ES2212260T5 - Procedimiento de evolucion molecular in vitro de la funcion proteica. - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para la creación in vitro de una biblioteca molecular sobre al evolución de la función proteica. Particularmente, se refiere a la variabilidad y modificación de la función proteica mediante la distribución aleatoria de segmentos de secuencia polinucleótida. Se puede obtener una proteína de características deseadas incorporando variantes de regiones de péptidos (motivos variantes) en una regiones de péptidos definidos (secuencia de andamio). Los motivos variantes se pueden obtener de un DNA padre que se ha sometido a mutagénesis para crear una pluralidad de derivados de éstos diferentemente mutados o se pueden obtener de secuencias en vivo. Estos motivos variantes se pueden incorporar a una secuencia de andamio y la proteína codificada resultante se puede seleccionar para obtener las características deseadas. Este procedimiento es idealmente empleado para tener anticuerpos con características deseadas mediante el aislamiento de secuencias individuales CDR DNA e incorporándolas a un andamio que puede, por ejemplo ser de un anticuerpo totalmente diferente.

Description

Procedimiento de evolución molecular in vitro de la función proteica.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con un método para la evolución molecular in vitro de la función proteica. Concretamente, aunque no de forma exclusiva, se relaciona con la redistribución de la secuencia polinucleotidica en una secuencia codificante.
Antecedentes de la invención
La función proteica puede ser modificada y mejorada in vitro por una variedad de métodos, incluyendo la mutagénesis dirigida a sitio (Moore y col., 1987), la clonación combinatoria (Huse y col., 1989; Marks y col., 1992) y la mutagénesis aleatoria combinada con sistemas de selección apropiados (Barbas y col., 1992).
El método de mutagénesis aleatoria, junto con selección, ha sido empleado en una serie de casos para mejorar la función proteica y existen dos estrategias diferentes. En primer lugar, la aleatorización de toda la secuencia génica en combinación con la selección de una proteína variante (mutante) con las características deseadas, seguido de un nuevo ciclo de mutagénesis aleatoria y selección. Este método puede ser luego repetido hasta encontrar una variante proteica que se considere óptima (Moore y col., 1996). Aquí, la ruta tradicional para introducir mutaciones es por PCR tendente a errores (Leung y col., 1989), con una proporción de mutación de \approx0,7%.
En segundo lugar, se pueden mutagenizar regiones definidas del gen con cebadores degenerados, lo que permite razones de mutación de hasta el 100% (Griffiths col., 1994; Yang y col., 1995). Cuando más alta sea la razón de mutación empleada, más limitada será la región del gen que puede ser sometida a mutaciones.
Se ha usado extensamente la mutación aleatoria en el campo de la ingeniería de los anticuerpos. Se pueden clonar in vitro genes de anticuerpos formados in vivo (Larrick y col., 1989) y se pueden someter combinaciones aleatorias de los genes codificantes de los genes variables pesados y ligeros a selección (Marks y col., 1992). Se pueden mejorar aún más fragmentos funcionales de anticuerpos seleccionados usando mutagénesis aleatoria y ciclos adicionales de selecciones (Hoogenboom y col., 1992).
La estrategia de mutagénesis aleatoria va seguida de selección. Se pueden seleccionar variantes con características interesantes y se combinan las regiones de ADN mutagenizadas de diferentes variantes, cada una de las cuales tiene características interesantes, en una secuencia codificante (Yang y col., 1995). Éste es un proceso secuencial de múltiples etapas y se pueden perder los efectos sinérgicos potenciales de diferentes mutaciones en diferentes regiones, ya que no están sometidas a selección en combinación. Así, estas dos estrategias no incluyen la mutagénesis simultánea de regiones definidas y la selección de una combinación de estas regiones. Otro procedimiento conlleva el emparejamiento combinatorio de genes que pueden ser usados para mejorar, por ejemplo, la afinidad de anticuerpos (Marks y col., 1992). Aquí, las tres regiones CDR (regiones determinantes de complementariedad) en cada gen variable son fijas y esta tecnología no permite la redistribución de regiones CDR individuales entre
clones.
La selección de proteínas funcionales a partir de librerías moleculares ha sido revolucionada por el desarrollo de la tecnología de exhibición de fagos (Parmley y col., 1987; McCafferty y col., 1990; Barbas y col., 1991). Aquí, el fenotipo (proteína) está directamente ligado a su genotipo correspondiente (ADN) y esto permite clonar directamente el material genético, que puede ser entonces sometido a más modificaciones para mejorar la función proteica. Se ha usado la exhibición de fagos para clonar ligantes funcionales a partir de una variedad de librerías moleculares con hasta 10^{11} transformantes en cuanto a tamaño (Griffiths y col., 1994). Así, se puede usar la exhibición de fagos para clonar directamente ligantes funcionales a partir de librerías moleculares y se puede usar también para mejorar aún más los clones originalmente seleccionados.
