EP4626907A1 - Verbesserte waschleistung durch den einsatz einer protease fusioniert mit speziellem adhäsionsvermittlerpeptid - Google Patents

Verbesserte waschleistung durch den einsatz einer protease fusioniert mit speziellem adhäsionsvermittlerpeptid

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Publication number
EP4626907A1
EP4626907A1 EP23805576.8A EP23805576A EP4626907A1 EP 4626907 A1 EP4626907 A1 EP 4626907A1 EP 23805576 A EP23805576 A EP 23805576A EP 4626907 A1 EP4626907 A1 EP 4626907A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amino acid
protease
peptide
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23805576.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shohana ISLAM
Christian DEGERING
Susanne Wieland
Anna EBEL
Iva ANIC
Irmgard Schmidt
Roland Breves
Christian Kastner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP4626907A1 publication Critical patent/EP4626907A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38681—Chemically modified or immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention is in the field of enzyme technology.
  • the invention relates to proteases which are covalently linked to a heterologous peptide sequence, which gives the proteases better cleaning performance.
  • the invention also relates to the uses of these protease conjugates and methods in which they are used, as well as agents containing them, in particular washing and cleaning agents.
  • proteases are among the most technically important enzymes of all. They are the longest established enzymes for detergents and cleaning agents and are contained in practically all modern, high-performance detergents and cleaning agents. They break down protein-containing soiling on the items being cleaned.
  • proteases of the subtilisin type (subtilases, subtilopeptidases, EC 3.4.21.62) are particularly important; they are serine proteases due to the catalytically active amino acids. They act as nonspecific endopeptidases and hydrolyze any acid amide bonds that are located inside peptides or proteins. Their pH optimum is usually in the clearly alkaline range. An overview of this family is provided, for example, in the article "Subtilases: Subtilisin-like proteases” by R.
  • subtilisin enzymes edited by R. Bott and C. Betzel, New York, 1996.
  • Subtilases are naturally produced by microorganisms. Among these, the subtilisins produced and secreted by Bacillus species are particularly worthy of mention as the most important group within the subtilases.
  • subtilisin-type proteases preferably used in detergents and cleaning agents are the subtilisins BPN' from Bacillus amyloliquefaciens and Carlsberg from Bacillus lichen formis, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the protease from Bacillus lentus, in particular from Bacillus lentus DSM 5483, subtilisin DY and the enzymes thermitase, proteinase K and the proteases TW3 and TW7, which are classified as subtilases but no longer as subtilisins in the narrower sense, as well as variants of the proteases mentioned which have an amino acid sequence which is different from that of the original protease.
  • Proteases are modified in a targeted or random manner using methods known from the state of the art and are thus optimized for use in detergents and cleaning agents, for example. These include point mutagenesis, deletion or insertion mutagenesis or fusion with other proteins or protein parts. For most of the state-of-the-art proteases, optimized variants are known. Subtilisin Carlsberg is available in a further developed form under the trade name Alcalase® from the company Novozymes. Subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase® and Savinase® by the company Novozymes. The protease variants known as BLAP® are derived from the protease from Bacillus lentus DSM 5483.
  • proteases include those known under the trade names Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase® and Ovozyme®. from the company Novozymes, the enzymes available under the trade names Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase® and Properase® from the company Danisco/Genencor, the enzymes available under the trade name Protosol® from the company Advanced Biochemicals Ltd., the enzymes available under the trade name Wuxi® from the company Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., the enzymes available under the trade names Proleather® and Protease P® from the company Amano Pharmaceuticals Ltd., and the enzymes available under the name Proteinase K-16 from the company Kao Corp.
  • proteases from Bacillus gibsonii and Bacillus pumilus which are disclosed in the international patent applications WO 2008/086916 and WO 2007/131656, as well as EP 2016175.
  • Other proteases which can be used advantageously are disclosed in the patent applications WO 91/02792, WO 2008/007319, WO 93/18140, WO 01/44452, GB 1243784, WO 96/34946, WO 2002/029024 and WO 2003/057246.
  • proteases which can be used are those which are naturally present in the microorganisms Stenotrophomonas maltophilia, in particular Stenotrophomonas maltophilia K279a, Bacillus intermedius and Bacillus sphaericus.
  • proteases are suitable for use in liquid surfactant-containing preparations. Many proteases do not show sufficient catalytic performance in such preparations. For the use of proteases in cleaning agents, a high catalytic activity under conditions such as those encountered during a wash cycle and a high storage stability are therefore particularly desirable.
  • prior art liquid formulations containing proteases and surfactants have the disadvantage that the proteases they contain do not exhibit satisfactory proteolytic activity under standard washing conditions (e.g. in a temperature range of 20°C to 40°C) or are not storage-stable and the formulations therefore do not exhibit optimal cleaning performance on protease-sensitive soiling.
  • proteases can be significantly increased if they are fused with specific adhesion-promoting peptides. This effect was demonstrated here with an exemplary protease, but is also transferable to other proteases.
  • the performance of the proteases is increased by fusion with the peptides described here, which act as adhesion promoters, in such a way that the concentration used can be significantly reduced without loss of performance.
  • the heterologous peptide is a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence of 4 to 50 amino acids, preferably 10 to 24 amino acids, wherein
  • amino acid sequence in N- to C-terminal orientation has the following sequence
  • Xi is a positively charged amino acid, preferably R or K, more preferably R, X2 and X3 are uncharged amino acids, preferably selected from A, L, S, I, M and Q, more preferably from A, S, I and L, in particular A and L, each X4 independently of one another is any amino acid, preferably with the exception of P, more preferably with the exception of P and G;
  • the amino acid sequence is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% or
  • the present invention is directed to a nucleic acid encoding a protease conjugate according to the present invention.
  • the present invention also relates to a non-human host cell comprising a nucleic acid according to the present invention or a protease conjugate according to the present invention.
  • the present invention is also directed to an agent, in particular a washing or cleaning agent, characterized in that it contains at least one protease conjugate according to the present invention.
  • the present invention is directed to methods for cleaning textiles or hard surfaces, characterized in that an agent according to the present invention is used in at least one method step.
  • the present invention is also directed to the use of a protease conjugate according to the present invention in a washing or cleaning agent for removing peptide- or protein-containing stains.
  • At least one as used herein means 1 or more, e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more. When applied to a component or compound, unless otherwise specified, this term does not refer to the absolute number of molecules, but rather to the number of different types of molecules that fall within the respective definition of the component or compound. "At least one protease” thus means that at least one type of protease is present, but not that at least one protease molecule is present.
  • “Substantially free from” means that the composition or agent contains less than 2% by weight, preferably less than 1% by weight, more preferably less than 0.5% by weight and most preferably less than 0.1% by weight of the corresponding substance, based on the total weight of the composition/agent.
