EP4689060A1 - Verfahren zur erzeugung von hydrogel-mikropartikeln - Google Patents

Verfahren zur erzeugung von hydrogel-mikropartikeln

Info

Publication number
EP4689060A1
EP4689060A1 EP24714864.6A EP24714864A EP4689060A1 EP 4689060 A1 EP4689060 A1 EP 4689060A1 EP 24714864 A EP24714864 A EP 24714864A EP 4689060 A1 EP4689060 A1 EP 4689060A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
channel
hydrophilic
hydrogel
cell suspension
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP24714864.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd SCHEUFELE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4689060A1 publication Critical patent/EP4689060A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2/00—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic
    • B01J2/02—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops
    • B01J2/06—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops in a liquid medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
    • C08J2305/04—Alginic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
    • C08J2305/12—Agar-agar; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2371/00—Characterised by the use of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Derivatives of such polymers
    • C08J2371/02—Polyalkylene oxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
    • C08J2389/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
    • C08J2389/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic method for producing hydrogel microparticles for culturing cells according to the preamble of the independent claim.
  • microfluidics One area of microfluidics is so-called droplet-based microfluidics.
  • small drops or discrete volumes of immiscible liquid phases are generated and used within the microfluidic system.
  • Two liquid phases are used for the microfluidic production of the drops, which are referred to as the so-called continuous phase (medium in which drops are generated) and the dispersed phase (medium of the drops).
  • Oils such as mineral oil or fluorinated oil, are usually used as the continuous phase.
  • Aqueous solutions, such as hydrogels, are used as the dispersed phase.
  • cells can be taken up into the droplets and cultivated in them.
  • challenges in cultivation include ensuring that the cells are adequately supplied with nutrients and oxygen and that a suitable pH value is maintained.
  • the continuous and dispersed phases must be biocompatible and their influences on the cells and cultivation processes must be taken into account.
  • US 2019/0105279 A1 describes a device for producing hydrogel microparticles with cells contained therein, wherein a A hydrophilic polymer precursor solution with cells in it and a hydrophobic liquid, such as an oil, are brought together at one point through two separate lines so that hydrogel microparticles are formed. Polymerization of the hydrogel microparticles only occurs after they have formed.
  • So-called lab-on-a-chip systems, or LoC systems for short, are microfluidic systems that accommodate the functionalities of a macroscopic laboratory on a plastic substrate for automated processing. Such systems make it possible to process biochemical processes largely or completely automatically.
  • Lab-on-a-chip systems typically comprise two main components.
  • the first is a test carrier, for example in the form of a cartridge, which comprises structures and mechanisms for manipulating a sample, in particular passive components such as channels, reaction chambers or upstream reagents or active components such as valves, pumps or mixers.
  • the second main component is a control unit for controlling the microfluidic processes in the cartridge.
  • a microfluidic method for producing hydrogel microparticles for culturing cells with the characterizing features of the independent patent claim is provided.
  • tumor organoids are used to research tumor diseases, as they represent the conditions in vivo well.
  • One way to produce tumor organoids is to remove individual cells or tissue fragments from the primary tumor of a cancer patient and then cultivate them.
  • a microfluidic method for producing hydrogel microparticles for culturing cells wherein a dispersion medium, also referred to as a continuous phase, flows through a second channel, and wherein a hydrogel comprising dispersing medium, also referred to as dispersed phase, flows through a first channel.
  • the dispersion medium and the medium to be dispersed meet at a junction of the first and second channels, resulting in the pinching off of drop-shaped or spherical hydrogel microparticles of the phase to be dispersed, which are then carried further through a third channel.
  • a hydrophilic culture medium is used as the dispersion medium and a hydrophilic hydrogel cell suspension is used as the medium to be dispersed, whereby a polymerization process of the hydrophilic hydrogel cell suspension is initiated before it meets the hydrophilic culture medium.
  • a hydrophilic culture medium can be used as a dispersion medium or continuous phase.
  • the same culture medium is used that is also used in the established cultivation processes of cells and/or organoids carried out in the laboratory.
  • a particularly advantageous feature here is that an optimal culture medium for cell and/or organoid cultivation can be used.
  • a hydrophobic medium such as an oil is not an ideal liquid in several respects, as it leads to cytotoxicity and denaturation of proteins and, on the other hand, does not serve to supply the cells with nutrients and oxygen like a cultivation medium.
  • hydrophilic culture medium as a dispersion medium is that it ensures and improves the necessary supply of nutrients and oxygen to the cells, as well as the setting of a suitable pH value.
  • Another particularly advantageous feature is that it prevents cytotoxic effects on the cells being cultured.
  • the culture medium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) is used as a continuous phase.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • This is a standardized nutrient medium for cell culture that has been established for the cultivation of cells and/or organoids from various tissues or cells.
  • the cells to be cultivated are suspended in hydrogel or a hydrogel/buffer solution, whereby a suitable cell concentration can be set. This enables the desired number of cells to be set within the generated hydrogel microparticles.
  • the size of the hydrogel microparticles is in the micrometer range and is mainly determined by the flow rates of the continuous and dispersed phases, the interfacial tension between the two phases and the geometry of the microfluidic channels. It is chosen, for example, so that one or more cells can be cultivated into organoids.
  • the diameters of tumor organoids for example, are between 100 - 700 pm.
  • the polymerization process of the hydrophilic hydrogel cell suspension is thermally induced.
  • the thermal properties of the hydrogel are used to advantage here.
  • the viscosity and elastic modulus of some hydrogels such as Matrigel® (Corning), agarose or gelatin, are known to depend on temperature. These two rheological properties and the polymerization process can therefore be controlled specifically by the size and duration of the temperature exposure.
  • the thermal induction of the polymerization process of the hydrophilic hydrogel cell suspension takes place before it is introduced into the first channel by tempering the hydrophilic hydrogel cell suspension.
  • the hydrophilic hydrogel cell suspension is tempered to a temperature of 6 - 10°C. If a different hydrogel or mixtures of different hydrogels are used, the temperature is set to a specific temperature that initiates the polymerization of the respective hydrogel or mixture.
  • thermo polymerization process of the hydrophilic hydrogel cell suspension is supported during flow through the first channel by tempering the first channel.
