DD240020A1 - Verfahren zur herstellung neuer, pharmakologisch hochwirksamer phospholipide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer, pharmakologisch hochwirksamer Phospholipide, die sich hauptsaechlich vom natuerlich vorkommenden Plaettchen-aktivierenden Faktor durch ihr Substituentenmuster am quaternaeren Stickstoffatom der Phosphocholingruppierung unterscheiden. Das Ziel der Erfindung ist es, durch ein geeignetes Verfahren neue, pharmakologisch hochwirksame Phospholipide auf einfache Weise herzustellen. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch einen einfachen Syntheseweg Phospholipide mit Alkylglycero-3-phospho-N,N-dimethylethanolamin-Struktur mit verschiedenen Alkylhalogeniden umgesetzt werden. Die so veraenderte Phosphocholingruppierung bestimmt wesentlich die pharmakologische Aktivitaet des Molekuels. Die erfindungsgemaess hergestellten Phospholipide koennen zur spezifischen Aktivierung bzw. Desensibilisierung von Thrombozyten und Leukozyten sowie als Wirkstoffe von Antihypertonika und indirekten Fibrinolytika Anwendung finden.

Description

wobei R¹ einen unsubstituierten langkettigen Alkylrest mit 16, 18, oder 20 Kohlenstoffatomen darstellt, für R² eine Methyl-, Ethyl- oder n-Propylgruppe oder aber ein Wasserstoffatom steht und R¹ und R² auch gegenseitig vertauscht sein kann, mit Alkylhalogeniden der allgemeinen Formel II,

R³-X II

wobei R³ einen geradkettigen oder verzweigtenr Alkylrest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, der gesättigt oder ungesättigt, eine Doppel- oder Dreifachbindung enthalten oder substituiert sein kann, oder einen Arylrest, der auch substituiert sein kann, darstellt und X für Chlor, Brom oder Jod steht, zu Verbindungen der allgemeinen Formel IH,

CH-O-R¹

I 2

CH-O-R ^CH3

-0-P-O-CH₀-CH-N-R³

² //\q ²²\

0 0 - CH-

wobei R¹, R² und R³ die oben angegebene Bedeutung besitzen, umgesetzt werden und nachfolgend die Verbindungen der allgemeinen Formel III, worin R¹ und R³ die oben angegebene Bedeutung besitzen und für R² ein Wasserstoffatom steht und R¹ und R² auch gegenseitig vertauscht sein können, mit Derivaten kurzkettiger Carbonsäuren, wie Essig- oder Propionsäure, zu Verbindungen der allgemeinen Formel IV,

CH₂-O-R¹

CH-0-CO-R² CH₃

CH_o-.0-P-0-CH«-CH_p®N-R3 IV

² \ ²N

wobei R¹ und R³ die oben angegebene Bedeutung besitzen und für R² eine Methyl- oder Ethylgruppe steht, umgesetzt werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichent, daß die Umsetzungen unter Verwendung wasserfreier Alkohole, wie Methanol oder Ethanol, in Gegenwart äquivalenter Mengen einer stärkeren Base, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, durchgeführt werden.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzungen mit einem 3molaren Überschuß an Alkylhalogenid und in einem Temperaturbereich von 40 bis 50°C oder Raumtemperatur durchgeführt werden.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzungen unter Verwendung wasserfreier basischer Lösungsmittel, wie Pyridin oder Triethylamin, und mit Säureanhydriden oben genannter Säuren bei 40⁰C durchgeführt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R² in Formel IM ein Wasserstoffatom ist.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer, pharmakologisch hochwirksamer Phospholipide. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur spezifischen Aktivierung bzw. Desensibilisierung von Thrombozyten und Leukozyten sowie als Wirkstoffe von Antihypertonika und Fibrinolytika Anwendung finden.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der Literatur noch nicht beschrieben. Lediglich seit der Strukturaufklärung des Plättchen-aktivierenden Faktors (i-O-Octadecyl/Hexadecyl^-O-acetyl-sn-glycero-S-phosphocholin, platelet-activating factor, PAF) und der Charakterisierung seiner Wirkungen als Mediator allergischer und entzündlicher Reaktionen: Aktivierung von Thrombozyten und Leukozyten, Steigerung der Gefäßpermeabilität, Kontraktion der glatten Muskulatur, Senkung des Blutdruckes und Freisetzung von Plasminogenaktivator, sind zahlreiche Syntheseverfahren dieses physiologischen Mediators beschrieben worden. Prinzipiell lassen sich zwei verschiedene Verfahrenswege unterscheiden:

1. Die totalsynthetischen Verfahren - GODFROID et al., FEBS Letters 116,161 (1980); HEYMANS et al., Biochim. biophysica Acta 666, 230 (1981); HIRTH et al., HeIv. chim. Acta 65,1059 (1982); VAN BOECKEL et al., Synthesis 399 (1982); FUJIFA et al., Tetrahedron Letters 23, 3507 (1982) - bauen zunächst systematisch die Alkylglycerolstruktur in Mehrstufenreaktionen auf und führen letztlich die -Phosphocholingruppierung durch Umsetzen mit 2-Bromethylphosphorsäuredichlorid und anschließendem Austausch des Bromatoms mitTrimethylamin ein.

2. Die partialsynthetischen Verfahren - HANAHAN et al., J. biol. Chem. 254, 9355 (1979); MURAMATSU et al., Chem. Phys. Lipids 29, 121 (1981); HANAHAN et al., J. Lipid Res. 25,198 (1984); WEBER et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20, 238 (1984) -verwenden eine aus nativen Materialien isolierte Vor- oder Zwischenstufe des Wirkstoffes, die entweder die Phosphocholingruppierung bereits beinhaltet oder erst auf genanntem chemischem Wege eingeführt werden muß.

Methodisch erlauben die verschiedenen Verfahrenswege keine Variationen der Phosphocholinkopfgruppe. Nach dem heutigen Kenntnisstand gilt als gesichert, daß die Phosphocholinkopfgruppe im Wirkstoffmolekül als ein wesentliches Strukturmerkmal für die pharmakologische Wirkung angesehen wird. Mitunter reichen hier geringfügige Strukturabwandlungen schon aus, um drastische Änderungen der pharmakologischen Aktivität hervorzurufen - SATOUCHI et al., J. biol. Chem. 256,4425 (1981); TERASHITA et al., Life Sciences 32,1975 (1983) -. In der Literatur sind einige Verfahren zur Herstellung von Phospholipiden mit substituierter Phosphocholingruppierung bekannt- BUSSE et al., BRD Pat. 3 212 387 (1983); ElBL et al., BRD Pat. 2 717 547 (1978) -. Hierbei werden entweder die entsprechenden Bromester dieser Phospholipide mit substituierten tertiären Aminen umgesetzt oder aber die Cholingruppierung enzymatisch mit Phospholipase D gegen einen anderen Aminoalkohol ausgetauscht. Die Verfahren können den Anforderungen einer praktischen Synthese nicht genügen, da die entsprechenden Ausgangsprodukte nicht einfach zugänglich sind und anderenfalls die enzymatische Reaktion mit längerkettigen Aminoalkoholen wenn überhaupt nur in sehr schlechten Ausbeuten verläuft.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein geeignetes technisch anwendbares Verfahren zur Herstellung neuer pharmakologisch hochwirksamer Phospholipide zu entwickeln.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, einen einfach gangbaren Syntheseweg zur Herstellung von neuen pharmakologisch hochwirksamen Phospholipiden aufzufinden. Ausgangsverbindungen sind in an sich bekannter Weise herstellbare Phospholipide mit Ν,Ν-Dimethylethanolaminkopfgruppe. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel I,

CH₂-O-R¹ .

CH-^O-R² C

I Φ/

CH-O-P-O-CH-CH-N-H

²f\₀ \

wobei R¹ einen unsubstituierten langkettigen Alkylrest mit 16,18 oder 20 Kohlenstoffatomen darstellt, für R² eine Methyl-, Ethyl- oder n-Propylgruppe oder aber ein Wasserstoffatom steht und R¹ und R² auch gegenseitig vertauscht sein können, mit Alkylhalogeniden der allgemeinen Formel II,

wobei R³ einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, der gesättigt oder ungesättigt, eine Doppeloder Dreifachbindung enthalten oder substituiert sein kann, oder einen Arylrest, der auch substituiert sein kahn, darstellt und X für Chlor, Brom oder Jod steht, zu Verbindungen der allgemeinen Formel III,

CH₀-O-R¹

CH-O-R^{2 CH}3

CH -0-P-O-CH -CH -N-R³ 2 /,v ^{2 2} \

wobei R¹, R² und R³ die oben angegebene Bedeutung besitzen, umgesetzt werden.