  • Liquid as used herein includes liquids and gels as well as pasty compositions. It is preferred that the liquid compositions are flowable and pourable at room temperature, but it is also possible that they have a yield point.
  • a substance, e.g. a composition or an agent is solid according to the definition of the invention if it is in the solid state at 25°C and 1,013 mbar.
  • a substance, e.g. a composition or an agent is liquid according to the definition of the invention if it is in the liquid state at 25°C and 1,013 mbar.
  • Liquid also includes gel.
  • Heterologous refers to the fact that the peptide sequence which has adhesion-promoting properties does not naturally occur in combination with the protease.
  • the conjugates described here are therefore not natural hybrids of a protease and a peptide unrelated to the protease.
  • adheresion is understood to mean an interaction between the peptide and a surface, whereby the peptide can adhere to the surface.
  • adheresion-promoting refers to the ability to interact with various surfaces, e.g. textile surfaces, and/or to adhere to a specific surface under suitable conditions, i.e. usually non-denaturing conditions, where the binding affinity is greater than that of a reference sequence that does not have adhesion-promoting properties.
  • variant refers to variants of an enzyme or a protein/peptide that continue to have the functionality of the parent molecule, but differ from the parent sequence by one or more sequence deviations, e.g. 1, 2 or 3 or more sequence deviations, e.g. a substitution, deletion or insertion.
  • sequence identity of such variants may be in the range of 80% based on the total length of the parent peptide, and may be at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5%.
  • protease-linker-peptide When reference is made herein to various linked or individual amino acid sequences, these are always shown in N- to C-terminal orientation unless otherwise stated. Furthermore, the individual amino acids or amino acid sequences are linked to one another via peptide bonds unless otherwise stated. Thus, the hyphen in the representation protease-linker-peptide, for example, means that these corresponding three sequences are fused to one another via peptide bonds.
  • sequence comparison is based on the BLAST algorithm, which is established in the state of the art and is commonly used (see, for example, Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic local alignment search tool.” J. Mol. Biol. 215:403- 410, and Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J.
  • homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are therefore defined by similarities in the sequences. Such regions often have identical functions. They can be small and contain only a few nucleotides or amino acids. However, such small regions often perform essential functions for the overall activity of the peptide/protein. It may therefore be useful to relate sequence matches only to individual, possibly small regions. Unless otherwise stated, identity or homology statements in the present application refer to the total length of the respective nucleic acid or amino acid sequence specified.
  • the peptide or protein concentration can be determined using known methods, e.g. the BCA method (bicinchoninic acid; 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (A. G. Gornall, C. S. Bardawill and M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766).
  • BCA method bicinchoninic acid
  • 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid or the biuret method
  • A. G. Gornall, C. S. Bardawill and M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766 The person skilled in the art in the field of peptide and protein technology knows a variety of suitable methods for determining the peptide or protein concentration, which can be used in the context of this invention.
  • the peptides can have amino acid changes, in particular amino acid substitutions, insertions or deletions.
  • Such peptides are further developed, for example, by targeted genetic modification, i.e. by mutagenesis processes, and optimized for specific applications or with regard to special properties (e.g. with regard to their stability, binding, etc.).
  • targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions can be introduced into the known molecules in order to change certain properties, for example.
  • the surface charges and/or the isoelectric point of the molecules and thus their interactions with a surface can be changed.
  • the net charge of the peptides can be changed in order to improve substrate binding.
  • one or more corresponding mutations can increase the stability or adsorption of the peptide.
  • Advantageous properties of individual mutations, eg individual substitutions can complement each other.
  • a protease conjugate according to the invention consists of
  • amino acid sequence in N- to C-terminal orientation has the following sequence
  • the amino acid sequence is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% or
  • proteases are the subtilisins BPN' from Bacillus amyloliquefaciens and Carlsberg from Bacillus licheniformis, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and the enzymes thermitase, proteinase K and the proteases TW3 and TW7, which are classified as subtilases but no longer as subtilisins in the narrower sense.
  • Subtilisin Carlsberg is available in a further developed form under the trade name Alcalase® from the company Novozymes.
  • subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase® and Savinase® respectively by the company Novozymes.
  • Protease variants are derived from the protease from Bacillus lentus DSM 5483.
  • Other useful proteases include those available under the trade names Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase®, Progress Uno 101 L® and Ovozyme® from Novozymes, those available under the trade names Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase®, Properase®, Preferenz P100® and Preferenz P300® from Danisco/DuPont, those available under the trade name Lavergy pro 104 LS® from BASF, those available under the trade name Protosol® from Advanced Biochemicals Ltd., those available under the trade name Wuxi® from Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., those available under the trade names Proleather® and
  • proteases from Bacillus gibsonii and Bacillus pumilus which are disclosed in WO 2008/086916, WO 2007/131656, WO 2017/215925, WO 2021/175696 and WO 2021/175697, are also particularly preferably used.
  • Other proteases which can be used advantageously are disclosed in, for example, WO 91/02792, WO 2008/007319, WO 93/18140, WO 01/44452, GB 1243784 A, WO 96/34946, WO 02/029024 and WO 03/057246.
  • Preferred proteases include a) a protease which has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence given in SEQ ID NO:1 over its entire length by at least 70% and increasingly preferably by at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% or 98.8% identical and, in each case based on the numbering according to SEQ ID NO:2, (i) at the position corresponding to position 101, the amino acid substitution R101 E, and (ii) at at least one of the positions corresponding to positions 3, 4, 45, 55, 58, 59, 61,
  • S163G-N261 D, S3T-N76D-Q137H-S141 H-R145H-S156D-Y209W existing group is selected; b) a protease which has proteolytic activity and comprises an amino acid sequence which is at least 70% and increasingly preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5% and 98% identical to the amino acid sequence given in SEQ ID NO:3 over its entire length and, in each case based on the numbering according to SEQ ID NO:2, (i) at the positions corresponding to positions 9, 130, 133, 144, 217,
  • the protease is selected from proteases of group b).
  • the heterologous peptide linked according to the invention to the protease as described and defined above, which acts as an adhesion promoter for the protease is a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence of 4 to 50 amino acids, preferably of at least 8, 9, 10, 11 or 12 amino acids in length. Preferred lengths are up to 40, up to 35, up to 30, or up to 25 or up to 24 amino acids.
  • the peptide can have a length of 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 amino acids, in particular 12 to 18 amino acids.
  • a “peptide” in the context of the present invention is understood to mean a polymer composed of amino acids, preferably the 20 proteinogenic L-amino acids, preferably of linear structure, which has up to 100 amino acids which are linked to one another via peptide bonds.
