EP4639076A1

EP4639076A1 - Verfahren und gerät zur schichtdickenbestimmung histologischer schnittpräparate und konzentrationsbestimmung von biologischen substanzen in histologischen präparaten

Info

Publication number: EP4639076A1
Application number: EP23837262.7A
Authority: EP
Inventors: Matthias Meinhardt; Adrian Ehrenhofer
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2022-12-22
Filing date: 2023-12-20
Publication date: 2025-10-29
Also published as: WO2024133511A1; DE102022134504A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Schichtdicke eines Schnittpräparates in der medizinischen Histologie. In einem weiteren Aspekt betriff die Erfindung dabei ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz in einem in dem Schnittpräparat enthaltenen Gewebe, insbesondere für die diagnostische Bestimmung der Konzentration in medizinischen Schnittpräparaten. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung für die Messung der Schichtdicke eines Schnittpräparates und optional für die Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz in dem Schnittpräparat.

Description

VERFAHREN UND GERÄT ZUR SCHICHTDICKENBESTIMMUNG HISTOLOGISCHER SCHNITTPRÄPARATE UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON BIOLOGISCHEN SUBSTANZEN IN HISTOLOGISCHEN PRÄPARATEN

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft den Bereich der Medizin, Diagnostik, Histologie (bzw. Schnittpräparate von Zellblöcken), Färbung und Beurteilung von Gewebeschnitten und die Konzentrationsmessung von Zielsubstanzen in Gewebeschnitten. Dabei betrifft die Erfindung insbesondere den Bereich der medizinischen Histologie und die diagnostische Konzentrationsmessung von Zielsubstanzen in Gewebeschnitten.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Schichtdicke eines Schnittpräparates, umfassend (a) die Messung von Werten, die durch Streuung und/oder Absorption durch das Schnittpräparat erzeugt wurden, (b) die Bereitstellung einer Modellierung der Schichtdicke des Schnittpräparates basierend auf Kalibrierwerten, und (c) die Ermittlung der Schichtdicke des Schnittpräparates durch Verwendung der gemessenen Werte sowie der Modellierung gemäß (b). Die Erfindung betrifft dabei vorzugsweise ein Verfahren zur Bestimmung einer Schichtdicke eines Schnittpräparates, umfassend (a) die Messung von Werten, die durch Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat mit einer Lichtquelle oder mehreren Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wurden, und (b) die Bereitstellung einer Modellierung der Schichtdicke des Schnittpräparates basierend auf Kalibrierwerten, die durch eine Messung der Streuung und Absorption eines Lichtstrahls durch ein oder mehrere Kalibrierpräparate mit einer Lichtquelle oder mehrerer Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wurden, und (c) die Ermittlung der Schichtdicke des Schnittpräparates durch Verwendung der gemessenen Werte gemäß (a) sowie einer Modellierung gemäß (b).

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung für die Messung der Schichtdicke eines Schnittpräparates und optional für die Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz in dem Schnittpräparat, umfassend (a) eine Lichtquelle oder mehrere Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen, (b) mindestens ein Sensor für die Messung der Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls, (c) eine Vorrichtung für die Positionierung des Schnittpräparates während der Messung, und (d) eine Recheneinheit für die Modellierung der Schichtdicke eines Schnittpräparates oder für die Verwendung der Modellierung bei der Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates.

In einem weiteren Aspekt betriff die Erfindung einen Objektträger zur erwendung in dem Verfahren oder der Vorrichtung, umfassend ein Eichpräparat enthaltend eine Ziel-Substanz in zwei oder mehr Konzentrationen, die räumlich voneinander getrennt sind, auf dem zusätzlich das histologische Schnittpräparat aufgebracht werden kann. HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK

Die Histopathologie beinhaltet die Untersuchung von Gewebeschnitten wie beispielsweise Biopsien mittels besonderer Färbetechniken und ist ein wichtiges diagnostisches Mittel in der Medizin. Sie dient dabei beispielsweise der Beurteilung der Malignität und Frühdiagnose von Tumoren, dem Nachweis von Stoffwechselerkrankungen, parasitären bakteriellen und entzündlichen Erkrankungen und somit der Entscheidungsfindung bei der Therapieauswahl.

Seit ihrer Etablierung vor ca. 150 Jahren beinhaltet die Methode der Histopathologie, Schnittpräparate von menschlichem oder tierischem Gewebe zu gewinnen, herzustellen und die Gewebestrukturen oder Inhaltsstoffe darin anschließend durch Farbstoffe für die Untersuchung am Mikroskop sichtbar zu machen. Die Gewinnung, Herstellung und Anfärbung der Schnitte wird als Histologie bezeichnet und die erhaltenen Schnitte als histologische Präparate.

Vier Schritte, die dabei allen Verfahren der klassischen Histologie und Histopathologie gemeinsam sind, sind (i) die Vorbereitung inklusive der Fixierung und Einbettung bzw. des Einfrierens, (ii) das Schneiden, (iii) die Färbung und (iv) die mikroskopische Beurteilung der Probe.

(i) Es sind verschiedene Arten von histologischen Präparaten bekannt, die eine unterschiedliche Vorbereitung benötigen, wie beispielsweise Paraffinpräparate oder Präparate, die durch Gefrierschnitte angefertigt werden. Die Auswahl des histologischen Präparates und der damit verbundenen Vorbereitungsschritte richtet sich nach den Eigenschaften des Gewebes, den zu untersuchenden Strukturen im Gewebe, deren Beständigkeit während der Präparation und Vorbereitung sowie auch der klinischen Fragestellung und Dringlichkeit. In der Regel werden Paraffinpräparate verwendet, wobei das zu untersuchende Gewebe in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet wird.

(ii) Im nächsten Schritt wird das eingebettete oder eingefrorene Gewebe in der Regel manuell am Mikrotom geschnitten. Die Schnittdicke wird mechanisch auf eine Dicke zwischen 1 bis 9 pm eingestellt, üblich sind insbesondere 1 bis 5 pm. Der Schnitt kräuselt sich beim Schneiden stark und wird zusätzlich durch das enthaltene Gewebe beeinflusst. Anschließend wird der Schnitt auf einer Wasseroberfläche gestreckt und von dort für die weitere Prozessierung und Untersuchung auf einen Objektträger übertragen. Die Präzision dieser Geräte ist dabei sehr unterschiedlich und unterliegt auch durch die manuelle Bedienung starken Schwankungen. Die Schwankungen der tatsächlichen Schichtdicke des geschnittenen des histologischen Präparates können hierbei mehr als 200% betragen. Zusätzlich unterschiedet sich die eingestellte Schnittdicke am Mikrotom oft erheblich von der tatsächlichen Schichtdicke des Präparates. Dies wurde beispielsweise in einer Studie von Masuda et. al., 1998 untersucht. In der Studie wurden mit einem konfokalen Laser Scan-Mikroskop Querschnitte zahlreicher mit Routinemethoden hergestellte Paraffin- Schnittpräparate mit einer Schichtdicke von 3 pm und höher untersucht. Hierbei zeigten insbesondere die dünneren Schnitte eine erhebliche Abweichung nach oben von der Voreinstellung am Mikrotom. Die Schichtdicke hat einen erheblichen Einfluss auf die Intensität der Färbung, da Präparate mit einer höheren Schichtdicke oft eine intensivere Färbung aufweisen oder aber der Prozess der Färbung selbst durch die Schichtdicke beeinflusst sein kann. Eine starke Abweichung von der eingestellten Schichtdicke ist somit insbesondere für die spätere Färbung, Beurteilung der Färbung und den darauf basierenden Befund des Histopathologen problematisch.

(iii) Das geschnittene und auf einen Objektträger aufgebrachte Präparat wird im Anschluss durch verschiedene Farbstoffe angefärbt. Eine Färbung dieser Schnittpräparate ist dabei für eine Beurteilung durch den Histopathologen notwendig, da die ungefärbten Bestandteile der Zellen und des Gewebes unter dem Lichtmikroskop schwer unterscheidbar sind. Das Ziel der Färbung ist es daher, eine visuelle Unterscheidung der Bestandteile des Gewebes zu schaffen. Standard ist dabei eine Doppelfärbung mit Hämatoxylin und Eosin, die die Grundkomponenten der Zelle (Zellkern und Zytoplasma) anfärbt. Für besondere Strukturen, wie beispielsweise Bindegewebsfasern, werden zusätzliche Spezialfärbungen (z. B. Goldner-Färbung) verwendet. Ein fundamentaler Fortschritt war zudem die Einführung der Immunhistochemie. Bei dieser Methode binden Antikörper spezifisch an ausgewählte zu untersuchende Zielproteine. Diese spezifisch gebundenen Antikörper können mittels eines Detektionssystems, welches an die Antikörper bindet, durch Farbstoffe im sichtbaren Wellenlängenbereich oder Fluoreszenzfarbstoffe am Mikroskop visualisiert werden.

(iv) Die anschließende Bewertung des gefärbten histologischen Schnittpräparates unterliegt der Erfahrung des beurteilenden Histopathologen, der eine subjektive Bewertung der Präparate vornimmt. Dabei beurteilt der Histopathologe in der Regel das morphologische Erscheinungsbild der Probe, das Vorhandensein, die Lokalisierung und die Anfärbung bestimmter Strukturen und die Intensität der Färbung. Die Beurteilung der Färbeintensität erfolgt dabei meist qualitativ oder semiquantitativ durch Schätzung und Einteilung in die Bewertungen „stark“, „mittel“ „gering“ oder „negativ“ sowie die Verteilung der gefärbten Strukturen im Schnittpräparat.

Nur für einzelne Erkrankungen und damit zusammenhängende Zielstrukturen und spezielle Proteine wird bislang eine feinere Abstufung durch detailliertere Scores durchgeführt. Dies geschieht dann nach einem festgelegten Bewertungssystem, bei dem oft verschieden Einzelkriterien zu einem Score verrechnet werden. Beispiele dafür sind der immunreaktive Score 0-12 für Östrogenrezeptoren und Progesteronrezeptoren beim Mammakarzinom, Scores für Her2neu, das proliferationsassoziierte Antigen Ki 67, das Protein c-Myc, PD-L1 und andere. Bei diesen genannten Faktoren ist eine genauere Quantifizierung deshalb so wichtig, weil hiervon eine Prognosegruppe und auch therapeutische Entscheidungen abgeleitet werden. Es besteht also insbesondere für solche Zielstrukturen und -Substanzen der Bedarf einer exakten und objektiven Quantifizierung. Diese Scores beruhen jedoch ebenfalls auf der subjektiven Beurteilung und Erfahrung des Histopathologen. Eine quantitative Messung einer Substanzkonzentration im histologischen Präparat ist bisher im klinischen Alltag nicht möglich, ist jedoch allgemein von großem Interesse um eine präzisere Beurteilung und Diagnostik als Grundlage für beispielsweise Therapieentscheidungen zu ermöglichen. Für eine quantitative Bestimmung von Substanzkonzentrationen ist es im klinischen Umfeld bisher notwendig die Methoden der klinischen Chemie anzuwenden. Die klinische Chemie bietet dabei im Gegensatz zur Histologie die Möglichkeit der Quantifizierung von Zielsubstanzen in biologischem Material mittels hochpräziser Methoden. Dabei werden überwiegend flüssige Proben (Blut, Blutserum und andere Körperflüssigkeiten) analysiert. Bei der spezifischen Proteinbestimmung wird üblicherweise ein Immunassay durchgeführt. Dabei wird das Protein mit einem für dieses Protein spezifischen Antikörper gebunden. Dieser Antikörper kann mit einem Enzym gekoppelt sein (ELISA), welches aus einem Substrat Farbe erzeugt. Die Dichte der Farbe kann photometrisch gemessen werden und somit eine Konzentration des gebundenen Proteins zugeordnet werden. Allerdings ist hier keine Lokalisierung der Substanz im Gewebe, sondern lediglich die Bestimmung eines Durchschnittswertes der Konzentration der Zielsubstanz in der biologischen Probe möglich.

Während die Schritte des Einbettens und der Färbung mittlerweile insbesondere im klinischen Umfeld größtenteils automatisiert ablaufen können und somit geringen Schwankungen unterliegen, wird aus den oben genannten Punkten ersichtlich, dass insbesondere die Schritte des Schneidens der Probe am Mikrotom und die Beurteilung der Probe durch den Histopathologen bisher nicht automatisiert und standardisiert sind und eine präzise und quantitative Beurteilung von histologischen Schnittpräparaten erschweren.

Es wurden verschiedene Ansätze untersucht, um eine objektivere Beurteilung histologischer Präparate zu ermöglichen. Insbesondere in Bezug auf die Beurteilung von histologischen Präparaten angefertigten- Bildern und Bestimmung von Zielsubstanzen in histologischen Präparaten wurden bereits verschiedene Ansätze der Standardisierung unternommen.

In den letzten Jahren ist es möglich geworden, histologische Schnittpräparate durch Kombination spezieller Mikroskop-Optik mit einem Bildsensor zu scannen und aus einer Vielzahl an Einzelbildern ein hochauflösendes Bild des gesamten Präparates zu erstellen. Dieser sogenannte Slide-Scan kann anstelle der Betrachtung des Schnittpräparates am Mikroskop verwendet werden und findet allmählich Einsatz in der Routine der Histopathologie. Allerdings wird auch der Slide-Scan bislang subjektiv durch den Histopathologen durch Vergabe von Scores bewertet. Die Auswertung des Scans durch Imageanalyse und Algorithmen der Bildvermessung unter anderem mit Hilfe Künstlicher Intelligenz (Kl) ist in Entwicklung und teils auch schon in Anwendung, wobei jedoch weiterhin die Bewertung nur relativer Farbunterschiede im Fokus steht.

Nguyen et al., 2013 offenbart die Bestimmung einer relativen Färbeintensität durch Messung der optischen Dichte und anschließender Subtraktion der Intensität des gefärbten Bereiches von der maximalen Intensität.

Choudhury et al., 2009 offenbart die Verwendung eines ATM-Scores (Average Threshold Measure), um Grenzwerte für positive Färbungen in der Immunhistochemie automatisch zu setzen. Dieser zeigte ebenfalls eine gute Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit, ermöglicht aber keine absolute Messung der Proteinkonzentration. Jensen et al., 2017 offenbart eine Immunhistochemie-Methode zur Bestimmung des Her2neu Proteins, die auf einem Amplifikationssystem basiert, welches durch das Auszählen von Punkten in einer Imageanalyse die Bestimmung eines Proteins im fixierten und paraffineingebetteten Gewebe ermöglicht. Mit dem Verfahren können jedoch keine einzelnen Komponenten der Zelle (insbesondere Zytoplasma und Zellkern) vermessen werden. Das Ergebnis wird ebenfalls als ein Histoscore präsentiert. Der sog. Histoscore basiert auf der Färbedichte und dem Prozentsatz der gefärbten Zellen und besteht aus vier Kategorien: negativ (0), schwach (1+), mäßig (2+) und stark (3+).

Quantitative Methoden zur Bestimmung einer absoluten Substratkonzentration in einem histologischen Präparat werden in US 2004/0253649 A1 und US 5610022 offenbart.

US 2004/0253649 A1 offenbart ein Verfahren zur Quantifizierung von zellulären Proteinen in Gewebeproben mittels eines Zellbildgebungs-Densitometers in Verbindung mit einer immunhistologischen Färbung und einem Referenzstandard der in gleicher Form wie die eigentliche Gewebeprobe angefärbt wird. Das Verfahren ermöglicht die Quantifizierung eines Target-Proteins hinsichtlich der absoluten Menge des Proteins bzw. der Anzahl der Proteinmoleküle pro Zelle/ Volumen/ Fraktion in einer Gewebeprobe, die das Zielprotein exprimiert.

US 5610022 offenbart ebenfalls eine interne Kontrolle, die für die Quantifizierung von Substanzkonzentrationen in Gewebeproben mittels Immunhistochemie verwendet werden kann. Die Kontrolle wird unter den gleichen Bedingungen wie die Probe behandelt, einschließlich der Immunfärbung der Gewebeprobe. Die Immunreaktivität der Kontrolle und der Probe werden vor und nach der Verarbeitung durch eine Messung verglichen.

Die genannten Verfahren, insbesondere die in US 2004/0253649 A1 und US 5610022 beschriebenen Methoden, ermöglichen eine präzisere, semiquantitative oder quantitative Bestimmung von Substanzkonzentrationen in histologischen Präparaten. Die großen Schwankungen der Schichtdicke beim manuellen Schneiden am Mikrotom mit Schwankungen um bis zu 200% in der tatsächlichen Schichtdicke werden allerdings nicht berücksichtigt, haben aber erheblichen Einfluss auf die Farbintensität der Färbung, welche die Grundlage für die Substanzkonzentrationsbestimmung in den jeweiligen Verfahren bildet. Die Schwankungen in der tatsächlichen Schichtdicke beeinträchtigen somit die Genauigkeit und Präzision der jeweiligen Verfahren erheblich.

EP 1200799 B1 offenbart eine Methode und ein Gerät für die Bestimmung der Dicke von dünnen Filmen („thin films“), welche auf ellipsometrischen Messung der Rotation von polarisiertem Licht, das durch den dünnen Film reflektiert wird, beruht.