  • the first channel is heated to a temperature of 6 - 10°C, for example.
  • At least the first channel of the microfluidic device has a temperature control, for example by means of Peltier elements attached thereto.
  • the thermal polymerization process of the hydrophilic hydrogel-cell suspension is initiated while flowing through the first channel.
  • the hydrogel-cell suspension is then introduced into the first channel of the microfluidic device in a liquid state in which the polymerization process has not yet begun.
  • Matrigel® (Corning) is used as the hydrogel, the Matrigel cell suspension is tempered to 4°C when it is fed into the first channel.
  • the first channel is tempered to initiate the thermal polymerization process of the hydrogel cell suspension.
  • the first channel is tempered to a temperature of 6 - 10°C, for example.
  • At least the first channel of the microfluidic device has a temperature control, for example by means of Peltier elements attached to it.
  • a temperature control for example by means of Peltier elements attached to it.
  • the temperature control of a Matrigel cell suspension and/or the first channel to 6-10°C is advantageous, as this initiates and supports the polymerization process of Matrigel® in a known or experimentally investigated manner. Furthermore, the viscosity values and elastic modulus values for Matrigel® are known for this temperature range and data on the polymerization time are available.
  • the hydrophilic culture medium is introduced into the second channel at a pre-tempered temperature.
  • the hydrophilic culture medium is pre-tempered to 37°C, for example, if the dispersing phase comprises Matrigel®.
  • the second channel is tempered to a temperature of 37°C, for example using Peltier elements.
  • the advantage here is that the formation of the spherical hydrogel microparticles is supported when the continuous phase and the phase to be dispersed meet, as well as the complete curing of the hydrogel microparticles during flow through the third channel of the microfluidic device.
  • the polymerization process of the hydrophilic hydrogel cell suspension is induced by means of light.
  • a photoactive hydrogel for example polyethylene glycol (PEG), is used.
  • PEG polyethylene glycol
  • at least the first channel is optically transparent for the respective light wavelengths.
  • the advantage here is that the location or area in which the polymerization process takes place is spatially precisely defined and only takes place where the incident light hits the hydrogel cell suspension.
  • the polymerization process of the hydrophilic hydrogel cell suspension is induced by addition of a reagent.
  • the reagent is added to the hydrophilic hydrogel cell suspension before or during flow through the first channel. If the addition takes place within the microfluidic device during flow through the first channel, this can be done through a microfluidic mixer or another supplying microfluidic channel.
  • the advantage here is that precisely defined amounts of substance and volume ratios can be set, which allow the polymerization process to proceed in the desired manner.
  • several reagents can be mixed or added one after the other. In comparison to thermal induction of the polymerization process, there is no need to temper adjacent areas and temperature-dependent undesirable influences on the cells and cell cultivation.
  • the hydrophilic hydrogel cell suspension has a modulus of elasticity of 0.1 - 20 Pa and a viscosity of 0.1 - 50 Pa-s when it comes into contact with the culture medium.
  • the complete polymerization of the hydrogel microparticles takes place during the flow through the third channel by tempering the third channel, in particular to 37°C, and/or by light and/or by a reagent.
  • a temperature of 37°C in the third channel is advantageous for cell cultivation. This is the standard cultivation temperature for 2D and 3D cell cultivation, especially in incubators, for example in the laboratory.
  • Matrigel® and other thermally inducible hydrogels polymerize quickly and completely at 37°C.
  • at least the third channel of the microfluidic device has a temperature control, for example by means of Peltier elements attached to it.
  • the third channel is irradiated with light, for example, to ensure complete polymerization, so that the polymerization process progresses and does not slow down or come to a standstill.
  • the third channel is designed to be optically transparent for the respective light wavelengths.
  • a reagent is added to the third channel for complete polymerization.
  • the addition is carried out, for example, via a microfluidic mixer or another supplying microfluidic channel.
  • a microfluidic mixer or another supplying microfluidic channel.
  • the hydrophilic hydrogel cell suspension comprises Matrigel® (Corning), agarose, gelatin, and/or PEG and/or alginate.
  • the preferred hydrogel is Matrigel®, which is used as standard for the cultivation of organoids and in which polymerization or hardening is induced thermally. At low temperatures of 4°C, Matrigel® is liquid and no polymerization takes place. The polymerization process begins at temperatures greater than or equal to 6°C and in laboratory applications usually takes place at room temperature or in a laboratory incubator at 37°C. Matrigel® is therefore tried and tested and easy to handle.
  • agarose or gelatin is used as a hydrogel, the polymerization of which is induced thermally.
  • the advantage of using agarose is that it is not of animal origin, is inexpensive compared to other hydrogels and is easily available.
  • PEG polymerization induced by light.
  • the advantage of using PEG is that it can be produced synthetically and its flexibly adjustable mechanical properties.
  • alginate is used as a hydrogel, which hardens, for example, by the addition of calcium chloride.
  • a pumping unit for example a syringe, membrane or peristaltic pump, which is connected to the second microfluidic channel.
  • a pump unit such as a syringe, membrane or peristaltic pump (not shown), which is connected to the first microfluidic channel, is used to supply and move the hydrogel cell suspension forward. This allows the adjustment and variation of the flow rate.
  • optical monitoring of the production of the spherical or droplet-shaped hydrogel microparticles and the number of cells contained therein can be additionally implemented.
  • optical accessibility of the microfluidic device must be achieved by using a transparent material at least partially for its production. Relevant areas of the microfluidic device can be observed using a camera or microscope unit mounted above it.
  • a microfluidic cultivation of the cells within the generated, fully cured hydrogel microparticles, in particular to form organoids can take place.
  • the hydrogel microparticles with the cells contained therein are transported further, for example, into a microfluidic device as described in the patent application with the file number 102022214275.6, which was filed on December 22, 2022, and used, for example, to cultivate cells using the method described there.
  • the method according to the invention can also be carried out in a cartridge, in particular a microfluidic cartridge, as described for example in DE102016222072A1 or DE102016222075A1.
  • Fig. 1 the schematic representation of a cross section through a microfluidic device in which the method according to the invention for producing hydrogel microparticles for culturing cells takes place
  • Fig. 2 the schematic representation of a flow diagram of a
  • Figure 1 shows a microfluidic device 10 with a first channel 23 and a second channel 24, which converge towards one another and meet at a connection point 25 and then continue in a third channel 1 arranged orthogonally to the first channel 23 and second channel 24.