  • the peptides of the invention have an amino acid sequence of 4 to 50 amino acids.
  • the amino acids are given in the context of this invention in a one-letter code, where e.g. C stands for cysteine, R for arginine, A for alanine and L for leucine.
  • C in the above sequence (C) m XiX2X3(X4)nX5(C) o stands for a cysteine residue. It is also clear that unless otherwise stated, the amino acids in an amino acid sequence disclosed herein are linked via peptide bonds and the sequence, unless otherwise stated, is listed in N- to C-terminal orientation.
  • N-terminus or “N-terminal” in the context of the present invention typically describes the end of the amino acid chain of the peptide which has a free amino group.
  • N- to C-terminal orientation in the context of this invention refers to an amino acid sequence in which the order of the amino acids is described from the N-terminus to the C-terminus.
  • Typical acidic or negatively charged amino acids are D and E.
  • any amino acid typically means one of the 20 naturally occurring proteinogenic amino acids, i.e., one of glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), phenylalanine (F), serine (S), threonine (T), proline (P), methionine (M), cysteine (C), histidine (H), lysine (K), arginine (R), glutamine (Q), asparagine (N), aspartic acid (D), glutamic acid (E), tyrosine (Y), and tryptophan (W).
  • the amino acids are typically L-amino acids unless otherwise stated.
  • the peptide may also consist of D-amino acids, although it may be preferred that D- and L-amino acids do not occur simultaneously within the peptides described herein.
  • such an arbitrary amino acid includes all of the aforementioned amino acids with the exception of proline, or in some embodiments also with the exception of proline and glycine. These two amino acids are not preferred in certain embodiments because they have helix-breaking properties and can therefore adversely affect the secondary structure of the peptides.
  • the peptide has a total charge of -2 to +12, preferably from 0 to +8, even more preferably from 0 to +4, in particular from 0 to +2.
  • the total charge of the peptide is based on the number of positively and negatively charged amino acids in the peptide, in particular arginine (R), lysine (K), histidine (H), aspartic acid (D) and glutamic acid (E) and results from the sum of the negative and positive charges, with one positive and one negative charge canceling each other out.
  • a peptide with 2 arginine residues and 1 glutamic acid residue would therefore have a total charge of +1.
  • the total charge of the peptide is preferably -2 to +12, more preferably 0 to +8, even more preferably 0 to +4, in particular 0 to +2.
  • the peptide is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • the feature that the peptide has a net positive charge at the “N-terminus, which includes the first 3-4 amino acids” means that the N-terminal 3-4 amino acids contain more positively charged amino acids than negatively charged ones. In various In embodiments, this feature is fulfilled, for example, when the N-terminal 3-4 amino acids have 1 or 2 positively charged amino acids, ie H, K or R, preferably K or R, more preferably R, and no negatively charged amino acids such as E or D. If the N-terminus contains a negatively charged amino acid, the number of positively charged amino acids must be at least 2 so that the net charge remains positive.
  • the feature that the peptide has a negative or neutral net charge at the "C-terminus, which includes the last 3-6 amino acids" means that the number of charged amino acids must be 0 or the number of negatively charged amino acids, i.e. D and E, must be greater than the number of positively charged ones.
  • An example of such a C-terminal sequence would be EAL or the double sequence of this motif.
  • the sequence X1X2X3 is RAL, RSI or RLA, preferably RAL or RLA, in particular RAL.
  • the N-terminal sequence RAL or RLA not only advantageously has a positive net charge, it also comprises amino acids with a particularly high alpha-helix-forming potential, as explained below.
  • the arginine residue can also be replaced by lysine, but the N-terminal arginine residue is particularly preferred.
  • the sequence (X4)nX5 comprises at least one sequence XeXyXs, where Xe is a charged or uncharged amino acid, preferably R, K, E, L, A or Q, more preferably R, K, E or Q, and X7 and Xe are independently negatively charged or uncharged amino acid with the exception of P and G, preferably A, L, E, R, Q or M, e.g. A, L, E, Q or M, more preferably A, E, Q or L, even more preferably A, E or L, in particular A or L; and/or
  • (ii) (X4)n comprises at least one aromatic amino acid, preferably W or F.
  • one of the sequences XeXyXs which are close to, i.e. within the 6 C-terminal amino acids, or at the C-terminus, has as Xe a negatively charged amino acid, e.g. E.
  • the peptide contains an aromatic amino acid selected from W and F, there is a positively or negatively charged amino acid next to, in particular C-terminally, and in particular there is no further aromatic amino acid next to the aromatic amino acid.
  • the aromatic amino acids phenylalanine (F) and tryptophan (W) are preferably used in the peptide sequence according to the invention as helix formers and/or for pi stacking.
  • the aromatic amino acid tyrosine (Y) is not used in the peptide sequence in various embodiments because it has helix-breaking properties. In various embodiments, the peptide is therefore free of Y residues.
  • pi-stacking refers to the non-covalent interaction between aromatic ring systems.
  • (ii) (X4)nX5 comprises at least one sequence XeXyXs, wherein XeXyXs is EAL, LEA or ELA, preferably EAL, and wherein this sequence is preferably not located in the N-terminal amino acids of positions 1-6; and/or
  • nX5 comprises at least one sequence XeXyXs, where XeXyXs is EQA, QAL, LQA or QLA, preferably EQA, QAL or QLA, in particular QAL.
  • (X4)nX5 comprises at least one sequence XeX Xa, where XeXyXs is QLA or EQA, which sequence is preferably not located in the N-terminal amino acids of positions 1-6 or 1-11.
  • (X4)nX5 comprises at least one sequence XeXyXsXg, where XeXyXsXg is AQLA or SEQA, wherein this sequence is preferably not located in the N-terminal amino acids of positions 1-6 or 1-11.
  • the peptide comprises the sequence X1X2X3, where X1X2X3 is RAL, and (X4)nX5 comprises at least one of QAL and EAL, preferably both.
  • the peptide has the sequence
  • (C)mRAL(Xio)qEAL(Xii)rQAL(Xi2) s (C) 0 , where X10 and Xu are independently any amino acid, preferably with the exception of P, more preferably with the exception of P and G; X12 is any uncharged amino acid, preferably Q, A or L, in particular A or L; q and r are 0 or integers from 1-10, preferably 0, 1, 2 or 3; and s is 0 or 1, where q+r+s 0-21, preferably 0-15 or 0-9 or 1-15 or 1 -9 or 1 -6 or 0-6 or 0-3 or 1 -3.
  • the peptide additionally comprises at least one further (second) RAL sequence.
  • this can follow the first RAL sequence directly C-terminally or be separated from it by 1-3 amino acids, eg 7 by 1 or 3 by three amino acids.
