일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 ανβ5 인테그린에 특이적인 항체를 함유하는 제약 조성물의 투여를 포함하며, ανβ3 인테그린에 결합되는 항체 또는 길항제의 투여는 포함하지 않는다.

본 발명의 방법은 패혈증에 걸린 또는 패혈증 발병 위험이 있는 개체의 치료에 유용하다. 투여는 정맥내 또는 복강내 투여일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여는 단일요법제일 수 있거나, 또는 전형적인 실무와 마찬가지로, 패혈증과 결부된 합병증을 치료 또는 예방하고자 하는 다른 치료제, 예를 들어 정맥내 수액, 혈압 상승제, 외과적 처치, 항생제, 활성화된 단백질 C, 인슐린, GM-CSF, TGFβ 경로 억제제, β-2 작동제, 이뇨제, ανβ5 인테그린의 길항제, ανβ5 인테그린에 특이적으로 결합되는 제2 항체, ανβ6 인테그린의 길항제, 혈관수축제 및 수축 촉진약(예를 들어, 페닐에프린, 노르에피네프린, 도파민, 도부타민)과 함께일 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 패혈증 치료용 에이전트의 확인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 복수의 에이전트를 ανβ5 인테그린과 접촉시키는 단계, ανβ5 인테그린에의 리간드의 결합과 경쟁하는 에이전트를 선발하는 단계, 및 패혈증에 대한 선발된 에이전트의 영향을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 복수의 에이전트를 ανβ5 인테그린과 접촉시키는 단계, ανβ5 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 에이전트를 선발하는 단계, 및 패혈증에 대한 선발된 에이전트의 영향을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 ανβ3에 결합되는 에이전트를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ανβ3, β3, ανβ6, β6, ανβ8, 또는 β8에 유의하게 결합하지 않는다. 패혈증에 대하여 영향을 미치는 에이전트는 패혈증 치료용 에이전트로서 확인된다. 상기 복수의 에이전트는 복수의 항체일 수 있다. 리간드는 예를 들어 ALULA를 포함하는 항체일 수 있거나, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 오스테오폰틴, 테나신 c 또는 아데노바이러스 펜톤 염기일 수 있다.

본 발명의 이들 및 기타 실시양태는 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해 추가로 예시된다.

도 1a: 인간 폐동맥 내피 세포(pulmonary artery endothelial cell, HPAEC)에 있어서 작동제-유도된 투과성은 ανβ5의 항체 억제에 의해 약화되며 ανβ3의 항체 억제에 의해 향상된다. 트랜스웰스(Transwells)(등록상표) 상의 혈청-기아(serum-starved) 융합성 HPAEC 단층은 VEGF(30 ng/ml), TGF-β(10 ng/ml), 또는 트롬빈(10 U/ml)으로 자극되기 1시간 전에 ανβ3 및 ανβ5 항체(항-ανβ3 및 ανβ5 Ab)(10 ㎍/ml) 또는 대조(10 ㎍/ml) 항체(Ab)와 함께 인큐베이션되었다. C¹⁴-알부민 추적자를 정단 웰에 적용하고 1시간 후 측저 웰 내용물을 후속적으로 수집하여 신틸레이션 카운팅(분당 카운트(counts per minute, CPM))함으로써 경내피 누출을 결정하였다. 예시된 데이타는 평균 +/- 표준 오차, n=3이다.
도 1b: ανβ3 및 ανβ5는 초점 부착부에 동시 국소화된다. HPAEC의 융합성 단층은 고정되며, 투과되며, ανβ3- 및 ανβ5-특이적으로 염색되었다(이어서 알렉스(Alex) 488-표지된 그리고 로다민-표지된 이차 항체로 염색됨). 인테그린 ανβ3 및 ανβ5는 각각 녹색 및 적색으로 의사착색되었으며, 이미지 프로(Image Pro)(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 병합되었다.
도 1c 및 도 d: ανβ5는 트롬빈-유도된 스트레스 섬유 형성을 우선적으로 지지하며, ανβ3은 S1P-유도된 피질 액틴 형성을 우선적으로 지지한다. HPAEC의 융합성 단층은 이소형 대조(대조 Ab), ανβ3, 또는 ανβ5 항체(10 ㎍/ml) 중 어느 하나로 1시간 동안 전처리되고, 그 후 트롬빈(10 U/ml, 10분) 또는 S1P(0.5 μM, 10분)로 자극되었다. 그 후 세포는 고정되고, 투과되고, 로다민-팔로이딘으로 염색되었다.
도 1e: ανβ3 차단은 트롬빈-유도된 투과성에 대한 S1P 보호를 극복한다. 트랜스웰스(등록상표) 상의 혈청-기아 융합성 HPAEC 단층은 트롬빈으로 자극되기 1시간 전에 ανβ3 또는 이소형 대조 항체(10 ㎍/ml) 및/또는 S1P(0.5 μM)와 함께 인큐베이션되었다. C¹⁴-알부민 추적자를 정단 웰에 적용하고 1시간 후 측저 웰 내용물을 후속적으로 수집하여 신틸레이션 카운팅(분당 카운트, CPM)함으로써 경내피 누출을 결정하였다. 예시된 데이타는 평균 +/- 표준 오차, n=3이다.
도 2: β3 k.o. 마우스에서는 ALL의 LPS-유도된 모델에서 폐 부종 형성이 증가되었다. 중량- 및 성별-매칭된 β3 k.o. 마우스 및 야생형 마우스에 50 ㎕ 물 중 50 ㎍ LPS 대 50 ㎕ 물 비히클 대조, 또는 10 mg/kg 대 동일 물 부피의 대조를 기관내로(A), 또는 10 mg/kg i.p.로(B) 투여하였다. LPS 또는 물을 투여한지 5일 후, 폐 관류 및 일괄적 폐 수확 2시간 전에 에반스 블루(Evans blue) 염료가 후안와에 투여되었다. 혈관외 에반스 블루는 포름아미드로 추출되었으며, 분광광도법(560 nm)으로 측정되었다. 에반스 블루 삼출은 전체 폐의 건조 중량당 분광광도법 단위로서 측정되었다(g^-1). 예시된 데이타는 평균 +/- 표준 오차, n=10이다.
도 3a: β3 k.o. 마우스에서는 야생형 대조와 비교하여 i.p. LPS-유도된 패혈증 모델에서 사망률이 증가하였다. 중량 및 성별-매칭된 β3 k.o. 및 야생형 대조 마우스에 10 mg/kg의 LPS가 i.p. 주사에 의해 투여되었다. 데이타는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 분석, 군들 사이의 로그 순위 검정 차이, p = 0.0044에 의해 분석되었다.
도 3b: β3 k.o. 마우스는 LPS(10 mg/kg)의 i.p. 주사 후 장간막 혈관 주위에 FITC-BSA 추적자의 국소적인 삼출이 있다. 내피 누출 부위는 FITC-표지된 BSA(90마이크로미터의 크기, 시그마(Sigma))의 사용에 의해 현미경에 의해 확인되었는데, 상기 BSA는 마우스를 안락사시키기 1시간 전에 후안와에 주사되었다(염수 중 30 mg/kg). 장간막 및 소장은 혈관계를 붕괴시키지 않도록 주의하면서 일괄적으로 수확되었다. 장간막 전조직 표본(whole mount)이 준비 및 고정되었다(문헌[Baluk et al.(1999) Br J Pharmacol 126:522]). 누출 부위는 라이카(Leica) DM5000B 현미경을 이용하여 국소적 FITC 삼출 영역으로서 확인되었다.
도 3c: β3 k.o. 마우스에서는 LPS(10 mg/kg)의 i.p. 주사 후 소장 및 장간막 및 결장에서 ¹²⁵I-BSA 추적자의 삼출이 증가되었다. 중량 및 성별-매칭된 β3 k.o. 및 야생형 대조 마우스에 10 mg/kg의 LPS를 i.p. 주사로 투여하였다. 30시간에서, 0.5 μCi의 ¹²⁵I-BSA가 후안와 주사에 의해 투여되었다. 2시간 후, 마우스는 안락사되고, 소장 및 장간막 및 결장이 수확되어 전체 분당 카운트(CPM)에 대하여 분석되었다. 예시된 데이타는 각각의 군에 있어서 평균 +/- 표준 오차, n=6이다. β3 k.o. 대 야생형 대조: 소장/장간막의 경우 p=0.034, 결장의 경우 p=0.042.
도 3d: 인간 탯줄 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에서의 작동제-유도된 투과성은 ανβ3의 항체 억제에 의해 향상된다. 트랜스웰스(등록상표) 상의 혈청-기아 융합성 HUVEC 단층은 VEGF(30 ng/ml), TGF-β(10 ng/ml), 또는 트롬빈(10 U/ml)으로 자극되기 1시간 전에 항-ανβ3 및 대조 항체(Ab)(10 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션되었다. 예시된 데이타는 각각의 군에 있어서 평균 +/- 표준 오차, n=3이다. 대조 대 항-ανβ3 Ab: 염수의 경우 p=0.972, VEGF의 경우 p=0.033, 트롬빈의 경우 p=0.041, TGF-β의 경우 p=0.029.
도 3e. β3 k.o. 마우스는 LPS(10 mg/kg)의 복강내 주사 후 혈액 농축을 나타낸다. β3 k.o. 및 야생형 대조 마우스에 LPS를 i.p. 투여한지 36시간 후, 하대정맥 천공을 통하여 혈액을 빼내고 헤마토크릿 수준을 측정하였다. 예시된 데이타는 각각의 군에 있어서 평균 +/- 표준 오차, n=6이다.
도 4a: β5 k.o. 마우스에서는 패혈증의 복강내 LPS 모델(13 mg/kg)에서 사망률이 감소되었다. 중량 및 성별-매칭된 β3 k.o. 및 야생형 대조 마우스에 13 mg/kg의 LPS가 i.p. 주사에 의해 투여되었다. 데이타는 카플란-마이어 생존 분석, 군들 사이의 로그 순위 검정 차이, p=0.0007에 의해 분석되었다.
도 4b: β5 k.o. 마우스는 야생형 대조와 비교하여 LPS(13 mg/kg)의 복강내 주사 후 장간막 혈관 주위에 FITC-BSA 추적자의 삼출이 감소하였다. 내피 누출 부위는 FITC-표지된 BSA(90마이크로미터의 크기, 시그마)의 사용에 의해 현미경에 의해 확인되었는데, 상기 BSA는 마우스를 안락사시키기 1시간 전에 후안와에 주사되었다(염수 중 30 mg/kg). 장간막 및 소장은 혈관계를 붕괴시키지 않도록 주의하면서 일괄적으로 수확되었다. 장간막 전조직 표본이 준비 및 고정되었다(문헌[Baluk et al.(1999) Br J Pharmacol 126:522]). 누출 부위는 라이카 DM5000B 현미경을 이용하여 국소적 FITC 삼출 영역으로서 확인되었다.
도 4c: ανβ5 차단 항체의 투여는 야생형 대조와 비교하여 LPS-유도된 패혈증(13 mg/kg)에서 사망까지의 시간을 증가시킨다. 중량 및 성별-매칭된 야생형 마우스에 13 mg/kg의 LPS가 i.p. 주사에 의해 투여되었다. LPS를 주사한지 24시간 후, 마우스는 ανβ5 또는 이소형 대조 항체 중 어느 하나의 후안와 주사에 대하여 랜덤화되었다. 데이타는 카플란-마이어 생존 분석, 군들 사이의 로그 순위 검정 차이, p=0.0124에 의해 분석되었다.
도 5: ανβ5 차단 항체의 투여는 대조와 비교하여 맹장 결찰 및 천공(cecal ligation and puncture, CLP) 유도된 패혈증에서 사망까지의 시간을 증가시킨다. 중량 및 성별-매칭된 야생형 마우스는 CLP 수술을 받았다. 수술 및 복부 절개의 봉합 후, 마우스는 ανβ5 또는 이소형 대조 항체 중 어느 하나의 후안와 주사에 대하여 랜덤화되었다. 데이타는 카플란-마이어 생존 분석, 군들 사이의 로그 순위 검정 차이, p=0.0124에 의해 분석되었다.

I. 서론

본 발명은 부분적으로는 ανβ5 인테그린에 결합되는 에이전트로 동물을 처리하면 패혈증 증상이 감소된다는 놀라운 발견을 기반으로 한다. 본 발명자는 ανβ5 인테그린에 결합되는 항체가 ανβ5 인테그린에의 리간드 결합을 차단함을 입증하였다. 더욱 특히는 ανβ5 인테그린의 결합의 차단이 패혈증의 중증도를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 결과는 굉장한 것이며, 그 이유는 ανβ5 차단 항체의 투여가 패혈증을 실제로 역전시키기 때문이다. 표준 패혈증 치료제는 일반적으로 예를 들어 항생제 또는 소염제의 사용에 의해 패혈증을 예방하는 것을 추구한다. 일반적으로, 패혈증 반응의 급성인 성질은 즉각적이고 공격적인 의료 개입을 필요로 하며, 표준 치료제는 효과적이지 못하다. 따라서, 본 발명은 유효량의 ανβ5 길항제를 대상체에게 투여하는 단계에 의해 대상체에서 패혈증을 치료하거나, 예방하거나 역전시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 ανβ5 인테그린과 상호작용하는 에이전트를 확인하는 단계 및 이를 패혈증을 치료하는 그의 능력에 대하여 시험하는 단계에 의해 패혈증 치료용의 새로운 에이전트를 확인하는 방법을 제공한다.