La combinación aleatoria de ADN de diferentes clones mutados es una forma más eficiente para buscar a través del espacio de la secuencia. El concepto de redistribución de ADN (Stemmer, 1994) utiliza la fragmentación aleatoria del ADN y el montaje de fragmentos en una secuencia codificante funcional. En este procedimiento, es posible introducir secuencias de ADN químicamente sintetizadas y de este modo dirigir la variación a lugares definidos en el gen cuya secuencia de ADN es conocida (Crameri y col., 1995). En teoría, es también posible redistribuir ADN entre cualesquiera clones. Sin embargo, si el gen redistribuido resultante ha de ser funcional con respecto a expresión y a actividad, los clones a redistribuir tienen que estar relacionados o incluso ser idénticos, a excepción de un bajo nivel de mutaciones aleatorias. La redistribución de ADN entre clones genéticamente diferentes producirá, en general, genes no funcionales.
Resumen de la invención
En general, la presente invención proporciona un método de obtención de una secuencia polinucleotídica codificante de una proteína de características deseadas, consistente en incorporar al menos una región nucleotídica variante (motivo variante) en regiones nucleotídicas definidas (secuencia andamio) derivadas de una secuencia polinucleotídica parental. La nueva secuencia polinucleotídica montada puede entonces expresarse y la proteína resultante sometida a un estudio selectivo para determinar sus características.
El presente método permite alterar las características de las proteínas modificando la secuencia polinucleotídica codificante de la proteína de una manera específica. Se puede conseguir esto bien a) substituyendo una región especificada de la secuencia nucleotídica con una secuencia nucleotídica diferente, bien b) mutando la región especificada para alterar la secuencia nucleotídica. Estas regiones especificadas (motivos variantes) son incorporadas en regiones andamio o marco (secuencia andamio) de la secuencia polinucleotídica original (secuencia polinucleotídica parental) que, cuando son montadas de nuevo, codificarán para una proteína de características alteradas. Las características de la proteína codificada se alteran como resultado de que la secuencia de aminoácidos cambia en correspondencia a los cambios en la secuencia polinucleotídica codificante.
Más que modificar una secuencia aleatoriamente y depender después de una extensa selección en cuanto a la proteína codificada deseada, los presentes inventores han visto que es deseable disponer de un método que modifique segmentos seleccionados (motivos variantes) de una proteína manteniendo otros.
Los motivos variantes pueden ser segmentos de secuencia nucleotídica que codifican para regiones especificadas de una proteína. Por ejemplo, regiones funcionales de una proteína (por ejemplo, bucles) o regiones CDR en un anticuerpo.
La secuencia andamio puede corresponder a segmentos de secuencia nucleotídica que es deseable mantener; por ejemplo, pueden codificar regiones más estructurales de la proteína, v.g. regiones marco en un anticuerpo.
Los motivos variantes pueden ser segmentos nucleotídicos que se originaron de la misma secuencia polinucleotídica que la secuencia andamio, es decir, la secuencia polinucleotídica parental, pero que han sido mutados para alterar la secuencia codificante con respecto a la del parental. Por ejemplo, la secuencia polinucleotídica parental puede codificar para un anticuerpo. Las secuencias nucleotídicas codificantes de las regiones CDR del anticuerpo (motivos variantes) pueden ser seleccionadas a partir del resto de la secuencia codificante del polinucleótido parental, mutadas y luego montadas de nuevo con una secuencia andamio derivada del resto de la secuencia codificante. El anticuerpo expresado diferirá del anticuerpo de tipo salvaje expresado por el polinucleótido parental sólo en las regiones
CDR.
Alternativamente, el motivo variante puede derivar de una secuencia polinucleotídica codificante de una proteína secuencialmente relacionada con la proteína codificada por la secuencia polinucleotídica parental. Por ejemplo, las regiones CDR de un anticuerpo (anticuerpo A) pueden ser substituidas por las regiones CDR de otro anticuerpo (anticuerpo B).
En cada caso, se puede hacer un estudio selectivo de la proteína expresada resultante en cuanto a las características deseadas. Las características deseables pueden ser cambios en las propiedades biológicas de la proteína. Por ejemplo, se puede alterar la estructura terciaria de la proteína. Esto puede afectar a sus propiedades de unión, a su capacidad para ser segregada por las células o al interior de las células o, para las enzimas, a sus propiedades catalíticas. Si la proteína es un anticuerpo o parte del mismo, puede ser deseable alterar su capacidad para unirse específicamente a un antígeno o mejorar sus propiedades de unión en comparación con el anticuerpo parental.
Según un aspecto de la presente invención, se facilita un método de obtención de una proteína de características deseadas incorporando regiones peptídicas variantes (motivos variantes) en regiones peptídicas definidas (secuencia andamio), cuyo método consiste en las siguientes etapas:
(a) someter la secuencia polinucleotídica parental codificante de uno o más motivos proteicos a mutagénesis para crear una pluralidad de derivados mutados de forma diferente de la misma, u obtener un polinucleótido parental codificante de una pluralidad de motivos proteicos variantes de secuencia desconocida;
(b) disponer de una pluralidad de parejas de oligonucleótidos, representando cada pareja localizaciones espaciadas entre sí sobre la secuencia polinucleotídica parental que limitan un motivo proteico variante intermedio y utilizar cada una de dichas parejas de oligonucleótidos como cebadores de amplificación para amplificar el motivo intermedio;
(c) obtener una secuencia nucleotídica de una sola hebra a partir de la secuencia nucleotídica amplificada así aislada, y
(d) montar la secuencia nucleotídica codificante de una proteína incorporando a las secuencias nucleotídicas derivadas de la etapa (c) anterior una secuencia nucleotídica codificante de una secuencia andamio.