  • Figure 1 shows an embodiment of the microfluidic method, wherein Matrigel® (Corning) is used as the hydrogel of the hydrogel cell suspension 33, the polymerization process of which is thermally induced.
  • Matrigel® Corening
  • the hydrophilic culture medium 44 DMEM for example, is introduced into the microfluidic device 10 as a dispersion medium 44 via the second channel 24 and conveyed in a second direction 15b.
  • the hydrophilic culture medium 44 is preheated to a temperature of 37°C, for example, and/or the second channel 24 is heated to 37°C.
  • the hydrophilic Matrigel cell suspension 33 is introduced into the microfluidic device 10 as a medium 33 to be dispersed via the first channel 23 and conveyed in a first direction 15a.
  • the hydrophilic Matrigel cell suspension 33 has suspended cells 9 with a set cell concentration and is introduced into the first channel 23 in the liquid state at 4°C.
  • the first channel 23 is heated to a temperature of 6-10 °C so that the polymerization process of the Matrigel® is specifically thermally initiated.
  • the Matrigel® has a desired elastic modulus and a desired viscosity, which differ significantly from the aqueous culture medium 44.
  • These two rheological properties and the polymerization process are specifically controlled by the size and duration of the temperature effect. Since the Matrigel cell suspension 33 thus comes into contact with the connection point 25 of the first 23 and second channel 24 has already hardened slightly, a pinch-off of an already slightly polymerized Matrigel microparticle 3a occurs and ultimately it is torn off and transported further. In this way, slightly polymerized droplet- or spherical Matrigel microparticles 3a are dispersed in the culture medium 44 and transported further via the third channel 1 in a third direction 15c.
  • Further polymerization to form fully polymerized hydrogel microparticles 3b occurs while the fluid flows through the third channel 1 by tempering the third channel 1, for example to a temperature of 37°C.
  • a pump unit (not shown) is used to supply and advance the hydrophilic culture medium 44 and the Matrigel cell suspension 33 in the microfluidic device 10, which is connected to the first 23 or second microfluidic channel 24.
  • the cells 9 in the particularly fully cured Matrigel microparticles 3b are subsequently cultured, for example within the Matrigel microparticles 3b, in particular to form organoids.
  • FIG. 2 shows a flow diagram of an embodiment of the microfluidic method.
  • the hydrophilic hydrogel cell suspension 33 is introduced as a medium to be dispersed into the first channel 23 of the microfluidic device 10 and conveyed further.
  • the polymerization process of the hydrogel is specifically initiated.
  • a hydrophilic culture medium 44 is introduced as a dispersion medium into the microfluidic device 10 via the second channel 24.
  • the partially polymerized hydrophilic hydrogel cell suspension 33 and the hydrophilic culture medium 44 meet at the connection point 25 of the first 23 and second channel 24, whereby in step 108 hydrogel microparticles 3a are pinched off. These are transported further via the third channel 1 in a step 109 and completely polymerized.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Es wird ein mikrofluidisches Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln (3a, 3b) zur Kultivierung von Zellen (9) beschrieben, wobei ein Dispersionsmedium (44) durch einen zweiten Kanal (24) strömt, und wobei ein ein Hydrogel umfassendes zu dispergierendes Medium (33) durch einen ersten Kanal (23) strömt und wobei das Dispersionsmedium (44) und das zu dispergierende Medium (33) an einer Verbindungsstelle (25) des ersten (23) und des zweiten Kanals (24) zusammentreffen, wobei es zur Abschnürung von kugelförmigen Hydrogel-Mikropartikeln (3a, 3b) der zu dispergierenden Phase (33) kommt, die über einen dritten Kanal (1) weitergeführt werden, wobei als Dispersionsmedium ein hydrophiles Kulturmedium (44) verwendet wird und als zu dispergierendes Medium eine hydrophile Hydrogel-Zell-Suspension (33) verwendet wird, und wobei ein Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension (33) vor dem Zusammentreffen mit dem hydrophilen Kulturmedium (44) in Gang gesetzt wird.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mikrofluidisches Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln zur Kultivierung von Zellen nach dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs.
Stand der Technik
Ein Teilbereich der Mikrofluidik ist die sogenannte tropfenbasierte Mikrofluidik. Hierbei werden kleine Tropfen bzw. diskrete Volumina aus nicht mischbaren flüssigen Phasen innerhalb des mikrofluidischen System generiert und verwendet. Für die mikrofluidische Herstellung der Tropfen werden zwei flüssige Phasen eingesetzt, die als sog. kontinuierliche Phase (Medium, in dem Tropfen erzeugt werden) und dispergierte Phase (Medium der Tropfen) bezeichnet werden. Üblicherweise kommen Öle, beispielsweise Mineralöl oder fluoriertes Öl, als kontinuierliche Phase zum Einsatz. Als dispergierte Phase werden wässrige Lösungen, beispielsweise Hydrogele, verwendet.
Zur Zellkultivierung können Zellen jeweils in die Tropfen aufgenommen werden und in diesen kultiviert werden. Herausforderungen bei der Kultivierung bestehen dabei jedoch in der ausreichenden Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff sowie der Gewährleistung eines geeigneten pH-Werts. Des Weiteren müssen die kontinuierliche und dispergierte Phase biokompatibel sein und deren Einflüsse auf die Zellen und Kultivierungsvorgänge berücksichtigt werden.
In der US 2019/0105279 A1 ist eine Vorrichtung zur Herstellung von Hydrogelmikropartikeln mit darin enthaltenen Zellen beschrieben, wobei eine hydrophile Polymer Prekursor-Lösung mit sich in dieser befindlichen Zellen und eine hydrophobe Flüssigkeit, beispielsweise ein Öl, durch zwei separate Leitungen an einem Punkt zusammengeführt werden, sodass sich Hydrogelmikropartikel ausbilden. Eine Polymerisation der Hydrogelmikropartikel erfolgt erst nachdem sich diese ausgebildet haben.
Sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, kurz LoC-Systeme, sind mikrofluidische Systeme, welche Funktionalitäten eines makroskopischen Labors auf einem Kunststoffsubstrat für eine automatisierte Prozessierung unterbringen. Solche Systeme ermöglichen es, biochemische Prozesse weitestgehend oder vollständig automatisiert zu prozessieren.
Lab-on-a-Chip-Systeme umfassen typischerweise zwei Hauptkomponenten. Die erste ist ein Testträger, beispielsweise in Form einer Kartusche, welcher Strukturen und Mechanismen für die Manipulation einer aufgenommenen Probe umfasst, insbesondere passive Komponenten wie Kanäle, Reaktionskammern oder vorgelagerte Reagenzien oder auch aktive Komponenten wie Ventile, Pumpen oder Mischer. Die zweite Hauptkomponente ist eine Steuereinheit zur Steuerung der mikrofluidischen Abläufe in der Kartusche.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein mikrofluidisches Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln zur Kultivierung von Zellen mit den kennzeichnenden Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs bereitgestellt.
Zur Erforschung von Tumorerkrankungen kommen zum Beispiel sogenannte Tumor-Organoide zum Einsatz, welche die Gegebenheiten in vivo gut repräsentieren. Eine Möglichkeit zur Herstellung von Tumor-Organoiden ist die Entnahme einzelner Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärtumor eines Krebspatienten und deren anschließende Kultivierung.
Erfindungsgemäß wird ein mikrofluidisches Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln zur Kultivierung von Zellen zur Verfügung gestellt, wobei ein Dispersionsmedium, auch als kontinuierliche Phase bezeichnet, durch einen zweiten Kanal strömt, und wobei ein ein Hydrogel umfassendes zu dispergierendes Medium, auch als dispergierte Phase bezeichnet, durch einen ersten Kanal strömt. An einer Verbindungsstelle des ersten und des zweiten Kanals treffen das Dispersionsmedium und das zu dispergierende Medium zusammen, wobei es zur Abschnürung von tropfen- bzw. kugelförmigen Hydrogel-Mikropartikeln der zu dispergierenden Phase kommt, die über einen dritten Kanal weitergeführt werden. Hierbei wird als Dispersionsmedium ein hydrophiles Kulturmedium verwendet und als zu dispergierendes Medium wird eine hydrophile Hydrogel-Zell-Suspension verwendet, wobei ein Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension vor dem Zusammentreffen mit dem hydrophilen Kulturmedium in Gang gesetzt wird.
Dass sich in dem erfindungsgemäßen Verfahren trotz hydrophilem Kulturmedium anstelle einer hydrophoben Flüssigkeit beim mikrofluidischen Zusammenführen des hydrophilen Kulturmediums und der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension dennoch Tropfen ausbilden, wird der Polymerisationsprozess des Hydrogels vor dem Zusammentreffen mit dem Kulturmedium in Gang gesetzt, so dass ein signifikanter Unterschied der rheologischen Eigenschaften, insbesondere des Elastizitätsmoduls und der Viskosität der beiden Phasen, besteht. Die bereits leicht polymerisierte Hydrogel-Zell-Suspension trifft dann auf das wässrige Kulturmedium und die Abschnürung eines Tropfens der Hydrogel-Zell- Suspension wird ermöglicht.
Anstelle eines hydrophoben Mediums, wie beispielsweise eines Öls, kann so ein hydrophiles Kulturmedium als Dispersionsmedium bzw. kontinuierliche Phase verwendet werden. Es wird beispielsweise dasselbe Kulturmedium verwendet, welches auch bei den etablierten, im Labor durchgeführten Kultivierungsprozessen von Zellen und/oder Organoiden zum Einsatz kommt. Besonders vorteilhaft hierbei ist, dass somit ein für eine Zell- und/oder Organoidkultivierung optimales Kulturmediums verwendet kann. Ein hydrophobes Medium wie beispielsweise ein Öl, ist nämlich in mehrfacher Hinsicht keine ideale Flüssigkeit, da dieses zum einen zu Zytotoxizität und Denaturierung von Proteinen führt und zum anderen nicht wie ein Kultivierungsmedium zur Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff dient. Vorteilhaft bei der Verwendung eines hydrophilen Kulturmediums als Dispersionsmedium ist daher, dass dieses die erforderliche Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff, sowie die Einstellung eines geeigneten pH-Werts gewährleistet und verbessert. Zudem besonders vorteilhaft ist, dass eine Verhinderung zytotoxischer Effekte auf die zu kultivierenden Zellen erzielt wird.
Desweiteren ergibt sich eine verbesserte Übertragbarkeit und Vergleichbarkeit zwischen einer manuell im Labor durchgeführten Zell- und/oder Organoid- Kultivierung und der mikrofluidischen Implementierung der Verwendung eines für die Zell- und/oder Organoidkultivierung optimalen Kulturmediums.
Als kontinuierliche Phase wird beispielsweise das Kulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) verwendet. Es handelt sich dabei um ein standardisiertes Nährmedium für die Zellkultur, das für eine Kultivierung von Zellen und/oder Organoiden aus verschiedenen Geweben bzw. Zellen etabliert ist.
Die zu kultivierenden Zellen werden in Hydrogel bzw. einer Hydrogel/Puffer- Lösung suspendiert, wobei eine geeignete Zellkonzentration einstellbar ist. Dies ermöglicht insbesondere die Einstellung einer gewünschten Anzahl von Zellen innerhalb der generierten Hydrogel-Mikropartikeln. Die Größe der Hydrogel- Mikropartikel liegt im Mikrometerbereich und wird hauptsächlich von den Flussraten der kontinuierlichen und dispergierten Phase, der Grenzflächenspannung zwischen den beiden Phasen und der Geometrie der mikrofluidischen Kanäle bestimmt. Sie wird beispielsweise so gewählt, dass eine bzw. mehrere Zellen darin zu Organoiden kultivierbar sind. Die Durchmesser von Tumor-Organoiden liegen beispielsweise zwischen 100 - 700 pm.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen. In einer ersten vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell- Suspension thermisch induziert.
Vorteilhaft hierbei werden thermische Eigenschaften des Hydrogels ausgenutzt. Die Viskosität und der Elastizitätsmodul einiger Hydrogele, wie beispielsweise Matrigel® (Corning), Agarose oder Gelatine, sind in bekannter Weise abhängig von der Temperatur. Diese beiden rheologischen Eigenschaften und der Polymerisationsprozess können somit gezielt über die Größe und Dauer einer Temperatureinwirkung gesteuert werden.