II. 정의

"ανβ5 길항제"는 ανβ5 인테그린 상의 이용가능한 리간드 결합 부위에 대하여 ανβ5 리간드와 경쟁하는 임의의 에이전트이다. ανβ5 길항제는 ανβ5 또는 β5에 특이적으로 결합하거나 ανβ5 인테그린의 활성 또는 발현을 억제할 수 있는 에이전트를 포함한다. 그 예는 항체, 소분자형 억제제, 폴리뉴클레오티드 억제제(예를 들어, 안티센스 및 siRNA)를 포함한다.

"ανβ5 인테그린"은 특히 세포-세포 상호작용, 세포-세포외 매트릭스(ECM) 상호작용 및 세포-병원체 상호작용을 매개하는 비-공유적 결부 α/β 헤테로이량체를 포함하는 부착 분자 패밀리의 구성원이다. ανβ5는 β5 서브유닛(서브유닛)을 포함하는 유일한 인테그린이다. ανβ5는 RGD 펩티드 서열을 인식하여 비트로넥틴에 결합하며(예를 들어, 문헌[Hynes, Cell 69:11-25(1992)] 참조), 뇌졸중, 심근 경색, 암(즉, 혈관 신생), 및 안내 신생혈관 질환을 포함하는 다수의 장애에 연루되었다(예를 들어, 문헌[Friedlander et al., Science 270(5241):1500-2(1995)]; 문헌[Friedlander et al., PNAS USA 93(18):9764-9(1996)]; 문헌[Elicieri et al., J. Cell Biol. 157(10:149-159(2002)]; 문헌[Heba et al., J. Vase. Res. 38(3):288-300(2001)]; 문헌[Soeki et al., Cardiology 93(3):168-74(2000)]; 및 문헌[Li et al., Am. J. Physiol. 270(5 Pt 2):H1803-11(1996)] 참조). αv 및 β5는 둘 모두 서열 결정되었으며 특성화되었다(예를 들어, 각각 문헌[Hynes, 1992, 상기 문헌] 및 미국 특허 제5,527,679호 참조). 따라서 ανβ5 인테그린의 활성은 RGD 및 비트로넥틴 결합과, 세포-세포, 세포-ECM, 및 세포-병원체 상호작용의 매개를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

패혈증은 신체 전체에 걸쳐 존재하는 급성 염증의 징후, 예를 들어 발열 및 비정상적인 백혈구 세포 카운트를 그 특징으로 한다. 패혈증은 때로 세균 감염에 의해 야기되며, 따라서 세균 감염 그 자체의 증상이 또한 암시하는 것일 수 있다. 따라서, 패혈증 위험이 있는 개체는 감염, 특히 중증 감염을 앓고 있는 것, 또는 과거에 패혈증을 경험한 것을 포함할 수 있다.

패혈증 반응에서, 면역계는 감염에 반응하며, 조직 손상 및 대사 변화를 야기할 수 있다. 이러한 응답의 외향적인 신체적 증상은 빈번하게는 높은 심박수(분당 90 초과의 박동), 높은 호흡수(분당 20 초과의 호흡), 상승된 백혈구 세포(white blood cell, WBC) 카운트(12,000 초과) 및 상승되거나 저하된 체온(36℃ 미만 또는 38℃ 초과)을 포함한다. 면역학적 응답은 급성기 단백질의 광범위한 활성화를 야기하며, 이는 그 후 혈관계 및 기관에 대한 손상을 야기한다. 극단적인 경우에는 사망으로 이어진다. 임의의 질환 또는 장애와 관련하여, 의학계의 당업자라면 패혈증을 가장 잘 인식하고 진단할 수 있다. 또한 당업자라면 "패혈증"이 절대적인 용어가 아니며, 전신적인 염증성 응답 증후군, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크를 나타내기 위하여 사용될 수 있음을 인식할 것이다.

ανβ5 인테그린 길항제의 "치료적 용량", "치료적 양", "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 환자에 있어서 예를 들어 패혈증을 포함하는 ανβ5 인테그린과 결부된 중증도의 질환 증상을 예방하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 감소시키는 길항제의 양이다.

본원에서 사용될 때, "치료하다" 및 "예방하다"라는 용어는 절대적인 용어인 것으로 의도되지 않는다. 치료는 증상의 발병의 임의의 지연, 증상의 개선, 환자 생존성의 향상, 조직 손상의 감소 등을 나타낼 수 있다. 실제, 일부 실시양태에서 본 발명에 따른 치료에 의해 질환이 역전될 수 있다. 이와 유사하게, 예방은 증상의 발별의 임의의 지연 또는 문맥에 따라서는 증상의 중증도의 감소를 나타낼 수 있다. 치료 효과는 치료를 받지 않은 개체 또는 개체 풀(pool)과 비교되거나 예를 들어 치료 전의 동일 환자와 비교될 수 있다.

본원에서 "대상체"라는 용어는 치료에 고려되는 임의의 개체를 나타내기 위하여 널리 사용된다. 전형적으로 대상체는 인간 또는 일부 다른 포유류이다.

"항체"라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하여 그를 인식하는, 면역글로불린 유전자 또는 그의 기능성 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 나타낸다. 인식되는 면역글로불린의 유전자는 무수한 면역글로불린 가변 영역의 유전자뿐만 아니라 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역의 유전자도 포함한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 다시 각각 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 규정한다.

예시적인 면역글로불린(항체)의 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식에 책임이 있는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. "가변 중쇄", "V_H" 또는 "VH"라는 용어는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 나타내고 이는 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하는 반면, "기변 중쇄", "V_L" 또는 "VL"이라는 용어는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 나타내고 이는 Fv, scFv , dsFv 또는 Fab를 포함한다.

항체의 기능성 단편의 예는 전 항체 분자, 항체 단편, 예컨대 Fv, 단쇄 Fv(scFv), 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR), VL(경쇄 가변 영역), VH(중쇄 가변 영역), Fab, F(ab)2' 및 이들의 임의의 조합 또는 표적 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 펩티드의 임의의 다른 기능성 부분을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다(예를 들어, 문헌[FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul ed., 4th ed. 2001] 참조). 당업계의 숙련자에 의해 인정되는 바와 같이, 다양한 항체 단편이 다양한 방법, 예를 들어 펩신과 같은 효소를 이용한 온전한 항체의 분해 또는 드노보식(de novo) 합성에 의해 수득될 수 있다. 항체 단편은 재조합적 DNA 방법의 이용에 의해 또는 화학적으로 드노보식으로 합성된다. 따라서 본원에서 사용될 때 항체라는 용어는 전체 항체의 변경에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합적 DNA 방법을 이용하여 드노보식으로 합성된 것(예를 들어, 단쇄 Fv), 또는 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 사용하여 확인된 것을 포함한다(예를 들어, 문헌[McCafferty et al.,(1990) Nature 348:552] 참조). 또한 "항체"라는 용어는 2가 또는 2특이성(bispecific) 분자, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)를 포함한다. 2가 및 2특이성 분자는 예를 들어 문헌[Kostelny et al.(1992) J. Immunol. 148:1547], 문헌[Pack and Pluckthun(1992) Biochemistry 31:1579], 문헌[Hollinger et al.(1993), PNAS. USA 90:6444], 문헌[Gruber et al.(1994) J Immunol. 152:5368], 문헌[Zhu et al.(1997) Protein Sci. 6:781], 문헌[Hu et al.(1996) Cancer Res. 56:3055], 문헌[Adams et al.(1993) Cancer Res. 53:4026], 및 문헌[McCartney, et al.(1995) Protein Eng. 8:301]에 기술되어 있다.

"단쇄 Fv(scFv)" 또는 "단쇄 항체"는 scFv 항체의 VH 및 VL 영역이 2개의 사슬의 항체에서 발견되는 것과 유사한 항원 결합 부위를 생성하도록 폴딩된 단쇄를 포함하는 단백질을 나타낸다. scFv 항체의 제조 방법이 예를 들어 문헌[Ward et al., Exp Hematol.(5):660-4(1993)]; 및 문헌[Vaughan et al., Nat Biotechnol. 14(3):309-14(1996)]에 기술되었다. 단쇄 Fv(scFv) 항체는 길이가 50개 이하의 아미노산, 일반적으로 40개 이하의 아미노산, 바람직하게는 30개 이하의 아미노산, 더 바람직하게는 20개 이하의 아미노산인 펩티드 링커를 임의로 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 콘카타머(concatamer), 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 그러한 서열이다. 그러나, 링커 내에서 약간의 아미노산 치환이 행해질 수 있음이 인정되어야 한다. 예를 들어, 발린이 글리신을 치환할 수 있다. 추가의 펩티드 링커 및 그의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Huston et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8:5879(1988)]; 문헌[Bird et al., Science 242:4236(1988)]; 문헌[Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362(1990)]; 미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제5,132,405호 및 문헌[Stemmer et al., Biotechniques 14:256-265(1993)]을 참조한다.

본원에서 사용될 때, "키메라 항체"는(a) 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이한 또는 변경된 클래스, 이펙터(effector) 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 새로운 특성을 키메라 항체에 부여하는 전적으로 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 일부분이 변경되거나, 대체되거나 교환된 면역글로불린 분자; 또는(b) 가변 영역 또는 그의 일부분이 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역 또는 그의 일부분으로, 또는 또 다른 종 유래의 상응하는 서열 또는 또 다른 항체 클래스 또는 하위 클래스 유래의 상응하는 서열로 변경, 대체 또는 교환된 면역글로불린 분자를 나타낸다.

본원에서 사용될 때, "인간화 항체"는 공여체 항체 유래의 CDR이 인간의 프레임워크 서열에 그래프팅된 면역글로불린 분자를 나타낸다. 인간화 항체는 프레임워크 서열 내에 공여체 기원의 잔기를 또한 포함할 수 있다. 인간화 항체는 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분을 또한 포함할 수 있다. 인간화 항체는 수용체 항체에서도 발견되지 않고 임포트된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 또한 포함할 수 있다. 인간화는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며(예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321 :522-525; 1986]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988)]; 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992]; 미국 특허 제4,816,567호), 이는 "슈퍼인간화(superhumanizing)" 항체(문헌[Tan et al., J. Immunol. 169: 1 119, 2002]) 및 "재표면화(resurfacing)"(예를 들어, 문헌[Staelens et al., Mol Immunol. 43: 1243, 2006]; 및 문헌[Roguska et al., Proc. Natl Acad. Sci USA 91 : 969, 1994])과 같은 기술을 포함한다.

본원에서 사용될 때, "V-영역"은 프레임워크 1(F1), 상보성 결정 영역 1(CDR1), F2, CDR2, 및 F3 - CDR3 및 F4를 포함함 - 의 절편을 포함하는 항체 가변 영역 도메인을 나타내며, 상기 절편들은 B-세포 분화 동안 중쇄 및 경쇄 V-영역 유전자의 재배열의 결과로서 V-절편에 부가된다. 본원에서 사용될 때, "V-절편"은 V 유전자에 의해 코딩되는 V-영역(중쇄 또는 경쇄)의 영역을 나타낸다. 중쇄 가변 영역의 V-절편은 FR1-CDR1-FR2-CDR2 및 FR3을 코딩한다. 본 발명의 목적상, 경쇄 가변 영역의 V-절편은 FR3를 통하여 CDR3까지 연장하는 것으로 정의된다.

본원에서 사용될 때, "J-절편"이라는 용어는 CDR3 및 FR4의 C-말단 부분을 포함하는, 코딩된 가변 영역의 하위서열(subsequence)을 나타낸다. 내인성 J-절편은 면역글로불린 J-유전자에 의해 코딩된다.

본원에서 사용될 때, "상보성 결정 영역(CDR)"은 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 의해 확립된 4개의 "프레임워크" 영역들을 단절시키는, 각각의 사슬 내의 3개의 초가변 영역들 중 하나를 나타낸다. CDR은 항원 에피토프에의 결합에 주로 책임이 있다. 전형적으로 각각의 사슬의 CDR은 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 넘버링된 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 칭해지며, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치하는 사슬에 의해 확인된다. 따라서, 예를 들어 V_H CDR3은 그가 발견되는 항체의 중쇄의 가변 영역 내에 위치하며, 반면에 V_L CDR1은 그가 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인으로부터의 CDR1이다.

상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종들 내에서 비교적 보존되어 있다. 항체의 프레임워크 영역, 즉, 구성 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 3차원 공간에서 CDR을 배치하고 정렬하는 역할을 한다. 따라서, V 영역 내에서의 CDR의 위치는 항체들 사이에서 비교적 보존된다.