Este método puede también incluir la etapa de expresión de la proteína resultante codificada por la secuencia nucleotídica montada y hacer un estudio selectivo de las propiedades deseadas.
Preferiblemente, la secuencia polinucleotídica parental es ADN del que derivan las secuencias de ADN codificantes de los motivos variantes y de las secuencias andamio.
Preferiblemente, los pares de oligonucleótidos son cebadores oligonucleotídicos de una sola hebra. Uno de dichos pares puede estar unido a un miembro de una pareja de unión específica ("MSBP"). El MSBP es preferiblemente biotina, cuyo compañero de unión específica podría ser, por ejemplo, estreptavidina. Utilizando la pareja de unión específica, se pueden aislar las secuencias nucleotídicas amplificadas.
Se puede realizar la mutación aleatoria por cualquier método convencional, pero un método adecuado es la PCR tendente a errores.
La proteína en cuestión podría ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tenga características deseables. Son ejemplos de fragmentos de anticuerpos, capaces de unirse a un antígeno u otro compañero de unión, el fragmento Fab, consistente en los dominios VL, VH, C1 y CH1; el fragmento Fd, consistente en los dominios VH y CH1; el fragmento Fv, consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; el fragmento dAb, consistente en un dominio VH; regiones CDR aisladas, y fragmentos F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra. También se incluyen fragmentos Fv de una sola cadena.
En una aproximación, después de mutar aleatoriamente ADN codificante del anticuerpo, o una porción de ese ADN (por ejemplo, la que codifica para las regiones Fab o regiones variables), se podrían sintetizar cebadores oligonucleotídicos correspondientes a secuencias limitantes de las CDR (los motivos variantes), de tal forma que se amplifiquen los ADN codificantes de las CDR, junto con cualquier mutación que pueda haberse producido en las CDR. Éstas pueden ser incorporadas en el nuevo montaje de la secuencia codificante del anticuerpo usando las secuencias de ADN CDR amplificadas y las secuencias andamio de ADN marco ("FR") no mutadas, dando lugar a la expresión de un anticuerpo que tiene una nueva combinación de CDR y que potencialmente tiene propiedades alteradas, que pueden ser seleccionadas o buscadas de un modo convencional.
En otra aproximación, más que mutar las CDR y volverlas a montar de nuevo en un anticuerpo que estará estrechamente relacionado con el anticuerpo parental del que derivan las CDR, las CDR pueden ser tomadas de uno o más anticuerpos existentes, pero ser de secuencia desconocida. Usando cebadores oligonucleotídicos que representan secuencias que limitan las diversas CDR, se pueden amplificar las CDR individuales, aislarlas y montarlas en un andamio predeterminado.
Por supuesto, se podrían usar combinaciones de las aproximaciones anteriores, tomando las CDR de uno o más anticuerpos parentales y montándolas en un andamio para producir un anticuerpo secundario completamente nuevo, luego, después de hacer una selección para obtener un anticuerpo secundario con características deseadas, se podría mutar el ADN que lo codifica, amplificar y aislar las CDR y montarlas luego nuevamente con ADN no-CDR no mutado (andamio) del anticuerpo secundario para producir variantes del anticuerpo secundario que están mutadas en las CDR y que pueden ser seleccionadas en cuanto a propiedades mejoradas con respecto al anticuerpo secundario originalmente seleccionado.
La presente invención permite una nueva forma de aislamiento de secuencias de ADN a partir de clones genéticamente relacionados que son funcionalmente diferentes. Clones genéticamente relacionados son aquéllos que pertenecen a una clase estructural particular, por ejemplo inmunoglobulinas o alfa-beta-barril. La invención permite tanto el aislamiento como la combinación aleatoria en una secuencia de ADN dada de secuencias funcionales a partir de estos clones relacionados. Estas secuencias funcionales pueden ser bucles que realizan unión o catálisis.
El concepto de la invención se demuestra usando moléculas de anticuerpo donde se pueden aislar regiones CDR de diferentes secuencias de la línea germinal y combinarlas aleatoriamente en una secuencia marco definida. La invención aumenta la complejidad de las librerías moleculares que pueden ser seleccionadas usando exhibición de fagos. El concepto de la invención se demuestra también por la maduración por afinidad de fragmentos de anticuerpo mediante aislamiento y combinación aleatoria de regiones CDR mutadas.
No es posible usar el concepto de redistribución del ADN (Stemmer, 1994) para aislar secuencias específicas y combinar éstas aleatoriamente en una secuencia génica dada, ya que no es posible amplificar regiones de ADN individual formadas in vivo usando redistribución del ADN. La combinación de secuencias génicas enteras es posible, pero aquí las regiones definidas no pueden ser redistribuidas. Más bien, se redistribuye todo el ADN. Así, secuencias de ADN de clones genéticamente relacionados que son funcionalmente diferentes, por ejemplo proteínas que pertenecen a clases estructurales como inmunoglobulinas o alfa-beta-barriles, no pueden ser redistribuidas de tal forma que se mantengan constantes regiones específicas y se redistribuyan otras regiones.