  • the peptide contains two RAL sequences and at least one EAL and QAL sequence. Preferred sequences are:
  • X10 and Xu are independently any amino acid, preferably with the exception of P, more preferably with the exception of P and G, e.g. W or F or further motifs comprising QAL or EAL;
  • X12 is any uncharged amino acid, preferably Q, A or L, in particular A or L;
  • q and r are 0 or integers from 1-6, preferably 0, 1, 2, or 3; and
  • the peptide contains at least one W or F, preferably exactly one W or F.
  • the peptide consists of at least 60%, preferably at least 65%, more preferably at least 70%, in particular at least 75% or at least 80% or at least 85% or at least 90% or at least 95% of amino acids with a high alpha-helix-forming potential, wherein these amino acids are preferably selected from E, A, L, M, Q, K, R, F, I, H, W and D, more preferably E, A, L, M, Q, K, R, F, I and H; even more preferably E, A, L, M, Q, K, R and F.
  • the peptide particularly preferably forms a helical secondary structure, in particular an ⁇ -helix structure, preferably with an ⁇ -helix content of at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, in particular higher than 95%.
  • the use of the motif AL or LA in the amino acid sequence of the peptide can contribute to the stability of the helical structure because these amino acids have a high ⁇ -helix potential.
  • the peptide has an amino acid sequence according to one of SEQ ID NOs: 1-15 and/or 16-17, in particular 1-15, or variants thereof which have at least 80%, preferably at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84% or at least 85%, more preferably at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% sequence identity to the indicated sequence, wherein preferably the RAL motif, and more preferably also the EAL and/or QAL motif, if present, are invariable. If the RAL, EAL and QAL motifs are present in the peptide, they are preferably invariable in all of the aforementioned variants.
  • the peptide may have a high proportion of hydrophobic amino acids selected from A, L, F, W, V, M, I and P, in particular A, L, F, W, V, M and I.
  • the peptide has an amino acid sequence which has a length of 10 to 24 amino acids, e.g. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 amino acids, in particular 12 to 19 amino acids, e.g. 12-18 amino acids.
  • the peptide has the amino acid cysteine (C) at the C-terminus. In other embodiments, the peptide has the amino acid cysteine at the N-terminus.
  • This amino acid can enable coupling to other molecules, structures or substrates via the free sulfhydryl group. This amino acid therefore serves as a linking site but is typically not involved in the desired adhesive effect.
  • the peptide comprises or consists of an amino acid sequence which has at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5%, in particular 100% sequence identity with one of the following amino acid sequences: RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO:4), RALRALRALEALEAL (SEQ ID NO:5), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO:6, RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO:7), RALRALQALEALEAL (SEQ ID NO:8)
  • the peptide comprises or consists of an amino acid sequence which comprises at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5%, in particular 100% sequence identity with one of the following amino acid sequences: RSIVTFSLRQNAQLA (SEQ ID NO:19), RSIVTFSLRQNSEQA (SEQ ID NO:20), GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO: 21), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO:22), QQSIRIMTI
  • the peptide comprises or consists of an amino acid sequence which has at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.5%, in particular 100% sequence identity with one of the following amino acid sequences: GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO:21), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO:22), QQSIRIMTIKHP (SEQ ID NO:23), WRHPRLRCGNLL (SEQ ID NO:24) or QKSRNRMTRTHP (SEQ ID NO:21),
  • the peptide may further comprise or consist of one of the following amino acid sequences, or be a variant thereof: SRARLFVVTYHK (SEQ ID NO:26), HMISTMNAASRR (SEQ ID NO:27), RSIVTFSLRQNR (SEQ ID NO:28), RNTIRIRTIKHP (SEQ ID NO:29) or RHSSTLRYRPLP (SEQ ID NQ:30), wherein a variant has an amino acid sequence which is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more preferably at least 98%, even more preferably at least at least at least
  • the peptide is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • RALQALRALQALEAL-C (SEQ ID NO:31), RALRALRALEALEAL-C (SEQ ID NO:32), RALRALRALQALQAL-C (SEQ ID NO:33), RALRALRALQALEAL-C (SEQ ID NO:34), RALRALQALEALEAL-C (SEQ ID NO:35), RALFEALQALFRALEAL-C (SEQ ID NO:36), RALRALALEALQALEA-C (SEQ ID NO:37), RALFEALFRALEALR-C (SEQ ID NO:38), RALFEALFRALEAL-C (SEQ ID NO:39), RALEALFRALEAL-C (SEQ ID NQ:40), RALRALFEALEAL-C (SEQ ID NO:41), RALEALFRALQALEAL-C (SEQ ID NO:42), RALEALWRALQALEAL-C (SEQ ID NO:43), RALEALWRALEAL-C (SEQ ID NO:31), RALRALRALEALEAL-C (
  • the peptide may further comprise an amino acid sequence according to SEQ ID NOs: 53-57 (SRARLFWTYHK-C (SEQ ID NO:53), HMISTMNAASRR-C (SEQ ID NO:54), RSIVTFSLRQNR-C (SEQ ID NO:55), RNTIRIRTIKHP-C (SEQ ID NO:56), RHSSTLRYRPLP-C (SEQ ID NO:57)) or a variant thereof which comprises at least 80%, preferably at least 81%, 82%, 83%, 84% or 85%, more preferably at least 86%, even more preferably at least 87%, even more preferably at least 88%, even more preferably at least 89%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 91%, even more preferably at least 92%, even more preferably at least 93%, even more preferably at least 94%, even more preferably at least 95%, even more preferably preferably at least 96%, even more preferably at least 97%, even more
  • the heterologous peptide sequence which acts as an adhesion promoter for the protease, is directly covalently linked to the protease, i.e. the first and/or last amino acid of the protease is linked to a terminal amino acid of the peptide sequence via a peptide bond.
  • the bond can also be made via a linker, in particular a peptide linker.
  • Such a bond via a peptide linker is preferred.
  • Suitable linkers are known in the art and can be static/rigid or flexible. This property is determined by the secondary structure of the linker, for example, rigid linkers can have an alpha helix as a secondary structure.
  • the peptide linker sequence is flexible and has no secondary structure or only short secondary structure elements. Linkers suitable in the context of the present invention are described below.
