ES2206737T3 - Composicion de manosa-6-fosfato y su uso en el tratamiento de desordenes fibroticos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA MANOSA - 6 - FOSFATO QUE SE FORMULA MEDIANTE EL AJUSTE DEL PH COMO UNA SUSPENSION O SOLUCION CON UN PH DE 6 A 8, PREFERIBLEMENTE DE 6,5 A 7,5 Y A UNA CONCENTRACION DE 65 A 300 MM. DICHAS SUSPENSIONES PUEDEN PREPARARSE EN GELES VISCOSOS DE ACIDO HIALURONICO. DICHAS COMPOSICIONES SON UTILES EN LA CURACION DE LAS HERIDAS, PARTICULARMENTE PARA PREVENIR O ATENUAR LA FORMACION DE CICATRICES.

Description

Composición de manosa-6-fosfato y su uso en el tratamiento de desórdenes fibróticos.

Antecedentes de la invención 1.- Ámbito de la invención

La presente invención se encuentra en el campo de la prevención o mitigación de desórdenes fibróticos, especialmente la formación de la cicatriz en la curación de heridas.

2.- Descripción de la técnica relacionada

Es un problema que, aunque en los humanos y en otros mamíferos las heridas normalmente se curan bastante rápidamente, a menudo se forma un feo tejido de cicatrización. La formación de cicatrices y otros desórdenes fibróticos son problemas clínicos importantes por lo que, frecuentemente, producen efectos adversos sobre la función y el crecimiento, así como en algunos casos, una apariencia estética indeseable.

La curación de heridas en el adulto se caracteriza por inflamación aguda, contracción y depósito de colágeno, respuestas que posiblemente se han optimizado para que se cierre rápido la herida y se minimice la infección. La formación de cicatrices puede ser problemática en casi todos los órganos y tejidos del cuerpo, p. ej., en los ojos, en el sistema nervioso central, en el músculo, en las articulaciones, etc. Procedimientos similares pueden dar también como resultado otros desórdenes fibróticos que son comunes en muchas áreas de la medicina y de la cirugía. Por ejemplo, la cirugía abdominal a menudo conduce a adhesiones y/o estenosis fibrosas intraperitoneales, mientras que las retinopatías fibróticas severas, cicatrización posterior a la cirugía del glaucoma, vitreorretinopatía proliferativa, queloides, enfermedades de la piel como, p.ej., la epidermolisis bullosa, escleroderma, esclerosis sistémica, fibrosis pulmonar, nefritis glomerular, formación de cicatrices en el sistema nervioso central después de, por ejemplo, un infarto o neurocirugía y cirrosis hepática, son problemas médicos importantes. Un objetivo médico fundamental es, por lo tanto, la reducción e, idealmente, la prevención de la formación de cicatrices y de otros desórdenes fibróticos.

El documento WO93/18777 (British Technology Group Ltd.), equivalente al documento GB-A 2.256.310, describe el uso de la manosa-6-fosfato para el tratamiento de los desórdenes fibróticos. Esto acelera la curación de heridas y además previene o mitiga la formación de cicatrices. En esta solicitud de patente se sugiere que la manosa-6-fosfato (M6P) puede formularse de cualquier manera convencional con una diversidad de vehículos que incluyen, por ejemplo, al ácido hialurónico. La concentración sugerida de la M6P es 10-60 mM. Los mejores resultados se obtuvieron a 20 mM, mientras que 10 mM ofreció resultados pobres, peores que el control. Es un problema mejorar los resultados obtenidos en la solicitud de patente WO93/18777.

Resumen de la invención

Actualmente se ha hallado que cuando el pH de las soluciones y de las suspensiones de sal de sodio de M6P está dentro del intervalo 6,5 a 8, se puede obtener una mejora en la curación de heridas con altas concentraciones de M6P, concretamente 65-300 mM.

La presente invención, por lo tanto, proporciona una composición que comprende una solución o una suspensión de sal de sodio de M6P a una concentración de 65-300 mM y un pH ajustado con sosa dentro del intervalo 6,5 a 8. Preferiblemente, la concentración es 65-120mM e, incluso más preferible, 80-120 mM. Independientemente de esto, el pH más preferible está entre 6,5 a 7,5, más preferible aun entre 7 y 7,4.

Para conseguir el pH deseado es necesaria la adición de sosa, por ejemplo, hidróxido sódico. Por lo que, por ejemplo, M6P 100 mM en suero salino fisiológico (pH 7,4) es demasiado ácido y por lo tanto requiere que se eleve el pH. Las soluciones de manosa-6-fosfato monosódica de baja molaridad de M6P, es decir, menores de 60 mM, normalmente tendrán un pH de 6,5 a 7 sin ningún ajuste del pH.

El documento US-A 5.244.651 describe una composición farmacéutico para la desensibilizar la dentina en el que el M6P se asocia con una sal polivalente y no se ajusta el pH. "Methods of Enzimatic Analysis", Vol, II, pág. 292, Ed. H.U. Bergmeyer, Verlag Chemie, Weinheim (1983) se refiere a M6P potásica a una concentración de 44,6 mM para su uso en pruebas enzimáticas. Estos compuestos no están dentro del alcance de la presente invención.

Se excluyen de la invención por negación las composiciones que contienen receptores específicos de manosa-6-fosfato. Los receptores específicos de manosa-6-fosfato se unirían a la manosa-6-fosfato y así la disminuirían su disponibilidad. La negación surge de la referencia Waheed y col., Biochemistry 29, 2449-2455 (1990), que describe el aislamiento de receptores específicos de manosa-6-fosfato en formas diméricas y tetraméricas y experimentos en lo que las preparaciones del receptor se incuban a pH 7,5 con manosa-6-fosfato 5mM. con el fin de investigar si la unión del ligando influye en la oligomerización del receptor.

La invención reside en las composiciones per se así como su uso en la prevención o mitigación de desórdenes fibróticos, especialmente para el uso en la curación de heridas en los humanos y en animales.

La invención incluye el uso de la composición anterior en la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de los desórdenes fibróticos, especialmente, para la curación de heridas. El medicamento puede usarse en un procedimiento para la prevención o el tratamiento de desórdenes fibróticos en los humanos, que comprende la aplicación de una cantidad de la composición de la invención efectiva en la zona donde se espera que haya o hay un desorden fibrótico, especialmente una herida, eficaz para prevenir o tratar dicho desorden y especialmente para inhibir la formación de cicatriz en la herida.

La invención es de especial interés para el tratamiento de heridas oculares y por lo tanto, proporciona un dosificador para la aplicación de una cantidad de gel o ungüento adecuada para el ojo, o de "lágrimas", el dosificador que contiene una composición de la invención.

Breve descripción de las figuras

La única figura es una gráfica de la molaridad de la manosa-6-fosfato monosódica en solución salina de tampón fosfato que, antes de la adición de la M6P, está a pH 7,4, en ordenadas (eje y), frente al pH en abscisas (eje x).

Descripción de las formas de realización preferidas

La M6P puede estar presente en forma de una de sus sales mono- o disódica farmacéuticamente aceptable.

Al compuesto de M6P, tanto en solución como en suspensión, se le ajusta el pH con cualquier base compatible, especialmente, hidróxido sódico, y se formula para obtener una concentración de 65-300 mM. LA concentración óptima parece ser 80-120, especialmente, cercana a 100 mM.