Hierbei ist es vorteilhaft, wenn die thermische Induzierung des Polymerisationsprozesses der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension vor deren Eingabe in den ersten Kanal erfolgt durch Temperieren der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension. Wird als Hydrogel beispielsweise Matrigel® verwendet, so wird die hydrophile Hydrogel-Zell-Suspension beispielsweise auf eine Temperatur von 6 - 10°C temperiert. Kommt ein anderes Hydrogel oder Mischungen aus verschiedenen Hydrogelen zum Einsatz, so wird die Temperatur auf eine spezifische, die Polymerisation des jeweiligen Hydrogels bzw. der Mischung in Gang setzende Temperatur eingestellt.
Zudem ist es vorteilhaft, wenn der thermische Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension während des Durchströmens des ersten Kanals unterstützt wird, indem der erste Kanal temperiert wird.
Wird Matrigel® als Hydrogel verwendet, so wird der erste Kanal beispielsweise auf eine Temperatur von 6 - 10°C temperiert.
Hierzu weist zumindest der erste Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung eine Temperierung auf, beispielsweise mittels daran angebrachter Peltier-Elemente.
Alternativ ist es vorteilhaft, wenn der thermische Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension während des Durchströmens des ersten Kanals initiiert wird. Die Hydrogel-Zell-Suspension wird dann in einem flüssigen Zustand, in welchem der Polymerisationsprozess noch nicht begonnen hat, in den ersten Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung eingebracht. Wird Matrigel® (Corning) als Hydrogel verwendet, so ist die Matrigel-Zell-Suspension bei der Eingabe in den ersten Kanal beispielsweise auf 4°C temperiert. Der erste Kanal wird temperiert, um den thermischen Polymerisationsprozess der Hydrogel-Zell- Suspension zu initiieren. Wird als Hydrogel Matrigel® verwendet, so wird der erste Kanal beispielswiese auf eine Temperatur von 6 - 10°C temperiert.
Hierzu weist zumindest der erste Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung eine Temperierung auf, beispielsweise mittels daran angebrachter Peltier-Elemente. Auf diese Weise wird der Polymerisationsprozess des Hydrogels gezielt thermisch in Gang gesetzt.
Die Temperierung einer Matrigel-Zell-Suspension und/oder des ersten Kanals auf 6-10°C ist vorteilhaft, da dann in bekannter bzw. experimentell untersuchter Weise der Polymerisationsprozess von Matrigel® in Gang gesetzt und unterstützt wird. Desweiteren sind die Viskositätswerte und Elastizitätsmodul-Werte bei Matrigel® für diesen Temperaturbereich bekannt und es liegen Daten zu der Polymerisationsdauer vor.
Desweiteren ist es vorteilhaft, wenn das hydrophile Kulturmedium vortemperiert in den zweiten Kanal eingebracht wird. Hierzu wird das hydrophile Kulturmedium, im Fall, dass die dispergierende Phase Matrigel® umfasst, beispielsweise auf 37°C vortemperiert. Alternativ oder zusätzlich wird der zweite Kanal beispielsweise auf eine Temperatur von 37°C temperiert, beispielsweise mittel Peltier-Elementen.
Vorteilhaft hierbei ist, dass so die Ausbildung der kugelförmigen Hydrogel- Mikropartikel beim Zusammentreffen der kontinuierlichen und zu dispergierenden Phase, sowie die vollständige Aushärtung der Hydrogel-Mikropartikel während des Durchströmens des dritten Kanals der mikrofluidischen Vorrichtung unterstützt wird.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird der Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension mittels Licht induziert. Hierbei wird ein photoaktives Hydrogel, beispielsweise Polyethylenglycol (PEG) eingesetzt. In dieser Ausführungsform ist zumindest der erste Kanal optisch transparent für die jeweiligen Lichtwellenlängen ausgebildet.
Vorteilhaft hierbei ist, dass der Ort bzw. Bereich, in dem der Polymerisationsprozess stattfindet räumlich genau definiert ist und nur dort stattfindet, wo das eingestrahlte Licht auf die Hydrogel-Zell-Suspension trifft.
Im Vergleich hierzu werden bei einer thermischen Induktion auch angrenzende Bereiche temperiert und so der Polymerisationsprozess evtl, beeinflusst. Desweiteren vorteilhaft ist, dass keine Temperaturveränderungen auf die Zellen bzw. die Zellkultivierung Einfluss nehmen, wodurch evtl, unerwünschte bzw. Undefinierte Einflüsse verhindert werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird der Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension durch Zugabe eines Reagenz induziert.
Das Reagenz wird der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension hierbei vor oder während des Durchströmens des ersten Kanals zugegeben. Erfolgt die Zugabe innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung während des Durchströmens des ersten Kanals, so kann dies durch einen mikrofluidischen Mischer oder einen weiteren zuführenden mikrofluidischen Kanal erfolgen.
Vorteilhaft hierbei ist, dass genau definierte Stoffmengen- und Volumenverhältnisse eingestellt werden können, die in gewünschter Weise den Polymerisationsprozess ablaufen lassen. Außerdem können auch mehrere Reagenzien gemischt oder einzeln hintereinander zugeführt werden. Im Vergleich zur thermischen Induktion des Polymerisationsprozesses entfallen auch hier eine Temperierung von angrenzenden Bereichen und temperaturabhängige unerwünschte Einflüsse auf die Zellen und die Zellkultivierung.
Selbstverständlich können die genannten Möglichkeiten zur Initiierung der Polymerisierung der Hydrogel-Zell-Suspension in geeigneter Weise miteinander kombiniert werden. Dies ist insbesondere vorteilhaft, bei der Verwendung von Mischungen mehrerer Hydrogele oder bei Verwendung eines Hydrogels, das mehr als eine Möglichkeit der Vernetzungsaktivierung aufweist.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist die hydrophile Hydrogel-Zell-Suspension beim Zusammentreffen mit dem Kulturmedium ein Elastizitätsmodul von 0,1 - 20 Pa und eine Viskosität von 0,1 - 50 Pa-s auf.