US 2013/0314712 A1 offenbart ebenfalls ein Gerät und eine Methode für die Bestimmung der optischen Eigenschaften eines „thin films“, bei welcher der „thin film“ gleichzeitig mit Licht verschiedener Wellenlängen bestrahlt und Interferenzeffekte gemessen werden. Anschließend werden Reflexions- und Transmissionskoeffizienten berechnet und mit Kalibierwerten verglichen. Basierend darauf kann in einem Bild des dünnen Films durch eine Grauwertanalyse der Pixel eines Bildes des „thin films“ und Vergleich mit Kalibier- bzw. Referenzwerten die Dicke und die Konzentration von Analyten in dem „thin film“ bestimmt werden. Eine konkrete Methode zur Bestimmung der Konzentration oder eine gezielte Analyse ausgewählter Bereiche des „thin films“ ist jedoch nicht offenbart. Matenaers et al. (PLoS ONE 13 (2), 2018, S- 1-21 ; e0192879) offenbart die Bestimmung der Schichtdicke eines histologischen Präparates mittels eines Reflektometers (Messung der spektralen Reflexion in Abhängigkeit von der Wellenlänge) als Alternative zur in der Histologie üblichen orthogonale Wiedereinbettungstechnik (ORE). Die Bestimmung der Schichtdicke mittels Reflexion wird jedoch nur für harte Schnitte wie beispielsweise Kunstharz beschrieben, nicht für Paraffin schnitte offenbart. Paraffinschnitte stellen jedoch den überwiegenden Teil der in der Histologie angefertigten Schnitte dar. Gleichzeitig zeigen Paraffinschnitte im Gegensatz zu beispielswiese Kunstharz eine geringe Homogenität, welche eine Bestimmung der Schichtdicke mittels Reflexion teils stark beeinträchtigen kann. Die Anwendbarkeit dieser Methode auf Paraffinschnitte ist somit fraglich.

Insgesamt beruhen alle diese Verfahren zur Schnittdickenmessung entweder auf einer Messung nur der Oberfläche oder Reflexion und Transmission. Keines der Verfahren untersucht oder berücksichtigt spezielle Eigenschaften von Paraffinschichten, deren Struktur komplexer ist als beispielsweise die Struktur harter Schnitte wie Kunstharz. Durch diese komplexe Struktur können sich mehrere optische Effekte überlagern und die Bestimmung der Schichtdicke mittels der bekannten optischen Methoden erheblich erschweren und beeinträchtigen.

US 2006/0154234 A1 beschreibt Standardisierungs- und Quantifizierungsmethoden für die Histologie, Immunhistochemie und Zytologie. Dabei wird ein Referenzstandard für die Zytologie und Histologie offenbart, weicher ein Einbettungsmedium und ein kompaktes Partikel wie beispielsweise eine Zelle oder ein nichtbiologisches Partikel mit zellähnlichen Dimensionen enthält. Hierbei enthält die Zelle bzw. der Partikel eine bekannte Menge einer Substanz (beispielsweise ein Protein oder eine Nukleinsäure), welche quantitativ in der eigentlichen Probe bestimmt werden soll. Die tatsächliche Schnittdicke der histologischen Präparate wird bei der Bestimmung der Substanzkonzentration jedoch nicht untersucht, auch werden für die Konzentrationsbestimmung einzelne Bilder des Schnittes verwendet, welche eine Inhomogenität in der Belichtung aufweisen können und so die Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung beeinträchtigen können. Darüber hinaus werden wie oben ausgeführt nur definierte Partikel gemessen und nicht die gesamte oder eine beliebig große Fläche des Schnittes. Um eine genaue und präzise Bestimmung von Substanzkonzentrationen in Kombination mit der Lokalisierung der Substanz in histologischen Präparaten und somit eine fundierte Grundlage für die Diagnosestellung und Therapieentscheidung basierend auf diesen Präparaten zu ermöglichen, besteht somit die Notwendigkeit das Verfahren der Histologie weiterzuentwickeln und zu automatisieren. Diese Weiterentwicklung ist insbesondere in Hinblick auf die Schritte des Verfahrens, die starken, unter anderem auch lokalen bzw. örtlichen Schwankungen unterliegen, notwendig, wie beispielsweise die tatsächliche Schichtdicke der zu untersuchenden Präparate. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es die Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und ein Verfahren bereitzustellen, dass die genaue und präzise Bestimmung von Substanzkonzentrationen und die Lokalisierung von Substanzen in Schnittpräparaten ermöglicht. Dabei war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, das die tatsächliche Schichtdicke eines Schnittpräparates und eines Kalibrierpräparates bestimmt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es einen Korrekturfaktor für die tatsächliche lokal bzw. örtlich unterschiedliche Schichtdicke des Schnittpräparates bereitzustellen, der für die genaue Bestimmung einer Substanzkonzentration in dem Schnittpräparat verwendet werden kann. Weiterhin war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Eichpräparat bereitzustellen, das die zu bestimmende Zielsubstanz enthält und für die Quantifizierung der Substanzkonzentration im Schnittpräparat verwendet werden kann. Zusätzlich war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung für die Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates bereitzustellen. Weiterhin war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Objektträger bereitzustellen, der im erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung verwendet werden kann und, auf dem sowohl das Schnittpräparat als auch das Eichpräparat aufgebracht werden und simultan angefärbt werden können.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.

In einem Aspekt betriff die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer Schichtdicke eines Schnittpräparates, umfassend (a) Messung eines oder mehrerer Werte, die durch Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat mit einer Lichtquelle oder mehreren Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wurden, (b) Bereitstellung einer Modellierung der Schichtdicke des Schnittpräparates basierend auf Kalibrierwerten, die durch eine Messung der Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch ein oder mehrere Kalibrierpräparate mit einer Lichtquelle oder mehrerer Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wurden, und (c) Ermittlung der Schichtdicke des Schnittpräparates durch Verwendung der gemessenen Werte gemäß (a) sowie einer Modellierung gemäß (b).

Es ist ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass es eine einfache und präzise Bestimmung der tatsächlichen Schichtdicke eines Schnittpräparates ermöglicht. Schnittpräparate werden üblicherweise durch Schneiden am Mikrotom vorbereitet. Dabei kann die tatsächliche Schichtdicke erheblich von der eingestellten Schichtdicke abweichen, insbesondere bei niedrigen eingestellten Schichtdicken. Die Schichtdicke kann dabei einen wesentlichen Einfluss auf die nachfolgende Färbung und Beurteilung durch den Histopathologen oder auch die Quantifizierung von Zielsubstanzen im Schnittpräparat haben. Gängige Methoden zur Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates umfassen aufwendige und zeitintensive mikroskopische Verfahren wie die Verwendung eines Laserscan-Mikroskops. Es ist daher ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass durch Messung der Streuung und/oder Absorption eines Schnittpräparates schnell und ohne Verwendung spezieller Mikroskope oder spezieller Kenntnisse des Anwenders die tatsächliche Schichtdicke eines Schnittpräparates bestimmt werden kann. Dabei ermöglicht die Bereitstellung einer Modellierung der Schichtdicke durch Verwendung von Kalibrierpräparaten und darauf basierender Kalibrierwerte eine breite Anwendung des Verfahrens, da basierend auf der Modellierung und den gemessenen Werten die tatsächliche Schnittdicke jedes vorliegenden Schnittpräparates direkt bestimmt werden kann. Weiterhin ermöglich das Verfahren im Gegensatz zu den mikroskopischen Verfahren eine Hochdurchsatzbestimmung der tatsächlichen Schnittdicke von Schnittpräparaten, wodurch es sich insbesondere für die Anwendung im klinischen Alltag, in dem eine hohe Menge an Schnittpräparaten anfällt, als vorteilhaft erweist.

Die Messung der Streuung und/oder Absorption erweist sich für das erfindungsgemäße Verfahren als besonders vorteilhaft, da die gemessenen Streuungs- und/oder Absorptionswerte eine hohe Empfindlichkeit in Bezug auf die Schichtdicke aufweisen. Durch Messung der Streuung und/oder Absorption ist es im Gegensatz zu anderen optischen Effekten wie teilweise der Transmission und insbesondere der Reflexion möglich über einen breiten Wellenlängenbereich die tatsächliche Schichtdicke des Schnittpräparates präzise und richtig zu bestimmen und somit auch die Präzision und Richtigkeit der Beurteilung von Schnittpräparaten und der Bestimmung der Konzentration von Zielsubstanzen in diesen Präparaten zu erhöhen. Dabei ermöglicht eine Messung mittels Streuung und/oder Absorption insbesondere auch die Messung der Schichtdicke von Schnittpräparaten, welche eine unregelmäßige Struktur und Oberfläche aufweisen, wie beispielsweise Paraffinschnitte, welche einen Großteil der in der Histologie verwendeten Schnittpräparate darstellen. Für die Bestimmung der Schichtdicke solcher Präparate mit unregelmäßiger Struktur ist beispielsweise die alleinige Messung der Transmission nicht geeignet, da sich mehrere optische Effekte in unterschiedlicher Ausprägung überlagern, sodass keine kontinuierliche Beziehung zwischen Schichtdicke und Transmission hergestellt werden kann.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle(n) eine Wellenlänge von 200 bis 2000 nm, vorzugsweise 300 bis 1800 nm, besonders bevorzugt 400 bis 1700 nm aufweisen. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform können die Lichtquelle(n) eine Wellenlänge von 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 oder 2000 nm oder weitere Wellenlängen in diesem Bereich haben, welche die gewünschten Eigenschaften der vorliegenden Erfindung erzielen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Modellierung der Schichtdicke umfasst, (a) Bereitstellung der Kalibrierwerte, die durch eine Messung der Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch ein oder mehrere Kalibrierpräparate mit einer Lichtquelle oder mehreren Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen ermittelt wurden, wobei die Kalibrierpräparate eine bekannte Schichtdicke von 0,1 bis 10 pm, bevorzugt eine bekannte Schichtdicke von 1 bis 7 pm aufweisen, (b) Ermittlung einer oder mehrerer Kalibrierfunktionen, wobei die Kalibrierfunktion die Korrelation der Schichtdicke des einen oder mehrerer Kalibrierpräparate mit den Kalibrierwerten umfasst, (c) Vergleich der gemessenen Werte eines Schnittpräparates mit den ein oder mehreren Kalibrierfunktionen gemäß (b), vorzugsweise unter Berücksichtigung einer Ungenauigkeit der Messung der Werte von 5%, (d) Die Ausgabe einer Schichtdicke des Schnittpräparates, welche dem Mittelwert eines oder mehrerer Werte entspricht, die gemäß (c) mit einer oder mehrerer der Kalibrierfunktionen übereinstimmen. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform können die Lichtquelle(n) eine Wellenlänge von 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 oder 2000 nm oder weitere Wellenlängen in diesem Bereich haben, welche die gewünschten Eigenschaften der vorliegenden Erfindung erzielen.

Durch die Bereitstellung einer Modellierung der tatsächlichen Schichtdicke eines Schnittpräparates ist eine einfache und breite Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich. Im Gegensatz zu mikroskopischen Verfahren zur Bestimmung der tatsächlichen Schichtdicke ist das Verfahren ohne spezielle Kenntnisse und mit einfach zu bedienenden Geräten, wie beispielsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung, anwendbar und ermöglicht dabei eine präzise und genaue Bestimmung der tatsächlichen Schichtdicke sowie deren örtlicher Verteilung. Weiterhin ermöglicht die Verwendung einer Modellierung im erfindungsgemäßen Verfahren eine automatisierte und Hochdurchsatz-Bestimmung der Schichtdicke, welche insbesondere im klinischen Alltag auch durch Personal ohne spezielle Kenntnisse eingesetzt werden kann.

Vorteilhafterweise kann mittels der Kalibrierfunktion für mehrere örtlich bzw. lokal getrennten Bereichen des Schnittpräparates ein Korrekturfaktor ermittelt werden, welcher örtlich unterschiedliche Korrekturen und beispielsweise wie unten im Detail ausgeführt die Erstellung eines Höhenprofils der Schnittpräparates ermöglicht.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Schnittpräparat eine Schichtdicke von 0,1 bis 10 pm, vorzugsweise 1 bis 7 pm aufweist. In einer weiteren Ausführungsform kann das Schnittpräparat eine Schichtdicke von 0,1 pm, 0,2 pm, 0,3 pm, 0,5 pm, 0,6pm, 0,7 pm, 0,8 pm, 0,9 pm, 1 pm, 1 ,5 pm, 2 pm, 2,5 pm, 3 pm, 3,5 pm, 4 pm, 4,5 pm, 5 pm, 5,5 pm, 6 pm, 6,5 pm, 7 pm, 7,5 pm, 8 pm, 8,5 pm, 9 pm, 9,5 pm, 10 pm oder einer anderen Dicke in diesem Bereich haben, welche die gewünschten Eigenschaften der vorliegenden Erfindung erzielt.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise für den gesamten Bereich der in der Histologie üblichen Schichtdicken von Schnittpräparaten eingesetzt werden.

Überaschenderweise weist das erfindungsgemäße Verfahren dabei über den gesamten Bereich eine hohe Empfindlichkeit auf und ermöglicht eine genaue und präzise Bestimmung der tatsächlichen Schichtdicke. Hierbei ermöglicht das Verfahren überraschenderweise auch in dem in der Histologie üblichen Schichtdickenbereich von 1 bis 2 pm, für welchen eine besonders hohe Abweichung von der am Mikrotom eingestellten Schichtdicke beobachtet wurde, eine genaue Bestimmung der Schichtdicke und somit eine genaue Quantifizierung von Zielsubstanzen in Schnitten dieser Dicke. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere in der Histologie breit eingesetzt werden und somit die genaue Beurteilung, Quantifizierung von Zielsubstanzen und darauf basierende Diagnosen und Therapieentscheidungen ermöglichen.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Schnittpräparat Gewebe enthält.

In einerweiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich die Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz in dem in einem Schnittpräparat enthaltenen Gewebe.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Konzentration der Ziel-Substanz umfasst: (a) Bereitstellung eines Schnittpräparates und eines E ich prä parates, wobei das Eichpräparat eine vorbestimmte Konzentration der Ziel-Substanz umfasst, (b) Bestimmung der Schichtdicke des Schnittpräparates und des Eichpräparats, (c) Ermittlung eines Korrekturfaktors durch Verwendung der Schichtdicke gemäß (b), (d) simultane Färbung des Schnittpräparates und des Eichpräparates, vorzugsweise auf der Oberfläche eines Objektträgers, (e) Messung der Farbintensität des im Schnittpräparat enthaltenen Gewebes und der im Eichpräparat enthaltenen Zielsubstanz, und (f) Ermittlung der Konzentration der Ziel-Substanz in dem Gewebe durch Verwendung der Farbintensität gemäß (e) und des Korrekturfaktors gemäß (c). In einerweiteren Ausführungsform wird der gewebefreie Teil des Schnittpräparates und/oder des Eich prä parates weicher einen Farbstoff enthält, der Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm absorbiert, vor der Färbung abgedeckt oder abgetrennt.

In einerweiteren Ausführungsform wird die Bestimmung der Schichtdicke erst nach der simultanen Färbung des Schnittpräparates durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Bestimmung der örtlich unterschiedlichen Schichtdicke erst nach der simultanen Färbung des Schnittpräparates durchgeführt.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Konzentration der Ziel-Substanz umfasst: (a) Bereitstellung eines Schnittpräparates und eines Eich prä parates, wobei das Eichpräparat eine vorbestimmte Konzentration der Ziel-Substanz umfasst, und das Schnittpräparat und das Eichpräparat einen oder mehrere Bereiche umfassen, welche einen Farbstoff enthalten, der Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm absorbiert, (b) Abdeckung oder Abtrennung der Bereiche des Schnittpräparates und des Eichpräparates, welche den Farbstoff enthalten, (c) simultane Färbung des Schnittpräparates und des Eichpräparates, vorzugsweise auf der Oberfläche eines Objektträgers, (d) Bestimmung der Schichtdicke des Schnittpräparates und des Eichpräparats durch ein Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, (e) Ermittlung eines Korrekturfaktors durch Verwendung der Schichtdicke gemäß (d), (f) Messung der Farbintensität des im Schnittpräparat enthaltenen Gewebes und der im Eichpräparat enthaltenen Zielsubstanz, und (g) Ermittlung der Konzentration der Ziel-Substanz in dem Gewebe durch Verwendung der Farbintensität gemäß (f) und des Korrekturfaktors gemäß (e).