Die Umsetzungen werden in wasserfreien Alkoholen, wie Methanol, Ethanol oder in Lösungsmittelgernischen von Methanol/Tetrahydrofuran (1:1), in Gegenwart äquivalenter Mengen einer stärkeren Base, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, durchgeführt. Zur Erhöhung der Ausbeute kann die Menge des Alkylhalogenids auch im Überschuß eingesetzt werden. Besonders bevorzugt erfolgt die Umsetzung mit einem 3molaren Überschuß an Alkylhalogenid in Gegenwart von Natriumhydroxid in Methanol. Die Reaktionen werden möglichst unter Feuchtigkeitsausschluß in einem Temperaturbereich von 40 bis 50⁰C durchgeführt, allerdings kann in einigen Fällen auch bei Raumtemperatur gearbeitet werden.

Verbindungen der allgemeinen Formel IM,

wobei R¹ und R³ die oben angegebene Bedeutung besitzen und für R² ein Wasserstoffatom steht und R¹ und R² auch gegenseitig vertauscht sein kann, werden mit geeigneten Derivaten kurzkettiger Carbonsäuren, wie Essigsäure oder Propionsäure zu _ Verbindungen der allgemeinen Formel IV,

CH	—0-CO-R2	Chi	CH3
CH		Φ/ ^3
ι	-0-P-O-CH0-CH	-N-R°
CH	2 // \	2 \
	ο οθ

IV

wobei R¹ und R³ die oben angegebene Bedeutung besitzen und für R² eine Methyl- oder Ethylgruppe steht, umgesetzt. Geeignete Derivate sind Säureanhydride oder Säurechloride obengenannter Carbonsäuren. Die Umsetzungen erfolgen in wasserfreien organischen Lösungsmitteln, wie Pyridin, Triethylamin oder Chinolin oder in Lösungsmittelgemischen von Chloroform/Pyridin bzw. Chloroform/Triethylamin (1:1). Bevorzugt werden Pyridin als Lösungsmittel und Säureanhydride als Acylierungsreagenzien, die zweckmäßigerweise im 8molaren Überschuß eingesetzt werden. Die Umsetzungen werden bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur bis 40 ⁰C durchgeführt.

Die Reaktion von IM zu IV verläuft dann besonders glatt, wenn R² in III gleich H bedeutet, wobei R² und R¹ in ihrer Stellung gegenseitig vertauscht sein können.

Überraschenderweise zeigen die erfindungsgemäßen Phospholipide wesentlich bessere pharmakologische Wirkungen, als die aus dem gegenwärtigen Stand der Technik bekannten Verbindungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen induzieren bereits in sehr niedrigen Konzentrationen die Blutplättchenaggregation, besitzen eine starke antihypertensive Wirkung und Plasminogenaktivator-freisetzende Eigenschaften. Diese Ergebnisse waren beim Stand der Technik nicht zu erwarten und stellen somit eine wertvolle Bereicherung der auf diesen Gebieten bekannten Wirkstoffe dar. Die Erfindung wird an den nachstehenden Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

i-O-Hexadecylglycero-S-phosphorsäure^'-N-ethyl-N.N-dimethylammoniumethylester (III mit R' = C_i6H₃₃, R² = H und R³ = C₂H₅) 194 mg = 0,4 mmol I (R¹ = H₃₃, R² = H) und 16 mg gepulvertes Natriumhydroxid werden in 15 ml getrocknetem Methanol gelöst. Nach Zugabe von 170 mg = 1,2 mmol Il (R³ = C₂H₅₁X = J) wird das Reaktionsgemisch in einem festverschlossenen Kolben auf dem Wasserbad bei 4O⁰C temperiert. Nach 12 Stunden Reaktionszeit zeigt die dünnschichtchromatographische Kontrolle vollständige Umsetzung an. Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt, tropfenweise mit 1N Salzsäure neutralisiert und durch Zugabe von 15 ml Chloroform sowie 10 ml Wasser die organische Phase abgetrennt. Nach Zufügen von 20 ml Natriumacetatlösung (0,1 mol/l), 30 ml Methanol und 10 ml Chloroform wird geschüttelt, die organische Phase abgetrennt und i. Vak. eingedampft. Der feste Rückstand wird aus einem Gemisch von Aceton/Chloroform (4:1) umgefällt und im Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält über 90% des reinen Endproduktes als weiße hygroskopische Substanz. Elementaranalyse: C₂₅H₆₄NO₆P x H₂O (513,7)

