ES2097717T5

ES2097717T5 - Dna codificante de un receptor de neuropeptido y/peptido yy/polipeptido pancreatico humano (y4) y sus aplicaciones.

Info

Publication number: ES2097717T5
Application number: ES95907215T
Authority: ES
Inventors: Jonathan A. Bard; Mary W. Walker; Theresa Branchek; Richard L. Weinshank
Original assignee: H Lundbeck AS
Current assignee: H Lundbeck AS
Priority date: 1993-12-28
Filing date: 1994-12-28
Publication date: 2010-10-18
Anticipated expiration: 2014-12-28
Also published as: WO1995017906A1; DE69423007T2; JPH09511127A; GR970300026T1; EP0746332B2; ATE189607T1; EP0746332A1; AU702438B2; DE69423007D1; DE69423007T3; CA2156272A1; CA2156272C; DE746332T1; EP0746332A4; DK0746332T4; EP0746332B1; JP4216326B2; ES2097717T3; DK0746332T3; US5958709A

Abstract

20101018

Description

DNA codificante de un receptor de neuropéptido Y/péptido YY/polipéptido pancreático humano (Y4) y sus aplicaciones.

A todo lo largo de esta solicitud de patente, se hace referencia entre paréntesis a diversas publicaciones con indicación de autor y año. Las citas completas de estas referencias pueden encontrarse al final de la memoria descriptiva, precediendo inmediatamente a las reivindicaciones. La descripción de estas publicaciones se incorpora por la presente por referencia en esta solicitud para describir más plenamente la técnica a la que se refiere la presente invención.

Los neuropéptidos son pequeños péptidos procedentes de grandes proteínas precursoras sintetizadas por las neuronas peptidérgicas y las células endocrinas/paracrinas. Dichos péptidos hacen concebir esperanzas para el tratamiento de trastornos neurológicos, psiquiátricos, y endocrinos (De Wied, 1990). A menudo, los precursores contienen múltiples péptidos biológicamente activos. Existe gran diversidad de neuropéptidos en el cerebro causados por el empalme alternativo de transcritos de genes primarios y el procesamiento de precursores diferenciales. Los receptores de neuropéptidos sirven para discriminar entre ligandos y activar las señales apropiadas. Así, es de esperar que los receptores de neuropéptidos estén constituidos por un gran número de miembros.

El neuropéptido Y (NPY), un péptido de 36 aminoácidos, es el neuropéptido más abundante identificado en el cerebro de los mamíferos. NPY es un regulador importante tanto en el sistema nervioso central como en el periférico (Heilig et al., 1990) e influye en una diversa gama de parámetros fisiológicos, con inclusión de los efectos sobre la actividad psicomotriz, la toma de alimentos, la secreción endocrina central, y la vasoactividad en el sistema cardiovascular. Concentraciones elevadas de NPY se encuentran en los nervios simpáticos que atienden a la vasculatura coronaria, cerebral, y renal, y ha contribuido a la vasoconstricción. Se han identificado sitios de fijación de NPY en una diversidad de tejidos, con inclusión del bazo (Lundberg et al., 1988), las membranas intestinales, el cerebro (Hinson et al., 1988), la musculatura lisa aórtica (Mihara et al., 1989), el riñón, los testículos, y la placenta (Dumont et al., 1992). Adicionalmente, se han registrado sitios de fijación en varias líneas de células de rata y humanas (v.g. Y1 en células SK-N-MC, MC-YXC, CHP-212, y PC12; Y2 en células SK-N-Be(2), CHP-234, y SMS-MSN) (Aakerlund et al., 1990; Grundemar et al., 1993).

NPY forma una familia (denominada la familia de polipéptidos pancreáticos) junto con el polipéptido pancreático (PP) y el péptido YY (PYY), que se componen todas ellas de 36 aminoácidos y tienen una estructura terciaria común, el denominado pliegue PP (Glover et al., 1985). Características específicas de esta familia incluyen una hélice de poliprolina en los restos 1 a 8, una vuelta \beta en los restos 9 a 14, una hélice \alpha en los restos 15 a 30, un término C proyectado hacia fuera en los restos 30 a 36, y una amida carboxi-terminal que parece ser crítica para la actividad biológica (Schwartz et al., 1990). El residuo amidado del terminal C de estos péptidos es esencial para la actividad biológica (Wahlestedt et al., 1986). Los estudios realizados con fragmentos peptídicos de NPY han indicado que existen subtipos múltiples de receptores NPY (Wahlestedt et al., 1986). Han sido definidos tres subtipos principales de receptores NPY (Y1, Y2 e Y3) por criterios farmacológicos, con un cuarto receptor Y1 "atípico" que ha sido propuesto para regular el comportamiento relacionado con la alimentación. El único receptor NPY que ha sido clonado hasta la fecha es el gen del receptor Y1, de ratón (Eva et al., 1992), rata (Eva et al., 1990), y humano (Larhammar et al., 1992). Una de las características farmacológicas clave que distinguen Y1 e Y2 es el hecho de que el receptor Y1 (y no el receptor Y2) responde a un análogo de NPY modificado en los restos 31 y 34 ([Leu31,Pro34]NPY), en tanto que el receptor Y2 (y no el receptor Y1) tiene afinidad elevada para el fragmento del terminal carboxilo del péptido NPY, NPY-(13-36) (Wahlestedt et al., 1986; Fuhlendorff et al., 1990).

Los genes de receptores para los otros dos péptidos estructuralmente afines, el péptido YY (PYY) y el polipéptido pancreático (PP), tampoco han sido clonados hasta ahora. el péptido YY se encuentra principalmente en las células endocrinas del tracto gastrointestinal inferior (Bottcher et al., 1984). Los receptores para PYY fueron descritos por primera vez en el intestino delgado de la rata (Laburthe et al., 1986). Este receptor ha sido definido como preferente para PYY debido a que presenta una afinidad de cinco a diez veces mayor para PYY que para NPY (Laburthe et al., 1986; Laburthe, 1990). Recientemente se ha descrito una línea de células, PKSV-PCT, derivada de los túbulos proximales de los riñones, que expresa receptores para PYY (Voisin et al., 1993). El polipéptido pancreático está localizado predominantemente en las células endocrinas de los islotes pancreáticos (Alumets et al., 1978). PP inhibe la secreción exocrina pancreática y la contracción de la vesícula biliar (Schwartz, 1983). Es interesante que PP no parece sintetizarse o localizarse en el sistema nervioso central (Di Maggio et al., 1985), pero se han encontrado sitios de fijación selectiva de PP en diversas áreas del cerebro, tales como el área postrema y los núcleos adyacentes, regiones permeables situadas en la barrera hematoencefálica (Whitcomb et al., 1990). Los receptores de PP tienen una afinidad mucho mayor para PP que para NPY o PYY (Inui et al., 1990). Se ha demostrado que PP se fija con alta afinidad a los sitios de fijación en una línea de células de feocromocitoma, PC12 (Schwartz et al., 1987). El orden de rangos de afinidad para los receptores farmacológicamente definidos de NPY y péptidos afines se enumera en la Tabla 1.

Empleando un enfoque de escrutinio de homología para clonar nuevos genes receptores de NPY, los autores de la invención describen en esta memoria el aislamiento y la caracterización de un nuevo clon receptor NPY/PYY/PP que ha sido designado por los autores como Y4. Parece ser que el receptor Y4 tiene un perfil farmacológico singular, con relación a otros receptores afines a NPY, exhibiendo afinidad máxima para el polipéptido pancreático propiamente dicho. Este clon receptor permitirá examinar ulteriormente la posibilidad de diversidad de receptores y la existencia de subtipos múltiples dentro de esta familia de receptores. Estos podrían servir luego como herramientas inestimables para el diseño de fármacos destinados a varias condiciones patofisiológicas tales como pérdida de memoria, depresión, ansiedad, epilepsia, dolor, hipertensión, problemas locomotores, trastornos del ritmo circadiano, trastornos de la relación alimentación/peso corporal, trastornos sexuales y/o relacionados con la reproducción, congestión nasal, diarrea, y trastornos gastrointestinales y cardiovasculares.

Esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Y4 humano, es decir, un receptor caracterizado por un perfil farmacológico característico del receptor Y4 humano que se muestra en la Tabla 6.

Esta invención proporciona también una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Y4 de rata, por ejemplo un receptor caracterizado por un perfil farmacológico característico del receptor Y4 de rata que se muestra en la Tabla 6.

Esta invención proporciona también una proteína aislada que es un receptor Y4 humano o de rata y es codificada por las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente.

Esta invención proporciona un vector que comprende las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente.

Esta invención proporciona también vectores tales como plásmidos y baculovirus que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente, adaptados para expresión en una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero que comprenden adicionalmente los elementos reguladores necesarios para la expresión del ácido nucleico en las células bacterianas, de levadura, de insecto o de mamífero enlazadas operativamente al ácido nucleico que codifica el receptor Y4 a fin de permitir la expresión del mismo.

Esta invención proporciona una célula de mamífero que comprende las moléculas de ácido nucleico que codifican un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente.

Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede fijarse específicamente a un receptor Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan el ácido nucleico que codifica un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente con el ligando en condiciones que permiten la fijación de ligandos a dicho receptor Y4, y detectar la presencia de cualquiera de los ligandos fijados a un receptor Y4, determinando con ello si el ligando se fija específicamente a un receptor Y4 humano o de rata.

Esta invención proporciona también un método para determinar si un ligando es un agonista de los receptores Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan el ácido nucleico que codifica el receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente con el ligando en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4 a partir de las células, y detectar por medio de un bioensayo, tal como una respuesta de un segundo mensajero, un aumento en la actividad del receptor Y4, determinando de este modo si el ligando es un agonista de los receptores Y4 humano o de rata.

Esta invención proporciona adicionalmente un método para determinar si un ligando es un antagonista de los receptores Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan el ácido nucleico codificante de un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente con el ligando en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4, y detectar por medio de un bioensayo, tal como una respuesta de un segundo mensajero, una disminución en la actividad de los receptores Y4, determinando de este modo si un ligando es un antagonista de los receptores Y4 humano o de rata.

Esta invención proporciona adicionalmente un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos de fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan el ácido nucleico codificante de un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente con una pluralidad de compuestos, y determinar aquellos compuestos que se fijan a la célula, identificando con ello los candidatos de fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4 humano o de rata.

Esta invención proporciona también un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos de fármacos que actúan como agonistas de un receptor Y4 humano o de rata que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan el ácido nucleico codificante de un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente con una pluralidad de compuestos en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4, y determinar aquellos compuestos que activan el receptor en la célula utilizando un bioensayo, tal como un ensayo de segundo mensajero, identificando con ello los candidatos de fármacos que actúan como agonistas de los receptores Y4 humano o de rata.

Esta invención proporciona un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridarse específicamente a una molécula de mRNA que codifica un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente, a fin de prevenir la traducción de la molécula de mRNA.

Esta invención proporciona un anticuerpo dirigido a un receptor Y4 humano o de rata, codificado por la molécula de ácido nucleico que se ha mencionado anteriormente.

Esta invención proporciona un método de preparación del receptor Y4 humano o de rata purificado y aislado codificado por el ácido nucleico que se ha mencionado anteriormente, que comprende a) construir un vector adaptado para expresión en una célula que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ácido nucleico en la célula enlazados operativamente al ácido nucleico codificante de un receptor Y4 con objeto de permitir la expresión del mismo, en el cual la célula se selecciona del grupo constituido por células bacterianas, células de levadura, células de insecto y células de mamífero; b) insertar el vector del paso a en una célula huésped adecuada; c) incubar las células del paso b en condiciones que permiten la expresión de un receptor Y4; d) recuperar el receptor así producido; y e) purificar el receptor así recuperado, preparando de este modo un receptor Y4 aislado y purificado.

Esta invención proporciona también un método de preparación del receptor Y4 humano o de rata aislado, que comprende insertar el ácido nucleico codificante de un receptor Y4 humano o de rata como se ha mencionado anteriormente en un vector adecuado, insertar el vector resultante en una célula huésped adecuada, recuperar el receptor producido por la célula resultante, y purificar el receptor así recuperado.

Esta invención proporciona un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de fijarse específicamente con cualesquiera secuencias de una molécula de mRNA que codifica el receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente, a fin de impedir la traducción de moléculas de mRNA que codifican el receptor Y4.

Figura 1

Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida de un nuevo Receptor de Neuropéptidos Humano hp25a (Secuencia I.D. Núms. 1 y 2). Los nucleótidos se presentan en la orientación 5' a 3', y la región codificante se numera partiendo de la metionina de iniciación y finalizando en el codón de terminación. Se muestra la secuencia de aminoácidos deducida por traducción de un marco de lectura abierto largo junto con las regiones 5' y 3' no traducidas. Los números situados en los márgenes izquierdo y derecho representan numeraciones de nucleótidos (línea superior) y de aminoácidos (línea inferior), partiendo de la primera posición como adenosina (A) y la metionina de iniciación (M), respectivamente.

Figura 2

Alineación de la secuencia del clon humano hp25a con genes receptores Y1 humano, Y1 de rata, e Y1 de ratón. La secuencia de aminoácidos deducida del receptor humano hp25a (Y4) (línea primera), a partir de la metionina de iniciación (M) al codón de parada (*), está alineada con el clon del receptor Y1 humano (Larhammar et al., 1992), el clon del receptor Y1 de rata (Eva et al., 1990), y el clon del receptor Y1 de ratón (Eva et al., 1992). Los guiones representan espacios añadidos necesarios para una alineación apropiada. El sombreado gris indica restos en los clones receptores que son idénticos a hp25a. Los números situados encima de las secuencias de aminoácidos corresponden a las posiciones de aminoácidos de hp78a, partiendo de la metionina de iniciación (M) y finalizando con el codón de terminación (*), y con inclusión de los espacios para justificar una alineación apropiada. Las barras de trazo grueso situadas por encima de la secuencia indican las siete regiones supuestas que se extienden más allá de la membrana (TM) (TM I-VII).

Figura 3

Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida del receptor Y4 de rata codificado por rs16b (Núms. I.D. de Secuencia y ). Los nucleótidos se presentan en la orientación 5' a 3' y la región codificante se numera partiendo de la metionina de iniciación supuesta y finalizando en el codón de terminación. Se muestra la secuencia de aminoácidos deducida por traducción de un marco de lectura abierto largo, junto con regiones 5' y 3' no traducidas. La secuencia de aminoácidos se representa utilizando abreviaturas de una sola letra.

Figura 4

Alineación de los receptores Y4 de rata y humano. Se muestran las secuencias de aminoácidos predichas del receptor Y4 de rata (Y4 rat) y receptor Y4 humano (Y4 hum); las secuencias tienen una identidad global de 75% y una identidad de 84% en los dominios transmembrana. Se muestran abreviaturas de una sola letra para los aminoácidos. Las siete regiones supuestas que se extienden más allá de la membrana (TM) (TM I-VII) se indican por corchetes encima de la secuencia.