Das erfindungsgemäße Verfahren der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise dazu eingesetzt werden eine Zielsubstanz in einem Schnittpräparat absolut zu quantifizieren. Dabei ermöglicht die Verwendung eines Eichpräparates, welches eine bekannte Konzentration der Zielsubstanz enthält und im erfindungsgemäßen Verfahren simultan zum Schnittpräparat angefärbt und vermessen wird, die Bestimmung der absoluten Konzentration der Zielsubstanz. In Kombination mit der Bestimmung der gegebenenfalls örtlich unterschiedlichen tatsächlichen Schichtdicke des Schnittpräparates und des Eichpräparates wird ein Korrekturfaktor (beispielsweise als auf einem Höhenprofil basierende Korrekturfaktor-Fläche auch Korrekturfläche genannt) bereitgestellt, der die Genauigkeit und Richtigkeit der Konzentrationsbestimmung erheblich erhöht. In den bisher im Stand der Technik verwendeten Verfahren zu absoluten Konzentrationsbestimmung einer Zielsubstanz in histologischen Präparaten wird die tatsächliche Schichtdicke der Schnittpräparate nicht bestimmt und kein darauf basierender Korrekturfaktor berechnet. Da die Schichtdicke der Schnittpräparate wie beispielsweise histologischer Präparate jedoch erheblich schwanken kann, beispielsweise aufgrund des Schnittverfahrens (z.B. mittels eines Mikrotoms) oder durch das verwendete Einbettungsmaterial (z.B. durch die lokalen Unterschiede in der Schichtdicke, wie sie bei Paraffin auftreten) sich somit innerhalb des Schnittpräparates oder auch zwischen Schnitt- und Eichpräparat erheblich unterscheiden kann und gleichzeitig einen wesentlichen Einfluss auf die Intensität der Färbung und somit die Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz hat, wird im erfindungsgemäßen Verfahren im Vergleich zum Stand der Technik durch Ermittlung eines Korrekturfaktors für die Schichtdicke eine deutlich erhöhte Genauigkeit und Präzision der absoluten Konzentrationsbestimmung erreicht. Eine Korrektur dieser örtlichen bzw. lokalen Unterschiede in der Schichtdicke, wie sie bei Paraffin auftreten, und deren Berücksichtigung in der Konzentrationsbestimmung, beispielsweise durch die unten ausgeführte Erstellung eines Höhenprofils, ist im Stand der Technik bisher nicht offenbart.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es somit erstmals möglich, eine präzise absolute quantitative Messung der Konzentration einer Ziel-Substanz mit gleichzeitiger Lokalisierung der Zielsubstanz histologischen Schnittpräparat durchzuführen. Substanzen, insbesondere Proteine, für die anderweitig quantitative Messmethoden vorliegen, können durch die Erstellung einer Kalibrierkurve anhand des Eichpräparates im Vergleich mit dem Schnittpräparat objektiv quantifiziert werden. Somit weist das erfindungsgemäße Verfahren sowohl die hohe quantitative Genauigkeit der Klinischen Chemie und die hohe räumliche Auflösung der Histologie auf. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind lokalisierte und exakte Messungen von Konzentrationen einer Ziel-Substanz in Einzelzellen und sogar in einzelnen Zellkomponenten (Zellmembran, Zytoplasma, Zellkern, Teile des Zytoplasmas oder des Zellkerns) möglich. Damit ergeben sich insbesondere neue Möglichkeiten in der medizinischen Diagnostik und Forschung. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Grenzwerte für diagnostische Entscheidungen / Therapieentscheidungen festgelegt werden und in der Forschung wird zudem eine hochaufgelöste und absolute quantitative Analyse von pathologischen Prozessen ermöglicht.

Das vorliegende Verfahren kann dabei insbesondere für Erkrankungen mit heterogenem Erscheinungsbild relevant sein, wie beispielsweise das Prostatakarzinom, bei dem das prostataspezifische Antigen (PSA) gebildet wird. PSA kann immunhistochemisch im Karzinom und mit den Methoden der klinischen Chemie im Blut (Serum) nachgewiesen werden. Erhöhte Blutwerte weisen dabei auf eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen eines Karzinoms oder einer Metastasierung hin, können aber auch bei Entzündungen erhöht sein. Weiterhin ist die Expression bei einem vorliegenden Tumor individuell unterschiedlich, heterogen und aktuell nicht exakt quantifizierbar. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine PSA- Quantifizierung und -Lokalisierung im Tumorgewebe erreicht werden und basierend darauf individuelle Cut-off-Werte für jeden Patienten ermittelt werden, der den aktuell für alle Patienten statistisch ermittelten Cut-off ablösen kann. Damit könnten Prognose und Therapieentscheidungen für diese Tumorerkrankung erheblich präzisiert und individualisiert werden. In ähnlicher Weise kann das Verfahren auch für andere Tumorerkrankungen und - marker Anwendung finden, beispielsweise für das Protein S100, welches bei malignen Melanomen exprimiert wird.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Eichpräparat die Ziel-Substanz in zwei oder mehr Konzentrationen enthält, die räumlich voneinander getrennt sind.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke des Schnittpräparates und des Eichpräparates in gewebefreien Bereichen des Schnittpräparates und des Eichpräparates bestimmt wird.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Werte, die durch Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat, das Eichpräparat und/oder Kalibrierpräparat erzeugt werden, an einer oder mehr Positionen in den gewebefreien Bereichen des Präparates gemessen werden, vorzugsweise an zwei oder mehr Positionen, besonders bevorzugt an zwei oder vier Positionen. In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Werte, die durch Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat, das Eichpräparat und/oder Kalibrierpräparat erzeugt werden, an zwei oder mehr Positionen in den gewebefreien Bereichen des Präparates gemessen werden, welche symmetrisch um das im Schnittpräparat enthaltene Gewebe angeordnet sind, vorzugsweise an sich gegenüberliegenden gewebefreien Bereichen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass aus den zwei oder mehreren Positionen gemessenen Werte ein Mittelwert gebildet wird, welcher für die Bestimmung der Schichtdicke des Schnittpräparates verwendet wird. In einerweiteren Ausführungsform wird eine zweidimensionale Funktion (Korrekturfläche) bestimmt. Eine solche Korrekturfläche berücksichtigt die gegebenenfalls im Schnittpräparat vorhandenen lokalen bzw. örtlichen Unterschiede in der Schichtdicke und kann somit zu örtlich bzw. lokal unterschiedlichen Korrekturfaktoren führen.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die gewebefreien Bereiche des Schnittpräparates, des einen oder mehrerer Kalibrierpräparate und/oder des Eichpräparates einen oder mehrere Bereiche umfassen, welche einen Farbstoff enthalten, der Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm absorbiert, beispielsweise 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 950 n, 1000 nm, 1050 nm, 1100 nm, 1150 nm, 1200 nm, 1250 nm, 1300 nm, 1350 nm, 1400 nm, 1450 nm, 1500 nm, 1550 nm, 1600 nm, 1650 nm, 1700 nm, 1750 nm, 1800 nm, 1850 nm, 1900 nm, 1950 nm oder 2000 nm, vorzugsweise in einem Bereich von 300 bis 800 nm,

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Schnittpräparat, die einen oder mehreren Kalibrierpräparate und das Eichpräparat ein Paraffinschnitt sind.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Schnittpräparat und/oder das Eichpräparat durch Einbetten von Gewebe und/oder eines oder mehrerer Eichkegel, welche aufbereitetes Gewebe einer bekannten Konzentration enthalten, in einen Paraffinblock, welcher anschließend geschnitten wird, erhalten werden. In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Schnittpräparat durch Einbetten von Gewebe in einen Paraffinblock (Probenblock), welcher anschließend geschnitten wird, erhalten wird. In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das das Eichpräparat durch Einbetten eines oder mehrerer Eichkegel, welche aufbereitetes Gewebe einer bekannten Konzentration enthalten, in einen Paraffinblock (Eichblock), welcher anschließend geschnitten wird, erhalten wird. In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Eichpräparat durch Einspritzen einer Lösung enthaltend eine definierte Konzentration des Zielproteins in einen oder mehrere bereits hergestellte Eichkegel, welche anschließend in Paraffin eingebettet und geschnitten werden, erhalten wird. In einerweiteren Ausführungsform wird der Eichkegel nach Einspritzen einer Lösung enthaltend eine definierte Konzentration des Zielproteins zur Verfestigung des Proteins in Formalin gelagert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Zielprotein ein aus einem Gewebe isoliertes Protein und/oder ein rekombinant hergestelltes Protein.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Farbstoffe, die Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm absorbieren, in den gewebefreien Bereich des Probenblocks und/oder des Eichblocks eingebracht werden und der Probenblock und/oder der Eichblock anschließend geschnitten werden um ein Schnittpräparat und/oder ein Eichpräparat zu erhalten. In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff durch Einbringen einer oder mehrerer Stanzen (Kalibrierstanzen) in den Probenblock und/oder Eichblock eingebracht wird. In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff in einen separaten Paraffinblock eingebracht wird, aus welchem durch Stanzen eine oder mehrere Proben entnommen werden, welche in den Probenblock und/oder den Eichblock eingebracht werden, vorzugsweise durch Stanzen.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke eines Schnittpräparates durch Messung von Werten, die durch Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat, in den einen oder mehreren Bereichen, in denen ein Farbstoff eingebracht wurde, bestimmt wird. In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke eines Schnittpräparates durch Messung von Werten, die durch Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat, in den einen oder mehreren Bereichen, in denen die Kalibrierstanze eingebracht wurde, bestimmt wird.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke eines Schnittpräparates durch die Messung von Werten, die durch Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat, in den zwei oder mehr Bereichen, in denen ein Farbstoff eingebracht wurde, bestimmt wird. In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass anhand der Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates durch Messung von Werten, die durch Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat, in den zwei oder mehr Bereichen, in denen ein Farbstoff eingebracht wurde, bestimmt wird, ein Profil der Schichtdicke (Höhenprofil) des Paraffinschnittes erstellt wird.

In einer Ausführungsform umfasst die Erstellung des Höhenprofils eine zweidimensionale Fittingfunktion. In einerweiteren Ausführungsform umfasst die zweidimensionale Fittingfunktion an zwei oder mehreren, unterschiedlichen Positionen des Schnittpräparates bestimmten Schichtdicken oder äquivalenten Schichtdicken (Stützstellen). In einer weiteren Ausführungsform umfasst Erstellung des Höhenprofils zusätzlich die Interpolation aus den Stützstellen der mittels der zweidimensionalen Fittingfunktion auf das gesamte Schnittpräparat.

In einerweiteren Ausführungsform wird anhand des Höhenprofils für jeden Bereich des Schnittpräparates und/oder des Eichpräparates(Kontrollbereich) ein Korrekturfaktor bestimmt und die Konzentration einer Ziel-Substanz in einem Bereich des Schnittpräparates unter Verwendung des Korrekturfaktors für diesen Bereich In einerweiteren Ausführungsform wird die Konzentration einer Ziel-Substanz in einem Bereich des Schnittpräparates unter Verwendung eines Korrekturfaktors für diesen Bereich bestimmt, wobei Korrekturfaktor ein konstanter Korrekturwertes für das gesamte Schnittpräparat oder ein örtlich aufgelöster Korrekturfaktor (mittels eines Höhenprofils erstelle Korrekturfläche) ist.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass ein digitaler Scan des Schnittpräparates, des Kalibrierpräparates und/oder des Eich präparates angefertigt wird, der für die Messung der Werte und/oder der Farbintensität verwendet wird, wobei die Messung der Werte und/oder der Farbintensität die Bestimmung eines Helligkeitswertes umfasst. Durch die Erstellung eines digitalen Scans im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine standardisierte und auch automatisierte Erstellung von Kalibierkurven basierend auf Kalibrierpräparaten und/oder Eichpräparaten und Auswertung des Schnittpräparates und Konzentrationsbestimmung einer Zielsubstanz ermöglicht. Das einfache Fotografieren eines Schnitt-, Eich- oder Kalibrierpräparates führt zu erheblichen Schwankungen in der Bildqualität bedingt durch variable Vergrößerungen, Vignettierung des Bildfeldes und unterschiedliche Lampenhelligkeit, Farbtemperatur und Belichtungszeit. Durch Erstellung eines digitalen Scans wird in Gegensatz dazu ein Bild erzeugt, welches eine gleichmäßige Helligkeit mit gleichem Weißabgleich aufweist, und durch Kalibrierung auch bei unterschiedlichen Schnittpräparaten immer gleich durchgeführt werden kann. Das erzeugte Bild kann dann standardisiert und automatisch ausgewertet, und für die Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates mit dem Korrekturfaktor oder den mehreren durch das Höhenprofil ermittelten Korrekturfaktoren (Korrekturfläche) der tatsächlichen Schichtdicke verrechnet, und für die Konzentrationsbestimmung verwendet werden. Für die Auswertung können dabei auch übliche Fotobearbeitungsprogramme, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden.

Im Gegensatz zu dem in US 2013/0314712 A1 offenbarten Verfahren in welchem nur der Schnitt als Ganzes oder in bestimmten Regionen in der Apparatur gemessen wird, nicht jedoch am gescannten Bild, ermöglicht ein digitaler Scan des Schnittpräparates gemäß der vorliegenden Erfindung eine pixelgenaue Auflösung des Schnittpräparates. An einem digital gescannten Bild, welches sich aus zahlreichen Einzelbildern zusammensetzt, ist eine gleichmäßige Bildhelligkeit/Basisintensität des Signals über das gesamte Präparat gewährleistet, da optisch erzeugte Bilder immer eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Randabdunklung aufweisen.

In einerweiteren Ausführungsform wird ein mathematisches Programm zur Bestimmung der Korrekturfläche verwendet. In einerweiteren Ausführungsform wird mittels des mathematischen Programms eine Falschfarbendarstellung mit Farblegende erstellt, wobei in der Farblegende die örtlichen Konzentrationen der Ziel-Substanz codiert sind. Vorteilhafterweise gibt ein solches mathematisches Programm somit Aufschluss über die lokalen Konzentrationen der Ziel-Substanz in einem Schnittpräparat.

In einerweiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass anhand der gemessenen Farbintensität der im Eichpräparat vorhandenen Ziel-Substanz eine Kalibrierkurve für die Konzentration der Ziel-Substanz erstellt wird, die vorzugsweise aus zwei oder mehr Konzentrationen der Ziel-Substanz ermittelt wird.

Durch das Bereitstellen von zwei oder mehr Konzentrationen der Ziel-Substanz ist es möglich eine Kalibrierkurve zu erstellen, anhand derer die Konzentration genau und präzise bestimmt werden kann. Die räumliche Trennung der Konzentrationen im Eichpräparat vermeidet dabei Überlappungen und Vermischungen der Konzentrationen und damit fehlerhafte Konzentrationsbestimmungen. Die räumliche Trennung und Bereitstellung verschiedener Konzentrationen können entsprechend bekannten Techniken sehr einfach erreicht werden.

In einerweiteren Ausführungsform wird (a) das die Ziel-Substanz enthaltende Präparat oder Gewebe entsprechend im Stand der Technik bekannter Methoden aufbereitet, vorzugsweise durch mechanisches Zerkleinern und/oder Auflösung des Gewebes in einem Lysepuffer, (b) die Konzentration der Ziel-Substanz bestimmt, vorzugsweise durch die Methoden der klinischen Chemie, (c) das aufbereitete Präparat so verdünnt, dass es eine bestimmte Konzentration der Ziel-Substanz enthält und (d) das aufbereitete Präparat oder Gewebe gemäß (c) in einem Gel in Form eines Eichkegels (Zellblock) gebunden. In einer weiteren Ausführungsform werden eine oder mehrere der Eichkegel in einen Paraffinblock (Eichblock) räumlich getrennt voneinander eingebracht. In einerweiteren Ausführungsform kann dieser Eichblock im erfindungsgemäßen Verfahren für die Herstellung eines Eichpräparates verwendet werden, vorzugsweise durch Herstellung eines Schnittes des Eichblockes.

Die Eichblöcke gemäß der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise in standardisierten Verfahren für beliebige Zielsubstanzen wie beispielsweise Proteine hergestellt und dem Anwender des Verfahrens bereitgestellt werden. Dadurch kann eine hohe weltweite Standardisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens erreicht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Ziel- Substanz eine Substanz innerhalb dem in einem Schnittpräparat enthaltenen Gewebe, bevorzugt ein Protein ist und die Ziel-Substanz anhand des Eichpräparats und der Kalibrierkurve in dem im Schnittpräparat enthaltenen Gewebe lokalisiert und die Konzentration der Zielsubstanz bestimmt wird.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung für die Messung der Schichtdicke eines Schnittpräparates und optional für die Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz in dem Schnittpräparat, umfassend (a) eine Lichtquelle oder mehrere Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen im Bereich von 200 bis 2000 nm, vorzugsweise 300 bis 1800 nm, besonders bevorzugt 400 bis 1700 nm, (b) mindestens einen Sensor für die Messung der Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls, (c) eine Vorrichtung für die Positionierung des Schnittpräparates während der Messung, und (d) eine Recheneinheit für die Modellierung der Schichtdicke eines Schnittpräparates oder für die Verwendung der Modellierung bei der Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform können die eine Lichtquelle oder die mehreren Lichtquellen eine Wellenlänge von 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 oder 2000 nm oder weitere Wellenlängen in diesem Bereich haben, welche die gewünschten Eigenschaften der vorliegenden Erfindung erzielen.

In einerweiteren Ausführungsform ist die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Formgebungsstruktur umfasst, in welche eine oder mehrere Lichtquellen und eine oder mehrere Sensoren eingebracht werden können, vorzugsweise in sich gegenüberliegenden Positionen. In einerweiteren Ausführungsform ist die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass ein Objektträger, auf dem ein Schnittpräparat und/oder ein Eichpräparat oder ein Kalibrierpräparat aufgebracht sind, zwischen Lichtquelle und Sensor eingebracht werden kann und der von der Lichtquelle ausgehende Lichtstrahl durch den Objektträger geleitet wird und die Streuung und/oder Absorption des Lichtstrahls durch den Sensor gemessen werden kann. In einerweiteren Ausführungsform ist die Lichtquelle eine Leuchtdiode oder eine Laserdiode. In einerweiteren Ausführungsform ist der Sensor eine Photodiode und/oder ein Scanner. In einerweiteren Ausführungsform ist die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine oder mehrere Blenden umfasst, welche den von der Lichtquelle ausgehenden Lichtstrahl auf eine oder mehrere bestimmte Positionen des Objektträgers, auf welchem ein Schnittpräparat und/oder ein Eichpräparat oder ein Kalibrierpräparat aufgebracht sind, begrenzt. In einer weiteren Ausführungsform, umfasst die Vorrichtung eine Kamera, welche die durch die eine oder mehrere Blenden begrenzte Durchleuchtungsposition des Objektträgers durch die Lichtquelle aufnehmen kann. In einerweiteren Ausführungsform kann die Kamera für die Erstellung eines Bildes vom Schnittpräparat beispielsweise für eine Bildauswertung und/oder für die Bestimmung weiterer Eigenschaften des Schnittpräparates verwendet werden, beispielsweise für die Bestimmung der Homogenität des Präparates in Form von Messwerten, welche für die Bestimmung der Schichtdicke oder einer Konzentration einer Zielsubstanz in einem Schnittpräparat verwendet werden können.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Objektträger zurVerwendung in dem Verfahren und/oder mit der Vorrichtung, umfassend ein Eichpräparat enthaltend eine Ziel- Substanz in zwei oder mehr Konzentrationen, die räumlich voneinander getrennt sind, auf dem zusätzlich das Schnittpräparat aufgebracht werden kann. In einer weiteren Ausführungsform, umfasst der Objektträger einen abdeckbaren und/oder abtrennbaren Bereich. In einer weiteren Ausführungsform ist in dem abtrennbaren Bereich der gewebefreie Teil des Eichpräparates aufgebracht welcher einen Farbstoff enthält, der Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm absorbiert, vorzugsweise in Form einer Kalibrierstanze. In einerweiteren Ausführungsform wird in dem abtrennbaren Bereich der gewebefreie Teil des Schnittpräparates aufgebracht welcher einen Farbstoff enthält, der Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm absorbiert, vorzugsweise in Form einer Kalibrierstanze.

Durch Bereitstellung eines Objektträgers, auf dem das Schnittpräparat und das Eichpräparat aufgebracht werden können, wird eine simultane Probenbearbeitung ermöglicht. Durch die simultane Probenbearbeitung kann das erfindungsgemäße Verfahren innerhalb kurzer Zeit durchgeführt werden, da die Schritte der Probenvorbereitung nur einmal und nicht für Schnittpräparat und Eichpräparat separat durchgeführt werden müssen. Weiterhin wird das erfindungsgemäße Verfahren durch die simultane Probenvorbereitung weiter standardisiert, da eventuelle Schwankungen, die durch eine separate Probenbearbeitung entstehen können, ausgeschlossen werden. Die Bereitstellung eines Objektträgers für das erfindungsgemäße Verfahren erleichtert weiterhin die Anwendbarkeit, beispielsweise im klinischen Umfeld, da lediglich das Schnittpräparat aufgebracht werden und die standardisierten Schritte des Verfahrens durchgeführt werden muss. Durch das Abdecken oder Abtrennen der Kalibrierstanzen, kann vorteilhafterweise ein Zersetzen der Kalibrierstanzen vermieden werden, wodurch es möglich ist die Bestimmung der Schichtdicke nach der Färbung der Präparate in einem Schritt durchzuführen, beispielsweise durch einen Scan der Präparate, welcher anschließend für die Bestimmung der Schichtdicke, der Kalibrierkurve und der Konzentration der Ziel-Substanz verwendet werden kann. Werden die Kalibrierstanzen nicht abgedeckt, muss die Bestimmung der Schichtdicke vor der Färbung erfolgen, da die Kalibrierstanzen sich während der Färbung zersetzen und eine anschließende Bestimmung der Schichtdicke somit nicht mehr möglich ist.

Die oben genannten Merkmale in Bezug auf das Verfahren zur Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates haben strukturelle und funktionelle Auswirkungen auf die anderen Aspekte der Erfindung die das Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz in dem in einem Schnittpräparat enthaltenen Gewebe , die Vorrichtung zur Messung der Schichtdicke eines Schnittpräparates und den Objektträger zu Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren umfassen, so dass das Verfahren zur Bestimmung der Schichtdicke, das Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz, die Vorrichtung zur Messung der Schichtdicke und der Objektträger jeweils durch die Merkmale der anderen Aspekte beschrieben oder von diesen abgeleitet werden können.

DETAILLIERTE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Alle zitierten Dokumente der Patent- und Nichtpatentliteraturwerden hiermit in vollem Umfang durch Verweis einbezogen. Jeder im Folgenden beschriebene Begriff ist in seiner allgemeinen Bedeutung zu verstehen, wie sie der Fachmann kennt. Die Definitionen werden im Folgenden beispielhaft angegeben, um zu verdeutlichen, wie jeder Begriff im Zusammenhang mit der Erfindung angewendet wird und in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden kann.

Die Histologie und Histopathologie beinhalten die mikroskopische Untersuchung von biologischem Material wie beispielsweise Gewebeproben in Bezug auf die Morphologie. In der Histopathologie ist die unter dem Mikroskop zu untersuchende Probe in der Regel biologisches Material in Form einer bei einer Operation oder medizinischen Untersuchung entnommenen Gewebeprobe, auch Biopsie genannt. Eine Biopsie ist ein Verfahren zur Entnahme und Gewinnung einer kleinen Menge von Gewebe einer Person oder eines Patienten. Zu den verschiedenen Arten der Biopsie gehören unter anderem die Stanzbiopsie, die Nadelbiopsie, die endoskopische Biopsie, die Exzisionsbiopsie und die perioperative Biopsie. Größere Proben bestehen aus Organen oder Organteilen („Resektate“) und erfordern zusätzlich die Entnahme von repräsentativem Material durch den Pathologen vor der weiteren Untersuchung. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Typische durch Biopsie gewonnene Proben enthalten unter anderem Gewebe des Dickdarms, der Niere, der Bauchspeicheldrüse, des Gebärmutterhalses, der Lunge, der Brust, der Prostata oder Weichgewebe.

Für die histologische oder pathohistologische Untersuchung wird die entnommene Probe anschließend (i) fixiert, (ii) geklärt/eingebettet, (iii) geschnitten und (iv) angefärbt. Alternativ dazu können Gefrierschnitte mit einem Kryostaten angefertigt werden, wenn schnelle Ergebnisse erforderlich sind oder die Fixierung die Ziel Strukturen beeinträchtigen würde.

Die Fixierung der Probe wird vorgenommen, um Autolyse und Fäulnis zu verhindern und im Gewebe vorhandene Strukturen während der nachfolgenden Schritte der zu erhalten. Die Fixierung von Gewebeproben kann mittels physikalischer oder chemischer Methoden erfolgen. Physikalische Methoden umfassen Wärme- und Mikrowellenbehandlung sowie die Kryokonservierung. Die chemische Fixierung erfolgt in der Regel durch Eintauchen des Präparates in ein Fixiermittel. Darüber hinaus gibt es Fixiermittel, die in Form von Dampf eingesetzt und für einige spezielle histochemische Verfahren verwendet werden, wie beispielsweise die Dampffixierung gefriergetrockneter Gewebe durch Paraformaldehyd und Osmiumtetroxid. Chemische Fixiermittel umfassen Alkohole, Aldehyde wie Formalin, neutral gepuffertes Formalin (4-10% Formaldehyd in isotoner gepufferter Kochsalzlösung), Paraformaldehyd, Glutaraldehyd und Akrolein, Oxidationsmittel wie Kaliumpermanganat, Osmiumtetroxid und Chromsäure und Gerbstoffe. Biologische Gewebeproben werden oft unmittelbar nach der Entnahme für 24 bis 48 Stunden in ein Fixiermittel überführt, in der Regel in 10 % neutral gepuffertes Formalin.

Für die anschließende Dehydratisierung, auch „Dehydrierung“ genannt, wird die Probe in steigende Konzentrationen von Alkohol eingetaucht, um Wasser und Formalin aus der Probe zu entfernen. Die Dehydratisierung ist gefolgt von der Klärung durch ein organisches Lösungsmittel wie Xylol, um den Alkohol zu entfernen und die Infiltration und somit Einbettung in Paraffinwachs zu ermöglichen. Beim Einbetten wird die Probe mit dem Einbettungsmittel - in der Regel Paraffin - infiltriert. Das Einbettungsmittel bildet eine Trägermatrix und ermöglicht im Anschluss die Probe in sehr dünne Schnitte zu schneiden, die mikroskopisch untersucht werden können.

Ein Schnitt auch „Schnittpräparat“ genannt wird in der Regel mit einem Mikrotom angefertigt. Ein Mikrotom ist ein Schneidegerät mit dem sehr dünne Schnittpräparate mit einer Schichtdicke im Bereich von 0.1 bis 100 pm erhalten werden können. Der Begriff „Schichtdicke“ beschreibt hierbei den Durchmesser beziehungsweise die Höhe des Schnittpräparates, die gleichmäßig (konstante Höhe in der Fläche) oder variabel (örtlich veränderlich) sein kann. Ein Mikrotom besteht üblicherweise aus einem Messerblock, einem Präparatehalter und einem Vorschubmechanismus. Beim Schneiden wird das Messer durch das Präparat gedrückt und ein dünnes Schnittpräparat erhalten, welches durch den Vorschubmechanismus aus dem Gerät geschoben wird, um den nächsten Schnitt zu ermöglichen. Es sind verschiedene Typen von Mikrotomen bekannt, wie beispielsweise Schlittenmikrotome, Rotationsmikrotome, Vibratome, Sägemikrotome und Laser-Mikrotome. Ein Fachmann kann aus diesen Geräten ein geeignetes Gerät für das Herstellen von Schnittpräparaten auswählen. Für histologische Untersuchungen werden Schnittpräparate mit einer Schichtdicke von 1 bis 10 pm, vorzugsweise 2 bis 7 pm angefertigt. Die angefertigten Schnitte werden in einem Wasserbecken aufgefangen und auf der Oberfläche des Wassers durch die Oberflächenspannung ausgestreckt und können so auf einen Objektträger für die weitere Probenvorbereitung übertragen werden.

Der Begriff "Paraffinschnitt" bezieht sich auf ein Schnittpräparat, das durch Schneiden eines Paraffin blockes erhalten wurde. In diesem Paraffinblock kann eine histologische Probe eingebettet sein, die Gewebe enthält. Die Bereiche des Paraffinblockes in denen kein Gewebe eingebettet ist werden als „gewebefreie Bereiche“ bezeichnet. Die Einbettung in einen Paraffinblock dient dabei der Unterstützung der Gewebestruktur, ermöglicht die Anfertigung sehr dünner Schnittpräparate des Gewebes und das Aufbringen der Schnittpräparate auf einen Objektträger für eine anschließende Untersuchung, beispielsweise eine mikroskopische Untersuchung. Der Begriff „histologisches Schnittpräparat“ umfasst ein Schnittpräparat, das Gewebe enthält, das beispielsweise durch eine Biopsie erhalten wurde.

Paraffin ist ein Gemisch aus gesättigten azyklischen Kohlenwasserstoffen mit der allgemeinen Summenformel C_nH2n+2, wobei die Zahl n zwischen 18 und 32 liegt. Paraffin ist leichtflüssig, ölig oder wachsartig, und gegenüber vielen Chemikalien reaktionsträge. Paraffin wird in der Histologie als Einbettungsmittel für histologische Präparate eingesetzt. Bei einer Wellenlänge von 300 nm oder höher ist Paraffin gut lichtdurchlässig (Li et al. 2015). Im sehr kurzwelligen Bereich (nahe 200 nm und darunter) wird Paraffin undurchlässig auch bei sehr dünner Schichtdicke.

Der Begriff „Extinktion“ beschreibt die Verminderung einer Strahlung wie beispielsweise eines Lichtstrahls auch „Lichtquelle“ genannt, bei Durchtritt durch ein Medium, wie beispielsweise einen Paraffinschnitt. Dabei charakterisiert der Extinktionskoeffizient die Stärke der Wechselwirkung der Strahlung mit dem Medium. Er ist eine von der Wellenlänge der einfallenden Strahlung abhängige Stoffkonstante. Die Extinktion ist der Gesamteffekt der Abschwächung und teilt sich auf in die Komponenten Reflexion, Absorption, Streuung und Beugung. Die Abschwächung der Intensität entlang des Weges durch das Medium ist proportional zum Absorptionskoeffizienten des durchstrahlten Materials und dessen Dicke. Daraus ergibt sich das Lambert-Beersche Gesetz.

Das Lambert-Beersche-Gesetz beschreibt die Abschwächung der Intensität einer Strahlung in Bezug zu deren Anfangsintensität bei dem Durchgang durch ein Medium mit einer absorbierenden Substanz in Abhängigkeit von der Konzentration der absorbierenden Substanz und der Schichtdicke des Mediums. Absorbierende Substanzen können beispielsweise Paraffin, natürliche in histologischen Präparaten enthaltene Pigmente wie Melanin oder zur Färbung von histologischen Präparaten verwendete Farbstoffe sein. Absorbierende Substanzen können auch Farbstoffe oder Mischungen von Farbstoffen sein, welche in Form einer Kalibrierstanze in den Probenblock, Eichblock oder Kalibrierblock eingebracht werden. Vorzugsweise absorbieren diese Farbstoffe in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm, besonders vorzugsweise im Bereich 300 bis 800 nm. Farbstoffe, die in diesem Bereich absorbieren umfassen beispielsweise Anthrachinone (beispielsweise Alizarin und Karmin), Azofarbstoffe (beispielsweise Anilingelb und Kongorot), Dioxazinfarbstoffe (beispielsweise Siriuslichtblau und Carbazolviolett), Indigoide Farbstoffe (beispielsweise Indigo und Indirubin), Formazanfarbstoffe (beispielsweise Reactive Blue 235), Methinfarbstoffe (beispielsweise ß-Carotin, Lycopin und Basic Red 12), Nitro- und Nitrosofarbstoffe (beispielsweise Acid Orange 3 und Acid Green 1).

Es gibt mehrere Varianten der Notation des Lambert-Beerschen-Gesetzes. Eine davon ist: wobei I_o die Intensität des einfallenden Lichtstrahls, ^die Intensität des transmittierten Lichtes, (A) der wellenlängenabhängige Absorptionskoeffizient oder Extinktionskoeffizient, c die Stoffmengenkonzentration der absorbierenden Substanz und d die Dicke des durchströmten Mediums ist. Das Lambert-Beersche Gesetz kann für beliebige Wellenlängen A aufgestellt werden, um die spezifische Absorption des Lichts dieser Wellenlänge mit der Intensität /₀(A) zu berechnen, die zur Intensität des transmittierten Lichtes ^(A) führt.

Der Begriff „Reflexion“ beschreibt die Zurückwerfung der Strahlung beim Auftreffen auf die Grenzfläche zwischen zwei verschiedenen Medien. Die Reflexion ist somit ein Phänomen, das an Oberflächen auftritt und zeigt keine Abhängigkeit von der Schichtdicke eines Schnittpräparates. Der Begriff „Absorption“ beschreibt die Aufnahme von Strahlung durch ein Medium und ist reziprok zur Transmission, die die relative optische Durchlässigkeit eines Mediums beschreibt. Die Absorption ist abhängig von der Wellenlänge der Strahlung und dem Medium. Der Begriff „Streuung“ auch „Lichtstreuung“ genannt, beschreibt die Zerteilung eines Lichtstrahles durch Unregelmäßigkeiten in einem durchlässigen Medium, wie beispielsweise Atome, Moleküle, Bakterien oder T röpfchen in einer Emulsion oder im Nebel. Je nach Art, Form und Größe des streuenden Objektes wird die gestreute Lichtintensität unterschiedlich im umgebenden Raum verteilt. Dadurch wird die gerade durch ein Medium durchtretende Strahlung abgeschwächt. Diese Abschwächung der Strahlung wird im Rahmen einer Extinktionsmessung eines Mediums gemeinsam mit den Effekten der Absorption, Reflexion und Beugung gemessen. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Effekte der Reflexion und Beugung bei Durchtritt durch ein Schnittpräparat zu vernachlässigen und die Extinktionsmessung basiert im Wesentlichen auf der Messung von Streuung und/oder Absorption. Geräte für die Messung der Extinktion umfassen beispielsweise Turbidimeter, Nephelometer, Spektrometer wie UV/VIS-Spektrometer oder Infrarotspektrometer und sind einem Fachmann bekannt. Im Kontext von Durchlichtmessungen bei Flüssigkeiten wird vom Fachmann auch der Begriff Turbidimetrie verwendet, der von der Nephelometrie (Streulichtmessung) abgegrenzt wird. In der vorliegenden Erfindung werden für die Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates vorzugsweise die Prinzipien der Turbidimetrie verwendet, während die Prinzipien der winkelabhängig aufgelösten Nephelometrie vorzugsweise für weitere Hinweise auf die räumliche Verteilung von Konzentrationen (beispielsweise in Dickenrichtung des Schnittes) genutzt werden können.

Der Begriff „Lichtquelle“ umfasst ein physikalisches System, das elektromagnetische Strahlung vom Röntgen- bis zum infraroten Bereich aussendet, üblicherweise in einem begrenzten Spektralgebiet. Übliche Lichtquellen, die beispielsweise für Extinktionsmessungen wie Streuungs- und/oder Absorptionsmessungen verwendet werden können, umfassen ohne Einschränkung Kontinuumstrahler wie Halogen-Lampen und Xenon-Lampen, Linienstrahler wie Cadmium- und Quecksilber-Lampen, Leuchtdioden (LEDs), Leuchtstoffröhren und Laser.

Der Begriff „Kalibrierung“ umfasst die Messung eines Präparates beziehungsweise einer Probe bekannter Eigenschaft mittels eines Verfahrens beziehungsweise einer Messmethode, um dieses Verfahren für die Bestimmung dieser Eigenschaft bei einem Präparat mit unbekannter Eigenschaft zu verwenden. Die zu bestimmende Eigenschaft kann dabei beispielsweise die Konzentration einer bestimmten Substanz in dem Präparat oder die Schichtdicke des Präparates umfassen. Die zu bestimmende Eigenschaft kann außerdem beispielsweise Konstanten im mathematischen Modell zur Auswertung der Messdaten umfassen. Das für die Kalibrierung verwendete Präparat mit bekannter Eigenschaft wird als „Kalibrierpräparat“ oder „Eichpräparat“ bezeichnet und die anhand dieses Kalibrierpräparates oder Eichpräparates gemessenen Werte als „Kalibrierwerte“. Anhand dieser Kalibrierwerte können aus den mittels des Verfahrens erhaltenen Werte eines Präparates mit unbekannter Eigenschaft die Eigenschaften wie beispielsweise die Konzentration einer bestimmten Substanz ermittelt und errechnet werden.

Der Begriff „Kalibrierkurve“ auch „Standardkurve“ genannt umfasst dabei eine mathematische Beziehung beziehungsweise Korrelation mehrerer ermittelter Kalibrierwerte, die beispielsweise durch Messung mehrerer bekannter Konzentrationen eines Präparates oder Messung der Streuung und/oder Absorption verschiedener Präparate mit bekannter Schichtdicke ermittelt wurden. Diese Kalibrierkurve kann für die Bestimmung der Eigenschaften eines Präparates mit unbekannter Eigenschaft mittels des Verfahrens, das für die Erstellung der Kalibrierkurve verwendet wurde, verwendet werden. Dabei umfasst die Kalibrierkurve üblicherweise Messwerte im für die Probe oder das Präparat mit unbekannten Eigenschaften zu erwartenden Bereich.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Modellierung“ die mathematische Repräsentation (Berechnung) der Eigenschaften eines Präparates mit unbekannter Eigenschaft basierend auf einer oder mehreren Kalibrierkurven für diese Eigenschaft. Dabei werden die Kalibrierwerte bereitgestellt, eine oder mehrere Kalibrierkurven erstellt, die für ein Präparat mit unbekannten Eigenschaften gemessenen Werte mit den Kalibrierkurven verglichen und ein entsprechender Wert für die ungenannte Eigenschaft dieses Präparats anhand der Kalibrierkurven berechnet. Außerdem kann „Modellierung“ die Anwendung zusätzlicher mathematischer Formeln, welche physikalische Zusammenhänge beschreiben, wie beispielsweise das Lambert-Beersche Gesetz, beinhalten.

Anhand der Modellierung kann in der vorliegenden Erfindung ein Korrekturfaktor für eine Probe berechnet werden. Ein Korrekturfaktor ist eine in eine Rechnung eingeführte Größe, die notwendig ist, um den Einfluss einer bestimmten Größe oder eines bestimmten Effektes auszugleichen, der die Berechnung anderenfalls verfälschen oder beeinflussen würde. In der vorliegenden Erfindung wird ein Korrekturfaktor basierend auf der tatsächlichen Schichtdicke eines Schnittpräparates berechnet. Dieser Korrekturfaktor für die Schichtdicke wird in die Berechnung der Konzentration einer Zielsubstanz in dem Präparat verwendet, um den Einfluss der Schichtdicke auf die Farbintensität der Färbung, auf der die Konzentrationsberechnung beruht, auszugleichen.

Der Begriff "histologisches Färben" bezieht sich auf die Verwendung histochemischer Farbstoffe zur Behandlung von Gewebeschnitten (vorzugsweise in Paraffin eingebettet oder gefroren). Die histologische Färbung kann auch einen oder mehrere weitere Zwischenschritte enthalten, wie beispielsweise die Zugabe eines Enzyms. Die Immunhistochemie ist eine spezielle Form der Färbung, bei dem das Zielprotein in einem Zwischenschritt mit einem Antikörper markiert wird; ein zweiter Antikörper bindet an den ersten und ist z. B. mit Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt oder einem Enzym, welches sekundär die Farbe aus einem speziellen Substrat erzeugt. Hierbei sind für eine Vielzahl an Proteinen kommerzielle Antikörper verfügbar, weicher ein Fachmann entsprechend auswählen kann. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe "histologische Färbung", "histochemische Färbung" und „immunhistochemische Färbung“ synonym verwendet. Schnittpräparate werden für eine histologische Untersuchung in der Regel angefärbt, um strukturelle Merkmale des Gewebes zu färben und den Gewebekontrast zwischen strukturellen Merkmalen zu erhöhen. Dabei können durch gezielte Auswahl des Farbstoffes bestimmte Zielstrukturen und Zielsubstanzen angefärbt werden. Für die Histologie relevante Zielsubstanzen umfassen dabei ohne Einschränkung Proteine wie Zellrezeptoren (z.B. Östrogenrezeptoren, Progesteronrezeptoren, Her2neu und c-Myc) und weitere intra- und/oder extrazellulär auftretende Proteine (z.B. das Ki67 und PSA) oder andere Bestandteile wie Nukleinsäuren, Schleimsubstanzen und Lipide. Typische histochemische Färbungen umfassen beispielsweise die Färbung von Cytochrom-c-Oxidase, ATPasen und NADH.

Übliche histologische Färbungen umfassen ohne Einschränkung die Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (HE-Färbung), Azokarmin und Anilinblau (Azan-Färbung), Resorcin, Fuchsin und Orcein (Elastica-Färbung), Azur, Eosin und Methylenblau (Giemsa-Färbung), Eisenhämatoxylin, Pikrinsäure und Säurefuchsin (van Gieson-Färbung), Eisenhämatoxylin und Lichtgrün (Trichromfärbung nach Masson-Goldner), Eisenhämatoxylin (Färbung nach Weigert), Eisenhämatoxylin (nach Heidenhain, EH-Färbung), Silberionen (Golgi-Färbung), Kupferphthalocyanin (Luxol Fast Blue Färbung), Kresylviolett, Toluidinblau oder Thionin (Nissl- Färbung), Hämatoxylin nach Harris, Orange G und Polychromlösung (Papanicolaou-Färbung), Perjodsäure (PAS-Färbung), Siriusrot (Pikro-Siriusrot-Färbung) und Silber (Wartin-Starry- Färbung). Weitere Farbstoffe, die alleine oder in Kombination und in Kombination mit weiteren Chemikalien zu histologischen Färbung verwendet werden können umfassen ohne Einschränkung Alizarin, Viktoriablau B, Acid Red 88, Eosin, Säurefuchsin, Kongorot, Safranin, basisches Fuchsin, Kristallviolett, Methylenblau, Hämatoxylin, Kernechtrot, Ethylgrün, DRAQ5TM, DRAQ7TM, Nuclear Yellow (Hoechst S769121), Nuclear Green DCS1 , Hoechst, DAPI, Propidiumiodid, Acid Fast Bacteria-Färbung, Alcianblau (pH 1.0), Alcianblau (pH 2.5), Alizarinrot, kolloidales Eisen, Hydroxystilbamidin, Berliner Blau, Oil Red O, Safranin O stain, Sudanschwarz B und Toluidinblau.

Der Begriff „Farbintensität“ auch "Signalintensität" genannt bezieht sich auf die Stärke des messbaren Ausgangssignals, das die Konzentration des an eine beliebige Region eines Gewebeschnitts gebundenen Farbstoffs widerspiegelt, z. B. eine zytoplasmatische Region einer Zelle, eine Kernregion einer Zelle, eine interstitielle Region oder eine leere Region. Die Farbintensität kann beispielsweise mittels allgemein bekannter Bildbearbeitungsprogramme als Helligkeitswert beziehungsweise Tonwert, welches der Helligkeitswert eines Bildpixels in einem Farbkanal ist, bestimmt werden.

Der Begriff „Eichpräparat“ oder „Vergleichspräparat“ betrifft ein Schnittpräparat, dass eine bekannte Konzentration einer Zielsubstanz enthält und für die Erstellung einer Kalibrierkurve oder Eichkurve verwendet werden kann, welche beispielsweise eine gemessene Farbintensität mit der bekannten Konzentration der Ziel-Substanz korreliert. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Eichpräparate aus Gewebe, Zellen oder Substanzen hergestellt werden, die nachweislich die Zielsubstanz enthalten. Die Konzentration der Zielsubstanz kann beispielsweise mittels der in der klinischen Chemie üblichen Methoden, wie beispielsweise ELISA oder Massenspektrometrie ermittelt werden. Basierend auf der bekannten Substanzkonzentration können durch Verdünnung verschiedene Konzentrationen im passenden Konzentrationsbereich hergestellt werden. Die Klinische Chemie verwendet standardmäßig nur flüssige Proben. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das verflüssigte Gewebe verfestigt und als Vergleichspräparat (Eichpräparat) verwendet. Die Eichpräparate werden dabei in Form von Zellblöcken auch „Eichkegel“ genannt, in denen das Gewebe, die Zellen oder die Substanzen in definierter Konzentration in einem Gel gebunden sind, hergestellt. Einer oder mehrere dieser Zellblöcke unterschiedlicher Konzentrationen können anschließend in eine Matrix wie beispielsweise Paraffin in einen sogenannten Eichblock eingebettet werden. Durch die Einbettung in eine Matrix liegen die Zellblöcke in verschiedenen Konzentrationen im Eichblock räumlich getrennt vor. Ein Eichblock kann auch durch Einspritzen eines Zielproteins in Form einer Lösung enthaltend eine definierte Konzentration des Zielproteins in einen oder mehrere Eichkegel hergestellt werden. Das Zielprotein kann dabei ein aus einem Gewebe isoliertes und/oder ein rekombinant hergestelltes Protein sein. Das Protein wird durch anschließende Lagerung des Eichkegels in Formalin und Einbettung in Paraffin verfestigt. Ein Eichblock kann mittels eines Mikrotoms geschnitten werden und in der vorliegenden Erfindung als Eichpräparat verwendet werden. In einen Eichblock können eine oder mehrere Kalibrierstanzen eingebracht sein, welche absorbierende Substanzen wie Farbstoffe oder Mischungen von Farbstoffen enthalten. Ein aus einem solchen Eichblock hergestelltes Eichpräparat kann somit Kalibrierstanzen enthalten, welche absorbierende Substanzen wie Farbstoffe oder Mischungen von Farbstoffen enthalten.

Der Begriff „Kalibrierpräparat“ betrifft ein Schnittpräparat, welches eine bekannte Schichtdicke aufweist, kein Gewebe enthält und für die Erstellung einer Kalibrierkurve verwendet werden kann, welche beispielsweise Werte, die durch Streuung und/oder Absorption gemessen wurden, mit der bekannten Schichtdicke korreliert. Vorzugsweise weist ein Kalibrierpräparat eine bekannte Schichtdicke von 0,1 bis 10 pm auf. Ein Kalibrierpräparat kann aus einem Kalibrierblock hergestellt werden, welcher mittels eines Mikrotoms geschnitten wird. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Kalibrierblock ein Paraffinblock, welcher kein Gewebe enthält. In den Kalibrierblock können eine oder mehrere Kalibrierstanzen eingebracht sein, welche absorbierende Substanzen wie Farbstoffe oder Mischungen von Farbstoffen in einem Trägermaterial enthalten. Ein aus einem solchen Kalibrierblock hergestelltes Kalibrierpräparat kann somit Kalibrierstanzen enthalten, welche absorbierende Substanzen wie Farbstoffe oder Mischungen von Farbstoffen enthalten. Eine solche Kalibrierstanze kann ein Trägermaterial enthalten, welches sich bei der Färbung und/oder Fixierung des histologischen Schnittpräparates auflöst und/oder Material enthalten, welches sich bei der Färbung und/oder Fixierung des histologischen Schnittpräparates nicht auflöst.

Ein Objektträger ist ein Gegenstand auf dem Objekte und Präparate wie beispielsweise Schnittpräparate aufgebracht werden können und mikroskopisch betrachtet werden können. Für Objektträger verwendete Materialien umfassen Kalk-Natron-Glas, Quarzglas oder Kunststoffe wie Polystyrol. Vorzugsweise bestehen die Objektträger der vorliegenden Erfindung aus Quarzglas.

Der Begriff „Sensor“ auch als „Detektor“ bezeichnet, umfasst eine Vorrichtung, die bestimmte physikalische oder chemische Eigenschaften (z. B. die Helligkeit, die Extinktion, die Absorption, die Streuung eines Lichtstrahls) und/oder die stoffliche Beschaffenheit seiner Umgebung qualitativ oder als Messgröße qualitativ und/oder quantitativ erfassen kann. Diese Größen werden mittels physikalischer, chemischer oder biologischer Effekte erfasst und in ein weiterverarbeitbares Signal wie beispielsweise ein elektrisches Signal oder ein Bild umgeformt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Sensor ein Lichtsensor wie beispielsweise eine Photodiode, eine Kamera oder ein Scanner sein.

Der Begriff „digitaler Scan“ umfasst die Erzeugung eines Bildes des Schnitt-, Eich oder Kalibrierpräparates mittels eines Scanners. Das Bild weist in allen Abschnitten eine Helligkeit mit gleichem Weißabgleich auf und wird nach einem standardisierten Verfahren für alle Präparate gleich aufgenommen. Der erzeugte digitale Scan kann für die Analyse der Helligkeitswerte beziehungsweise Tonwerte beispielsweise durch Verwendung eines dem Fachmann bekannten Fotobearbeitungsprogrammes oder für eine automatisierte Auswertung verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst in einigen Ausführungsformen eine Recheneinheit für die Modellierung beziehungsweise Verwendung der Modellierung. Die Recheneinheit ist vorzugsweise ein herkömmliches Computergerät mit einem Prozessor, einem Eingabegerät wie einer Tastatur oder einer Maus, einem Speicher wie einer Festplatte und einem flüchtigen oder nichtflüchtigen Speicher und einem Computercode (Software). Der Computer kann auch eine programmierbare Leiterplatte, einen Mikrocontroller oder eine andere Vorrichtung zum Empfangen und Verarbeiten von Datensignalen umfassen, wie sie von den lokalen Steuerungen, programmierbaren Fertigungsanlagen, programmierbaren Materialhandhabungsanlagen und Robotermanipulatoren empfangen werden. Die Vorrichtung kann ein Computergerät umfassen, das mit dem erforderlichen Computercode oder der erforderlichen Software vorgeladen ist, welche die erfindungsgemäßen Schritte der Modellierung durchführt. In bestimmten Ausführungsformen können mehrere Clients wie Desktop-, Laptop- oder Tablet-Computer an einen Server angeschlossen werden, so dass beispielsweise mehrere Benutzer die erfindungsgemäße Modellierung gleichzeitig verwenden können. Das Computersystem kann auch mit anderen Computern über ein lokales Netzwerk (LAN) oder über eine Internetverbindung vernetzt sein. Das System kann auch ein Sicherungssystem umfassen, das eine Kopie der erfindungsgemäß gewonnenen Daten aufbewahrt.

Als „Korrekturfläche“ wird eine mathematische Flächenfunktion bezeichnet, die verwendet wird, um das Höhenprofil (lokal unterschiedliche Höhen im Paraffin und im eingebetteten Gewebe) zu korrigieren. Korrigieren bedeutet in diesem Kontext, dass eine einheitliche Schichtdicke (oder äquivalente Schichtdicke) an jedem Ort im Schnitt (sowohl in den Kalibrierstanzen als auch in den Bereichen des Präparates, welche Gewebe enthalten) erreicht wird. Dies ermöglicht die spätere Umwandlung der örtlich bestimmten Farbwerte (beispielsweise in einem digitalen Scan des Schnittpräparates) in Konzentrationswerte der Zielsubstanz.

Die Komponenten des Computergerätes und des Computercodes können konventionell sein, obwohl das Computergerät und der Computercode für jede spezielle Implementierung individuell konfiguriert wird. Der Computercode kann auf jeder beliebigen Architektur laufen, z. B. auf Personal-ZMikrocomputern, Minicomputern, Mikrocontrollern oder Großrechnersystemen. Beispielhafte Betriebssysteme sind Apple Mac OS X und iOS, Microsoft Windows und UNIX/Linux, SPARC-, POWER- und Itanium-basierte Systeme sowie die z/Architektur. Der Computercode zur Durchführung der Erfindung kann in einer beliebigen Programmiersprache oder einer modellbasierten Entwicklungsumgebung geschrieben werden, wie z. B. C/C++, C#, Objective-C, Java, Basic/VisualBasic, MATLAB, Simulink, StateFlow, Lab View oder Assembler, ohne darauf beschränkt zu sein. Der Computercode kann Unterprogramme enthalten, die in einer proprietären Computersprache geschrieben sind, die spezifisch für den Hersteller einer Leiterplatte, eines Controllers oder einer anderen Computer-Hardwarekomponente ist, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet wird.

