ES2202576T3 - Fosfatidil-oligogliceroles. - Google Patents

Fosfatidil-oligogliceroles.

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ES2202576T3 ES97903308T ES97903308T ES2202576T3 ES 2202576 T3 ES2202576 T3 ES 2202576T3 ES 97903308 T ES97903308 T ES 97903308T ES 97903308 T ES97903308 T ES 97903308T ES 2202576 T3 ES2202576 T3 ES 2202576T3
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Abstract

LA INVENCION TRATA DE COMPOSICIONES ESPECIFICAS DE FORMULA GENERAL (A) QUE SE EMPLEAN PARA FORMAR LIPOSOMAS CON UN PERIODO DE VIDA MEDIA EN SANGRE PROLONGADO.

Description

Fosfatidil-oligogliceroles.
El invento se refiere a compuestos de fosfatidilo, que contienen un radical hidrófilo definido, así como a liposomas, que tienen una prolongada duración de vida útil.
Los liposomas habituales tienen en el suero un período de tiempo de permanencia de hasta 5 horas. En particular, en el caso de la utilización de liposomas como vehículos para sustancias activas farmacéuticas, es deseable, no obstante, un período de tiempo de permanencia lo más largo que sea posible de los liposomas en la circulación sanguínea.
Conforme a ello, se desarrollaron los denominados "liposomas de reserva (del inglés stealth)", que presentan una prolongada duración de vida útil. Estos "liposomas de reserva" están constituidos sobre la base de compuestos de fosfatidilo, que contienen un radical de polietilen-glicol prolongado. El radical de polietilen-glicol se manifestó como sumamente eficaz para la pretendida duración de vida útil prolongada en el caso de pesos moleculares comprendidos entre 2.000 y 3.000. Una desventaja esencial de estos "liposomas de reserva" o bien de los compuestos de fosfatidilo con un radical de polietilen-glicol se encuentra, no obstante, en el hecho de que no se trata de compuestos exactamente definidos, puesto que estos radicales de polietilen-glicol tienen diversas longitudes de cadena.
Además, por Maruyama y colaboradores (Int. J. Pharmac. 111 (1994), 103-107) se propuso la utilización de dipalmitoíl-fosfatidil-poligliceroles con el fin de prolongar la circulación de los liposomas. Puesto que, sin embargo, se partía de poligliceroles técnicos, tampoco en este caso se obtuvieron productos uniformes de ningún tipo. Los poligliceroles técnicos, que se componen de una mezcla a base de poligliceroles con una diversa longitud de cadena y de monoglicerol, y que son caracterizados por su peso molecular medio, fueron fosfatidilados por medio de la fosfolipasa D. Con los productos así obtenidos se pudo observar sin embargo solamente un pequeño aumento de la duración de vida útil de los liposomas en sangre.
A partir del documento de solicitud de patente de la República Democrática Alemana DD-A-240020 se conoce un procedimiento para la preparación de fosfolípidos farmacológicamente activos. A estos compuestos les falta, sin embargo, el radical hidrófilo definido, que es característico para los compuestos del invento. Esta publicación no se ocupa de liposomas.
La misión del presente invento fue poner a disposición compuestos que aumenten la duración de vida útil de los liposomas, y que al mismo tiempo presenten una composición exactamente señalable.
El problema planteado por esta misión se resuelve de acuerdo con el invento por medio de un compuesto de la Fórmula general (A)
1
en la que R^{1} y R^{2} representan, independientemente uno de otro, hidrógeno, un radical alquilo o acilo saturado o insaturado, que eventualmente puede estar ramificado o/y sustituido, R^{3} representa hidrógeno o un radical alquilo,
n es = 0 ó 1,
x representa un número entero de 1 a 4, y
m representa un número entero de 2 a 10, en el caso de que n sea = 0, o un número entero de 1 a 10, en el caso de que n sea = 1, así como es 1, en el caso de que x sea mayor que 1,
realizándose, en el caso de que n sea = 0, que el compuesto es uniforme en más de un 90% en lo que respecta al valor de m, exceptuando los compuestos en los que R^{1} = hexadecilo, R^{2} = metilo, n = 1, x = 1 y m = 1.
La constitución escalonada, en la que está basada este invento, de los radicales hidrófilos de los compuestos de fosfatidilo de la Fórmula (A) hace posible obtener una composición exactamente definida de los compuestos.
Por lo tanto, en el caso del compuesto de acuerdo con el invento de la Fórmula (A) no se trata de una mezcla de moléculas diferentes, que tienen una composición y una longitud de cadena indeterminadas, sino que se puede obtener deliberadamente una estructura deseada. Esto significa que, por ejemplo, en el caso de que el producto deseado sea un derivado de triglicerol, en el que por consiguiente x = 1 y m = 3 en la Fórmula (A), es pequeño el contenido de derivados de monoglicerol, diglicerol, tetraglicerol y oligogliceroles superiores. Se obtiene preferiblemente un derivado de glicerol con una longitud de cadena determinada, que está esencialmente libre de derivados de glicerol con otra distinta longitud de cadena. En particular, el contenido de derivados de monoglicerol es pequeño y asciende a menos que 5%, preferiblemente a menos que 1%, y de manera especialmente preferida, a menos que 0,1%, referido al deseado derivado de un oligoglicerol.
De acuerdo con el invento, el compuesto de la Fórmula (A) representa un compuesto uniforme que tiene una estructura definida. Preferiblemente, el compuesto es uniforme en más de un 95%, de manera especialmente preferida en más de un 99%, en lo que respecta al valor de m. No obstante, también es posible poner a disposición el compuesto con una uniformidad de más que 99,9% en lo que respecta al valor de m.
Preferiblemente, en el caso del compuesto se trata de derivados de oligogliceroles con 2 a 5 unidades de glicerol, preferiblemente con 2 a 4 unidades de glicerol. En este caso, se trata preferiblemente de radicales de oligogliceroles lineales enlazados en 1.3.
Los radicales R^{1} y R^{2} representan, de acuerdo con el invento, de manera preferida, independientemente uno de otro, hidrógeno, un radical alquilo C_{1}-C_{24} o acilo C_{1}-C_{24} saturado o insaturado, preferiblemente hidrógeno o un radical alquilo C_{8}-C_{24} o acilo C_{8}-C_{24} saturado o insaturado, realizándose que por lo menos uno de los radicales R^{1} y R^{2} representa un radical acilo.
El radical R^{3} representa preferiblemente hidrógeno o un radical alquilo con 1 a 4 átomos de carbono.
El compuesto de la Fórmula (A) puede presentarse en forma de un racemato, que contiene un enlace con fosfo-rac-(1 ó 3)-oligoglicerol o en forma de un isómero estéreamente especifico. Los estereoisómeros pueden tener un enlace con fosfo-sn-1-oligoglicerol o un enlace con fosfo-sn-3-oligoglicerol. La formación del enlace estéreamente especifico se puede llevar a cabo análogamente al procedimiento descrito en la bibliografía documento de solicitud de patente alemana DE 31 30 867 A1; H. Eibl y colaboradores, Chem. Phys. Lipids, 28 (1981), 1-5, 41 (1986), 53-63 y 47 (1988, 47-53).
Otro objeto adicional del invento del invento son liposomas, que contienen fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos, eventualmente colesterol y de 1 a 50% en moles de un compuesto de la Fórmula general (A)
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o sus sales, realizándose que el colesterol, los fosfolípidos, los alquil-fosfolípidos y el compuesto de la Fórmula (A) proporcionan en común 100% en moles, en donde R^{1} y R^{2} representan, independientemente uno de otro, hidrógeno, un radical alquilo o acilo saturado o insaturado, que eventualmente puede estar ramificado o/y sustituido.
R^{3} representa hidrógeno o un radical alquilo,
n es = 0 ó 1,
x representa un número entero de 1 a 4,
m representa un número entero de 2 a 10, en el caso de que n sea = 0, o un número entero de 1 a 10, en el caso de que n sea = 1, así como es 1, en el caso de que x sea mayor que 1, realizándose, en el caso de que n sea = 0, que el compuesto (A) es uniforme en más de un 90% en lo que respecta al valor de m.
Los liposomas de acuerdo con el invento tienen un periodo de tiempo de semidescomposición (o de semivida) en el suero de 18 a 20 horas. En este caso, se encontró sorprendentemente una disminución lineal de la concentración de liposomas en la sangre.
De acuerdo con el invento, se prefiere el compuesto (A) con una uniformidad mayor que 95%, de manera especialmente preferida mayor que 99%, en lo que respecta al valor de m. Sin embargo, también es posible utilizar el compuesto (A) en una forma prácticamente pura, con una uniformidad mayor que 99,9% en lo que respecta al valor de m.
Preferiblemente, los liposomas contienen un compuesto de la Fórmula (A), en la que x es = 1 y m es un número entero de 2 a 5, de manera especialmente preferida un número entero de 2 a 4.
Los radicales R^{1} y R^{2} del compuesto de la Fórmula(A) contenido en los liposomas, pueden representar, independientemente uno de otro, hidrógeno, un radical alquilo C_{1}-C_{24} o acilo C_{1}-C_{24} saturado o insaturado, preferiblemente hidrógeno o un radical alquilo C_{8}-C_{24} o acilo C_{8}-C_{24} saturado o insaturado. En el caso de los sustituyentes se trata de un radical que no interfiere en la preparación. R^{3} representa preferiblemente hidrógeno o un radical alquilo C_{1}-C_{4}.
El compuesto de la Fórmula (A) se puede presentar en los liposomas en forma de una mezcla racémica, por lo tanto con un enlace de fosfo-rac-(1 ó 3)-oligoglicerol. Preferiblemente, éste se presenta en una forma estéreamente especifica con una unión con fosfo-sn-1-oligoglicerol o con un enlace de fosfo-sn-3-oligoglicerol.
De manera preferida, por lo menos uno de los radicales R^{1} y R^{2} de la Fórmula (A) representa un grupo acilo.
Los liposomas, en los que se presenta el compuesto de la Fórmula (A) con n = 0, tienen preferiblemente una carga negativa en exceso. No obstante, también se pueden preparar liposomas a partir de compuestos de la Fórmula (A), en los que n es = 1. En este caso, los liposomas no tienen preferiblemente ninguna carga en exceso o tienen una carga positiva en exceso.
Los liposomas contienen, junto a un compuesto de la Fórmula (A), fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos, así como eventualmente colesterol. Preferiblemente, se emplean de 5 a 15% en moles del compuesto de la Fórmula (A). En el caso de que los liposomas no tengan ninguna carga en exceso, se prefiere una composición de 0 a 70% en moles de colesterol, de 1 a 50% en moles de un compuesto de la Fórmula (A), y fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos. En el caso de una carga negativa en exceso, una composición preferida de los liposomas se compone de 0 a 70% en moles de colesterol, 1 a 15% en moles de un compuesto de la Fórmula (A), así como de fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos. Una proporción más alta de compuestos de la Fórmula (A)con una carga negativa en exceso, conduciría a la inestabilidad de los liposomas en la circulación sanguínea. De manera preferida, los liposomas comprenden de 35 a 43% en moles, de modo especialmente preferido de 38 a 42% en moles de colesterol, de 5 a 15% en moles de un compuesto de la Fórmula (A), y fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos.
Los fosfolípidos o/y los alquil-fosfolípidos pueden ser, por ejemplo, diacil-fosfo-gliceroles con una estructura definida. Por lo general, estos constituyentes de los lípidos se pueden emplear como compuestos que tienen una estructura definida.
En el caso de que x sea > 1, el radical -CH_{2}(-CHOH)_{x}-CH_{2}-OH procede preferiblemente de azúcar-alcoholes, que para x = 2, tienen 4 grupos hidroxilo, para x = 3, tienen 5 grupos hidroxilo, y para x = 4, tienen 6 grupos hidroxilo. Ejemplos de tales radicales son derivados de manita para x = 4, derivados de lixita para x = 3 y derivados de treita para x = 2.