El sistema aportado por la presente invención ofrece una forma simple de combinar aleatoriamente regiones funcionales de proteínas (por ejemplo, bucles) con un andamio definido (específicamente seleccionado), es decir, la redistribución de bucles en la estructura terciaria de una proteína dada para hallar nuevas funciones proteicas. Más aún, la tecnología de redistribución del ADN introduce mutaciones en una proporción del 0,7% (Stemmer, 1994). Así, la tecnología conocida de redistribución del ADN (Stemmer, 1994) no permite la redistribución de regiones no mutadas, ya que el propio proceso introduce mutaciones en posiciones aleatorias, incluyendo las regiones
andamio.
\newpage
Por el contrario, la invención permite la mutagénesis de secuencias de ADN definidas junto con redistribución y montaje de estas piezas de ADN en una región codificante y permitirá la mutagénesis de regiones definidas y la posterior selección de estas regiones en combinación.
La invención permite redistribuir y combinar aleatoriamente diferentes regiones de ADN de diferentes secuencias (clones). Esto aumenta la variación genética a partir de la cual se seleccionan los fragmentos de anticuerpo funcionales y aumentará por lo tanto la probabilidad de seleccionar proteínas con las características deseadas. Se puede ver que, redistribuyendo aleatoriamente tan sólo cien CDR en cada posición en el VH y VL de un fragmento, se pueden obtener hasta 1012 combinaciones, prolongando así la variabilidad normalmente encontrada en el sistema inmune.
La invención permite la amplificación de regiones definidas a partir de, por ejemplo, una librería de ADNc usando dos cebadores, de los cuales uno está biotinilado. Usando el MSBP, por ejemplo biotina, se puede aislar ADN de una sola hebra y usarlo en el proceso de montaje de genes. Los presentes inventores han demostrado esto con la amplificación de diversas regiones CDR de una librería génica de anticuerpos y la combinación de estas regiones CDR aleatoriamente con una región marco dada. Así, regiones definidas de ADN (regiones marco) pueden estar espaciadas por regiones aleatorias de ADN (regiones CDR) que se originan in vivo o que pueden ser químicamente
sintetizadas.
La presente invención también proporciona secuencias polinucleotídicas y las proteínas que codifican producidas por el método antes descrito. También se presentan vectores que incorporan las secuencias polinucleotídicas y células huésped transformadas por los vectores.
La presente invención también aporta una librería polinucleotídica consistente en polinucleótidos creados por el método antes descrito, que pueden ser usados para exhibición de fagos.
Se ilustrarán ahora aspectos y realizaciones de la presente invención a modo de ejemplo, en relación a las figuras adjuntas. Otros aspectos y realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Todos los documentos mencionados en este texto son incorporados aquí como referencia.
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Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la redistribución de secuencias específicas de ADN entre diferentes clones, en base al montaje de secuencias génicas a partir de un conjunto de oligonucleótidos solapantes siguiendo un protocolo de PCR de una sola etapa.
La Figura 2 muestra diferentes constantes de velocidad de disociación para diferentes clones con redistribución de CDR. Una barra baja representa una velocidad de disociación lenta y una barra alta representa una velocidad de disociación rápida. El clon 36 es el fragmento de anticuerpo no mutado original.
La Figura 3 muestra los resultados de fragmento de anticuerpo scFv purificado por afinidad estudiado por HPLC, columna de FPLC Superose S-200 (Pharmacia) en tampón PBS. El pico 1 es la forma monomérica del fragmento de anticuerpo, el pico 2 es una pequeña cantidad de impureza y el pico 3 es NaN_{3} (azida sódica), usado como
conservante.
La Figura 4 muestra una representación esquemática de la amplificación de secuencias definidas de ADN y la redistribución de éstas en un marco maestro. Sólo se amplifican las regiones CDR. Figura 4A: Montaje de genes para el dominio VH. La plantilla es scFv-B11 mutado con PCR tendente a errores. Se amplifica una CDR individual usando dos cebadores adyacentes a la CDR particular y uno de estos cebadores es biotinilado en el extremo 5'. Se amplifica la CDR individual y se produce ADN de doble hebra ("dsADN") con las mutaciones enfocadas hacia la CDR, ya que los dos cebadores de amplificación no contienen ninguna mutación. Se separa este ADN en dos moléculas de ADN de una sola hebra. Se usa la molécula sin biotina en el montaje génico. Se sintetizan los cebadores 725, 729, 730, 728 y 727 en un sintetizador de AD y los cebadores H2, H3 y H5 contienen CDR mutada y son amplificados como antes. Figura 4B: Montaje de genes para el dominio VL. Se amplifican las CDR de la misma manera que en A. Se sintetizan los cebadores 759, 738, 745, 744 y 880 en un sintetizador de ADN y los cebadores L2, L3 y L5 contienen CDR mutada y se amplifican como antes.
La Figura 5 muestra la alineación de las secuencias peptídicas para los clones 3, 11 y 31 con el fragmento de anticuerpo no mutado original (wt). Las regiones CDR están marcadas. Las mutaciones en los clones 3, 11 y 31 están subrayadas.
La Figura 6 muestra los principios para el aislamiento de ADN de una sola hebra para la redistribución de regiones definidas de ADN.