Figura 5

Fijación en equilibrio de ^{125}I-PYY a membranas de células COS-7 que expresan transitoriamente receptores hp25a. Las membranas se incubaron con ^{125}I-PYY durante los tiempos indicados, en presencia o ausencia de PP humano 100 nM. La fijación específica, B, se representó en función del tiempo, t, para obtener el número máximo de sitios de fijación en equilibrio, B_{t}, y la tasa de asociación observada, K_{obs}, de acuerdo con la ecuación, B = B_{t} * (1 - e^{-(kobs \ * \ t)}). La fijación se muestra como el porcentaje de fijación total en equilibrio, B_{t}, determinado por análisis de regresión no lineal. Los datos son representativos de tres experimentos independientes, determinándose cada punto por triplicado.

Figura 6A

Fijación saturable en equilibrio de ^{125}I-PYY a membranas de células COS-7 que expresan transitoriamente receptores hp25a. Las membranas se incubaron con ^{125}I-PYY de concentraciones comprendidas entre 0,003 nM y 2 nM, en presencia o ausencia de PP humano 100 nM.

Figura 6B

Se representó gráficamente la fijación específica de ^{125}I-PYY a membranas de células COS-7 que expresaban transitoriamente receptores hp25a en las condiciones descritas en la Figura 6A en función de la concentración de ^{125}I-PYY libre, [L], para obtener el número máximo de sitios de fijación saturables, B_{max}, y la constante de disociación en equilibrio de ^{125}I-PYY, K_{d}, de acuerdo con la isoterma de fijación, B = B_{max} [L]/([L] + K_{d}). Se muestra la fijación específica para los datos correspondientes a un valor representativo de cuatro experimentos independientes, midiéndose cada punto por cuadruplicado.

Figura 7

Desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY de células COS-7 que expresan transitoriamente receptores hp25a. Las membranas se incubaron con ^{125}I-PYY y concentraciones crecientes de competidores peptídicos. Se determinaron los valores CI_{50} correspondientes al desplazamiento del 50% por análisis de regresión no lineal y se convirtieron en valores K_{i} de acuerdo con la ecuación, K_{i} - CI_{50}/(1 + [L]/K_{d}), donde [L] es la concentración de ^{125}I-PYY y K_{d} es la constante de disociación en equilibrio de ^{125}I-PYY. Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes, determinándose cada punto una sola vez o por duplicado. Los órdenes de rango de afinidad para estos y otros compuestos se enumeran por separado en la Tabla 2.

Figura 8

Inhibición de la acumulación de cAMP estimulada por forskolina en células LM(tk-) intactas que expresan de manera estable el receptor Y4 humano. Los datos funcionales se derivaron de radioinmunoensayo de cAMP en células LM(tk-) estimuladas con forskolina 10 \muM durante un período de 5 minutos. Se ensayó el PP humano en cuanto a actividad agonista a concentraciones que abarcaban desde 0,03 pM a 0,3 \muM a lo largo del mismo período. Los datos se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros por regresión no lineal. Los datos que se muestran son representativos de tres experimentos independientes.

Figuras 9A y 9B

Figura 9A. Estimulación de la concentración intracelular de calcio libre en células LM(tk-) intactas que expresan de manera estable el receptor Y4 humano. Evolución representativa en el tiempo. Los datos funcionales se obtuvieron por fluorescencia de Fura-2/AM en células LM(tk-) estimuladas con PP humano 100 nM (cuadrados vacíos) o NPY humano 100 nM (cuadrados llenos) en el tiempo indicado por la flecha. Los datos que se muestran son representativos de dos experimentos independientes. Figura 9B. Curva concentración/respuesta. Los datos se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros por regresión no lineal.

A lo largo de esta solicitud de patente, se utilizan las siguientes abreviaturas estándar para indicar las bases nucleotídicas específicas:

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Esta invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los receptores Y4 humano o de rata. El receptor humano es un receptor caracterizado por un perfil farmacológico característico de receptor Y4 humano como se muestra en la Tabla 6. El receptor de rata es por ejemplo un receptor caracterizado por un perfil farmacológico característico del receptor Y4 de rata como se muestra en la Tabla 6. La molécula de ácido nucleico aislada puede codificar un receptor Y4 que se caracteriza por una secuencia de aminoácidos en la región transmembrana, en el cual la secuencia de aminoácidos tiene una homología de 60% o superior con la secuencia de aminoácidos en la región transmembrana del receptor Y4 humano que se muestra en la Figura 2. En una realización, el receptor Y4 tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el receptor Y4 humano que se describe en la Figura 1. Sin embargo, en otra realización el receptor Y4 tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el receptor Y4 de rata que se describe en la Figura 3. En otra realización, el receptor Y4 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1. En otra realización, el receptor Y4 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 3. Tal como se utiliza en esta memoria, el término receptor Y4 abarca cualquier secuencia de aminoácidos, polipéptido o proteína que tenga sustancialmente la misma farmacología proporcionada por el receptor Y4 humano expuesto que se muestra en las Tablas 1-3 y la Tabla 6 y las Figuras 5-7. Como se describe en esta memoria, el receptor Y4 humano tiene un perfil farmacológico que difiere de cualquier subtipo de receptor Y de neuropéptidos conocido (a saber, Y1, Y2 e Y3), el receptor del neuropéptido YY, y el receptor de polipéptidos pancreático, y se designa por consiguiente como el receptor Y4 humano.

El único receptor NPY que ha sido clonado hasta la fecha es el gen del receptor Y1, de ratón (Eva et al., 1992), de rata (Eva et al., 1990) y humano (Larhammar et al., 1992). La máxima homología del receptor Y4 con cualquier receptor conocido descrito en las bases de datos Genbank/EMBL es una identidad global de aminoácidos de 42% con el receptor Y1 humano.

Esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Y4 humano o un receptor Y4 de rata que tiene las características mencionadas anteriormente. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "molécula de ácido nucleico aislada" significa una molécula de ácido nucleico que es una molécula con una forma que no existe en la naturaleza. Ejemplos de una molécula de ácido nucleico aislada de este tipo son una molécula de RNA, cDNA, o DNA genómico aislado que codifica un receptor Y4. Un medio de aislamiento de un receptor Y4 humano consiste en sondar una genoteca genómica humana con una sonda de DNA natural o diseñada artificialmente, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Las sondas de DNA derivadas del gen del receptor humano Y4 son sondas particularmente útiles para este propósito. Las moléculas de DNA y cDNA que codifican receptores Y4 humanos pueden utilizarse para obtener DNA genómico complementario, cDNA o RNA a partir de fuentes humanas, de mamífero, o de otros animales, o para aislar cDNA o clones genómicos afines por el escrutinio de genotecas de cDNA o genómicas, por métodos descritos con mayor detalle más adelante. De este modo se obtienen los elementos reguladores de la transcripción a partir de la región 5' no traducida de los clones aislados, y otras regiones de estabilidad, procesamiento, transcripción, traducción, y determinantes de especificidad de tejidos desde las regiones 3' y 5' no traducidas de los genes aislados. Ejemplos de una molécula de ácido nucleico son una molécula de DNA, RNA, cDNA o DNA genómico aislado o moléculas sintéticas de DNA o RNA que codifican un receptor Y4 humano o de rata. Tales moléculas pueden tener secuencias codificantes tales como las secuencias codificantes que se muestran en las Figuras 1 ó 3. La molécula de DNA de la Figura 1 codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína del receptor Y4 humano,
mientras que la molécula de DNA de la Figura 3 codifica la secuencia de aminoácidos del receptor Y4 de rata.

Esta invención proporciona adicionalmente una molécula de cDNA codificante de un receptor Y4 que tiene una secuencia codificante sustancialmente igual a la secuencia codificante que se muestra en las Figuras 1 y 3. Esta molécula se obtiene por los medios descritos anteriormente.

Esta invención proporciona también una proteína aislada que es un receptor Y4 humano o un receptor Y4 de rata codificado por la molécula de ácido nucleico mencionada anteriormente. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "proteína aislada" significa una molécula de proteína exenta de otros componentes celulares. Un ejemplo de una proteína de este tipo es una proteína aislada que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1, que es un receptor Y4 humano, o la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 3, que es un receptor Y4 de rata. Un medio para la obtención del receptor Y4 aislado consiste en expresar DNA codificante del receptor como se ha mencionado anteriormente en un huésped adecuado, tal como una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero, utilizando métodos bien conocidos en la técnica, y recuperar la proteína del receptor después que la misma ha sido expresada en dicho huésped, utilizando de nuevo métodos bien conocidos en la técnica. El receptor puede aislarse también a partir de células que lo expresan, en particular de células que han sido transfectadas con los vectores de expresión descritos más adelante con mayor detalle.

Esta invención proporciona vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico aisladas tales como DNA, RNA, o cDNA codificantes del receptor Y4 humano o del receptor Y4 de rata como se ha mencionado anteriormente. Ejemplos de vectores son virus tales como bacteriófagos (tales como el fago lambda), virus animales (tales como herpesvirus, el virus de la leucemia de los murinos, y baculovirus), cósmidos, plásmidos (tales como pUC18, disponible de Pharmacia, Piscataway, NJ), y otros vectores de recombinación. Las moléculas de ácido nucleico se insertan en los genomas del vector por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la inserción y el DNA vector pueden exponerse ambos a una enzima de restricción para crear extremos complementarios en ambas moléculas que aparean recíprocamente sus bases y se ligan luego con una ligasa. Alternativamente, pueden ligarse al DNA insertado enlazadores que corresponden a un sitio de restricción en el DNA vector, el cual se digiere luego con la enzima de restricción que corta en dicho sitio. Están disponibles también otros medios. Ejemplos específicos de tales plásmidos son plásmidos que comprenden cDNA que tiene una secuencia codificante sustancialmente igual a la secuencia codificante que se muestra en la Figura 1 y designada clon hp25a (Seq. I.D. Nº 1) o la secuencia codificante que se muestra en la Figura 3 y designada clon rs16b (Secuencia I.D. Nº 27).

Esta invención proporciona también vectores que comprenden moléculas de DNA que codifican receptores Y4 como se han mencionado anteriormente, adaptados para expresión en una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero, que comprenden adicionalmente los elementos reguladores necesarios para la expresión del DNA en las células bacterianas, de levadura, de insecto o de mamífero enlazadas operativamente al DNA codificante de un receptor Y4 de tal manera que permiten la expresión del mismo. El DNA que tiene secuencias codificantes sustancialmente iguales a la secuencia codificante que se muestra en la Figura 1 puede ser insertado útilmente en los vectores para expresar receptores Y4 humanos. El DNA que tiene secuencias codificantes sustancialmente iguales a la secuencia codificante que se muestra en la Figura 3 puede insertarse útilmente en los vectores para expresar receptores Y4 de rata. Los elementos reguladores requeridos para la expresión incluyen secuencias promotoras que fijan la RNA-polimerasa y secuencias de iniciación de la transcripción para fijación de ribosomas. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriana incluye un promotor tal como el promotor lac y para iniciación de la transcripción la secuencia Shine-Dalgarno y el codón de iniciación AUG (Maniatis, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Análogamente, un vector de expresión eucariota incluye un promotor heterólogo u homólogo para la RNA-polimerasa II, una señal de poliadenilación situada aguas abajo, el codón de iniciación AUG, y un codón de terminación para desprendimiento de ribosoma. Adicionalmente, un vector de expresión de insecto, tal como un baculovirus recombinante, utiliza las señales de expresión del gen de la polihedrina para expresión del gen insertado en células de insecto. Tales vectores pueden obtenerse comercialmente o ensamblarse a partir de las secuencias descritas por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo los métodos descritos anteriormente para construcción de vectores en general. Los vectores de expresión son útiles para producir células que expresan el receptor. Ciertos usos de tales células se describen más adelante con mayor detalle.

Esta invención proporciona adicionalmente un plásmido adaptado para expresión en una célula bacteriana, de levadura, de insecto, o, en particular, de mamífero, que comprende una molécula de DNA que codifica un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente y los elementos reguladores necesarios para expresión del DNA en la célula bacteriana, de levadura, de insecto, o de mamífero enlazados operativamente al DNA codificante de un receptor Y4 a fin de permitir la expresión del mismo. Algunos plásmidos adaptados para expresión en una célula de mamífero son pSVL (disponible de Pharmacia, Piscataway, NJ) y pcEXV-3 (Miller J. y Germain R.N., J. Exp. Med. 164: 1478 (1986)). Un ejemplo específico de un plásmido de este tipo es un plásmido adaptado para expresión en una célula de mamífero que comprende cDNA que tiene secuencias codificantes sustancialmente iguales a la secuencia codificante que se muestra en la Figura 1 y los elementos reguladores necesarios para expresión del DNA en la célula de mamífero que se designa pcEXV-Y4 y que ha sido depositado en la ATCC con el Nº de Acceso 75631. Otro ejemplo de un plásmido de este tipo es un plásmido adaptado para expresión en una célula de mamífero que comprende cDNA que tiene secuencias codificantes sustancialmente iguales a la secuencia codificante que se muestra en la Figura 3 y los elementos reguladores necesarios para expresión del DNA en la célula de mamífero que se designa pcEXV-rY4 y que ha sido depositado en la ATCC. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que pueden construirse numerosos plásmidos adaptados para expresión en una célula de mamífero que comprenden el DNA codificante de receptores Y4 como se han mencionado anteriormente y los elementos reguladores necesarios para expresar dicho DNA en la célula de mamífero, utilizando plásmidos existentes y adaptados según sea apropiado para contener los elementos reguladores necesarios para expresar el DNA en la célula de mamífero. Los plásmidos pueden construirse por los métodos descritos anteriormente para vectores de expresión y vectores en general, y por otros métodos bien conocidos en la técnica.

El depósito expuesto anteriormente, y los otros depósitos expuestos en esta memoria, se realizaron de acuerdo con y en cumplimiento del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimientos de Patente, en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.

Esta invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico codificante de un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente, tal como una célula de mamífero que comprende un plásmido adaptado para expresión en una célula de mamífero, que comprende una molécula de ácido nucleico codificante de un receptor Y4 como se ha mencionado anteriormente, cuya proteína codificada se expresa en la superficie celular, y los elementos reguladores necesarios para expresión del ácido nucleico en la célula de mamífero enlazados operativamente al ácido nucleico codificante de un receptor Y4 a fin de permitir la expresión del mismo. Numerosas células de mamífero pueden utilizarse como huéspedes, con inclusión, por ejemplo, de fibroblastos de ratón NIH-3T3, células CHO, células HeLa, células LM(tk-), células Y1, etc. Pueden utilizarse plásmidos de expresión tales como el descrito anteriormente para transfectar células de mamífero por métodos bien conocidos en la técnica tales como precipitación con fosfato de calcio, o puede introducirse de otro modo DNA codificante de estos receptores Y4 en células de mamífero, v.g., por microinyección, a fin de obtener células de mamífero que comprenden DNA, v.g., cDNA o un plásmido, codificante de cualquier receptor Y4. Un ejemplo de una célula LM(tk-) se designa L-nY4-3, (depositada en la ATCC). Otro ejemplo de una célula NIH-3t3 se designa n-hY4-5 (depositada en la ATCC).

Por conveniencia se establece que, en lo que sigue, el término "receptor Y4" se refiere a un receptor Y4 humano o de rata identificado como se expone en las reivindicaciones 1 y 2, y la expresión "ácido nucleico codificante de un receptor Y4" se refiere a un ácido nucleico que codifica un receptor Y4 humano o de rata identificado por las características que se reseñan en las reivindicaciones 1 a 9.

Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede fijarse específicamente a un receptor Y4, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante del vector Y4 con el ligando en condiciones que permiten la fijación de ligandos a dicho receptor, y detectar la presencia de cualquier ligando de este tipo fijado específicamente al receptor Y4, determinando con ello si el ligando se fija específicamente a un receptor Y4.

Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando puede fijarse específicamente a un receptor Y4, que comprende preparar un extracto de células a partir de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4, aislar una fracción de membrana a partir del extracto de células, poner en contacto el ligando con la fracción de membrana en condiciones que permiten la fijación de ligandos a dicho receptor, y detectar la presencia de cualquier ligando fijado al receptor Y4, determinando con ello si el compuesto es capaz de fijarse específicamente a un receptor Y4.

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Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando es un agonista del receptor Y4, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 con el ligando en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4 por la célula, y detectar por medio de un bioensayo, tal como una respuesta de segundo mensajero, un aumento en la actividad del receptor Y4, determinando con ello si el ligando es un agonista del receptor Y4.

Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando es un agonista del receptor Y4, que comprende preparar un extracto de células a partir de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4, aislar una fracción de membrana a partir del extracto de células, poner en contacto la fracción de membrana con el ligando en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4, y detectar por medio de un bioensayo, tal como una respuesta de segundo mensajero, un aumento en la actividad del receptor Y4, determinando con ello si el ligando es un agonista del receptor Y4.

Esta invención proporciona un método para determinar si un ligando es un antagonista del receptor Y4, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 con el ligando en presencia de un agonista conocido del receptor Y4, tal como PP, en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4 y detectar por medio de un bioensayo, tal como una respuesta de segundo mensajero, una disminución en la actividad del receptor Y4, determinando con ello si el ligando es un antagonista del receptor Y4.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "agonista" significa cualquier ligando capaz de aumentar la actividad del receptor Y4. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "antagonista" significa un ligando capaz de disminuir la actividad del receptor Y4. Este compuesto puede ser natural o sintético.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la célula es una célula de mamífero. En una realización adicional, la célula es de origen no neuronal. En otra realización, la célula no neuronal es una célula COS-7, una célula CHO, una célula NIH-3T3 o una célula LM(tk-).

Un método para determinar si un ligando es capaz de fijarse al receptor Y4 humano comprende poner en contacto una célula no neuronal transfectada (es decir una célula que no expresa naturalmente ningún tipo de receptor NPY, PP, o PYY, y por consiguiente expresará únicamente un receptor de este tipo si el mismo se transfecta a la célula) que expresa un receptor Y4 en su superficie, o poner en contacto una preparación de membrana derivada de una célula transfectada de este tipo con el ligando en condiciones que se sabe prevalecen y están asociadas por tanto con la fijación in vivo de los ligandos a un receptor Y4, detectar la presencia de cualquiera de los ligandos que se ensayan fijados al receptor Y4 en la superficie de la célula, y determinar de este modo si el ligando se fija a, activa o inhibe la activación del receptor Y4. Un sistema de respuesta para detectar la activación o inhibición de la activación del receptor Y4 se obtiene por transfección de DNA aislado a una célula huésped adecuada que contiene el sistema de segundo mensajero deseado tal como la hidrólisis de fosfoinositidos, adenilato-ciclasa, guanilato-ciclasa o canales iónicos. Un sistema de célula huésped adecuado de este tipo se aísla a partir de líneas de células pre-existentes, o puede generarse por inserción de componentes apropiados de sistemas de segundo mensajero en líneas de células existentes. Dicho sistema de transfección proporciona un sistema completo de respuesta para investigación o ensayo de la actividad de los receptores Y4 con ligandos como los descritos anteriormente. Los sistemas de transfección son útiles como cultivos de células vivas para ensayos de fijación competitiva entre fármacos conocidos o candidatos y ligandos que se fijan al receptor y que están marcados por reactivos radiactivos, espectroscópicos o de otro tipo. Preparaciones de membrana que contienen el receptor aislado de las células transfectadas son también útiles para estos ensayos de fijación competitiva. Los ensayos funcionales de sistemas de segundo mensajero o sus secuelas en sistemas de transfección actúan como ensayos para actividad de fijación y eficacia en la activación de la función de un receptor. Un sistema de transfección constituye un "sistema de descubrimiento de fármacos" útil para la identificación de compuestos naturales o sintéticos con potencial para desarrollo de fármacos que pueden modificarse ulteriormente o utilizarse directamente como compuestos terapéuticos a fin de activar o inhibir las soluciones naturales del receptor Y4. El sistema de transfec-
ción es útil también para determinar la afinidad y eficacia de fármacos conocidos en los sitios del receptor Y4.

Esta invención proporciona también un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos para fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4 en la superficie de una célula, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 con una pluralidad de compuestos y determinar aquellos compuestos que se fijan a la célula, identificando de este modo fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4.

Esta invención proporciona también un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos para fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4 en la superficie de una célula, que comprende preparar un extracto de células a partir de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico que codifica el receptor Y4, aislar una fracción de membrana del extracto de células, poner en contacto la fracción de membrana con una pluralidad de compuestos y determinar aquellos compuestos que se fijan a la fracción de membrana, identificando de este modo candidatos para fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4.

Esta invención proporciona también un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos para fármacos que actúan como agonistas del receptor Y4, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 con una pluralidad de compuestos en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4, y determinar aquellos compuestos que activan el receptor Y4 en la célula utilizando un bioensayo, tal como un ensayo de segundo mensajero, identificando de este modo los fármacos que actúan como agonistas del receptor Y4.

Esta invención proporciona también un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos para fármacos que actúan como agonistas del receptor Y4, que comprende preparar un extracto de células a partir de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4, aislar una fracción de membrana del extracto de células, poner en contacto la fracción de membrana con una pluralidad de compuestos en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4, y determinar aquellos compuestos que activan el receptor Y4 en la célula utilizando un bioensayo, tal como un ensayo de segundo mensajero, identificando con ello candidatos para fármacos que actúan como agonistas del receptor Y4.

En una realización de los métodos identificados anteriormente, la célula es una célula de mamífero. En otra realización, la célula de mamífero es de origen no neuronal. En una realización adicional, la célula de mamífero de origen no neuronal es una célula COS-7, una célula CHO, una célula LM(tk-), una célula suprarrenal Y1 de murino, o una célula NIH-3T3.

El ácido nucleico de la célula puede tener una secuencia codificante sustancialmente igual a las secuencias codificantes que se muestran en las Figuras 1 y 3. Los candidatos de fármacos se identifican por selección de compuestos químicos que se fijen con afinidad alta a la proteína del receptor Y4 expresada en células transfectadas, utilizando métodos de fijación de radioligandos bien conocidos en la técnica, ejemplos de los cuales se muestran en los ensayos de realización descritos en esta memoria. Los candidatos de fármacos se escrutan también en cuanto a selectividad por identificación de compuestos que se fijan con alta afinidad al receptor Y4 pero no se fijan con alta afinidad a ningún otro subtipo de receptor NPY, o a ningún otro sitio receptor conocido. Dado que los compuestos selectivos de alta afinidad interaccionan fundamentalmente con el sitio del receptor Y4 diana después de su administración al paciente, las probabilidades de la producción de un fármaco con efectos secundarios indeseables se minimizan por este enfoque.

Esta invención proporciona una composición farmacéutica como se menciona más adelante, que comprende un compuesto químico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, y emulsiones, tales como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, y diversos tipos de agentes humectantes. Una vez que se ha demostrado que el candidato para fármaco está bio-disponible adecuadamente siguiendo una vía de administración particular, por ejemplo la vía oral o por inyección (tienen que mantenerse concentraciones terapéuticas adecuadas en el sitio de acción durante un período de tiempo adecuado con objeto de conseguir el beneficio terapéutico deseado), y se ha demostrado que es no tóxico y terapéuticamente eficaz en modelos de enfermedad apropiados, el fármaco puede administrarse a los pacientes por dicha vía de administración determinada para hacer el fármaco bio-disponible, en una formulación apropiada sólida o en solución, a fin de lograr el beneficio terapéutico deseado.

Esta invención proporciona un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridarse específicamente con cualesquiera secuencias de una molécula de mRNA que codifica un receptor Y4 a fin de impedir la traducción de la molécula de mRNA. El oligonucleótido antisentido puede tener una secuencia capaz de hibridarse específicamente con cualesquiera secuencias de la molécula de cDNA cuya secuencia se muestra en la Figura 1 o la Figura 3. Un ejemplo particular de un oligonucleótido antisentido es una oligonucleótido antisentido que comprende análogos químicos de nucleótidos.

Esta invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una cantidad del oligonucleótido descrito anteriormente, que es eficaz para reducir la actividad de un receptor Y4 humano por paso a través de una membrana celular y fijación específica con mRNA codificante de un receptor Y4 en la célula a fin de impedir su traducción, y un vehículo farmacéuticamente aceptable capaz de pasar a través de una membrana celular. El oligonucleótido puede estar acoplado a una sustancia que inactiva el mRNA, tal como una ribozima. El vehículo farmacéuticamente aceptable capaz de pasar a través de las membranas celulares puede comprender también una estructura que se fija a un receptor en una célula capaz de ser absorbido por las células después de su fijación a la estructura. La estructura del vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser capaz de fijarse a un receptor que es específico para un tipo de célula seleccionado. La estructura puede formar parte de una proteína conocida por fijarse a un receptor de tipo celular específico, por ejemplo una molécula de insulina, que podría dirigirse como diana a las células pancreáticas. Las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias codificantes sustancialmente iguales a las secuencias codificantes que se muestran en las Figuras 1 y 3 pueden utilizarse como los oligonucleótidos de la composición farmacéutica.

Los fármacos de oligonucleótidos antisentido inhiben la traducción del mRNA que codifica estos receptores. Los oligonucleótidos sintéticos, u otras estructuras químicas antisentido están diseñados para fijarse a mRNA codificante del receptor Y4 e inhibir la traducción del mRNA, y son útiles como fármacos para inhibir la expresión de los genes receptores de Y4 en pacientes. Esta invención proporciona un medio para alterar terapéuticamente los niveles de expresión de los receptores Y4 humanos por el uso de un fármaco de oligonucleótido antisentido sintético (SAOD) que inhibe la traducción de mRNA codificante de estos receptores. Los oligonucleótidos sintéticos, u otras estructuras químicas antisentido diseñadas para reconocer y fijarse selectivamente a mRNA, se construyen de modo que sean complementarios a porciones de las secuencias nucleotídicas que se muestran en las Figuras 1 y 3 de DNA, RNA o de ácidos nucleicos artificiales modificados químicamente. El SAOD está diseñado de modo que sea estable en el torrente sanguíneo para administración a los pacientes por inyección, o en condiciones de cultivo de células en laboratorio, para administración a células extraídas del paciente. El SAOD está diseñado para ser capaz de pasar a través de las membranas celulares a fin de penetrar en el citoplasma de la célula en virtud de propiedades físicas y químicas del SAOD que lo hacen capaz de atravesar las membranas celulares (v.g. por diseño de pequeñas estructuras químicas SAOD hidrófobas) o en virtud de sistemas de transporte específicos en la célula que reconocen y transportan el SAOD al interior de la célula. Adicionalmente, el SAOD puede estar diseñado para administración únicamente a ciertas poblaciones de células seleccionadas por direccionamiento del SAOD de modo que sea reconocido por mecanismos celulares específicos de absorción que fija y absorbe el SAOD únicamente dentro de ciertas poblaciones de células seleccionadas. Por ejemplo, el SAOD puede estar diseñado también para fijarse a un receptor que se encuentra únicamente en cierto tipo de célula, como se ha expuesto anteriormente. El SAOD está diseñado para reconocer y fijarse selectivamente a la secuencia de mRNA diana, que puede corresponder a una secuencia contenida dentro de las secuencias que se muestran en las Figuras 1 y 3 en virtud del apareamiento de bases complementarias al mRNA. Por último, el SAOD está diseñado para inactivar la secuencia de mRNA diana por cualquiera de tres mecanismos: 1) por fijación al mRNA diana e inducción con ello de la degradación del mRNA por mecanismos celulares intrínsecos tales como digestión con RNAsa I, 2) por inhibición de la traducción del mRNA diana por interferencia con la fijación de factores reguladores de la traducción o de ribosomas, o 3) por inclusión de otras estructuras químicas, tales como secuencias de ribozima o grupos químicos reactivos, que degradan o modifican químicamente el mRNA diana. Se ha demostrado que los fármacos de oligonucleótidos antisentido sintéticos son capaces de exhibir las propiedades descritas anteriormente cuando se dirigen contra dianas de mRNA (J.S. Cohen, Trends in Pharm. Sci. 10, 435 (1989; H.M. Weintraub, Sci. Am., enero (1990) p. 40). Adicionalmente, el acoplamiento de ribozimas a oligonucleótidos antisentido es una estrategia prometedora para la inactivación de mRNA diana (N. Sarver et al., Science 247, 1222 (1990)). Un SAOD sirve como agente terapéutico eficaz si está diseñado para ser administrado a un paciente por inyección, o si las células diana del paciente se extraen, se tratan con el SAOD en el laboratorio, y se devuelven de nuevo al paciente. De esta manera, un SAOD puede ser útil como terapia para reducir la expresión de receptores en células diana particulares de un paciente, en cualquier condición clínica que pueda beneficiarse de la expresión reducida de los receptores Y4.

Esta invención proporciona un anticuerpo dirigido a un receptor Y4, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítope de un receptor Y4 presente en la superficie de una célula y que tenga una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a una secuencia de aminoácidos para un epítope de la superficie celular del receptor Y4 humano incluido en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1 (Seq. I.D. Nº 2) o el receptor Y4 de rata incluido en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 3 (Seq. I.D. Nº 28). Las secuencias de aminoácidos pueden analizarse por métodos bien conocidos en la técnica a fin de determinar si las mismas producen regiones hidrófobas o hidrófilas en las proteínas construidas por ellas. En el caso de las proteínas de la membrana celular, son bien conocidas regiones hidrófobas que forman parte de la proteína que se inserta en la bicapa lipídica que forma la membrana celular, mientras que las regiones hidrófilas están localizadas en la superficie celular, en un ambiente acuoso. Por consiguiente, los anticuerpos para las secuencias de aminoácidos hidrófilas que se muestran en las Figuras 1 y 3 se fijarán probablemente a un epítope de la superficie de un receptor Y4 humano o de rata, respectivamente, como se ha descrito. Los anticuerpos dirigidos a los receptores Y4 pueden ser derivados de suero o monoclonales, y se preparan utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo se preparan anticuerpos monoclonales utilizando tecnología de hibridoma por fusionamiento de células B productoras de anticuerpos procedentes de animales inmunizados con células de mieloma y selección de la línea de células de hibridoma resultante que produce el anticuerpo deseado. Células tales como las células COS-7 o las células LM(tk-) que comprenden DNA codificante del receptor Y4 humano y que expresan por consiguiente el receptor Y4 pueden utilizarse como inmunógenos para generar un anticuerpo de este tipo. Alternativamente, pueden prepararse péptidos sintéticos utilizando máquinas comercialmente disponibles y las secuencias de aminoácidos que se muestran en las Figuras 1 y 3 (Seq. I.D. Núms 2 y 28). Como otra alternativa adicional, DNA, tal como cDNA o un fragmento del mismo, puede clonarse y expresarse, y el polipéptido resultante se puede recuperar y utilizar como inmunógeno. Estos anticuerpos son útiles para detectar la presencia de receptores Y4 humanos codificados por el DNA aislado, o para inhibir la función de los receptores en animales vivos, en humanos, o en tejidos o fluidos biológicos aislados de animales o humanos.

Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un anticuerpo dirigido contra el receptor Y4 humano eficaz para bloquear la fijación de ligandos al receptor Y4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Para este propósito es útil un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítope de un receptor Y4 presente en la superficie de una célula y que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a una secuencia de aminoácidos para un epítope de la superficie celular del receptor Y4 incluido en la secuencias de aminoácidos que se muestran en las Figuras 1 y 3. La fijación del anticuerpo al receptor impide el funcionamiento del receptor, neutralizando con ello los efectos de la actividad del receptor Y4. Los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente son útiles asimismo para este propósito. Algunos ejemplos de anormalidades son amnesia, depresión, ansiedad, epilepsia, dolor, depresión, hipertensión, y trastornos del sueño y de la alimentación.

Esta invención proporciona un método de detección de la presencia de un receptor Y4 en la superficie de una célula, que comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo dirigido al receptor Y4, en condiciones que permiten la fijación del anticuerpo al receptor, y detectar la presencia del anticuerpo fijado a la célula, detectando con ello la presencia del receptor Y4 en la superficie de la célula. Un método de este tipo es útil para determinar si una célula dada es deficiente en actividad de receptores Y4 en la superficie de la célula. Los anticuerpos fijados se detectan por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo por fijación de marcadores fluorescentes a los anticuerpos y examen de la muestra de células bajo un microscopio de fluorescencia a fin de detectar la fluorescencia en una célula indicativa de la fijación del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente son útiles para este propósito.

Esta invención proporciona un método de preparación del receptor Y4 aislado y purificado que comprende a) construir un vector adaptado para expresión en una célula que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión de ácido nucleico en la célula enlazada operativamente al ácido nucleico codificante de un receptor Y4 a fin de permitir la expresión del mismo, en el cual la célula se selecciona del grupo constituido por células bacterianas, células de levadura, células de insecto y células de mamífero; b) insertar el vector del paso a) en una célula huésped adecuada; c) incubar las células del paso b) en condiciones que permiten la expresión de un receptor Y4; d) recuperar el receptor así producido; y e) purificar el receptor así recuperado, preparando de este modo el receptor Y4 aislado y purificado. Un ejemplo de un receptor Y4 aislado es una proteína aislada que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que las secuencias de aminoácidos que se muestran en las Figuras 1 y 3. Por ejemplo, las células pueden inducirse para expresar receptores por exposición a sustancias tales como hormonas. Las células pueden homogeneizarse luego y el receptor puede aislarse del homogeneizado utilizando una columna de afinidad que comprenda, por ejemplo, PP u otra sustancia conocida por fijarse al receptor. Las fracciones resultantes pueden purificarse luego poniéndolas en contacto con una columna cambiadora de iones, y por determinación de la fracción que contiene actividad del receptor o se fija a los anticuerpos anti-receptor. Este método para preparación del receptor Y4 utiliza métodos de tecnología de DNA recombinante bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado que codifica el receptor Y4 se inserta en un vector adecuado, tal como un vector de expresión. Una célula huésped adecuada, tal como una célula bacteriana, o una célula eucariota tal como una célula de levadura, se transfecta con el vector. Se aísla el receptor Y4 del medio de cultivo por purificación mediante afinidad o por cromatografía u otros métodos bien conocidos en la técnica.

Esta invención identifica por primera vez una nueva proteína receptora, su secuencia de aminoácidos, y su gen humano. Adicionalmente, esta invención describe un grupo de receptores no reconocidos con anterioridad dentro de la definición de un receptor Y4. La información y las herramientas experimentales proporcionadas por este descubrimiento son útiles para generar nuevos agentes terapéuticos, y nuevos ensayos terapéuticos o de diagnóstico para esta nueva proteína receptora, su molécula de mRNA asociada o su DNA genómico asociado. La información y las herramientas experimentales proporcionadas por este descubrimiento serán útiles para generar nuevos agentes terapéuticos, y nuevos ensayos terapéuticos o de diagnóstico para esta nueva proteína receptora, su molécula de mRNA asociada, o su DNA genómico asociado.

Específicamente, esta invención se refiere al aislamiento por primera vez de un clon genómico humano y un clon genómico de rata que codifica un receptor Y4. Un nuevo gen humano para el receptor identificado en esta memoria como Y4 ha sido identificado y caracterizado. Adicionalmente, el receptor Y4 humano se ha expresado en células COS-7. Las propiedades farmacológicas de fijación de la proteína codificada se han determinado, y estas propiedades de fijación clasifican dicha proteína como un nuevo receptor NPY/PYY/PP que ha sido designado por los autores de la presente invención como un receptor Y4. Líneas de células de mamífero que expresan este receptor Y4 en la superficie celular han sido construidas, estableciendo así las primeras líneas celulares cultivadas y bien definidas con las cuales se puede estudiar este receptor Y4.

Esta invención se comprenderá mejor haciendo referencia a los Detalles Experimentales que siguen, pero los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que los experimentos específicos detallados son únicamente ilustrativos de la invención, que se describe más plenamente en las reivindicaciones que siguen después de ellos.

Detalles experimentales

Clonación y secuenciación de un receptor de neuropéptido humano (Y4). Una genoteca genómica de placenta humana en \lambda guión II (\approx 1,5 x 10^{6} recombinantes totales; Stratagene, La Jolla, CA) se escrutó utilizando sondas solapantes de oligonucleótidos transmembrana (TM) (TM 1, 2, 3, 5 y 7) derivadas del gen receptor del neuropéptido Y1 de rata (Eva, C. et al., 1990; Nº de acceso a GenBank Z11504). Los oligómeros solapantes (TM1: nucleótidos 198-251, cadena (+)/5'-TTGCTTATGGGGCTGTGATTATTCTTGGGGTCTCTGGAAACCTGG-3' (Secuencia I.D. Nº 3) y cadena (-)/5'-TAGGATGATTATGATCAATGCCAGGTTTCCAGAGACCCCAAGAAT-3' (Secuencia I.D. Nº 4); TM 2: nucleótidos 269-328, cadena (+)/5'-AAAGAGATGAGGAATGTCACCAACATTCTGATCGTGAACCTCTCC-3' (Secuencia I.D. nº 5) y cadena (-)/5'-CAGCAAGTCTGAGAAGGAGAGGTTCACGATCAGAATGTTGGTGAC-3' (Secuencia I.D. Nº 6); TM 3: nucleótidos 401-478, cadena (+)/5'-TGCAAACTGAATCCTTTTGTGCAATGCGTCT
CCATTACAGTATCCATTTTCTCT3' (Secuencia I.D. Nº 7) y cadena (-)/5'-ACGTTCCACAGCGATGAGAACCA
GAGAGAAAATGGATACTGTAATGGAGACGCA-3' (Secuencia I.D. Nº 8); TM 5: nucleótidos 716-778, cadena (+)/5'-CTGCAGTATTTTGGCCCACTCTGTTTCATATTCATATGCTAC-3' (Secuencia I.D. Nº 9) y cadena (-)/5'-CAAGCGAATGTATATCTTGAAGTAGCATATGAATATGAAACA-3' (Secuencia I.D. Nº 10); TM 7: nucleótidos 971-1045, cadena (+)/5'-CTGCTCTGCCACCTCACGGCCATGATCTCCACCTGCGTCAACC CCATC-3' (Secuencia I.D. Nº 11) y cadena (-)/5'-GAAATTTTTGTTCAGGAATCCATAAAAGATGGGGTTGACGCAGGTGGA-3'
(Secuencia I.D. Nº 12); Nº de acceso a GenBank Z11504 se marcaron con [^{32}P]-dATP y [^{32}P]dCTP por síntesis con el fragmento grande de DNA-polimerasa. La hibridación se llevó a cabo en condiciones de baja severidad: 40ºC en una solución que contenía 25,0% de formamida, 5x SSC (1x SSC es cloruro de sodio 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M), 1x solución de Denhardt (0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de Ficoll, 0,02% de seroalbúmina bovina) y 25 \mug/\mul de DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos. Los filtros se lavaron a 40ºC en 0,1x SSC que contenía 0,1% de dodecilsulfato de sodio y se expusieron a -70ºC a película Kodak XAR en presencia de un filtro de intensificación. Los clones de fago lambda que se hibridaban con las sondas se purificaron de calvas y se preparó DNA por análisis de transferencia Southern (Southern, 1975; Sambrook et al., 1989). Utilizando este método se aisló un clon genómico que se hibridaba con la totalidad de las cinco sondas TM Y1 de rata, designado hp25a. Para subclonación y análisis ulterior por transferencia Southern, el DNA de hp25a se clonó en pUC18 (Pharmacia, Piscataway, NJ). El análisis de la secuencia de nucleótidos se realizó por el método de terminación de cadenas de didesoxi-nucleótidos de Sanger (Sanger et al., 1977) sobre moldes de plásmidos bicatenarios desnaturalizados, utilizando Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland, OH).

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Clonación y secuenciación de un receptor de neuropéptidos (Y4) NPY de rata

Se escrutó una genoteca genómica de bazo de rata (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando sondas oligonucleotídicas TM solapantes (TM 1-7) derivadas de las secuencias nucleotídicas correspondientes aproximadamente a las regiones TM de la secuencia de aminoácidos del receptor humano Y4 como se muestra en la Figura 2. Los oligómeros solapantes utilizados fueron como sigue:

2

3

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se marcaron con [^{32}P]-ATP y [^{32}P]-CTP por síntesis con el fragmento grande de DNA-polimerasa. La hibridación se llevó a cabo en condiciones de severidad reducida: 40ºC en una solución que contenía 37,5% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 5X SSC, 1X solución de Denhard, y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos. Se lavaron los filtros a 45ºC en 0,1X SSC que contenía 0,1% de dodecil-sulfato de sodio (SDS) y se expusieron a -70ºC a película Kodak XAR en presencia de un filtro intensificador. Los clones del fago lambda que se hibridaban a las sondas se purificaron de calvas por extensión en placa y repetición del escrutinio sucesivos. Un clon genómico que se hibridaba a la totalidad de las siete sondas TM del receptor humano Y4, designado rs16b, se aisló utilizando este método. Para expresión y análisis de la secuencia, un fragmento BamHI/HindIII de 2,0 kb de rs16b se subclonó a los sitios polienlazadores correspondientes de un vector de expresión eucariota pcEXV-3 (Miller y Germain, 1986) modificado para incluir un polienlazador con sitios de restricción EcoRI, SstI, ClaI, KpnI, SmaI, XbaI, BamHI, SalI y HindIII, y designado EXJ.RH. El análisis de la secuencia de nucleótidos se realizó por el método de terminación de cadenas con didesoxi-nucleótidos de Sanger (Sanger, 1977) sobre moldes de plásmidos bicatenarios, utilizando Sequenase (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio).

Transfección transitoria: la región codificante entera de hp25a (1127 pb), que incluía 680 pb de la secuencia 5' no traducida (5' UT) y 205 pb de la secuencia 3' no traducida (3' UT), se clonó en los sitios BamHI y EcoRI del vector de expresión eucariota modificado por polienlazadores pCEXV-3 (Miller et al., 1986), denominado EXJ.HR (J.B., datos no publicados). Células de riñón de mono (COS-7) se transfectaron transitoriamente con el plásmido hp25a/EXJ (vector de expresión que contenía el gen receptor hp25a) utilizando metodología de DEAE-dextrano (reactivos obtenidos de Specialty Media, Lavellette, NJ).

El plásmido rs16b/EXJ (el vector de expresión que contenía el gen receptor rs16b), se transfectó transitoriamente en células Cos-7 utilizando métodos similares, al igual que el receptor Y1 humano (Larhammar, 1992) y el receptor Y2 humano. El receptor Y2 clonado fue descrito en la solicitud de Patente U.S. 08/192.288 presentada el 2 de febrero de 1994, actualmente en tramitación, cuyos contenidos precedentes se incorporan por la presente como referencia.

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Transfección estable

Receptores Y4 humanos se co-transfectaron con un gen resistente a G-418 en la línea de células NIH-3T3 de embrión de ratón por un método de transfección con fosfato de calcio (Cullen, 1987). Las células transfectadas de manera estable se seleccionaron con G-418. Los receptores Y4 humanos se transfectaron análogamente en células de fibroblastos de ratón LM(tk-).

Cultivo de células: las células COS-7 se multiplicaron en placas de 150 mm (Corning en D-MEM con suplementos (Medio de Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero de ternero, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina/80 unidades/ml de estreptomicina) a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Placas de reservas de células COS-7 se tripsinizaron y se fraccionaron en relación 1:6 cada 3-4 días. Células SK-N-Be(2) de neuroblastoma humano se multiplicaron análogamente en matraces de 225 cm^{2} (Co-star) utilizando Medios Esenciales Modificados de Eagle al 50%, Mezcla de Nutrientes de Ham F-12 al 50%, suero bovino fetal al 15%, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina/80 unidades/ml de estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales. Los matraces de reservas de células SK-N-Be(2) se tripsinizaron y se fraccionaron en relación 1:10 cada 7 días.

Se multiplicaron células NIH-3T3 de embrión de ratón en placas de 150 mm en Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suplementos (10% de suero de ternero, glutamina 4 mM, 100 unidades/ml de penicilina/100 \mug/ml de estreptomicina) a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Las placas de reservas de células NIH-3T3 se tripsinizaron y se fraccionaron en relación 1:15 cada 3-4 días. Las células LM(tk-) de fibroblastos de ratón se multiplicaron en placas de 150 mm en Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suplementos (10% de suero de ternero, glutamina 4 mM, 100 unidades/ml de penicilina/100 \mug/ml de estreptomicina) a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Las placas de reservas de células LM(tk-) se tripsinizaron y fraccionaron en relación 1:10 cada 3-4 días.

Los medios de cultivo de células y los suplementos eran de Specialty Media (Lavallette, NJ). Las placas de cultivo de células (150 mm) eran de Corning (Corning, NY). Los matraces de cultivo de células (225 cm^{2}) y las placas de microtitulación de polipropileno eran de Co-star (Cambridge, MA).