프레임워크 영역 및 CDR의 위치 및 아미노산 서열은 당업계의 다양한 공지된 정의, 예를 들어, 카바트(Kabat), 초티아(Chothia), 국제 이뮤노제네틱스 데이타베이스(international ImMunoGeneTics database, IMGT), 및 AbM을 이용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 존슨(Johnson) 등의 상기 문헌; 문헌[Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglob㎕ins. J. Mol. Biol. 196, 901-917]; 문헌[Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglob㎕in hypervariable regions. Nature 342, 877-883]; 문헌[Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the 인간 VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817]; 문헌[Al-Lazikani et al., J.Mol. Biol 1997, 273(4)] 참조). 항원 조합 부위의 정의가 하기 문헌에 또한 기술되어 있다: 문헌[Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221(2000)]; 및 문헌[Lefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1 ;29(1):207-9(2001)]; 문헌[MacCallum et al., Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol, 262(5), 732-745(1996)]; 및 문헌[Martin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272(1989)]; 문헌[Martin, et al., Methods Enzymol, 203, 121-153,(1991)]; 문헌[Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126,(1992)]; 및 문헌[Rees et al., In Sternberg M.J.E.(ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996].

주어진 단백질 또는 펩티드를 칭할 때 "특이적으로(또는 유의하게또는 선택적으로) 결합하는"이라는 어구는 단백질 및 기타 생물제제(biologics)의 불균질 집단의 존재 하에 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 표기된 면역분석 조건 하에서, 특정한 항체는 특정 단백질(예를 들어, ανβ5 인테그린, β5, 또는 그의 일부분)에 결합하며, 샘플에 존재하는 다른 단백질에는 유의한 양으로 결합하지 않는다. 그러한 조건 하에서의 항체에의 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 대하여 선발된 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, ανβ5 인테그린 또는 β5 폴리펩티드에 대하여 발생된 항체가 그 단백질과 특이적으로 면역반응성이며 다른 단백질과는 면역반응성이 아닌 항체를 수득하기 위하여 추가로 선발될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특이적 항체는 당해 단백질의 다형성 변이체, 예를 들어 관심있는 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 단백질에 또한 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 ανβ3 또는 β3에의 유의한 결합 없이 ανβ5 또는 β5 상의 에피토프에 특이적으로 결합하도록 선발된다. 일부 실시양태에서, ανβ5 특이적 항체는 ανβ6, β6, β8, 또는 ανβ8에 유의하게 결합하지 않는다.

숙련자라면, "특이적" 결합 또는 "유의한" 결합이 절대적인 용어인 것으로 의도되지 않음을 이해한다. 예를 들어, 항체가 특정 에피토프에 유의하게 결합하지 않을 경우, 이것은 항체를 발생시킨 에피토프와 비교하여 적어도 5배, 8배, 10배, 20배, 50배, 80배, 또는 100배 감소된 친화도로 결합한다. 예를 들어, ανβ5-특이적 항체는 이것이 ανβ5에 결합하는 것보다 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 미만의 친화도보다 작은 친화도로 ανβ3, ανβ6, 또는 ανβ8에 결합할 경우 ανβ3, ανβ6, 또는 ανβ8에 유의하게 결합하지 않는다. 결합 친화도는 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 ELISA를 이용하여 결정될 수 있다. 친화도는 해리 상수(Kd 또는 K_D)로 표현될 수 있다. 비교적 더 높은 Kd는 더 낮은 친화도를 나타낸다. 따라서, 예를 들어 ανβ5에 있어서의 ανβ5-특이적 항체의 Kd는 전형적으로 또 다른 단백질에서의 ανβ5-특이적 항체의 Kd보다 적어도 5배, 8배, 10배, 15배, 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배 또는 그 이상만큼 더 낮다. 숙련자라면 비-특이적 결합을 나타내고 상대적인 결합 수준들을 비교하기 위하여 대조를 디자인하는 방법을 이해할 것이다.

다양한 면역분석 포맷을 이용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선발할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석, 웨스턴 블롯(Western blot), 또는 면역조직화학이 단백질과 특이적으로 면역반응성인 단클론 항체의 선발에 통상적으로 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하는 데 사용될 수 있는 면역분석 포맷 및 조건에 대한 설명에 대해서는 문헌[Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NY(1988)]을 참조한다. 전형적으로, 특이적 반응 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈(noise)의 적어도 2배, 더 전형적으로는 배경의 10배 내지 100배 초과이다.

결합에 대하여 "특이적으로 경쟁하는" 에이전트는 항체가 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 감소시킨다. 제1 항체는 당업계에 공지된 경쟁적 결합 분석법 중 임의의 것을 사용하여 제1 항체의 존재 하에 항원에의 제2 항체의 결합이 적어도 30%, 일반적으로 적어도 약 40%, 50%, 60%, 75%, 또는 적어도 약 90%만큼 감소될 경우 제2 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것으로 간주된다(예를 들어, 할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 상기 문헌 참조).

"평형 해리 상수" 또는 "친화도"(약기: Kd 또는 K_D)라는 용어는 해리 속도 상수(k_d, 시간^-1)를 결합 속도 상수(association rate constant, k_a, 시간^-1M^-1)로 나눈 것을 나타낸다. 평형 해리 상수는 당업계의 임의의 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 친화도가 높은 항체는 37℃에서 수행되는 표면 플라스몬 공명 분석법에 의해 결정할 때 1가 친화도가 약 10 nM 미만, 흔히 약 500 pM 또는 약 50 pM 미만이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체의 친화도(표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정할 경우)는 500 pM 미만, 전형적으로 약 100 pM 미만, 또는 심지어 25 pM 미만이다.

"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 충합체를 나타내기 위하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어들은 천연 아미미노산 중합체 및 비-천연 아미노산 중합체뿐만 아니라 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 모방체이기도 한 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 사용될 때, 상기 용어는 전장 단백질(즉, 항원)을 포함하여 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기는 펩티드 공유 결합에 의해 연결된다.

"아미노산"이라는 용어는 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체뿐만 아니라 천연 및 합성 아미노산도 나타낸다. 천연 아미노산으로는 유전자 코드에 의해 코딩되는 것과, 후에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이 있다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 갖는, 즉, R기, 아미노기, 카르복실기 및 수소에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 나타낸다. 그러한 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만 천연 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 유지한다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 나타낸다.

본원에서 아미노산은 그의 일반적으로 공지된 3문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)가 권장하는 1문자 기호에 의해 나타내어질 수 있다. 이와 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그의 일반적으로 용인된 1문자 코드에 의해 나타내어질 수 있다.

"펩티드모방물" 및 "모방체"라는 용어는 본 발명의 ανβ5 길항제의 사실상 동일한 구조적 및 기능적 특징을 갖는 합성된 화학적 화합물을 나타낸다. 펩티드 유사체는 일반적으로 제약 산업에서 주형 펩티드의 것과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 사용된다. 이들 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티드모방물"로 지칭된다(예를 들어, 문헌[Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986)]; 문헌[Veber and Freidinger TINS p. 392(1985)]; 및 문헌[Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229(1987)] 참조). 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 등가의 또는 향상된 치료 또는 예방 효과를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티드 모방물은 패러다임 폴리펩티드(즉, 생물학적 도는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예컨대 천연 ανβ5 리간드와 구조적으로 유사하지만, 예를 들어 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, 및 -CH₂SO-로 이루어진 군으로부터 선택된 결합에 의해 임의로 대체된 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 상기 모방체는 아미노산의 합성, 비-천연 유사체로 전적으로 구성될 수 있거나, 부분적 천연 아미노산과 아미노산의 부분적 비-천연 유사체의 키메라 분자이다. 또한 상기 모방체는 임의의 양의 천연 아미노산의 보존적 치환이 모방체의 구조 및/또는 활성을 또한 사실상 변경시키지 않는 한 그러한 치환이 혼입될 수 있다.

본원에 사용될 때, "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 상호교환가능하게 사용된다. "폴리뉴클레오티드"라는 용어의 사용은 올리고뉴클레오티드(즉, 짧은 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 또한 이 용어는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및 천연 변이체를 나타내며, 또한 예를 들어 그리고 한정됨이 없이 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA) 등과 같은 합성 및/또는 비-천연 핵산(즉, 핵산 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 포함함)을 나타낼 수 있다. 달리 나타내지 않으면, 특정 핵산 서열은 또한 명백하게 나타낸 서열뿐만 아니라 그의 보존적 변형 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열도 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081(1991)]; 문헌[Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985)]; 및 문헌[Cassol et al.(1992)]; 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)] 참조).

"siRNA" 또는 "RNAi"는 이중 가닥 RNA를 형성하는 핵산을 나타내며, 상기 이중 가닥 RNA는 D전자 도는 표적 유전자와 동일한 세포에서 siRNA가 발현될 때 상기 유전자 또는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 능력을 갖는다(예를 들어, 문헌[Bass, Nature, 411, 428-429(2001)]; 문헌[Elbashir et al., Nature, 411, 494-498(2001)]; 국제 특허 공개 제WO 00/44895호; 국제 특허 공개 제WO 01/36646호; 국제 특허 공개 제WO 99/32619호; 국제 특허 공개 제WO 00/01846호; 국제 특허 공개 제WO 01/29058호; 국제 특허 공개 제WO 99/07409호; 및 국제 특허 공개 제WO 00/44914호 참조). 따라서 "siRNA"는 상보성 가닥들에 의해 형성되는 이중 가닥 RNA를 나타낸다. 이중 가닥 분자를 형성하도록 혼성화되는 siRNA의 상보성 부분들은 전형적으로 상당한 또는 완전한 동일성을 갖는다. 일 실시양태에서, siRNA는 표적 유전자에 대하여 상당한 또는 완전한 동일성을 가지며 이중 가닥 siRNA를 형성하는 핵산을 나타낸다. siRNA의 서열은 전장 표적 유전자 또는 그의 하위서열에 상응할 수 있다. 전형적으로, siRNA는 길이가 적어도 약 15-50RO 뉴클레오티드이다(예를 들어, 이중 가닥 siRNA의 각각의 상보성 서열은 길이가 15-50개 뉴클레오티드이며, 이중 가닥 siRNA는 길이가 약 15-50개 염기쌍, 바람직하게는 대략적으로 바람직하게는 약 20-30개 염기 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이가 약 20-25개 뉴클레오티드, 예를 들어 길이가 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 뉴클레오티드이다.

"사일런싱(silencing)" 또는 "하향조절"은 간섭 RNA 또는 기타 핵산 서열의 부재 하에 검출되는 정상 수준과 비교하여 표적 서열 또는 단백질의 양 또는 활성의 감소, 또는 표적 서열, 즉 RNAi에 의해 표적화되는 서열의 전사 및/또는 번역의 검출가능한 감소를 나타낸다. 검출가능한 감소는 5% 또는 10%만큼 적거나 80%, 90% 또는 100%만큼 클 수 있다. 더 전형적으로, 검출가능한 감소는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70%의 범위이다.

III. ανβ5 활성의 억제

본 발명은 ανβ5 인테그린에의 리간드의 결합의 억제에 의해 예를 들어 패혈증과 같이 ανβ5 인테그린을 포함하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. ανβ5 인테그린 발현 또는 ανβ5 인테그린에의 리간드 결합을 억제하는 임의의 방법을 이용하여 본 발명의 방법에 따라 ανβ5 인테그린을 포함하는 질환을 치료할 수 있다. 예를 들어, ανβ5 인테그린에 특이적으로 결합하는 항체, β5 서브유닛에 특이적으로 결합하는 항체, ανβ5 인테그린의 리간드, 및 그러한 리간드의 펩티드, 비-펩티드, 및 펩티드 모방 유사체를 이용하여 ανβ5 인테그린에의 결합을 억제하고 그에 따라 ανβ5를 포함하는 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 게다가, β5의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, siRNA 분자, 안티센스 서열 등)를 이용하여 패혈증과 같이 ανβ5 인테그린을 포함하는 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

인테그린 서브유닛은 무차별적이어서, 상이한 이량체 파트너들 및 상이한 리간드들 둘 모두에 결합한다. 상이한 이량체 상은 상이한 그러나 흔히는 중첩된 세트의 리간드 및 조직에 결합할 수 있다. 예를 들어, αv 서브유닛은 몇몇 β 인테그린 서브유닛, 예를 들어, β1, β3, β5, β6, 및 β8과 쌍을 형성할 수 있다. ανβ5 인테그린은 예를 들어, β_lg _- _h3, 비트로넥틴, 오스테오폰틴, CXCL4 등에 다양한 친화도로 결합한다. ανβ1, ανβ3, 및 ανβ5 인테그린은 예를 들어 뇌에 있어서 동정맥 기형 및 해면상 기형에서 중첩된 조직 결합 패턴을 가질 수 있다(문헌[Seker et al.(2006) Neurosurgery 58:159-68]). 오스테오폰틴은 α5β1, ανβ3, ανβ5, α9β1, 및 ανβ6에 다양한 친화도로 결합하는 리간드의 일례이다. Sdc-1(신데칸-1), 비트로넥틴, 및 피브로넥틴도 다수의 인테그린 쌍에 결합한다.

따라서, 특정 인테그린 쌍들 사이에 유사한 국소화 또는 외견상의 결합 과잉성(redundancy)이 있을 수 있지만, 명백하게 상이한 것도 있으며, 이는 본원에 예시된 바와 같다. 인테그린은 기능적으로 상호교환가능한 것이 아니며, 따라서 특정 인테그린의 조정자는 상호교환가능한 기능을 가질 것으로 기대되지 않는다. 게다가, 리간드들 사이에 무차별이 주어진다면, 그리고 다양한 결합 친화도가 주어진다면, 특정 리간드의 표적화는 것은 인테그린과의 그의 상호작용을 예측가능하게 또는 전적으로 표적화하지 못한다.

이와 관련하여, 항체는 그의 비상한 특이성 때문에 특정 인테그린의 표적화에 특히 유용하다. 항체는 특정 표적에 대하여 발생될 수 있으며, 이는 표적 상의 유일무이한 3차원 에피토프를 인식한다(상기 에피토프에 특이적으로 결합한다).

A. ανβ5 항체 길항제

ανβ5 인테그린에 또는 ανβ5 인테그린의 β5 서브유닛에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 패혈증을 치료 또는 예방할 수 있다. 또한 상기 항체는 ανβ5 인테그린에의 결합 또는 ανβ5 인테그린의 β5 서브유닛에의 결합에 대하여 다른 리간드와 경쟁할 수 있다. 적합한 항체는 단클론 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 항체 단편(즉, Fv, Fab,(Fab')₂, 또는 scFv)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 다른 인테그린, 예를 들어 ανβ3, ανβ6, 또는 ανβ8에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 ALULA 및 ανβ5 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 항체와, 그의 키메라 및 단편 형태를 포함한다.

본원에서 입증된 바와 같이, 인테그린 ανβ3 및 ανβ5는 패혈증 반응에서 반대의 작용을 갖는다. ανβ5에 특이적인 항체는 2가지 상이한 쥐과 패혈증 모델에서 생존성을 효과적으로 연장시키는 반면, ανβ3에 대한 항체는 생존성을 실제로 감소시킨다. 이와 유사하게, β5 결핍 마우스는 덜 중증인 패혈증 반응(예를 들어, 감소된 혈관 투과성 및 일혈)으로 더 잘 생존한 반면, β3 결핍 마우스는 더욱 중증의 패혈증 반응(예를 들어, 증가된 혈관 투과성 및 일혈)을 보여주었다.

패혈증의 치료를 위하여, 본 발명은 ανβ3의 유의한 결합 없이 ανβ5에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 경우에, 본 항체는 β3, β6, 또는 β8 인테그린에 결합하지 않는다. 결합은 전형적으로 종들 내에서 비교되어서, 예를 들어 항체가 인간 ανβ5에 특이적일 경우 이것은 인간 β3, β6, 또는 β8 인테그린에 유의하게 결합하지 않게 된다. 일부 실시양태에서, 본 항체는 ανβ3에 대한 친화도가 매우 낮으며, 예를 들어 K_D가 0.1 mM 초과이다. 본 항체는 β5, β5와 쌍을 형성할 때에만 존재하는 αv의 에피토프, 또는 αv 및 β5의 부분을 포함하는 에피토프를 특이적으로 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, ανβ5 특이적 항체는 혈관 투과성을 촉진하는 리간드와의 ανβ5의 상호작용을 억제한다.

특이적으로 ανβ5는 탐지하지만 β3, β6, 또는 β8 인테그린은 탐지하지 않는 항체는 본원에 기술된 표준 기술을 이용하여 검출될 수 있다. 예시적인 아미노산 서열에 대한 젠뱅크(Genbank) 등록 번호는 마우스 및 인간 β3(O54890 및 P05106.2), 마우스 및 인간 β5(P11688 및 P18084), 마우스 및 인간 β6(Q9Z0T9 및 P18564.2), 및 마우스 및 인간 β8(P26012 및 Q0VBD0)을 포함한다. 다른 종, 예를 들어 비-인간 영장류, 래트, 개, 고양이, 말, 소 등에 있어서의 인테그린 서열이 또한 공개적으로 입수가능하다.

특이적으로 ανβ5는 탐지하지만 β3, β6, 또는 β8은 탐지하지 않는 항체는 특정 종 유래의 인테그린 단백질의 결합을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체가 인간 ανβ5에는 특이지만 β3, β6, 또는 β8 인테그린 서브유닛에는 특이적이지 않을 경우, 이것은 인간 β3, β6, 또는 β8에 유의하게 결합하지 않는다.

일부 실시양태에서, ανβ5 인테그린에 결합하는 단클론 항체 ALULA(미국 20110-2209 버지니아주 매너서스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 ATCC에 2004년 2월 13일에 만들어진, ATCC 기탁 번호 PTA-5817로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성됨)는 패혈증을 포함하여 ανβ5 인테그린을 포함하는 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 또는 키메라 ALULA, ALULA 항체 단편, 또는 ανβ5 인테그린 또는 ανβ5 인테그린의 β5 서브유닛에의 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 단클론 항체를 이용하여 패혈증을 치료한다. ανβ5 인테그린에의 결합에 대하여 경쟁하는 항체는 ALULA의 V 영역 서열 또는 CDR 서열을 이용하여 유도될 수 있다. 일부 실시양태에서, 경쟁 항체는 ALULA와 경쟁하는 항체에 대하여 스크리닝함으로써 확인된다.

ALULA는 ανβ5 인테그린에 결합하며, 포유류 대상체에 ALULA를 투여하면 대상체에서 패혈증의 중증도가 감소된다. 일부 실시양태에서, ALULA는 ανβ5에 특이적인 마우스 IgG2b 이소형 단클론 항체이다. 일부 실시양태에서, ALULA의 ανβ5 결합 단편, 예를 들어, ALULA의 CDR, 또는 ανβ5에 결합하는 유사한 서열을 보유하는 인간화 Fab' 영역 또는 Fab' 영역이 사용된다. ALULA는 β3, β6, 또는 β8 인테그린을 포함하는 에피토프에 유의하게 결합하지 않는다(문헌[Su et al.(2007) Am J Respir Cell Mol. Biol 36:377]). ALULA는 당업계에서 일반적인 기술을 이용하면 키메라이거나 또는 인간화될 수 있다.

단클론 항체는 당업계의 숙련자에게 친숙한 다양한 기술에 의해 수득된다. 간략하게는, 요망되는 항원으로 면역화한 동물 유래의 비장 세포를 일반적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 불사화한다(예를 들어, 문헌[Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519(1976)]). 대안적인 불사화 방법은 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus), 발암 유전자, 또는 레트로바이러스, 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 이용한 형질전환을 포함한다. 단일 불사화 세포로부터 생긴 콜로니는 항원에 대한 요망되는 특이성 및 친화성의 항체의 생성에 대하여 스크리닝되며, 그러한 세포에 의해 생성된 단클론 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복강 내로의 주사를 포함하는 다양한 기술에 의해 향상될 수 있다. 대안적으로, 문헌[Huse et al., Science 246: 1275-1281(1989)]에 약술된 일반적인 프로토콜에 따라 인간 B 세포 유래의 DNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 단클론 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 DNA 서열이 단리될 수 있다.

단클론 항체는 수집되며, 면역분석법, 예를 들어 고형 지지체 상에 고정된 면역원을 이용한 고체상 면역분석법에서 면역원에 대하여 적정된다. 단클론 항체는 일반적으로 적어도 약 0.1 mM, 더 일반적으로는 적어도 약 1 μM의 K_d로 결합하며, 흔히 1 nM 이하의 K_d로 결합하도록 디자인될 수 있다.

예시적인 실시양태에서, 동물, 예컨대 토끼 또는 마우스는 ανβ5 폴리펩티드, 또는 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작제물로 면역화된다. 면역화의 결과로서 생성된 항체는 표준 방법을 이용하여 단리될 수 있다.

본 발명의 면역글로불린 - 그의 결합 단편 및 기타 유도체를 포함함 - 은 형질감염된 세포에서의(예를 들어, 불사화 진핵 세포, 예컨대 골수종 또는 하이브리도마 세포에서의) 또는 공지된 방법에 의해 항체를 생성할 수 있는 마우스, 래트, 토끼 또는 기타 척추동물에서의 발현에 의한 것을 포함하는 다양한 재조합 DNA 기술에 의해 쉽게 생성될 수 있다. DNA 서열에 적합한 공급원 세포와 면역글로불린 발현 및 분비에 적합한 숙주 세포가 다수의 공급원, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 획득될 수 있다(문헌[Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Fifth edition(1985) Rockville, Md]).

일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체, 즉, 인간에 있어서 면역원성이 덜하면서 비-인간 항체의 반응성을 유지하는 항체이다. 이는 예를 들어 ανβ5 인테그린에 특이적인 비-인간 CDR 영역을 유지시키고, 항체의 남아있는 부분을 그의 인간 대응체로 대체함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어 문헌[Morrison et al., PNAS USA, 81: 6851-6855(1984)]; 문헌[Morrison and Oi, Adv. Immunol, 44:65-92(1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988)]; 문헌[Padlan, Molec. Immun., 28:489-498(1991)]; 문헌[Padlan, Molec. Immun., 31(3): 169-217(1994)]을 참조한다. 항체를 인간화하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며,예를 들어 미국 특허 제4,816,567호; 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,859,205호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,761호; 미국 특허 제5,693,762호; 미국 특허 제5,777,085호; 미국 특허 제6,180,370호; 미국 특허 제6,210,671호; 및 미국 특허 제6,329,511호; 국제 특허 공개 제WO 87/02671호; 유럽 특허 출원 제0173494호; 문헌[Jones et al.(1986) Nature 321 :522]; 및 문헌[Verhoyen et al(1988) Science 239:1534]에 기술되어 있다. 인간화 항체는 예를 들어 문헌[Winter and Milstein(1991) Nature 349:293]에 추가로 기술되어 있다. 예를 들어, 인간화 면역글로불린 프레임워크 영역을 코딩하는 제1 서열 및 요망되는 면역글로불린 상보성 결정 영역을 코딩하는 제2 서열 세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 합성에 의해 또는 적절한 cDNA 및 게놈 DNA 절편을 조합함으로써 생성될 수 있다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포로부터 공지된 절차에 따라 단리될 수 있다. 본 발명의 면역글로불린을 생성하기 위한 CDR은 ανβ5 인테그린에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체(예를 들어, ALULA 또는 ανβ5 인테그린에의 특이적 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 항체)로부터 유사하게 유도된다.

일부 경우에, CDR을 인간 프레임워크에 전달하면 인간화 항체에 있어서의 특이성이 손실된다. 이러한 경우, 역돌연변이가 상기 항체의 인간 부분의 프레임워크 영역 내로 도입될 수 있다. 역돌연변이를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Co et al , PNAS USA 88;2269-2273(1991)] 및 국제 특허 공개 제WO 90/07861호에 기술되어 있다.

또한 ανβ5 특이적 항체는, 모든 또는 대부분의 가변 영역이 유지되지만 불변 영역은 대체되도록 키메라 항체일 수 있다. ALULA를 예로서 사용하면, ανβ5 인테그린 결합 활성을 보유한 쥐과 가변 영역은 인간 불변 영역, 또는 수의학적 처리에서 사용하기 위한 또 다른 포유류 유래의 불변 영역과 조합된다.

일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab, F(ab')₂, Fv 또는 scFv이다. 항체 단편은 화학적 분해(예를 들어, 파파인 또는 펩신) 및 재조합 방법을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 생성될 수 있다. 재조합 핵산의 단리 및 제조 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다(문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual(2d ed. 1989)]; 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1995)] 참조). 항체는 이. 콜라이(E. coli), 기타 세균 숙주, 효모, 및 다양한 고등 진핵 세포, 예컨대 COS, CHO, 및 HeLa 세포주 및 골수종 세포주를 포함하여 다양한 숙주 세포에서 발현될 수 있다.

본 발명의 일 실시양태는 ανβ5 인테그린에의 특이적 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 항체를 확인하는 방법을 제공한다.

경쟁적 결합 분석법을 이용하여 ανβ5 인테그린에의 특이적 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 당업계에 공지된 다수의 경쟁적 결합 분석법들 중 임의의 것을 이용하여 동일 항원에 대한 두 항체 사이의 경쟁을 측정할 수 있다. 간략하게는, 상이한 항체들이 또 다른 항체의 결합을 억제하는 능력이 시험된다. 예를 들어, 항체는 샌드위치 ELISA 분석법을 이용하여 그가 결합하는 에피토프에 의해 구별될 수 있다. 이는 포획 항체를 이용하여 웰의 표면을 코팅함으로써 실시된다. 그 후 포화 미만의 농도(subsaturating concentration)의 태그된 항원이 포획 표면에 첨가된다. 이 단백질은 특이적 항체:에피토프 상호작용을 통하여 항체에 결합된다. 세척 후, 검출가능한 모이어티(moiety)에 공유 결합된 제2 항체(예를 들어, HRP, 이때 표지된 항체는 검출 항체로서 정의됨)가 ELISA에 첨가된다. 이 항체가 포획 항체와 동일한 에피토프를 인식할 경우, 이것은 표적 단백질에 결합할 수 없으며, 이는 상기 특정 에피토프가 더 이상 결합에 이용가능하지 않기 때문이다. 그러나 이 2차 항체가 표적 단백질 상의 상이한 에피토프를 인식할 경우 이것은 결합할 수 있으며 이 결합은 관련 기질을 이용하여 활성의 수준(그리고 그에 따라 결합된 항체)를 정량화함으로써 검출될 수 있다. 배경은 포획 항체 및 검출 항체 둘 모두로서 단일 항체를 사용함으로써 규정되며, 반면, 최대 신호는 항원 특이적 항체를 이용하여 포획하고 항원 상의 태그에 대한 항체를 이용하여 검출함으로써 확립될 수 있다. 배경 및 최대 신호를 기준으로 사용함으로써 항체를 쌍비교 방식으로 평가하여 에피토프 특이성을 결정할 수 있다.

제1 항체는, 상기에 기술된 분석법들 중 임의의 것을 사용하여 제1 항체의 존재 하에 항원에의 제2 항체의 결합이 적어도 30%, 일반적으로 적어도 약 40%, 50%, 60% 또는 75%만큼, 흔히 적어도 약 90%만큼 감소될 경우 제2 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것으로 간주된다.

B. ανβ5 인테그린의 발현의 억제

상기에 논의된 바와 같이, 본 발명은 ανβ5 인테그린에의 리간드의 결합의 차단이 패혈증의 중증도를 감소시킨다는 놀라운 발견을 기반으로 한다. 예를 들어, 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명자는 β5^-/- 생쥐, 및 ανβ5 길항제 항체로 처리된 마우스가 패혈증 모델에서 생존성이 향상되었음을 입증하였다. ανβ3에 대한 항체 길항제는 실제로 유해하였으며, 패혈성 응답을 악화시켰다.

따라서, 전사 또는 번역 수준에서 β5 인테그린 유전자의 발현을 특이적으로 간섭하는 뉴클레오티드 서열이 패혈증의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 이러한 접근법에서는 siRNA에 의한 mRNA의 분해를 유도함으로써 또는 안티센스 핵산에 의해 mRNA를 차폐함으로써 특정 돌연변이 mRNA의 전사 또는 번역을 차단하기 위하여 예를 들어 siRNA 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, siRNA 또는 안티센스 작제물은 β3 서브유닛의 발현을 유의하게 차단하지 않는다.

1. siRNA

β5 유전자에 상응하는 이중 가닥 siRNA는 β5 mRNA 전사체의 분해를 유도함으로써 ανβ5 인테그린의 전사 및/또는 번역을 사일런싱시키고 따라서 ανβ5 인테그린의 발현 방지에 의해 패혈증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. siRNA는 전형적으로 길이가 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드이며, 더 전형적으로는 길이가 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드이며, 가장 전형적으로는 길이가 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드이다. siRNA 분자 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌[Bass, 2001, Nature, 411, 428-429]; 문헌[Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498]; 국제 특허 공개 제WO 00/44895호; 국제 특허 공개 제WO 01/36646호; 국제 특허 공개 제WO 99/32619호; 국제 특허 공개 제WO 00/01846호; 국제 특허 공개 제WO 01/29058호; 국제 특허 공개 제WO 99/07409호; 및 국제 특허 공개 제WO 00/44914호에 기술되어 있다. dsRNA 또는 siRNA(예를 들어, 헤어핀(hairpin) 이중가닥으로서)로 전사되는 DNA 분자는 또한 RNAi를 제공한다. dsRNA로 전사되는 DNA 분자는 미국 특허 제6,573,099호와 미국 특허 출원 공개 제2002/0160393호 및 미국 특허 출원 공개 제2003/0027783호와, 문헌[Tuschl and Borkhardt, Molecular Interventions, 2: 158(2002)]에 개시되어 있다. 예를 들어, 젠뱅크 등록 번호 AK054968; BF588784; BE208820; BE207859; 또는 BE206567에 개시된 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 dsRNA 올리고뉴클레오드가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 간섭 RNA의 부재 하에 탐지된 증상과 비교하여 패혈증 증상의 중증도가 감소하는 것을 이용하여 siRNA의 효능을 모니터링할 수 있다.

siRNA는 siRNA의 주사, 흡입 또는 경구 섭취에 의한 것을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 대상체에 전달될 수 있다. siRNA에 적합한 또 다른 전달 시스템으로는 예를 들어 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템과 같은 콜로이드성 분산 시스템이 있다. 본 발명의 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 유용한 인공 막 소낭(vesicle)이다. 리포좀 내의, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산은 생물학적 활성 형태로 세포에 전달된다(문헌[Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981]). 리포좀은 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 특정 세포 유형 또는 조직에 표적화될 수 있다.

2. 안티센스 올리고뉴클레오티드

β5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 ανβ5 인테그린의 전사 및/또는 번역을 사일런싱하고 그에 따라 패혈증을 치료 또는 예방하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 에를 들어, 젠뱅크 등록 번호 BF588784(인간); BE208820(인간); BE207859(인간); BE206567(인간); NM_002213(인간); BC006541(인간); NM_174679(소); AF468059(소); NM_O1O58O(쥐과); BC058246(쥐과); XM_147237(쥐과); AF022111(쥐과); AF022110(쥐과); AF043257(쥐과); AF043256(쥐과); 및 S58644(래트)에 개시된 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 안티센스 핵산의 부재 하에 탐지된 증상과 비교하여 패혈증 증상의 중증도가 감소하는 것을 이용하여 안티센스 핵산의 효능을 모니터링할 수 있다.

안티센스 핵산은 특정 mRNA 분자의 적어도 일부분에 대하여 상보성인 DNA 또는 RNA이다(예를 들어, 문헌[Weintraub, Scientific American, 262:40(1990)] 참조). 전형적으로, 합성 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 길이가 15개 내지 25개 염기이다. 안티센스 핵산은 예를 들어 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 및 -아노머 당-포스페이트, 골격-변형 뉴클레오티드와 같은 변형 뉴클레오티드 또는 천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

세포에서, 안티센스 핵산은 상응하는 mRNA에 혼성화되어 이중 가닥 분자를 형성한다. 안티센스 핵산은 mRNA의 번역을 간섭하며, 그 이유는 세포가 이중 가닥인 mRNA를 번역하지 않기 때문이다. 약 15개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 바람직하며, 그 이유는 상기 올리고머가 표적 뉴클레오티드 돌연변이체 생성 세포 내로 도입될 때 더욱 큰 분자보다 문제를 야기할 가능성이 더 적으며 용이하게 합성되기 때문이다. 유전자의 시험관내 번역을 억제하기 위한 안티센스 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다(문헌[Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289,(1988)]. 덜 일반적으로는, DNA에 직접적으로 결합하는 안티센스 분자가 사용될 수 있다.

β5 인테그린 유전자에 특이적인 안티센스 폴리뉴클레오티드의 전달은 에를 들어 상기 폴리뉴클레오티드의 직접적인 주사, 흡입 또는 섭취를 포함하여 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 성취될 수 있다. 게다가, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 재조합 발현 벡터(예를 들어, 아데노바이러스(adenovirus), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 또는 레트로바이러스(retrovirus)를 기반으로 한 바이러스 벡터) 또는 콜로이드성 분산 시스템(예를 들어, 리포좀)을 이용하여 전달될 수 있으며, 이는 본원에 기술된 바와 같다.

IV. 추가의 ανβ5 길항제의 확인

ανβ5 인테그린의 추가의 길항제가 미국 특허 출원 제20050226865호에서 발견될 수 있거나 당업계의 숙련자에게 공지된 방법에 따라 쉽게 확인될 수 있다. 길항제에 대하여 스크리닝하는 한 가지 편리한 방법은 잠재적인 길항제가 공지된 인테그린 리단드의 결합에 대하여 경쟁하는 능력을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 오스테오폰틴, 테나신 c 및 아데노바이러스 펜톤 염기는 ανβ5 인테그린의 잠재적인 길항제를 확인하기 위하여 경쟁 분석법에서 사용될 수 있는 공지된 ανβ5 인테그린 리간드이다. 아미노산 서열 RGD를 포함하는 다른 폴리펩티드도 경쟁 분석법에서 사용될 수 있다. 게다가, ανβ5 인테그린에 결합하는 단클론 항체 및 그의 단편을 이용하여 ανβ5 인테그린의 추가의 길항제에 대하여 스크리닝할 수 있다. 일부 실시양태에서, ALULA 및 ανβ5에의 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 항체를 이용하여 ανβ5 인테그린의 추가의 길항제에 대하여 스크리닝한다.

경쟁 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, ανβ5 인테그린의 리간드 또는 ανβ5 인테그린에의 리간드 결합에 대하여 경쟁하는 항체(예를 들어, ALULA)는 ανβ5 인테그린에의 결합 차이(예를 들어, ανβ5 인테그린에 대한 잠재적인 경쟁 리간드의 증가하는 양의 존재 하에서)가 측정될 수 있도록 표지된다. 리간드는 천연 리간드일 뿐만 아니라 합성 리간드일 수도 있다. 경쟁적 분석법은 잠재적인 경쟁 길항제의 친화도를 나타낸다.

세포에서, 예를 들어 포유류 세포에서, 특히 인간 세포에서 특정 토폴로지(topology)의 ανβ5 인테그린의 기능 또는 활성의 수준을 조정하는 에이전트를 확인하기 위하여 다수의 상이한 스크리닝 프로토콜이 이용될 수 있다. 일반적으로, 스크리닝 방법은 예를 들어 ανβ5 인테그린에의 결합에 의해 또는 ανβ5 인테그린에 특이적인 항체(예를 들어, ALULA) 또는 리간드(예를 들어, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 오스테오폰틴, 테나신 c, 아데노바이러스 펜톤 염기)가 ανβ5 인테그린에 결합하지 못하게 함으로써 ανβ5와 상호작용하는 에이전트를 확인하기 위하여 복수의 에이전트를 스크리닝하는 것을 포함한다.

ανβ5 인테그린에 결합할 수 있는 에이전트에 대하여 스크리닝함으로써 예비 스크린을 행할 수 있으며, 이는 그렇게 확인된 에이전트들 중 적어도 일부가 ανβ5 인테그린 길항제일 가능성이 있기 때문이다. 상기 결합 분석법은 일반적으로 ανβ5 인테그린을 하나 이상의 시험 에이전트와 접촉시키고, ανβ5 인테그린과 시험 에이전트가 결합 복합체를 형성하기에 충분한 시간을 허용하는 것을 포함한다. 형성된 임의의 결합 복합체는 다수의 확립된 분석 기술들 중 임의의 것을 사용하여 검출될 수 있다. 단백질 결합 분석법은 면역조직화학적 결합 분석법, 유세포 분석법 또는 기타 분석법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 분석법에서 이용되는 ανβ5 인테그린은 자연적으로 발현되거나, 클로닝되거나, 합성될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 시험관내에서 또는 세포 기반 분석법으로서 수행될 수 있다. 세포 기반 분석법은 ανβ5 인테그린이 발현되는 임의의 세포에서 수행될 수 있다. 세포 기반 분석법은 에이전트에 의한 ανβ5 인테그린 활성의 조정 또는 에이전트 결합에 대하여 스크리닝하기 위하여 ανβ5 인테그린을 함유하는 세포 분획 또는 전 세포를 포함할 수 있다. 당업계의 숙련자라면 ανβ5 인테그린이 내인성 ανβ5 인테그린을 포함하지 않는 세포에서 발현될 수 있음을 인정할 것이다. 적합한 세포 기반 분석법은 에를 들어 문헌[DePaola et al., Annals of Biomedical Engineering 29: 1-9(2001)]에 기술되어 있다.

ανβ5 인테그린과 상호작용하는 것으로 처음에 확인된 에이전트는 겉보기 활성을 확인하기 위하여 추가로 시험될 수 있다. 바람직하게는 그러한 연구는 하기 실시예에 기술된 바와 같이 패혈증의 적합한 세포 기반 모델 또는 동물 모델을 이용하여 행해진다. 그러한 방법의 기본 포맷은 처음 스크린 동안 확인된 리드(lead) 화합물을 모델로서의 역할을 하는 동물에게 투여하고, 그 후 실제 패혈증이 개선되는지를 결정하는 것을 포함한다. 입증 연구에서 이용된 동물 모델은 일반적으로 임의의 종류의 포유류이다. 적합한 동물의 구체예는 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이 등) 및 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 기니아 피그, 토끼 등)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

ανβ5 인테그린의 잠재적인 길항제로서 시험되는 에이전트는 임의의 작은 화학적 화합물, 또는 생물학적 실체(entity), 예컨대 폴리펩티드, 당, 핵산 또는 지질일 수 있다. 대안적으로, 조정제는 유전자 변경된 버전의 ανβ5 인테그린 또는 ανβ5 인테그린 리간드일 수 있다. 가장 흔히는 수성 또는 유기(특히 DMSO-기반) 용액에 용해될 수 있는 화합물이 사용되지만, 본질적으로 임의의 화학적 화합물이 본 발명의 분석법에서 잠재적인 조정제 또는 리간드로서 사용될 수 있다. 본 분석법은 분석 단계를 자동화하고 임의의 편리한 공급원으로부터의 화합물을 분석에 제공함으로써 큰 화학적 라이브러리를 스크리닝하도록 디자인되는데, 이는 전형적으로 병행으로(예를 들어, 로봇 분석법에서 미세적정 플레이트 상의 미세적정 포맷으로) 실행된다.

일 실시양태에서, 높은 처리량의 스크리닝 방법은 다수의 잠재적인 치료 화합물(잠재적인 조정제 또는 리간드 화합물)을 포함하는 조합적 화학적 라이브러리 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 그러한 "조합적 화학적 라이브러리" 또는 "리간드 라이브러리"는 그 후 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 분석법에서 스크리닝하여 요망되는 특징적인 활성을 디스플레이하는 라이브러리 구성원(특히 화학종 또는 화학적 하위부류)을 확인한다. 그렇게 확인된 화합물은 통상적인 "리드 화합물"로서의 역할을 할 수 있거나 그 자신이 잠재적인 또는 실제적인 치료제로서 사용될 수 있다.

조합적 화학적 라이브러리는 다수의 화학적 "빌딩 블록", 예컨대 시약의 조합에 의해 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학적 화합물의 콜렉션이다. 예를 들어, 선형의 조합적 화학적 라이브러리, 예컨대 폴리펩티드 라이브러리는 주어진 화합물 길이에 있어서(즉, 폴리펩티드 화합물에서의 아미노산의 수) 모든 가능한 방식으로 화학적 빌딩 블록(아미노산)의 세트를 조합함으로써 형성된다. 수백만개의 화학적 화합물이 화학적 빌딩 블록들의 그러한 조합적 혼합을 통하여 합성될 수 있다.

조합적 화학적 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 그러한 조합적 화학적 라이브러리는 펩티드 라이브러리를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다(예를 들어, 미국 특허 제5,010,175호, 문헌[Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493(1991)] 및 문헌[Houghton et al., Nature 354:84-88(1991)] 참조). 화학적 다양성의 라이브러리를 생성하는 다른 화학물질이 또한 이용될 수 있다. 그러한 화학물질은 펩토이드(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 91/19735호), 코딩된 펩티드(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 93/20242호), 랜덤 바이오-올리고머(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 92/00091호), 벤조디아제핀(예를 들어, 미국 특허 제5,288,514호), 디버소머(diversomer), 예컨대 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드(문헌[Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913(1993)]), 비닐성 폴리펩티드(문헌[Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568(1992)]), 글루코스 스캐폴딩(scaffolding)을 갖는 비펩티드성(nonpeptidal) 펩티드모방물(문헌[Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218(1992)]), 작은 화합물의 라이브러리의 유사 유기 합성(문헌[Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661(1994)]), 올리고카르바메이트(문헌[Cho et al., Science 261:1303(1993)]), 및/또는 펩티딜 포스포네이트(문헌[Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658(1994)]), 핵산 라이브러리(오스벨(Ausubel), 베르거(Berger) 및 샘브룩(Sambrook)의 모든 상기 문헌 참조), 펩티드 핵산 라이브러리(예를 들어, 미국 특허 제5,539,083호 참조), 항체 라이브러리(예를 들어, 문헌[Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314(1996)] 및 국제 특허 출원 제PCT/US96/10287호 참조), 탄수화물 라이브러리(예를 들어, 문헌[Liang et al., Science, 274:1520-1522(1996)] 및 미국 특허 제5,593,853호 참조), 작은 유기 분자의 라이브러리(예를 들어, 벤조디아제핀은 문헌[Baum C&EN, Jan 18, page 33(1993)]; 이소프레노이드는 미국 특허 제5,569,588호; 티아졸리디논 및 메타티아자논은 미국 특허 제5,549,974호; 피롤리딘은 미국 특허 제5,525,735호 및 미국 특허 제5,519,134호; 모르폴리노 화합물은 미국 특허 제5,506,337호; 벤조디아제핀은 미국 특허 제5,288,514호 등 참조).

조합적 라이브러리의 제조 장치가 구매가능하다(참조: 예를 들어, ECIS TM, 어플라이드 바이오피직스 인크.(Applied BioPhysics Inc.), 미국 뉴욕주 트로이, MPS, 390 MPS, 어드밴스드 켐 테크(Advanced Chem Tech), 미국 켄터키주 루이빌, 심포니(Symphony), 레이닌(Rainin), 미국 매사추세츠주 워번, 433에이 어플라이드 바이오시스템즈(433A Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티, 9050 플러스(Plus), 밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 베드포드). 게다가, 다수의 조합적 라이브러리 그 자체가 구매가능하다(참조: 예를 들어, 컴제넥스(ComGenex), 미국 뉴저지주 프린스턴, 트리포스, 인크.(Tripos, Inc.), 미국 미주리주 세인트 루이스, 쓰리디 파마슈티칼스(3D Pharmaceuticals), 미국 펜실베이니아주 엑스톤, 마텍 바이오사이언시즈(Martek Biosciences), 미국 메릴랜드주 컬럼비아 등).

V. 치료적 치료

상기에 논의된 바와 가이, 본 발명은 ανβ5 인테그린의 길항제를 함유하는 조성물을 또한 제공한다. 본 발명의 조성물은 패혈증을 포함하여 ανβ5 인테그린을 포함하는 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 제공될 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 조성물(예를 들어, ALULA, 인간화 ALULA, ALULA 단편, 또는 ανβ5 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 항체를 함유하는 조성물)이 패혈증에 걸린 또는 패혈증 발병 위험이 있는 대상체에서 패혈증을 치료 또는 예방하기 위하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 감염성 에이전트에 노출된 대상체는 그러한 노출 후 치료될 가능성이 있으며, 반면 패혈증 위험이 있는 환자는 에방적으로 및/또는 치료적으로 치료될 수 있다. 패혈증 위험이 있는 환자의 예는 급성 호흡을 갖는 환자, 세균성 패혈증 증상을 나타내는 환자, 혈액 배양물이 그람(gram) 양성 또는 그람 음성 세균에 대하여 양성인 환자, 췌장염, 또는 출혈성 쇼크 상태의 환자를 포함한다.

본 발명의 조성물은 소정의 기간 동안(예를 들어, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 1 내지 3주 또는 그 이상) 규칙적으로(예를 들어, 매일), 또는 단회 용량, 다회 용량으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 예를 들어 주사(예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내 또는 피내), 흡입, 경피 적용, 직장 투여 또는 경구 투여에 의한 것을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 경로를 이용하여 포유류 대상체에 직접적으로 투여하여 ανβ5 결합을 차단할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 조성물 투여에 사용되는 특정 방법에 의해서뿐만 아니라 투여되는 특정 조성물에 의해서도 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물의 광범위하게 다양한 적합한 제형이 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989] 참조).

단독의 또는 다른 적합한 성분들과 조합된 본 발명의 조성물은 흡입을 통하여 투여될 에어로졸 제형으로 만들어질 수 있다(즉, 본 조성물은 "분무"될 수 있다). 에어로졸 제형은 가압된 허용되는 분사제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 두어질 수 있다.

투여에 적합한 제형은 수성 및 비-수성 용액, 등장성 살균 용액 - 항산화제를 포함할 수 있음 - , 완충제, 정균제 및 제형이 등장성으로 되게 하는 용질과, 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 살균 현탁액을 포함한다. 본 발명의 실행에서, 조성물은 예를 들어 경구, 비강, 국소, 정맥내, 복강내 또는 수막강내 투여될 수 있다. 화합물의 제형은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉된 용기 형태로, 예컨대 앰풀 또는 바이알 형태로 제시될 수 있다. 용액 및 현탁액은 이전에 기술된 종류의 살균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 조정제가 제조된 식품 또는 약물의 일부로서 또한 투여될 수 있다.

경구 투여에 적합한 제형은 (a) 액상 용액, 예컨대 희석제, 예컨대 물, 염수 또는 PEG 400에 현탁된 유효량의 패키징된 핵산; (b) 각각이 소정량의 활성 성분을 액체, 고형물, 과립 또는 젤라틴으로서 함유하는 캡슐, 사세제(sachet) 또는 정제; (c) 적절한 액체 중 현탁액; 및 (d) 적합한 에멀젼을 포함할 수 있다. 정제 형태는 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 미정질 셀룰로오스, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 및 기타 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 착향제, 염료, 붕해제, 및 제약상 양립가능한 담체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 활성 성분에 더하여 당업계에 공지된 담체를 함유하는, 불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 중 활성 성분을 포함하는 향성 또는 수크로스 및 아카시아 에멀젼, 겔 등뿐만 아니라 플레이버(flavor), 예를 들어 수크로스 중 활성 성분도 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 환자에게 투여되는 용량은 시간이 지남에 따라 대상체에서 유익한 응답, 예를 들어 폐 모세혈관 정수압의 감소, 폐 내의 유체의 감소, 폐 내의 유체 축적 속도의 감소, 또는 그 조합을 초래하기에 충분하여야 한다. 임의의 환자에 있어서의 최적의 용량 수준은 이용되는 특정 조정제의 효능, 환자의 연령, 체중, 신체 활동, 식이를 포함하는 다양한 인자에 따라, 다른 약물과의 가능한 조합에 따라, 그리고 패혈증의 중증도에 따라 달라진다. 용량의 크기는 또한 특정 대상체에 있어서 특정 화합물 또는 벡터의 투여에 수반되는 임의의 해로운 부작용의 정도, 성질 및 존재에 의해 결정된다.

투여되는 ανβ5 인테그린의 길항제의 유효량을 결정하는 데 있어서 의사는 길항제 독성 및 길항제의 순환 혈장중 수준을 평가할 수 있다. 일반적으로, 길항제의 용량 당량은 전형적인 대상체의 경우 약 1 ng/kg 내지 10 mg/kg이다.

투여에 있어서, ανβ5 인테그린의 길항제는 대상체의 전체 건강 및 질량에 적용될 때 다양한 농도에서의 길항제의 부작용 및 길항제의 LD₅₀에 의해 결정되는 속도로 투여될 수 있다. 투여는 단회 용량 또는 분할 용량을 통하여 성취될 수 있다.

VI. 병용 요법

일부 실시양태에서, ανβ5 인테그린은 패혈증의 치료 또는 예방용의 제2 치료제와 함께 투여된다. 예를 들어, ανβ5 인테그린의 길항제(예를 들어, ALULA, 인간화 ALULA, ALULA의 단편, 또는 ανβ5에 대하여 ALULA와 경쟁하는 항체)는 예를 들어 항생제, 스타틴, 스테로이드, 활성화된 단백질 C, 이뇨제, 혈관 수축제, 수축 촉진약을 포함하는 패혈증 표준 치료제들 중 임의의 것과 함께 투여될 수 있다. 게다가, ανβ5 인테그린의 길항제는 패혈증에 연루된 대사 경로를 표적화하는 에이전트와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, ανβ5 인테그린의 길항제는 TGFβ 경로 억제제, 활성화된 단백질 C, GM-CSF, ανβ5 인테그린 또는 β5에 특이적으로 결합하는 항체, ανβ5 인테그린의 제2 길항제, ανβ6 인테그린에 특이적으로 결합하는 항체, ανβ6 인테그린의 길항제, 트롬빈 수용체 길항제, 항-트롬빈제, 로 키나제(rho kinase) 억제제, 및 예를 들어 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA를 포함하여 ανβ5 인테그린의 발현을 억제하는 핵산과 함께 투여될 수 있다.

스타틴(HMG-CoA 리덕타제 억제제)은 예를 들어 심바스타틴 또는 아토르바스타틴을 포함한다. 항생제 요법이 일반적이며, 이는 특정 감염을 특이적으로 표적화하기 위하여 의료 전문가에 의해 가장 잘 선택될 수 있다. 예시적인 항생제는 예를 들어 페니실린, 에리트로마이신, 시클릭 리포펩티드(답토마이신), 글리실시클린(트게시클린) 및 옥사졸리디논(리네졸리드)을 포함한다.

적합한 TGFβ 경로 억제제는 예를 들어 문헌[Ling et al., J. Amer. Soc. Nephrol. 14: 377-388(2003)], McCormick et al., J. Immunol. 163:5693-5699(1999)], 및 문헌[Cordeiro, Curr. Opin. Mol. Ther. 5(2): 199-203(2003)]에 기술된 TGF-β 항체(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 또는 임의의 그의 조합을 특이적으로 차단하는 것을 포함함); 예를 들어, 문헌[DaCosta Bayfield, Mol. Pharmacol. 65(3):744-52(2004)], 문헌[Laping, Curr. Opin. Pharmacol. 3(2):204-8(2003)], 문헌[Laping, Mol. Pharmacol. 62(1):58-64(2002)]에 기술된 TGF-β 수용체 제II형 억제제 또는 TGF-β 수용체 제I형 키나제 억제제; 예를 들어, 문헌[Pittet, J. Clin. Invest. 107:1537-1544(2001)]; 문헌[Wang et al., Exp Lung Res. 28(6):405-17(2002)] 및 문헌[Wang, Thorax 54(9):805-12(1999)]에 기술된 가용성 TGF-β 수용체 제II형; 예를 들어, 문헌[Zhang, J Invest. Dermatol. 121(4):713-9(2003)]에 기술된 가용성의 잠복성 결부된 펩티드; 예를 들어, 문헌[Crawford et al., Cell 93:1159-1170(1998)], 문헌[Riberiro et al., J. Biol. Chem. 274:13586-13593(1999)], 및 문헌[Sch㎕tz-Cherry et al., J. Biol. Chem. 269: 26775-26782(1994)]에 기술된 트롬보스폰딘 I 억제제를 포함한다. 적합한 β-2 작동제는 예를 들어, 알부테롤, 비톨테롤, 포르모테롤, 이소프로테레놀, 레발부테롤, 메타프로테레놀, 피르부테롤, 살메테롤 및 테르부탈린을 포함한다.

게다가, ανβ5 인테그린의 길항제는 미국 특허 공개 제20020004042호에 기술된 β2 아드레날린 수용체와 조합되어, 그리고 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2000/40019206호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0019037호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0019035호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0018192호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0010023호, 미국 특허 출원 공개 제2003/0181440호, 미국 특허 출원 공개 제2003/0171271호, 미국 특허 출원 공개 제2003/0139398호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0037889호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0077321호 및 미국 특허 출원 공개 제2002/0072500호에 기술된 ανβ5 인테그린의 소분자형 억제제와 조합되어 투여될 수 있다.

ανβ5 인테그린의 길항제(예를 들어, ALULA, 인간화 또는 키메라 ALULA, ALULA의 단편, 또는 ανβ5 결합에 대하여 ALULA와 경쟁하는 항체) 및 제2 치료제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어 ανβ5 인테그린의 길항제가 먼저 투여되고, 이어서 제2 치료제가 투여될 수 있다. 대안적으로, 제2 치료제가 먼저 투여되고, 이어서 ανβ5 인테그린의 길항제가 투여될 수 있다. 일부의 경우, ανβ5 인테그린의 길항제 및 제2 치료제는 동일한 제형으로 투여된다. 다른 경우, ανβ5 인테그린의 길항제 및 제2 치료제는 상이한 제형으로 투여된다. ανβ5 인테그린의 길항제 및 제2 치료제가 상이한 제형으로 투여될 때, 이들의 투여는 동시적이거나 순차적일 수 있다.

투여에 있어서, ανβ5 인테그린의 길항제 및 제2 치료제는 대상체의 전체 건강 및 질량에 적용될 때 다양한 농도에서의 길항제 및 제2 치료제의 부작용과 길항제 및 제2 치료제의 합해진 LD₅₀에 의해 결정되는 속도로 투여될 수 있다. 일부의 경우, ανβ5 인테그린의 길항제 및 제2 치료는 치료적 용량 미만의 용량 또는 치료적 용량으로 각각 투여된다.

실시예

실시예 1: 재료 및 방법

시약 및 항체: LPS(리스트 파마슈티칼스(List Pharmaceuticals)), VEGF 및 TGF-β(알앤디 시스템즈(R & D Systems)), 트롬빈(아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)). 마우스 항-인간 ανβ3 항체(클론 LM609)(케미콘(Chemicon)) 및 마우스 IgG1 이소형 대조(업스테이트(Upstate)). 마우스 항-마우스/인간 ανβ5 항체(ALULA), 암하 아타킬리트(Amha Atakilit)의 호의(문헌[Su et al. 2007 Am J Respir Cell Mol. Biol 36:377]) 및 C7(항-소 LDL 수용체 IgG2b 이소형 대조(ATCC). ¹²⁵I-표지된 소 혈청 알부민(BSA)(지나토프 아이에스오-티이엑스 다이아그노스틱스(Jeanatope ISO-TEX Diagnostics)), ¹⁴C-BSA)(퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)). 스핑고신 1-포스페이트(S1P)(시그마).

세포 배양: 인간 폐동맥 내피 세포(HPAEC) 및 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)를 EGM-2^TM 배지(클론틱스(Clonetics), 론자(Lonza))에서 제조업자의 프로토콜에 따라 배양 및 유지하였다.

경내피적 알부민 흐름의 분석: 6.5 mm 콜라겐-코팅 PFTE 막 코스타 트랜스웰스(Costar Transwells)(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)) 상에 세포를 웰당 75,000개의 세포로 접종하고, 융합성이 되도록 배양하였다. 세포를 텍스트에 기술한 항체 및 시약과 함께 인큐베이션하였다. 그 후, ¹⁴C-BSA(0.005 μCi)(퍼킨-엘머)를 37℃에서 1시간 동안 각각의 상부 구획에 적용하고, 그 후 하부 구획으로부터의 내용물을 수집하고, LS 6500 다목적용 신틸레이션 카운터(M㎕ti-Purpose Scintillation Counter)(베크만(Beckman))를 이용하여 카운팅하였다. 기저선에서 추적자 중 97% 초과를 보유한 단층만을 연구하였다.

액틴 세포골격 염색: 세포를 4일에 걸쳐 융합성이 되도록 콜라겐-코팅 유리 커버슬립 상에서 성장시켰다. 세포는 혈청-기아 세포(12시간)였으며, 이를 텍스트에 기술한 항체 및 시약으로 예비 처리하였다. 그 후 세포를 3.7% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시키고, 0.5% 트리톤 X-100을 투과시키고, 그 후 로다민 팔로이딘(몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes))으로 염색시키고, 탑재하고, 낙사형광용으로 갖추어진 라이카 DM5000B 현미경을 이용하여 이미지화하였다.

β3 서브유닛 k.o., β5 서브유닛 k.o., 및 WT 마우스: 129/sv 배경의 β3 및 β5 서브유닛 k.o. 및 WT 마우스를 우리 실험실에서 교배 및 유지하였다. 모든 실험을 20 g(+/- 2 g)으로 칭량되는 연령 및 중량-매칭된 암컷 마우스를 이용하여 수행하였다.

복강내(i.p.) LPS 패혈증 모델: 물에 1 mg/ml로 희석시킨 LPS(리스트 파마슈티칼스)를 10 mg/kg 또는 13 mg/kg의 용량으로 i.p. 주사하였다.

기관 혈관외 투과성 분석: 각각의 패혈성 상해의 적용 후 소정의 시점에서(LPS의 i.p.의 경우 대략 36시간), 0.5 μCi의 ¹²⁵I-BSA를 후안와에 주사하고, 2시간 동안 순환시켰다. 2시간 후, 마우스를 안락사시키고, ¹²⁵I의 분당 카운트(CPM)의 개개의 평가를 위하여 기관을 수확하였다(위저드(Wizard)(등록상표) γ 카운터, 퍼킨엘머). 수확한 기관은 소장/장간막, 결장을 포함하였다. 폐 혈관 투과성은 우리의 이전의 방법에 기술된 바와 같이 혈관외 혈장 등가물(extravascular plasma equivalent, EVPE)을 측정하는 방법을 이용하여 동시에 평가한다(문헌[Su et al. 2007 Am J Respir Cell Mol. Biol 36:377]).

장간막 혈장 누출의 FITC-BSA 국소화: 내피 누출 부위는 마우스를 안락사시키기 2시간 전에 FITC-표지 BSA(90S 시그마 FD70S, 25 mg/ml의 원액)를 후안와에 주사함으로써(100 mg/kg) 현미경에 의해 확인하였다. 장간막 및 소장은 혈관계를 붕괴시키지 않도록 주의하면서 일괄적으로 수확하였다. 장간막 전조직 표본을 준비하고, 4% 파라폴름알데히드 및 PBS 0.3% 트리톤으로 고정시켰다(문헌[Baluk et al.(1999) Br J Pharmacol 126:522]). 라이카 DM5000B 현미경을 이용하여 국소적 FITC 삼출 영역으로서 누출 부위를 확인하였다.

골수 재구성: 6-8주령의 공여 마우스(β3 k.o. 또는 야생형 주)를 이소플루란 과량 및 경추 탈골을 이용하여 안락사시켰다. 골수 세포를 긴 사지골의 원위 단부로부터 수확하고, IMDM 20% 송아지 태아 혈청 배지에 현탁시켰다. 1-3x10⁶개의 세포/수령체는 방사선 조사한(1,100 RAD, 대략 8분) 마우스 내로 꼬리 정맥에 의해 주사하였다.

방사선 조사한 마우스를 절차 후 6주 동안 네오마이신/폴리마이신수로 처리하였다. 골수 생착은 혈소판에서의 β3 발현에 대하여 유세포 분석법에 의해 결정하였다.

마우스 혈소판 단리 및 β3 발현의 평가: 혈액을 하대정맥 천공에 의해 마우스로부터 수집하고, ACD(시그마)를 포함하는 세척 완충액(NaCl 137 nM, KCl 2.7 nM, MgC1₂.6H₂O 1.0 mM, NaH₂PO₄.H₂O 3.3 mM, HEPES 3.8 mM, 글루코스 0.1%, BSA 0.1%, pH 7.4)을 포함하는 튜브에 첨가하였다. 10 단위의 아피라제 + 0.75 ㎕의 PGE1을 첨가하고 현탁시킨 후 원심분리하였다(200 g, 5분). 혈장 풍부 혈장을 제거하고, 2.0 ㎕의 아피라제 및 0.75 ㎕의 PGE1을 첨가한 후 원심분리하였다(700 g, 5분). 그 후, 펠렛화된 혈소판을 β3 항체(이바이오사이언스(eBioscience) 항-마우스 CD61 클론 2C9.G3, 16-0611-81)와 함께 인큐베이션하고, 항-햄스터 PE 이차 항체(잭슨 랩스(Jackson Labs))로 표지하고, 유세포 분석법(FACSort, 벡톤 디킨슨(Beckton Dickinson))으로 프로세싱하였다.

헤마토크릿 측정: 혈액을 하대정맥 천공을 통하여 수득하고, 마이크로헤마토크릿 모세관 내로 흡인시키고, 마이크로원심분리기(유니코(Unico) C MH30)에서 회전시켰다.

실시예 2: 인간 폐동맥 내피 세포( HPAEC )에서의 작동제-유도된 투과성은 ανβ5의 항체 억제에 의해 약화되며 ανβ3의 항체 억제에 의해 향상된다.

HPAEC를 인테그린 ανβ5 및 ανβ3에 특이적인 기능-차단 항체로 처리하고, 부종원성 작동제-유도된 투과성을 관찰하였다. 트랜스웰스 상에서 성장시킨 융합성 단층을 가로지르는 C¹⁴-BSA 흐름을 측정함으로써 내피 투과성을 결정하였다. ανβ 5-억제 항체는 VEGF, TGF-β, 및 트롬빈에 대한 증가된 투과성 응답을 약화시켰다. 이와는 대조적으로, ανβ3-억제 항체는 이들 작동제 각각에 대한 투과성 응답을 향상시켰다(도 1a).

실시예 3: ανβ3 및 ανβ5는 초점 부착부에 동시 국소화된다 .

작동제-유도된 투과성에 대한 ανβ5 및 ανβ3 차단의 반대되는 영향을 고려하여, 본 발명자는 HPAEC에서 ανβ5 및 ανβ3을 면역세포화학적으로 국소화하여 이러한 기능적 차이가 차별적 세포 분포와 결부될 수 있는지를 평가하였다. 놀랍게도, 둘 모두의 인테그린은 공통의 초점 부착 부위에 대부분 동시국소화되었다(도 1b).

실시예 4: ανβ5는 트롬빈 -유도된 스트레스 섬유 형성을 우선적으로 지지하며 ανβ3은 S1P -유도된 피질 액틴 형성을 우선적으로 지지한다.

공통적인 초점 부착부를 점유함에도 불구하고, ανβ5 및 ανβ3이 관찰된 기능적 효과와 일치하는 방식으로 액틴 조직화의 차별적 패턴을 지지할 수 있는지를 시험하였다. 트롬빈은 그의 내피 투과성-유도 특성에 대하여 광범위하게 연구된 전응고제 세린 프로테아제이다. 트롬빈은 PAR₁G 단백질 커플링된 수용체(GPCR)를 통하여 신호를 전달하여 복잡한 신호전달 경로를 개시하며, 이는 RhoA를 활성화시키고 F-액틴을 스트레스 섬유로 조직화한다. 스핑고신-1-포스페이트(S1P)는 막 인지질 스핑고마이엘린의 분해에 의해 생성되는 지질이다. S1P₁ 수용체의 활성화는, PAR₁과는 대조적으로 내피 장벽-보호 응답을 트리거링한다. S1P₁ 활성화는 Tiam-1이 p110α 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K)-의존적으로 카베올린-풍부 미세도메인 내로 모집되게 하고 Rac1을 활성화시키는데, 이는 액틴이 피질 분포 번들(bundle), 즉, "피질" 액틴으로 재조직화되는 것을 유도한다.

본 발명자는 HPAEC에 대한 트롬빈 및 S1P의의 기능적으로 그리고 형태적으로 독특한 영향에 대한 ανβ5 및 ανβ3의 항체 차단의 영향을 조사하였다. ανβ5 차단은 트롬빈으로 처리한 HPAEC에서 스트레스 섬유 형성을 약화시켰다. 인테그린 ανβ3 차단 항체는 어떠한 영향도 없었다(도 1c). 이와는 대조적으로, S1P-유도된 피질 액틴 형성은 ανβ5 항체에 의해 영향을 받지 않았으며, 오히려 ανβ3 항체에 의해 약화되었다(도 1d).

실시예 5: ανβ3 차단은 트롬빈 -유도된 투과성에 대한 S1P 보호를 극복한다.

다음, 본 발명자는 S1P에 의해 유도된 장벽-보호 응답에 대한 ανβ3 차단의 영향을 연구하였다. HPAEC를 ανβ3 또는 이소형 대조 항체로 전처리하고, 그 후 S1P로 처리한 것을 증가 용량의 트롬빈으로 자극하였다. ανβ3 항체를 이용한 전처리는 S1P에 대한 장벽-보호 응답을 극복하였으며, 이소형 대조로 전처리한 세포와 비교하여 트롬빈에 대하여 과투과성 응답을 야기하였다(도 1e).

실시예 6: β3 k.o. 마우스는 급성 폐손상(Acute Lung Injury , ALI )의 LPS -유도된 모델에서 폐 부종 형성을 증가시켰다.