  • such peptide linkers have a length of 1 to 200 amino acids, e.g. 1 to
  • Preferred combination of protease, linker and heterologous peptide are, in N- to C-terminal orientation:
  • protease linker (II) peptide (i) protease linker (II) peptide
  • protease preferably has one of the following amino acid substitution variants, each based on the numbering according to SEQ ID NO:1:
  • peptide preferably comprises or consists of one of the following amino acid sequences, or is a variant thereof: RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO:4), RALRALRALEALEAL (SEQ ID NO:5), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO:6), RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO:7), RALRALQALEALEAL (SEQ ID NO:8), RALFEALQALFRALEAL (SEQ ID NO:4), RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO:5), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO:6), RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO:7), RALRALQALEALEAL (SEQ ID NO:8), RALFEALQALFRALEAL (SEQ ID NO:4), RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO:5), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO:6), RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO:7), RALRALQALEALEAL (
  • the above-mentioned combinations (a)-(n) are preferred, wherein the protease in each case has the amino acid substitution variant P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T, Q271 E, based on the numbering according to SEQ ID NO:1, and wherein the peptide in each case consists of one of the amino acid sequences SEQ ID NOs: 4-30.
  • a further aspect of the present invention is a nucleic acid which encodes a protease conjugate according to the invention, as well as a vector containing such a nucleic acid, in particular a cloning vector or an expression vector.
  • RNA molecules can be DNA or RNA molecules. They can be present as a single strand, as a single strand complementary to this single strand, or as a double strand. In the case of DNA molecules in particular, the sequences of both complementary strands must be taken into account in all three possible reading frames. It must also be taken into account that different codons, i.e. base triplets, can code for the same amino acids, so that a specific amino acid sequence can be coded by several different nucleic acids. Due to this degeneracy of the genetic code, all nucleic acid sequences that can code for one of the proteases described above are included in this subject matter of the invention.
  • Bottlenecks in protein biosynthesis can occur if the codons on the nucleic acid in the organism are faced with a comparatively small number of loaded tRNA molecules. Although coding for the same amino acid, this leads to a codon being translated less efficiently in the organism than a synonymous codon that codes for the same amino acid. Due to the presence of a higher number of tRNA molecules for the synonymous codon, this can be translated more efficiently in the organism.
  • Expression vectors comprise nucleic acid sequences which enable them to replicate in the host cells containing them, preferably microorganisms, particularly preferably bacteria, and to express a nucleic acid contained therein.
  • the expression is influenced in particular by the promoter(s) which regulate transcription.
  • expression can take place by the natural promoter originally located in front of the nucleic acid to be expressed, but also by a promoter of the host cell provided on the expression vector or by a modified or completely different promoter of another organism or another host cell.
  • at least one promoter is provided for the expression of a nucleic acid according to the invention and used for its expression.
  • Expression vectors can also be regulated, e.g.
  • Preferred host cells according to the invention secrete the (transgenically) expressed protein into the medium surrounding the host cells.
  • the proteases can be modified by the cells producing them after they have been produced, e.g. by attaching sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such post-translational modifications can functionally influence the protease conjugate.
  • host cells whose activity can be regulated by genetic regulatory elements, which are provided on the vector, for example, but can also be present in these cells from the outset. These can be stimulated to express themselves, for example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the cultivation conditions, or when a certain cell density is reached. This enables economical production of the proteins according to the invention.
  • An example of such a compound is IPTG as described above.
  • gram-negative bacteria such as Escherichia coli
  • a large number of proteins are secreted into the periplasmic space, i.e. into the compartment between the two membranes that enclose the cells.
  • gram-negative bacteria can also be designed in such a way that they not only secrete the expressed proteins into the periplasmic space, but also into the medium surrounding the bacteria.
  • Gram-positive bacteria such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of the Actinomycetales, on the other hand, do not have an outer membrane, so secreted proteins are immediately released into the medium surrounding the bacteria, usually the nutrient medium, from which the expressed proteins can be purified. They can be isolated directly from the medium or further processed.
  • gram-positive bacteria are related to or identical to most of the organisms of origin for technically important enzymes and usually produce comparable enzymes themselves, so that they have a similar codon usage and their protein synthesis apparatus is naturally oriented accordingly.
  • the host cell is characterized in that it is a bacterium, preferably one selected from the group of the genera of Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferably one selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and St
  • bacterium preferably one
  • Host cells according to the invention are preferably used to produce protease conjugates according to the invention.
  • a further subject of the invention is therefore a method for producing a protease conjugate comprising a) culturing a host cell according to the invention, and b) isolating the protease conjugate from the culture medium or from the host cell.
  • This subject matter of the invention preferably includes fermentation processes. Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, e.g. the protease conjugates according to the invention. All fermentation processes that are based on a corresponding process for producing a protease conjugate according to the invention represent embodiments of this subject matter of the invention.
  • Fermentation processes that are characterized by the fact that the fermentation is carried out via a feed strategy are particularly suitable.
  • the media components that are consumed by the ongoing cultivation are fed in. This can achieve considerable increases in both the cell density and the cell mass or dry mass and/or in particular in the activity of the enzyme of interest.
  • the fermentation can also be designed in such a way that undesirable Metabolic products are filtered out or neutralized by adding buffer or appropriate counter ions.
  • the protease conjugate produced can be harvested from the fermentation medium. Such a fermentation process is preferred over isolation of the protease conjugate from the host cell, i.e. product preparation from the cell mass (dry mass), but requires the provision of suitable host cells or of one or more suitable secretion markers or mechanisms and/or transport systems so that the host cells secrete the protease conjugate into the fermentation medium. Without secretion, the protease conjugate can alternatively be isolated from the host cell, i.e. purified from the cell mass, e.g. by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, or by chromatographic purification.
  • the invention further relates to an agent which is characterized in that it contains at least one protease conjugate as described and defined above.
  • the agent is preferably a washing or cleaning agent.
  • fatty acids or fatty alcohols or their derivatives - unless otherwise stated - represent branched or unbranched carboxylic acids or alcohols or their derivatives with preferably 6 to 22 carbon atoms.
  • the oxo alcohols or their derivatives obtainable, for example, by RoELEN's oxo synthesis can also be used accordingly.
  • alkaline earth metals are mentioned below as counterions for monovalent anions, this means that the alkaline earth metal is naturally present in only half the amount of the anion - sufficient to balance the charge.
  • a washing or cleaning agent is understood to mean all conceivable types of washing or cleaning agent, both concentrates and agents that can be used undiluted, for use on a commercial scale, in the washing machine or for hand washing or cleaning.
  • washing agents for textiles, carpets or natural fibers, for which the term washing agent is used.
  • This also includes, for example, dishwashing detergents for dishwashers (machine dishwashing detergents) or manual dishwashing detergents or cleaners for hard surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramics, tiles, stone, painted surfaces, plastics, wood or leather, for which the term cleaning agent is used, i.e. in addition to manual and machine dishwashing detergents, scouring agents, glass cleaners, toilet air fresheners, etc.
  • washing and cleaning agents within the scope of the invention also include washing aids that are added to the actual washing agent during manual or machine textile washing in order to achieve an additional effect.
  • washing and cleaning agents within the scope of the invention also include textile pre- and Post-treatment agents, i.e. agents with which the item of laundry is brought into contact before the actual washing, e.g. to dissolve stubborn dirt, and also agents which, in a step following the actual textile washing, give the laundry other desirable properties such as a pleasant feel, crease-freeness or low static charge.
  • the latter agents include fabric softeners.
  • An agent according to the invention advantageously contains at least one protease conjugate according to the invention in an amount of 2 pg to 20 mg, preferably 5 pg to 17.5 mg, particularly preferably 20 pg to 15 mg and very particularly preferably 50 pg to 10 mg per g of the agent.
  • the concentration of the protease conjugate described herein (active enzyme) in the agent is >0 to 1% by weight, preferably 0.0001 or 0.001, even more preferably 0.001 to 0.1% by weight, in each case based on the total weight of the agent.
  • An agent according to the invention contains the protease conjugate increasingly preferably in an amount of from 1 x 10 -8 to 5% by weight, from 0.0001 to 1% by weight, from 0.0005 to 0.5% by weight, from 0.001 to 0.1% by weight, in each case based on active protein and based on the total weight of the detergent.
  • the embodiments of the present invention include all solid, powdery, liquid, gel-like or pasty dosage forms of agents according to the invention, which may optionally also consist of several phases and may be in compressed or non-compressed form.
  • the agent may be in the form of a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g/l to 1200 g/l, in particular 500 g/l to 900 g/l or 600 g/l to 850 g/l.
  • the solid dosage forms of the agent also include extrudates, granules, tablets or pouches.
  • the agent may also be liquid, gel-like or pasty, e.g.
  • Liquid agents are generally preferred.
  • the agent can also be a one-component system. Such agents consist of one phase. Alternatively, an agent can also consist of several phases. Such an agent is therefore divided into several components.
  • the detergents according to the invention when in liquid form, they preferably contain more than 40% by weight, preferably 50 to 90% by weight and particularly preferably 60 to 80% by weight of water based on their total weight.
  • the agents according to the invention can contain one or more surfactants, with particular emphasis being placed on anionic surfactants, nonionic surfactants and mixtures thereof, but cationic, zwitterionic and/or amphoteric surfactants can also be included.
  • the agents preferably contain 5 to 70% by weight of surfactant, preferably 5 to 60% by weight and more preferably 5 to 50% by weight of surfactant.
  • Suitable anionic surfactants are in particular soaps and those which contain sulfate or sulfonate groups with preferably alkali ions as cations.
  • Soaps which can be used are preferably the alkali salts of saturated or unsaturated C s fatty acids. Such fatty acids can also be used in a form which is not completely neutralized.
  • the useful surfactants of the sulfate type include the salts of the sulfuric acid half esters of C s fatty alcohols and the sulfation products of the nonionic surfactants mentioned with a low degree of ethoxylation.
  • the usable surfactants of the sulfonate type include, for example, Cg-14-alkylbenzenesulfonates, alkanesulfonates which are obtained from Cs-alkanes, for example by sulfochlorination or sulfoxidation with subsequent hydrolysis or neutralization, Ci2-18-olefinsulfonates which are formed by reacting corresponding monoolefins with sulfur trioxide, mixtures of alkene and hydroxyalkanesulfonates, disulfonates such as those obtained, for example, from Cs-monoolefins with terminal or internal double bonds by sulfonation with gaseous sulfur trioxide and subsequent alkaline or acidic hydrolysis of the sulfonation products, and ⁇ -sulfofatty acid esters (estersulfonates) which are formed by sulfonating fatty acid methyl or ethyl esters, e.g. ⁇ -sulfonated
  • Suitable alkylbenzenesulfonates are preferably selected from linear or branched alkylbenzenesulfonates of the formula in which R' and R" are independently H or alkyl and together contain 6 to 19, preferably 7 to 15 and in particular 9 to 13 C atoms.
  • a particularly preferred representative is sodium dodecylbenzylsulfonate.
  • sulfuric acid monoesters of straight-chain or branched C7-2i-alcohols ethoxylated with 1 to 6 moles of ethylene oxide such as 2-methyl-branched Cg-n-alcohols with an average of 3.5 moles of ethylene oxide (EO) or Ci2-18-fatty alcohols with 1 to 4 EO.
  • Suitable alkyl ether sulfates are, for example, compounds of the formula
  • R 1 is a linear or branched, substituted or unsubstituted alkyl radical, preferably a linear, unsubstituted alkyl radical, particularly preferably a fatty alcohol radical.
  • Preferred radicals R 1 are selected from decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, eicosyl radicals and mixtures thereof, with the representatives with an even number of C atoms being preferred.
  • Particularly preferred radicals R 1 are derived from C s fatty alcohols, e.g.
  • AO is an ethylene oxide (EO) or propylene oxide (PO) group, preferably an ethylene oxide group.
  • EO ethylene oxide
  • PO propylene oxide
  • the index n stands for an integer from 1 to 50, preferably from 1 to 20 and in particular from 2 to 10. Most preferably, n stands for the numbers 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8.
  • X + stands for a monovalent cation or the nth part of an n-valent cation, preference being given to the alkali metal ions and among these Na + or K + , with Na + being extremely preferred. Further cations X + can be selected from NHT, % Zn 2+ , % Mg 2+ , % Ca 2+ , % Mn 2+ and mixtures thereof.
  • the stated degree of ethoxylation represents a statistical mean value which can be a whole or a fractional number for a specific product.
  • the stated degrees of alkoxylation represent statistical mean values which can be a whole or a fractional number for a specific product.
  • Preferred alkoxylates/ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow range ethoxylates, NRE).
  • detergents also contain soap(s).
  • Preferred detergents are therefore characterized by the fact that they contain soap(s).
  • Suitable soaps are saturated fatty acid soaps, such as the salts of lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, hydrogenated erucic acid and behenic acid, and in particular soap mixtures derived from natural fatty acids, e.g. coconut, palm kernel or tallow fatty acids.
  • Suitable nonionic surfactants are in particular alkyl glycosides and ethoxylation and/or propoxylation products of alkyl glycosides or linear or branched alcohols each having 8 to about 18 C atoms in the alkyl moiety and 3 to 20, preferably 4 to 10 alkyl ether groups. Furthermore, corresponding ethoxylation and/or propoxylation products of N-alkylamines, vicinal diols, fatty acid esters and fatty acid amides, which correspond to the long-chain alcohol derivatives mentioned with regard to the alkyl moiety, and of alkylphenols having 5 to 12 C atoms in the alkyl radical are usable.
  • nonionic surfactants which are used either as the sole nonionic surfactant or in combination with other nonionic surfactants, are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated Fatty acid alkyl esters, preferably with 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, in particular fatty acid methyl esters.
  • Peroxygen compounds suitable for use in agents according to the invention are, in particular, organic peracids or peracidic salts of organic acids, such as phthalimidopercaproic acid, perbenzoic acid or salts of diperdodecanedioic acid, hydrogen peroxide and hydrogen peroxide-releasing compounds under the washing conditions.
  • inorganic salts which include perborate, percarbonate, persilicate and/or persulfate such as caroate, and hydrogen peroxide inclusion compounds such as H202-urea adducts.
  • Hydrogen peroxide can also be produced with the aid of an enzymatic system, ie an oxidase and its substrate.
  • acylated alkylenediamines in particular tetraacetylethylenediamine (TAED), acylated triazine derivatives, in particular 1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine (DADHT), acylated glycolurils, in particular tetraacetylglycoluril (TAGU), N-acylimides, in particular N-nonanoylsuccinimide (NOSI), acylated phenolsulfonates or carboxylates or the sulfonic or carboxylic acids thereof, in particular nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate or laroyloxybenzenesulfonate (NOBS or iso-NOBS or LOBS), 4-(2-decanoyloxyethoxycarbonyloxy)benzenesulfonate (DECOBS) or decanoy
  • N-benzoylcaprolactam nitriles from which perimidic acids are formed, in particular aminoacetonitrile derivatives with a quaternized nitrogen atom, and/or oxygen-transferring sulfonimines and/or acylhydrazones.
  • the hydrophilically substituted acyl acetals and the acyl lactams are also preferred.
  • Combinations of conventional bleach activators can also be used.
  • Such bleach activators can be present in the usual amount range, preferably in amounts of 0.5 to 10% by weight, in particular 1 to 8% by weight, based on the total agent, particularly in the presence of the above-mentioned hydrogen peroxide-producing bleaching agents, but are preferably completely absent when percarboxylic acid is used as the sole bleaching agent.
  • solid Agents may also contain sulfonimines and/or bleach-enhancing transition metal salts or transition metal complexes as so-called bleach catalysts.
  • the detergents according to the invention can contain an organic solvent as a further component.
  • organic solvents have a beneficial effect on the enzyme stability and the cleaning performance of these agents.
  • Preferred organic solvents come from the group of mono- or polyhydric alcohols, alkanolamines or glycol ethers.
  • the solvents are selected from ethanol, n- or i-propanol, butanol, glycol, propanediol, butanediol, glycerin, diglycol, propyl diglycol, butyl diglycol, hexylene glycol, ethylene glycol methyl ether, ethylene glycol ethyl ether, ethylene glycol propyl ether, ethylene glycol mono-n-butyl ether, diethylene glycol methyl ether, diethylene glycol ethyl ether, propylene glycol methyl ether, propylene glycol ethyl ether, propylene glycol propyl ether, dipropylene glycol methyl ether, dipropylene glycol ethyl ether, methoxytriglycol, ethoxytriglycol, butoxytriglycol, 1-butoxyethoxy-2-propanol, 3-methyl-3-methoxybutanol, propylene glycol
  • Detergents or cleaning agents according to the invention can contain only one protease in the form of a protease conjugate according to the invention. Alternatively, they can also contain other hydrolytic enzymes or other enzymes in a concentration appropriate for the effectiveness of the agent. A further embodiment of the invention thus represents agents which further comprise one or more other enzymes.
  • Further enzymes are advantageously present in the agent in an amount of 1 x 10 -8 to 5 percent by weight based on active protein.
  • Each further enzyme is increasingly preferably contained in agents according to the invention in an amount of 1 x 10 -7 to 3 wt. %, from 0.00001 to 1 wt. %, from 0.00005 to 0.5 wt. %, from 0.0001 to 0.1 wt. % and particularly preferably from 0.0001 to 0.05 wt. %, based on active protein.
  • the enzymes particularly preferably show synergistic cleaning performance against certain soilings or stains, ie the enzymes contained in the agent composition support each other in their cleaning performance.
  • the subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase® and Savinase® respectively by the company Novozymes.
  • Protease variants are derived from the protease from Bacillus lentus DSM 5483.
  • Other useful proteases are, for example, those sold under the trade names Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase®, Progress Uno 101 L® and Ovozyme® by the company Novozymes, which are sold under the trade names, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase®, Properase®, Preferenz P100® and Preferenz P300® from Danisco/DuPont, the enzymes sold under the trade name Lavergy pro 104 LS® from BASF, the enzymes sold under the trade name Protosol® from Advanced Biochemicals Ltd., the enzymes sold under the trade name Wuxi® from Wuxi Snyder Bioproducts
  • proteases from Bacillus gibsonii and Bacillus pumilus which are disclosed in WO 2008/086916, WO 2007/131656, WO 2017/215925, WO 2021/175696 and WO 2021/175697, are also particularly preferably used.
  • Other proteases which can be used advantageously are disclosed in, for example, WO 91/02792, WO 2008/007319, WO 93/18140, WO 01/44452, GB 1243784 A, WO 96/34946, WO 02/029024 and WO 03/057246.
  • Suitable lipases and cutinases are those of bacterial or fungal origin. Chemically modified or mutated enzymes generated by protein engineering are included. Examples are lipase from Thermomyces, e.g. from T. lanuginosus (formerly called Humicola lanuginosa) as described in EP 0258068 and EP 0305216, cutinase from Humicola, e.g. H. insolens (WO 96/13580), lipase from strains of Pseudomonas (some of them now renamed Burkholderia), e.g. P. alcaligenes or P. pseudoalcaligenes (EP 0218272), P. cepacia (EP 0331376), P.
  • Thermomyces e.g. from T. lanuginosus (formerly called Humicola lanuginosa) as described in EP 0258068 and EP 0305216
  • cutinase from Humicola e.g.
  • cutinases that were originally isolated from Fusarium solani pisi and Humicola insolens can be used. Lipases that are also suitable are available from the Amano company under the names Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B® or Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillus sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-AP® and Lipase AML®. Lipases and cutinases from the Danisco/DuPont company can be used, for example, whose starting enzymes were originally isolated from Pseudomonas mendocina and Fusarium solanii.
  • lipases also referred to as acyltransferases or perhydrolases
  • acyltransferases with homology to Candida antarctica lipase A (WO 2010/111143), acyltransferase from Mycobacterium smegmatis (WO 2005/056782), perhydrolases from the CE 7 family (WO 2009/067279) and variants of M. smegmatis perhydrolase, in particular the S54V variant used in the commercial product Gentle Power Bleach from Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 2010/100028).
  • Preferred commercial lipase products include LipolaseTM, LipexTM, LipolexTM and LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (Genencor / DuPont) and Lipomax (Gist-Brocades).