La Figura 7 muestra la longitud de la cadena pesada CDR3 de diferentes clones. Estas regiones CDR han sido amplificadas a partir de diferentes secuencias de la línea germinal y aleatoriamente clonadas para una región marco definida (a partir de la secuencia DP-47).
La Figura 8 muestra una representación esquemática de la amplificación de secuencias definidas de ADN y la redistribución de éstas en un marco maestro. Todos los oligonucleótidos usados en el montaje de genes son amplificados por PCR, pero sólo las regiones CDR contienen cualquier variación genética. Figura 8A: Montaje de genes para el dominio VH. La plantilla para la amplificación de la región marco es scFv-B11, mientras que las CDR son amplificadas a partir de ADNc preparado con linfocitos de sangre periférica, amígdalas y bazo. Se amplifica un fragmento de ADN individual usando dos cebadores localizados en los extremos de los fragmentos que han de ser amplificados y uno de estos cebadores es biotinilado en el extremo 5'. Se amplifica el fragmento de ADN individual y se produce ADN de doble hebra (dsADN). Se separa este ADN en dos moléculas de ADN de una sola hebra. Se usa la molécula sin biotina en el montaje génico, es decir, los cebadores H1, H4 y H6, y estos cebadores no contienen variación. Los cebadores HCDR1, HCDR2 y HCDR3 contienen diferentes CDR y son amplificados usando dos cebadores adyacentes a la CDR particular y uno de estos cebadores es biotinilado en el extremo 5'. Se amplifica la CDR individual y se produce ADN de doble hebra (dsADN) con la variación enfocada hacia la CDR, ya que los dos cebadores de amplificación no contienen ninguna mutación. Se separa este ADN en dos moléculas de ADN de una sola hebra y se usa en el montaje génico del dominio VH en un formato de librería, es decir, que la variación en las CDR deriva de diferentes secuencias de la línea germinal. Los cebadores BT25 y BT26 son sintetizados en una máquina sintetizadora de ADN. Figura 8B: Montaje de genes para el dominio VL. En principio, el mismo procedimiento que en A. Los cebadores L1, L4 y L6 son amplificados y producidos por PCR y no contienen variación. LCDR1, LCDR2 y LCDR3 contienen diferentes CDR. Los cebadores BT7 y BT12 son sintetizados en una máquina sintetizadora de ADN.
La Figura 9 muestra la variación en una librería construida según la Figura 8. Se sintetizó la región scFv de clones de librería y del scFv-B11 original, que se une a FITC (isotiocianato de fluoresceína) por PCR. Se cortaron los productos de la PCR purificados con BstNI y se separaron en un gel de agarosa al 2,5%. Los clones 1-15 están en la banda 2-16 y los clones 16-29 están en la banda 18-31. El scFv-B11 original está en la banda 32. El análisis reveló que se podían clasificar 28 clones en 13 grupos diferentes según el patrón de restricción y el tamaño de los fragmentos. Ocho clones (1, 2, 8, 10, 12, 16, 26 y 27) eran únicos, 2 clones (17 y 24) parecían similares, 1 grupo de clones (18, 23 y 29) tenían 3 miembros similares, 2 grupos (5, 15, 14 y 19) y (3, 4, 6 y 11) tenían 4 miembros y 1 grupo (7, 9, 13, 20, 21, 22 y 25) tenía 7 miembros similares. Este experimento subestima la variación en la librería, ya que BstNI detecta sólo una fracción de la variabilidad de secuencia. Además, la resolución del gel no permitió la detección de diferencias menores de tamaño y no resolvió fragmentos por debajo de 100 pb.
La Figura 9B muestra clones que exhiben un patrón de restricción similar en el experimento ejemplificado en la Figura 9A, cortando con BstNI y con BamHI y separando en geles de agarosa al 3%. Para facilitar la comparación, se juntaron sobre los geles los grupos de clones similares descritos en el experimento A. Se excluyeron el clon 8 y el 28 del experimento A debido a limitaciones de espacio.
Gel I) Banda 1-8: patrón, clon 5, 15, 14, 19, 2, 27, scFv-B11 original, respectivamente.
Gel II) Banda 1-8: patrón, clon 16, 17, 24, 18, 23, 29, 26, respectivamente.
Gel III) Banda 1-8: patrón, clon 7, 9, 13, 20, 21, 22, 25, respectivamente.
Gel VI) Banda 1-8: patrón, clon 3, 4, 6, 11, 1, 10, 12, respectivamente.
En estas condiciones experimentales mejoradas, esencialmente todos los clones tenían diferentes patrones de restricción/tamaños de fragmentos. Todos los clones eran diferentes del gen scFv-B11 original (banda 8, gel 1). Más aún, los grupos de clones que parecían similares en la Figura 9A resultaron ser diferentes, según se analizó en la Figura 9B. Véanse los clones 5, 15, 14 y 19 (bandas 2-5, gel I); los clones 17 y 24 (bandas 3-4, gel II), los clones 18, 23 y 29 (bandas 5-7, gel II), los clones 7, 9, 13, 20, 21, 22 y 25 (bandas 2-8, gel III) y los clones 3, 4, 6, 11 (bandas 2-5, gel IV).