Recolección de la membrana: las membranas se recolectaron a partir de células COS-7 cuarenta y ocho horas después de la transfección, y de células SK-N-Be(2) siete días después del fraccionamiento. Las células adherentes se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato y enfriada en hielo (NaCl 138 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KCl 2,5 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, NaCl_{2} 0,9 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, pH 7,4) y se sometieron a lisis por tratamiento con ultrasonidos en tampón hipotónico enfriado en hielo (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM, pH 7,7). Las partículas grandes y los residuos se clarificaron por centrifugación a velocidad baja (200 x g, 10 min, 4ºC). Las membranas se recogieron de la fracción sobrenadante por centrifugación a velocidad alta (32.000 x g, 18 min, 4ºC), se lavaron con tampón hipotónico enfriado en hielo y se recogieron de nuevo por centrifugación a velocidad alta (32.000 x g, 18 min, 4ºC). El sedimento final de membrana se resuspendió por tratamiento con ultrasonidos en un volumen pequeño (\sim 500 \mul) de tampón de fijación enfriado con hielo (NaCl 10 mM, HEPES 20 mM, KH_{2}PO_{4} 0,22 mM, CaCl_{2} 1,26 mM, MgSO_{4} 0,81 mM, pH 7,4). La concentración de proteínas se midió por el método de Bradford (Bradford, 1976) utilizando el Reactivo Bio-Rad, con seroalbúmina bovina como patrón.

Fijación de radioligandos a las suspensiones de membrana: las suspensiones de membrana se diluyeron en tampón de fijación suplementado con 0,1% de seroalbúmina bovina y 0,1% de bacitracina para obtener una concentración óptima de proteínas de membrana: \sim0,02 mg/ml para los receptores Y1 humanos, \sim0,015 mg/ml para los receptores hp25a, y \sim 0,25 mg/ml para SK-N-Be(2). (En estas condiciones, el ^{125}I-PYY fijado por las membranas en el ensayo era menor que 10% del ^{125}I-PYY suministrado a la muestra). ^{125}I-PYY y los competidores peptídicos no marcados se diluyeron también a las concentraciones deseadas en tampón de fijación suplementado. Se prepararon luego muestras individuales en placas de microtitulación de polipropileno con 96 pocillos por mezcla de suspensiones de membrana (200 \mul), ^{125}I-PYY (25 \mul), y péptidos no marcados o tampón de fijación suplementado (25 \mul). Las muestras se incubaron en un baño de agua a 30ºC con agitación constante mediante sacudidas durante 120 min. Las incubaciones se determinaron por filtración sobre filtros Whatman GF/C (recubiertos previamente con 0,5% de polietilenimina y secados al aire antes de su empleo). Las membranas retenidas en el filtro se sometieron a cómputo respecto a ^{125}I en un contador gamma. La fijación inespecífica se definió por PP humano 100 nM para los receptores hp25a y por NPY 100 nM para los receptores Y1 y SK-N-Be(2). La fijación específica en estudios de evolución temporal y de competición era típicamente 80%; la mayor parte de la fijación inespecífica estaba asociada con el filtro. Se analizaron los datos de fijación utilizando regresión no lineal y técnicas estadísticas disponibles en el paquete GraphPAD InPlot (San Diego, CA). La ^{125}I-PYY de porcino era de New England Nuclear (Boston, MA). El NPY y los análogos peptídicos afines eran de Bachem California (Torrance, CA) o de Peninsula (Belmont, CA). Los filtros Whatman GF/C eran de Brandel (Gaithersburg, MD). El reactivo Bio-Rad era de Bio-Rad (Hercules, CA). La seroalbúmina bovina y la bacitracina eran de Sigma (St. Louis, MO). Todos los materiales restantes eran de calidad reactivo. Ensayo funcional: radioinmunoensayo de cAMP Células transfectadas de manera estable se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos y se cultivaron hasta confluencia. Para reducir el potencial de desensibilización de receptores, el componente de suero de los medios se redujo a 1,5% durante 4 a 16 horas antes del ensayo. Las células se lavaron en solución salina tamponada de Hank, o HBS (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM, CaCl_{2} 1 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1 mM, y glucosa 10 mM) suplementada con 0,1% de seroalbúmina bovina más teofilina 5 mM, y se pre-equilibraron en la misma solución durante 20 min a 37ºC en 5% de CO_{2}. Las células se incubaron luego 5 min con forskolina 10 \muM y diversas concentraciones de ligandos selectivos de los receptores. El ensayo se terminó por la eliminación de HBS y acidificación de las células con HCl 100 mM. El cAMP intracelular se extrajo y se cuantificó con una versión modificada de un radioinmunoensayo basado en perlas magnéticas (Advanced Magnetics, Cambridge, MA). El complejo final antígeno/anticuerpo se separó del ^{125}I-cAMP libre por filtración a vacío a través de un filtro PVDF en una placa de microtitulación (Millipore, Bedford, MA). Los filtros se taladraron con un punzón y se sometieron a cómputo respecto a ^{125}I en un contador gamma Packard. Los datos de fijación se analizaron utilizando regresión no lineal y técnicas estadísticas disponibles en el paquete GraphPAB Prism (San Diego, CA).

Ensayo funcional: movilización intracelular de calcio. Se midió la concentración intracelular de calcio libre por microespectrofluorometría utilizando el colorante indicador fluorescente Fura-2/AM. Las células transfectadas de manera estable se sembraron en una cápsula de cultivo de 35 mm que contenía una inserción de cubreobjetos de vidrio. Las células se lavaron con HBS y se cargaron luego con 100 \mul de Fura-2/AM (10 \muM) durante 20 a 40 min. Después del lavado con HBS para eliminar la solución de Fura-2/AM, se equilibraron las células en HBS durante 10 a 20 min. Las células se visualizaron luego bajo el objetivo 40X de un microscopio Leitz Fluovert FS y se determinó la emisión de fluorescencia a 510 nm con longitudes de onda de excitación alternantes entre 340 y 380 nm. Los datos de fluorescencia brutos se convirtieron en concentraciones de calcio utilizando curvas patrón de concentración de calcio y técnicas de análisis por equipo lógico (software).

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Localización en los tejidos y expresión génica: PCR con transcriptasa inversa

Tejidos humanos (obtenidos de National Disease Research Interchange) se homogeneizaron y se extrajo el RNA total utilizando el método de guanidina-isotiocianato/almohadilla de CsCl (Kingston, 1987). El RNA se trató con DNasa para eliminar cualquier DNA genómico contaminante. Se preparó cDNA a partir del RNA total con iniciadores de hexanucleótidos aleatorios utilizando transcriptasa inversa (Superscript II; BRL). Una parte alícuota del cDNA de la primera cadena (250 ng de RNA total) se multiplicó en una mezcla de reacción PCR de 50 \mul (concentración final de dNTPs 200 \muM) que contenía 1,2 U de polimerasa Taq en el tampón suministrado por el fabricante (Perkin-Elmer Corporation), y concentraciones 1 \muM de iniciadores, utilizando un programa consistente en 30 ciclos de 94ºC/2', 68ºC/2', y 72ºC/3', con una pre- y post-incubación de 95ºC/5' y 72ºC/10', respectivamente. Se diseñaron iniciadores PCR para Y4 humano contra la secuencia Y4 humana en el tercer bucle intracelular y regiones del terminal carboxi: 5'-CGCGTGTTTCACAAGGGCACCTA-3' y 5'-TGCCACTTAGCCTCAGGGACCC3', respectivamente.

Los productos PCR se pasaron sobre un gel de agarosa al 1,5% y se transfirieron a membranas de nailon cargadas (Zetaprobe GT, BioRad), y se analizaron como transferencias Southern. Se prepararon sondas de hibridación correspondientes a la región receptora flanqueada por iniciadores PCR (5'-TCCGTATGTACTGTGGACAGGGGCAGATGCTCCGACTCCTCCAGG-3' y se pre-escrutaron en cuanto a ausencia de reactividad cruzada con subtipos de los receptores humanos Y1 e Y2. Se hibridaron los filtros con una sonda interna [\gamma-^{32}P]ATP marcada en los extremos a los iniciadores PCR, se lavaron en condiciones de severidad alta, y se expusieron a película Kodak XAR en presencia de un filtro intensificador, como se ha descrito anteriormente. Se condujeron análisis similares PCR y de transferencia Southern con iniciadores y sonda dirigidos hacia el gen preparado en el laboratorio de los autores de la invención, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (Clontech, Palo Alto, CA), y se demostró que se estaban ensayando cantidades iguales de cDNA procedentes de los diferentes tejidos para la expresión de NPY.

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Resultados

Se escrutó una genoteca genómica humana de placenta, en condiciones de severidad reducida, con sondas oligonucleotídicas dirigidas contra las regiones transmembrana primera, segunda, tercera, quinta y séptima del gen receptor del neuropéptido Y1 de rata (Eva, C. et al., 1990; Nº de acceso en GenBank Z11504). Se aislaron clones que se hibridaban positivamente (\approx100-150), se purificaron en calvas y se caracterizaron par análisis mediante transferencia Southern y secuenciación. Un clon, hp25a, contenía un fragmento PstI de 1,3 kb que se hibridaba con las sondas oligonucleotídicas derivadas de Y1 de rata y se subclonó subsiguientemente a un vector pUC. El análisis de la secuencia del DNA indicó homología máxima a los genes del receptor Y1 de rata y humano. Este clon era un fragmento parcial de gen sin intrones, que codificaba parte del tercer bucle intracelular a través del término carboxilo, con inclusión de un codón de terminación.

Para obtener un clon de longitud total, un fragmento de hibridación de 2,0 kb BamHI/EcoRI, que contenía la región codificante completa, que carecía de intrones, se subclonó en un vector de expresión y se secuenció. El constructo genómico de longitud total en el vector de expresión (denominado hp25a/EXJ) contiene un marco de lectura abierto de 1127 pb, con 680 pb de la secuencia 5' UT predicha y 205 pb de la secuencia 3' UT predicha, y codifica una proteína de 375 aminoácidos de longitud, con una masa molecular relativa de \approx41.000 daltons. El análisis de hidropatía de la proteína es consistente con una topografía supuesta de siete dominios transmembrana, indicativa de la familia de receptores acoplados a la proteína G.

El análisis de la secuencia inicial reveló que el clon hp25a/EXJ contenía varias características/restos estructurales conservados encontrados entre los miembros de la familia de los receptores de neuropéptidos, con inclusión de dos glicinas y asparagina en TM1 (posiciones 55, 58 y 59, respectivamente, en Fig. 2), una asparagina, leucina y ácido aspártico en TM2 (posiciones 82, 83 y 87, respectivamente, en Fig. 2), una serina y leucina en TM3 (posiciones 128 y 132, respectivamente, en Fig. 2), un triptófano y prolina en TM4 (posiciones 164 y 173, respectivamente, en Fig. 2), una tirosina y prolina en TM5 (posiciones 223 y 226, respectivamente, en Fig. 2), una fenilalanina, triptófano, y prolina en TM6 (posiciones 275, 279, y 281, respectivamente en Fig. 2), y una serina, treonina, asparagina, y prolina en TM7 (posiciones 315, 316, 319, y 320, respectivamente, en Fig. 2). Otras características de este gen receptor hp25a humano son la presencia de tres sitios potenciales para glicosilación enlazada en N en el término amino (restos de asparagina 2, 19, y 29; Fig. 1) y la presencia de varias serinas y treoninas en el término carboxilo y bucles intracelulares, que pueden servir como sitios para fosforilación potencial por proteína-quinasas.

Una comparación de secuencias de nucleótidos y péptidos del clon hp25a/EXJ con las secuencias contenidas en las bases de datos GenBank EMBL revela que el clon está muy relacionado con los genes y proteínas receptores Y1 de rata, ratón, y humano (véase Fig. 2). El clon hp25a exhibe 42% de identidad total de aminoácidos con el receptor NPY-1 humano y 55% de identidad cuando se comparan solamente los dominios transmembrana entre hp25a e Y1. La comparación de los restos de aminoácidos individuales en los dominios TM entre hp25a e Y1 revela una identidad < 30%, 57%, 57%, 57%, 52%, 63%, y 71% en las regiones TM uno a siete correspondientes, respectivamente. El clon hp25a se hibridaba solamente con la sonda específica TM7 a partir de la serie original de sondas TM derivadas de rata utilizadas originalmente para escrutar la genoteca, lo que es consistente con el hecho de que el clon hp25a comparte el grado máximo de identidad de aminoácidos con el dominio TM7 del receptor Y1 de rata.

Un homólogo de rata del receptor Y4 humano, designado rs16b, se aisló de una genoteca genómica de bazo de rata utilizando sondas derivadas de las regiones transmembrana del receptor Y4 humano. La secuencia nucleotídica de rs16b es idéntica en un 80% en la región codificante a la secuencia nucleotídica del receptor Y4 humano, y codifica una proteína de 375 aminoácidos de longitud (Figura 3). El clon rs16b exhibe 75% de identidad total de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de Y4 humano, y en los dominios transmembrana supuestos (TMs), la proteína predicha por rs16b exhibe 84% de identidad de aminoácidos con el receptor Y4 humano. Este grado de identidad primaria de secuencia de aminoácidos es menor que el observado típicamente para especies homólogas, y sugiere que los receptores Y4 de rata y humano pueden exhibir también variaciones funcionales. El bucle intracelular predicho entre TMs V y VI es particularmente divergente, exhibiendo solamente 56% de identidad de aminoácidos entre el Y4 de rata y el humano. La divergencia en esta región podría mediar potencialmente diferencias en el acoplamiento de la proteína G entre los receptores de rata y humano. Las secuencias primarias de los receptores Y4 de rata y humano exhiben también diferencias en sus patrones de motivos de secuencia para la fosforilación de la caseína-quinasa II, N-miristoilación, y fosforilación de la proteína-quinasa C; estos sitios podrían mediar potencialmente diferencias en la función o regulación de los dos receptores.

Células de riñón de mono que expresaban transitoriamente el gen codificante del receptor hp25a se utilizaron para evaluación farmacológica. Las membranas recolectadas de las células COS-7 transfectadas transitoriamente exhibían fijación de [^{125}I]PYY saturable con afinidad alta. La evolución temporal de la fijación específica se midió en presencia de ^{125}I-PYY 0,06 nM (Fig. 5). La curva de asociación era monofásica, con una tasa de asociación observada (K_{obs}) de 0,12\pm0,02 min^{-1} y un valor t_{1/2} de 6 min; la fijación en equilibrio alcanzaba un 95% de su culminación dentro de 26 min y se completaba en un 100% dentro de 50 min (n = 3). Para comparación, se midió también la evolución temporal de la fijación a receptores Y1 humanos expresados transitoriamente en células COS-7. La curva de asociación era monofásica, con un valor K_{obs} de 0,06 \pm 0,02 min^{-1} y un valor t_{1/2} de 12 min; la fijación en equilibrio alcanzaba un 95% de su culminación dentro de 51 min y se completaba en un 100% dentro de 90 min (n = 3) (datos no presentados). Los diferentes patrones de asociación de radioligandos para hp25a y los receptores Y1 humanos sugieren nuevos mecanismos de interacción receptor/ligando.

Los datos de fijación de saturación para ^{125}I-PYY se ajustaron a un modelo de un solo sitio con un valor K_{d} aparente de 0,11 \pm 0,01 nM y un valor B_{max} aparente de 1,42 \pm 0,05 picomoles/mg de proteína de membrana, correspondientes a aproximadamente 1,4 x 10^{5} receptores/célula (n = 4; Fig. 6). Dado que la eficiencia de transfección era 20-30% (datos no presentados), la densidad de receptores en las células transfectadas era probablemente muy próxima a 7 x 10^{5}/célula. Las membranas de las células falsamente transfectadas, cuando se prepararon y se analizaron del mismo modo que las de las células transfectadas con hp25a, no exhibían fijación específica alguna de ^{125}I-PYY. De este modo se llegó a la conclusión de que los sitios de fijación de ^{125}I-PYY observados en las condiciones descritas se derivaban del constructo hp25a.

El perfil farmacológico de hp25a se definió por ensayos de fijación de membrana. El receptor se sondó respecto a características de todos los receptores de la familia de polipéptidos pancreáticos bien caracterizados, con inclusión de Y1, Y2, Y3, y PP. El orden de rango de afinidad para varios análogos peptídicos se derivó del desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY (Fig. 7 y Tabla 2). Se comparó el receptor hp25a con dos sistemas modelo: 1) el receptor Y1 humano clonado (Larhammar et al., 1992; Herzog et al., 1992) expresado transitoriamente en células COS-7, y 2) la población de receptores afines a Y2 expresada por células de neuroblastoma humano SK-N-Be(2) (Wahlestedt et al., 1991; Dumont et al., 1992). No se ha descrito ningún modelo para los receptores humanos Y3 y PP.

PP se fijaba a hp25a con afinidad extremadamente alta (K_{i} = 0,029 nM) y selectividad espectacular: PP tenía una selectividad > 6000 veces para hp25a en comparación con los receptores Y1 humanos (K_{i} = 200 nM) y los receptores SK-N-Be(2) (K_{i} > 300 nM). Este perfil sugiere que hp25a podría funcionar selectivamente como un receptor PP in vivo. Los datos indicaban adicionalmente, sin embargo, que hp25a se fijaba muy bien a NPY humano (K_{i} = 1,4 nM) y mejor aún a PYY humano (K_{i} = 0,62 nM). Estos valores K_{i}, si bien son menores que el K_{i} para PP, son comparables a las concentraciones eficaces de NPY y PYY obtenidos por numerosos estudios fisiológicos y farmacológicos (Dumont, 1992). En la investigación realizada por los autores de la presente invención, los receptores SK-N-Be(2) se fijaban a NPY humano y PYY humano en el mismo orden de rango que hp25a, pero con afinidad de 5 a 10 veces mayor, mientras que los receptores Y1 humanos se fijaban a NPY y PYY humanos en el orden de rango opuesto con afinidad de 5 a 30 veces mayor. La hidrólisis de la amida del terminal carboxi a ácido carboxílico libre, como en el ácido NPY humano libre, destruía la fijación a todos los receptores. Un requerimiento para una amida del terminal carboxi parece ser una característica estructural común de todas las interacciones péptido/receptor de la familia de polipéptidos pancreáticos.

Fuhlendorff y sus colaboradores reemplazaron Ile^{31} y Gln^{34} en NPY con los restos correspondientes de PP para crear [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY, que se utiliza comúnmente para diferenciar los receptores Y1 de Y2 (Fuhlendorff, 1990). [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY humano exhibía una selectividad >2300 veces para los receptores Y1 humanos en comparación con SK-N-Be(2), pero solamente una selectividad de 5 veces para los receptores Y1 humanos en comparación con hp25a. [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY humano era un ligando mejor para hp25a (K_{i} = 0,60 nM) que lo era el NPY humano propiamente dicho (K_{i} = 1,4 nM). Esto es posiblemente un reflejo del modo en que [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY mimetiza PP en las posiciones 31 y 34. En contraste, el análogo [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY era bien tolerado por el receptor Y1 humano (K_{i} = 0,13 nM), pero no era preferido con respecto al péptido originario (K_{i} = 0,049 nM).

EL receptor hp25a exhibía un nivel de sensibilidad intermedio para las supresiones en el terminal N de NPY y PYY, menor que los receptores Y1 humanos. La eliminación de Tyr^{1} de NPY de porcino dio como resultado una pérdida de 29 veces en afinidad para los receptores Y1 humanos en comparación con el péptido originario de longitud total. La misma modificación disminuyó la afinidad cuatro veces para los receptores hp25a y tres veces para los receptores SK-N-Be(2). Es interesante a este respecto que PP humano contiene Ala^{1}; el resto Tyr^{1} de NPY puede no jugar un papel importante en el reconocimiento de receptores. La truncación a NPY_{13-36} disminuía 1000 veces la afinidad para los receptores Y1 humanos, 33 veces para hp25a, y 4 veces para los receptores SK-N-Be(2). La truncación adicional a NPY_{22-36} de porcino reducía la afinidad 3500 veces para los receptores Y1 humanos, 120 veces para hp25a, y 11 veces para SK-N-Be(2). A este respecto, el receptor hp25a comparte características de farmacología afines a las de Y1 e Y2, como sería de esperar si la región N-terminal de NPY de porcino estuviera implicada sólo moderadamente en el reconocimiento de receptores.

Una diferencia estructural importante entre PP humano, PYY humano y NPY humano es que tanto NPY como PYY humanos contienen Gln^{34}, mientras que PP humano contiene Pro^{34}. Cuando se reemplazó Gln^{34} en NPY con Pro^{34} (como en el análogo [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY), se observó un aumento en la afinidad de fijación para el receptor Y4 humano. Se detectó un aumento similar en la afinidad de fijación cuando Gln^{34} de PYY se reemplazó con Pro^{34}, lo que soportaba la idea de que los péptidos afines a PP son preferidos por el receptor Y4. El reemplazamiento de Pro^{34} en PP humano por Gln^{34} (como en [Ile^{31}, Gln^{34}]PP) causaba un cambio muy pequeño en la afinidad de fijación de PP, sin embargo, lo que sugiere que en el caso de PP existen contribuciones significativas a la afinidad de fijación de otras regiones de la estructura del péptido.

Los Solicitantes extendieron ulteriormente los datos de estructura/actividad para fragmentos de PP humano (PP_{2-36}, PP_{13-36}, PP_{20-36}, PP_{27-36}, y PP_{31-36}). La fijación de PP no se veía afectada por la truncación del terminal N a PP_{2-36}, pero la truncación ulterior a PP_{13-36} y más allá era destructiva. El fragmento PP más corto ensayado, PP_{31-36}, se fijaba selectivamente al receptor Y4 con K_{i} = 350 nM, y la hidrólisis de la amida C-terminal era perjudicial (K_{i} > 10.000 nM para el ácido libre de PP_{31-36} humano), como ha sido publicado previamente para NPY. De este modo se llega a la conclusión de que la fijación de PP al receptor Y4 se asemeja a la fijación de NPY al receptor Y1, en el sentido de que 1) Pro^{34} es bien tolerado y 2) se requieren ambos extremos del péptido para la actividad de fijación óptima. Esto está en contraste con el modelo de fijación de Y2, en el sentido de que 1) Pro^{34} no es bien tolerado y 2) la región N-terminal de NPY no contribuye significativamente a la afinidad de fijación. Obsérvese también que los ligandos PYY_{3-36} humano y C2-NPY selectivos de Y2 exhiben una afinidad relativamente baja para el receptor Y4 humano.

Adicionalmente, se investigó la fijación del neurotransmisor tetrapeptídico de invertebrados Phe-Met-Arg-Phe-Amida (FMRF-amida). Se ha demostrado que este péptido mimetiza varias funciones de NPY, con inclusión de la estimulación de la toma de alimentos en las ratas (Robert, 1988). FMRFamida se fijaba selectivamente al receptor Y4 con un valor K_{i} de 4000 nM. Un derivado estrechamente afín, Phe-Leu-Arg-Phe-amida (FLRFamida), exhibía una afinidad de fijación de Y4 mejorada (K_{i} = 750 nM), en tanto que mantenía la selectividad. Se investigó también la fijación de [D-Trp^{32}]NPY. Se había informado que este péptido estimula la toma de alimento cuando se inyecta en el hipotálamo de la rata, y mitiga también la alimentación inducida por NPY en el mismo paradigma (Balasubramanian, 1994). [D-Trp^{32}]-NPY exhibía una afinidad de fijación relativamente baja para el receptor Y4 humano así como para los subtipos de receptores Y1 e Y2 humanos. Los datos para estos y otros nuevos péptidos no incluidos en la presentación de la patente original se enumeran en la Tabla 3.

Se pre-escrutaron NIH-3T3 y LM(tk-) no transfectados en cuanto a fijación específica de ^{125}I-PYY y se encontró que ésta era negativa (datos no presentados). Después de co-transfección con el cDNA de Y4 humano y un gen resistente a G418 y selección con G-418, las colonias supervivientes se escrutaron en cuanto a fijación específica de ^{125}I-PYY. Se identificaron dos clones positivos y se aislaron para estudio ulterior (el clon #5 de hY4 de NIH-3T3 y el clon #3 de hY4 de LM(tk-)). La fijación de ^{125}I-PYY a las membranas del clon estable NIH-3T3 era saturable en un intervalo de concentración de radioligando de 0,5 pM a 2,5 nM. Los datos de fijación se ajustaron a un modelo de fijación de un solo sitio con un valor K_{i} aparente de 0,017 nM \pm 0,005 y una densidad de receptores de 350 \pm 80 fmol/mg de proteína de membrana (valor medio \pm error estándar del valor medio, n = 2). El clon LM(tk-) exhibía una densidad de receptores estimada de 7 fmol/mg de proteína de membrana durante el escrutinio de selección primario, y no se analizó ulteriormente en un ensayo de saturación.

Se cree que la activación de todos los receptores de tipo Y descritos hasta ahora implica acoplamiento a las proteínas G sensibles a la toxina de la tos ferina que son inhibidoras de la actividad de adenilato-ciclasa (G_{i} o G_{o}) (Wahlestedt y Reis, 1993). Sobre la base de estas observaciones previas, se ha investigado la capacidad de PP para inhibir la acumulación de cAMP estimulada por la forskolina en células LM(tk-) que expresan de manera estable el receptor Y4 humano. La incubación de células intactas con forskolina 10 \muM producía un aumento aproximado de 10 veces en la acumulación de cAMP en un período de tiempo de 5 minutos, como se determinó por radioinmunoensayo. La incubación simultánea con PP humano redujo la acumulación de cAMP estimulada por la forskolina en un 67% en células LM(tk-) transfectadas de manera estable (Fig. 8) pero no en las células no transfectadas (datos no presentados). Los solicitantes llegan a la conclusión de que la activación del receptor Y4 humano puede dar como resultado una menor acumulación de cAMP, muy probablemente por inhibición de la actividad de adenilato-ciclasa.

Los péptidos seleccionados por su capacidad para fijarse al receptor Y4 humano expresado transitoriamente se investigaron en cuanto a su capacidad para activar Y4 humano en el ensayo de cAMP (Tabla 4). Obsérvese que tanto PP humano como PP_{2-36} humano se fijaban al receptor Y4 con un valor K_{i} de 0,06 nM, y que cada uno de ellos exhibía una actividad comparable en el ensayo cAMP con valores CE_{50} estrechamente concordantes de 0,09 nM y 0,08 nM, respectivamente. Los fragmentos de PP truncados PP_{27-36} y PP_{31-36} eran ligandos relativamente débiles en el ensayo de fijación y tenían también una eficacia menor que 50% en comparación con el PP de longitud total en lo referente a la reducción de cAMP estimulado por forskolina, actuando por consiguiente como agonistas parciales. Análogamente, tanto NPY como PYY (que se desvían de PP fundamentalmente en la reacciones del terminal N) producían valores de CE_{50} \geq 10 veces mayores que sus valores K_{i}. La activación de receptores (más que la fijación) puede depender por consiguiente acusadamente de la estructura de PP en el terminal N. Se investigó también la actividad funcional del modulador del comportamiento de alimentación consignado [D-Trp^{32}]NPY. Consistentemente con la baja actividad de fijación de este péptido para el receptor Y4 humano, no se detectó actividad funcional alguna del péptido a concentraciones de hasta 0,3 \muM (véase la Tabla 4), o cuando se ensayó a 0,3 \muM para el antagonismo de la respuesta funcional de PP (datos no presentados).

La concentración intracelular de calcio libre se incrementaba notablemente en las células LM(tk-) transfectadas de manera estable con el receptor Y4 humano después de aplicación de PP humano 100 nM (\Delta [Ca^{2+}]_{i} = 325 nM; Fig. 9). La respuesta a NPY 100 nM era relativamente pequeña (\Delta [Ca^{2+}]_{i} = 68 nM). Las células LM(tk-) no transfectadas no eran sensibles a ninguno de los péptidos (datos no presentados). Cuando se analizó ulteriormente PP humano en una curva concentración/respuesta, el valor máximo \Delta [Ca^{2+}]_{i} medido fue 334 nM, y el valor CE_{50} era 35 nM (Fig. 9, inserción). Esta mayor actividad de PP en comparación con NPY es consistente con los perfiles farmacológicos derivados tanto de los ensayos de fijación como de los ensayos cAMP descritos anteriormente. El ensayo de movilización de calcio proporciona por consiguiente una segunda vía por la cual se puede medir la activación del receptor Y4.

Se detectó mRNA de Y4 por técnicas PCR en una amplia gama de tejidos humanos. Se detectaron señales de hibridación relativamente intensas en cerebro total, arteria coronaria, e íleon, lo que sugiere un papel potencial para los receptores Y4 en la función del CNS, la regulación cardiovascular, y la fisiología gastrointestinal (Tabla 5).

El cDNA correspondiente al homólogo de Y4 de rata se expresó transitoriamente en células COS-7 para estudios de fijación de membrana. La fijación de ^{125}I-PYY al receptor Y4 de rata era saturable a lo largo de una concentración de radioligando de 0,5 pM a 2,5 nM. Los datos de fijación se ajustaron a un modelo de un solo sitio con un valor K_{d} aparente de 0,15 nM \pm 0,005 y una densidad de receptor de 275 \pm 3 fmol/mg de proteína de membrana (valor medio \pm error estándar del valor medio, n = 2). Como se determinó por utilización de análogos peptídicos dentro de la familia de polipéptidos pancreáticos, el perfil farmacológico de Y4 de rata guarda cierta semejanza con el receptor Y4 humano; sin embargo, hay varias excepciones interesantes, que incluyen PP de rana, PP de salmón, PP_{31-36} humano, y PP aviar, cada uno de los cuales discriminaba \sim 10 veces entre los subtipos del receptor de rata y humano (Tabla 6). Las diferencias pueden reflejar el hecho de que PP no está bien conservado entre especies con relación a NPY y PYY; por consiguiente, las especies homólogas de PP exhibirán probablemente más variabilidad en la fijación de ligandos.

En suma, tanto el receptor Y4 humano como el receptor Y4 de rata presentaban características singulares entre los receptores de neuropéptidos, exhibiendo un perfil que es divergente de sus afines más próximos, Y1 o Y2, en el sentido de que cada uno de ellos se fija óptimamente a PP en lugar de hacerlo a NPY o PYY (véanse Tablas 1, 2 y 6). Al contrario que los modelos de receptor Y1 e Y2, el receptor Y4 parece ser una diana razonable para la totalidad de los tres ligandos peptídicos.