In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausführungsform erfolgt die vollständige Polymerisierung der Hydrogel-Mikropartikel während des Durchströmens des dritten Kanals durch Temperieren des dritten Kanals, insbesondere auf 37°C, und/oder durch Licht und/oder durch ein Reagenz.
Eine Temperierung des dritten Kanals auf eine Temperatur von 37°C ist vorteilhaft in Hinblick auf die Kultivierung der Zellen. Für die 2D- und 3D- Zellkultivierung, insbesondere in Inkubatoren beispielsweise im Labor, ist dies die Standard-Kultivierungstemperatur.
Außerdem polymerisieren Matrigel® und andere thermisch induzierbare Hydrogele bei 37°C schnell und vollständig aus. Hierzu weist zumindest der dritte Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung eine Temperierung auf, beispielsweise mittels daran angebrachter Peltier-Elemente.
Bei Hydrogelen, deren Polymerisationsprozess mittels Licht induziert wird, wird der dritte Kanal zur vollständigen Polymerisierung beispielsweise mittels Licht bestrahlt, sodass der Polymerisationsprozess voranschreitet und sich nicht verlangsamt oder zum Stillstand kommt. Hierzu ist der dritte Kanal optisch transparent für die jeweiligen Lichtwellenlängen ausgebildet.
Bei Hydrogelen, deren Polymerisationsprozess Reagenz-induziert abläuft, wird beispielsweise zur vollständigen Polymerisierung ein Reagenz in den dritten Kanal zugegeben. Die Zugabe erfolgt beispielweise durch einen mikrofluidischen Mischer oder einen weiteren zuführenden mikrofluidischen Kanal. Selbstverständlich können die genannten Möglichkeiten zur vollständigen Polymerisierung in geeigneter Weise miteinander kombiniert werden.
Zudem wird weiter vorteilhaft vorgeschlagen, dass die hydrophile Hydrogel-Zell- Suspension Matrigel® (Corning), Agarose, Gelatine, und/oder PEG und/oder Alginat umfasst.
Als Hydrogel wird bevorzugt Matrigel® verwendet, welches standardmäßig für die Kultivierung von Organoiden verwendet wird und bei dem die Polymerisation bzw. Aushärtung thermisch induziert wird. Bei niedrigen Temperaturen von 4°C ist Matrigel® flüssig und keine Polymerisation findet statt. Der Polymerisationsprozess setzt bei Temperaturen größer oder gleich 6°C ein und erfolgt in der Laboranwendung üblicherweise bei Raumtemperatur oder in einem Labor-Inkubator bei 37°C. Matrigel® ist somit erprobt und einfach in der Handhabung.
Alternativ oder zusätzlich wird als Hydrogel beispielsweise Agarose oder Gelatine verwendet, deren Polymerisation thermisch induziert wird. Vorteilhaft bei der Verwendung von Agarose ist, dass diese nicht tierischen Ursprungs ist, kostengünstig im Vergleich zu anderen Hydrogelen sowie einfach verfügbar.
Weiterhin alternativ wird als Hydrogel beispielsweise PEG verwendet, dessen Polymerisation mittels Licht induziert wird. Vorteilhaft bei der Verwendung von PEG ist dessen synthetische Hersteilbarkeit sowie dessen flexibel einstellbare mechanische Eigenschaften.
Weiterhin alternativ oder zusätzlich wird als Hydrogel beispielsweise Alginat verwendet, welches beispielsweise durch die Zugabe von Calciumchlorid aushärtet.
Für das Zuführen und Vorwärtsbewegen des hydrophilen Kulturmediums in der mikrofluidischen Vorrichtung wird eine Pumpeinheit verwendet, beispielsweise eine Spritzen-, Membran- oder Peristaltikpumpe, die mit dem zweiten mikrofluidischen Kanal verbunden ist. Dies ermöglicht insbesondere die Einstellung und Variation der Flussrate des hydrophilen Kulturmediums. Ebenso wird für das Zuführen und Vorwärtsbewegen der Hydrogel-Zell- Suspension eine Pumpeinheit, beispielsweise eine nicht dargestellte Spritzen-, Membran- oder Peristaltikpumpe verwendet, die mit dem ersten mikrofluidischen Kanal verbunden ist Dies ermöglicht die Einstellung und Variation der Flussrate.
Optional kann eine optische Überwachung der Erzeugung der kugel- bzw. tropfenförmigen Hydrogel-Mikropartikel sowie der darin enthaltenen Zellanzahl ergänzend implementiert werden. Hierfür ist eine optische Zugänglichkeit der mikrofluidischen Vorrichtung zu realisieren, indem für deren Herstellung zumindest teilweise ein transparentes Material verwendet wird. Durch eine darüber angebrachte Kamera bzw. Mikroskopeinheit können relevante Bereiche der mikrofluidischen Vorrichtung beobachtet werden.
In einem weiteren Schritt kann eine mikrofluidische Kultivierung der Zellen innerhalb der generierten, vollständig ausgehärteten Hydrogel-Mikropartikel, insbesondere zu Organoiden, erfolgen. Hierfür werden die Hydrogel-Mikropartikel mit darin enthaltenen Zellen beispielsweise in eine mikrofluidische Vorrichtung wie in der Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 102022214275.6, welche am 22.12.2022 eingereicht wurde, beschrieben, weitertransportiert und beispielsweise mittels des dort beschriebenen Verfahrens zur Kultivierung von Zellen eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner in einer Kartusche, insbesondere einer mikrofluidischen Kartusche, wie beispielsweise in DE102016222072A1 oder DE102016222075A1 beschrieben, ablaufen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 : die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine mikrofluidische Vorrichtung in welcher das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln zur Kultivierung von Zellen abläuft, und Fig. 2: die schematische Darstellung eines Flussdiagramms eines
Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsformen der Erfindung
In Figur 1 ist eine mikrofluidische Vorrichtung 10 dargestellt mit einem ersten Kanal 23 und einem zweiten Kanal 24, welche aufeinander zulaufen und an einer Verbindungsstelle 25 Zusammentreffen und dann in einem zum ersten 23 und zweiten Kanal 24 orthogonal angeordneten dritten Kanal 1 weitergeführt werden.