Los liposomas de acuerdo con el invento tienen un periodo de tiempo de semidescomposición en la circulación sanguínea manifiestamente elevado. Preferiblemente, su periodo de tiempo de semidescomposición es de por lo menos 10 horas, de manera especialmente preferida de más que 12 horas. Se obtuvieron unos periodos de tiempo de semidescomposición de los liposomas de acuerdo con el invento, comprendidos entre 18 y 20 horas. Sorprendentemente, en este caso, se comprobaron unas curvas absolutamente lineales de disminución de las concentraciones de lípidos en sangre. De manera preferida, de acuerdo con el invento, después de 6 horas se encuentra en la sangre más de un 50% y, de manera especialmente preferida, más de un 60% de la cantidad añadida de liposomas.
Como propiedad especialmente sorprendente de los liposomas de acuerdo con el invento se ha manifestado su enriquecimiento preferente en el bazo. En dependencia de la composición y del tamaño de los liposomas, se consiguieron ya unos factores de enriquecimiento en el bazo que son mayores en un múltiplo de aproximadamente 25 en comparación con los valores en el hígado. En este caso, el enriquecimiento en el bazo sube, en comparación con el hígado, con un valor creciente para m en la Fórmula A y con un tamaño creciente de los liposomas. Así, el grado de enriquecimiento en el bazo aumenta en un múltiplo en la transición desde los SUV's (del inglés "Small 
 \hbox{Unilamellar}
Liposomes", = liposomas unilaminares pequeños; con un diámetro de aproximadamente 60 nm) a los LUV's (del inglés "Large Unilamellar Liposomes", liposomas unilaminares grandes; con un diámetro de aproximadamente 190 nm). El enriquecimiento preferido en el bazo aumenta también con un número creciente de átomos de carbono en R^{1} y R^{2}.
Además de esto, se encontró que los liposomas de acuerdo con el invento se enriquecen en determinados tejidos tumorales. Así, se encontró, que un enriquecimiento de tal orden tiene lugar en el caso del carcinoma de mama inducido con metil-nitroso-urea (carcinoma de MNU).
Además, los liposomas de acuerdo con el invento pueden contener adicionalmente una o varias sustancias activas farmacéuticas.
Como sustancias activas se pueden utilizar, por regla general, todas las sustancias activas que se pueden incorporar mediante liposomas de algún modo en el plasma. Los grupos preferidos de sustancias activas son, por una parte, agentes citostáticos, en particular antibióticos de antraciclina, tales como, por ejemplo, doxorrubicina, epirrubicina o daunomicina, prefiriéndose especialmente doxorrubicina. Otros agentes citostáticos preferidos son idarrubicina, hexadecil-fosfocolina, 1-octadecil-2-metil-rac-glicero-3-fosfocolina, 5-fluoro-uracilo, complejos con cis-platino tales como carboplatino y novantrón, así como mitomicinas.
Otros grupos preferidos de sustancias activas son los de sustancias moduladoras de inmunidad tales como, por ejemplo, citocinas, prefiriéndose entre éstas, a su vez, los interferones y en particular el \alpha-interferón, sustancias activas antimicóticamente (p.ej. amfotericina B) y sustancias activas contra enfermedades provocadas por protozoos (malaria, infecciones causadas por tripanosomas y leishmanias). Se prefiere igualmente el taxol como sustancia activa.
Otro grupo preferido de sustancias activas es el de las sustancias activas líticas, tales como las que se describen en el documento DE 41 32 345 A1. El contenido de esta solicitud de patente se incluye en la presente por su referencia. Se prefieren mitefosina, edelfosina, ilmofosina, así como SRI62-834.
Otro objeto adicional del presente invento es, por consiguiente, la utilización de los liposomas de acuerdo con el invento para la preparación de un agente antitumoral, siendo doxorrubicina la sustancia activa especialmente preferida.
Otro objeto del presente invento es la utilización de los liposomas de acuerdo con el invento para la preparación de un agente destinado a influir sobre la proliferación de células, siendo la sustancia activa una citocina, de manera especialmente preferida, \alpha-interferón.
Otro objeto del invento del invento es una composición farmacéutica, que contiene los liposomas anteriormente descritos e, incorporadas en los liposomas, una o varias sustancias activas farmacéuticas eventualmente en común con sustancias diluyentes, coadyuvantes, de vehículo y de relleno farmacéuticamente usuales.
Los liposomas de acuerdo con el invento se preparan de acuerdo con métodos en sí conocidos con dispositivos corrientes para ello. Típicamente, una solución que contiene los diversos componentes del liposoma, inclusive de 1 a 50% en moles de un compuesto de la Fórmula (A), se puede transformar en una suspensión de lípidos, que es comprimida entonces bajo una alta presión a través de boquillas o de discos perforados, pudiéndose regular a través del tamaño de las aberturas en el disco perforado el tamaño de los liposomas obtenidos. Medidas apropiadas para la transferencia de una suspensión de lípidos a liposomas son conocidas por un experto en la especialidad. Preferiblemente, de un 5 a 15% en moles de un compuesto de la Fórmula general (A) con un 35 a 43% en moles de colesterol y con un 42 a 60% en moles de fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos se transforman en una suspensión de lípidos, que luego se transforma en liposomas mediante medidas apropiadas, de una manera en sí conocida.
Tales procedimientos conocidos se pueden utilizar también para la preparación de una formulación farmacéutica, que contiene los liposomas de acuerdo con el invento y una o varias sustancias farmacéuticamente activas. Para la incorporación de sustancias activas insolubles en agua, la sustancia activa se disuelve en este caso en común con los constituyentes lipídicos, mientras que para la incorporación de sustancias activas solubles en agua, la película de lípidos se mezcla con una solución acuosa, que contiene la sustancia activa soluble en agua.
Los compuestos de acuerdo con el invento de la Fórmula (A) se pueden preparar para n = 1 mediante enlace de un oligoglicerol definido, a través del grupo amino, con una fosfatidil-etanol-amina. En este caso, se obtienen compuestos neutros, es decir compuestos sin ninguna carga en exceso. En el caso de los oligogliceroles definidos, empleados para el enlace, se trata de compuestos de la Fórmula (B).
Para la preparación de compuestos de la Fórmula general (A), en la que n es = 0, se enlaza un oligoglicerol definido con un fosfatidil-glicerol. Además, se pueden preparar compuestos de la Fórmula general (A) con n = 0, mediante el recurso de que se enlaza un oligoglicerol definido o un azúcar C_{4}-C_{6}-alcohol, mediando utilización de un agente de fosforilación, con un alcohol de la fórmula CH_{2}-OR^{1}-CHOR^{2}-CHOH. Preferiblemente, como agente de fosforilación se utiliza POCl_{3}.
La preparación de fosfolípidos a partir de diacil-gliceroles se describe en la bibliografía (documento DE 32 39 817 A1; P. Woolley y colaboradores, Chem. Phys. Lipids 47 (1988), 55-62; H. Eibl y colaboradores, Chem. Phys. Lipids 47 (1988), 63-68) y se puede aplicar de una manera correspondiente.
Mediante los procedimientos anteriormente descritos se puede formar un compuesto racémico, que contiene un enlace de fosfo-rac-(1 o 3)-oligoglicerol. Preferiblemente, mediante los procedimientos anteriormente descritos se pueden formar compuestos estéreamente específicos, que tienen un enlace de fosfo-sn-1-oligoglicerol o un enlace de fosfo-sn-3-oligoglicerol. De manera preferida, para la preparación de un compuesto de la Fórmula (A), se emplea un oligoglicerol lineal con una longitud de cadena definida.
Un objeto adicional del invento es un oligoglicerol protegido de la Fórmula (B),
3
en la que Y representa un número entero de 1 a 9 y X representa un grupo bencilo, alquilo o tetrahidropiranilo, exceptuando el caso de que X = metilo cuando Y = 1 (conocido por la cita bibliográfica de Tetrahedron, 1995, 51 (16), 4.723-4.732, compuesto 11). De manera preferida, Y es un número entero de 1 a 3. De acuerdo con el invento, se consigue obtener oligogliceroles enlazados en 1.3, en una forma prácticamente pura. Se pueden preparar oligogliceroles que tienen una longitud de cadena determinada, que prácticamente no contienen impurezas de oligogliceroles con otra longitud distinta de cadena. Además, los oligogliceroles utilizados de acuerdo con el invento prácticamente no presentan ninguna impurificación por el glicerol monómero. Por lo tanto, se trata de compuestos uniformes que tienen una estructura definida.
En el oligoglicerol, X puede representar otro grupo protector apropiado. Además, en lugar de acetona, puede estar presente también otro grupo protector, en particular otra cetona distinta.
Además de esto, el invento comprende alquil-oligogliceroles de la Fórmula (C),
4
en la que Y representa un número entero de 0 a 8, preferiblemente un número entero de 1 a 3, y uno de los radicales X o Z representa un radical alquilo saturado o insaturado y el otro de los radicales representa hidrógeno, exceptuando Y = 0, cuando X = metilo (conocido por la cita bibliográfica de Tetrahedron, 1995, 51 (16), 4.723-4.732, compuesto 10), o uno de los radicales X o Z es C_{16}H_{33} (conocido por el documento DE-A-36 19 883, página 33). También en el caso de los alquil-oligogliceroles se trata de compuestos uniformes que tienen una estructura definida.
La preparación de oligogliceroles, oligogliceroles protegidos y alquil- oligogliceroles presenta un interés especial, puesto que, con ayuda de estas sustancias de partida, se pueden obtener una serie de sustancias coadyuvantes importantes y nuevas para la solubilización y para el mejoramiento de la permeación a través de membranas. La preparación de derivados de fosfatidil-oligogliceroles de la Fórmula (A), que llevan grupos hidroxilo adicionales en la zona polar, presenta un interés especial para prolongar el período de tiempo de vida útil de los liposomas en la sangre.
Por causa del enriquecimiento preferente en el bazo de los liposomas de acuerdo con el invento, éstos se adecuan generalmente para la introducción selectiva de sustancias en el bazo. En este caso, se puede tratar de medicamentos, agentes de contraste o similares. En particular, esto presenta importancia para el mejoramiento de la calidad de las vacunas, puesto que el bazo es especialmente importante para la formación de anticuerpos en el marco del sistema inmunitario. Igualmente, el enriquecimiento comprobado de los liposomas de acuerdo con el invento en un tejido tumoral presenta importancia para la aportación específica de sustancias activas, agentes de contraste y similares a uno de tales tejidos tumorales.
El invento se ilustra más detalladamente con ayuda de los siguientes Ejemplos en unión con los dibujos adjuntos. En los dibujos representan:
La Figura 1 una representación gráfica, que representa la distribución de los liposomas de acuerdo con el invento en el bazo y en el hígado por órgano total.
La Figura 2 es una representación gráfica, que ilustra la distribución de los liposomas de acuerdo con el invento en el bazo y en el hígado por gramo de órgano.
La Figura 3 es una representación gráfica, que ilustra la evolución de las curvas del nivel en sangre en función del tiempo para diversos liposomas de acuerdo con el invento.
Ejemplo 1
En un ensayo con animales se utilizaron liposomas que se componían de 40% en moles de colesterol, 10% en moles de fosfatidil-glicerol y 50% en moles de dipalmitoíl-lecitina. En este caso, se estableció un tiempo de semidescomposición en el suero de 4 horas con una curva de disminución típica, es decir al principio una disminución muy rápida y más delante una disminución más lenta.
Se prepararon liposomas con la misma composición, en los que se reemplazó el fosfatidil-glicerol por un fosfatidil-glicerol G_{2} de acuerdo con el invento. Se obtuvo un periodo de tiempo de semidescomposición en el suero de 18 a 20 horas, con una curva de disminución absolutamente lineal. La curva de disminución lineal se encontró de manera independiente del tamaño de los liposomas preparados. Con liposomas de 50 nm y con liposomas de 150 nm se encontró la misma disminución lineal de la concentración de liposomas en el suero. Además, se comprobó la disminución lineal de la concentración de liposomas en la sangre con diversas concentraciones iniciales.