En conclusión, estos experimentos sugieren que la librería contiene una alta variabilidad.
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Descripción detallada y ejemplificación de la invención
Un aspecto del procedimiento de redistribución de ADN puede ser ilustrado por las siguientes etapas en la Fig. 1.
A: Se divide un gen codificante de una proteína de interés en oligonucleótidos solapantes.
B: Se montan los oligonucleótidos usando PCR en una secuencia génica de longitud total.
C. Se somete la secuencia génica a mutagénesis por PCR tendente a errores.
D: Se sintetizan pares de oligonucleótidos, cubriendo cada par una región definida por uno de los oligonucleótidos de la etapa A anterior, excepto para una región localizada en el medio del oligonucleótido de la etapa A. Esta región no cubierta es la secuencia de ADN que puede ser redistribuida después de la amplificación por PCR. Estos dos oligonucleótidos sintetizados pueden ser usados, por lo tanto, como cebadores de amplificación para amplificar la región no cubierta.
E: Uno de estos cebadores de amplificación es biotinilado y el producto de PCR de doble hebra puede ser entonces aislado usando sistemas de estreptavidina conocidos.
F: A partir de los oligonucleótidos amplificados así aislados se puede obtener una secuencia de ADN de una sola hebra que contiene ADN de la región no cubierta antes citada, que puede ser usada como oligonucleótido en un nuevo montaje de la secuencia génica descrita en la etapa A.
G: Si se amplifican secuencias de ADN de diferentes clones y de diferentes regiones de la secuencia génica mutada y se las hace de una sola hebra, se combinarán aleatoriamente en el proceso de PCR del montaje de genes. Esta combinación aleatoria es la base de la evolución molecular in vitro.
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Ejemplos
Los presentes inventores han demostrado el concepto de la redistribución de ADN definido en diferentes marcos experimentales. En primer lugar, se ejemplifica la redistribución de regiones CDR mutadas in vitro en un fragmento de anticuerpo con fines de maduración por afinidad (ejemplos 1 y 2) y, en segundo lugar, se ejemplifica la redistribución de CDR formadas in vivo para la creación de una librería de anticuerpos altamente variable (ejemplos 3 y 4).
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1. Maduración por afinidad
Se desarrolló un sistema modelo basado en el fragmento de anticuerpo scFv-B11, que se une a FITC. Se montó el gen de longitud total codificante de este scFv a partir de un conjunto de 12 oligonucleótidos (Fig. 4A y Fig. 4B) que representan la secuencia conocida de ADN del scFv-B11 y se pudo verificar la unión funcional del producto génico a FITC. Se mutagenizó entonces esta secuencia génica usando PCR tendente a errores y se amplificaron los ADN codificantes de las regiones CDR como se ha descrito anteriormente usando los cebadores de amplificación, uno de los cuales está biotinilado. (Las regiones CDR son las partes de la molécula de anticuerpo implicadas en la unión al antígeno, en este caso FITC).
Se amplificaron las seis regiones CDR y se montó un nuevo gen usando seis oligonucleótidos seleccionados entre el primer montaje de 12 oligonucleótidos (véase lo anterior) (éstos no estaban mutagenizados) y seis de la amplificación de regiones CDR mutagenizadas. La selección de fragmentos de anticuerpos funcionales que se unen a FITC fue llevada a cabo usando exhibición de fagos. El 50% de los clones se unían a FITC con velocidades de disociación diferentes a las del scFv-B11 original, según se midió en el biosensor BIAcore (Figura 2). Esto demuestra que los clones fueron cambiados en la forma en que reconocían FITC.
De los 16 clones identificados con unión a FITC en BIAcore (Figura 2), se escogieron los clones 3, 11, 27 y 31 para analizarlos con más detalle, ya que estos clones exhibían los mayores cambios en las velocidades anormales. Se expresaron estos clones y se purificaron por afinidad en una columna conjugada con FITC-BSA y eluida con un tampón de bajo pH. Se hizo una mayor purificación de los fragmentos de anticuerpo scFv purificados y se analizaron por HPLC, usando una columna de FPLC Superdex 200 de Pharmacia con capacidad para separar la forma monomérica y la dimérica de los anticuerpos. En todos los clones, la forma monomérica dominaba (en la Figura 3 se muestra el perfil típico de tamaño). Se purificó ésta y se usó en el análisis de afinidad detallado usando un biosensor BIAcore
(Tabla 1).
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TABLA 1 Determinación de afinidad de los seleccionados 
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1 
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El clon #11 exhibía una afinidad 2,8 veces mayor que el fragmento de anticuerpo scFv-B11 original. Este aumento se basa en una velocidad anormal más lenta. Un clon (#27) mostró un aumento de 2 veces la velocidad de asociación. Sin embargo, la afinidad global de este clon era similar al clon FITC-B11 original debido a una más rápida velocidad de disociación. La distribución de diferentes velocidades de asociación y disociación entre los clones fue considerada una fuente de redistribución de CDR para mejorar más las afinidades.