Ber.: N 2,73 P 6,03

Gef.: N 2,68 P 6,12

Beispiel 2 .

i-O-Hexadecylglycero-S-phosphorsäure^'-N-propyl-N.N-dimethylammoniumethylester (III mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = H und R³ = η - C₃H₇) 194 mg = 0,4 mmol I (R¹ = C₁₆H₃₃, R² = H) und 16 mg gepulvertes Natriumhydroxid werden in 15 ml getrocknetem Methanol gelöst. Nach Zugabe von 205 mg = 1,2 mmol Il (R³ = η -C₃H₇, X = J) wird die Reaktionsmischung im verschlossenen Kolben auf dem Wasserbad 30 Stunden bei 5OC temperiert. Die dünnschichtchromatographische Kontrolle des Reaktionsverlaufs zeigt etwa 80proz. Umsatz an. Die erkaltete Reaktionslösung wird tropfenweise mit 1N Salzsäure neutralisiert, nach Zugabe von 15 ml Chloroform sowie 10 ml Wasser die organische Phase getrennt und i. Vak. zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 25 ml Chloroform, 30 ml Methanol und 25 ml Natriumacetatlösung (0,1 mol/l) geschüttelt, die organische Phase abgetrennt und i. Vak. bis zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wird säulenchromatographisch an 20 gi<ieselgel 60 (Merck) mit Chloroform/Methanol (100:35) als Elutionsmittel gereinigt, anschließend aus Aceton/Chloroform (4:1) umgefällt und im Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält 70% des reinen Endproduktes als farblose hygroskopische Substanz. Elementaranalyse: C₂₆H₅₆NO₆P x H₂O (527,7)

Ber.: N 2,65 P 5,87

Gef.: N 2,58 P 5,94

Beispiel 3

i-O-Hexadecylglycero-S-phosphorsäure^-N-allyl-N.N-dimethyl-ammoniumethylester (III mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = H und R³ = C₃H₅) 145 mg = 0,3 mmol I (R' = C₁₆H₃₃, R² = H) und 12 mg gepulvertes Natriumhydroxid werden in 15 ml getrocknetem Methanol gelöst. Nach Zugabe von 110 mg = 0,9 mmol Il (R³ = C₃H₅, X= Br) wird die Reaktionsmischung im verschlossenen Kolben bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach 5 Stunden zeigt die dünnschichtchromatographische Kontrolle des Reaktionsverlaufs vollständigen Umsatz an. Das Reaktionsgemisch wird tropfenweise mit 1N Salzsäure neutralisiert und durch Zugabe von 15 ml Chloroform und 10 ml Wasser die organische Phase abgetrennt. Nach Zugabe von 30 ml Methanol, 20 ml Natriumacetatlösung (0,1 mol/l) sowie 10 ml Chloroform wird kräftig geschüttelt, die organische Phase abgetrennt und i. Vak. bis zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird aus einem Gemisch von Aceton/Chloroform (4:1) umgefällt und im Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält 95% des reinen Endproduktes als weiße hygroskopische Substanz. Elementaranalyse: C₂₆H₅₄NO₆Px H₂O (525,7) Ber.: N 2,66 P 5,89 Gef.: N 2,62 P 5,83

Beispiel 4

i-O-Hexadecylglycero-S-phosphorsäure^'-N-carboxymethyl-N^-dimethylammoniumethylester (III mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = H und Ra = CI-¹ .,0OH)

194mg = 0,4mmol I (R¹ = C₁₆H₃₃, R² = H), 24 mg gepulvertes Natriumhydroxid und 223 mg = 1,2 mmol Il (R³ = CH₂COOH, X = J) wird in 15 ml getrocknetem Methanol gelöst und im verschlossenen Kolben bei 30⁰C stehengelassen. Nach 20 Stunden ist das Aüsgangsprodukt vollständig umgesetzt, wie die dünnschichtchromatographische Kontrolle zeigt. Die Reaktionslösung wird tropfenweise mit 1N Salzsäure (pH = 2) angesäuert und durch Zugabe von 15 ml Chloroform sowie 10 ml Wasser die Phasen getrennt. Die wäßrige Phase i. Vak. bis zur Trockne eingeengt und mit 10 ml getrocknetem Aceton versetzt. Der unlösliche Rückstand wird abgesaugt, mehrfach mit kaltem getrocknetem Aceton gewaschen und im Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält 80% des reinen Endproduktes als weißes hygroskopisches Pulver. Elementaranalyse: C₂₅H₅₂NO₈X H₂O (543,7) Ber.: N 2,58 P 5,70 Gef.: N 2,49 P 5,75