Sin ajustes de pH, muchas de estas formulaciones darían como resultado un pH ácido indeseable. Incluso en solución salina de tampón fosfato(PBS), la M6P monosódica a 65 mM da un pH tan bajo como 6,45. Concentraciones mayores de M6P dan incluso un pH inferior. Por lo que, en el caso particular ilustrado en la figura, usando M6P monosódica disuelta en PBS, pH 7,4, el área B por encima de la curva, hacia el lado derecho de pH 6,5, representa concentraciones de M6P (60 mM y superiores) que darían un pH inferior a 6,5 sin ajustes de pH. El área A por encima de la curva, ahí y hacia el lado izquierdo del pH 6,5, representa concentraciones de M6P (menores que 60 mM) que darían un pH por encima de 6,5 sin ajustes del pH. Por lo que la solución de M6P de 60 mM o mayor en PBS, como en la presente invención donde la concentración es 65-300mM, requerirá el ajuste del pH para aumentar el pH a 6,5 o más. Puesto que M6P está hidrolizada a pH alcalino, se sugiere un pH no superior a 7,5 con un límite superior de 8 aproximadamente.

La formulación de M6P con ácido hialurónico (HA) es beneficiosa para la curación de heridas. Quiere decir que, el HA no es tan solo un vehículo inactivo sino un co-ingrediente que ejerce efectos positivos. Este es un efecto sorprendente, puesto que el HA usado por separado no parece estimular la curación de heridas. Al contrario que el descubrimiento del documento WO 93/18777, elevadas concentraciones de M6P en HA, formuladas como suspensión viscosa, proporcionan un efecto excelente en la curación de heridas.

Cuando se formula M6P con el pH ajustado con ácido hialurónico (HA), se consigue una carga elevada.

El HA puede tener cualquiera de los pesos moleculares medios que oscilan de 0,7 a 3 millones, preferiblemente de 0,75 a 2,25 millones y, lo más preferible de 1 a 1,75 millones. Se formulará para producir una viscosidad adecuada, por cuanto más alto sea el peso molecular de HA, menor será la concentración requerida de éste. El HA de p.m. bajos es, sin embargo, más fácil de manipular. Preferiblemente se usa HA de un peso molecular medio de 1,3 x 10^{6}. La concentración de HA de p.m. medio de 1 x 10^{6} a 1,5 x 10^{6} preferiblemente está en el intervalo de 0,5 a 2% en peso total de la composición. La viscosidad del gel está, preferiblemente, en el intervalo de 20.000 a 50.000 centipoises, especialmente de 20.000 a 30.000.

La M6P puede formularse en la composición de la invención con cualquier polímero que sea (a) no perjudicial para una herida ("biocompatible") (b) no inflamatorio (no causa inflamación en el lugar de la herida) y (c) pueda absorberse en el lugar de la herida ("bioabsorbible"). Debería ser capaz de liberar una concentración de M6P dentro de los intervalos preferidos establecidos arriba durante al menos 3 días y preferiblemente durante al menos 7 días desde la aplicación. Ejemplos de dichos polímeros adecuados son el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico, el poligalactido, poliláctido y carbonato de polimetileno. Por otro lado, la metil celulosa y el ácido poliacrílico causan inflamación y son inadecuados.

Las composiciones de la invención pueden prepararse de cualquier forma posible. Por ejemplo, puede adaptarse para la administración tópica como un gel, una crema, una loción o un ungüento. Estas serán formuladas de manera convencional e incluirán vehículos acuosos u oleaginosos u otros vehículos y pueden incluir además antisépticos y otros agentes convencionales en el tratamiento de heridas. Además pueden formularse como soluciones inyectables estériles que pueden formularse con cualquier disolvente convencional apropiado, p. ej., en suero salino fisiológico (NaCl 0,9% p/v). No obstante, se apreciará que la forma específica de la combinación de M6P y ácido hialurónico (HA) sea un gel viscoso.

\newpage

Un forma de aplicación particularmente conveniente de las composiciones de la invención será mediante un apósito para la herida impregnado o revestido de la composición, como una venda, tirita, compresa absorbente o un apósito polimérico o de hidrogel, p.ej., de colágeno, alginato sódico o cloruro de polivinilo. El apósito, normalmente, se conservará en condiciones de esterilidad preparado para su uso. Para tratamientos internos, se sugiere un implante que comprenda un polímero, como vehículo, y la composición de la invención.

Aunque el interés primario de la invención esté en relación con la curación de heridas, ya surjan debido a la cirugía o de otra manera, que incluye abrasiones severas, laceraciones y quemaduras, es además aplicable a otros tipos de lesiones, p.ej., foto-lesiones en la piel, queloides, cicatrices hipertróficas, daño en los tendones, lesión por aplastamiento, vitreorretinopatía proliferativa y cicatrización después de la cirugía del glaucoma, lesiones en el SNC que producen la cicatrización del tejido, por ejemplo, después de un infarto o de neurocirugía, adhesiones tisulares, por ejemplo, adhesiones peritoneales o aquéllas producidas después de la cirugía grave abdominal o pélvica, cicatrización en enfermedades abrasivas de la piel, p.ej., epidermolisis bullosa, escleroderma, esclerosis sistémica, fibrosis de hígado y pulmón y otros desórdenes, por ejemplo, aquellos mencionados en relación con el documento WO91/04748 (La Jolla).

Un aspecto particularmente importante de la invención yace en el tratamiento de los desórdenes tisulares que conducen a desórdenes fibróticos en relación con los ojos, especialmente aquellos que conducen a la recaída del glaucoma después de la cirugía o a la formación de membrana epi-retinal en la que un desgarro en el tejido ocular conduce a la fibrosis con la contracción y el arrugado de la retina o cicatrización de la cornea tras la lesión. La invención incluye de forma particular soluciones estériles de "lágrimas" de M6P. Éstas pueden aplicarse con un dispositivo tal como un envase de plástico que tiene una boquilla que expulsa "lágrimas" cuando se presiona o con un envase ajustado con una tapón que tiene un cuentagotas adherido al tapón que se extiende por dentro del recipiente. Los geles y ungüentos pueden dispensarse en tubos que tienen las boquillas de pequeño diámetro convencionales en las formulaciones oculares.

Otro aspecto importante de la invención recae en el tratamiento de heridas cutáneas y desórdenes fibróticos que ocurren en relación con las heridas cutáneas, p.ej., queloides y cicatrices hipertróficas. La formulación de la presente invención promueve la curación de heridas y reduce la formación de cicatrices. La curación de tendones y ligamentos también se mejora con la invención.

La forma de aplicación de la composición de la invención será, normalmente, tópica, p.ej., a una herida (por dentro y alrededor de ella), pero en los casos apropiados será subcutánea, intradérmica o intratisular p.ej., puede requerirse inyección tendonal, o implantación con el fin de alcanzar mejor el tejido afectado. En casos extremos, puede ser aconsejable la inyección intravenosa o intraocular. Preferiblemente, el M6P se aplica al área afectada durante al menos los tres primeros días de tratamiento, preferiblemente, dos veces al día.

La invención se ilustra con los siguientes ejemplos. "Bioclusive" es una marca comercial registrada. M6P se usó todo el tiempo como sal monosódica.

Ejemplos Efecto de la Manosa-6-fosfato sobre la curación de heridas en ratas Procedimiento

Se practicaron cuatro incisiones lineales de espesor total de 1 cm de longitud hacia el fondo del panículo carnoso sobre la piel dorsal de ratas macho Sprague-Dawley, de 250 g de peso. Las incisiones que se practicaron fueron de 1 cm hacia cada lado de la línea media, 3 y 8 cm desde la base del cráneo. La línea media es una línea que sigue la columna vertebral desde la cabeza a la cola, longitudinal respecto al animal. Las heridas fueron entonces longitudinales, paralelas a la columna vertebral. Las heridas se dejaron a propósito sin suturar para curarlas. Cada animal siempre tuvo su propia herida control. Un "grupo de tratamiento" se refiere al tratamiento que cada animal recibió dentro del grupo. Se rotó la posición sobre el animal de cada herida tratada específicamente entre réplicas para permitir cualquier efecto de posición. Se asignaron al azar cuatro animales por tiempo para cada uno de los grupos de tratamiento, recibiendo inyecciones de 100 \mul (50 \mul a cada lado de la herida) antes de realizarse las heridas (día 0), y los días 0-7 tras haberse realizado las heridas. A las heridas control se les inyectó PBS solo. Las heridas se recogieron el día 80 después de haberse practicado la herida. Las heridas se recogieron mediante excisión del tejido circundante. Se diseccionó cada herida, y la mitad se congeló rápidamente en un medio preservante comercialmente disponible "OCT" para realizar criocortes e inmunotinción y la otra mitad se fijó en formaldehído para incluirla en parafina e histología. Las secciones de parafina se tiñeron de la forma habitual con hematoxilina y eosina, rojo picrosirio y tricrómico de Masson Lille para revelar el espesor de las fibras de colágeno, la densidad y la orientación para permitir la valoración de la calidad de la cicatriz.

Se tomaron las secciones histológicas (4-10 por herida) y fueron valoradas por investigadores entrenados y validados según una escala visual análoga. Esta escala es una línea de 10 cm en la que un extremo (0) representa la piel normal y el otro extremo (10) la peor cicatriz posible. Se asignó a cada herida una única valoración, siendo ésta la media de las valoraciones dadas por dos investigadores entrenados, y se determinó la media de estas valoraciones para un número (n) de heridas.

El efecto del pH sobre la actividad anti-cicatrizante de la M6P

Se midió el pH de la M6P en solución en PBS y se halló que se había formado una solución ácida. El pH era dependiente de la concentración, con la concentración más alta, las soluciones eran las más acídicas. A concentraciones de 100 y 300 mM de M6P el pH de las soluciones fue 6,2 y 5,5, respectivamente. Los experimentos se emprendieron para determinar si los efectos inhibitorios tempranos observados de la M6P sobre la curación de heridas se debían al bajo pH más que a la osmolaridad de la solución.

La influencia del pH sobre el efecto anti-cicatrizante de la M6P se investigó mediante la administración a las ratas de un intervalo de concentraciones de M6P a pH fisiológico. La M6P se disolvió en la mitad del volumen apropiado de agua estéril bidestilada y el pH se ajustó a 7,4 mediante la adición de una cantidad muy pequeña, cercana a 10 \mul, de NaOH 10M. El ajuste fino se hizo usando NaOH 1M y comprobando el pH con un pHmetro. Entonces se llevó la solución al volumen requerido con PBS estéril 2X. El pH se comprobó de nuevo para asegurar que permanecía en 7,4. Posteriormente, la solución se esterilizó por filtración antes de su uso. La M6P se administró a las heridas mediante inyección intradérmica, como se describió anteriormente. Se aplicaron todas las concentraciones de M6P diariamente, antes de practicarse las heridas (día 0) y durante 7 días después a que se hicieran las heridas. Se asignaron aleatoriamente cuatro animales por cada tiempo a 2 grupos de tratamiento y las cuatro heridas se trataron con inyecciones de PBS solo, con M6P 10 mM, 20 mM y 300 mM o con PBS solo, M6P 50mM, 100 mM y 200 mM. Las heridas se recogieron los días 1, 3, 7 y 80 después de practicarse éstas.

Las concentraciones altas de M6P no tuvieron efectos deletéreos en la curación de las heridas y, en general, las concentraciones más altas de M6P producían una mayor reducción en la cicatrización. La actividad anti-cicatrizante de la M6P fue evidente cuando se aplicó una concentración de 20 mM de M6P, pero el incremento de la concentración a 100 mM mejoró más aún la calidad de la cicatriz. A concentraciones superiores a 100 mM, no se observaron reducciones mayores consistentes en la cicatrización, pero no se observaron efectos deletéreos en el procedimiento de curación. Esto muestra que los efectos reducidos descritos previamente con concentraciones elevadas de M6P no se deben a la osmolaridad, sino al uso de un pH que no sea óptimo y que tras el ajuste del pH, de acuerdo con la presente invención, la dosis óptima es ahora 100 mM.

En las heridas tratadas con M6P a pH 7,4 se observó la reducción de la angiogénesis, del contenido de fibronectina en la herida y del infiltrado de monocitos y macrófagos 7 días después de practicarse las heridas. Todos estos efectos fueron dependientes de la dosis, por ejemplo, incrementó con el aumento de la dosis y compatible con una reducción de la actividad del TGF-\beta en el lugar de la herida. A los tres días después de practicarse las heridas, el contenido de fibronectina en las heridas tratadas con M6P fue el más elevado, las heridas tratadas solo con PBS contenían poca fibronectina a este tiempo. Este efecto es consistente con una tasa más rápida de curación en las heridas tratadas con M6P.

Se llevaron a cabo más experimentos de la misma forma con una molaridad constante (100 mM) pero a pH variable (5,5, 7,4, 9,5).

Se ha demostrado que la M6P es una agente anti-cicatrizante efectivo y que el pH de la solución es crítico para la actividad de la molécula in vivo. El tratamiento más efectivo parece ser uno que libera una dosis considerable de M6P, cercana a 100 mM, durante un periodo de tiempo prolongado (0-7 días) tras practicarse las heridas.

Los principales resultados de estos ejemplos se muestran debajo, en las tablas.

Valoraciones medias usando una escala visual análoga

Dos observadores entrenados valoraron las secciones histológicas tomadas a los 80 días tras practicarse las heridas para la calidad de la cicatriz usando una escala visual análoga sin puntos de referencia en la que 0= piel normal, 10= la peor cicatriz.

Inyecciones de M6P, pH 7,4

	Valoración media \pm EMS	N^{o} de heridas valoradas
Control	7,1 \pm 0,6	8
10 mM	5,4 \pm 1,1	4
20 mM	4,2 \pm 1,3	4
50 mM	2,9 \pm 1,1	4
100 mM	3,5 \pm 1,1	4
200 mM	6,2 \pm 0,9	4
300 mM	5,0 \pm 1,8	4

Inyecciones de M6P, 100 mM

		Valoración media \pm EMS	N^{o} de heridas valoradas
Control	pH 5,5	6,4 \pm 0,7	4
M6P	pH 5,5	2,5 \pm 0,6	4
Control	pH 7,4	6,6 \pm 0,7	4
M6P	pH 7,4	2,9 \pm 0,6	4
Control	pH 9,5	5,5 \pm 0,6	4
M6P	pH 9,5	5,3 \pm 1,0	4

Nota: Estas figuras sugieren que un pH tan bajo como 5,5 proporciona resultados tan buenos como el pH 7,4, pero, cualitativamente, los resultados fueron reconocidamente mejores a pH 7,4.

Claims (13)

1. Una composición que comprende una solución o una suspensión de sal de sodio de manosa-6-fosfato a una concentración de 65 a 300 mM y pH ajustado con sosa a pH 6,5 a 8, que excluye una composición que contiene receptores específicos de manosa-6-fosfato.

2. Una composición según la reivindicación 1 en el que el pH es de 6,5 a 7,5.

3. Una composición según la reivindicación 2 en el que el pH es de 7 a 7,5.

4. Una composición según la reivindicación 1, 2 ó 3 en el que la concentración es de 80 a 120 mM.

5. Una composición según la reivindicación 1, 2, ó 4 que además comprende ácido hialurónico a una concentración efectiva para proporcionar un gel viscoso adecuado para la retención en o alrededor de la herida.

6. Una composición según la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5 estéril.

7. Una composición según la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5 para uso en la curación de heridas.

8. Una composición según la reivindicación 6 para uso en la curación de heridas en los ojos.

9. Un apósito de heridas recubierto o impregnado con una composición reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 formulado para su administración en los ojos, como un gel, ungüento o "lágrimas".

11. Un dispositivo para la aplicación de una cantidad de gel o de ungüento adecuado para el ojo o de lágrimas, conteniendo el dispositivo una composición reivindicado en la reivindicación 10.

12. El uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la fabricación de un medicamento para su aplicación en las heridas.

13. El uso de una composición según la reivindicación 10 en la fabricación de un medicamento para su aplicación en el ojo para curar una herida en éste.