In bestimmten Ausführungsformen kann die Recheneinheit Verstärkungselektronik für das Ausgangssignal einer Photodiode in Form eines Transimpedanzverstärkers enthalten, welcher in Form eines integrierten Schaltkreises (Integrated Circuit) auf einer Platine realisiert ist. In weiteren Ausführungsformen kann das Messsignal mit einem Mikrocontroller (beispielsweise Arduino) ausgelesen und verarbeitet werden. In weiteren Ausführungsformen kann das Messsignal in einem Mikrocontroller aufbereitet und dann in einem angeschlossenen Computergerät weiterverarbeitet werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann eine menschliche Aufsichtsperson anwesend sein, um die Modellierung zu überwachen und etwaige Fehler oder Störungen zu beheben. In bevorzugten Ausführungsformen der automatisierten oder halbautomatisierten Ausführung des Verfahrens ist die Aufsichtsperson jedoch nicht wesentlich an dem Verfahren beteiligt, das über die Vorbereitung und Anbringung eines Objektträgers an der mikroskopischen Ausrüstung hinausgeht, und muss daher nicht routinemäßig in die computerimplementierten Aspekte der Erfindung eingreifen.

REFERENZEN

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Nguyen, David. "Quantifying chromogen intensity in immunohistochemistry via reciprocal intensity." (2013).

Choudhury, Kingshuk Roy, et al. "A robust automated measure of average antibody staining in immunohistochemistry images." Journal of Histochemistry & Cytochemistry 58.2 (2010): 95-107.

Jensen, Kristian, et al. "A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2." Modern Pathology 30.2 (2017): 180-193.

Li, Dong, et al. „Optical properties of a liquid paraffin-filled double glazing unit“ Energy and Buildings 108 (2015) 381-386.

Matenaers et al., Practicable methods for histological thickness measurement in quantitative stereological analyses, PLoS ONE 13 (2), 2018, S- 1-21 ; e0192879.

FIGUREN

Die Erfindung soll im Folgenden anhand der Abbildungen und Beispiele näher erläutert werden.

Die Abbildungen und Beispiele beschränken den Umfang der Erfindung nicht, sondern stellen bevorzugte Ausführungsformen der Aspekte der Erfindung dar, die der Veranschaulichung dienen.

Abb.1 : Gewebe mit natürlichem Gewebspigment (Melanin/Eisen), das mittels Mikrotom in unterschiedlicher Schichtdicke geschnitten wurde (A) 1 pm, (B) 3 pm, (C) 5 pm und (D) 7 pm.

Abb.2: Transmissionskurve (Transmittance) von flüssigem Paraffin gemessen bei verschiedenen Schichtdicken, in Abhängigkeit von der Wellenlänge (nach Li et al. 2015) (Stand der Technik).

Abb. 3: Messsignal (in mV) nach Durchtritt von UV-C (A = 260 nm) durch gewebefreie Paraffinschnitte in Abhängigkeit von der Schnittdicke in pm (p) (Durchschnitt aus mehreren Messungen), O=Leerwert (nur Glas).

Abb. 4: Messung der Streuung eines roten Lasers (650 nm) durch gewebefreie Paraffinschnitte als zentrale Helligkeit im Projektionsfoto in Abhängigkeit von der Schnittdicke in pm (p), links Leerwert (Schichtdicke 0, nur Glas), ganz links Schwarzwert (dunkelster Abschnitt des Fotos ohne Laser) als Durchschnittswerte aus mehreren Messungen (n > 6).

Abb.5: (A) bis (E) Gegenüberstellung der Messkurven (Streuung) bei unterschiedlichen Wellenlängen, aufgetragen gegen die Schnittdicken 1 , 3, 5 und 7 pm (p) (Leerwert = 0) eines gewebefreien Paraffinschnittes: (A) Infrarot (direkte Messung Foto), (B) rot (zentrale Helligkeit im Projektionsfoto), (C) blau (zentrale Helligkeit im Projektionsfoto), (D) violett (zentrale Helligkeit im Projektionsfoto) und (E) UV-C Durchlässigkeit (Sensor, in mV). (Das Maximum liegt mit Ausnahme der Messung im UV-C Bereich bei 3 pm. Im Vergleich von 1 pm und 5 pm ist eine Verschiebung des Maximums in Richtung 1 pm im Infrarotbereich und in Richtung 5 pm im violetten Wellenlängenbereich erkennbar, veranschaulicht durch eine Gerade. Der Neigungswinkel der Gerade ist in (F) gegen die Wellenlänge aufgetragen und zeigt eine eindeutige monotone Beziehung.

Abb.6: Verläufe mit zugehörigen Fitting-Funktionen. TW bezeichnet hierbei Tonwerte TW_t e [0; 255] und U die gemessene Spannung.

Abb.7: Beispielmesswerte für die Dicke von 5 pm. Hervorgehoben sind vom Algorithmus erkannte plausible Dicken im jeweiligen Verlauf (in pm). Als Kreuz markiert ist die Übereinstimmungsspanne zwischen allen Verläufen. Der Mittelwert daraus wird als Ausgabewert bestimmt.

Abb.8: Beispiele für die Messung der Farbintensität. Ausschnittfotos eines Schnittscans mit Histogramm. Immunhistochemie für Melan A (rotes Farbsubstrat im Positivbild), hier das Umkehrbild, an dem der Helligkeitswert im entsprechenden grünen Farbkanal ermittelt wird. Schnittdicke A 7 pm, B ca. 3 pm Schichtdicke. Die höhere Schichtdicke zeigt eine entsprechend höhere Farbintensität.

Abb.9: (A) Eichkegel mit verflüssigtem Gewebe (Hirn), welches standardisiert verdünnt, in Gel wieder verfestigt und in Paraffin eingebettet wurde. Für jeden Block wurde in einem Parallelansatz die Konzentration des Zielproteins (S100) in der Klinischen Chemie ermittelt. (B) Neu-Zusammensetzung dieser Eichkegel in verschiedenen Konzentrationen C1 bis C3 in einen neuen gemeinsamen Eichblock (Schema).

Abb.10: Schema eines Objektträgers 1 welcher für die Schichtdickenmessung und Bestimmung der Konzentration einer Zielsubstanz in einem Schnittpräparat 3 verwendet werden kann. Im Kontrollbereich 2 wird ein Schnitt eines Eichblockes (Eichpräparat) aufgebracht, welcher Eichkegel (A- D) enthält, welche jeweils eine bestimmte Konzentration der bestimmenden Ziel- Substanz enthalten. Im mittleren Bereich des Objektträgers wird das Schnittpräparat 3 aufgebracht, welches eine Gewebeprobe 4 umfasst. Im Schnittpräparat 3 und im Eichpräparat können Kalibrierstanzen 7 eingebracht sein. Im Datenfeld 6 können Informationen zur Identifizierung beispielsweise der Probe und der Färbung aufgebracht werden. Der Objektträger wird in die erfindungsgemäße Vorrichtung eingeführt. Anschließend wird in den dunkelgrau markierten Bereichen und/oder in den Bereichen der Kalibierstanzen 7 die Messung der Schichtdicke durchgeführt. Im Bereich des Schnittpräparates wird hierbei in einer bevorzugten Ausführungsform eine Messung an vier Messpositionen 5 durchgeführt.

Abb. 1Abb.11 : (A) Eichkurve, erstellt anhand der Tonwerte, die für die Eichblöcke ermittelt wurden, die eine eindeutige Zuordnung jedes Tonwertes zu einer Konzentration zulässt (die Konzentrationen wurden parallel in gleicher Verdünnungsreihe in der klinischen Chemie ermittelt). x-Achse: Verdünnungsreihe (10x10'^x) (B) Umkehrbild der Immunhistochemie für SWO der Patientenprobe auf dem gleichen Schnitt. Durch die Eichkurve und individuelle Kalibrierung kann jedem Bereich des Bildes eine Konzentration von S100 zugeordnet werden. (C) zeigt die Messwerte, die für zwei nebeneinander liegende T umorzellen eines malignen Melanoms (Metastase) ermittelt wurden. Für die Messung wird mindestens ein Bildpixel benötigt, idealerweise aber mehrere.

Abb.12: Schnitt eines Eichblocks (Eichpräparat) enthaltend drei unterschiedlich konzentrierte Eichkegel von Hirngewebe, gefärbt mit einer Immunhistochemie für S 100 (braune Farbreaktion).

Abb.13: Korrelation des in einem digitalen Scan des Eichpräparates gemessenen Tonwertes (Umkehrbild, blauer Farbkanal) mit der in den Eichkegeln enthaltenen S100- Proteinkonzentration.

Abb.14: Die Mittelwerte der an den vier Messpositionen („Nord“, „Ost“, „Süd“ und „West“) gemessenen Werte (Streuung und Absorption) zeigen konstant abnehmende Messwerte (y- Achse, in % vom interpolierten Leerwert) in Abhängigkeit von der Wellenlänge (infrarot, rot, blau und violett) und der Schichtdicke in pm (x-Achse).

Abb.15: Schnittserie (1-7 pm) eines Paraffinblocks enthaltend eine Kugel aus gefärbtem Wachs mit bekannter Farbkonzentration (z.B. rot), aus der auch die Kalibrierstanzen gewonnen werden. Hierbei ist bereits mit bloßem Auge erkennbar, dass die Farbdichte mit der Schnittdicke zunimmt.

Abb.16: Abhängigkeit der Farbintensität (Helligkeitswert, auch bezeichnet als Tonwert) der unter Abb. 15 beschriebenen Kugeln aus Wachs von der Schichtdicke der Schnittserie in pm (p) (1-7 pm, Umkehrbild, grüner Farbkanal). Abb.17: Ungefärbte Paraffin schnitte unterschiedlicher Dicke (oben (Eichpräparat) von links nach rechts 7, 5, 3, 1 pm; unten (Schnittpräparat) 1 , 3, 5, 7 pm) mit darin enthaltenen, mitgeschnittenen Eichstanzen.

Abb.18: Aus der Test-Schnittserie (1 , 3, 5 und 7 pm) erstellte Standardkurven (Mittelwerte verschiedener Messungen) jeweils für verdünntes (rechts) und unverdünntes (links) Wachs.

Abb.19: Färbung der Test-Schnittserie mittels Immunhistochemie für S 100. Oben jeweils Tumorgewebe, unten Eichblöcke (eingestellte Schnittdicke des Mikrotoms auf dem Objektträger eingezeichnet).

Abb.20: Kalibrierungskurven: Links die Kalibrierung des Eichpräparates, rechts für das Schnittpräparat (Tumorprobe) nach Korrektur des Schnittdickenunterschiedes zwischen Eichpräparat und Schnittpräparat.

Abb.21 : Ist eine Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung in einer isometrischen Ansicht. Die Vorrichtung umfasst Formgebungsstruktur 8 (Gehäuse), in welche eine Lichtquelle 9 (beispielsweise eine Leuchtdiode) und ein Sensor 11 (beispielsweise eine Photodiode) in sich gegenüberliegenden Positionen eingebracht werden können. Zwischen Lichtquelle 9 und dem Sensor 11 kann der Objektträger 1 , auf welchem ein Schnittpräparat und/oder ein Eichpräparat oder ein Kalibrierpräparat aufgebracht sind so eingebracht werden, dass der von der Lichtquelle 9 ausgehende Lichtstrahl durch den Objektträger 1 geleitet wird und die Streuung und/oder Absorption des Lichtstrahls durch den Sensor 11 gemessen werden kann.

Abb.22: Ist eine Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Draufsicht. Die Vorrichtung umfasst eine oder mehrere Blenden 12 (Position der Blenden angezeigt, Blenden selbst in der Abbildung nicht dargestellt), welche in die Formgebungsstruktur 8 eingebracht werden können, um einen Lichtstrahl ausgehend von der Lichtquelle 9 (in der vorliegenden Abbildung nicht dargestellt, in Abbildung 23 dargestellt) auf eine oder mehrere bestimmte Positionen des Objektträgers 1 , auf welchem ein Schnittpräparat und/oder ein Eichpräparat oder ein Kalibrierpräparat aufgebracht sind, einzugrenzen und so die Streuung und/oder Absorption des Lichtstrahlt durch das Schnittpräparat, Eichpräparat oder Kalibrierpräparat zu messen.

Abb.23: Ist eine Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung in der Vorderansicht. Die Vorrichtung umfasst zudem eine Kamera 13 (Position der Kamera dargestellt, Kamera selbst nicht dargestellt), welche die Durchleuchtungsposition des Objektträgers 1 durch die Lichtquelle 9 aufnehmen kann und verwendet wird um die Positionierung der einen oder mehreren Blenden 12 zwischen der Lichtquelle 9 und dem Objektträger 1 und dem Sensor 11 und dem Objektträger 1 zu überprüfen und so eine Messung der Streuung und/oder Absorption des Lichtstrahls durch das Schnittpräparat, Eichpräparat oder Kalibrierpräparat, welche auf dem Objektträger 1 aufgebracht sind, an einer oder mehreren bestimmten Positionen zu ermöglichen. Weiterhin kann die Kamera für die Erstellung eines Bildes vom Schnittpräparat oder die Bestimmung weiterer Eigenschaften des Schnittpräparates verwendet werden, beispielsweise für die Bestimmung der Homogenität des Präparates in Form von Messwerten, welche für die Bestimmung der Schichtdicke oder einer Konzentration einer Zielsubstanz in einem Schnittpräparat verwendet werden können. Die Lichtquelle 9 und/oder der Sensor 11 können auf einem Einschub 10 in die Formgebungsstruktur 8 der Vorrichtung eingebracht werden und so vorteilhafterweise durch Entfernen des Einschubes und Einsetzen eines Einschubes, weicher eine andere Lichtquelle (beispielsweise eine Leuchtdiode einer anderen Wellenlänge) umfasst, ausgetauscht werden und so beispielsweise eine Messung bei einer anderen Wellenlänge ermöglichen.

Abb.24: Ist eine Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung in der Seitenansicht. Wie in Abbildung 23 beschrieben, können die Lichtquelle 9 und/oder der Sensor 11 auf einem Einschub 10 in die Formgebungsstruktur 8 der Vorrichtung eingebracht werden und ausgetauscht werden. Dies ermöglicht beispielsweise die Messung der Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat, Eichpräparat oder Kalibrierpräparat, welche auf dem Objektträger 1 aufgebracht sind, bei unterschiedlichen Wellenlängen, durch Austausch der Lichtquelle 9 gegen eine Lichtquelle 9 einer anderen Wellenlänge.

Abb. 25: Bilder des Lascerscan-Mikroskops. (A) Lichtbild vom Rand eines Schnittprärates mit eingezeichneten Höhenprofillinien aus dem 3D-Scan, (B) das ermittelte Höhenprofil, welches entlang des Pfeils vom rechten oberen zum linken unteren Rand erstellt wurde. Dabei wurde eine Schichtdicke von 7,56 pm ermittelt.

Abb. 26: Zusammenfassung der Messwerte aller Höhenprofile der Paraffinschnitte aus der Laserkohärenztomographiemessung, (A) Einzelwerte, (B) Mittelwerte. Erkennbar ist zum einen eine starke Streuung (A) der gemessenen Schnittdicken, zum anderen eine große Abweichung der Mittelwerte (B) nach oben im Vergleich zur Sollschnittdicke (Einstellung des Mikrotoms), insbesondere bei dünnen Schnitten.

Abb. 27.: Ähnlichkeit der Scans. (A) Nach einer Image Registration vom Typ „rigid“ (Translation & Rotation) zum Vergleich der Bilder konnten diese mithilfe von Starrkörper-Transformationen (Verschiebung, Rotation, kein Strecken) übereinandergelegt werden. Anschließend wurden 10 x 8 Messfenster (Quadrate) definiert. (B) Die Farbmesswerte (von 0-250) sind für jeden Farbkanal und jedes Fenster (1-80) eingetragen. Dabei ist erkennbar, dass die Fehlerbalken/Standardabweichungen in jedem Fenster jeweils sehr gering sind.

Abb. 28: (A) Ursprünglicher Scan mit Kalibrierstanzen (Kreise) und Protein-Testsubstanz (Fläche, dunkelgrau). (B) Bestimmung des Farbmittelwerts (ohne Berücksichtigung der weißen umgebenden Fläche) bei Kalibrierstanze oben Mitte.

Abb. 29: (A) Durch die Kalibrierstanzen aufgespannte Korrekturfläche (in Farbwerten) an den jeweiligen Positionen im Schnitt. (B) Falschfarbenbild Korrekturfläche. Abb. 30: (A) Korrigiertes Bild innerhalb der Korrekturfläche (gestrichelte Linie), (B) Sehr stark überhöhte Darstellung zur Veranschaulichung der Unebenheiten und Unterschiede in der Schichtdicke innerhalb des Schnittes.

Abb. 31 : Gewebeaufbereitung (Hirngewebe) mit Histogel, ausgegossen, zerteilt, paraffiniert. (A) Immunhistochemie für S 100: Hohe Homogenität des Materials ohne erkennbare systematische Konzentrationsgefälle; kleine Unregelmäßigkeiten durch Luftbläschen und mutmaßliche Schnittartefakte. (B) Immunhistochemie für NeuN, die punktförmig Nervenzellen markiert, auch hier generell sehr homogene Verteilung.

Abb. 32: Beispiel eines Eichkegels (Gewebeaufbereitung angedickt in definierter Verdünnung, HE-Färbung. Der Eichkegel zeigt eine hohe Homogenität des enthaltenen Gewebes.

Abb. 33: Gewebe (unfixiertes Hirngewebe) nach zweimaligem Passieren durch ein ultrafeines Sieb (400 mesh). Makroskopisch (A) und auch mikroskopisch (B) (HE-Färbung, Schnittpräparat nach Einbettung) sind keine Einzelfragmente mehr abgrenzbar, die Zellkerne (dunkle Punkte) und Fasern (alles weitere dazwischen) erscheinen annähernd homogen verteilt.

Abb. 34: Messwerte der Konzentrationen von S 100 (Klinische Chemie) in Verdünnungsreihen von 3 verschiedenen Ansätzen, die unmittelbar hintereinander von dem gleichen Probenmaterial angefertigt wurden. Die Varianz der Ergebnisse ist sehr gering.

BEISPIELE

Paraffinschnitt

Formalin-fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe wird manuell am Mikrotom geschnitten. Die Schnittdicke wird mechanisch auf eine Dicke zwischen 1 m bis zu 9 pm eingestellt, üblich sind insbesondere 1 bis 5 pm. Beim Schneiden kräuselt sich der Schnitt in der Regel stark Dieser Effekt wird zusätzlich durch das enthaltene Gewebe verstärkt. Nach dem Schneiden wird der Schnitt auf einer Wasseroberfläche gestreckt und von dort auf einen Objektträger übertragen.

Die tatsächliche Schichtdicke weicht in der Regel stark von der eingestellten Schichtdicke ab und hat gleichzeitig einen Einfluss auf die Farbintensität. Dieser Effekt basiert auf der mit der erhöhten Schichtdicke steigenden optischen Dichte des Schnittpräparates und dem Lambert- Beerschen Gesetz. Der Einfluss der Schichtdicke auf die Farbintensität kann bereits in ungefärbten Präparaten anhand der natürlichen Färbung des Gewebes beobachtet werden (Abbildung 1 natürliche Pigmente Hämosiderin und Melanin, Abbildung 15Abb. 1 , histologisch angefärbter Schnitt).

Genauiakeit der am Mikrotom einaestellten Schichtdicke

Zunächst wurde am Testgerät (Mikrotom Leica RM2125 RTS) eine standardisierte Schnittserie von einem lediglich aus Paraffin (ohne Gewebe) bestehenden Testblock angefertigt: Je vier Schnitte mit den am Gerät eingestellten Schnittdicken 0,5 pm, 1 pm, 2 pm, 3 pm, 4 pm, 5 pm, 6 m und 7 pm. Von jedem dieser Schnitte wurde am Rand und in der Mitte jeweils ein ultragenaues Höhenprofil und ein 3D-Scan mit Hilfe eines Laserscanmikroskops (Kohärenztomograph Keyence VK-X1050) angefertigt. Anhand dieser konnte die Höhe des Schnittes am Rand und zentral mit einer Genauigkeit von ca. 0,01 pm gemessen werden. Dabei zeigte sich, dass die Höhe dieses Profils insbesondere bei niedrigen Schnittdicken eine erhebliche Abweichung teils um ein Vielfaches der eingestellten Dicke zeigte (s. Abbildungen 25 und 26). Daraus kann geschlossen werden, dass komplexe Auffaltungen der Paraffinschicht vorliegen.

Bestimmuna der Schichtdicke mittels Streuuna und/oder Absorption

Verqleichsbeispiel - Transmission im UV-C Bereich

Die Transmission beschreibt die relative Durchlässigkeit eines Mediums (hier Paraffin) in Prozent und ist reziprok zur Absorption (Aufnahme einer Strahlung beim Durchtritt durch ein Medium). Diese ist je nach Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung unterschiedlich und wird in Transmissionskurven beschrieben. Abbildung 2 zeigt die Transmissionskurven für Paraffin (nach Li et al. 2015).

Es zeigt sich, dass Paraffin weitestgehend unabhängig von der Schichtdicke ab einer Wellenlänge von 300 nm gut lichtdurchlässig ist. Im sehr kurzwelligen Bereich (nahe 200 nm und darunter) wird Paraffin bei allen gemessenen Schichtdicken lichtundurchlässig. Im Grenzbereich zwischen 200-300 nm besteht hingegen eine starke Empfindlichkeit der Messung (d. h. Variabilität des Messergebnisses bei wechselnder Eingangsgröße) in Abhängigkeit von der Schichtdicke.

Für eine Messung in diesem Wellenlängenbereich wurde eine Schaltung mit einer UV-C empfindlichen Fotodiode gewählt. Als Lichtquelle wurde zunächst eine kommerziell erhältliche UV-C-Leuchtstoffröhre (OSRAM Puritec HNS 5W) verwendet, deren Emissionsspektrum einen starken Peak bei 254 nm zeigt. Zwischen Strahlungsquelle und Sensor wurden Objektträger mit Paraffinschnitten mit am Mikrotom eingestellter Schichtdicke von 1 , 3, 5 und 7 pm, zunächst ohne Gewebeprobe in den Strahlengang eingebracht. Als Leerwert wurde ein Abschnitt des Objektträgers ohne Paraffin gemessen.

Für die Messungen im UV-C Bereich war es erforderlich, hochreines Quarzglas zu verwenden (synthetisches Fused Silica). Für alle übrigen Wellenlängen sind Standard-Objektträger verwendbar.

Die Ergebnisse der Messungen sind Abbildung 3 als Mittelwerte der Extinktion mit UV-C als Strahlungsquelle in mV des Sensors (Sensor-Typ: UVC-T10GM-LA, UV sensor module, 220-280 nm) gezeigt.

Entgegen den Erwartungen zeigte sich keine kontinuierliche Abnahme des Messsignals bei zunehmender Schichtdicke, vielmehr eine Kurve. Das Maximum der Kurve liegt dabei bei einer mittleren Schichtdicke von 5 pm und übersteigt den Leerwert. Dies kann zum einen durch einen möglichen Fluoreszenzeffekt, der bei UV-Strahlung häufig vorkommt, bedingt sein. Bei diesem Fluoreszenzeffekt wird eine Strahlungsemission durch eine ursprünglich kürzere Wellenlänge einer Strahlungsquelle verursacht. Damit erscheint die Emission der Probe stärker, als sie nach der Intensität der eigentlichen Strahlungsquelle zu erwarten wäre (bekannte Effekte bei Signalfarben, Weißmachern oder sogenanntem Schwarzlicht) und kann somit einen Leerwert übersteigen. Weiterhin können Streuungseffekte und Reflexionen in der Messkammer von Bedeutung sein. Als wesentliche Hypothese aus diesen Überlegungen wurde angenommen, dass bei niedriger Schichtdicke neben der Absorption ein zweiter Effekt eine Rolle spielt. Als wahrscheinlichster zweiter Effekt nach der Absorption wurde die Streuung untersucht.

Erfindunasciemäßes Beispiel -Streuung und Absorption

Die Streuung beschreibt die Zerteilung eines Lichtstrahles (Ablenkung von Photonen) durch Unregelmäßigkeiten in einem prinzipiell durchlässigen Medium (beispielsweise Nebel). Ein Paraffinschnitt erscheint mit bloßem Auge trüb und nur schemenhaft durchsichtig. Die Trübung eines Paraffinschnitts kann beispielsweise auf die Bildung von ungleich verteilten Erstarrungsgebieten beim Abkühlen des flüssigen Paraffins und die dadurch auftretenden Übergänge, an denen Streuung stattfindet, erklärt werden. Eine Streuung in einem optischen Medium führt zu einer Verminderung des Bildkontrastes. Helle Lichtpunkte werden daher überdurchschnittlich abgeschwächt. Zunächst erschien eine Laserlichtquelle für die Messung besonders geeignet. Dieser wurde nicht direkt auf einen Sensor gerichtet, sondern auf eine Projektionsoberfläche (matter Fotokarton). Dies hatte den Vorteil, dass auch umgebende Streuungsmuster erfasst werden. Die Projektion wurde standardisiert mit einer Digitalkamera erfasst (gleiche Belichtungsdaten für jedes Foto, keine Belichtungs- oder Empfindlichkeits- Automatik). Die Helligkeit bzw. Abschwächung gegenüber dem Leerwert (Objektträger ohne Paraffinschnitt) wurde als Tonwert des Fotos im entsprechenden Farbkanal (rot, 0-255) erfasst. Basierend darauf wurde die weiter unten beschriebene Vorrichtung entwickelt, bei weicher eine direkte Messung mit Photodioden durchgeführt wird.

Die Methode zeigte eine sehr gute Wiederholbarkeit bei Mehrfachmessung in verschiedenen Abschnitten von Paraffinschnitten und hoch signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Schichtdicken. Es wurde angenommen, dass die Streuung gleichmäßig mit der Schichtdicke zunimmt. Es zeigte sich jedoch analog zur UV-C Messung eine Kurve mit einem Maximum bei mittlerer Schichtdicke von 3 pm (Abbildung 4). Die Schlussfolgerung daraus war, dass die Streuung bei niedrigen Schichtdicken besonders hoch ist und dadurch die Durchlässigkeit bei niedrigen Schichtdicken stärker vermindert und die Kurvenform mit Maximum bewirkt. Zur Aufklärung trugen Mikrotografien und Lasermikroskopie bei: Diese zeigen tatsächlich eine stärkere Faltung des Schnittes bei niedrigen Schnittdicken (nicht gezeigt). Alle Effekte zusammen werden bei der Modellierung berücksichtigt.

Eine weitere Beobachtung war, dass das Maximum der Kurve abhängig von der Wellenlänge der Lichtquelle bei unterschiedlichen Schichtdicken liegt. Während das Maximum bei der Messung im UV-C-Bereich bei 5 pm eingestellter Schichtdicke liegt, lag das Maximum bei rotem Laserlicht (650 nm) bei 3 pm Schichtdicke. Im Folgenden wurden weitere Messungen mit Strahlungsquellen unterschiedlicher Wellenlänge durchgeführt. Verwendet wurden Laser mit blauem (A ca. 450 nm) und violettem Licht (A = 405 nm) und eine Infrarotquelle (A ca. 980 nm) verwendet.

Unterschiede in den Maxima der Kurven bestehen insbesondere zwischen 1 pm und 5 pm Schichtdicke (Abbildung 5). Der 1 pm-Schnitt ergibt im Infrarotbereich deutlich höhere Werte als der 5 pm-Schnitt, bei violetter Lichtquelle (405 nm) ist es umgekehrt. Zur Visualisierung des Effektes wurde eine Gerade zwischen die Messwerte der 1 pm und 5 pm Schnittdicken gezogen, deren Neigungswinkel erfasst und gegen die Wellenlänge der Strahlungsquelle graphisch dargestellt. Hier ist ein eindeutiger und regelmäßiger Effekt erkennbar, der auch bei kleinen Unterschieden-beispielsweise zwischen blauem und violettem Licht - sichtbar wird. Da die Maxima der Kurven weit genug auseinander liegen, kann sowohl durch die Messung bei einer Wellenlänge als auch durch die Kombination der Messung bei verschiedenen Wellenlängen eine eindeutige retrograde Zuordnung zur Schnittdicke in ausreichender Genauigkeit erfolgen. Die Messung bei mehreren Wellenlängen erhöht dabei die Genauigkeit.

Paraffinschnitte mit enthaltenem Gewebe weisen häufig unregelmäßige Strukturen auf. Diese Unregelmäßigkeiten können in Scans ungefärbter Schnittpräparate oder am Lasermikroskop sichtbar gemacht werden. Die Genauigkeit kann hierbei durch eine „Mehr-Positions-Messung“ eines Schnittes an verschiedenen Positionen des Schnittes verbessert werden. Hierfür wurden im Paraffinschnitt, welcher ungefärbtes Tumorgewebe enthält, bei verschiedenen Wellenlängen (infrarot bis violett) an vier definierten Positionen („Nord“, „Ost“, „Süd“ und „West“, s. Abbildung 10) Streuung und Absorption gemessen. Hierbei nahm die Durchlässigkeit, wie bereits zuvor beobachtet, mit steigender Schichtdicke ab. Die Mittelwerte der vier Messpositionen um das Gewebe zeigten dabei eine klare Abhängigkeit von der Wellenlänge und der Schnittdicke (Abbildung 14). Zu beachten ist, dass die Kurve von Paraffinschnitten mit enthaltenem Gewebe einen anderen Verlauf zeigt als ohne enthaltenes Gewebe (kein Maximum), was bei der Eichung zu berücksichtigen ist.

Erfindunospemäßes Beispiel -Absorption

Die Genauigkeit kann zudem durch Einbringen sogenannter „Wachsstanzen“ auch „Kalibrierstanzen“ genannt (Bereiche, welche einen Farbstoff enthalten, welcher im Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm absorbiert) erhöht werden. Hierbei wurden zunächst Kugeln aus gefärbtem Wachs (hier rot) mit bekannter Farbkonzentration in einen neuen Paraffinblock eingegossen. Von solch einem Block wurde eine Schnittserie (1 - 7 pm) angefertigt. Hierbei ist erkennbar, dass die Farbdichte und somit Absorption mit der Schnittdicke zunimmt (Abbildung 15). Die Schnitte wurden gescannt und die Farbdichte als Tonwert (0-255) bestimmt. Hierbei zeigt sich eine klare lineare Abhängigkeit der Werte von der Schnittdicke (Abbildung 16). Durch Einbringen einer oder mehrerer Kalibrierstanzen in ein Schnittpräparat kann somit durch Messung der Absorption in diesen Bereichen die Schichtdicke bestimmt werden. Mittels mehrerer Kalibrierstanzen aus gefärbtem Wachs in verschiedenen Bereichen des Schnittpräparates kann zudem ein Höhenprofil des Schnittes erstellt werden. Mit dieser Information kann für jeden Bereich des Schnittes ein Korrekturfaktor ermittelt werden und der Scan der Färbung nachträglich für jeden Bereich entsprechend korrigiert werden (Abbildungen 28 bis 30).

Skript zur Modellierung der Schichtdicke aus Kalibrierwerten

Zur Auswertung der Schichtdicke aus den erhaltenen Messwerten (Kalibrierwerten) (Streuung und/oder Absorption) wurde ein Auswertungsskript in der Software Matlab entwickelt. Dieses führt ein Fitting jedes einzelnen Verlaufs für verschiedene Lichtwellenlängen mit den Bezeichnungen IR (980 nm), LR (650 nm), LB (450 nm), LL (405 nm) und UV (260 nm) mit einer smoothing spline-Funktion (stückweise Interpolationsfunktion, die jeden Stützpunkt beinhaltet) aus. Die Verläufe sind in Abbildung 6 dargestellt. Dieses Script gilt zunächst für Paraffinschnitte ohne enthaltenes Gewebe.

Die Software nutzt die für einen Paraffinschnitt gemessenen Streuungswerte in einer oder mehreren der 5 Verläufen zur Bestimmung der tatsächlichen Schichtdicke. Dazu wird der jeweilige Streuungswert (separat für IR, LR, LB, LL und UV) mit der bekannten Messungenauigkeit (z.B. ±5%) als Messwertspanne beaufschlagt. Anschließend werden die Werte der Kurven, die in der zugehörigen Spanne liegen, im Verlauf markiert (Abbildung 7) Dies sind die möglichen Schichtdicken, für die der gemessene Wert im Rahmen der Messgenauigkeit gemessen werden kann und die durch das Skript als plausible Schichtdicken für den Paraffinschnitt berechnet werden. Die Genauigkeit der Bestimmung kann dabei durch Verwendung mehrerer bei unterschiedlichen Wellenlängen gemessenen Verläufe erhöht werden.

Bei Verwendung mehrerer Verläufe, ergibt sich aus den übereinstimmenden Dicken der Schichten (in Abbildung 7 durch das Kreuz markiert), eine Spanne von möglichen Schichtdicken. Durch Berechnung des Mittelwertes und der Standardabweichung dieser möglichen Schichtdicken wird die Schichtdicke des Paraffinschnittes bestimmt.

Im Folgenden wurden für verschiedene Dicken "künstliche Messwerte" erzeugt, für die die Güte der Auswertung verglichen wurde. Dafür wurde eine Test-Schichtdicke ("reale Schichtdicke") definiert. Diese entspricht der Messung der Schichtdicke eines Schnittes, der mithilfe des Skriptes analysiert werden soll. Darauf basierend wurden "Beispiel-Messwerte" generiert, d.h. für die gegebene Schichtdicke gemäß den bekannten Verläufen zu erwartende Messwerte bzw. Sensor-Ausgaben. Zur Berücksichtigung eines zufälligen Fehlers in der Messung wurden diese Werte mit einem zufälligen "Messfehler" von 5% beaufschlagt (Pseudo-Zufallszahl mit dem Mersenne-Twister Generator und dem Seed von 1).

Die Auswertung über einen Schichtdickenbereich von 1-7 pm ergibt dabei über einen breiten Bereich eine hohe Genauigkeit des Skriptes. Abweichungen treten im Bereich 2-3,5 pm auf. Ist die am Mikrotom eingestellte Schnittdicke ("Sollschnittdicke") bekannt, werden die Abweichungen in diesem Bereich deutlich reduziert.