Beispiel 5

i-O-Hexadecylglycero-S-phosphorsäure^'-N-propan^S-diol-N.N-dimethylammoniumethylester (IM mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = CH₃und R³ = CH₂-CHOH-CH₂-OH) 200 mg = 0,4 mmol 1-(R¹ = C₁₆H₃₃, R² = CH₃), 16 mg gepulvertes Natriumhydroxid und 242 mg = 1,2 mmol Il (R³ = CH₂-CHOH-CH₂-OH₁X = J) in 15 ml getrocknetem Methanol werden analog Beispiel 2 umgesetzt. Man erhält nach säulenchromatographischer Reinigung an 15 g Kieselgel 60 (Merck) mit Chloroform/Wasser durch kontinuierliche Erhöhung der Polarität von (100:45:1) auf (100:50:5) 60% des reinen Endprodukts in Form einer wachsartigen stark hygroskopischen Substanz.

Elementaranalyse: C₂₇H₅₇NO₈P x H₂O (572,8) Ber.: N 2,45 P 5,41 Gef.: N 2,37 P 5,52

Beispiel 6

i-O-Hexadecylglycero-S-phosphorsäure^'-N-ethyl-N.N-dimethylammoniumethylester (IV mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = CH₃ und R³ = C₂H₅) 77 mg =0,15 mmol getrocknetes III (R' = C₁₆H₃₃, R² = H und R³ = C₂H₅) werden in 190 mg = 2,4 mmol getrocknetem Pyridin sowie 122 mg = 1,2 mmol Essigsäureanhydrid suspendiert und in einem verschlossenen Kolben 8 Stunden im Wasserbad auf 40°C temperiert. Die dünnschichtchromatographische Kontrolle zeigt nahezu vollständigen Umsatz an. Zur Reaktionslösung werden 2 ml Wasser hinzugegeben, eine weitere Stunde auf 40°C erwärmt, über Nacht stehengelassen und lyophilisiert. Der Rückstand wird säulenchromatographisch an 15 g Kieselgel 60 (Merck) mit Chloroform/Methanol/Wasser (70/35/5) gereinigt und aus Chloroform/Aceton (1:6) umgefällt. Man erhält 70% des analysenreinen Endprodukts als weiße, stark hygroskopische Substanz. Elementaranalyse: C₂₇H₅₆NO₇P= H₂O (555,7) Ber.: N 2,52 P 5,57

Gef.:N2,61 P 5,43 ,.,,,,„_. -

Beispiel 7

i-O-Hexadecyl^-O-acetylglycero-S-phosphorsäure^'-N-propyl-N.N-dimethylammoniumethylester (IV mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = CH₃ und R^n-C₃H₇)

79 mg = 0,15 mmol III (R¹ = C₁₆H₃₃, R² = H und R³ = n-C₃H₇) werden analog Beispiel 6 umgesetzt. Man erhält nach säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel 60 (Merck) mit Chloroforom/Methanol/Wasser (70:35:3) als Elutionsmittel 70% des reinen Endproduktes in Form einer weißen stark hygroskopischen Substanz.

Elementaranalyse: C₂₇H₅₈NO₇Px H₂O (569,8) Ber.: N 2,46 P 5,44 Gef.: N 2,48 P 5,39

Beispiel 8

i-O-Hexadecyl^-O-acetylglycero-S-phosphorsäure^'-N-allyl-N^-dimethylammoniumethylester (IV mit R' = C₁₆H₃₃, R² = CH₃ und ^ = C₃H₅)

79 mg = 0,15 mmol III (R¹ = C₁₆H₃₃, R³ = H und R³ = C₃H₅) werden analog Beispiel 6 umgesetzt. Man erhält nach "slljTelichrornatögräphischer^ReinigüngTnKieselgeröÖ (Merck) mit Chloroform/Methanol (100:40) als Elutionsmittel 65% des analysenreinen Endproduktes als weißes stark hygroskopisches Pulver. Elementaranalyse: C₂₇H₅₆NO₇P x H₂O (567,7) Ber.: N 2,48 P 5,46