In der mikrofluidische Vorrichtung 10 läuft beispielsweise das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln 3a, 3b zur Kultivierung von Zellen 9 ab. In Figur 1 ist ein Ausführungsbeispiel des mikrofluidische Verfahren gezeigt, wobei als Hydrogel der Hydrogel-Zell-Suspension 33 Matrigel® (Corning) verwendet wird, dessen Polymerisationsprozess thermisch induziert wird.
Über den zweiten Kanal 24 wird als Dispersionsmedium 44 beispielsweise das hydrophile Kulturmedium 44 DMEM in die mikrofluidische Vorrichtung 10 eingebracht und in eine zweite Richtung 15b gefördert. Hierbei ist das hydrophile Kulturmedium 44 beispielsweise auf eine Temperatur von 37°C vortemperiert und/oder der zweite Kanal 24 wird auf 37°C temperiert. Über den ersten Kanal 23 wird als zu dispergierendes Medium 33 die hydrophile Matrigel-Zell-Suspension 33 in die mikrofluidische Vorrichtung 10 eingebracht und in eine erste Richtung 15a gefördert. Die hydrophile Matrigel-Zell-Suspension 33 weist suspendierte Zellen 9 mit einer eingestellten Zellkonzentration auf und wird bei 4°C im flüssigen Zustand in den ersten Kanal 23 eingebracht. Der erste Kanal 23 wird auf eine Temperatur von 6-10 °C temperiert, sodass der Polymerisationsprozess des Matrigels® gezielt thermisch in Gang gesetzt wird. So liegen beim Zusammentreffen mit dem zugeführten Kulturmedium 44 ein gewünschter Elastizitätsmodul und eine gewünschte Viskosität des Matrigels® vor, welche sich vom wässrigen Kulturmedium 44 signifikant unterscheiden. Diese beiden rheologischen Eigenschaften und der Polymerisationsprozess werden gezielt über die Größe und Dauer der Temperatureinwirkung gesteuert. Da die Matrigel- Zell-Suspension 33 somit beim Zusammentreffen an der Verbindungsstelle 25 des ersten 23 und zweiten Kanals 24 bereits leicht ausgehärtet ist, kommt es zu einer Abschnürung eines bereits leicht polymerisierten Matrigel-Mikropartikels 3a und letztlich zum Abreißen und Weitertransport desselben. Auf diese Weise werden leicht polymerisierte tropfen- bzw. kugelförmige Matrigel-Mikropartikel 3a in dem Kulturmedium 44 dispergiert und über den dritten Kanal 1 in eine dritte Richtung 15c weitertransportiert.
Die weitere Polymerisierung zu vollständig polymerisierten Hydrogel- Mikropartikeln 3b erfolgt während des Durchströmens des dritten Kanals 1 durch Temperieren des dritten Kanals 1 beispielsweise auf eine Temperatur von 37°C. Für das Zuführen und Vorwärtsbewegen des hydrophilen Kulturmediums 44 sowie der Matrigel-Zell-Suspension 33 in der mikrofluidischen Vorrichtung 10 wird eine nicht dargestellte Pumpeinheit verwendet, die mit dem ersten 23 bzw. zweiten mikrofluidischen Kanal 24 verbunden ist.
Die Zellen 9 in den insbesondere vollständig ausgehärteten Matrigel- Mikropartikel 3b werden anschließend beispielsweise innerhalb der Matrigel- Mikropartikel 3b insbesondere zu Organoiden kultiviert.
In Figur 2 ist ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des mikrofluidischen Verfahrens gezeigt. In einem Schritt 105 wird die hydrophile Hydrogel-Zell- Suspension 33 als zu dispergierendes Medium in den ersten Kanal 23 der mikrofluidischen Vorrichtung 10 eingebracht und weitergefördert. In einem Schritt 106 wird der Polymerisationsprozess des Hydrogels gezielt in Gang gesetzt. In einem beispielsweise gleichzeitig mit Schritt 105 erfolgenden Schritt 107 wird über den zweiten Kanal 24 ein hydrophiles Kulturmedium 44 als Dispersionsmedium in die mikrofluidische Vorrichtung 10 eingebracht. An der Verbindungsstelle 25 des ersten 23 und zweiten Kanals 24 treffen die teilweise polymerisierte hydrophile Hydrogel-Zell-Suspension 33 und das hydrophile Kulturmedium 44 zusammen, wobei es in Schritt 108 zu einer Abschnürung von Hydrogel-Mikropartikeln 3a kommt. Diese werden in einem Schritt 109 über den dritten Kanal 1 weitertransportiert und vollständig polymerisiert.

Claims

1 . Mikrofluidisches Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln (3a, 3b) zur Kultivierung von Zellen (9), wobei ein Dispersionsmedium (44) durch einen zweiten Kanal (24) strömt, und wobei ein ein Hydrogel umfassendes zu dispergierendes Medium (33) durch einen ersten Kanal (23) strömt und wobei das Dispersionsmedium (44) und das zu dispergierende Medium (33) an einer Verbindungsstelle (25) des ersten (23) und des zweiten Kanals (24) Zusammentreffen, wobei es zur Abschnürung von kugelförmigen Hydrogel- Mikropartikeln (3a, 3b) des zu dispergierenden Mediums (33) kommt, die über einen dritten Kanal (1) weitergeführt werden, dadurch gekennzeichnet, dass als Dispersionsmedium ein hydrophiles Kulturmedium (44) verwendet wird und dass als zu dispergierendes Medium eine hydrophile Hydrogel-Zell-Suspension (33) verwendet wird, wobei ein Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension (33) vor dem Zusammentreffen mit dem hydrophilen Kulturmedium (44) in Gang gesetzt wird.
2. Mikrofluidisches Verfahren nach Anspruch 1 , wobei der Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension (33) thermisch induziert wird.
3. Mikrofluidisches Verfahren nach Anspruch 2, wobei die thermische Induzierung des Polymerisationsprozesses der hydrophilen Hydrogel-Zell- Suspension (33) vor deren Eingabe in den ersten Kanal (23) erfolgt durch Temperieren der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension (33), insbesondere auf eine Temperatur von 6 - 10°C.
4. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei der thermische Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell- Suspension (33) während des Durchströmens des ersten Kanals (23) initiiert und/oder unterstützt wird durch Temperieren des ersten Kanals (23), insbesondere auf eine Temperatur von 6 - 10°C.
5. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das hydrophile Kulturmedium (44) vortemperiert in den zweiten Kanal (24) eingebracht wird, insbesondere vortemperiert auf eine Temperatur von 37°C.
6. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension (33) mittels Licht induziert wird, und wobei zumindest der erste Kanal (23) zumindest teilweise optisch transparent ausgebildet ist.
7. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Polymerisationsprozess der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension (33) durch Zugabe einer Reagenz induziert wird, welche der hydrophilen Hydrogel-Zell-Suspension (33) vor oder während des Durchströmens des ersten Kanals (23) zugegeben wird.
8. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die vollständige Polymerisierung der Hydrogel-Mikropartikel (3a, 3b) während des Durchströmens des dritten Kanals (1) durch Temperieren des dritten Kanals (1), insbesondere auf eine Temperatur von 37°C und/oder durch Licht und/oder durch ein Reagenz erfolgt.
9. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die hydrophile Hydrogel-Zell-Suspension (33) beim Zusammentreffen mit dem hydrophilen Kulturmedium (44) ein Elastizitätsmodul von 0,1 - 20 Pa und eine Viskosität von 0,1 - 50 Pa-s aufweist.
10. Mikrofluidisches Verfahren, wobei die hydrophile Hydrogel-Zell- Suspension (33) Matrigel® (Corning), Agarose, Gelatine, Polyethylenglycol und/oder Alginat umfasst.
EP24714864.6A 2023-03-30 2024-03-21 Verfahren zur erzeugung von hydrogel-mikropartikeln Pending EP4689060A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102023202946.4A DE102023202946A1 (de) 2023-03-30 2023-03-30 Verfahren zur Erzeugung von Hydrogel-Mikropartikeln
PCT/EP2024/057560 WO2024200191A1 (de) 2023-03-30 2024-03-21 Verfahren zur erzeugung von hydrogel-mikropartikeln

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP4689060A1 true EP4689060A1 (de) 2026-02-11

Family

ID=90544609

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP24714864.6A Pending EP4689060A1 (de) 2023-03-30 2024-03-21 Verfahren zur erzeugung von hydrogel-mikropartikeln

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4689060A1 (de)
CN (1) CN120882859A (de)
DE (1) DE102023202946A1 (de)
WO (1) WO2024200191A1 (de)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10260039B2 (en) 2011-05-11 2019-04-16 Massachusetts Institute Of Technology Microgels and microtissues for use in tissue engineering
DE102016222072A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur geneigten Prozessierung von mikrofluidischen Kartuschen
DE102016222075A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Prozessiersystem und Verfahren zur Prozessierung einer mikrofluidischen Kartusche mit einer Prozessiereinheit
US11166920B2 (en) 2017-10-05 2021-11-09 Auburn University Microfluidics device for fabrication of large, uniform, injectable hydrogel microparticles for cell encapsulation
WO2020082075A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Stc, Unm Method and apparatus for acoustically assisted droplet generation
KR102425901B1 (ko) * 2019-05-02 2022-07-28 숙명여자대학교산학협력단 액적화된 하이드로겔 및 이의 제조방법
CN115820416A (zh) 2022-12-07 2023-03-21 重庆大学 用于单细胞三维培养的微流控芯片和单细胞三维培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE102023202946A1 (de) 2024-10-02
WO2024200191A1 (de) 2024-10-03
CN120882859A (zh) 2025-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1201304B1 (de) Mikrostrukturierte Plattform für die Untersuchung einer Flüssigkeit
DE202015009609U1 (de) Mikrofluidisches System zur Erzeugung von Emulsionen
DE112015007082B4 (de) Zellanalyseeinrichtung, Vorrichtung und ein diese verwendendes Zellanalyseverfahren
EP4007689B1 (de) Verfahren und steuereinheit zum 3d druck von vaskularisierten geweben und organen
DE102015106870B3 (de) System zur Inkubation von mikrofluidischen Tropfen und Verfahren zur Bereitstellung von homogenen Inkubationsbedingungen in einer Tropfeninkubationseinheit
EP3874021B1 (de) Fluidikvorrichtung, fluidiksystem und verfahren zum entwickeln dreidimensionaler zellulärer gebilde
DE102009001257A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Handhabung von Flüssigkeiten
EP4638695A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur kultivierung von zellen
EP4689060A1 (de) Verfahren zur erzeugung von hydrogel-mikropartikeln
DE102020107599B3 (de) Verfahren zur Kultivierung von Zellen
EP1750155B1 (de) Verfahren zur Herstellung einer Probenkammer
DE102011112638B4 (de) Mikrofluidischer Chip mit mikrofluidischem Kanalsystem
EP2707142A2 (de) Verfahren zur separation polarisierbarer biopartikel
DE102006025011A1 (de) Mikrotiterplatte und deren Verwendung
DE102006051535A1 (de) Automatischer Mikrofluidik-Prozessor
DE102015200643B4 (de) Verfahren zur herstellung von neuronalen zellen enthaltenden strangförmigen kapseln und strangförmige kapseln
DE102022134439A1 (de) Verfahren zur Herstellung eines faserverstärkten Hydrogelformkörpers
EP2893980A1 (de) Mikrofluidisches System sowie Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials
WO2023110314A1 (de) Vorrichtung und verfahren zum splitten dreidimensionaler agglomerate
EP3024567B1 (de) Verkapselungseinrichtung und -verfahren zur verkapselung einer probe in einer polymerkapsel
DE102022213554A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zum Splitten dreidimensionaler Agglomerate
DE102021214281A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zum Splitten dreidimensionaler Agglomerate
DE102015113887B3 (de) Mikrofluidische Flusszelle, Verfahren zur Synthese von Biomolekülen in einer mikrofluidischen Flusszelle und Verfahren zur Herstellung einer mikrofluidischen Flusszelle
DE102017011226B3 (de) Automatisiertes, integriertes mikrofluidisches System für die Hochdurchsatz-Klonierung
DE102005042884B3 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von kugel- oder schlauchförmigen künstlichen Membranen

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20251030

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC ME MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR