ES2203654T3 - Expresion citoplasmatica de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moleculas de fusion de fragmentos de anticuerpos en e. coli. - Google Patents

Expresion citoplasmatica de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moleculas de fusion de fragmentos de anticuerpos en e. coli.

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ES2203654T3 ES96103913T ES96103913T ES2203654T3 ES 2203654 T3 ES2203654 T3 ES 2203654T3 ES 96103913 T ES96103913 T ES 96103913T ES 96103913 T ES96103913 T ES 96103913T ES 2203654 T3 ES2203654 T3 ES 2203654T3
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Abstract

LA INVENCION TRATA DE LA EXPRESION CITOPLASMATICA DE ANTICUERPOS, FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS Y FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS.MOLECULAS DE FUSION EN E. COLI. ESPECIALMENTE SE OBTIENEN DE FORMA VENTAJOSA FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS-MOLECULAS DE EXPRESION CON UN TROZO DE ANTICUERPO CONTRA TUMORES, Y UN TROZO DE ENZIMA QUE DEGRADA UNA "PREDROGA" ATOXICA EN LA "DROGA" TOXICA CONSERVANDO CADA UNA PROPIEDADES FUNCIONALES.

Description

Expresión citoplasmática de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moléculas de fusión de fragmentos de anticuerpos en E.coli.
La invención se refiere a la expresión citoplasmática de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moléculas de fusión de fragmentos de anticuerpos en E. coli. En especial, las moléculas de fusión de fragmentos de anticuerpos con una parte del anticuerpo dirigida contra tumores y una parte enzimática que separa los "profármacos" no tóxicos en "fármacos" tóxicos pueden obtenerse así de modo favorable, conservando las respectivas propiedades funcionales.
La expresión de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos manteniendo su propiedad de unión al antígeno hasta el momento sólo pudo realizarse en E. coli empleando secuencias señal que controlan el transporte al periplasma. En la expresión periplasmática de E. coli, el resultado de la expresión varía en un intervalo de pocos \mug/l de medio de cultivo (Ayala et al. Bio Techniques 13, páginas 790-799, 1992). Además, con frecuencia se requieren pruebas de replegamiento para obtener fragmentos de anticuerpos funcionalmente activos (Fab) o regiones de unión a antígeno (sFv).
Por ello, existía la necesidad de desarrollar mejores métodos para la expresión de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos funcionalmente activos. Con relación al concepto de ADEPT (Bagshawe, Br. J. Cancer, Vol. 60, páginas 275-281, 1989), estos métodos mejorados también deberían ser aplicables a moléculas de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos, en especial a proteínas de fusión con enzimas citoplasmáticas de mamíferos o de E. coli como, por ejemplo, la \beta-glucuronidasa de E. coli.
La \beta-glucuronidasa de Escherichia coli está bien estudiada en sus aspectos bioquímico y genético. El gen (uid A) fue clonado por Jefferson et al. (PNAS Vol. 83, páginas 8447-8451, 1986) y empleado como gen informante para regiones de control heterólogas.
La \beta-glucuronidasa (\beta-D-glucuronisida glucuronosohidrolasa, E.C. 3.2.1.31) representa una hidrolasa ácida que cataliza la separación de los \beta-glucurónidos. Dado que las glucuronidasas de mamíferos se estudiaron intensamente, se dispone de una diversidad de sustancias para los análisis histológicos, espectrofotométricos y fluorimétricos. Esta enzima adquirió una nueva importancia adicional en el uso para proteínas de fusión en la terapia tumoral dirigida. En este caso, se utiliza la glucuronidasa humana en forma de una proteína de fusión con anticuerpos/fragmentos de anticuerpos, o bien, regiones de unión a antígeno (Bosslet et al., Br. J. Cancer, 65, 234-238, 1992). Como alternativa a la enzima humana, también es posible el uso de la \beta-glucuronidasa homóloga de E. coli. Entre otras, una de las ventajas de la \beta-glucuronidasa de E. coli es que, con un pH fisiológico, su actividad catalítica es significativamente mayor que la de la \beta-glucuronidasa humana.
Las moléculas de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos hasta ahora sólo pudieron expresarse de modo periplasmático en E. coli. Por lo tanto, la proporción enzimática usada para ello siempre se compone de enzimas periplasmáticas de E. coli como, por ejemplo, la \beta-lactamasa (Goshorn et al., Canc. Res. 53, 2123-2117,1993).