기능-차단 ανβ5 항체는 급성 폐손상(ALI)의 허혈-관류 모델에서 폐부종 형성을 약화시켰으며, ανβ5 항체-처리 및 β5 서브유닛 k.o. 마우스는 ALI의 인공 호흡 장치-유도된 모델에서 폐부종 형성으로부터 보호되었다(문헌[Su et al.(2007) Am J Respir Cell Mol. Biol 36:377]). ανβ3 차단에서 관찰된 과투과성 내피 응답이 ALI의 모델에서 관련이 있는지를 결정하기 위하여, 본 발명자는 야생형 대조에 대하여 β3 k.o. 마우스에서 기관내(도 2a) 및 복강내(i.p.)(도 2b) LPS 투여 후 페 혈관 투과성을 측정하였다. 이들 모델 각각에 있어서, 본 발명자는 β3 k.o. 군에서 폐 에반스 블루 삼출의 유의한 증가를 발견하였다.

β5 결핍의 보호 효과를 ALI의 LPS-유도된 모델에 적용할지를 결정하기 위하여, 본 발명자는 야생형 마우스에 대하여 β5 k.o.에서 기관내 및 i.p. LPS 투여 후 폐에서 에반스 블루 삼출량을 측정하였다. 예비 결과에 의하면 β5 k.o. 마우스가 ALI의 LPS-유도된 모델에서 폐부종 형성을 감소시켰음이 나타났다. 중량 및 성별-매칭된 β5 k.o. 및 야생형 마우스를 50 ㎕ 물 비히클 대조에 대하여 50 ㎕ 물 중 50 ㎍ LPS를 투여하거나, 10 mg/kg을 i.p 투여하였다.

실시예 7: β3 k.o. 마우스는 야생형 대조와 비교하여 i.p. LPS -유도된 패혈증에서의 사망률이 증가되었다 .

본 발명자는 ανβ3 기능의 손실이 전신성 패혈증 모델에서 과투과성 내피 응답을 향상시키는지를 결정하고자 하였다. 복강 패혈증의 i.p. LPS-유도된 모델에서, 본 발명자는 야생형 대조와 비교하여 β3 k.o. 마우스에서 사망률이 증가하였음을 알아냈다(도 3a).

실시예 8: β3 k.o. 마우스는 LPS 의 i.p. 주사 후 장간막 혈관 주위에서 FITC-BAS 추적자의 국서적 삼출이 있었다.

β3 결핍에 있어서 증가된 LPS-유도 사망률이 증가된 전신적 혈관 투과성과 결부된 것인지를 결정하기 위하여, 본 발명자는 전조직 표본 이미지화를 위하여 온전한 소장 및 장간막을 수확하기 2시간 전에 FITC-BSA 혈관 추적자를 주사하였다. FITC 형광에 의해 강조된 온전한 혈관을 현미경 검사법으로 관찰하였다. 본 발명자는 β3 k.o. 마우스에서 i.p. LPS 투여(10 mg/kg) 후 WT 대조와 비교하여 국소적 장간막 혈관 추적자 삼출이 증가하였음을 알아냈다(도 3b).

실시예 9: β3 k.o. 마우스에서는 LPS( 10 mg / kg )의 i.p. 주사 후 소장/장간막 및 결장 내로의 ¹²⁵ I- BSA 삼출이 증가하였다.

이러한 과투과성 응답을 정량화하기 위하여, 본 발명자는 장간막/소장 및 결장을 일괄적으로 수확하기 2시간 전에 ¹²⁵I-BSA 혈관내 추적자을 주사하였다. 전 기관을 전체 분당 카운트(CPM)에 대하여 분석하고, 혈청중 카운트로 정규화하였다. 본 발명자는 WT 마우스와 비교하여 β3 k.o.에서 장간막/소장 및 결장에서 ¹²⁵I-BSA 추적자의 유의한 증가가 있음을 알아냈다(도 3c).

실시예 10: 인간 탯줄 정맥 내피 세포( HUVEC )에서의 작동제-유도된 투과성은 ανβ3의 항체 억제에 의해 향상된다.

ανβ3 차단에 의한 내피 과투과성 응답이 전신 혈관으로부터 유래된 내피 세포에서 관련이 있는지를 결정하기 위하여, HUVEC를 ανβ3 차단 항체로 전처리하고, 부종원성 작동제-유도된 투과성에 대한 그의 영향을 연구하였다. 트렌스웰스 상에서 성장시킨 융합성 단층을 가로지르는 C¹⁴-BSA 흐름을 측정함으로써 내피 투과성을 결정하였다. HPAEC에서와 같이, ανβ3-억제 항체는 HUVEC에서 VEGF, TGF-β, 및 트롬빈에 대한 증가된 투과성 응답을 향상시켰음이 밝혀졌다(도 3d).

실시예 11 : β3 k.o 마우스는 LPS i.p. 후 혈액 농축을 나타낸다.

인테그린 β3 서브유닛(CD61)은 αv(CD51) 및 αIIb(CD41) 서브유닛 둘 모두와 회합된다. αIIbβ3은 혈소판 상의 주요 인테그린으로서, 혈소판 활성화, 응집 및 기능을 조절한다. 혈소판 기능이상 및 가능한 출혈의 혼동자에 대처하기 위하여, 헤마토크릿에 대한 LPS i.p. 투여(10 mg/kg)의 영향을 측정하였다. β3 k.o. 마우스에서는 헤마토크릿이 유의하게 증가하여 상당한 출혈에 대한 증거를 제공하고, 오히려 혈장의 삼출 및 혈관 투과성의 증가를 제공함이 밝혀졌다(도 3e).

실시예 12: β5 k.o. 마우스에서는 패혈증의 LPS i.p. 모델에서 생존성이 증가되었다 .

ανβ5 차단 및 결핍은 작동제-유도된 투과성에 대한 보호를 부여한다. 현재의 연구에 의하면 ανβ5 및 ανβ3이 혈관 투과성에 대하여 반대되는 조절 효과를 가지며, β3 k.o. 마우스에서는 LPS-유도된 패혈증에서 혈관 투과성 및 사망률이 증가되었음이 밝혀졌다. i.p. LPS-유도된 복강 패혈증 모델에서, 야생형 대조와 비교하여 β5 k.o. 마우스에서 생존성이 증가하였음이 밝혀졌다(도 4a). 이 결과는 ανβ5 결핍이 혈관 투과성 및 패혈증의 결부된 해로운 영향을 감소시킴을 입증한다.

실시예 13: β5 k.o. 마우스에서는 LPS 의 i.p. 주사 후 장간막 혈관 주위에서 FITC - BSA 추적자의 국소적 삼출이 감소하였다.

장벽-보호 응답이 LPS i.p.에 의해 β5 결핍에서 일어나는지를 결정하기 위하여, 전조직 표본 이미지화를 위하여 온전한 소장 및 장간막을 수확하기 2시간 전에 FITC-BSA 혈관 추적자를 주사하였다. FITC 형광에 의해 강조된 온전한 혈관을 미생물 검사법으로 관찰하였다. LPS i.p. 투여(13 mg/kg) 후 야생형과 비교하여 β5 k.o. 마우스에서 국소적 장간막 혈관 삼출이 감소하였음이 밝혀졌다(도 4b).

실시예 14: ανβ5 차단 항체의 투여는 야생형 대조와 비교하여 i.p. LPS-유도된 패혈증에서 사망까지의 시간을 증가시킨다.

LPS(13 mg/kg)를 i.p. 투여한지 24시간 후, 야생형 마우스는 병에 걸려 아팠으며, 이는 패혈증 증후군으로 진단된 위독하게 아픈 환자와 유사하였다. 이 시점에서, 마우스를 이소형 대조 항체에 대하여 ανβ5 차단 항체로 처리하였다. ανβ5 차단 항체로 처리한 마우스에서는 이소형 대조로 처리한 마우스와 비교하여 사망까지의 시간이 유의하게 증가하였다(도 4c).

이들 결과는, ανβ5 차단 항체의 투여가 패혈증을 실제로 역전시키기 ㄸ때때문에 놀라운 것이다. 일반적으로, 패혈성 반응의 급성인 성질은 즉각적인 집중적인 의료 개입, 예를 들어 환기, 투석, 정맥내액, 및 항생제를 필요로 한다.

실시예 15: ανβ5 차단 항체의 투여는 야생형 대조와 비교하여 패혈증의 맹장 결찰 및 천공( CLP ) 모델에서 사망까지의 시간을 증가시킨다.

ανβ5 차단 항체가 패혈증을 역전시키는 능력을 추가로 조사하기 위하여, 맹장 결찰 및 천공 수술을 수행하고, 이어서 ALULA ανβ5 항체 및 대조(C7) 항체를 투여하였다. CLP는 다균성 복강 패혈증의 연구에 사용한 표준 설치류 모델이다(예를 들어, 문헌[Rittirsch et al.(2009) Nat. Protocols 4:31-36] 참조). 간략하게는, 상기 수술은 맹장의 단부와 회맹장판 사이의 50% 거리에서의 맹장의 결찰, 이어서 23게이지 니들을 이용한 원위 맹장의 철저한 천공을 포함하였다. 작은 대변 비드(다수의 세균 종의 내인성 공급원)를 천공 부위를 통하여 짜냈다. 맹장의 천공은 세균성 복막염, 이어서 염증성 응답의 전신적 활성화 및 패혈증과, 마지막으로 사망을 야기하였다.

20마리의 마우스에서 CLP 수술을 수행하였으며, 이때 각각 10마리를 대조 항체 또는 ανβ5 항체를 이용한 처리쪽으로 랜덤화하였다. CLP 수술을 수행하고 복부 절개부를 닫은 후, ανβ5 또는 대조 항체를 후안와 혈관망 주사를 통하여 단회 용량으로 정맥내(iv) 투여하였다. 사망률을 도 5에 도시한 바와 같이 기록하였다(시간은 h의 단위임).

이 결과에 의하면 LPS 실시예로부터의 것이 확인되었다. 또, ανβ5 차단항체의 투여에 의해 생존성이 유의하게 향상되었으며, 이때 마우스 중 80%가 10일 초과의 일수 동안 생존하였다. 이와는 대조적으로, 대조 항체로 처리한 마우스 중 40%만이 생존하였다. 따라서, 세균 감염에의 노출 후 ανβ5 차단 항체의 투여는 패혈증 및 사망 가능성을 감소시키기에 충분하였다.

상기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제공되며, 본 발명의 범주를 한정하기 위하여 제공된 것은 아니다. 본 발명의 다른 변동이 당업계의 숙련자에게 쉽게 자명해질 것이며, 이는 첨부된 특허청구범위에 포함된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 데이타베이스, 특허, 특허 출원 및 등록 번호는 사실상 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

Claims

ανβ5 인테그린에 특이적인 항체의 치료적 양을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 ανβ5 인테그린에의 리간드 결합을 특이적으로 억제하며, ανβ3, β3, ανβ6, β6, ανβ8 또는 β8 중 1 이상에 유의하게 결합하지 않는 것인 대상체에서 패혈증의 치료 또는 예방 방법.
제1항에 있어서, 항체는 ανβ3, β3, ανβ6, β6, ανβ8 또는 β8 중 어떠한 것에도 유의하게 결합하지 않는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체는 키메라 또는 인간화 항체인 방법.
제1항에 있어서, 리간드는 비트로넥틴, 피브로넥틴, 오스테오폰틴, 테나신 c 및 아데노바이러스 펜톤 염기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체는 ανβ5 인테그린에의 특이적 결합에 대하여 ATCC 기탁 번호 PTA-5817의 하이브리도마에 의해 생성된 ALULA 항체와 경쟁하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 항체는 ALULA의 상보성 결정 영역을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 항체는 인간화 또는 키메라 ALULA인 방법.
제5항에 있어서, 항체는 ALULA인 방법.
제1항에 있어서, 투여는 복강내 또는 정맥내 투여인 방법.
제1항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
제1항에 있어서, 대상체는 패혈증을 앓는 것인 방법.
제1항에 있어서, 대상체는 패혈증 발병 위험성이 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 패혈증 치료 또는 예방용의 제2 치료제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 제2 치료제는 항생제, 스타틴, 스테로이드, 활성화된 단백질 C, TGFβ 경로 억제제, GM-CSF, 이뇨제, ανβ5 인테그린의 길항제, ανβ5 인테그린에 특이적으로 결합하는 제2 항체, ανβ6 인테그린의 길항제, 혈관수축제 및 수축 촉진약으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
ανβ5 인테그린의 활성 또는 발현을 특이적으로 억제하지만, ανβ3, β3, ανβ6, β6, ανβ8 또는 β8 중 1 이상의 활성 또는 발현은 유의하게 억제하지 않는 에이전트(agent)의 치료적 양을 투여함으로써 대상체에서 ανβ5 인테그린의 활성 또는 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 대상체에서 패혈증의 치료 또는 예방 방법.
제15항에 있어서, 상기 에이전트는 ανβ5 인테그린 길항제, ανβ5 인테그린의 소분자형 억제제, 및 β5 서브유닛의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제15항에 있어서, 에이전트는 ανβ5 인테그린에 특이적인 항체 및 ανβ5 인테그린의 소분자형 억제제로부터 선택되는 것인 방법.