Ciaf M 0 ε,Ι P R RA Beispiel 9

i-O-Hexadecyl^-O-acetylglycero-S-phosphorsäure^'-N-carboxy-methyl-N^-dimethylammoniumethylester (IV mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = CH₃ und R³ = CH₂COOH) 81 mg = 0,15 mmol III (R' = C₁₆H₃₃, R² = H und R² = CH₂COOH) werden analog Beispiel 6 umgesetzt. Man erhält nach säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel 60 (Merck) mit Chloroform/Methanol/Wasser (70:35:3) als Elutionsmittel 50% des reinen Endproduktes als weiße stark hygroskopische Substanz.

Elementaranalyse: C₂₆H₅₄NO₉P χ H₂O (585,7) Ber.: N 2,39 P 5,29 Gef.: N 2,46 P 5,36

Beispiel 10-15 Auf analoge Weise wie in den Beispielen 1-9 beschrieben wurden folgende Verbindungen hergestellt.

Beispiel 10

i-O-Hexadecyl^-O-methylglycero-S-phosphorsäure^'-N-benzyl-N.N-dimethylammoniumethylester (III mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = CH₃ und R³ = CH₂-C₆H₆) C₃₁H₆₀NO₇P (589,8) Nachweis durch Dünnschichtchromatographie

Beispiel 11

i-O-Hexadecyl^-O-methylglycero-S-phosphorsäure^'-N-hydroxy-ethyl-N^-dimethylamrnoniumethylester (III mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = CH₃ und R³ = CH₂-CH₂-OH) C₂₆H₅₈NO₈P (543,7) Nachweis durch Dünnschichtchromatographie

Beispiel 12

i-O-Hexadecyl^-O-ethylglycero-S-phosphorsäure^'-N-bromethyl-N.N-dimethylammoniumethylester (IM mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = C₂H₅ und R³ = C₂H₅-Br) C₂₇H₅SBrNo₇P (620,7) Nachweis durch Dünnschichtchromatographie

Beispiel 13

i-O-Hexadecyl^-O-ethylglycero-S-phosphorsäure^'-N-propagyl-N^-dimethylammoniurnethylester (III mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = C₂H₅ und R³ = C₃H₃

Nachweis durch Dünnschichtchromatographie

Beispiel 14

i-O-Hexadecylglycero-S-phosphorsäure^'-N-butyl-N.N-dimethylammoniumethylester (III mit R¹ = C₁₆H₃₃, R² = H und R³ = n-C₄H₉) C₂₇H₆₀NO₇P (541,9) Nachweis durch Dünnschichtchromatographie

Beispiel 15

i-O-Methyl^-O-hexadecylglycero-S-phosphorsäure^'-N-ethyl-N.N-dimethylammoniumethylester (IM) mit R¹ = CH₃, R² = C₁₆H₃₃ und

C₂₆H₅₈NO₇P (527,7) Nachweis durch Dünnschichtchromatographie Im folgenden wird die pharmakologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen am Beispiel der Aktivierung sowie Desensibilisierung von Thrombozyten beschrieben.

Thrombozytenaktivierung*

Die Thrombozytenaktivierende Wirkung wurde mittels des von Born (J. Physiol. [London] 162, 67-68,1962) entwickelten Aggregationstestes unter Verwendung eines Zweikanalaggregometers, Typ ELVI 840 der Firma Elvi Logos (Mailand, Italien) unter Standardbedingungen bestimmt.

0,5 ml plättchenreiches Plasma (PRP), das aus humanem Zitratblut bzw. aus heparinisiertem Kaninchenblut durch Differentialzentrifugation präpariert wurde, wird auf 37°C erwärmt und mit einer konstanten Geschwindigkeit von 900 U/min gerührt. Man setzt 50 μΙ der betreffenden, in HSA-PBS (2,5 mg Humanserumalfjumin pro ml Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,4) gelösten Verbindung zu und ermittelt die maximale Transmissionsänderung, die innerhalb von 4 min nach Zugabe der Substanz erfolgt. Als Bezug (100% Aggregation) dient die nach Zugabe von PAF (IV, R¹ = C₁₆H₃₃, R² = R³ = CH₃) in einer Endkonzentration von 10 μπιοΙ/Ι beobachtete maximale Transmissionsänderung. Tabelle 1 enthält die ermittelten EC₆₀-WeIIe.

Desensibilisierung der Thrombozyten gegenüber einer Aktivierung durch den PAF

Humanes PRP wird für mindestens 10 min bei 37 ⁰C mit Acetylsalizylsäure in einer Endkonzentration von 1 mmol/l inkubiert. 0,5 ml derart vorbehandelten PRP's wird für genau 4 min mit abgestuften Konzentrationen der zu untersuchenden Verbindung ohne zu Rühren bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgt die Auslösung der Thrombozytenaggregation durch Zugabe von PAF in einer Endkonzentration von 10 Mmol/l. Als Bezug (100% Aggregation) wird PRP eingesetzt, welches für 4 min mit der entsprechenden

Menge HSA-PBS vorinkubiert worden ist.

Durchführung und Auswertung der Aggregation erfolgten wie vorgehend beschrieben. Die ermittelten IC₅₀-WeIIe sind in Tabelle 2

zusammengefaßt.

Tabelle 1: Thrombozytenaggregierende Wirkung

Verbindung

R'

R² R³

Mensch	EC50	Kaninchen
> 100 Mmol/l	EC50
(n = 5)	> 100 Mmol/l
> 100 Mmol/l	(n = 3)
(n = 3)	18+ 6 Mmol/l
> 100 Mmol/l	(n = 3) .
(n = 3)	- 12 ±4 Mmol/l
> 100 Mmol/l .	(n=3)
<n^3)	18 dz 11 Mmol/l
> 100 Mmol/l .	(n = 3)
(n = 3)	> 100 Mmol/l
> 100 Mmol/l	(n = 3)
(n = 3),	35 + 15 Mmol/l
101 +50 nmol/l	(n = 3)
(n = 7)	4,6 + 0,9 nmol/l
25 + 6 nmol/l	(n = 3)
(n=5)	1,5+ 0,2 nmol/l
62 ± 4 nmol/l	(n = 3)
(n = 5)	3,2 ± 1,8 nmol/l
38 + 2 nmol/l	(n = 3)
(n = 4)	2,0 + 0,6 nmol/l
> 100 Mmol/l	(n = 3)
(n = 2)	5,0 ± 1,8 Mmol/l
(n = 2)

(lyso-PAF)

IV (PAF) IV IV IV IV

C16H33	H	CH3
C16H33	H	C2H5
C16H33	H	η-C3H7
C16H33	H	C3H5
C16H33	H	CH2-COOH
C16H33	CH3	CH-CH-CH- i I I
		: oh oh

Cigri33 CH3 CH3

C16H33 CH3 C2H5

C16H33 CH3 Π ~~ C3H7

C16H33 CH3 G3H5

C₁₆H₃₃ CH₃ CH₂-COOH

Tabelle 2: Desensibilisierende Wirkung gegenüber einer Aktivierung durch den PAF

Verbin	R1	R2	R3	CH3	IC50
dung
III	C16H33	H	CH3	C2H5	> 100 Mmol/l
(lyso-PAF)					(η = 2)
Ml	C16H33	H	C2H5	η-C3H7	> 100 Mmol/l
					(η = 2)
III	C16H33	H	η-C3H7	C3H5	> 100 Mmol/l
					(η = 2) .
III	C16H33	H	C3H5	CH2-COOH	> 100 Mmol/l
				(η =2)
III	C16H33	H	CH2-COOH	> 100 Mmol/l .
				(η = 2)
III	C16H33	CH3	CH2CH-CH2	> 100 Mmol/l
			I I	(η = 2)
			OH OH
IV	C16H33	CH3	18 ± 11 nmol/l
(PAF)			(η = 9)
IV	C16H33	CH3	4,1 + 2,2 nmol/l
			(η = 3)
IV	C16H33	CH3	21,0 + 14 nmol/l
			(η = 3)
IV	C16H33	CH3	4,6 + 0,2 nmol/l
			(η = 2)
IV	C16H33	CH3	15,0+ 7 Mmol/l

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung neuer pharmakologisch hochwirksamer Phospholipide, dadurch gekennzeichnet, daß Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel I,

   CH₂-O-R¹

   CH-0-R² CH

   CH₂-O-P-O-CH-CH-N-H 1 '

   0 0^Θ CH₃