ES2205467T3 - Matrices biodegradables de poros abiertos. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento directo para reparar materiales poliméricos porosos mediante una combinación de pasos de formación de espuma con gas y el lixiviado de partículas. La invención también se refiere a la preparación de materiales porosos mediante el procedimiento, particularmente estos materiales tienen una característica relacionada con la estructura porosa, y los procedimientos para empleo de estos materiales porosos, particularmente para ingeniería textil.
Description
Matrices biodegradables de poros abiertos.
La invención está dirigida a un proceso para
preparar materiales polímeros porosos por una combinación de pasos
de transformación en espuma con gas y lixiviación de material
particulado. La invención está dirigida también a un material
polímero poroso preparado por el proceso, que tiene particularmente
una estructura característica de poros interconectados, y a métodos
para utilizar dicho material polímero poroso, en particular para
construcción de tejidos.
La falta de tejido autólogo y alogénico adecuado
para trasplante ha impulsado el desarrollo del campo de la
construcción de tejidos, en el cual se crean nuevos tejidos a partir
de células cultivadas y materiales biológicos. Esto es ventajoso
debido a que estas células pueden expandirse in vitro y
cultivarse para uso por múltiples pacientes. El material biológico
sirve como vehículo para localizar las células de interés, como
separador físico para crear espacio potencial para desarrollo de
tejidos, y como molde-guía de la regeneración de
tejidos. Los homopolímeros y copolímeros biodegradables de ácido
láctico y ácido glicólico son candidatos atractivos para fabricar
matrices de construcción de tejidos debido a sus propiedades físicas
flexibles y bien definidas y su biocompatibilidad relativa.
Adicionalmente, el producto de degradación de estos polímeros son
metabolitos naturales y se eliminan fácilmente del cuerpo.
El documento DE 1.694.599 A expone un proceso
para preparar un material polímero poroso para películas plásticas,
especialmente películas flexibles permeables al vapor de agua a
partir de poli(cloruro de vinilo).
Se han utilizado varias técnicas para fabricar
polímeros en forma de matrices porosas para aplicaciones de
construcción de tejidos, con inclusión de colada en
disolvente/lixiviación de material particulado (SC/PL) (A.G. Mikos,
A.J. Thorsen, L.A. Czerwonka, Y. Bao, y R. Langer, "Preparation
and characterization of poly(L-lactic acid)
foams", Polymer, 35, 1068-1077 (1994));
separación de fases (H. Lo, M.S. Ponticiello, y K.W. Leong,
"Fabrication of controlled release biodegradable foams by phase
separation", Tissue Engineering, 1, 15-28
(1995)); extrusión de fibras y procesamiento de formación de tela
(J.F. Cavallaso, P.D. Kemp y K.H. Kraus, "Collagen Fabrics as
Biomaterials", Biotechnology and Bioengineering, 43, p.
781-791 (1994)); y transformación en espuma con gas
(D.J. Mooney, D.F. Baldwin, N.P. Suh, J.P. Vacanti, R. Langer,
"Novel approach to fabricate porous sponges of
poly(D,L-lactic-co-glycolic
acid) without the use of organic solvents", Biomaterials, 17,
1417-1422 (1996)). Los métodos de colada con
disolvente/lixiviación de material particulado y de separación de
fases requieren el uso de disolventes orgánicos. Los residuos de
disolventes orgánicos que pueden quedar en estos polímeros después
del procesamiento pueden dañar las células trasplantadas y el tejido
próximo, y desactivar muchos factores biológicamente activos (v.g.,
los factores de crecimiento) cuya incorporación en la matriz de
polímero para liberación controlada podría ser deseable. La
formación de fibras requiere típicamente temperaturas elevadas
(superiores a la temperatura de transición del polímero), y no es
aplicable al procesamiento de polímeros amorfos. Las altas
temperaturas utilizadas en este proceso desnaturalizarían
probablemente cualesquiera moléculas biológicamente activas cuya
incorporación en la matriz podría ser deseable.
El método de transformación en espuma con gas
(por ejemplo, de Mooney et al., citado anteriormente) proporciona
una técnica para fabricar matrices altamente porosas a partir de
poli(ácido láctico-co-glicólico)
(PLGA) utilizando un gas a alta presión que evita el uso de
disolventes orgánicos y temperaturas altas. Sin embargo, la técnica
produce típicamente una estructura de poros cerrados, que es
desventajosa en muchas aplicaciones de trasplante de células.
Adicionalmente, se produce como resultado una piel sólida de
polímero en la superficie exterior de la matriz transformada en
espuma y esto puede conducir a limitaciones de transporte de
masa.
La presente invención se refiere a un proceso
para preparar un material polímero poroso que comprende formar poros
en un material polímero que contiene un material particulado
susceptible de lixiviación por transformación en espuma con gas y
lixiviar subsiguientemente el material particulado para formar
porosidad adicional, en el cual la formación de los poros por
transformación en espuma con gas se realiza sometiendo una mezcla de
partículas del polímero y partículas del material particulado a una
atmósfera de un gas inerte a presión elevada tal que el gas se
disuelve en el polímero y creando luego una inestabilidad
termodinámica tal que se produce formación de núcleos y crecimiento
de poros de gas y el polímero que contiene el material particulado
forma una matriz continua.
Un objeto de esta invención es proporcionar un
nuevo proceso para preparar materiales polímeros porosos que son
útiles para construcción de tejidos y otras aplicaciones en las
cuales la estructura de poros es particularmente ventajosa. Por
ejemplo, los polímeros de la invención pueden tener dos tipos de
porosidad, el primero formado por procesamiento de transformación en
espuma con gas y el segundo formado por la acción de lixiviación del
material particulado. La combinación de estos dos tipos de porosidad
puede regularse por las condiciones de procesamiento y los
materiales utilizados para proporcionar materiales polímeros porosos
con una gama de propiedades ventajosas. En una realización
preferida, la porosidad procedente de la lixiviación del material
particulado da como resultado materiales de estructura de poros
interconectados que tienen una estructura de poros abiertos. Otros
objetos de la invención incluyen los materiales polímeros porosos
preparados por el proceso y métodos de utilización de dichos
materiales para construcción de tejidos, por ejemplo.
Después del estudio ulterior de la memoria
descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, resultarán evidentes
objetos y ventajas adicionales de esta invención para los expertos
en la técnica.
\newpage
De acuerdo con el proceso de la invención, una
mezcla de partículas de polímero y un material particulado
susceptible de lixiviación moldeado opcionalmente con compresión a
un tamaño y forma deseados, se somete a una atmósfera gaseosa a alta
presión de tal manera que el gas se disuelve en el polímero; a
continuación se crea una inestabilidad termodinámica, por ejemplo
por reducción de la presión, de tal modo que el gas disuelto sufre
nucleación y forma poros de gas en el interior del polímero; esto
causa la expansión de las partículas de polímero, y a medida que las
mismas se expanden, se fusionan, creando una matriz de polímero
continua que contiene el material particulado; por último, el
material particulado se lixivia del polímero con un agente
lixiviante creando una porosidad adicional. El proceso proporciona
así una nueva combinación de los procesos de transformación en
espuma con gas (GF) para formar poros y lixiviación de un material
particulado (PL) para formar otro tipo de porosidad. Por
consiguiente, el proceso puede denominarse un proceso GF/PL en
oposición a los procesos conocidos de colada con
disolvente/lixiviación de material particulado (SC/PL).
Los nuevos materiales preparados por el proceso
se caracterizan por tener poros formados por transformación en
espuma con gas y poros formados por lixiviación de un material
particulado, denominándose también los poros formados por
lixiviación del material particulado macroporos. Preferiblemente, la
porosidad resultante de la lixiviación del material particulado, que
puede controlarse por la cantidad y el tamaño del material
particulado entre otros factores, es tal que da como resultado
interconexiones y, por tanto, una estructura de poros abiertos.
Típicamente, las matrices preparadas por el método GF/PL de la
invención tendrán una estructura de poros interconectados o abiertos
semejante a la estructura demostrada en las fotomicrografías
generadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y expuestas en el mismo. En
una realización que proporciona una mezcla de polímero y material
particulado lixiviable en la cual la cantidad de material
particulado lixiviable es al menos 50% en volumen se producirá como
resultado una estructura de poros parcialmente interconectados o
abiertos. Una cantidad mayor de material particulado lixiviable
puede utilizarse para obtener una estructura totalmente
interconectada.
Si bien los materiales preparados por un proceso
SC/PL pueden proporcionar también cierto grado de una matriz de
poros interconectados, los autores de la invención han descubierto
que los materiales preparados por el proceso GF/PL de la invención
exhiben una estructura de poros distinta y propiedades mecánicas
notablemente ventajosas sobre los materiales preparados por SC/PL.
Esta ventaja se suma a la ventaja de la ausencia de necesidad de
disolventes orgánicos y/o temperaturas altas en la preparación del
material y la ausencia de residuos de disolvente orgánico en los
materiales preparados, ventajas que hacen los materiales aún más
útiles para las aplicaciones descritas más adelante. Por ejemplo,
los materiales de la invención exhiben propiedades de resistencia
mucho mayor, v.g. resistencia a la tracción. Por ejemplo, los
materiales de acuerdo con la invención se pueden preparar para
maximizar la resistencia a la tracción a fin de proporcionar
materiales con un módulo de tracción de, por ejemplo, 850 kPa,
particularmente 1110 kPa, o mayor. Sin embargo, dichos materiales de
alta resistencia pueden no ser necesarios para todas las
aplicaciones, y materiales con un módulo de tracción tan bajo como
100 kPa, por ejemplo, se han encontrado útiles. Adicionalmente, los
materiales exhiben una resistencia mejorada a la compresión. Por
ejemplo, los materiales de acuerdo con la invención se pueden
preparar para maximizar la resistencia a la compresión a fin de
proporcionar materiales con un módulo de compresión de, por ejemplo,
250 kPa, particularmente 289 kPa, o mayor. Los materiales
comparativos preparados por SC/PL exhiben un módulo de tracción de
334 \pm 52 kPa y un módulo de compresión de 159 \pm 130 kPa.