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TABLA 1

4

TABLA 2

5

TABLA 3 Receptor Y humano frente a receptores de tipo Y clonados a partir del humano. Los datos de fijación reflejan el desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY procedente de membranas de células COS-7 que expresan transitoriamente los receptores Y1 humano, Y2 humano e Y4 humano. Los valores CI_{50} correspondientes a 50% de desplazamiento se determinaron por análisis de regresión no lineal y se convirtieron en valores K_{i} de acuerdo con la ecuación Chang-Prusoff, K_{i} = CI_{50}/(1 + [L]/K_{d}), donde [L] es la concentración de ^{125}I-PYY y K_{d} es la constante de disociación en equilibrio de ^{125}I-PYY. Se hace referencia a cualquier péptido no incluido en la presentación de la patente original como un "péptido nuevo"

6

TABLA 3 (continuación)

8

TABLA 3 (continuación)

9

TABLA 4 Activación funcional del receptor Y4 humano e inhibición de la acumulación de cAMP. Los valores K_{i} se derivaron de ensayos de fijación como los descritos en la Tabla 3. Los péptidos se evaluaron respecto a afinidad de fijación y se analizaron luego respecto a actividad funcional. Los datos de funcionalidad se derivaron del radioinmunoensayo de la acumulación de cAMP en células LM(tk-) transfectadas de manera estable, estimuladas con forskolina 10 \muM. La inhibición máxima de la acumulación de cAMP con relación a la producida por PP humano (E_{max}) y la concentración que producía un efecto semi-máximo (CE_{50}) se determinaron por regresión no lineal

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TABLA 5 Macrolocalización de mRNA del receptor Y4 en tejidos humanos por PCR. Los datos de localización reflejan la multiplicación basada en PCR de cDNA de Y4 humano derivado de extractos de mRNA de tejidos humanos. Se prepararon transferencias Southern de los productos PCR y se hibridaron con sondas oligonucleotídicas marcadas con ^{32}P selectivas para subtipos de receptores de tipo Y. Los productos marcados se registraron en película de rayos X y se determinó la densidad relativa de señal por inspección visual. En este esquema de evaluación, + = señal débil, + + = señal moderada, + + + = señal intensa

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TABLA 6 Perfil farmacológico de fijación del receptor Y4 de rata frente al receptor Y4 humano. Los datos de fijación reflejan el desplazamiento competitivo de ^{125}I-PYY de membranas de células COS-7 que expresan transitoriamente los receptores Y4 de rata e Y4 humano. Los valores CI_{50} correspondientes al 50% de desplazamiento se determinaron por análisis de regresión no lineal y se convirtieron en valores K_{i} de acuerdo con la ecuación Chang-Prusoff, K_{i} = CI_{50}/(1+[L]/K_{d}), donde [L] es la concentración de ^{125}I-PYY y K_{d} es la constante de disociación en equilibrio de ^{125}I-PYY

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Discusión

Los solicitantes han clonado DNA representativo de un nuevo receptor humano neuropéptido Y/péptido YY/
polipéptido pancreático (Y4) de DNA genómico humano. De todas las secuencias de receptores acoplados a la proteína G conocidas (base de datos EMBL/Genbank), la homología máxima era exhibida entre hp25a y los genes del receptor Y1 (ratón -Eva et al., 1992; rata -Eva et al., 1990; y humano -Larhammar et al., 1992). La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de hp25a humano con secuencias de receptores acoplados a la proteína G conocidas indica que la concentración máxima de aminoácidos idénticos se encuentra en los dominios transmembrana. En estas regiones TM, el porcentaje de identidad para el clon hp25a es 55% en comparación con Y1 humano, y menor que 35% con otros miembros de la subfamilia de péptidos y otras subfamilias de receptores acoplados a la proteína G. La alineación de esta secuencia de hp25a humano, con relación a otros receptores acoplados a la proteína G u otros miembros de la subfamilia de receptores de neuropéptidos, específicamente Y1 humano, indica una secuencia singular, lo que demuestra que hp25a es un receptor de nueva identificación. La homología de hp25a con Y1 indica que el mismo es afín a la familia de receptores NPY/PYY/PP.

Si bien la secuencia del receptor humano hp25a exhibe mayor identidad global y transmembrana con la secuencia del receptor Y4 de rata rs16b que con otros receptores de tipo Y tales como el receptor Y1 humano, la divergencia entre las secuencias Y4 de rata e Y4 humana puede contribuir a las diferencias farmacológicas entre los dos receptores. El aislamiento del homólogo de rata del receptor Y4 proporciona el medio para comparar las propiedades farmacológicas de los receptores Y4 de rata y humano (véase más adelante) en relación con sus diferencias observadas en estructuras primarias. Estos datos serán críticos para el diseño y ensayo de agentes terapéuticos humanos con acción en estos sitios.

El perfil farmacológico singular del receptor Y4 humano hp25a sugiere que este receptor puede servir como nueva diana para el desarrollo de ligandos selectivos de subtipos. Los estudios de desplazamiento competitivo indican que PP humano es el ligando preferido para hp25a. El receptor se fija también con afinidad alta a NPY humano y PPY humano, que comparten \geq47% de identidad de aminoácidos con PP humano. La afinidad se incrementa por modificación de NPY para asemejarse estrechamente a PP, como en [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY. La afinidad disminuida para los fragmentos C terminales NPY sugiere que ambas regiones N-terminal y C-terminal de NPY contribuyen al reconocimiento del receptor hp25a. hp25a era menos sensible a la supresión N-terminal de NPY que lo era el receptor de Y1 humano. Puede especularse que tanto Y1 como hp25a comparten un mecanismo común de interacción peptídica que se ha optimizado para NPY o PP, respectivamente.

Los datos farmacológicos no soportan la clasificación de hp25a como un receptor Y1, en cuyo caso el mismo debería exhibir una selectividad >4000 veces para la fijación a NPY humano en comparación con PP humano (Tabla 2). Los datos tampoco soportan la clasificación como receptor Y2, en cuyo caso aquél debería tolerar la supresión N-terminal de NPY y no debería tolerar intercambio alguno de Gln^{34} en lugar de Pro^{34} (Tabla 2). Finalmente, los datos no soportan la clasificación de hp25a como receptor Y3, dado que entonces sería de esperar que aquél exhibiera mayor afinidad para NPY que para PP o PYY (Wahlestedt et al., 1991). Por esta razón, los solicitantes designan el receptor hp25a como un receptor Y4.

Los datos adicionales incluidos aquí reflejan una comprensión incrementada de las interacciones receptor/ligando. La identificación adicional de la farmacología del receptor Y4 realizada por los autores de la presente invención ha indicado, por ejemplo, que la afinidad de fijación tanto para NPY humano (K_{i} = 2,2 nM) como para PYY humano (K_{i} = 0,87 nM) puede mejorarse por conversión en [^{Leg}, Pro^{34}]NPY humano (K_{i} = 1,1 nM) o [Pro^{34}]PYY humano (K_{i} = 0,14 nM). Esta información confirma la importancia de Pro34- en el farmacóforo peptídico y podría incorporarse potencialmente en el diseño de ligandos no peptídicos metabólicamente estables con selectividad para Y4. Adicionalmente, los datos incitan a una re-evaluación de los informes bibliográficos en los cuales se describe [Pro^{34}]PYY como un ligando selectivo para Y1. Los resultados obtenidos por los autores de la presente invención indican que [Pro^{34}]PYY no discrimina entre el receptor Y1 humano clonado y el receptor Y4 humano clonado (K_{i} = 0,12 y 0,14 nM, respectivamente), por lo que [Pro^{34}]PYY no puede utilizarse en forma aislada para definir subtipos de receptores.

Otros péptidos particularmente interesantes incluyen FMRF-amida, FLRF-amida, y [D-Trp^{32}]NPY. Se ha demostrado que tanto FMRF-amida como [D-Trp^{32}]NPY modulan la toma de alimento en las ratas (obténgase referencia de George M). Si bien FMRF-amida y su derivado exhibían cierto grado de selectividad para Y4 (aunque afinidad relativamente baja en comparación con PP humano), [D-Trp^{32}]NPY era esencialmente inactivo en todos los subtipos de receptores Y estudiados. Estos perfiles tienen que considerarse cuando se quiere validar el mecanismo de receptores de la toma de alimento inducida por NPY. El tetrapéptido FLRF-amida tiene valor adicional como punto de partida para el diseño de pequeños compuestos no peptídicos con selectividad para Y4.

Los solicitantes tienen ahora varios sistemas de expresión del receptor Y4 de elección, adecuado singularmente cada uno de ellos para diferentes cuestiones de investigación. El sistema de expresión transitorio en COS-7, por ejemplo, permite generar cantidades suficientes de membranas para cuestiones rutinarias de la relación estructura/actividad. Los solicitantes pueden producir también receptores mutantes por mutagénesis dirigida al sitio u otras técnicas de mutagénesis y expresarlas transitoriamente en COS-7 para una comparación de las propiedades farmacológicas con las del receptor de tipo salvaje. De este modo, es posible formarse una idea sobre bolsas de fijación de receptores, dominios de fijación de ligandos, y mecanismos de activación. En tanto que el sistema de expresión transitoria requiere una nueva transfección para cada recolección de células o membranas, el sistema de expresión estable ofrece la comodidad de un solo paso de transfección seguido por técnicas de pasadas rutinarias. El sistema estable ofrece también la oportunidad de seleccionar la densidad de receptores, lo cual podría ser un factor importante en la evaluación de la actividad intrínseca de los ligandos del receptor Y4.

La identificación por los solicitantes del receptor Y4 expresado de manera estable demuestra ahora definitivamente que el receptor Y4 puede acoplarse simultáneamente a la regulación de cAMP y la movilización del calcio en un mismo tipo de célula. El valor CE_{50} para la respuesta del calcio es significativamente más alto que el valor CE_{50} para la respuesta de cAMP, lo que sugiere que la movilización del calcio puede reflejar un acoplamiento promiscuo del receptor a la proteína G distinto del requerido para la regulación de la ciclasa. Los ensayos funcionales permiten asignar actividades agonistas y antagonistas a compuestos selectivos de receptores y proporcionar con ello herramientas críticas para diseño de fármacos.

Se presenta lógicamente la cuestión de si hp25a debería clasificarse como un receptor PP. De acuerdo con el conocimiento de los solicitantes, no ha descrito ningún receptor PP humano. Por consiguiente, debería considerarse el receptor PP de rata para comparación. El receptor PP de rata se fija a PP y análogos en el mismo orden de rango que hp25a (PP > [Leu^{31}, Pro^{34}]NPY > NPY) (Schwartz et al., 1990). El receptor PP de rata parecía fijarse también a ambas regiones N-terminal y C-terminal del ligando peptídico (Schwartz et al., 1987). Una discrepancia evidente entre hp25a y el receptor PP de rata es que el último exhibía una selectividad 10.000 veces mayor para PP que para NPY (Schwartz et al., 1990).

En los experimentos de localización realizados por los solicitantes, se detectó mRNA de Y4 por técnicas PCR en una extensa gama de tejidos humanos. Se detectaron señales de hibridación relativamente intensas en cerebro total, arteria coronaria, e íleon, lo que sugería un papel potencial para los receptores Y4 en la función del CNS, la regulación cardiovascular, y la fisiología gastrointestinal. Este patrón de localización es consistente con estudios previamente publicados de efectos mediados por PP en 1) sitios del tallo cerebral (McTigue et al., 1993; Whitcomb et al., 1990), 2) sobre la presión sanguínea arterial (Wager-Page et al., 1993a) y 3) sobre la secreción de ácido gástrico y la motilidad gastrointestinal (McTigue et al., 1993; Wager-Page et al., 1993b). Una localización más definitiva del mRNA del receptor Y4 y la expresión del receptor (es decir, si se expresa en enterocitos, células de la musculatura lisa vascular, neuronas, etc.) puede obtenerse por hibridación in situ y técnicas de autorradiografía de receptores. Conforme al conocimiento de los solicitantes, no se ha publicado informe alguno acerca de la localización de receptores PP en tejido humano obtenida por fijación o estudios funcionales. Sin embargo, puede ser informativo comparar los datos de macrolocalización de Y4 humano presentados aquí con la caracterización del receptor PP en la rata. Receptores PP han sido descritos, por ejemplo, en núcleos del tallo cerebral tales como el área postrema, el núcleo interpeduncular, el núcleo dorsomedial, y el nucleus tractus solitarius (Whitcomb et al., 1990), consistente con la identificación de mRNA de Y4 en el cerebro humano. Los receptores PP en el tallo cerebral de rata son accesibles al PP circulante, que se libera por estimulación vagal del páncreas durante la comida (Whitcomb et al., 1990). La activación de los receptores PP del tallo cerebral inhibe la secreción pancreática ulterior, aumenta la secreción de ácido gástrico, intensifica la motilidad gástrica, e incrementa el tiempo de vaciado gástrico (Louie et al., 1985; McTigue y Rogers, 1993). Así pues, podría esperarse que un antagonista del receptor Y4, hiciera más lento el tiempo de vaciado gástrico y redujera potencialmente la cuantía de las comidas.

Dadas las semejanzas en perfiles farmacológicos entre el receptor de PP publicado y el receptor Y4 hp25a humano, podría caerse en la tentación de llamar receptor PP humano al hp25a. Sin embargo los Solicitantes creen que llamar receptor PP humano al hp25a podría ser engañoso. Esto es debido a que la ventana de afinidad relativamente comprimida para PP, PYY, y NPY (0,02 nM \leq K_{i} \leq 1,5 nM) hace de hp25a una diana potencial para los tres ligandos peptídicos. Experimentos de localización futuros pueden ayudar a resolver la relación entre hp25a y el
receptor PP.

Los solicitantes proponen que hp25a sea conocido como receptor Y4. El nombre no está sesgado hacia ningún miembro de la familia de polipéptidos pancreáticos. La "Y" tiene sus raíces en la clasificación original de los subtipos de receptores Y1 e Y2 (Whalestedt et al., 1987). La letra refleja la conservación en los miembros de la familia de polipéptidos pancreáticos de la tirosina del terminal C, descrita como "Y" en el código de aminoácidos de una sola letra. Los solicitantes observan que el receptor Y1 humano clonado fue introducido por Larhammar y colaboradores como un "receptor neuropéptido Y/péptido YY humano del tipo Y1", con ligandos peptídicos enumerados por orden de rango de afinidad (Larhammar et al., 1992). Análogamente, hp25a podría describirse como un receptor humano de polipéptido pancreático/péptido YY/neuropéptido Y del tipo Y4.

Conforme al conocimiento de los Solicitantes, hp25a es el primer receptor "tipo Y" que ha sido clonado a partir de una familia de subtipo distinta de Y1. El receptor Y3 consignado como clonado a partir de cerebro de bovino (Rimland et al., 1991) fue descrito con posterioridad como falsamente identificado (Jazin et al., 1993; Herzog et al., 1993). Un receptor afín a Y2 (PR4) se clonó a partir de Drosophila y se caracterizó utilizando análogos de NPY de mamífero (Li et al., 1992); sin embargo, la clasificación de este receptor es objeto de controversia. El receptor era relativamente insensible a NPY; se requerían concentraciones comprendidas entre 0,3 y 10 \muM para provocar la movilización del calcio en oocitos inyectados con mRNA de PR4 (Li et al., 1992). El receptor exhibía también un orden de rango de potencia para análogos NPY distinto del observado en los sistemas de mamífero (Wahlestedt et al., 1993; Li et al., 1992). Adicionalmente, un análogo de NPY no ha sido aislado de drosophila (Whalestedt et al., 1993). Es posible que un ligando de drosophila no identificado pueda activar PR4 más fácilmente que NPY, y como tal, el receptor puede ser reclasificado eventualmente.