Se secuenciaron tres clones. En la región VH (es decir, la mitad del scFv-B11 y portadora de tres regiones CDR), las mutaciones halladas estaban todas en las regiones CDR según lo esperado, ya que éstas eran las únicas regiones mutagenizadas y amplificadas usando los cebadores de amplificación. Es interesante el hecho de que todas las regiones CDR eran diferentes y llevan diferentes mutaciones (Figura 5). Sin embargo, en el caso de la región CDR 2, se vio la misma mutación (una substitución de tirosina a histidina) en los 3 clones (el resto de las regiones CDR diferían entre los clones).
Más aún, se vio que las frecuencias de mutación estaban entre el 2% y el 4%, según se determinó por los cambios de bases en la secuencia de 90 pb de longitud constituida por tres regiones CDR juntas. Éstas son mayores que la frecuencia de mutación por PCR tendente a errores e indican que existe combinación de regiones CDR individuales de diferentes clones.
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2. Maduración por afinidad-redistribución
Con objeto de realizar una segunda redistribución (nueva redistribución), se usaron los clones seleccionados por su afinidad de unión a FITC en un ciclo adicional de amplificación de CDR y de construcción de librerías. Teóricamente, la librería redistribuida de nuevo contendrá regiones CDR redistribuidas mutadas, seleccionadas en cuanto a una mejor unión a FITC. De esta forma, se podrían construir nuevas combinaciones de regiones CDR, mejoradas con respecto a la unión, y se podría someter la librería a selección de ligantes con mejores afinidades.
Se usó la reserva de todos los clones obtenidos del procedimiento de selección (según se detalla en el ejemplo 1) como plantilla para las amplificaciones de CDR. Se llevó a cabo una amplificación por cada CDR usando los cebadores que aparecen en la Tabla 2.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA 2 Secuencias de los cebadores usados en la redistribución de las CDR 
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\quad
B = Cebador 5' marcado con biotina
2 
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Se llevó a cabo la amplificación según los siguientes parámetros: 100 ng de plantilla (1,6 x 10^{8} UFC de bacterias crecidas durante 6 h), 60 pmol de cada cebador, 5 Unidades de PFU polimerasa (Stratagene), tampón PFU 1x, 500 \muM de dNTP, volumen de reacción 100 \mul, precalentamiento a 96ºC durante 10 minutos, 96ºC durante 1 minuto, 68ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto durante 25 ciclos, 72ºC durante 10 minutos. Este procedimiento era esencialmente igual al de la amplificación de CDR en el Ejemplo 1. Se usaron las CDR amplificadas para montaje en la secuencia codificante de VH y VL según las Figuras 1, 4A y 4B y la Tabla 3.
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TABLA 3 Parámetros de PCR para el montaje de las secuencias génicas VH y VL en la redistribución de CDR
3 
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Se montaron entonces VH y VL en una secuencia codificante de scFv según procedimientos estándar (Griffiths y col., 1994). Se sometió la librería resultante a separación para seleccionar ligantes con mejores afinidades por FITC. El procedimiento de selección para la librería redistribuida de nuevo era esencialmente el mismo que para la librería inicialmente redistribuida. El número total de clones obtenidos tras la selección era de 510. Se eligieron seis clones (B) de esta nueva reserva y se estudiaron y compararon con 6 clones (A) de la primera reserva, originados de la librería redistribuida (Tabla 4).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 4 Velocidades de disociación de clones individuales seleccionados entre la librería redistribuida (clones A) y entre la librería redistribuida de nuevo (clones B) 
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4 
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Dos clones de los experimentos de nueva redistribución (22B y 31B) exhibían velocidades de disociación substancialmente más lenta, lo que indica que el proceso de nueva redistribución daba ligantes con mejores afinidades.
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3. Clonación y redistribución de regiones de ADN definidas
En nuestro sistema, es posible amplificar regiones definidas de una librería de ADNc usando dos cebadores, uno de los cuales está biotinilado. Usando el grupo biotina, se puede aislar ADN de una sola hebra y usarlo en el proceso de montaje génico (Figura 6). Hemos demostrado esto con la amplificación de diversas regiones CDR de una librería génica de anticuerpos y la combinación de estas regiones CDR de forma aleatoria con una región marco dada. Así, se pueden espaciar regiones definidas de ADN (regiones marco) mediante regiones aleatorias de ADN (regiones CDR) que tienen un origen in vivo (Tabla 5). La región CDR3 varía en cuanto a tamaño (Figura 7). Alternativamente, estas regiones podrían ser químicamente sintetizadas.
TABLA 5 Combinación de regiones CDR de diferentes secuencias de la línea germinal trasplantadas al marco DP-47 que codifica el dominio variable pesado. Para CDR1 y CDR2, se indica el origen sugerido de la línea germinal. Para CD3, se da el número de residuos en la región CDR. N.D. = no determinado 
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5 
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4. Construcción de librería
Se construyó una librería génica codificante de fragmentos de anticuerpo scFv. La estrategia usada para esta librería se basa en el montaje de un conjunto de oligonucleótidos en una secuencia codificante de los dominios de anticuerpo VH y VL (Figura 8A, 8B). Se pueden redistribuir y montar las regiones CDR nativas formadas in vivo en un marco maestro dado. En este ejemplo, hemos desarrollado este concepto aún más y hemos montado secuencias génicas codificantes tanto de VH como de VL con regiones CDR nativas en un marco maestro dado. Así, se han redistribuido las seis posiciones CDR. El origen de la plantilla para la amplificación de las CDR era ADNc de células B de sangre periférica, bazo, amígdalas y nódulos linfáticos. También se han amplificado oligonucleótidos codificantes de las regiones marco usando la estrategia con dos cebadores flanqueantes, donde uno está biotinilado (cebadores L1, H1, L4, H4, L6 y H6) . Los cebadores usados están descritos en la Tabla 6 y en la Figura 8A, 8B.
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TABLA 6 Secuencias para los cebadores usados en la construcción de la librería 
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\quad
B = Cebador 5' marcado con biotina
7 
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Los parámetros de la PCR para la amplificación de las regiones CDR y marco eran esencialmente los mismos que los descritos en el ejemplo 2. Los parámetros de la PCR para el montaje de genes codificantes de VH y VL están descritos en la Tabla 7.
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TABLA 7 Parámetros de PCR para el montaje de las secuencias génicas VH y VL para la construcción de la librería
9 
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Se montaron las secuencias génicas VH y VL montadas en una secuencia codificante de scFv según procedimientos estándar (Griffiths y col., 1994). Se construyó una librería de 1,1 x 10^{9} miembros; de los 40 clones estudiados, los 40 contenían un inserto del tamaño correcto, según se determinó por electroforesis en gel de agarosa PCR. Para estudiar la variabilidad de la librería, se sometieron los insertos amplificados por PCR y purificados a escisión con BsTN1 y BamH1. Los clones mostraron diferentes patrones de restricción, según se determinó por electroforesis en gel de agarosa y se comparó con el scFv-B11 control (Figura 9).
Con objeto de determinar la frecuencia de clones capaces de expresar fragmentos de anticuerpo scFv, se plaquearon clones de la librería que contenían la secuencia FLAG (Hopp y col., 1989), así como bacterias control con y sin secuencia FLAG, a baja densidad en placas con caldo Luria que contenían 100 \mug/ml de ampicilina, 25 \mug/ml de tetraciclina y un 1% de glucosa. Se dejó que las placas crecieran a 37ºC durante la noche y se llevaron a filtros de nitrocelulosa por métodos estándar (Sambrook y col., 1989). Para inducir la síntesis de los genes scFv en las bacterias, se incubaron los filtros durante 4 h en placas que contenían isopropiltio-\beta-D-galactósido 0,5 mM, pero sin glucosa. Se lisaron entonces las bacterias por tratamiento con lisozima/cloroformo, se lavaron los filtros y se incubaron con anticuerpo anti-FLAG M2 (Kodak), seguido de un segundo anticuerpo anti-ratón conjugado a peroxidasa (P260 Dakopatts) y se detectaron con DAB (tetraclorhidrato de 3, 3'-diaminobencidina, Sigma) (Tabla 8).
TABLA 8 Frecuencia de genes de anticuerpos intactos en la librería
10
El anticuerpo anti-FLAG detecta una secuencia FLAG situada aguas abajo del gen scFv en los constructos de librería, así como en el vector control pFAB5cHis scFvB11, pero no en el vector original pFAB5cHis. Los clones a los que se une el anticuerpo anti-FLAG contienen, por lo tanto, un marco abierto de lectura intacto del gen scFv.
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Claims (8)

1. Un método de creación de una librería polinucleotídica, consistente en las etapas de obtención de un polinucleótido parental codificante de uno o más motivos proteicos variantes;
a) disponer de una pluralidad de pares de oligonucleótidos, representando cada par localizaciones espaciadas sobre la secuencia polinucleotídica parental que limitan un motivo proteico variante intermedio, y utilizar dichos pares de oligonucleótidos como cebadores de amplificación para PCR para amplificar el motivo intermedio;
b) obtener secuencias nucleotídicas de una sola hebra a partir de las secuencias nucleotídicas amplificadas así aisladas;
c) montar secuencias polinucleotídicas por incorporación de secuencias nucleotídicas derivadas de la etapa b) anterior a secuencias nucleotídicas codificantes de secuencias andamio, y
d) insertar dichas secuencias polinucleotídicas en vectores adecuados.
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2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que además incluye la etapa de expresión de dichas secuencias polinucleotídicas para obtener una librería correspondiente de secuencias polipeptídicas.
3. Un método según la Reivindicación 2, que además incluye el rastreo de la librería en cuanto a un polipéptido de las características deseadas.
4. Un método que consiste, después de la creación de una librería polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionar y expresar dichas secuencias polinucleotídicas para obtener polipéptidos de las características deseadas.
5. Un método según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia polinucleotídica montada codifica para un anticuerpo o parte del mismo.
6. Un método según la Reivindicación 5, donde la secuencia polinucleotídica montada codifica para una parte de anticuerpo y donde la parte es un fragmento Fab, Fd, Fv, dAb, F(ab')_{2} o scFv o una CDR aislada.
7. Un método según la Reivindicación 3 ó 4, donde un polipéptido de las características deseadas es un anticuerpo o parte del mismo.
8. Un método según la Reivindicación 7, donde un polipéptido de las características deseadas es una parte de anticuerpo y donde la parte es un fragmento Fab, Fd, Fv, dAb, F(ab')_{2} o scFv o una CDR aislada.
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