Si bien no se desea quedar ligados por esta
teoría, se supone razonablemente que las propiedades mecánicas
mejoradas y la matriz más resistente de los materiales preparados
por el proceso GF/PL de los inventores son resultado, al menos en
parte, de una mayor uniformidad de la distribución del polímero en
los materiales y/o mayor uniformidad en el tamaño y la distribución
de la porosidad en los materiales. Los polímeros SC/PL preparados no
tendrán una distribución de poros tan uniforme debido a que el
disolvente se evapora del polímero de una manera no uniforme y por
consiguiente la concentración de polímero cambia en el material de
modo no uniforme. Por ejemplo, los materiales SC/PL carecen
típicamente de uniformidad dado que, a medida que el disolvente se
evapora, la concentración de polímero aumenta en el fondo de la
matriz, es decir, el área en la cual la matriz toca el cubreobjetos
de vidrio. En contraste, los materiales GF/PL exhiben una estructura
de poros muy uniforme que indica que el polímero se transforma en
espuma uniformemente en todo el lecho del material particulado
durante el paso de transformación en espuma con gas.
Alternativamente, se supone que en el proceso
GF/PL las propiedades mecánicas pueden mejorarse por alineación
mediante tracción de las cadenas del polímero que puede ocurrir
durante la elongación que tiene lugar durante la transformación en
espuma. (Principles of Tissue Engineering, Academic Press, p. 264
(1997).
En cualquier caso, es una gran ventaja en la
construcción de tejidos y otras aplicaciones que los materiales de
la invención pueden prepararse para maximización de la resistencia a
la tracción y resistencia a la compresión dado que los mismos puede
manejarse y manipularse sin ruptura mecánica más fácilmente y
sobreviven mejor en el entorno en el cual se utilizan sin rotura
mecánica. Adicionalmente, los materiales de la invención con ambos
tipos de porosidad, preferiblemente con porosidad interconectada,
proporcionan un material singular y ventajoso para muchas
aplicaciones. El proceso puede proporcionar materiales con una
porosidad total desde, por ejemplo, mayor que 0 a 97% o superior.
Preferiblemente, la porosidad total está comprendida entre 90 y
97%.
Para el proceso, se utiliza una mezcla de
polímero y material particulado. La mezcla es preferiblemente lo más
uniforme posible y puede proporcionarse por medios convencionales.
Preferiblemente, la mezcla se moldea, por ejemplo, por moldeo
mediante compresión a la temperatura ambiente u otra temperatura
adecuada para efectuar el moldeo, hasta el tamaño y forma que es
sustancialmente el mismo que se desea para su uso final.
El polímero y los materiales particulados
deberían seleccionarse de tal manera que el material particulado
pueda lixiviarse con un agente lixiviante que no disuelva el
polímero o produzca cualquier otro tipo de impacto desfavorable
sobre el material. Los polímeros y materiales particulados útiles
para los procesos SC/PL expuestos en esta memoria son generalmente
útiles para el proceso GF/PL de la invención. Materiales útiles
adicionales se exponen más adelante.
Cualquier polímero en el cual pueda disolverse un
gas y formar poros de este modo y en el cual pueda incorporarse un
material particulado y lixiviarse del mismo puede utilizarse en el
proceso. Se prefiere, a fin de facilitar la disolución del gas, que
el polímero sea un polímero amorfo o predominantemente amorfo. No
obstante, si se desea utilizar un polímero cristalino, la
cristalinidad puede reducirse hasta un nivel tal que el gas pueda
disolverse en el mismo y posteriormente restablecerse la
cristalinidad después de la formación de los poros. Dependiendo de
la aplicación de los materiales, el polímero puede seleccionarse de
modo que sea biodegradable o no biodegradable. Para muchas
aplicaciones, tales como la construcción de tejidos, el polímero es
preferiblemente biocompatible con el entorno en el cual se
utiliza.
Así pues, una realización preferida de la
presente invención se refiere a un proceso para preparar un material
polímero poroso que comprende formar poros en un material polímero
que contiene un material particulado lixiviable por transformación
en espuma con gas y lixiviar subsiguientemente el material
particulado a fin de formar porosidad adicional, en el cual el
polímero es un polímero biocompatible.
Una clase preferida útil de polímeros son
homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, por
ejemplo, ácido poli-L-láctico
(PLLA), ácido poli-D,L-láctico
(PDLLA), poli(ácido glicólico) (PGA) y copolímeros de
D,L-lactida y glicolida (PLGA), particularmente con
50% o más de la lactida en el copolímero. Aunque en muchas
condiciones se prefieren los copolímeros a los homopolímeros, en
algunas circunstancias pueden ser preferidos los homopolímeros.
Otros polímeros útiles, por ejemplo, son poliésteres alifáticos,
tales como polihidroxibutirato y
poli-\varepsilon-caprolactona.
Adicionalmente, pueden utilizarse polianhídridos, polifosfazinas, y
polipéptidos.
Adicionalmente, se pueden utilizar mezclas de
diferentes polímeros o polímeros que contienen otros agentes, que
afecten particularmente a las propiedades mecánicas de la matriz
resultante. Por ejemplo, pueden utilizarse mezclas de diferentes
polímeros PLGA que tienen propiedades distintas para aprovechar la
ventaja de las propiedades de ambos. Asimismo, otros polímeros
pueden mezclarse con los polímeros PLGA, en particular para
modificar las propiedades mecánicas de los mismos. Por ejemplo, se
ha encontrado que una mezcla de un polímero PLGA y un material de
alginato proporciona una matriz más resistente con mayor elasticidad
y capacidad para resistir una mayor deformación antes de romperse.
Así, la misma puede ser útil, dependiendo de la aplicación, para
mezclar polímeros que dan como resultado una matriz con mejores
flexibilidad y/o resistencia. Mezclas con materiales que actúan como
plastificantes, agentes reforzantes o modificadores de otras
propiedades son, por consiguiente, útiles en la invención. Estos
materiales pueden ser polímeros o agentes de moléculas más pequeñas
que pueden actuar de una manera temporal y difundirse luego de la
matriz.
La composición y el peso molecular del polímero
tienen también un gran efecto sobre la porosidad y las propiedades
mecánicas de las matrices tridimensionales. Se ha demostrado que los
copolímeros de PLGA se transforman en espuma en mucho mayor
proporción que cualquier homopolímero de PGA o PLLA. Este
descubrimiento es coherente con informes previos según los cuales
los copolímeros amorfos de PLGA forman más espuma que lo hace el
polímero PGA cristalino (Mooney et al., Biomaterials, 17,
1417-1422, 1996). Esto es debido probablemente a una
disolución incrementada del gas en los polímeros amorfos en
comparación con los polímeros cristalinos (D.F. Baldwin et al.,
J. Eng. Mat. Tech., 117, 62, 1995; y D.W. Van Krevelen,
Properties of polymers, Elsevier Publ., 1976). El peso
molecular del polímero tiene un gran efecto sobre la porosidad del
entramado. Un polímero con un peso molecular alto (gran i.v.) no
formaba entramados con una porosidad tal alta como el mismo polímero
con un peso molecular inferior. Las cadenas de polímero más largas
del polímero de peso molecular alto se enmarañan probablemente en
mayor proporción, proporcionando así una mayor resistencia a la
expansión que las cadenas de polímero más cortas.
En una realización preferida, puede conseguirse
una formación máxima de poros por el uso de un copolímero amorfo de
lactida y glicolida de peso molecular bajo. Estas matrices tendrán
probablemente gran utilidad en la regeneración de tejidos orales.
Las mismas pueden utilizarse solas como una matriz GTR. Pueden
utilizarse también para suministrar factores de crecimiento de una
manera local y sostenida a fin de promover la regeneración.
Adicionalmente, aquéllas podrían utilizarse para trasplantar células
directamente a un sitio a fin de promover la regeneración de tejido
a partir de estas células y la interacción con las células
huésped.
El material particulado lixiviable es cualquier
material particulado que pueda lixiviarse de la matriz de polímero
con un agente lixiviante. Se prefieren sales solubles en un medio
acuoso, preferiblemente agua. Como sales, son materiales
particulados útiles NaCl, citrato de Na, tartrato de Na, y KCl.
Otros materiales particulados útiles lixiviables por disolución
incluyen, por ejemplo, materiales particulados de gelatina, colágeno
y alginato. Es también posible utilizar materiales particulados que
son lixiviables por disolventes orgánicos en los cuales el
disolvente no afecta desfavorablemente al polímero; sin embargo,
esto no se prefiere, dado que podría reducir la ventaja de la
ausencia de necesidad de un disolvente orgánico y la inexistencia de
residuo en el producto. Como se ha expuesto anteriormente, el tamaño
del material particulado afectará al tamaño de los poros formados
después de la lixiviación del material particulado. Aunque sin
carácter limitante de la invención, se prefiere que el material
particulado tenga un tamaño medio comprendido entre 10 y 500
micrómetros. Este tamaño corresponderá aproximadamente al tamaño de
los poros formados por la lixiviación del mismo.