La clonación y expresión de un receptor Y4 (hp25a) representa un avance importante en la capacidad para analizar numerosos procesos fisiológicos mediados por la familia de polipéptidos pancreáticos. Los sitios de fijación para PP, PYY, o NPY tienen una distribución anatómica muy extendida en dianas periféricas tales como la unión neuromuscular, la musculatura lisa, las células principales del estómago, los enterocitos intestinales, el túbulo proximal del riñón, y las células cargadas de grasa del tejido adiposo (Dumont et al., 1992; Castan et al., 1992). Estos receptores se encuentran por consiguiente en una posición que permite regular potencialmente una diversidad de funciones fisiológicas con inclusión del conocimiento, el ritmo circadiano, la sincronización del electroencefalograma (EEG), la temperatura corporal, la presión sanguínea, la actividad locomotora, la liberación neuroendocrina, el comportamiento sexual y/o relacionado con la reproducción, la alimentación, la activación simpática, la transmisión sensorial, la función gastrointestinal, la secreción intestinal, la absorción renal, y la función cardiovascular (Whalestedt et al., 1993).

Los receptores Y4 son un recurso inestimable para el diseño de fármacos. La familia de polipéptidos pancreáticos está involucrada potencialmente en varias condiciones patofisiológicas que incluyen pérdida de memoria, depresión, ansiedad, convulsiones epilépticas, dolor, hipertensión, problemas locomotores, trastornos del ritmo circadiano, trastornos de la relación alimentación/peso corporal, trastornos sexuales y/o relacionados con la reproducción, congestión nasal, y diarrea (Whalestedt et al., 1993; Dumont et al., 1992). Los datos disponibles implican a este receptor en el control de la obesidad y otros trastornos de la alimentación con inclusión de bulimia y anorexia. La síntesis química de fármacos selectivos no sólo para Y4 sino para todos los receptores de "tipo Y" se acelera notablemente por el escrutinio preliminar contra una población homogénea de receptores Y4 humanos clonados. A medida que lleguen a estar disponibles herramientas farmacológicas más específicas para el sondeo de la función de los receptores, es probable que se descubran indicaciones terapéuticas adicionales.

Los solicitantes no saben si hp25a representa el único receptor Y4 expresado en el genoma humano, o si existe un grupo de subtipos de receptores Y4 estructuralmente afines. Esta es una cuestión que puede resolverse utilizando secuencias de nucleótidos del receptor Y4 como la base para localización in situ, estrategias antisentido o de "precipitación", clonación por homología, y técnicas afines. Tales enfoques harán posible investigar la existencia de subtipos de receptores potencialmente nuevos con importancia farmacológica y terapéutica.

En conclusión, la estructura primaria de las proteínas codificadas por el gen hp25a (Y4) y su homólogo en la rata, así como su perfil farmacológico singular obtenido para el subtipo de receptor Y4, indican que estos genes representan una nueva subfamilia de receptores de polipéptidos pancreáticos. Se requerirán esfuerzos de clonación adicionales para aislar nuevos miembros de esta familia de receptores de neuropéptidos reconocidos recientemente.

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(1) INFORMACION GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Bard, Jonathan A.

\hskip4cm

Walker, Mary

\hskip4cm

Branchet, Theresa

\hskip4cm

Weinshank, Richard L.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TITULO DE LA INVENCION: DNA CODIFICANTE DE UN RECEPTOR DE NEUROPEPTIDO Y/PEPTIDO YY/POLIPEPTIDO PANCREATICO HUMANO (Y4) Y SUS APLICACIONES

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCION DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Cooper & Dunham

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1185 Avenue of the Americas

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL: 10036

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): EQUIPO LOGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NUMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACION:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACION:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACION DE APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: White, John P.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NUMERO DE REGISTRO: 28.678

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: 44743-A-PCT\JPW\MAT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACION PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELEFONO: (212) 278-0400

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (212) 391-0525

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1320 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACION: 88..1212

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 375 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:

22

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1439 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTETICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACION: 178..1306

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

42

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 376 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Y4 humano, es decir, un receptor caracterizado por un perfil farmacológico característico del receptor Y4 humano como se muestra en la Tabla 6.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor Y4 de rata, por ejemplo un receptor caracterizado por un perfil farmacológico característico del receptor Y4 de rata como se muestra en la Tabla 6.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2, en la cual la molécula de ácido nucleico es una molécula de DNA o una molécula de RNA.

4. La molécula de DNA de la reivindicación 3, en la cual la molécula de DNA es una molécula de cDNA.

5. La molécula de DNA de la reivindicación 3, en la cual la molécula de DNA es una molécula de DNA genómico.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la cual el receptor Y4 humano tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la mostrada en la Figura 1.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la cual el receptor Y4 humano tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la cual el receptor Y4 de rata tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la mostrada en la Figura 3.

9. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8, en la cual el receptor Y4 de rata tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 3.

10. Una proteína receptora Y4 purificada codificada por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Un vector de la reivindicación 11 adaptado para expresión en una célula bacteriana, célula de levadura, célula de insecto o célula de mamífero, que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión del ácido nucleico en dicha célula enlazados operativamente al DNA codificante del receptor Y4 a fin de permitir su expresión.

13. El vector de la reivindicación 12, en el cual el vector es un baculovirus.

14. El vector de la reivindicación 12, en el cual el vector es un plásmido.

15. El plásmido de la reivindicación 14 designado pcEXV-Y4 (Nº de acceso ATCC 75631).

16. Una célula de mamífero que comprende el vector de la reivindicación 13 ó 14.

17. La célula de la reivindicación 16, en la cual la célula es de origen no neuronal.

18. La célula de la reivindicación 16, en la cual la célula es una célula COS-7 o una célula LM(tk-).

19. La célula de la reivindicación 16, en la cual la célula es una célula NIH-3T3.

20. Un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridarse específicamente a una molécula de mRNA codificante de un receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata de la reivindicación 2 a fin de impedir la traducción de la molécula de mRNA o que tiene una secuencia capaz de hibridarse específicamente a la molécula de cDNA de la reivindicación 4.

21. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 20, que comprende análogos químicos de nucleótidos.

22. Un anticuerpo capaz de fijarse a un receptor Y4 humano codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.

23. Un anticuerpo capaz de inhibir competitivamente la fijación del anticuerpo de la reivindicación 22 a un receptor Y4 humano codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.

24. El anticuerpo de la reivindicación 23, en el cual el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

\newpage

25. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 24 dirigido a un epítope de un receptor Y4 humano o de rata presente en la superficie de una célula que expresa el receptor Y4 humano o de rata.

26. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad del oligonucleótido de la reivindicación 20 ó 21 eficaz para disminuir la actividad de un receptor Y4 humano o de rata por paso a través de una membrana celular y fijación específica con mRNA codificante de un receptor Y4 humano o de rata en la célula a fin de impedir su traducción, y un vehículo farmacéuticamente aceptable capaz de pasar a través de una membrana celular.

27. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en la cual el oligonucleótido está acoplado a una sustancia que inactiva el mRNA.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en la cual la sustancia que inactiva el mRNA es una ribozima.

29. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en la cual el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una estructura que se fija a un receptor en una célula capaz de ser absorbida por las células después de fijación a la estructura.

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 29, en la cual la estructura del vehículo farmacéuticamente aceptable es capaz de fijarse a un receptor que es específico para un tipo de célula seleccionado.

31. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad del anticuerpo de la reivindicación 22 eficaz para bloquear la fijación de un ligando a un receptor Y4 humano o de rata y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Un método para determinar si un ligando puede fijarse específicamente a un receptor Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante del receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o el receptor Y4 de rata de la reivindicación 2 con el ligando en condiciones que permiten la fijación de ligandos a dicho receptor, y detectar la presencia del ligando fijado específicamente al receptor Y4, determinando con ello si el ligando se fija específicamente a un receptor Y4 humano o de
rata.

33. Un método para determinar si un ligando pude fijarse específicamente a un receptor Y4 humano o de rata, que comprende preparar un extracto de células a partir de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante del receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o el receptor Y4 de la reivindicación 2, aislar una fracción de membrana del extracto de células, poner en contacto el ligando con la fracción de membrana en condiciones que permitan la fijación de ligandos a dicho receptor, y detectar la presencia de cualquier ligando fijado al receptor Y4, determinando con ello si el ligando es capaz de fijarse específicamente a un receptor Y4 humano o de
rata.

34. Un método para determinar si un ligando es un agonista del receptor Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata de la reivindicación 2 con el ligando en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional de receptor Y4, y detectar por medio de un bioensayo, tal como un ensayo de segundo mensajero, un aumento en la actividad del receptor Y4, determinando con ello si el ligando es un agonista del receptor Y4 humano o de rata.

35. Un método para determinar si un ligando es un agonista del receptor Y4 humano o de rata, que comprende preparar un extracto de células a partir de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata de la reivindicación 2, aislar una fracción de membrana del extracto de células, poner en contacto la fracción de membrana con el ligando en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4, y detectar por medio de un bioensayo, tal como un ensayo de segundo mensajero, un aumento en la actividad del receptor Y4, determinando con ello si el ligando es un agonista del receptor Y4 humano o de rata.

36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 35, en el cual el ensayo de segundo mensajero comprende la medida de cAMP intracelular o la movilización de calcio intracelular.

37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en el cual la célula es una célula de mamífero.

38. El método de la reivindicación 37, en el cual la célula de mamífero es de origen no neuronal.

39. El método de la reivindicación 38, en el cual la célula de mamífero de origen no neuronal es una célula COS-7, célula CHO, célula LM(tk-) o célula NIH-3T3.

40. Un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos para fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4 humano o de rata en la superficie de una célula, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata de la reivindicación 2 con una pluralidad de compuestos en condiciones que permiten la fijación de los compuestos al receptor Y4, y determinar aquellos compuestos que se fijan específicamente a la célula transfectada, identificando de este modo candidatos para fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4 humano o de rata.

41. Un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos para fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4 humano o de rata en la superficie de una célula, que comprende preparar un extracto de células a partir de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata de la reivindicación 2, aislar una fracción de membrana a partir del extracto de células, poner en contacto la fracción de membrana con una pluralidad de compuestos, y determinar aquellos compuestos que se fijan a la célula transfectada, identificando con ello candidatos para fármacos que se fijan específicamente a un receptor Y4 humano o de rata.

42. Un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos para fármacos que actúan como agonistas de un receptor Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto una pluralidad de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata de la reivindicación 2 con una pluralidad de compuestos en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4, y determinar aquellos compuestos que activan dicho receptor utilizando un bioensayo, tal como un ensayo de segundo mensajero, identificando con ello candidatos para fármacos que actúan como agonistas del receptor Y4 humano o de rata.

43. Un método de escrutinio de compuestos químicos para identificar candidatos para fármacos que actúan como agonistas de un receptor Y4 humano o de rata, que comprende preparar un extracto de células a partir de células transfectadas con y que expresan ácido nucleico codificante de un receptor Y4 humano de la reivindicación 1 o un receptor Y4 o de rata de la reivindicación 2, aislar una fracción de membrana a partir del extracto de células, poner en contacto la fracción de membrana con una pluralidad de compuestos en condiciones que permiten la activación de una respuesta funcional del receptor Y4, y determinar aquellos compuestos que activan dicho receptor utilizando un bioensayo, tal como un ensayo de segundo mensajero, identificando de este modo candidatos para fármacos que actúan como agonistas del receptor Y4 humano o de rata.

44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, en el cual el ensayo de segundo mensajero comprende la medida de cAMP intracelular o la movilización de calcio intracelular.

45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 44, en el cual la célula es una célula de mamífero.

46. El método de la reivindicación 45, en el cual la célula de mamífero es de origen no neuronal.

47. El método de la reivindicación 46, en el cual la célula de mamífero de origen no neuronal es una célula COS-7, una célula CHO, una célula LM(tk-) o una célula NIH-3T3.

48. Un método de detección de la presencia de un receptor Y4 humano o de rata en la superficie de una célula, que comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo de la reivindicación 22 en condiciones que permiten la fijación del anticuerpo al receptor, y detectar la presencia del anticuerpo fijado a la célula, detectando con ello la presencia de un receptor Y4 humano o de rata en la superficie de la célula.

49. Un método para preparar el receptor Y4 humano o de rata purificado de la reivindicación 11, que comprende:

a.: construir un vector adaptado para expresión en una célula que comprende los elementos reguladores necesarios para la expresión de ácido nucleico en la célula enlazados operativamente al ácido nucleico codificante del receptor Y4 humano o de rata a fin de permitir su expresión, en el cual la célula se selecciona del grupo constituido por células bacterianas, células de levadura, células de insecto y células de mamífero;

b.: insertar el vector del paso a en una célula huésped adecuada;

c.: incubar las células del paso b en condiciones que permiten la expresión del receptor Y4 humano o de rata;

d.: recuperar el receptor así producido; y

e.: purificar el receptor así recuperado, preparando de este modo un receptor Y4 humano o de rata.

\vskip1.000000\baselineskip

50. Una preparación de membrana aislada a partir de una célula que no expresa normalmente un receptor Y4 humano o de rata pero que ha sido transfectada con DNA codificante de un receptor Y4 humano codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata de acuerdo con la reivindicación 2, en condiciones tales que el receptor Y4 humano o de rata se expresa en la superficie de las células.

51. Un proceso para identificar un compuesto químico que se fija específicamente a un receptor Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto células no neuronales que expresan en su superficie celular el receptor Y4 humano codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1 ó el receptor Y4 de rata codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 2, o una fracción de membrana procedente de un extracto de células de la misma, con el compuesto químico en condiciones adecuadas para la fijación, y detectar la fijación específica del compuesto químico al receptor Y4 humano o de rata.

52. Un proceso para determinar si un compuesto químico se fija específicamente a y activa un receptor Y4 humano o de rata, que comprende poner en contacto células no neuronales productoras de una respuesta de segundo mensajero y que expresan en su superficie celular un receptor Y4 humano codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1 o un receptor Y4 de rata de la reivindicación 2, o una fracción de membrana procedente de un extracto de células del mismo, con el compuesto químico en condiciones adecuadas para activación del receptor Y4, y medir la respuesta del segundo mensajero en presencia y en ausencia del compuesto químico, indicando un cambio en la respuesta del segundo mensajero en presencia del compuesto químico que el compuesto químico activa el receptor Y4 humano o de rata.

53. El proceso de la reivindicación 52, en el cual la respuesta del segundo mensajero comprende actividad de adenilato-ciclasa, y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es una disminución en la actividad de adenilato-ciclasa.

54. El proceso de la reivindicación 52, en el cual la respuesta del segundo mensajero comprende niveles de calcio intracelulares y el cambio en la respuesta del segundo mensajero es un aumento en los niveles de calcio intracelulares.

55. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 51 a 54, en el cual la célula no neuronal es una célula de mamífero.

56. El proceso de la reivindicación 55, en el cual la célula de mamífero es una célula COS-7, una célula CHO, una célula LM(tk-), o una célula NIH-3T3.