Ejemplo 2 Proporción porcentual de los liposomas en la circulación sanguínea después de 6 horas
Se prepararon liposomas de acuerdo con el invento a partir de una mezcla de dipalmitoíl-sn-G-3-PC, colesterol y dipalmitoíl-sn-G-3-PG_{Y} en la relación molar de 45 : 45 : 10. Las proporciones porcentuales de la cantidad de liposomas añadida originalmente, que se encontró en la sangre después de 6 horas, se reproducen en la Tabla 1. Como comparación se indican los valores obtenidos por Maruyama y colaboradores en las mismas condiciones para el sistema de la mezcla de diestearil-sn-G-3-PC, colesterol y dipalmitoíl-sn-G-3-PG_{Y1} 45 : 45 : 10. Se pone de manifiesto un claro aumento de la cantidad encontrada de liposomas en comparación con el estado de la técnica.
TABLA 1
Y Ejemplo comparativo Y Ejemplo del invento
0 18% 0 21%
2 19% 2 80%
3 - 3 82%
4 20% 4 56%
Ejemplo 3
Liposomas a base de una mezcla de 1.2-dipalmitoíl-sn-glicerol-3-fosfocolina, 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfo-glicero-glicerol (PG_{n}) y colesterol en la relación molar 4 : 1 : 5 se doparon con inulina marcada con tritio. Estos liposomas se administraron a ratas en una dosificación de 100 \mumol de lípido por kg de rata y, después de 72 horas, se determinó la distribución de estos liposomas por los órganos, de bazo e hígado, mediante medición de la radiactividad. Los pesos de órganos de hígado variaban entre 9 y 10 g, los pesos de órganos de bazo variaban entre 0,6 y 0,7 g. La Figura 1 del dibujo adjunto muestra que con un valor para el hígado más alto en un múltiplo de aproximadamente 15 en el caso de la utilización de SUV's, la distribución aumenta considerablemente en favor del bazo con un número adicional de unidades de glicerol (x = 1; m = 1 a 4 en la Fórmula A).
En la Figura 2 se reproduce la absorción de liposomas en los órganos, bazo e hígado, por gramo de órgano. Según ésta, el bazo contiene, en el caso de que n sea = 4, una concentración de liposomas aproximadamente 9 veces más alta que el hígado, y para m = 1 el factor de enriquecimiento es igual a 4. Las Figuras 1 y 2 muestran, además, en la última columna el efecto del tamaño de los liposomas. Para LUV's con un diámetro de 190 nm resulta a partir de esto un refuerzo adicional del enriquecimiento en el bazo, de tal manera que ya en el caso de que n sea = 2, el factor de enriquecimiento es igual a 24. Con estos liposomas prácticamente ya no se alcanza el órgano hígado.
Ejemplo 4 Preparación de compuestos de la Fórmula (A)
Ejemplo 4a
Producto intermedio central de la Fórmula I
Los oligogliceroles diglicerol (G_{2}), triglicerol (G_{3}) y tetraglicerol (G_{4}) se pueden preparar a partir de un producto intermedio central, fácilmente conseguible, de la Fórmula I, el 1.2-isopropiliden-rac-glicero-3.1-rac-glicero-3-alil-éter (véase el Esquema A).
Esquema A Oligogliceroles de la Fórmula I
5
I
1) transposición de alilo a propenilo
2) desdoblamiento en condiciones ácidas
\hskip-1cm -----------------------------------G_{2}
1)1) epoxidación
2)2) desdoblamiento en condiciones ácidas
\hskip-1.5cm ---------------------------------------G_{3}
1) epoxidación
2) apertura con alcohol alílico
3) epoxidación
4) desdoblamiento en condiciones ácidas
\hskip-2cm ---------------------------------------------G_{4}
El producto intermedio descrito en la Fórmula I se puede obtener en grandes cantidades a partir del alil-glicidil-éter, adquirible en el comercio, mediante apertura del anillo catalizada por NaOH, con el 1.2-isopropiliden-rac-glicerol, que se puede adquirir igualmente en el comercio de productos químicos:
Apertura del epóxido con alcoholes (Ejemplo general) Preparación del producto intermedio central de la Fórmula I:
1.2-isopropiliden-rac-G_{1}-3.1-0.0-3-0-alil-rac-G_{2}
(Esquema pasa a página siguiente)
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6
1.2-isopropiliden-rac-glicerol (PM (peso molecular)132,16; 16 moles - 2.115 g) se mezcla con cantidades catalíticas de NaOH (PM 40.00; 0,6 moles - 24 g) y se lleva a disolución mediando agitación y calentamiento a 80ºC. A 80ºC se añade gota a gota alil-glicidil-éter (PM 114,14; 6 moles - 685 g) en un periodo de tiempo de 2 horas y la tanda se agita todavía durante 2 horas más a 80ºC. En ese momento, ha reaccionado el epóxido totalmente (Rf 0,8 en éter) mediando formación del eslabón G_{3} (Rf 0,60 en dietil-eter). El isopropiliden-rac-glicerol en exceso tiene un valor de Rf de 0,65 en dietil-eter y es eliminado a 75ºC / 10 mbar desde la mezcla de reacción. El residuo se mezcla con 1 l de diisopropil-éter y se extrae dos veces, cada vez con 1 l de NaCl (solución al 1% en H_{2}O). La fase orgánica se concentra por evaporación y se destila (Kpi_{10} -1 mbar 125ºC).
El rendimiento de producto puro, 1.2-isopropiliden-rac-G_{1}-3.1-0.0-3-0-alil-rac-G_{2}, (PM 246,30), es de 1.025 g (aproximadamente 70%).
En lugar de 1.2-isopropiliden-rac-glicerol, se pueden hacer reaccionar otros alcoholes primarios, así como alcohol alílico y alcohol bencílico, de acuerdo con las condiciones indicadas. Correspondientemente, se pueden emplear también otros epóxidos de la misma manera.
El producto intermedio de la Fórmula I se puede obtener también a partir de 1.2-isopropiliden-rac-glicero-3-glicidil-éter mediante apertura del anillo catalizada por NaOH con alcohol alílico. En este caso se tiene que preparar en primer lugar 1.2-isopropiliden-rac-glicero-3-glicidil-éter a partir de alil-glicerol.
\newpage
Ejemplo 4b
Alquilación de grupos hidroxilo primarios o secundarios (Ejemplo general) Preparación de un producto intermedio central
1.2-isopropiliden-rac-G_{1}-3.1-0.0-2-0-bencil-3-0-alil-rac-G_{2}
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El producto intermedio central, 1.2-isopropiliden-rac-G_{1}-3.1-rac-G_{2}-0-alil-éter (PM 246,30; 0,5 moles - 123 g) se disuelve en 500 ml de tetrahidrofurano, se mezcla con cloruro de bencilo (0,6 moles - 76 g) y se hierve a reflujo. Se deja entrar gota a gota lentamente terc.-butilato de K (0,7 moles - 79 g), disuelto en 500 ml de tetrahidrofurano. La reacción está terminada después de hervir a reflujo durante 30 minutos (control por DC (cromatografía de capa fina) - valores de Rf en etil-éter: educto (producto de partida), Rf = 0,1; producto (producto final), Rf = 0,4). La mezcla de reacción se reúne con 1 l de diisopropil-éter y con 1 l de una solución al 1% de NaCl, se agita, y la fase superior se concentra por evaporación rotatoria. El producto se puede utilizar ulteriormente de modo directo o se puede obtener mediante cromatografía en presencia de gel de sílice en una forma pura, con un rendimiento de aproximadamente 90%.
Fórmula empírica C_{19}H_{28}O_{5} (PM 336,42)
calc.: C, 67,83; H, 8,39; O, 23,79
enc.: C, 67,78; H, 8,34; O, -
En lugar de cloruro de bencilo se pueden utilizar también bromuro de bencilo, cloruro de alilo o bromuro de alilo, así como los halogenuros o mesilatos de alcoholes primarios. En particular, los productos de la reacción de grupos hidroxilo primarios o secundarios con mesilatos de alquilo conducen a los compuestos dianas deseados, con altos rendimientos (> 90%).
\newpage
Ejemplo 4c
Secuencia de síntesis O-alil-éter \rightarrow 0-propenil-éter \rightarrow alcohol (Ejemplo general) Preparación de 2-0-bencil-rac-G_{1}-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{2}
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Transposición
El 1.2-isopropiliden-rac-G_{1}-3.1-0.0-2-0-bencil-3-0-alil-rac-G_{2} (0,5 moles - 168 g) se disuelve en 500 ml de DMF y se mezcla con terc.-butilato de K (0,7 moles - 79 g). Se calienta con agitación a 110 a 115ºC (temperatura en la mezcla de reacción), se mantiene la reacción durante 15 minutos a esta temperatura, y la mezcla de reacción se enfría a 20ºC. Después de haber añadido 500 ml de diisopropil-éter y 500 ml de NaCl al 1%, se retira la fase superior de diisopropil-éter y se elimina el disolvente en vacío (control por DC - valores de Rf en una mezcla de hexano y diisopropil-éter (1:1) : educto, Rf = 0,2; producto, Rf = 0,4).
\newpage
Separación del grupo protector propenilo
El residuo de la reacción anterior, aproximadamente 168 g, se disuelve en 500 ml de metanol y se hierve a reflujo, después de haber añadido 50 ml de HCl 1 M. Después de 60 minutos, ha terminado la reacción (control por DC en una mezcla de hexano y diisopropil-éter (1:1) : educto, Rf = 0,4; producto, Rf = 0). El rendimiento de rac-G_{1}-3.1-rac-G_{2}-2-0-bencil-éter es > 90%. En las condiciones ácidas de la separación del propenilo, se elimina también el grupo protector isopropilideno. En caso necesario, el grupo protector isopropilideno se puede introducir de nuevo en la posición 1.2.
Introducción del grupo protector isopropilideno
El residuo de la reacción anterior (aproximadamente 0,5 moles) se disuelve en 300 ml de THF, se mezcla consecutivamente con 2.2-dimetoxi-propano (0,5 moles - 52 g) y 0,2 g de H_{2}SO_{4} en 10 ml de THF, y se agita durante 2 horas a 25ºC. La mezcla de reacción se neutraliza con una solución saturada de Na_{2}CO_{3}, el material precipitado se filtra con succión y el material filtrado se concentra por evaporación rotatoria con xileno en vacío y se libera de esta manera del agua. El producto se purifica mediante cromatografía en gel de sílice Kieselgel 60 (Merck, tamaño de granos 0,2 - 0,5 mm) (valores de Rf en dietil-éter : educto, Rf = 0,0; producto, Rf = 0,4). Se obtienen 121 g del producto intermedio, que es importante para la preparación de fosfatidil-digliceroles (entramado fundamental con G_{2}).
Entramado fundamental con G_{2}
2-0-bencil-rac-G_{1}-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{2} (rendimiento 82%).
Fórmula empírica: C_{16}H_{24}O_{5} (PM 296,36)
calc.: C, 64,85; H, 8,16; O, 26,99
enc.: C, 64,82; H, 8,14; O, -
De manera correspondiente, se pueden preparar los productos intermedios con unas proporciones más altas de oligogliceroles, que son importantes para la preparación de fosfatidil-oligogliceroles. A continuación, se han recopilado algunos datos analíticos acerca de productos intermedios centrales:
Entramado fundamental con G_{3}
2-0-bencil-rac-G_{1}-1.3-0.0-2-0-bencil-rac-G_{2}-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{3}
Fórmula empírica: C_{26}H_{36}O_{7} (PM 460,56)
calc.: C, 67,81; H, 7,88; O, 24,32
enc.: C, 67,75; H, 7,85; O, -
Entramado fundamental con G_{4}
2-0-bencil-rac-G_{1}-[1.3-0.0-2-O-bencil-G]2-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{4}
Fórmula empírica: C_{36}H_{48}O_{9} (PM 624,77)
calc.: C, 69,21; H, 7,74; O, 23,05
enc.: C, 69,17; H, 7,69; O, -
Entramado fundamental con G_{6}
2-0-bencil-rac-G_{1}-[1.3-0.0-2-0-bencil-G]4-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{6}
Fórmula empírica: C_{56}H_{72}O_{13} (PM 953,172)
calc.: C, 70,57; H, 7,61; O, 21,82
enc.: C, 70,56; H, 7,54; O, - 
\newpage
Entramado fundamental con G_{8}
2-0-bencil-rac-G_{1}-[1.3-0.0-2-0-bencil-G]6-13-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{8}
Fórmula empírica: C_{76}H_{96}O_{17} (PM 1.281,58)
calc.: C, 71,23; H, 7,55; O, 21,22
enc.: C, 71,15; H, 7,53; O, -
Ejemplo 4d
Sustancias, que llevan el grupo protector tetrahidropiranilo (en lugar de bencilo)
(Preparación de fosfatidil-oligogliceroles, que contienen ácidos grasos insaturados)
Para la realización de esta variante, se prepara el 1.2-isopropiliden-rac-glicero-3-0-alil-éter de acuerdo con H. Eibl y P. Woolley, Chem. Phys. Lipids 41 (1986) 53-63, y se epoxida.
Epoxidación (Ejemplo general)
El 1.2 isopropiliden-rac-glicero-3-0-alil-éter (PM 172,22; 1 mol - 172 g) se disuelve en 1 l de CH_{2}Cl_{2}. Se añade en porciones ácido 3-cloroperoxi-benzoico (1,1 moles) y se agita durante 6 horas a 25 - 30ºC. El educto (Rf 0,5 en dietil-éter / pentano 1 : 1) ha reaccionado totalmente para dar el producto deseado (Rf 0,2 en el sistema anterior). Se filtra con succión del material precipitado, al material filtrado se le añaden 100 g de Na_{2}CO_{3} y se agita durante otras 3 horas más a 20ºC. Se filtra con succión del material precipitado y se elimina el disolvente en vacío. El rendimiento de epóxido (PM 188,22) es de 170 g (90%). El epóxido se transforma seguidamente, tal como se ha descrito bajo el epígrafe de apertura del epóxido con alcoholes (Ejemplo 4a), con alcohol bencílico en el 1-0-bencil-rac-G_{1}-3.1-0.0-2,3-isopropiliden-rac-G_{2} y el grupo OH libre se transforma con 3.4-dihidro-2H-pirano en el derivado de tetrahidropirano.
Introducción del grupo protector tetrahidropirano (Ejemplo general)
El 1-0-bencil-rac-G_{1}-3.1-0.0-2.3-isopropiliden-rac-G_{2} (PM 296,36; 1 mol - 296 g) se disuelve en 1 l de THF, se mezcla con 1,4 moles de 3.4-dihidropirano-2H-pirano y se añaden 0,1 moles de ácido toluenosulfónico. Después de 1 hora, ha terminado la reacción (educto, Rf 0,65; producto, Rf 0,90 en dietil-éter) Se mezcla con 1 l de una solución 0,2 molar de Na_{2}CO_{3} y con 1 l de diisopropil-éter y se agita bien a fondo en un embudo de separación. La fase superior se concentra por evaporación rotatoria y el producto se transforma por hidrogenolisis con H_{2} en presencia de un catalizador de Pd/C (Pd al 5% sobre alcoholes) en el eslabón de G_{2} con un grupo hidroxilo libre.
Entramado fundamental con G_{2}
2-0-tetrahidropiranil-rac-G_{1}-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{2} (rendimiento 80%, referido al epóxido)
Fórmula empírica: C_{14}H_{27}O_{6} (PM 291,36)
calc.: C, 57,71; H, 9,34; O, 32,95
enc.: C, 57,59; H, 9,29; O, -
De manera correspondiente, los compuestos con otros entramados fundamentales se pueden transformar en las estructuras protegidas con THP. Por ejemplo, el 3-0-alil-éter del Ejemplo 4a se puede transformar en un epóxido y se puede abrir con alcohol alílico. Se forma de nuevo un 3-0-alil-éter, que se epoxida y abre con alcohol bencílico para dar el producto representado más abajo, que se puede transformar por introducción de 3 grupos protectores THP y por hidrogenolisis catalítica en un producto intermedio con un entramado fundamental con G_{4}.
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Entramado fundamental con G_{4}
2-O-THP-rac-G_{1}-[1.3-0.0-2-0-THP-G]_{2}-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{4}
Fórmula empírica: C_{30}H_{45}O_{2} (PM 607,75)
calc.: C, 59,29; H, 9,12; O, 31,59
enc.: C, 59,24; H, 9,08; O, -
Ejemplo 4e
Tratamiento ulterior del producto intermedio de la Fórmula I Entramado fundamental con G_{2} (racémico)
A partir de la Fórmula I se puede obtener un producto intermedio central para la preparación del entramado fundamental con G_{2} (véase el Esquema B). Para ello, la función OH secundaria en la Fórmula I se alquila, se bencila o se protege con tetrahidropiranilo.
\hskip6cm
Fórmula I 
\hskip7cm
a) alquilación 
\hskip7cm
b) bencilación 
\hskip7cm
c) introducción del grupo protector THP
10
Esquema B Producto intermedio central para la preparación del entramado fundamental con G_{2}:
X = alquilo saturado o insaturado, bencilo o THP
Compuestos de alquil-G_{2} 1) 2-0-alquil-rac-G_{1}-1.3-0.0-rac-G_{2}
El compuesto intermedio de la Fórmula II con X = alquilo se libera de los grupos protectores. Se prepararon los siguientes compuestos:
2-O-etil-G_{2}: C_{8}H_{18}O_{5} (194,23)
2-O-hexil-G_{2}: C_{12}H_{26}O_{5} (250,33)
2-O-undecenil-G_{2}: C_{17}H_{34}O_{5} (318,45)
2-O-dodecil-G_{2}: C_{18}H_{38}O_{5} (334,49)
2-O-octadecil-G_{2}: C_{24}H_{50}O_{5} (418,65)
2-O-erucil-G_{2}: C_{28}H_{56}O_{5} (472,75)
2) 1-O-alquil-rac-G_{1}-3.1-0.0-rac-G_{2}
En el compuesto intermedio de la Fórmula II con X = bencilo se elimina el alilo desde la posición1 y se introduce la correspondiente cadena de alquilo en la posición 1. Después de haber eliminado los grupos protectores, se obtuvieron los siguientes compuestos:
1-O-metil-G_{2}: C_{7}H_{16}O_{5} (180,20)
1-O-propil-G_{2}: C_{9}H_{20}O_{5} (208,25)
1-O-nonil-G_{2}: C_{15}H_{32}O_{5} (292,41)
1-O-undecil-G_{2}: C_{17}H_{36}O_{5} (320,47)
1-O-dodecil-G_{2}: C_{17}H_{38}O_{5} (334,49)
1-O-octadecil-G_{2}: C_{24}H_{50}O_{5} (418,65)
Se pueden obtener 1-0-alquil-diglicéridos insaturados también directamente pasando por la apertura del epóxido del 1.2-isopropiliden-glicero-glicidil-éter (Esquema D, Fórmula IV) con alcoholes, p.ej.
1-O-undecenil-G_{2}: C_{17}H_{34}O_{5} (318,45)
Esta vía es, no obstante, apropiada solamente para alcoholes de cadena corta, puesto que los rendimientos para alcoholes de cadena larga, tales como, p.ej., alcohol oleílico, son escasos. Para la preparación de 1-oleíl-G_{2} se prefiere, por consiguiente, una vía de síntesis que pasa por el 2-O-THP-glicero-1.3-0.0-(1.2-isopropiliden)-glicerol (esquema D, Fórmula V)
1-O-oleíl-G_{2}: C_{34}H_{48}O_{5} (416,64)
Productos intermedios para la síntesis de fosfolípidos, que contienen digliceroles en la zona polar
Los compuestos con unos grupos protectores favorables para estas síntesis contienen en G_{1} un grupo 2-O-bencil-éter o un grupo 2-O-tetrahidropiranilo:
1) 2-O-bencil-rac-G_{1}-1.3-0.0-(1.2-isopropiliden)-rac-G_{2}
C_{16}H_{24}O_{5} (296,36)
El compuesto de la Fórmula III se obtiene por transposición en condiciones básicas de alilo para dar propenilo, bencilación del grupo OH secundario y subsiguiente separación ácida del grupo protector propenilo.
\newpage
\hskip6cm
Fórmula I 
\hskip7cm
1) transposición de alilo a propenilo 
\hskip7cm
2) bencilación 
\hskip7cm
3) separación en condiciones ácidas
11
Esquema C Producto de partida para fosfatidil-digliceroles con radicales de ácidos grasos saturados 2) 2-O-tetrahidropiranil-rac-G_{1}-1.3-0.0-(1.2-isopropiliden)-rac-G_{2}
C_{14}H_{27}O_{6} (291,36)
El compuesto de la Fórmula V se prepara a partir de alil-glicerol. Después de una reacción por adición de isopropilideno, se epoxida y se obtiene el producto intermedio IV. Después de haber abierto el epóxido con alcohol bencílico, se introduce el grupo protector THP y se elimina el grupo bencilo.
(Esquema pasa a página siguiente)
12
Esquema D Producto de partida para fosfatidil-digliceroles con radicales de ácidos grasos insaturados Entramado fundamental con G_{3} (racémico)
A partir del producto intermedio central de la Fórmula II se pueden desarrollar los triglicéridos mediando inclusión del grupo alilo. Después de la epoxidación, a partir del epóxido se pueden preparar diversos productos intermedios o finales que presentan interés farmacéutico.
\newpage
Producto intermedio II
\hskip10cm
epoxidación
13
Esquema E Productos de partida para la preparación de entramados fundamentales con G_{3}
A partir del producto intermedio central de la Fórmula VI, se pueden preparar trigliceroles; el producto intermedio sirve también para la preparación de entramados fundamentales con G_{4}. En la Fórmula VI, X representa hidrógeno, un radical alquilo saturado, un radical bencilo o un radical THP.
Compuestos de alquil-G_{3} 1) 1-O-alquil-rac-G_{1}-1.3-0.0-rac-G_{2}-1.3-0.0-rac-G_{3}
El epóxido de la Fórmula VI (X = H) se abre directamente con alcoholes y, después de la separación del grupo protector isopropilideno, proporciona los siguientes compuestos:
1-O-etil-G_{3} C_{11}H_{24}O_{7} (268,30)
1-O-hexil-G_{3}: C_{15}H_{32}O_{7} (324,41)
1-O-nonil-G_{3}: C_{18}H_{38}O_{7} (366,491)
1-O-undecenil-G_{3}: C_{20}H_{40}O_{7} (392,53)
1-O-dodecil-G_{3}: C_{23}H_{44}O_{7} (408,57)
Los rendimientos en el caso de una apertura directa son malos para alcoholes de cadena más larga. Por lo tanto, se prepararon los compuestos con oleílo y erucilo de G_{3} por apertura de VI (X = THP) con bencilo, protección con THP de los grupos hidroxilo secundarios formados, desbencilación catalítica, alquilación en la posición 1 y eliminación de los grupos protectores.
1-O-oleíl-G_{3}: C_{27}H_{54}O_{7} (490,72)
1-O-erucil-G_{3}: C_{31}H_{62}O_{7} (456,82)
2) 2-O-alquil-rac-G_{1}-1.3-0.0-rac-G_{2}-1.3-0.0-rac-G_{3}
El epóxido de la Fórmula VI (X = bencilo o THP) se abre con alcohol alílico y se alquila en la posición 2. Los grupos protectores se eliminan de una manera usual. En el caso de la preparación de los compuestos de 2-0-alquilo insaturados, la transposición del grupo protector alilo se tiene que efectuar antes de la alquilación. Además, en este caso, en G_{2} solamente se puede utilizar el grupo protector THP, pero no el bencilo. Se prepararon los siguientes compuestos:
2-O-metil-G_{3} C_{10}H_{22}O_{7} (111,99)
2-O-propil-G_{3}: C_{12}H_{26}O_{7} (282,33)
2-O-nonil-G_{3}: C_{18}H_{38}O_{7} (366,49)
2-O-undecenil-G_{3}: C_{20}H_{40}O_{7} (392,53)
2-O-dodecil-G_{3}: C_{21}H_{44}O_{7} (408,57)
2-O-hexadecil-G_{3}: C_{25}H_{52}O_{7} (464,68)
2-O-oleíl-G_{3}: C_{27}H_{54}O_{7} (490,72)
2-O-erucil-G_{3}: C_{31}H_{62}O_{7} (456,82)
Productos intermedios para la síntesis de fosfolípidos, que contienen triglicéridos en la zona polar
Grupos protectores ventajosos para la constitución de fosfolípidos, que contienen radicales G_{3} en la zona polar, son radicales bencilo y radicales tetrahidropiranilo (THP). Los radicales bencilo se pueden eliminar de una manera sencilla y en condiciones suaves, pero, no obstante, con la limitación de que sólo se pueden utilizar ácidos grasos saturados. Los radicales THP presentan un interés especial, puesto que se pueden desprender en una etapa en unión con grupos protectores isopropilo.
1) 2-O-bencil-rac-G_{1}-1.3-0.0-(2-O-bencil)-rac-G_{2}-1.3-0.0-(1.2-isopropiliden)-rac-G_{3}
C_{26}H_{36}O_{7} (460,56)
Este compuesto se puede obtener a partir del producto intermedio central VI (X = bencilo) por apertura con alcohol alílico, bencilación de la posición 2 y separación del grupo protector alilo. Éste se designa en el texto como Fórmula VII.
2) 2-O-THP-rac-G_{1}-1.3-0.0-(2-O-THP)-rac-G_{2}-1.3-0.0-(1.2-isopropiliden)-rac-G_{3}
C_{22}H_{41}O_{9} (449,56)
Para la preparación de fosfolípidos con G_{3} insaturados, se utiliza en VI el radical X = THP. Se abre el epóxido VI con alcohol bencílico, se protege con THP el grupo hidroxilo secundario que queda libre, y se elimina el radical bencilo catalíticamente con H_{2}/Pt. El compuesto preparado de esta manera se designa en el texto como Fórmula VIII.
Observaciones adicionales
En la descripción precedente, los autores no hemos aprovechado el hecho de que en la Fórmula VI, para X = alquilo saturado, se pueden preparar de una manera sencilla compuestos con la siguiente estructura: 1-O-alquil-rac-G_{1}-3.1-0.0-(2-O-alquil)-rac-G_{2}-3.1-rac-G_{3}. Los representantes de estas nuevas estructuras se prepararon por apertura del epóxido VI (X = hexadecilo) con CH_{3}OH o alcohol undecenílico y separación del grupo protector isopropilideno
1-O-metil-rac-G_{1}-3.1-0.0-(2.0-hexadecil)-rac-G_{2}-3.1-rac-G_{3}:
C_{26}H_{54}O_{7} (478,71)
1-O-undecenil-rac-G_{1}-3.1-0.0-(2-O-hexadecil)-rac-G_{2}-3.1-0.0-rac-G_{3}:
C_{36}H_{72}O_{7} (616,958)
Entramado fundamental con G_{4} (racémico)
A partir del producto intermedio central de la Fórmula IX se pueden preparar entramados fundamentales con G_{4}.
Producto intermedio VI 
\hskip7cm
(X = H, alquilo saturado, bencilo o THP) 
\hskip7cm
1) 
\hskip0.5cm
Apertura con alcohol alílico 
\hskip7cm
2) 
\hskip0.5cm
X = H : epoxidación 
\hskip8cm
X = Be: bencilación de 2-OH, 
\hskip9cm
luego epoxidación 
\hskip8cm
X = THP: Introducción de THP en 2-OH, 
\hskip9cm
luego epoxidación
14
Esquema F Productos de partida para la preparación de entramados fundamentales con G_{4}
A partir del producto intermedio central de la Fórmula IX se pueden preparar tetragliceroles. Éstos se pueden utilizar también para la preparación de pentagliceroles.
A partir de los compuestos intermedios se pueden preparar también oligogliceroles con dos o más radicales alquilo. Compuestos de partida apropiados para ello son moléculas de la Fórmula IX, en las que X representa un radical alquilo saturado.
Compuestos de alquil-G_{4} 1) 1-O-alquil-rac-G_{1}-1.3-0.0-rac-G_{2}-1.3-0.0-rac-G_{3}-1.3-0.0-rac-G_{4}
El epóxido de la Fórmula IX, con X = H, se abre directamente con alcoholes. Esto proporciona, después de la separación del grupo protector isopropilideno, las siguientes sustancias:
1-O-etil-G_{4} : C_{14}H_{30}O_{9} (342,38)
1-O-hexil-G_{4}: C_{18}H_{38}O_{9} (398,49)
1-O-undecil-G_{4}: C_{19}H_{40}O_{9} (412,52)
1-O-undecenil-G_{4}: C_{19}H_{38}O_{9} (410,50)
1-O-dodecil-G_{4}: C_{20}H_{42}O_{9} (426,54)
Esta vía es apropiada solamente para alcoholes de cadena corta, puesto que los rendimientos para alcoholes de cadena más larga disminuyen grandemente.
Para alcoholes de cadena más larga, que están saturados, se tiene que escoger, por consiguiente, igual a como en el caso de G_{2} y G_{3}, una vía de síntesis que pasa por el producto intermedio central con X = bencilo. Se abre con alcohol alílico, se bencila el grupo 2-OH que queda libre, se elimina el grupo alilo en la posición 1 y se alquila la posición 1. Después de haber eliminado los grupos protectores, se obtienen:
1-O-hexadecil-G_{4}: C_{24}H_{50}O_{9} (482,99)
1-O-octadecil-G_{4}: C_{26}H_{54}O_{9} (510,70)
1-O-behenil-G_{4}: C_{30}H_{62}O_{9} (566,81)
2) 2-O-alquil-rac-G_{1}-1.3-0.0-rac-G_{2}-1.3-0.0-rac-G_{3}-1.2-0.0-rac-G_{4}
El compuesto intermedio central de la Fórmula IX se abre con alcohol alílico y se alquila la posición 2 que ha quedado libre. Después de la eliminación de los grupos protectores se obtienen:
2-O-propil-G_{4}: C_{15}H_{32}O_{9} (356,41)
2-O-hexil-G_{4}: C_{18}H_{38}O_{9} (398,49)
2-O-nonil-G_{4}: C_{21}H_{44}O_{9} (440,57)
2-O-undecil-G_{4}: C_{19}H_{38}O_{9} (410,50)
2-O-dodecil-G_{4}: C_{20}H_{42}O_{9} (426,54)
2-O-hexadecil-G_{4}: C_{24}H_{40}O_{9} (483,99)
2-O-octadecil-G_{4}: C_{26}H_{54}O_{9} (510,70)
2-O-oleíl-G_{4}: C_{26}H_{52}O_{9} (508,69)
2-O-erucil-G_{4}: C_{30}H_{60}O_{9} (564,80)
Productos intermedios para la síntesis de fosfolípidos, que contienen tetragliceroles en la zona polar
Compuestos con grupos protectores favorables para estas síntesis son bencil- y tetrahidropiranil-éteres, correspondientemente a las experiencias para la síntesis de los compuestos de G_{2} y G_{3}.
1) 2-O-bencil-rac-G_{1}-1.3-0.0-(2-O-bencil)-rac-G_{2}-1.3-0.0-(2-O-bencil)-rac-G_{3}- 1.3-0.0-(1.2-isopropiliden)-rac-G_{4}
C_{36}H_{48}O_{9} (624,77)
El compuesto intermedio importante para la síntesis de fosfolípidos con radicales G_{4} en la zona polar se prepara a partir de la Fórmula IX, X = bencilo, por apertura del epóxido con alcohol alílico, subsiguiente bencilación del grupo 2-OH que queda libre y eliminación de alilo. El compuesto aparece en el texto como Fórmula X.
2) 2-O-THP-rac-G_{1}-1.3-0.0-(2-O-THP)-rac-G_{2}-1.3-0.0-(2-O-THP)-rac-G_{3}- 1.3-0.0-(1.2-isopropiliden)-rac-G_{4}
C_{30}H_{45}O_{2} (607,75)
Para la preparación de este compuesto, que es apropiado para la preparación de fosfolípidos insaturados con entramados fundamentales con G_{4}, se procede de una manera análoga a como en la preparación del compuesto de G_{3}. Se abre el epóxido VII, con X = THP, con alcohol bencílico, se protege con THP el grupo 2-OH que queda libre y se elimina el bencilo con H_{2} (catálisis con Pd/C). El compuesto se designa en el texto como Fórmula XI.
Productos intermedios para la síntesis de fosfolípidos, que contienen oligogliceroles en la zona polar y que hacen posible un enlace sn-1 con el fosfato (configuración natural)
En el caso de la preparación que se ha efectuado hasta ahora de los compuestos, que son apropiados para una incorporación en la zona polar de fosfolípidos (fórmulas III y V para G_{2}, Fórmulas VII y VIII para G_{3}, Fórmulas x y XI para G_{4}), no se tomó en cuenta que en el fosfatidil-glicerol natural, es decir en el 1.2-diacil-sn-glicero-3-fosfo-sn-1-glicerol, el enlace de fosfato con el glicerol no acilado es un enlace sn-1. Puesto que los constituyentes de liposomas se utilizan como vehículos de medicamentos a ser posible en una configuración natural, se desarrollaron vías de síntesis que permiten también una configuración sn-1 del oligoglicerol polar (Esquema G).
Enlace sn-1-G_{1}-G_{2}
El enlace estéreamente especifico se puede llevar a cabo de una manera análoga al procedimiento descrito en la bibliografía (documento DE 31 30 867 A1; H. Eibl, Chem. Phys. Lipids 28 (1981) 1-5; H. Eibl y colaboradores, Chem. Phys. Lipids 41 (1986) 53-63; H. Eibl y colaboradores, Chem. Phys. Lipids 47 (1988) 47-53).
El producto de partida para este enlace es 2-0-bencil-3-0-alil-sn-glicerol, que después de una epoxidación se transforma por hidrólisis en el diol. Después de haber reaccionado con H^{+} y 2.2-dimetoxi-propano, se forma 2-O-Be-sn-G_{1}-3.1-0.0-(1.2-isopropiliden)-rac-G_{2}, una molécula de la Fórmula XII, que hace posible un enlace sn-1 con el grupo de fosfato en fosfolípidos y que corresponde al racemato de la Fórmula III.
Enlace sn-1-G_{1}-G_{2}-G_{3}
El producto de partida para este enlace es de nuevo 2-O-bencil-3-0-alil-sn-glicerol. Después de haber protegido la posición sn-1 con THP, se epoxida y el anillo epoxídico se abre con 1.2-isopropiliden-glicerol. Se bencila la función OH en G_{2} que queda libre, se elimina el grupo protector THP y se obtiene la molécula de la Fórmula XIII, que hace posible un enlace sn-1 con el grupo de fosfato en fosfolípidos. La molécula XIII corresponde al racemato de la Fórmula VII.
Enlace sn-1-G_{1}-G_{2}-G_{3}-G_{4}
El producto de partida es de nuevo 2-0-bencil-3-0-alil-sn-glicerol, para garantizar el enlace sn-1. Después de haber introducido el grupo protector THP, se epoxida y el epóxido se abre con alcohol alílico. Después de una epoxidación del producto intermedio, se abre con isopropiliden-glicerol, se bencilan los dos grupos OH libres y se elimina el THP. Se obtiene el compuesto XIV, que hace posible un enlace sn-1 con el fosfato y que corresponde al racemato de la Fórmula X.
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Cuando se desea, se pueden preparar correspondientemente también compuestos con enlaces sn-3-G_{1}-G_{2}, sn-3-G_{1}-G_{2}-G_{3} o sn-3-G_{1}-G_{2}-G_{3}-G_{4}. En este caso, se tiene que emplear en una misma secuencia de reacciones, en lugar de 2-O-bencil-2-0-alil-sn-glicerol, el enantiómero 2-0-bencil-1-0-alil-sn-glicerol.
Enlace sn-1-G_{1}-G_{2}
15
Enlace sn-1-G_{1}-G_{2}-G_{3}
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Enlace sn-1-G_{1}-G_{2}-G_{3}-G_{4}
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Esquema G Eslabones para fosfolípidos que hacen posible un enlace sn-1-Gx (x = 2 - 4). El producto de partida es 2-O-bencil-3-0-alil-sn-glicerol
Ejemplo 4f
Productos intermedios, que contienen los azúcar-alcoholes (Ejemplos generales)
Productos intermedios importantes son aquí, sobre todo, azúcar-alcoholes, que se pueden adquirir a precio barato o que se pueden conseguir a partir de éstos mediante reacciones sencillas (véase para ello la tabla adjunta). Son interesantes, en particular, D-manita como forma abierta de inosita, D-xilita, que no posee ninguna actividad óptica en el caso de una fosforilación en el átomo de C central, y que se puede obtener fácilmente en forma de 1.2; 4.5-diisopropiliden-xilita, así como meso-eritrita. Como grupos protectores se emplean aquí, en la mayoría de los casos, isopropilideno y tritilo en combinación con bencilo o alilo. También el grupo protector tetrahidropiranilo tiene aquí una cierta importancia. A modo de ejemplo, se describen aquí algunas posibilidades.
1.2;4.5-diisopropiliden-xilita (Ejemplo general para la introducción del grupo protector isopropilideno)
Se suspende xilita (1,0 mol - 152 g) en 500 ml de 2-propanol y se añade dimetoxi-propano (3,0 moles - 312 g). Se mezcla con 6 g de H_{2}SO_{4} en 100 ml de 2-propanol y se calienta a 50ºC. Después de 30 minutos se ha disuelto todo. Se reúne con tanta cantidad de amoníaco concentrado, hasta que la mezcla de reacción tenga un valor del pH de aproximadamente 8. Después de haber eliminado el disolvente en un evaporador rotatorio en vacío, el residuo se recoge en hexano y se enfría a -20ºC. Precipitan bonitos cristales de color blanco, que se filtran con succión y se utilizan para la fosforilación.
Fórmula empírica: C_{11}H_{19}O_{5} (PM 231,27)
calc.: C, 57,13; H, 8,28; O, 34,59
enc.: C, 57,01; H, 8,27; O, -
Fórmulas estructurales de algunos azúcar-alcoholes
18
19
20
1.2;3.4-diisopropiliden-5-bencil-D-manita (Ejemplo general para la utilización de grupos protectores tritilo en unión con grupos protectores bencilo)
Partiendo de 1.2;3.4;5.6-triisopropiliden-D-manita (PM 302,36), que se había obtenido de una manera análoga a la preparación del derivado de xilita, se obtiene, por cuidadosa separación del grupo protector, la 1.2;3.4-diisopropiliden-D-manita en un rendimiento de aproximadamente 30%. La triisopropiliden-D-manita (1,0 mol - 302 g) se disuelve en 600 ml de CH_{3}OH, se mezcla con Amberlyst 15 (5 g) y con 70 g de H_{2}O. Se calienta a 50ºC y se agita la solución a esta temperatura durante 40 minutos (educto, Rf 0,9; derivado 1.2;3.4, Rf 0,7; derivado 3.4, Rf 0,1 en una mezcla de CHCl_{3} y CH_{3}OH 1:1), se enfría a 20ºC y se filtra en 7,5 ml de amoníaco al 25% en 25 ml de 2-propanol (pH \sim 8). Al enfriar a 4ºC el producto de partida precipita y se puede recuperar (aproximadamente 120 g, \sim 40%). El material filtrado se concentra por evaporación y se purifica por cromatografía en gel de sílice Kieselgel 60 (Merck, Darmstadt). Se obtienen 84 g (\sim 32%) de 1.2:3.4-diisopropiliden-D-manita, que se puede obtener en una forma cristalina a partir de hexano.
Fórmula empírica: C_{12}H_{22}O_{6} (PM 262,30)
calc.: C, 54,95; H, 8,45; O, 36,60
enc.: C, 54,89; H, 8,34; O, -
Reacción de 1.2;3.4-diisopropiliden-D-manita con cloruro de tritilo y cloruro de bencilo (Ejemplo general para la tritilación y la subsiguiente alquilación).
La 1.2;3.4-diisopropiliden-D-manita (0,2 moles - 52 g) se disuelve en 300 ml de tolueno, se mezcla con trietil-amina (0,30 moles - 30 g) y se hierve a reflujo. Se añade gota a gota cloruro de tritilo (PM 278,78; 1 mol - 64 g) en 200 ml de tolueno y se hierve durante otros 60 minutos a reflujo (educto, Rf 0,7; producto, Rf 0,90 en una mezcla de CHCl_{3} y CH_{3}OH 10:1). La reacción ha terminado entonces. Se enfría a 20ºC, se filtra del hidrocloruro de trietil-amina precipitada, y el material filtrado se concentra por evaporación rotatoria. El residuo anterior se recoge en 400 ml de THF, se mezcla con cloruro de bencilo (0,3 moles - 38 g) y se hierve a reflujo. Se añade gota a gota terc.-butilato de K (0,25 moles - 28 g) - disuelto en 200 ml de THF y se trata la mezcla de reacción después de 1 hora (educto, Rf 0,90; producto, Rf 1,00 en una mezcla de CHCl_{3} y CH_{3}OH 10:1). La mezcla de reacción, después de haber añadido 300 ml de diisopropil-éter, se extrae con 600 ml de H_{2}O, se retira la fase superior y se elimina el disolvente en vacío. El anterior residuo se utiliza ulteriormente de modo directo.
Separación del grupo protector tritilo mediando conservación del grupo protector 3.4-isopropilideno (Ejemplo general)
El residuo oleoso de la reacción precedente (\sim 0,2 moles) se disuelve en 600 ml de una mezcla de acetona y CH_{3}OH 1:1 y se reúne con 3 ml de H_{2}SO_{4}. Se agita a 40ºC durante 40 minutos y se observa una separación completa del grupo protector tritilo y del grupo protector 1.2-isopropilideno (educto, Rf 0,95; producto, Rf 0,15 en dietil- eter). La mezcla de reacción se lleva con amoníaco a un pH de \sim 8, se filtra y se concentra por evaporación rotatoria. El residuo se cromatografía en gel de sílice y se cristaliza a partir de hexano.
2-O-bencil-3.4-isopropiliden-D-manita
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Fórmula empírica: C_{16}H_{24}O_{6} (PM 312,36)
calc.: C, 61,52; H, 7,74; O, 30,73
enc.: C, 61,44; H, 7,72; O, -
Como se ha indicado en el Ejemplo 4c, el grupo protector isopropilideno se puede introducir de nuevo en la posición 5.6. Se forma un producto intermedio central para la síntesis de compuestos de fosfatidil-D-manita, 2-O-bencil-3.4;5.6-diisopropiliden-D-manita.
Fórmula empírica: C_{19}H_{28}O_{6} (PM 352,42)
calc.: C, 64,75; H, 8,01; O, 27,24
enc.: C, 64,68; H, 7,94; O, -
Eslabones a base de azúcar-alcoholes, que se obtienen por combinación de una separación con peryodato de un diol vecinal y de una reducción del aldehído que se ha formado con hidruro de boro y sodio (Ejemplo general)
Se disuelve 1.2:3.4-diisopropiliden-D-manita (0,2 moles - 26 g) de acuerdo con H. Eibl, Chem. Phys. Lipids 28 (1981) 1-5, en 200 ml de CH_{3}OH, y se añade a una solución de 0,2 moles de meta-peryodato de sodio en 500 ml de agua. La temperatura no ha de sobrepasar los 30ºC. Después de 15 minutos, se ha terminado la reacción. El valor del pH de la mezcla de reacción se aumenta con KOH 5 m en agua a un pH = 8. Se separa por filtración con respecto de las sales precipitadas, y el aldehído que se ha formado se reduce con hidruro de boro y sodio (0,25 moles). Se obtiene en un rendimiento > 90%l a 1.2:3.4-diisopropiliden-D-lixita, que se extrae con 600 ml de cloroformo. La fase de cloroformo se concentra por evaporación rotatoria y el producto se cristaliza a partir de hexano.
Fórmula empírica: C_{11}H_{19}O_{5} (PM 231,27)
calc.: C, 57,13; H, 8,28; O, 34,59
enc.: C, 57,07; H, 8,21; O, -
Mediante utilización de estas diversas posibilidades, la separación de monoisopropilideno, la separación con peryodato de los dioles vecinales para dar los aldehídos y la reducción con hidruro de boro y sodio en combinación con la variación de tritilo / alquilo, se pueden obtener los más diversos azúcar-alcoholes, que se pueden transformar mediante acilación o fosforilación en interesantes compuestos de alquilo, acilo o fosfatidilo.
Preparación de derivados sencillos de ésteres y éteres a partir de los oligogliceroles y azúcar-alcoholes señalados (descripción general)
En diversas publicaciones se han descrito posibilidades para esterificar o eterificar, con una separación subsiguiente de los grupos protectores. En los artículos expuestos seguidamente se encuentran, además, diversos métodos de realizar la fosforilación.Estos métodos se pueden utilizar aquí análogamente.
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Eibl, H. Synthesis of glycerophospholipids [Síntesis de glicero-fosfo-lípidos] Chem. Phys. Lipids 26 (1980) 405-429.
Eibl, H. Phospholipid Synthesis [Síntesis de fosfolípidos] En: Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Applications [Liposomas, desde la estructura física a las aplicaciones terapéuticas (C.G. Knight, coordinador de edición), Elsevier, Amsterdam (1981) 19-50.
Eibl, H. y Kovatchev, S. Preparation of phospholipids and of their analogs by phospholipase D. [Preparación de fosfolípidos y de sus compuestos análogos mediante fosfolipasa D.] En: Methods of Enzymology [Métodos de enzimología]. Tomo 72. Coordinador de edición J. M. Lowenstein, Academic Press, Nueva York (1981) 632-639.
Eibl, H.: Phospholipide als funktionelle Bausteine biologischer Membranen [Fosfolípidos como eslabones funcionales de membranas biológicas] Angew. Chemie 96 (1984) 247-262.
Eibl. H.: Phospholipids as functional constituents of biomembranes [Fosfolípidos como constituyentes funcionales de membranas biológicas] Angew. Chem. edición internacional en ingles, 23 (1984) 257-271.
Eibl, H. Phospholipid synthesis: Oxazaphospholanes and dioxaphospholanes as intermediates [Síntesis de fosfolípidos: Oxazafosfolanos y dioxafosfolanos como compuestos intermedios]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) 4.074-4.077.
Eibl. H. y Wooley, P.: Synthesis of enantiomerically pure glyceryl esters and ethers. I. Methods employing the precursor 1.2-isopropylidene-sn-glycerol [Síntesis de ésteres y éteres de glicerilo puros en cuanto a los enantiómeros. I Métodos que emplean el compuesto precursor 1.2-isopropiliden-sn-glicerol]. Chem. Phys Lipids 41 (1986) 53-63.
Eibl. H. y Wooley, P.: Synthesis of enantiomerically pure glyceryl esters and ethers. II. Methods employing the precursor 3.4-isopropylidene-D-mannitol [Síntesis de ésteres y éteres de glicerilo puros en cuanto a los enantiómeros. I Métodos que emplean el compuesto precursor 3.4-isopropiliden-D-manitol]. Chem. Phys Lipids 47 (1988) 47-53.
Eibl. H. y Wooley, P.: A general synthetic method for enantiomerically pure ester and ether lysophospholipids [Un método general de síntesis de lisofosfolípidos de ésteres y éteres puros en cuanto a los enantiómeros]. Chem. Phys. Lipids 47 (1988) 63-68.
Wooley, P. y Eibl, H.: Synthesis of enantiomerically pure phospholipids including phosphatidylserine and
phosphatidylglycerol [Síntesis de fosfolípidos, inclusive fosfatidil-serina y fosfatidil-glicerol, puros en cuanto a los enantiómeros]. Chem. Phys. Lipids 47 (1988) 55-62.
Ejemplo 4g
Productos intermedios para la síntesis de fosfolípidos, que contienen azúcar-alcoholes en la zona polar
Tal como se ha descrito hasta ahora, la introducción en la zona polar de fosfolípidos pasando por oligogliceroles tiene un pronunciado efecto sobre la circulación sanguínea, cuando estas sustancias se emplean en forma de constituyentes de liposomas. Con el mismo resultado se pueden utilizar, sin embargo, en lugar de los oligogliceroles, también azúcar-alcoholes, p.ej. ésteres con ácido fosfórico de D-manita, D-lixita y D-treita. Estos compuestos se pueden introducir en fosfolípidos con grupos protectores apropiados (véase acerca de esto el Esquema H) de la manera descrita para los oligogliceroles. En el caso de los derivados descritos, el acoplamiento con fosfolípidos conduce de nuevo a un enlace sn-1 del ácido fosfórico con el azúcar-alcohol.
Derivado de D-manita
A partir de la 1.2.;5.6.-diisopropiliden-D-manita se puede preparar, mediante bencilación en la posición 3.4 y separación de los grupos protectores isopropilideno, la 3.4-0.0-dibencil-D-manita. Después de una introducción del grupo protector isopropilideno en la posición 1.2, tritilación y bencilación del grupo OH libre, tras haber separado el grupo tritilo, se obtiene el compuesto XV, que se puede incorporar en la zona polar de fosfolípidos.
Derivado de D-lixita
La 1.2-isopropiliden-3.4-0.0-dibencil-D-manita (véase más arriba) se desdobla con ácido peryódico y se reduce con NaBH_{4} para dar el alcohol XVI. Este compuesto se puede introducir en la zona polar de fosfolípidos.
Derivado de D-manita (6 grupos hidroxilo)
22
Derivado de D-lixita (5 grupos hidroxilo; a partir de D-manita)
23
Derivado de D-treita (4 grupos hidroxilo; a partir de D-manita)
24
Esquema H Polialcoholes con por lo menos 4 grupos hidroxilo para su incorporación en la zona polar de fosfolípidos Derivado de D-treita
El compuesto XVI se transforma por bencilación en la 1.2-isopropiliden-3.4.5-0.0,0-tribencil-D-lixita. Después de la separación del grupo protector isopropilideno, la separación con ácido peryódico y la reducción para dar el alcohol, se obtiene el compuesto XVII. Éste se puede introducir de una manera habitual en la zona polar de fosfolípidos.
Fosfolípidos, que contienen oligogliceroles en la zona polar
En publicaciones anteriores, los autores hemos descrito cómo se pueden preparar de una manera sencilla fosfolípidos a partir de diacil-gliceroles con cadenas de ácidos grasos saturados e insaturados, con dos cadenas de ácidos grasos iguales o diferentes. (Documento DE 32 39 817 Ar; P. Woolley y colaboradores Chem. Phys. Lipids 47 (1988) 55-62; H. Eibl y colaboradores, Chem. Phys. Lipids 47 (1988) 55-62; H. Eibl y colaboradores, Chem. Phys. Lipids 47 (1988) 63 - 68). Correspondientemente, se pueden utilizar también acil / alquil- o alquil / acil-gliceroles como producto de partida. Por el contrario, los fosfolípidos, que contienen dialquil-gliceroles, son extremadamente estables en el metabolismo y prácticamente no pueden ser resorbidos.
\newpage
Los citados compuestos se pueden preparar, en principio, según dos métodos diferentes.
Esto se deduce del hecho de que, a partir de dos alcoholes, R_{1}-OH y R_{2}-OH, se ha de preparar un diéster de ácido fosfórico.
Los alcoholes designados por la fórmula R_{1}-OH son alcoholes, que contienen un entramado fundamental de glicerol con dos cadenas de ácidos grasos y un grupo hidroxilo libre. Éstos, sin embargo, pueden contener también solamente una cadena de ácido graso y un grupo protector adicional, en la mayoría de los casos bencilo, para la preparación de monoacril-fosfolípidos, R_{1}-OH puede representar, no obstante, también un alcohol con un radical alquilo sencillo con uno o dos enlaces dobles en cis.
Los alcoholes designados por la fórmula R_{2}-OH son alcoholes, que en el texto presentado hasta aquí se habían designado como G_{2}, G_{3} y G_{4}. Se mencionan por las Fórmulas estructurales III y V (para G_{2}), VII y VIII (para G_{3}) y X hasta XIV (para G_{4}). Correspondientemente, se pueden emplear también los derivados de azúcar-alcoholes XV hasta XVII.
En el Esquema G se describe cómo se pueden emplear dos alcoholes R_{1}-OH y R_{2}-OH para la preparación de diésteres de ácido fosfórico con buenos rendimientos.
25
Por ejemplo, para R_{1} = 1.2-dipalmitoíl-sn-G y R_{2} = Fórmula XI, después de la eliminación de los grupos protectores, se establece la siguiente estructura:
26
Esquema G Diésteres de ácido fosfórico de la fórmula R_{3}O-PO^{-}_{3}-R_{2}; Na^{+}
Como agente de fosforilación se emplea oxicloruro de fósforo. A partir de los dos alcoholes R_{1}OH o R_{2}OH que se han de unir a través de un fosfato, se prepara en primer lugar el correspondiente dicloruro de ácido fosfórico, que por reacción con el respectivamente otro alcohol se hace reaccionar para dar el monocloruro de ácido fosfórico. Una hidrólisis en condiciones ligeramente básicas conduce entonces a los diésteres de ácido fosfórico, que después de la separación de los grupos protectores se convierten por ejemplo en XVIII, en 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfo-G_{1}-G_{2}-G_{3}-G_{4}; sal de Na^{+}.
Los Ejemplos descritos en lo sucesivo pueden ser ampliados de manera arbitraria, por una combinación distinta de las cadenas de ácidos grasos o por introducción de otros ácidos grasos, también de procedencia sintética y natural. Los fosfatidil-oligogliceroles preparados pueden contener, cada vez según las necesidades, y después de haber ajustado a una propiedad deseada, en la zona del oligoglicerol también todavía otras cadenas de alquilo o también otros radicales de ácidos grasos.
Los procedimientos que se han presentado aquí, que están basados en oligogliceroles, se pueden emplear y modificar, por lo tanto, de múltiples maneras, a fin de hacer variar las propiedades de los liposomas e influir sobre ellas. Por analogía a las hexadecil-fosfocolinas y a las erucil-fosfocolinas, estas sustancias son posiblemente también unas importantes moléculas biológicamente activas, que influyen sobre la transducción de señales y, por consiguiente, sobre las vías funcionales celulares.
Ejemplos de compuestos de fosfo-G_{1}-G_{2}
27
28
Ejemplos de compuestos de fosfo-G_{1}-G_{2}-G_{3}
29
30
Ejemplos de compuestos de fosfo-G_{1}-G_{2}-G_{3}-G_{4}
31
Ejemplos de enlaces fosfo-sn-G_{1} sn-1-G_{1}-G_{2}
32
33
sn-1-G_{1}-G_{2}-G_{3}:
34
sn-1-G_{1}-G_{2}-G_{3}-G_{4}:
35
Ejemplos de enlaces con azúcar-alcoholes Compuestos de fosfo-D-manita
36
37
Compuestos de fosfo-D-lixita
38
Compuestos de fosfo-D-treita
39
Ejemplo 4h
Etapas de fosforilación (prescripción general) en el ejemplo de la preparación de la sal de Na^{+} del 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfo-glicero-glicerol
En un matraz de tres bocas con una capacidad de 1 l se dispone previamente POCl_{3} (0,1 moles - 15,3 g) en 15 ml de THF. Mediando intensa agitación y enfriamiento con hielo, se añaden gota a gota 1.2-dipalmitoíl-sn-glicerol (0,1 moles - 57 g) en 100 ml de THF y, por separado, trietil-amina (0,11 moles - 11g) de tal manera que esté presente constantemente un ligero exceso de trietil-amina con respecto al 1.2-dipalmitoíl-sn-glicerol, a fin de recoger el cloruro de hidrógeno que se forma. La temperatura en la mezcla de reacción no ha de sobrepasar en este caso los 16ºC. Después de la adición gota a gota, se deja todavía durante 30 minutos a 16ºC y se comprueba mediante cromatografía DC la compleción de la reacción. (1.2-Dipalmitoíl-sn-glicerol, Rf 0,8; el dicloruro de ácido 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfórico se transforma por metanolisis en el correspondiente éster dimetílico de ácido fosfórico, Rf 0,4 en dietil-eter).
La segunda etapa de fosforilación se lleva a cabo seguidamente con un oligoglicerol protegido. Aquí se describe la reacción con 2-O-bencil-rac-G_{1}-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{2}. En la mezcla de reacción con dicloruro de ácido 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfórico se incorporan gota a gota el alcohol anteriormente citado (0,105 moles - 31 g) y trietil-amina (0,13 - 13 g) en 100 ml de THF, de tal manera que la temperatura en la mezcla de reacción no sobrepase los 40ºC. Después de 3 horas a 40ºC, ha terminado la reacción (el producto de partida en forma del éster dimetílico de ácido fosfórico, Rf 0,4; el producto final en forma del éster metílico, Rf 0,7 en dietil-eter). Se separa por filtración del hidrocloruro de trietil-amina que ha precipitado y se hidroliza la mezcla de reacción, esencialmente a base de monocloruro de 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfo-2-O-bencil-rac-glicero-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-glicerol junto a dicloruro de ácido 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfórico, que no ha reaccionado totalmente, con 26 g de Na_{2}CO_{3} disueltos en 260 ml de H_{2}O. Después de 4 horas, se mezcla con 400 ml de diisopropil-éter y la fase superior, que contiene el producto, se concentra por evaporación rotatoria hasta que se formen unos primeros cristales. Seguidamente, se mezcla con 500 ml de acetona y los cristales formados se filtran con succión a 20ºC. El material filtrado contiene el fosfatidil-glicero-glicerol protegido, sal de Na^{+} (Rf 0,6 en una mezcla de CHCl_{3}, CH_{3}OH, ácido acético glacial y H_{2}O 600 : 60 : 20 : 5). Después de haber eliminado el disolvente, se obtienen 48 g de un producto bruto, que se calienta a 60 - 70ºC durante 30 minutos en 140 ml de ácido acético y 60 ml de H_{2}O (separación del grupo protector isopropilideno). Se mezcla con 500 ml de CHCl_{3}, 600 ml de CH_{3}OH y 400 ml de H_{2}O y se agita bien a fondo. La fase inferior de CHCl_{3} se lava de nuevo con 600 ml de CH_{3}OH y 500 ml de H_{2}O, pero, en este caso, se ha de añadir una cantidad tal de Na_{2}CO_{3} que el valor de pH de la fase acuosa sea de 6. La fase inferior de cloroformo se concentra por evaporación rotatoria y el residuo se recoge en 400 ml de THF. Para la eliminación del grupo protector bencilo, la solución se mezcla con 6 g de Pd/C y se desbencila en una atmósfera de H_{2}. La reacción ha terminado después de aproximadamente 4 horas. Se separa del catalizador por filtración, se elimina el disolvente y se recoge el residuo (\sim 30 g) en 100 ml de CHCl_{3}. Se mezcla con 900 ml de acetona y los cristales resultantes se filtran con succión. Se obtiene un polvo de color blanco de 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfo-glicero-glicerol, sal de Na^{+}, rendimiento: 26 g (\sim 32%).
Fórmula empírica: C_{41}H_{80}NaO_{12}P (PM 819,04)
calc.: C, 60,13; H, 9,85; Na, 2,81; O, 30,73; P, 3,78
enc.: C, 60.01; H, 9,79; Na, - O, - ; P, 3,69
1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfo-glicero-glicero-glicerol, sal de Na^{+}
Fórmula empírica: C_{44}H_{86}NaO_{14}P (PM 893,12)
calc.: C,59,17; H, 9,71; Na, 2,57; O, 25,08; P, 3,47
enc.: C, 59,11; H, 9,62; Na, - O, - ; P, 3,45
1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfo-glicero-glicero-glicerol, sal de Na^{+}
Fórmula empírica: C_{47}H_{92}NaO_{16}P (PM 967,20)
calc.: C,58,37; H, 9,59; Na, 2,38; O, 26,47; P, 3,20
enc.: C, 58,29; H, 9,53; Na, - O, - ; P, 3.19
Para la preparación de fosfatidil-oligogliceroles con una cadena alifática, los denominados lisofosfatidil-oligogliceroles, se puede partir de compuestos que llevan en la posición sn-2 del glicerol un grupo bencil-éter, p.ej. 1-palmitoíl-2-O-bencil-sn-glicerol, 1-estearoíl-2-O-bencil-sn-glicerol, 1-O-hexadecil-2-O-bencil-sn-glicerol, 1-O-octadecil-2-O-bencil-sn-glicerol, etc.. Los autores hemos descrito la preparación de estos compuestos en las publicaciones de H. Eibl y P. Woolley, Chem. Phys. Lipids 41 (1986) 53-63 y Chem. Phys. Lipids 47 (1988) 55-62. Estos compuestos se fosforilan de la manera descrita para la preparación de 1.2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfo-glicero-glicerol, sal de Na^{+}, y se hacen reaccionar con los oligogliceroles protegidos. La separación de los grupos protectores se efectúa de una manera análoga. En la última etapa se efectúa por hidrogenolisis catalítica con Pd/C (al 5% sobre carbón activo) tanto la separación de los grupos bencilo en la zona del oligoglicerol, como también en el glicerol, que lleva un grupo acilo o alquilo (véanse acerca de ello los Ejemplos).
La preparación de los alquil-fosfo-oligogliceroles es, por el contrario, sencilla, puesto que en este caso se hacen reaccionar los correspondientes alcoholes de acuerdo con un esquema de fosforilación preestablecido. Para la preparación de los compuestos representantes insaturados se tiene que utilizar, no obstante, el grupo protector tetrahidropiranilo en lugar del grupo protector bencilo.
Para la síntesis de los compuestos representantes insaturados de esta clase de sustancias se tiene que adoptar una estrategia fundamentalmente diferente. Aquí se efectúa la fosforilación de 1.2-dibencil-sn-glicerol de la manera descrita (véase acerca de ello también la solicitud de patente alemana DE 32 39 817), y luego se lleva a cabo la reacción con un oligoglicerol protegido con tetrahidropiranilo. En lugar de la hidrólisis se lleva a cabo una metanolisis, obteniéndose triésteres de ácido fosfórico, p.ej. para 2-O-tetrahidropiranil-rac-G_{1}-1.3-0.0-1.2-isopropiliden-rac-G_{2};
40
Este producto intermedio central se somete, seguidamente, a una hidrogenolisis con Pd/C (al 5% sobre carbón activo). Se obtiene
41
A continuación, se pueden introducir cualesquiera ácidos grasos insaturados y también saturados en las posiciones sn-1 y sn-2 de la molécula de glicerol. Después de esto, tal como se ha descrito en nuestra solicitud de patente anterior, se efectúa la separación del grupo metilo con LiBr y, después de esto, la hidrólisis de los grupos protectores isopropilideno y tetrahidropiranilo en ácido acético al 70% a 60 hasta 70ºC. Los compuestos de dioleoílo cristalizan difícilmente y por lo tanto tienen que ser purificados por cromatografía, mientras que los compuestos de dierucilo ya se pueden obtener bien en una forma cristalina.
También para la preparación de los fosfatidil-oligogliceroles de cadena mixta es recomendable la estrategia del triéster de ácido fosfórico. En este caso, igual a como en la síntesis de los lisofosfatidil-oligogliceroles, se utilizan los 1-acil-2-O-bencil-sn-gliceroles o los 1-O-alquil-2-O-bencil-sn-gliceroles como productos de partida y se hacen reaccionar análogamente para dar el 1.2-dibencil-sn-glicerol. En este caso, se obtienen como productos intermedios, después de la desbencilación catalítica para el compuesto G_{2}:
42
A continuación, en la posición sn-2 libre se pueden introducir ácidos grasos insaturados y estas moléculas se pueden liberar de sus grupos protectores, tal como se ha descrito. Es agradable que las moléculas con la combinación de ácidos grasos 1-palmitoíl-2-oleoílo o 1-estearoíl-2-oleoílo, ya cristalizan bien.
Ejemplo 5 Otras propiedades
Con un número creciente de moléculas de glicerol, crece el número de grupos hidroxilo libres y, por consiguiente, la polaridad. Con una proporción de 5% en agua, el PP-G-PG_{4} forma, como único PP-G-PG_{n}, una solución isótropa transparente. Los lípidos PP-G-PG_{1}, PP-G-PG_{2} y PP-G-PG_{3} se disuelven en agua al calentarlos por encima de 40ºC y forman superestructuras. Después haber quedado por debajo de esta temperatura, se forman estructuras laminares que tienen histéresis diversamente pronunciadas, que son reconocibles por una anisotropía (doble refracción en la luz polarizada). La solución de PP-G-PG_{1} se enturbia con la máxima rapidez y el lípido en exceso precipita al dejar reposar a la temperatura ambiente. Las fases laminares de PP-G-PG_{2} y de PP-G-PG_{3} permanecen estables también a bajas temperaturas (hasta de 4ºC). Mientras que la transición desde la fase isótropa a la fase anisótropa a la temperatura ambiente para PP-G-PG_{2} es reconocible después de algunos minutos, esto requiere varias horas para PP-G-PG_{3}. Las diferencias en la polaridad se exteriorizan también en diferentes factores de retención (valores de Rf) en el cromatograma de capa fina sobre gel de sílice.

Claims (17)

1. Compuesto de la Fórmula general (A)
43
en la que R_{1} y R_{2} representan, independientemente uno de otro, hidrógeno, un radical alquilo o acilo saturado o insaturado, que eventualmente puede estar ramificado o/y sustituido, R_{3} representa hidrógeno o un radical alquilo,
n es = 0 ó 1,
x representa un número entero de 1 a 4, y
m representa un número entero de 2 a 10, en el caso de que n sea = 0, o un número entero de 1 a 10, en el caso de que n sea = 1, así como es 1, en el caso de que x sea mayor que 1,
realizándose, en el caso de que n sea = 0, que el compuesto es uniforme en más de un 90%, en lo que respecta al valor de m, exceptuando los compuestos en los que R_{1} = hexadecilo, R_{2} = metilo, n = 1, x = 1 y m = 1.
2. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque
x = 1 y m es un número entero de 2 a 5.
3. Liposomas,
caracterizados porque
contienen fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos, eventualmente colesterol y de 1 a 50% en moles de un compuesto de la Fórmula general (A)
44
o sus sales, realizándose que el colesterol, los fosfolípidos, los alquil-fosfolípidos y el compuesto de la Fórmula (A) proporcionan en común 100% en moles, en donde R_{1} y R_{2} representan, independientemente uno de otro, hidrógeno, un radical alquilo o acilo saturado o insaturado, que eventualmente puede estar ramificado o/y sustituido, y R_{3} representa hidrógeno o un radical alquilo,
n es = 0 ó 1,
x representa un número entero de 1 a 4 y
m representa un número entero de 2 a 10, en el caso de que n sea = 0, o un número entero de 1 a 10, en el caso de que n sea = 1, así como es 1, en el caso de que x sea mayor que 1, realizándose, en el caso de que n sea = 0, que el compuesto es uniforme en más de un 90%, en lo que respecta al valor de m.
\newpage
4. Liposomas de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizados porque
contienen de 5 a 15% en moles del compuesto de la Fórmula (A), realizándose que el colesterol, los fosfolípidos, los alquil-fosfolípidos y el compuesto de la Fórmula (A) proporcionan en común 100% en moles.
5. Liposomas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 ó 4,
caracterizados porque
en la Fórmula (A) x es = 1 y m representa un número entero de 2 a 5.
6. Liposomas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 hasta 5,
caracterizados porque
en la Fórmula (A) n es = 0.
7. Liposomas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 hasta 6,
caracterizados porque
contienen de 25 a 43% en moles de colesterol, de 5 a 15% en moles de un compuesto de la Fórmula general (A) y fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos.
8. Liposomas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 hasta 7,
caracterizados porque
el radical -CH_{2}(-CHOH)_{x}-CH_{2}-OH procede preferiblemente de azúcar-alcoholes, que tienen para x = 2, cuatro grupos hidroxilo, para x = 3, cinco grupos hidroxilo y para x = 4, seis grupos hidroxilo.
9. Liposomas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 hasta 8,
caracterizados porque
su periodo de tiempo de semidescomposición (semivida) en la sangre es por lo menos de 10 h.
10. Liposomas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 hasta 9,
caracterizados porque
contienen adicionalmente una o varias sustancias farmacéuticamente activas.
11. Composición farmacéutica,
caracterizada porque
contiene liposomas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 hasta 10 e, incorporadas en los liposomas, una o varias sustancias farmacéuticamente activas eventualmente en común con agentes diluyentes, coadyuvantes, de vehículo y de relleno farmacéuticamente usuales.
12. Procedimiento para la preparación de liposomas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 hasta 10,
caracterizado porque
de 1 a 50% en moles de un compuesto de la Fórmula general (A), con los otros componentes de los liposomas, en una cantidad, que en común con el compuesto de la Fórmula (A) proporciona 100% en moles, se transforma en una suspensión de lípidos, y la suspensión de lípidos se transforma en liposomas de una manera en sí conocida mediante medidas apropiadas.
13. Procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11,
caracterizado porque
se trabaja de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, y para la incorporación de sustancias activas insolubles en agua, se disuelve la sustancia activa en común con los constituyentes lipídicos, y para la incorporación de sustancias activas solubles en agua se mezcla la película de lípidos con una solución acuosa, que contiene la sustancia activa soluble en agua.
14. Procedimiento para la preparación de un compuesto de la fórmula general
45
en la que R_{1} y R_{2} representan, independientemente uno de otro, hidrógeno, un radical alquilo o acilo saturado o insaturado, que eventualmente puede estar ramificado o/y sustituido, R_{3} representa hidrógeno o un radical alquilo,
n es = 0 ó 1,
x representa un número entero de 1 a 4, y
m representa un número entero de 2 a 10, en el caso de que n sea = 0, o un número entero de 1 a 10, en el caso de que n sea = 1, así como es 1, en el caso de que x sea mayor que 1,
realizándose, en el caso de que n sea = 0, que el compuesto es uniforme en más de un 90%, en lo que respecta al valor de m,
caracterizado porque
un oligoglicerol definido o un azúcar-alcohol C_{4}-C_{6} se encadena con un alcohol de la fórmula CH_{2}OR_{1}-CHOR_{2}-CHOH mediando utilización de un agente de fosforilación.
15. Oligoglicerol protegido de la Fórmula (B)
46
en la que Y representa un número entero de 1 a 9 y X representa un grupo bencilo, alquilo o tetrahidropiranilo, exceptuando el significado de metilo cuando Y es = 1.
16. Alquil-oligoglicerol de la Fórmula (C)
47
en la que Y representa un número entero de 0 a 8 y uno de los radicales X o Z representa un radical alquilo saturado o insaturado y el otro de los radicales representa hidrógeno, exceptuando Y = 0, cuando X es = metilo o uno de los radicales X o Z es C_{16}H_{33}.
\newpage
17. Liposomas,
caracterizados porque
contienen fosfolípidos o/y alquil-fosfolípidos, eventualmente glicerol y de 1 a 50% en moles de un compuesto obtenido de acuerdo con la reivindicación 14.
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