Messung der Farbintensität

Im ersten Schritt wurde ein digitaler Scan der Schnitte erzeugt. Der Scanner erzeugt ein Bild, welches in allen Abschnitten gleichhell mit gleichem Weißabgleich ist und durch die Kalibrierung auch bei unterschiedlichen Schnittprä paraten immer gleich durchgeführt wird. Für die Messung der Farbintensität wird in einem Bildbearbeitungsprogramm der Tonwert des nächstliegenden Farbkanals (rot, grün oder blau) bestimmt (ggf. im Umkehrbild).

Weitere Schnittserien mit 1 ,3,5 und 7 pm mit Gewebe wurden angefertigt und die Dichte der Farbe des Gewebes als Tonwert/Intensität der Farbe (0-255) am digitalen Scan bestimmt. Zunächst wurde zur Orientierung natürliches Pigment verwendet. Dabei war eine eindeutig monotone Beziehung erkennbar, d.h. eine mit der Schnittdicke stetig zunehmende Farbintensität. In weiteren Testreihen wurde dies dann auch mit einer immunhistochemischen Färbung durchgeführt (Abbildung 8).

Das Prinzip kann auf jede beliebige Substanz übertragen werden, wenn sie eine Eigenfarbe hat oder angefärbt werden kann. Da natürliche Farben (z. B. der Blutfarbstoff Hämoglobin) bei den verwendeten sehr niedrigen Schichtdicken meist zu blass sind, werden in der Regel histochemische Färbungen eingesetzt. Zusätzlich wird zwischen Gewebe und Deckglas ein optisches Kit (Eindeck-Medium) eingebracht. Damit wird die Streuung durch Auffüllen der unregelmäßigen Oberfläche minimiert und ein gleichmäßiges, störungsfrei beurteilbares Bild ermöglicht.

Genauigkeit des Präparate-Scans

Hierzu wurde ein gefärbtes Testpräparat mit verschiedenen Strukturen und teils natürlichen Gewebepigmenten 5 mal am gleichen Gerät (Pannoramic Desk) gescannt. Die Scans wurden an definierten Arealen bezüglich der Farbdichte gemessen. Die Genauigkeit war hoch (die Streubreite gering) (Abbildung 27).

Für die Etablierung des Verfahrens wurde ein Protein verwendet, welches im histologischen Schnitt und mit den Methoden der klinischen Chemie in beiden Methoden standardmäßig und in hoher Genauigkeit untersucht werden kann und sich zuverlässig aus Gewebe gewinnen lässt.

Das Protein S100 ist ein Calcium-bindendes Protein mit niedriger Molekülmasse (9-13 kDa) mit verschiedenen Subtypen, detektiert wurde hier der Subtyp S100B. Dieser wird vor allem in Gliazellen, aber auch anderen Gewebetypen wie Melanozyten und melanozytären Tumoren exprimiert. Als Gewebe wurde eine frische (unfixierte) humane Großhirnprobe verwendet.

Für die Klinische Chemie wurde das Gewebe mechanisch durch Pürieren homogenisiert, mit einem Lysepuffer weitgehend aufgelöst und dann stark (10⁵-fach) weiterverdünnt, um in den verwendbaren Messbereich zu kommen, der bei dieser Methode sehr niedrig ist (zwischen 0,02 pg/L-30 pg/L) (Abbildung 34).

In der Histopathologie lief der Prozess geringfügig anders: Da ein histologisches Präparat während der Erstellung mehrere Spülschritte durchläuft, wurde hier Puffer ohne lysierende Substanzen verwendet, so dass winzigste Gewebsfragmente in gleicher Verdünnung wie in der Klinischen Chemie für die Eichpräparate zur Verfügung standen. Das Gewebe wurde dafür mechanisch mit einem Pürierstab in wenig Flüssigkeit zerkleinert und mechanisch in einem Gel mit definierter Verdünnung gebunden („Eichkegel“). Alternativ oder zusätzlich kann das Frischgewebe durch ein sehr feines Sieb passiert (100 mesh, bedeutet 100 Maschen pro Zoll) und mit Histogel zum Erstarren vermengt werden. Um eine noch höhere Homogenität zu erreichen kann das Gewebe zusätzlich einmal oder mehrfach durch ein 400 mesh-Sieb passiert werden (Abb. 33).

Dieser Eichkegel wurde in Paraffin eingebettet und geschnitten, wobei sich eine homogene Verteilung des Gewebes innerhalb des Kegels zeigte (Abbildung 32). Es wurden mehrere Zellblöcke mit definierter Verdünnung hergestellt. Für diese Zellblöcke konnte durch den Vergleich mit der Klinischen Chemie die enthaltene Gewebekonzentration errechnet werden. Anschließend wurden diese Zellblöcke als Eichinstrument in einen gemeinsamen neuen Paraffinblock eingegossen („Eichblock“) (Abbildung 9). Weiterhin kann hier auch vom Hersteller bereitgestelltes rekombinantes Testprotein in hoher Konzentration als kleines Depot von ca. 1 mm Größe direkt in den Eichkegel gespritzt werden).

Vom Zellblock wurde ein Schnittpräparat erstellt und eine Immunhistochemie für S 100 angefertigt. Dieses wurde eingescannt und die Farbkonzentration wurde als Tonwert des Bildes zwischen 0-255 ermittelt (blauer Farbkanal im Umkehrbild oder Braunfärbung im Positivbild). Jeder Tonwert lässt sich dabei eindeutig einer Konzentration von S100 zuordnen, wodurch eine Kalibrierkurve für S 100 anhand des Eichpräparates erstellt werden konnte (Abbildung 12, Abbildung 13).

Färbuna des Präparates mittels Immunhistochemie

Eine mögliche Fehlerquelle in der Konzentrationsbestimmung einer Zielsubstanz in einem Gewebe stellt die Verteilung der Antikörper auf dem Gewebeschnitt dar. Um dies zu testen, wurde wie oben beschreiben aufbereitetes Gewebe in eine ca. 5 x 6 cm große Gussform gegossen, um hohe Homogenität beim Erstarren zu gewährleisten. Diese Gussplatte wurde nach Formalinfixierung in orientierbare Streifen geschnitten, paraffiniert und in Paraffinblöcke gegossen. Von diesen wurde in der Routine eine flächenhafte Färbung für das Zielprotein (S100) durchgeführt, außerdem eine punktförmige Färbung (hier NeuN für die in der Gewebeaufbereitung gleichmäßig verteilten Nervenzellen). Die Färbungen zeigten eine nur minimale Schwankung (Abb. 31).

Anwenduna des vollständiaen Verfahrens - Streuung und Absorption

Zur abschließenden Testung der Methode wurde eine Gewebeprobe verwendet, für die bekannt war, dass sie S 100 exprimiert: Die Metastase eines malignen Melanoms. Die Messobjektträger wurden vorbereitet, indem ein Schnitt des Eichblocks mit anonymisierter Schnittdicke auf eine Hälfte des Objektträgers aufgetragen wurde. Auf die andere Hälfte wurde ein Schnitt der Tumorprobe aufgebracht, ebenfalls mit anonymisierter Schnittdicke (Abbildung 10). Für beide Schnitte wurde im gewebefreien Rand des Schnittes die Schnittdicke nach der o.g. Methode bestimmt und der Korrekturfaktor ermittelt. Der Schnitt wurde eingescannt und repräsentative Fotos erstellt. An den Eichschnitten wurde die Farbintensität (Tonwert, Umkehrbild blau) fürjede Konzentration ermittelt und aus diesen drei Werten eine individuelle Eichkurve ermittelt. Für die gewünschten Abschnitte im Tumor wurden ebenfalls die Farbintensität ermittelt und mittels der individuellen Eichkurve die Konzentrationen des Proteins S100 direkt zugeordnet und im Foto beschriftet (Abbildung 11 und Tabelle 1).

Tabelle 1 : Im Verfahren ermittelte Messwerte des Eichblockes

Anwendung des vollständigen Verfahrens -Absorption

Um eine Wachsstanze („Kalibrierstanze“) präzise in den zu messenden Block einzubringen, welcher das zu untersuchende Gewebe enthält, wurde eine Methode analog zur Erstellung eines Tissue Microarray verwendet. Mit einer Hohlnadel wurden dabei Gewebezylinder aus einem Paraffinblock, welcher das gefärbte Wachs enthält, entnommen und anschließend in den Block, welcher das zu untersuchende Gewebe oder die Eichkegel enthält, hineingestanzt. Hierbei wurden in jeden Block zwei Wachsstanzen unterschiedlicher Konzentration eingestanzt.

Von diesen Blöcken wurden zunächst ungefärbte Serienschnitte unterschiedlicher Schnittdicken (1 , 3, 5 und 7 pm) angefertigt auf einem Objektträger platziert (Abbildung 17). Die ungefärbten Schnitte wurden gescannt und anhand des Scanbild die Farbintensität (Helligkeitswerte) in den Bereichen der Kalibrierstanzen gemessen. Parallel wurde die Streuung von rotem Laserlicht fotografiert (im Bereich neben dem Gewebe).

Aus der Bestimmung der Farbintensität der Wachsstanzen in den Schnitten der unterschiedlichen Schichtdicken 1 , 3, 5, 7 pm konnte je eine Standardkurve für die beiden Konzentrationen der Wachsstanze erstellt werden (Abbildung 18). Basierend darauf wurde ein Korrekturfaktor zwischen der Schichtdicke des Eichblocks und des Blockes, welcher das Tumorgewebe enthält, ermittelt.

Anschließen wurden die Schnitte immunhistochemisch gefärbt (Abbildung 19). Dabei lösten sich die Kalibrierstanzen (hier Wachsstanzen) auf und waren nicht mehr messbar. Alternativ kann eine Kalibrierstanze verwendet werden, welche ein Material enthält, welches sich bei der Färbung und Fixierung der Schnitte nicht auflöst. Die gefärbten Schnittpräparate wurden anschließend gescannt und anhand des Scanbildes wurde die Farbintensität des Tumorgewebes und der Eichkegel des Eichblocks gemessen. Die Messbereiche sind in Abbildung 10 schematisch dargestellt. Anhand der Farbintensität der Eichkegel im Eichblock und der Korrelation mit der bekannten Konzentration der in den Eichkegeln enthaltenen Substanz (hier S 100- Protein), wurde eine Kalibrierkurve erstellt, welche unter Berücksichtigung des ermittelten Korrekturfaktors für die Bestimmung der Konzentration im Tumorgewebe des Schnittpräparates anhand des Helligkeitswertes des Tumorgewebes im gescannten Bild verwendet wurde (Abbildung 20). Diese kann im Kernbereich der Anwendung linear dargestellt werden. Hierfür wurde eine Tabellenkalkulation erstellt, die alle o. g. Berechnungen zusammenfasst. Hierbei müssen die gemessenen Werte (Kalibrierwerte) in die Tabelle oder ein entsprechendes Gerät eingegeben werden, woraus die individuelle Kalibrierung berechnet wird. Anschließend werden die Messwerte des Schnittpräparates (des zu messenden Areals der Gewebeprobe) eingegeben und die Konzentration des Zielproteins errechnet und ausgegeben.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1 . Ein Verfahren zur Bestimmung einer Schichtdicke eines Schnittpräparates, umfassend a. Messung einer oder mehrerer Werte, die durch Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch das Schnittpräparat mit einer Lichtquelle oder mehreren Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wurden, b. Bereitstellung einer Modellierung der Schichtdicke des Schnittpräparates basierend auf Kalibrierwerten, die durch eine Messung der Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch ein oder mehrere Kalibrierpräparate mit einer Lichtquelle oder mehrerer Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wurden, und c. Ermittlung der Schichtdicke des Schnittpräparates durch Verwendung der gemessenen Werte gemäß (a) sowie einer Modellierung gemäß (b).

2. Das Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle(n) eine Wellenlänge von 200 bis 2000 nm, vorzugsweise 300 bis 1800 nm, besonders bevorzugt 400 bis 1700 nm aufweisen.

3. Das Verfahren nach einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Modellierung der Schichtdicke umfasst, a. Bereitstellung der Kalibierwerte, die durch eine Messung der Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls durch ein oder mehrere Kalibrierpräparate mit einer Lichtquelle oder mehreren Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen ermittelt wurden, wobei die Kalibrierpräparate eine bekannte Schichtdicke von 0,1 bis 10 pm, bevorzugt eine bekannte Schichtdicke von 1 bis 7 pm aufweisen, b. Ermittlung einer oder mehrerer Kalibrierfunktionen, wobei die Kalibrierfunktion die Korrelation der Schichtdicke des einen oder mehrerer Kalibrierpräparate mit den Kalibrierwerten umfasst, c. Vergleich der gemessenen Werte eines Schnittpräparates mit den ein oder mehreren Kalibrierfunktionen gemäß (b), vorzugsweise unter Berücksichtigung einer Ungenauigkeit der Messung der Werte von 5%, d. Die Ausgabe einer Schichtdicke des Schnittpräparates, welche dem Mittelwert eines oder mehrerer Werte entspricht, die gemäß (c) mit einer oder mehrerer der Kalibrierfunktionen übereinstimmen.

4. Das Verfahren nach einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schnittpräparat eine Schichtdicke von 0,1 bis 10 pm, vorzugsweise 1 bis 7 pm aufweist.

5. Das Verfahren nach einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schnittpräparat Gewebe enthält.

6. Das Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, umfassend zusätzlich die Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz in dem in einem Schnittpräparat enthaltenen Gewebe.

7. Das Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, wobei die Bestimmung der Konzentration der Ziel-Substanz umfasst: a. Bereitstellung eines Schnittpräparates und eines Eichpräparates, wobei das Eichpräparat eine vorbestimmte Konzentration der Ziel-Substanz umfasst, b. Bestimmung der Schichtdicke des Schnittpräparates und des Eichpräparats durch ein Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, c. Ermittlung eines Korrekturfaktors durch Verwendung der Schichtdicke gemäß (b), d. simultane Färbung des Schnittpräparates und des Eichpräparates, vorzugsweise auf der Oberfläche eines Objektträgers, e. Messung der Farbintensität des im Schnittpräparat enthaltenen Gewebes und der im Eichpräparat enthaltenen Zielsubstanz, und f. Ermittlung der Konzentration der Ziel-Substanz in dem Gewebe durch Verwendung der Farbintensität gemäß (e) und des Korrekturfaktors gemäß (c).

8. Das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7, wobei das Eichpräparat die Ziel- Substanz in zwei oder mehr Konzentrationen enthält, die räumlich voneinander getrennt sind.

9. Das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8, wobei die Schichtdicke des Schnittpräparates und des Eichpräparates in gewebefreien Bereichen des Schnittpräparates und des Eichpräparates bestimmt wird.

10. Das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die gewebefreien Bereiche des Schnittpräparates, des einen oder mehrerer Kalibrierpräparate und/oder des Eichpräparates einen oder mehrere Bereiche umfassen, welche einen Farbstoff enthalten, der Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 2000 nm absorbiert, vorzugsweise im Bereich 300 bis 800 nm.

11. Das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Schnittpräparat, die einen oder mehreren Kalibrierpräparate und das Eichpräparat ein Paraffinschnitt sind.

12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 , wobei ein digitaler Scan des Schnittpräparates, des Kalibrierpräparates und/oder des Eichpräparates angefertigt wird, der für die Messung der Werte und/oder der Farbintensität verwendet wird, wobei die Messung der Werte und/oder der Farbintensität die Bestimmung eines Helligkeitswertes umfasst.

13. Das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 12, wobei anhand der gemessenen Farbintensität der im Eichpräparat vorhandenen Ziel-Substanz eine Kalibrierkurve für die Konzentration der Ziel-Substanz erstellt wird, die vorzugsweise aus zwei oder mehr Konzentrationen der Ziel-Substanz ermittelt wird.

14. Das Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, wobei die Ziel-Substanz eine Substanz innerhalb in dem in einem Schnittpräparat enthaltenen Gewebe, bevorzugt ein Protein, ist und die Ziel-Substanz anhand des Eichpräparats und der Kalibrierkurve in dem im Schnittpräparat enthaltenen Gewebe lokalisiert und die Konzentration der Zielsubstanz bestimmt wird.

15. Eine Vorrichtung für die Messung der Schichtdicke eines Schnittpräparates und optional für die Bestimmung der Konzentration einer Ziel-Substanz in dem Schnittpräparat, umfassend a. eine Lichtquelle oder mehrere Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen im Bereich von 200 bis 2000 nm, vorzugsweise 300 bis 1800 nm, besonders bevorzugt 400 bis 1700 nm, b. Mindestens einen Sensor für die Messung der Streuung und/oder Absorption eines Lichtstrahls, c. Eine Vorrichtung für die Positionierung des Schnittpräparates während der Messung, und d. Eine Recheneinheit für die Modellierung der Schichtdicke eines Schnittpräparates oder für die Verwendung der Modellierung bei der Bestimmung der Schichtdicke eines Schnittpräparates und optional für die Berechnung der Konzentration einer im Schnittpräparat enthaltenen Zielsubstanz.

16. Ein Objektträger zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche oder mit der Vorrichtung nach Anspruch 15, umfassend ein Eichpräparat enthaltend eine Ziel- Substanz in zwei oder mehr Konzentrationen, die räumlich voneinander getrennt sind, auf dem zusätzlich ein Schnittpräparat aufgebracht werden kann.