Hasta ahora no fue posible la expresión de una molécula de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos empleando una enzima citoplasmática de E. coli, como la \beta-glucuronidasa, en estado funcionalmente activo, es decir manteniendo la actividad enzimática -como también la capacidad de unión a antígenos de la parte del anticuerpo-. La expresión funcionalmente activa de la mayoría de los anticuerpos o de las moléculas de fragmentos de anticuerpos requiere, por lo general, secuencias señal definidas para la exportación de las moléculas expresadas a través del retículo endoplasmático al medio de cultivo (células animales y levaduras) o bien al periplasma (E. coli). Sólo en el retículo endoplasmático o en el periplasma se dan las condiciones oxidativas necesarias para la formación de los puentes de disulfuro importantes para la actividad funcional. Además, la vía de síntesis secretora con frecuencia es decisiva para el correcto plegamiento tridimensional de la proteína expresada.
Una cepa de E. coli deficiente respecto de la tiorredoxina reductasa, por ejemplo, la cepa AD 494, puede conformar puentes disulfuro en el citoplasma, permitiendo así la expresión intracelular de enzimas secretoras de modo natural como, por ejemplo, la fosfatasa alcalina (Derman et al., Science, Vol. 262, 1744-1747, 1993).
Se encontró ahora que puede producirse la expresión citoplasmática de una molécula Fab como, por ejemplo, del anticuerpo monoclonal (AMC) BW 431/26, en forma funcionalmente activa, es decir manteniendo las propiedades de unión a antígeno en una cepa de E. coli deficiente en tiorredoxina reductasa, como también de anticuerpos completos.
Sorprendentemente, además pudo expresarse en el citoplasma una molécula de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos que se compone, por ejemplo, de la enzima de E. coli \beta-glucuronidasa citoplasmática sin puente disulfuro y, por ejemplo, el Fab BW 431/26 que, a su vez, requiere de puentes intramoleculares de cistina para el plegamiento correcto (Fab BW 431/26 de \beta-glucuronidasa de E. coli), y pudo aislarse del mismo de modo funcional. En este caso, la molécula expresada era soluble y no se necesitaron ensayos de replegamiento. Con ello se abren nuevas posibilidades para la producción rentable de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moléculas de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos para uso terapéutico y diagnóstico.
\newpage
La invención, por lo tanto, se refiere a procedimientos para la expresión por tecnología genética de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moléculas de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos con enzimas citoplasmáticas de mamíferos o de E. coli como participante en la fusión mediante cepas de E. coli con deficiencia de tiorredoxina reductasa y el subsiguiente aislamiento del citoplasma de los productos de expresión. Los fragmentos de anticuerpos preferidos en relación con este procedimiento son fragmentos Fab o también regiones de unión a antígeno (sFv, Plückthun y Skerra, Meth. Enzymol. 178, páginas 497-515, 1991) o proteínas de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos con enzimas citoplasmáticas de E. coli como participante en la fusión, con especial preferencia, con
\beta-glucuronidasa de E. coli como participante en la fusión.
"Derman et al., Science 262, 1744-1745, 1993" revela el uso de diferentes cepas de E. coli con deficiencia de tiorredoxina reductasa para la producción de enzimas como, por ejemplo, fosfatasa alcalina, \beta-lactamasa, \beta-galactosidasa y uroquinasa.
Los siguientes ejemplos explican la invención.
Ejemplo 1 Construcción de un vector de expresión dicistrónico sin secuencias señal
A) Clonación de la \beta-glucuronidasa de E. coli a partir de E. coli RR1:
Con los cebadores E.c.\beta Gluc. for y E.c.\beta Gluc. back se amplificó mediante PCR la secuencia de ADN que codifica la \beta-glucuronidasa de E. coli de la cepa RR1 de E. coli y se clonó en el vector KS a través de Xba I/Hind III (Fig. 1).
B) Clonación de VH/CH1 y el ligador ("linker", pieza de unión) ACM BW-431/26 con la \beta-glucuronidasa de E. coli:
Con los cebadores Fab HC for y Fab HC back, a partir de una construcción existente de ADNc de HC-hum-\beta-glucuronidasa se amplificó por PCR el dominio variable VH y el dominio constante CH1 y se clonó a través de Xba I/Eco RI en el vector KS (Fig. 2). Luego de la verificación de la secuencia de ADN, se unió un fragmento de ADN obtenido a través de la digestión de Xba I/Nco I al vector cortado con XbaI/NcoI de la etapa de clonación A (Fig. 3).
C) Clonación del Fab BW 431/26 de \beta-glucuronidasa de E. coli en pTrc 99:
A la cadena liviana del ACM BW 431/26 existente en el vector de expresión pTrc99 (Amann et al., Gene 69, 301, 1988) se ligó un fragmento Xba I/Hind III, que contiene la correspondiente cadena pesada fusionada a la \beta-glucuronidasa de E. coli (Fig. 4). La construcción resultante presenta la estructura: promotor (trc)-secuencia Shine Dalgarno (SD) -VK/CK ACM BW 431/26 - SD -VH/CH1 ACM BW 431/26 -\beta-glucuronidasa de E. coli - señal de transcripción-terminación (Fig. 5).
Ejemplo 2 Expresión en AD 494
Los cultivos realizados durante la noche de pTrc dicistr. Fab de \beta-glucuronidasa de E. coli en AD 494, descrita en el Ejemplo 1, se diluyeron en una proporción de 1:10 y se incubaron a 25ºC hasta una DO_{600} de 0,7. Luego de la inducción con IPTG 1 mM durante 19 - 22 horas, se incubaron las células durante 1-1½ horas sobre hielo. Luego de la sedimentación y resuspensión de las células en 10 ml de PBS, pH 7,2 por litro de volumen de cultivo, se produjo la ruptura en la prensa "French Press" a 70-105 kg/cm^{2}. La ruptura de las células se clarificó a 20.000 rpm en el rotor SS-34, utilizándose el sobrenadante para los estudios posteriores.
Ejemplo 3 Purificación de la molécula de fusión por cromatografía por afinidad
El sobrenadante de la ruptura celular clarificado sobre un filtro de 2 \mum se purificó mediante cromatografía por afinidad (6 mg de ACM/ml de sefarosa 4B activada con CnBr) a través de la unión de la proteína de fusión a un anticuerpo monoclonal antiidiotípico (BW 2064(34)). La proteína de fusión unida a la columna de afinidad se eluyó a través del desplazamiento del valor del pH (pH 7,2 - pH 5,0). Mediante la ultrafiltración se efectuó luego la concentración del eluato (Filtron Macrosep. Omega NMWL:30 KD). En la SDS-PAGE se analizaron el sobrenadante de la ruptura celular, el flujo, el eluato concentrado y el filtrado de la ultrafiltración. La banda que se observa a aproximadamente 97 KD equivale en su peso molecular a la proteína de fusión esperada de la parte de la cadena pesada del anticuerpo y de la \beta-glucuronidasa de E. coli. La banda que se observa a aproximadamente 70 KD representa la \beta-glucuronidasa endógena, que también fue purificada con la cromatografía por afinidad a través de la formación de heterotetrámeros (véase más abajo) entre la \beta-glucuronidasa expresada de cadena pesada y la \beta-glucuronidasa endógena.
Ejemplo 4 Cromatografía sobre gel TSK-3000
La molécula nativa se estudió en la cromatografía sobre gel TSK-3000 y se determinó el peso molecular con 450 KD. Dado que la glucuronidasa en estado nativo forma un tetrámero, el peso molecular observado equivale al peso molecular teóricamente esperado. A continuación se describe en detalle esta etapa.
De una proteína de fusión purificada por afinidad a través del antiidiotipo se cromatografiaron 400 ng en 25 \mul en una columna TSK con gel G 3000 SW-XL (TOSO HAAS, Nº de pedido 3,5WxN3211, 7,8 mm x 300 mm) en un eluyente apropiado (PBS, pH 7,2, 5 g/l de maltosa, 4,2 g/l de arginina) con un caudal de 0,5 ml/min. La instalación de HPLC de Merck Hitachi (detector UV L-400, bomba L-6210 Intelligent, integrador Chromato D-2500) se propulsó a aproximadamente 20 bar, se determinó la densidad óptica del eluato a 280 nm y luego se recolectaron fracciones de 0,5 ml mediante un colector de fracciones LKB 2111 Multisac, que posteriormente se sometieron a análisis en el ensayo de especificidad de la actividad enzimática (Ejemplo 5). El experimento está representado en la Fig. 6. Basándose en las posiciones de peso molecular de las proteínas de control marcadas con flechas, puede deducirse que la proteína de fusión del Fab de \beta-glucuronidasa de E. coli funcionalmente activa presenta un peso molecular de aproximadamente 450 KD.
Ejemplo 5 Comprobación de las propiedades de unión a antígeno y la actividad enzimática
La capacidad de la proteína de fusión del Fab de \beta-glucuronidasa de E. coli de unirse específicamente al epítope en CEA (antígeno carcino-embrional) definido a través del ACM 431/26 y desarrollar simultáneamente la actividad enzimática de la \beta-glucuronidasa, se mostró en un ensayo de especificidad de la actividad enzimática (documento EP-A-0 501 215 A2, Ejemplo J). El ensayo determina la liberación de 4-metilumbeliferona a partir de 4-metilumbeliferil-\beta-glucurónido a través de la parte de \beta-glucuronidasa de la proteína de fusión, luego de que la proteína de fusión se uniera al antígeno a través de la parte Fab. Los valores de fluorescencia determinados se indican como unidades relativas de fluorescencia (UF) (tabla 1). El ensayo muestra que la proteína de fusión libera una cantidad significativa de metilumbeliferona en las placas recubiertas con CEA.
Como control se usaron placas recubiertas con MEP (mucina epitelial polimórfica). La señal de fluorescencia allí siempre fue inferior a 30 UF.
TABLA 1
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Sobrenadante de ruptura 8183 8149 7531 6631 4560 2509 1019 421,9
celular UF 1:3
Flujo UF 1:1 6548 5231 3222 1477 525,2 214 86,19 46,29
Eluato UF pH 5,0 1:3 7782 7571 6360 4239 1983 815,7 302 113,9
Eluato UF pH 5,0 7904 8106 8036 7153 5802 3618 1651 665,7
ultracon- centrado 1:10
Eluato UF pH 5,0 74,65 172,7 90,23 52,30 38,84 25,79 23,51 19,39
ultrafil- trado 1:1
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Behringwerke Aktiengesellschaft
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Emil-von-Behring-Str. 76
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Marburg
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 35041
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 06421-39-2069
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 06421-39-4558
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Expresión citoplasmática de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moléculas de fusión de fragmentos de anticuerpos en E. coli 
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Enterobacteriaceae: Escherichia coli 
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: KS + E.c.-Beta-Gluc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AAGCTTTCAT TGTTTGCCTC CCTGCTGCGG 
\hfill
30 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
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(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Enterobacteriaceae: Escherichia coli 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: KS + E.c.-Beta-Gluc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCTAGACCT GGTACGTCCT GTACAAACCC CA 
\hfill
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: pAB Stop ADN-c HC/hu-Beta-Gluc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGATCCCATG GAACCAGAAC CAGAACCGAG CTCAACTCTC TTGTCCACCT 
\hfill
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGGTGTT 
\hfill
57 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: pAB Stop ADN-c HC/hu-Beta-Gluc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCTAGATAAC GAGGGCAAAA AATGGAGGTC CAACTGCAGG AGAGC 
\hfill
45 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3169 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Enterobacteriaceae: Escherichia coli 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: pRAJ210
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: pTrc99 dicistr. Fab/E.c.-Beta-Gluc
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CÓDIGO: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 3..641
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CÓDIGO: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 666..3162
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
1
2
3
4 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 213 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
5
6 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 832 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
7
8
9

Claims (4)

1. Procedimiento para la expresión por tecnología genética de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o moléculas de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos con enzimas citoplasmáticas de mamíferos o de E. coli como participante en la fusión, caracterizado porque se emplean cepas de E. coli con deficiencia de tiorredoxina reductasa y se aíslan los productos de expresión del citoplasma.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se expresan fragmentos Fab o regiones de unión a antígeno (sFv).
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de fusión de enzimas en fragmentos de anticuerpos en el anticuerpo está dirigida contra células tumorales y la parte enzimática está en condiciones de separar los "profármacos" no tóxicos en "fármacos" tóxicos.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la parte del anticuerpo fue humanizada y la parte enzimática es una enzima citoplasmática humana.
ES96103913T 1995-04-11 1996-03-13 Expresion citoplasmatica de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moleculas de fusion de fragmentos de anticuerpos en e. coli. Expired - Lifetime ES2203654T3 (es)

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