Se disuelve un gas en el polímero de la mezcla,
preferiblemente moldeada, de polímero y material particulado
sometiendo la mezcla a una atmósfera a presión de un gas que es
inerte frente al sistema y que se disolverá en el polímero en
condiciones adecuadas. Gases y condiciones adecuados son conocidos
por otros procesos de transformación en espuma con gas, tal como se
expone en el artículo Biomaterials citado arriba, y pueden
utilizarse generalmente en esta invención.
Un ejemplo preferido de un gas adecuado es
CO_{2}. Una realización preferida de la presente invención es por
consiguiente un proceso para preparar un material polímero poroso
que comprende formar poros en un material polímero que contiene un
material particulado lixiviable por transformación en espuma con gas
y lixiviación subsiguiente del material particulado para formar
porosidad adicional, en el cual el gas utilizado es CO_{2}.
Ejemplos preferidos adicionales de gases
adecuados incluyen CO_{2}, aire, nitrógeno, helio, neón, kriptón,
argón, xenón u oxígeno. También pueden utilizarse líquidos volátiles
que proporcionan un gas a la temperatura de transformación en espuma
con gas, v.g. agua. Sin embargo, pueden utilizarse también otros
gases o líquidos volátiles que forman gases conocidos por ser útiles
como agentes de soplado. Éstos incluyen, por ejemplo, hidrocarburos
fluorados, con inclusión de hidrocarburos perfluorados. Preferidos
para éstos son hidrocarburos fluorados alifáticos o cicloalifáticos
de hasta 8 átomos de carbono tales como trifluorometano,
difluorometano, difluoroetano, tetrafluoroetano, heptafluoroetano,
perfluoropropano, perfluorobutano, perfluorociclobutano,
perfluoropentano, perfluorohexano, perfluoroheptano,
perfluorooctano, perfluorociclopentano, perfluorociclohexano,
hexafluoropropano y heptafluoropropano. El hexafluoruro de azufre
puede ser también un agente de soplado útil. Otros agentes de
soplado conocidos incluyen alcanos tal como propano, butanos y
pentanos; cicloalcanos y cicloalquenos tales como ciclobutano,
ciclopenteno y ciclohexeno; dialquil-éteres tales como dimetil-éter,
metil-etil-éter y dietil-éter; éteres de
cicloalquileno tales como furano; cetonas tales como acetona y
metil-etil-cetona; y carboxilatos
tales como ácido fórmico, ácido acético y ácido propiónico.
La presión se selecciona para facilitar la
disolución del gas en el polímero y dependerá, por tanto, del gas
utilizado, el polímero utilizado y la temperatura. Presiones de
42-63 bares (600-900 psi) son útiles
generalmente para CO_{2} y polímeros PLGA, aunque no son
limitantes de la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse incluso
gases en condiciones super o sub-críticas.
Adicionalmente, puede utilizarse un líquido volátil que pueda
disolverse en el polímero y forme un gas después de imposición de la
inestabilidad termodinámica. Como ejemplo, puede disolverse CO_{2}
en una mezcla de polímero poli[ácido
D,L-láctico-co-glicólico]
y material particulado de NaCl a una presión de 56 bares (80 psi)
aplicada durante aproximadamente 48 horas para permitir la
saturación.
El gas específico utilizado en la transformación
en espuma puede ser una variable crítica en la producción e matrices
porosas. La elección del gas utilizado en la transformación en
espuma tiene un gran efecto sobre la estructura del entramado final.
CO_{2} producía matrices altamente porosas, en tanto que N_{2} y
He conducían a una formación de poros inapreciable. Estos resultados
son coherentes con varios estudios previos en los cuales se ha
utilizado CO_{2} para crear estructuras porosas de polímeros
(Mooney et al., Biomaterials, 17, 1417-1422,
1996). Si bien el mecanismo exacto que subyace en este resultado no
se conoce, el mayor grado de transformación en espuma experimentado
con CO_{2} en comparación tanto con N_{2} como con He puede ser
el resultado de una interacción específica entre CO_{2} y los
grupos carbonilo de PLGA (Kazarian et al., J. Am. Chem. Soc., 18,
1729-1736, 1996).
El tiempo de equilibración con un gas y la tasa
de liberación de la presión afectaban a la porosidad y estabilidad
de las matrices, aunque no tan acusadamente como las otras
variables.
Con objeto de iniciar la formación de núcleos del
gas disuelto y el crecimiento de los poros de gas en el material, se
crea una inestabilidad termodinámica. Este fenómeno ha sido descrito
por ejemplo por Park, Baldwin y Suh, "Effect of the Pressure Drop
Rate on Cell Nucleation in Continuous Processing of Microcellular
Polymers", Polymer Engineering and Science, 35, pp.
432-440 (1995). Preferiblemente, esto se hace por
reducción de la presión de la atmósfera gaseosa, por ejemplo, hasta
la presión atmosférica en un periodo de tiempo breve. El periodo de
tiempo puede ser, por ejemplo, desde unos cuantos segundos a
aproximadamente 15 minutos. La fase gaseosa se separa del polímero
por formación de núcleos de los poros, y el crecimiento de los poros
tiene lugar por difusión de gas hacia las áreas adyacentes a los
sitios de formación de núcleos. El crecimiento de los poros reduce a
su vez la densidad del polímero. Pueden utilizarse otros métodos
para crear la inestabilidad, tales como aumento de la temperatura,
pero no se prefieren debido a la facilidad de procesamiento. La
estructura y el tamaño de los poros de gas formados dependerán,
entre otras cosas, del tipo de gas utilizado y la cantidad de gas,
que dependerá a su vez de la temperatura y presión inicial y final
de la atmósfera de gas aplicada, la solubilidad del gas en el
polímero particular, la tasa y tipo de formación de núcleos de los
poros y la tasa de difusión del gas a través del polímero hasta los
núcleos. Estos y otros factores pueden ajustarse para proporcionar
poros gas de un tamaño adecuado. Debería disolverse una cantidad
suficiente de gas para causar la formación de una matriz de polímero
continua cuando el polímero se expande durante el crecimiento de los
poros de gas.
Como resultado de la inestabilidad termodinámica,
la formación de núcleos de poros y la formación y expansión de los
poros de gas, el polímero que contiene el material particulado forma
una fase continua, es decir una matriz, alrededor de los poros de
gas.
El material particulado se lixivia del polímero
con un agente lixiviante. Como agente lixiviante es útil cualquier
agente que de lugar a la lixiviación, v.g., disuelva y elimine, el
material particulado del polímero. Como se ha expuesto
anteriormente, se prefiere un agente lixiviante de base acuosa,
particularmente agua. La lixiviación del material
particulado del polímero forma el tipo de porosidad, distinta de la formada por la transformación en espuma con gas, que como se ha expuesto anteriormente puede proporcionar una estructura de poros interconectados.
particulado del polímero forma el tipo de porosidad, distinta de la formada por la transformación en espuma con gas, que como se ha expuesto anteriormente puede proporcionar una estructura de poros interconectados.
La realización siguiente se proporciona como un
ejemplo representativo y no limitante de la invención.
Discos constituidos por polímero (v.g., ácido
poli[D,L-láctico-co-glicólico])
y partículas de NaCl se moldearon por compresión a la temperatura
ambiente, y se dejó subsiguientemente que se equilibraran con
CO_{2} gaseoso a alta presión (56 bares, 800 psi). La creación de
una inestabilidad termodinámica condujo a la formación de núcleos y
el crecimiento de los poros de gas en las partículas de polímero, y
la formación de una matriz continua de polímero. Las partículas de
NaCl se lixiviaron subsiguientemente para producir macroporos, y una
estructura macroporosa. La porosidad global y el nivel de
conectividad de los poros se reguló por la relación partículas de
polímero:partículas de sal. Tanto el módulo de compresión (159 \pm
130 kPa para SC/PL frente a 289 \pm 25 kPa para GF/PL) como el
módulo de tracción (334 \pm 52 kPa para SC/PL frente a 1100 \pm
236 kPa para GF/PL) de las matrices formadas por este método eran
significativamente mayores que los obtenidos con un proceso estándar
de colada con disolvente/lixiviación del material particulado. El
potencial de estas matrices para construir el nuevo tejido se
demostró por el descubrimiento de que las células de la musculatura
lisa se adherían fácilmente y proliferaban sobre estas matrices,
formando nuevos tejidos de alta densidad (3 x 10^{7} células/ml)
en cultivo. Este nuevo proceso, una combinación de técnicas de
transformación en espuma con gas a alta presión y lixiviación de un
material particulado, permite fabricar matrices a partir de
polímeros biodegradables con una porosidad y estructura de poros
bien controlada.
La presente invención se refiere también a un
polímero poroso que comprende una matriz de polímero que contiene
poros formados por transformación en espuma con gas y poros
formados por lixiviación de un material particulado del polímero, y
en el cual el polímero es biocompatible, y a un material polímero
que comprende una sección de polímero poroso que comprende una
matriz de polímero que contiene poros formados por transformación en
espuma con gas y poros formados por lixiviación de un material
particulado del polímero y una sección de polímero impermeable
conectado integralmente y en el cual el polímero es
biocompatible.
Los materiales preparados por el proceso de la
invención exhiben una extensa gama de utilidades. Los mismos se
pueden aplicar a cualquier uso que requiera un material polímero
poroso, particularmente con una estructura de poros abiertos.
Adicionalmente, los materiales son particularmente aplicables para
usos en los cuales no es tolerable un residuo de disolvente
orgánico, v.g. en aplicaciones en las cuales se desea
biocompatibilidad. Por ejemplo, los materiales son útiles como
matrices en las cuales las células son compatibles y crecen hasta
alcanzar su función propuesta, tales como en reemplazamiento de
tejidos, reemplazando eventualmente la matriz dependiendo de su
biodegradabilidad. Adicionalmente, los materiales pueden utilizarse
para proporcionar matrices ya fijadas a células que pueden luego
implantarse quirúrgicamente en un cuerpo. Por otra parte, los
materiales se pueden utilizar como sistema de suministro de fármacos
de liberación sostenida, como materiales matriz para la curación de
heridas, como matrices para estudios de cultivo de células in
vitro o usos similares a los citados. La estructura estable de
los materiales de la invención proporciona condiciones ideales para
cultivo de células.
Los materiales de la invención preparados por el
proceso GF/PL tienen generalmente además aplicaciones similares a
las de los materiales preparados por las técnicas SC/PL y de
separación de fases, por ejemplo, en una diversidad de aplicaciones
de trasplante de células, con inclusión de hepatocitos (D.J. Mooney,
P.M. Kaufmann, K. Sano, K.M. McNamara, J.P. Vacanti y R. Langer,
"Transplantation of hepatocytes using porous biodegradable
sponges", Transplantation Proceedings, 26,
3425-3426 (1994); D.J. Mooney, S. Park, P.M.
Kaufmann, K. Sano, K. McNamara, J.B. Vacanti, y R. Langer,
"Biodegradable sponges for hepatocyte transplantation", Journal
of Biomedical Materials Research, 29, 959-965
(1995)), condrocitos y osteoblastos. S.L. Ishaug, M.J. Yaszemski, R.
Biciog, A.G. Mikos: "Osteoblast Function on Synthetic
Biodegradable Polymers", J. of Biomed. Mat. Res. 28, p.
1445-1453 (1994). Sin embargo, los materiales de la
invención tienen propiedades mecánicas mejores y evitan el problema
de los residuos de disolvente orgánico que pueden dañar las células
trasplantadas o migrantes y el tejido próximo y/o desactivar
factores biológicamente activos.
Las células musculares lisas se adhieren
fácilmente al material matriz de la invención y crean tejidos
tridimensionales dentro de estas estructuras porosas; así, aquéllas
proporcionan un entorno adecuado para la proliferación celular.
Experimentos in vitro indican un crecimiento celular
concentrado alrededor de la periferia de la matriz. Esto es debido
probablemente a limitaciones de difusión de O_{2} a las células en
el centro de la matriz debido al espesor de la esponja (3,4 mm).
Adicionalmente, estas matrices tienen un mejor
potencial para incorporar factores de crecimiento que las preparadas
utilizando disolventes orgánicos. El problema potencial con los
disolventes orgánicos es que el residuo que queda en estos polímeros
después del procesamiento puede dañar las células trasplantadas y el
tejido próximo. Adicionalmente, la exposición a disolventes
orgánicos desactivaría muchos factores biológicamente activos.
Actualmente, la incorporación de factores de crecimiento con
biomateriales se realiza utilizando microesferas. Este método
utiliza también disolventes orgánicos durante la fabricación. Esta
desventaja puede eliminarse con los materiales matriz de la
invención debido a que el factor de crecimiento puede incorporarse
directamente en la matriz de polímero para obtener una mejor
liberación.
Una manera preferida de incorporar factores de
crecimiento en una matriz para construcción de tejidos y/o
proliferación de células consiste en proporcionar un factor de
crecimiento contenido dentro de una estructura de polímero en forma
de partículas, v.g. como microesferas de perlas, o mezclado con otro
polímero u otras moléculas, antes de la adición al PLGA para la
transformación en espuma. La estructura polímera puede formarse a
partir de otro copolímero de PLGA que se degrada a una tasa
diferente que el PLGA utilizado para formar el grueso de la matriz o
a partir de un material polímero diferente, tal como un material de
alginato o alginato modificado. Un sistema de este tipo proporciona
un nivel adicional de control sobre la cinética de liberación de
moléculas desde las matrices, y control adicional sobre su
bioactividad debido a que los factores de crecimiento contenidos
dentro de la estructura polímera pueden diseñarse de modo que
proporcionen un efecto de liberación controlada a partir de la misma
además de la cinética de liberación proporcionada por la matriz. La
liberación en esta situación estará controlada probablemente por
disociación del factor desde la perla, liberación del PLGA, o ambos.
Así pues, se proporciona un alto grado de control sobre la cinética
de liberación dentro de una gama potencialmente amplia. Además,
pueden incluirse factores múltiples en una matriz (en múltiples
tipos de las partículas descritas y/o en un polímero que comprende
el grueso de la matriz) que se liberarán en tiempos variables. Esto
será útil si se desea una cascada de liberación de factores de
crecimiento, u ondas de liberación del mismo factor (v.g., para uso
en inmunizaciones). La incorporación de los factores de crecimiento
de estas partículas (v.g., perlas de alginato) es también más
adecuada para mantener la bioactividad a largo plazo de los factores
que sí los mismos estuvieran inmovilizados directamente en el
polímero que comprende el grueso de la matriz transformada en
espuma.
Matrices altamente porosas, por ejemplo, de PLGA,
con una combinación de transformación en espuma con gas y
lixiviación de un material particulado pueden prepararse por la
invención. El método evita el uso de disolventes orgánicos o
temperaturas altas y produce materiales con estructuras de poros
deseables. Es posible controlar la porosidad y la estructura de
poros de estas matrices variando la relación de polímero particulado
y el tamaño de partícula del material particulado, por ejemplo.
Estas matrices exhiben propiedades mecánicas mejoradas, y pueden
utilizarse para formar tejidos tridimensionales. Este nuevo método
de fabricación puede utilizarse, por ejemplo, como un enfoque para
la incorporación de fármacos y/o factores de crecimiento en
polímeros utilizados como matrices para construcción de tejidos.
Otra aplicación útil para las matrices de
polímero de la invención es para regeneración guiada de tejidos
(GTR). Esta aplicación está basada en la hipótesis de que en el
tejido sano subyacente residen células progenitoras responsables de
la regeneración tisular y puede inducirse su migración hasta un
defecto y regeneración del tejido perdido. Una característica
crítica de las matrices para GTR es el transporte de células al
interior de la matriz, propiedad que viene dictada por la
distribución de tamaños de poro y la continuidad de los poros, es
decir, la interconectividad. La matriz debe permitir que las células
deseadas invadan la matriz impidiendo al mismo tiempo el acceso a
otros tipos de células.
Los materiales de la invención, en particular
como una esponja de polímero hecha de poli(ácido láctico) PLA,
poli(ácido glicólico) (PGA), o poli(ácido
láctico-co-glicólico) (PLGA), que
tienen una capa impermeable en uno de sus lados, pueden proporcionar
esta característica de permeabilidad selectiva. La capa impermeable
está compuesta de los mismos polímeros pero sin la extensión de
porosidad, y pueden utilizarse una diversidad de métodos para
acoplar la capa impermeable a la esponja de polímero.
En una realización particular que es
representativa de esta utilidad, la esponja de polímero se crea por
molienda de PLGA seguida por tamizado a fin de obtener partículas
con un diámetro comprendido entre 108 y 250 micrómetros. Estos
materiales polímeros se mezclan con cloruro de sodio y se prensan a
su forma definitiva con un troquel a una presión de aproximadamente
105 bares (1500 psi). El sólido polímero/sal se transforma luego en
espuma poniendo el sólido en una bomba de presión y exponiéndolo a
CO_{2} a una presión de 56 bares (80 psi) durante 48 horas seguido
por una reducción relativamente rápida de la presión. Esta reducción
de presión produce inestabilidades termodinámicas en la distribución
de CO_{2}, causando la formación de poros. El sólido polímero/sal
se deja luego en agua durante 24 horas para lixiviar la sal. Téngase
en cuenta que el agua debe cambiarse durante el proceso de
lixiviación. Este proceso produce una esponja de polímero que tiene
una porosidad mayor que 95%. La tasa de degradación de la esponja
puede modificarse variando la composición de ácidos láctico y
glicólico.
Puede crearse una capa impermeable en un solo
lado de la esponja por una de las técnicas siguientes, realizadas
preferiblemente antes de la transformación en espuma con gas del
material. La esponja puede prensarse a su forma definitiva en una
capa de PGA a una temperatura mayor que la temperatura de fusión del
PGA. El PGA fundido podrá adherirse a la esponja formando así una
capa delgada. Esta capa es impermeable debido a que el proceso de
transformación en espuma y el proceso de lixiviación tienen un
efecto insignificante sobre el PGA puro. Puede crearse también una
capa impermeable de PLGA sobre la esponja prensando la esponja sobre
una capa de PLGA. La pulverización de una solución de PLA en
cloroformo sobre un lado de la esponja puede crear también una capa
impermeable. Adicionalmente, es posible utilizar el mismo material
polímero y alterar la cantidad de material particulado lixiviable en
cada sección de tal manera que una sección forme una estructura de
poros abiertos y otra no lo haga. Asimismo, por utilización de
polímeros diferentes, pueden proporcionarse materiales en los cuales
una sección está transformada en espuma, y la sección de capa
impermeable no lo está. Aunque PLGA se transforma en espuma después
de la liberación de la presión desde la bomba, se forma una piel
impermeable sobre la capa delgada de PLGA que queda intacta durante
el proceso de lixiviación. Alternativamente, después del proceso de
transformación en espuma y lixiviación, la esponja polímera puede
sumergirse en PGA fundido o en una solución de PLGA en cloroformo.
Estos procedimientos pueden utilizarse para crear una esponja que
tiene una porosidad mayor que 95% con un lado impermeable.
Pueden aplicarse métodos similares a materiales
análogos, como se ha expuesta anteriormente, a fin de proporcionar
otros materiales de esponja de acuerdo con la invención útiles para
aplicaciones GTR.
Las matrices de PLGA pueden proporcionar también
un sustrato adecuado para formación de hueso. Una característica
crítica de una matriz para reemplazamiento de tejidos óseos es su
capacidad para proporcionar un entorno apropiado para el desarrollo
de tejido y la mineralización de la matriz. La capacidad de las
matrices GF/PL para permitir la adhesión celular y la formación de
tejido se evaluó in vitro por siembra y cultivo de células
MC3T3-E1, una línea de células osteogénica, sobre
entramados de PLGA con técnicas optimizadas previamente para otros
tipos de células (Kim et al., Biotech. Bioeng., 57, p.
46-54, 1998). Las células adheridas a la matriz
GC/PL proliferaron, y comenzaron a secretar proteínas de la matriz
extracelular, y al cabo de 4 semanas de cultivo pudieron observarse
parches de mineralización. Se formó un nuevo tejido con grandes
áreas de mineralización al cabo de 6 semanas. A lo largo de este
periodo de tiempo no se observó cambio alguno en el tamaño y la
forma de las matrices, lo que sugiere que las mismas tenían
propiedades mecánicas suficientes para controlar la formación global
de tejido óseo construido.
Una característica crítica de la matriz para uso
en la regeneración guiada de tejido es la capacidad de las células
para migrar hacia el interior de la matriz. Experimentos
preliminares confirman que las células migraban fácilmente hacia
dentro y a lo largo de la matriz in vitro. Esto era de
esperar, dado que estudios previos con estos tipos de matrices
demostraron crecimiento fibrovascular interno in vivo a una
tasa de 0,1-0,3 mm/día (Mooney et al., 1994,
supra).
Otra aplicación potencial de estos materiales de
esponja para GTR se refiere al tratamiento de una enfermedad
periodontal. La enfermedad periodontal se caracteriza por la pérdida
de fijación del ligamento periodontal al hueso alveolar. Las células
epiteliales de la encía comienzan a crecer hacia el interior del
sitio en el que estaba fijado el ligamento periodontal. Una esponja
del material matriz de acuerdo con la invención con un lado
impermeable podría utilizarse para prevenir el crecimiento hacia
abajo de células epiteliales en tanto que permitiría que las células
apropiadas ocuparan la esponja porosa regenerando de este modo el
ligamento periodontal. Orientaciones adicionales en cuanto a dicha
aplicación han sido proporcionadas por Shea et al., Tissue
Engineering: Fundamentals and Concepts, Capítulo III.6,
"Biodegradable Polymer Matrices in Dental Tissue
Engineering".
Para otras aplicaciones en las cuales se siembran
o se incorporan de otro modo células y crecen dentro de las matrices
de la invención, la incorporación y el crecimiento de las células
pueden facilitarse de una manera conocida en la técnica. Ejemplos de
tales métodos se proporcionan en las patentes U.S. Núms. 5.041.138;
5.567.612; 5.696.175 y 5.709.854.
Se cree que, sin más explicación, un experto en
la técnica puede, utilizando la descripción que antecede, utilizar
la presente invención en su más plena extensión. Las realizaciones
específicas preferidas siguientes deben interpretarse, por
consiguiente, como meramente ilustrativas, y no limitantes del resto
de la exposición en modo alguno.
Información adicional en relación con la
utilización de la presente invención puede encontrarse en la
Solicitud Provisional U.S. No. 60/042.198, presentada el 31 de marzo
de 1997.
En lo que antecede y en los ejemplos siguientes,
todas las temperaturas se indican en grados Celsius sin corregir y,
a no ser que se indique otra cosa, todas las partes y porcentajes se
expresan en peso.
Pelets de un copolímero 85:15 de
D,L-lactida y glicolida (PLGA) se adquirieron de
Boehringer Ingelheim (Henley, Montvale, NJ, EE.UU.), y se utilizaron
para fabricar las matrices de polímero en todos los experimentos. La
viscosidad intrínseca del polímero era aproximadamente
1,3-1,7. Los pelets de polímero se molieron
utilizando un molino Tekmar (Bel-Art Products,
Pequannock, NJ, EE.UU.) y se tamizaron para obtener partículas de
tamaños comprendidos entre 106 y 250 \mum. En ciertos
experimentos, la matrices de polímero se mezclaron con partículas de
cloruro de sodio (Mallinckrodt, Paris, KY, EE.UU.). Las partículas
de sal se tamizaron para proporcionar una gama de tamaños, y la
relación en peso de las masas NaCl:PLGA estaba comprendida entre 0 y
50. En todos los casos, la masa total de PLGA y NaCl se mantenía
constante en 0,8 g. Las mezclas de PLGA y NaCl se cargaron a una
matriz de KBr (1,35 cm de diámetro; Aldrich Chemical Co., Milwaukee,
WI, EE.UU.), y se comprimieron a 105 bares (1500 psi) durante 1
minuto, utilizando una Prensa de Laboratorio Carver (Fred S. Carver,
Inc., Menominee Falls, WI, EE.UU.) para producir discos sólidos
(espesor = 3,4 mm). Las muestras se expusieron luego a CO_{2}
gaseoso a alta presión (56 bares; 800 psi) durante 48 horas a fin de
saturar el polímero con gas. Se creo luego una inestabilidad
termodinámica por reducción de la presión de gas hasta la presión
atmosférica. Esto condujo a la formulación de núcleos y el
crecimiento de poros de CO_{2} dentro de las matrices de polímero.
Las partículas de NaCl se eliminaron subsiguientemente de las
matrices por lixiviación de éstas en ddH_{2}O durante 48 horas.
Todos los pasos del proceso se realizaron a la temperatura
ambiente.
Se fabricaron también esponjas porosas utilizando
una técnica de colada con disolvente-lixiviación de
material particulado descrita previamente (A.G. Mikos, A.J. Thorsen,
L.A. Czerwonka, Y. Bao, y R. Langer, "Preparation and
characterization of poly(L-lactic acid)
foams", Polymer, 35, 1068-1077 (1994)). En este
proceso, se disolvió PLGA en cloroformo (Mallincrodt; Paris, KY,
EE.UU.) para producir una solución de 10% (p/v), y se cargaron 0,12
ml de esta solución en cilindros de Teflón (diámetro 0,5 cm; Cole
Parmer) compactados con 0,4 g de partículas de cloruro de sodio
tamizadas a un tamaño comprendido entre 250 y 500 \mum. Después de
la evaporación del disolvente, las películas de polímero con
partículas de sal atrapadas (3 mm de espesor) se retiraron
cuidadosamente de los moldes. La sal se eliminó por inmersión de las
películas en agua destilada durante 48 horas.
La porosidad de las muestras se determinó
inicialmente por medidas y pesos en bruto después del procesamiento
utilizando la ecuación siguiente:
Ecu.
1:
Porosidad(%) =
1-[(peso/volumen)/(\text{densidad de polímero})] \ x \
100
Las muestras se sometieron a obtención de imagen
utilizando un microscopio electrónico de exploración
(ISI-DS 130, Topcon Technologies, Pleasanton, CA,
EE.UU.). Las muestras se recubrieron con oro utilizando un equipo
Sputter Coater (Desk II, Denton Vacuum, Cherry Hill, NJ, EE.UU.), y
el microscopio se hizo operar a 10 kV para obtener las imágenes de
las muestras. Se utilizó película Polaroid 55 para las
fotomicrografías.
Se realizaron ensayos de compresión y tracción en
un equipo MTS Bionics 100 (, Research Triangle Park, NC, EE.UU.).
Las muestras se cortaron en cuadrados de 1 x 1 cm para el ensayo de
compresión. Para el ensayo de tracción, las muestras (1 x 1 cm) se
fijaron a cartulina utilizando una cola epoxídica. Se cortó una
ranura de 1,7 mm en el centro de la cartulina y se centró la
muestra, después de lo cual se encoló para normalizar la longitud de
referencia. Los ensayos de compresión y tracción se realizaron con
una tasa de deformación constante (1 mm/min). Los módulos se
determinaron a partir de las pendientes en la porción elástica del
diagrama esfuerzo-deformación.
Se utilizó análisis termogravimétrico para
determinar la cantidad de residuo de sal que quedaba en la esponja
después de la lixiviación. Las matrices se calentaron desde 150ºC a
300ºC a una tasa constante de 10ºC/min, y se observó la masa
residual.
Se utilizaron en todos los experimentos células
musculares lisas (SMC). Las SMCs se aislaron y cultivaron utilizando
una modificación de las técnicas descritas en Rothman et al. (A.
Rothman, T.J. Kulik, M.B. Taubman, B.C. Berk, C.W.J. Smith y B.
Nadal-Ginard, "Development and characterization of
a cloned rat pulmonary arterial smooth muscle cell line that
maintains differentiated properties through multiple
subcultures", Circulation, 86, 1977-1986 (1992)).
En resumen, las células se aislaron de aortas de ratas macho Lewis
adultas de 300-350 g (Charles River Laboratories,
Wilmington, MA, EE.UU.) utilizando una disociación enzimática.
Después de ello, los tejidos adventicios, y los tejidos conectivos
que rodeaban las arterias se eliminaron por disección directa, se
cortó el tejido SM en múltiples piezas pequeñas y se puso en un
frasco de centrífuga que contenía un tampón de disociación
enzimática a 37ºC. Este tampón contiene 0,125 mg/ml de elastasa
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.), 1,0 mg/ml de colagenasa
(CLS tipo I, 204 unidades/mg, Worthington Biochemical Corp.,
Freehold, NJ, EE.UU.), 0,250 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja
(tipo 1-S, Sigma), y 2,0 mg/ml de seroalbúmina
bovina cristalizada (BSA, Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD;
EE.UU.). Después de 90 minutos de incubación, la suspensión se
filtró a través de un filtro Nitex de 100 \mum (Tetko, Inc.,
Briarcliff Manor, NY) y se centrifugó a 200 g durante 5 minutos. El
sedimento se resuspendió en Medio 199 (Sigma) complementado con 20%
(v/v) de suero de bovino fetal (FBS, Gibco),
L-glutamina 2 mM (Gibco), y 50 unidades/ml de
penicilina-estreptomicina (Gibco). Las células se
cultivaron sobre un plástico de cultivo de tejidos en una atmósfera
humidificada con 5% de CO_{2} con el medio (Medio 199, 10% (v/v)
de suero de bovino fetal, 50 unidades/ml de
penicilina-estreptomicina) cambiado cada dos días.
En estos experimentos se utilizaron células sometidas a 17
pasadas.
Las matrices se sembraron con SMCs poniendo una
suspensión de células de 40 ml que contenía 3,14 x 10^{7}
células/ml encima de cada matriz y dejando que la suspensión de
células se absorbiera en la matriz. Las matrices estaban alojadas en
cápsulas de cultivo de tejidos y se incubaron a 37ºC durante
aproximadamente 36 horas. A continuación, se cultivaron las matrices
de polímero durante 2 semanas y se pusieron en un frasco de
centrífuga (100 ml, Bellco Glass, Inc., Vineland, NJ, EE.UU.)
agitado a 40 RPM. El número de células en las matrices se determinó
midiendo el contenido de DNA en muestras triplicadas digeridas con
enzima utilizando colorante Hoechst 33258 y un fluorómetro (Hoefer
DyNA Quant 200, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) como se ha
descrito previamente. Para el examen al microscopio electrónico de
exploración, las muestras se fijaron en aldehído glutárico al 1% y
formaldehído al 0,1% durante 30 minutos y 24 horas, respectivamente,
se deshidrataron en una serie graduada de soluciones etanol/agua, se
secaron, y se recubrieron luego por pulverización catódica con oro.
Para obtener las imágenes de las muestras se utilizó un microscopio
electrónico de exploración (ISI-DS 130, Topcon
Technologies) que operaba a 10 kV. Se prepararon secciones
histológicas por fijación de matrices
célula-polímero (10% formalina), deshidratación,
incrustación, corte en secciones y tinción con hematoxilina y eosina
o Verhoef's utilizando técnicas estándar.
\newpage
Las fotomicrografías demostraron que la
transformación en espuma con gas, por sí sola, de los discos sólidos
de polímero conducía a la formación de matrices altamente porosas.
Sin embargo, estas matrices tenían una piel no porosa en las
superficies externas y los poros estaban en gran parte cerrados,
como era de esperar por los estudios previos. (D.J. Mooney, D.F.
Baldwin, N.P. Suh, J.P. Vacanti, y R. Langer, "Novel approach to
fabricate porous sponges of
poly(D,L-lactic-co-glycolic
acid) without the use of organic solvents", Biomaterials, 17,
1417-1422 (1996)). En contraste, la transformación
en espuma con gas y lixiviación subsiguiente de discos que contenían
un alto porcentaje (95%) de partículas grandes (250 < d < 425
\mum) de NaCl, de acuerdo con la invención, conducía a la
formación de matrices altamente porosas de poros abiertos sin
evidencia alguna de piel externa no porosa. La estructura de poros
observada en las secciones transversales de estas matrices era
similar a la observada en las secciones transversales de las
matrices formadas con una técnica SC/PL. Sin embargo, la estructura
de poros de las matrices formadas a partir del proceso SC/PL carece
a menudo de uniformidad en toda la matriz debido a la evaporación
del disolvente orgánico y el aumento subsiguiente en la
concentración de polímero de la solución restante atrapada dentro
del lecho de sal. Por ejemplo, se muestra en las fotomicrografías
que la superficie de estas matrices que es adyacente al cubreobjetos
de vidrio durante el procesamiento que es típicamente menos porosa
que el resto de la matriz. En contraste, la estructura de poros de
las matrices transformadas en espuma con
gas-lixiviadas del material particulado (GF/PL) era
uniforme en toda la matriz y en las superficies exteriores. El
análisis TGA de las matrices indicaba que quedaban cantidades
insignificantes de NaCl después de la lixiviación. En la cápsula
quedaban trazas de un residuo blanco. Para confirmar que la
transformación en espuma con gas era responsable de la formación de
matrices estables, se moldearon por compresión muestras de control,
pero no se transformaron en espuma. La lixiviación del NaCl de estas
matrices condujo a la rotura completa de las matrices.
La relación de NaCl:PLGA y el tamaño de las
partículas de NaCl en las matrices GF/PL se variaron a continuación
para determinar la gama de porosidad y estructura de poros que
podría obtenerse con este proceso (Tabla I). La porosidad global de
estas matrices aumentaba desde 85,1% \pm 2,3 a 96,5% \pm 0,5 a
medida que aumentaba análogamente la relación de NaCl:PLGA. Para
NaCl constante (95%), el aumento en el diámetro de las partículas de
sal tenía muy poco efecto sobre la porosidad global. Sin embargo,
las fotomicrografías demostraban que a medida que se incrementaba el
diámetro de la sal, aumentaba paralelamente el tamaño de poro.
A continuación se evaluó la estabilidad de las
matrices utilizando ensayos mecánicos de compresión y tracción. En
general, las matrices GF/PL exhibían propiedades mecánicas mejoradas
en comparación con las matrices SC/PL (véase Figura 1). Los módulos
de compresión medios eran 159 \pm 130 kPa y 289 \pm 25 kPa para
las matrices SC/PL y GF/PL, respectivamente. Los módulos de tracción
medios eran 334 \pm 52 kPa para las matrices SC/PL y 1100 \pm
236 kPa para las matrices GF/PL (Tabla II). Estos datos representan
un aumento de 80% en resistencia a la compresión y un aumento de
300% en resistencia a la tracción.
Se evaluó seguidamente la capacidad de las
matrices GF/PL para permitir la adhesión celular y la formación de
tejidos en un estudio in vitro. Las fotomicrografías
demuestran que las SMCs se adherían a la matriz GF/PL y cubrían la
superficie disponible después de la siembra. Se demostró un aumento
significativo en el número de células después de 2 semanas de
cultivo. La densidad media de células era 1,71 x 10^{7} células/ml
y 3,05 x 10^{7} células/ml a las 0 y 2 semanas, respectivamente.
Esto representa un aumento del 43,8% en la densidad de células. Las
células llenaban los poros de la matriz y creaban un nuevo tejido
tridimensional en el interior de la matriz sintética. Sin embargo,
la mayor parte del crecimiento de las células tenía lugar alrededor
de la periferia de la matriz de una manera relativamente uniforme, y
se observaba una baja concentración de células en el centro de las
matrices a las 2 semanas. No se observó cambio alguno en el tamaño y
la forma de las matrices a lo largo de este periodo de tiempo.
Concentración de NaCl | Diámetro (\mum) | ||
(%) | |||
106-250 | 250-425 | >425 | |
80 | - - - | 85,1 \pm 2,3 | - - - |
90 | 87,3 \pm 1,9 | 91,5 \pm 1,4 | - - - |
95 | 93,9 \pm 0,9 | 94,6 \pm 0,9 | 95,0 \pm 0,8 |
97 | - - - | 96,5 \pm 0,5 | - - - |
Resistencia a la tracción | |||
Método | Módulo de compresión | Módulo | Alargamiento de |
(kPa) | (kPa) | rotura (%) | |
Disolvente/lixiviación | 159 \pm 130 | 334 \pm 52 | 17,5 \pm 1,9 |
Espuma/lixiviación | 289 \pm 25 | 1100 \pm 236 | 12,0 \pm 1,3 |
Se añadió primeramente factor de crecimiento
endotelial vascular marcado con ^{125}I (VEGF) a una solución de
alginato de sodio al 1%, y se gelificaron luego perlas de esta
solución por inyección de gotitas en una solución acuosa que
contenía cloruro de calcio. Las perlas de alginato (de
aproximadamente 3 mm de diámetro) se recogieron, enjuagaron, y
liofilizaron. Las perlas liofilizadas se mezclaron con 85:15 PLGA y
partículas de NaCl, y la mezcla se moldeó por compresión y se
transformó conforme al proceso de transformación en espuma con
gas/lixiviación de material particulado como se ha descrito
previamente. Después de lixiviación de la sal y secado, las matrices
pusieron en medio de cultivo de tejidos exento de suero y se
mantuvieron a 37ºC. Se tomaron periódicamente muestras del medio, y
se analizaron en cuanto al contenido de
^{125}I-VEGF (liberado de las matrices de PFGA).
El factor de crecimiento liberado se normalizó para el total de
factor de crecimiento incorporado.
Se observó en el primer día un aumento brusco
inicial de aproximadamente 20% del factor de crecimiento
incorporado, y se anotó una liberación sostenida de factor de
crecimiento durante los 20 días restantes del experimento (véase la
Figura 2).
Un elemento que puede facilitar el desarrollo de
tejidos sobre las matrices es el suministro de factores de
crecimiento en el entorno local. La incorporación y liberación de
factores de crecimiento a partir de estas matrices se evaluó in
vitro utilizando factor del crecimiento endotelial vascular
marcado con ^{125}I (VEGF). Una fracción sustancial del fármaco se
liberó durante el proceso de lixiviación de las partículas; sin
embargo, el fármaco restante se liberó de una manera sostenida
durante los 21 días del experimento (Fig. 4).
Se obtuvieron pelets de ácido
poli(L-láctico) [PLLA], un copolímero 50:50
de D,L-lactida y glicolida (50:50 PLGA) con
viscosidad intrínseca (i.v. de 0,2 dl/g), un copolímero 75:25 PLGA
(i.v. = 1,3) y un copolímero 85:15 PLGA (i.v. = 1,4) de Boehringer
Ingelheim (Henley, Montvale, NJ, EE.UU.). Se adquirieron PGA, 50:50
PLGA (i.v. = 0,8) y 85:15 PLGA (i.v. = 0,63) de Medisorb
(Cincinnati, OH, EE.UU.). Se obtuvo 85:15 PLGA (i.v. = 3,63) de
Purasorb (Lincolnshire, IL, EE.UU.).
El polímero sólido (PLLA, PLGA, PGA) se molió
(después de congelación con nitrógeno líquido) utilizando un equipo
Scienceware Micro-Mill (Bel-Art
Products, Pequannock, NJ, EE.UU.) y se tamizó hasta un diámetro de
106-250 \mum. El NaCl, obtenido de Fisher
Scientific (Pittsburgh, PA, EE.UU.) se tamizó a un diámetro de
250-425 \mum para uso en ciertos experimentos. Se
conformaron discos sólidos de polímero por introducción de 150 mg de
polímero (PGA, 50:50 PLGA, 75:25 PLGA, 85:15 PLGA, y PLLA) en una
matriz redonda de acero inoxidable-KBr que tenía un
diámetro de 1,35 cm (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, EE.UU.) y
compresión durante 60 segundos a 105 bares (1500 psi) en una Prensa
de Laboratorio Carver (Fred S. Carver, Inc., Menominee Falls, WI,
EE.UU.). Este método produce discos sólidos para transformación en
espuma. Todas las muestras se fabricaron por triplicado.
Los discos se transformaron en espuma en un
recipiente de alta presión utilizando CO_{2}, N_{2}, o He a 59,5
bares (850 psi).
Después que los discos se hubieron equilibrado
(1-48 horas) con el gas, se redujo la presión a la
atmosférica. La inestabilidad termodinámica resultante causó la
formación de núcleos y el crecimiento de poros de gas dentro de la
matriz de polímero. Discos sólidos de polímero 85:15 (i.v. = 1,4) se
convirtieron en espuma durante 1 hora en CO_{2} y la presión se
liberó a tasas diferentes (1, 2,5, 5, 10 minutos) para determinar si
la tasa de liberación de la presión afecta a la estructura final de
las esponjas. Todos los pasos del proceso se realizaron a la
temperatura ambiente.
Se fabricaron discos de polímero/NaCl de manera
similar utilizando 40 mg de polímero y 760 mg de NaCl, comprimidos
en discos. Después de la conversión en espuma, los discos se
pusieron en agua destilada a fin de eliminar el NaCl. Esta solución
de lixiviación se cambió varias veces a lo largo del transcurso de
aproximadamente 18 horas. Se consideró que los discos se habían
lixiviado por completo cuando la solución se lixiviación no daba un
precipitado con AgNO_{3}. Si está presente en la solución
Cl^{-}, precipita con Ag^{+} para formar un precipitado blanco.
La ausencia de formación de este precipitado indicaba que el NaCl se
había eliminado por completo de los entramados. Los discos se
secaron luego al aire durante una noche, se midieron y se pesaron,
después de lo cual se guardaron a vacío en un desecador. Los discos
de polímero se midieron y pesaron inmediatamente después de la
transformación en espuma, y se guardaron luego a vacío en un
desecador.
Con objeto de calcular la porosidad de los discos
transformados en espuma, se utilizó un calibrador Boley para medir
el diámetro y espesor de cada disco. Los discos se pesaron en una
balanza Mettler y se utilizó la ecuación siguiente: (d = densidad de
polímero, g = peso de disco, cm^{3} = volumen calculado del
disco):
porosidad = 100 [1 -
(g/cm^{3})/d]
Se obtuvieron imágenes de varias de las muestras
utilizando un microscopio electrónico de exploración
(ISI-DS 130, Topcon Technologies, Pleasanton, CA,
EE.UU.). Las muestras se recubrieron de oro utilizando un
instrumento Sputter Coater (Desk II, Denton Vacuum, Cherry Hill, NJ,
EE.UU.) y el microscopio se operó a 10 kV para obtener la imagen de
las muestras. Para las fotomicrografías se utilizó película Polaroid
55.
El ensayo de compresión se realizó en un equipo
MTS Bionix 100 (Syntech, Research Triangle Park, NC, EE.UU.). Se
utilizaron exclusivamente discos de polímero/NaCl en los ensayos de
compresión debido a que los discos de polímero sólido se
transformaban en espuma con formas irregulares. Se utilizó una tasa
de deformación constante de 1 mm/min, y se determinaron los módulos
a partir de las curvas esfuerzo-deformación.
En la primera serie de experimentos, discos
sólidos de polímero se transformaron en espuma para investigar el
papel del tipo de gas, la tasa de liberación de la presión, y la
composición y el peso molecular del polímero en la porosidad de las
matrices de polímero. Matrices 85:15 de PLGA se transformaron en
espuma durante 1 hora con varios gases diferentes (CO_{2},
N_{2}, He). Se obtuvo una porosidad significativa como resultado
de la transformación en espuma con CO_{2} en comparación con
N_{2} y He. La porosidad "de preespuma" hace referencia a la
porosidad calculada después de la preparación del disco, pero antes
de la equilibración de la presión (Figura 4). La visualización de
las matrices transformadas en espuma con CO_{2} reveló una matriz
altamente porosa, constituida en gran parte por poros cerrados.
En el estudio inmediatamente siguiente, se varió
la tasa de liberación de la presión desde 1 a 10 minutos de tiempo
total. La porosidad de las matrices era relativamente constante con
indiferencia de la tasa de liberación de la presión, excepto en el
caso de una liberación muy rápida, cuando el gas se congelaba dentro
de la cámara. Esto condujo a una pequeña disminución en la porosidad
de la matriz (Figura 2).
Se investigó el efecto de la composición de
polímero utilizando relaciones de copolímero diferentes de PLGA (PGA
puro, 50:50, 75:25, 85:15 PLGA y PLLA puro). Ni PGA ni PLLA se
transformaban en espuma apreciablemente. Los copolímeros se
transformaban todos ellos en espuma para dar una porosidad mayor que
90% (Figura 6). De hecho, el copolímero 75:25 se transformaba en
espuma tan fuertemente que no mantenía su integridad en la fase de
liberación de presión/expansión del gas y se desintegró
literalmente. Por tanto, no pudo calcularse valor alguno de
porosidad para dicha muestra.
Con objeto de estudiar el efecto del peso
molecular del polímero sobre la formación de poros, discos de 85:15
PLGA con viscosidad intrínseca (i.v.) comprendida entre 0,63 y 3,59
dl/g, se transformaron en espuma en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi)
durante 24 horas con una liberación de presión de 2,5 minutos. El
PLGA de alta i.v. condujo a matrices con porosidad relativamente
baja, mientras que el PLGA de menor i.v. dio como resultado una
porosidad mucho mayor (Figura 7).
En la segunda serie de experimentos, se incorporó
NaCl en el disco de polímero para el propósito de crear una
estructura de poros abiertos. Se estudiaron diferentes variables
(tiempo de equilibración y composición del polímero) a fin de
determinar sus efectos sobre la estructura y estabilidad de los
entramados. Los resultados de la primera serie de experimentos
condujeron a los autores a utilizar CO_{2} como el gas empleado
para la transformación en espuma, y un tiempo de liberación de la
presión de 2,5 minutos en esta serie de experimentos. El examen de
una matriz típica formada por transformación en espuma de 85:15 PLGA
con NaCl en CO_{2}, muestra una estructura muy porosa con poros
interconectados en gran parte abiertos.
En el primer estudio, el tiempo de equilibración
se varió de 1 a 48 horas. La porosidad de las matrices era
relativamente constante para tiempos de equilibración mayores que 6
horas, pero decrecía para tiempos de equilibración inferiores a 6
horas (Fig. 8a). Las matrices fabricadas con diversos tiempos de
equilibración se ensayaron subsiguientemente para determinar si el
tiempo de equilibración afectaba a sus propiedades mecánicas. Aun
cuando la porosidad máxima se alcanzó con 6 horas de equilibración
con gas, se producía un entramado más resistente con tiempos de
equilibración mayores (Figura 8b).
Se varió a continuación la composición del
polímero para determinar si podrían obtenerse resultados similares a
los de la primera serie de experimentos. Los copolímeros de PLGA
conducían a una porosidad mucho mayor que lo hacían los
homopolímeros de PGA y PLLA (Figura 9a). Tanto los discos de PLLA
como los de PGA se desintegraban en el proceso de lixiviación,
indicando que se había producido poca transformación en espuma, en
todo caso. Aun cuando todos los polímeros de PLGA conducían a
matrices con porosidades similares, las matrices fabricadas a partir
de PLGA con mayor contenido de ácido láctico eran más rígidas
(Figura 9b).
Los ejemplos que anteceden pueden repetirse con
éxito similar empleando las sustancias reaccionantes y/o las
condiciones de operación de esta invención descritas genérica o
específicamente en sustitución de las utilizadas en los ejemplos que
anteceden.
Diversos otros objetos, características y
ventajas concomitantes de la presente invención se apreciarán más
plenamente a medida que la misma se entienda mejor cuando se
considere en asociación con los dibujos adjuntos, en los cuales los
caracteres de referencia iguales designan las mismas o similares
partes a todo lo largo de las diversas vistas.
Figura 1: Un gráfico que compara las propiedades
mecánicas (resistencia a la tracción) de matrices SC/PL y GF/PL.
Figura 2: Muestra el perfil de liberación del
factor de crecimiento radiomarcado de la matriz de polímero de
acuerdo con el Ejemplo 2.
Figura 3: Muestra la liberación acumulada de VEGF
a lo largo del tiempo para la matriz de acuerdo con el Ejemplo
3.
Figura 4: El efecto del tipo de gas sobre la
porosidad de las matrices. Se equilibraron discos de 85:15 PLGA
(i.v. = 1,4 dl/g) durante 1 hora en gas a 59,5 bares (850 psi) antes
de la liberación de la presión. El tiempo para liberación de la
presión fue 2,5 minutos.
Figura 5: El efecto de la tasa de liberación de
la presión sobre la porosidad de las matrices PLGA. Se transformaron
en espuma discos de 85:15 PLGA (i.v. = 1,4) durante 1 hora en
CO_{2}, con un tiempo de liberación de la presión de 1 a 10
minutos.
Figura 6: Porosidad de las matrices fabricadas a
partir de diferentes polímeros. Se expusieron los polímeros a 59,5
bares (850 psi) de CO_{2} durante 24 horas con liberación de la
presión durante 2,5 minutos.
Figura 7: El efecto del peso molecular sobre la
porosidad de las matrices de PLGA. Matrices de 85:15 PLGA con
viscosidad intrínseca variable se transformaron en espuma durante 24
horas en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) con un tiempo de liberación
de la presión de 2,5 minutos.
Figura 8a: Porosidad de las matrices con tiempos
de equilibración variables. Se transformaron en espuma discos de
85:15 PLGA (i.v. = 1,4) y NaCl en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi)
durante un tiempo comprendido entre 1 y 48 horas. El tiempo de
liberación de la presión fue 2,5 minutos.
Figura 8b: El módulo elástico de los entramados
polímero/NaCl fabricados con tiempos de equilibración diferentes.
Discos de 85:15 PLGA (i.v. = 1,4)/NaCl se transformaron en espuma en
CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) durante 1-12 horas
con liberación de la presión durante 2,5 minutos.
Figura 9a: El efecto de la composición del
polímero sobre la porosidad de los entramados polímero/NaCl.
Diferentes copolímeros de PLGA, PGA, y PLLA con NaCl se
transformaron en espuma durante 24 horas en CO_{2} a 59,5 bares
(850 psi) con un tiempo de liberación de la presión de 2,5
minutos.
Figura 9b: El módulo elástico de las matrices
formadas con diferentes composiciones de polímero. Relaciones de
copolímero diferentes de PLGA con NaCl se transformaron en espuma
durante 24 horas en CO_{2} a 59,5 bares (850 psi) con liberación
de la presión durante 2,5 minutos.
Claims (43)
1. Un proceso para preparar un material polímero
poroso que comprende formar poros en un material polímero que
contiene un material particulado susceptible de lixiviación por
transformación en espuma con gas y lixiviar subsiguientemente el
material particulado para formar porosidad adicional, en el cual la
formación de los poros por transformación en espuma con gas se
realiza sometiendo una mezcla de partículas del polímero y
partículas del material particulado a una atmósfera de un gas inerte
a presión elevada tal que el gas se disuelve en el polímero y
creando luego una inestabilidad termodinámica tal que se produce
formación de núcleos y crecimiento de poros de gas y el polímero que
contiene el material particulado forma una matriz continua.
2. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
la mezcla de partículas del polímero y partículas del material
particulado se moldea por compresión a un tamaño y forma
seleccionados antes de la formación de los poros de gas.
3. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
la inestabilidad termodinámica se crea por reducción de la presión
de la atmósfera.
4. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el gas es CO_{2}.
5. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el polímero es un polímero biocompatible.
6. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el polímero es un polímero biocompatible y biodegradable.
7. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el polímero es un homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o
ácido glicólico.
8. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el polímero es PLGA.
9. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el polímero es una mezcla de un homopolímero o copolímero de ácido
láctico y/o ácido glicólico con otro polímero.
10. El proceso de la reivindicación 9, en el cual
el polímero es una mezcla de un homopolímero o copolímero de ácido
láctico y/o ácido glicólico con un polímero de alginato.
11. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el material particulado es un material particulado soluble en
agua.
12. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el material particulado es una sal.
13. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el material particulado es NaCl.
14. El proceso de la reivindicación 1, en el cual
el tamaño y la cantidad del material particulado se seleccionan de
tal manera que se forma una estructura de poros interconectada en el
material polímero poroso.
15. El proceso de la reivindicación 12, en el
cual la cantidad de material particulado es al menos 50% en volumen
de la mezcla de partículas del polímero y partículas del material
particulado.
16. El proceso de la reivindicación 12, en el
cual el tamaño medio de partícula del material particulado es de 10
a 500 micrómetros.
17. Un proceso para preparar un material polímero
poroso que comprende formar poros en un material polímero que
contiene un material particulado lixiviable por transformación en
espuma con gas y lixiviación subsiguiente del material particulado
para formar porosidad adicional, en el cual el gas utilizado es
CO_{2}.
18. Un proceso para preparar un material polímero
poroso que comprende formar poros en un material polímero que
contiene un material particulado lixiviable por transformación en
espuma con gas y lixiviación subsiguiente del material particulado
para formar porosidad adicional, en el cual el polímero es un
polímero biocompatible.
19. El proceso de la reivindicación 18, en el
cual el polímero es un polímero biocompatible y biodegradable.
20. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, en el cual la formación de los poros por
transformación en espuma con gas se realiza sometiendo una mezcla de
partículas del polímero y partículas del material particulado a una
atmósfera de alta presión de un gas inerte de tal manera que el gas
se disuelve en el polímero, y creando luego una inestabilidad
termodinámica tal que tiene lugar formación de núcleos y crecimiento
de los poros de gas, y el polímero que contiene el material
particulado forma una matriz continua.
21. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el cual el polímero es un homopolímero
o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico.
22. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el cual el polímero es PLGA.
23. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el cual el polímero es una mezcla de un
homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico con
otro polímero.
24. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el cual el polímero es una mezcla de un
homopolímero o copolímero de ácido láctico y/o ácido glicólico con
un polímero de alginato.
25. Un polímero poroso que comprende una matriz
de polímero que contiene poros formados por transformación en espuma
con gas y poros formados por lixiviación de un material particulado
a partir del polímero, y en el cual el polímero es
biocompatible.
26. El polímero de la reivindicación 25, en el
cual la matriz de polímero es un polímero biocompatible y
biodegradable.
27. El polímero de la reivindicación 25, en el
cual la matriz de polímero es un homopolímero o copolímero de ácido
láctico y/o ácido glicólico.
28. El polímero de la reivindicación 25, en el
cual la matriz de polímero es PLGA.
29. El polímero de la reivindicación 25, en el
cual el polímero tiene una estructura de poros interconectada.
30. El polímero de la reivindicación 25, en el
cual la combinación de poros proporciona una estructura uniforme de
poros abiertos.
31. El polímero de la reivindicación 25, en el
cual el polímero exhibe un módulo de tracción de 850 kPa o
mayor.
32. Un método para suministro de fármacos que
comprende introducir un fármaco contenido dentro de un polímero
poroso de la reivindicación 25.
33. Un método para suministro de fármacos de
acuerdo con la reivindicación 32, en el cual el fármaco es un factor
de crecimiento contenido dentro de la estructura polímera de una
perla de polímero que está contenida en el interior del polímero
poroso.
34. Un método para construcción de tejidos que
comprende introducir como una matriz para el tejido un polímero
poroso de la reivindicación 25.
35. Un método para trasplante de células que
comprende administrar una combinación de un polímero poroso de la
reivindicación 25 y células para trasplante.
36. Un método para cultivo de células que
comprende cultivar células en los poros de un polímero poroso de la
reivindicación 25.
37. Un material polímero que comprende una
sección de polímero poroso que comprende una matriz de polímero que
contiene poros formados con transformación en espuma con gas y poros
formados por lixiviación de un material particulado a partir del
polímero y una sección de polímero impermeable conectada
integralmente y en el cual el polímero es biocompatible.
38. El material polímero de la reivindicación 37,
en el cual el polímero poroso tiene una estructura uniforme de poros
abiertos y el polímero impermeable es del mismo material polímero
pero sin una estructura de poros abiertos.
39. Un método para regeneración guiada de tejidos
que comprende introducir en el lugar que requiere regeneración de
tejido un material polímero de acuerdo con la reivindicación 37.
40. El material polímero de la reivindicación 37,
en el cual el polímero poroso y el polímero impermeable son de
material polímero diferente.
41. El polímero de la reivindicación 25 ó 37, que
comprende adicionalmente un fármaco contenido en el interior de los
poros del polímero poroso.
42. El polímero de la reivindicación 25 ó 37, que
comprende adicionalmente células viables dentro de los poros del
polímero poroso.
\newpage
43. El material polímero de la reivindicación 25
ó 37, que comprende adicionalmente células viables para regeneración
de tejidos dentro de los poros de la sección de polímero poroso.
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