  • oxidoreductases e.g. oxidases, oxygenases, catalases, peroxidases such as halo-, chloro-, bromo-, lignin-, glucose- or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases)
  • organic compounds, particularly aromatic ones, which interact with the enzymes are also added in order to increase the activity of the oxidoreductases in question (enhancers) or to ensure the flow of electrons in the event of very different redox potentials between the oxidizing enzymes and the soiling (mediators).
  • the enzymes to be used can also be formulated together with accompanying substances, for example from fermentation.
  • the enzymes are preferably used as enzyme liquid formulation(s).
  • the enzymes are usually not provided in the form of pure protein, but rather in the form of stabilized, storable and transportable preparations.
  • These include Prefabricated preparations include, for example, solid preparations obtained by granulation, extrusion or lyophilization or, in particular in the case of liquid or gel-like agents, solutions of the enzymes, advantageously as concentrated as possible, with little water and/or mixed with stabilizers or other auxiliary agents.
  • water-soluble films such as those used in the packaging of detergents and cleaning agents in unit dosage form.
  • Such a film enables the release of the enzymes after contact with water.
  • water-soluble refers to a film structure that is preferably completely water-soluble.
  • a film consists of (fully or partially hydrolyzed) polyvinyl alcohol (PVA).
  • Another subject of the invention is a method for cleaning textiles or hard surfaces, which is characterized in that an agent according to the invention is used in at least one method step.
  • the method described above is characterized in that the protease conjugate is used at a temperature of 0°C to 100°C, preferably 20°C to 60°C, more preferably 20°C to 40°C and most preferably at 30°C.
  • Conjugates according to the invention consisting of protease, linker and peptide:
  • N-terminal peptide N-peptide-flexible linker-protease-C (the linker is printed in bold and italics for visual differentiation)
  • variant 1 Compared to the wild-type protease (SEQ ID NO:3), variant 1 has the following mutations:
  • Protease activity is determined in a discontinuous assay using casein as a substrate.
  • the final concentration of the substrate solution is 12 mg/ml casein (prepared according to Hammarsten; Merck, Darmstadt, #2242) and 30 mM Tris in synthetic tap water.
  • Synthetic tap water is a solution of 0.029% (w/v) CaCL ⁇ 2H2O, 0.014% (w/v) MgCL ⁇ 6H2O and 0.021% (w/v) NaHCCh with 15° dH (German hardness).
  • the substrate solution is heated to 70°C and its pH is adjusted to 8.5 at 50°C using 0.1 N NaOH.
  • the protease solution is prepared by adding 2% (w/v) anhydrous pentasodium tripolyphosphate to synthetic tap water and adjusting to pH 8.5 with hydrochloric acid. To 600 ⁇ l of casein solution is added 200 ⁇ l of enzyme solution. The mixture is incubated at 50°C for 15 minutes. The reaction is terminated by the addition of 600 ⁇ l of 0.44 M trichloroacetic acid (TCA), 0.22 M sodium acetate in 3% (w/v). After a cooling step of 15 minutes on ice, the TCA insoluble protein is removed by centrifugation.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the brighter the fabric the better the cleaning performance.
  • An AY variant was determined for each soil and all AY values of the 6 soils per variant were added up once to determine ⁇ AY variant.
  • the fusion constructs show a significantly increased washing performance compared to the parent protease, regardless of the peptide or linker.
  • the protease activity is particularly improved in combination with the peptides SEQ ID NO. 24 and SEQ ID NO. 28, when these are located at the N-terminus of the protease, regardless of the linkers.

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Abstract

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie. Die Erfindung betrifft Proteasen, welche kovalent mit einer heterologen Peptidsequenz verbunden sind, wodurch den Proteasen eine bessere Reinigungsleistung verliehen wird. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendungen dieser Proteasekonjugate und Verfahren, in denen sie eingesetzt werden, sowie diese enthaltende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel.

Description

VERBESSERTE WASCHLEISTUNG DURCH DEN EINSATZ EINER PROTEASE FUSIONIERT MIT SPEZIELLEM ADHÄSIONSVERMITTLERPEPTID
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie. Die Erfindung betrifft Proteasen, welche kovalent mit einer heterologen Peptidsequenz verbunden sind, wodurch den Proteasen eine bessere Reinigungsleistung verliehen wird. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendungen dieser Proteasekonjugate und Verfahren, in denen sie eingesetzt werden, sowie diese enthaltende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel.
Proteasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Für Wasch- und Reinigungsmittel sind sie die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme. Sie bewirken den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Hierunter sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren Serin-Proteasen sind. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen und hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet z.B. der Artikel „Subtilases: Subtilisin-Iike Proteases“ von R. Siezen, Seite 75-95 in „Subtilisin enzymes“, herausgegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen gebildet. Hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten und sezernierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.
Beispiele für die in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens und Carlsberg aus Bacillus liehen! formis, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Protease aus Bacillus lentus, insbesondere aus Bacillus lentus DSM 5483, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7, sowie Varianten der genannten Proteasen, die eine gegenüber der Ausgangsprotease veränderte Aminosäuresequenz aufweisen. Proteasen werden durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren gezielt oder zufallsbasiert verändert und so z.B. für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln optimiert. Dazu gehören Punktmutagenese, Deletionsoder Insertionsmutagenese oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen. So sind für die meisten aus dem Stand der Technik bekannten Proteasen entsprechend optimierte Varianten bekannt. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von dem Unternehmen Novozymes erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase® bzw. Savinase® von dem Unternehmen Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Protease-Varianten ab. Weitere brauchbare Proteasen sind z.B. die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von dem Unternehmen Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase® und Properase® von dem Unternehmen Danisco/Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von dem Unternehmen Advanced Biochemicals Ltd., das unter dem Handelsnamen Wuxi® von dem Unternehmen Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von dem Unternehmen Amano Pharmaceuticals Ltd., und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von dem Unternehmen Kao Corp, erhältlichen Enzyme. Besonders bevorzugt eingesetzt werden auch die Proteasen aus Bacillus gibsonii und Bacillus pumilus, die offenbart sind in den internationalen Patentanmeldungen WO 2008/086916 und WO 2007/131656, sowie EP 2016175. Weitere vorteilhaft einsetzbare Proteasen sind offenbart in den Patentanmeldungen WO 91/02792, WO 2008/007319, WO 93/18140, WO 01/44452, GB 1243784, WO 96/34946, WO 2002/029024 und WO 2003/057246. Weitere verwendbare Proteasen sind diejenigen, die in den Mikroorganismen Stenotrophomonas maltophilia, insbesondere Stenotrophomonas maltophilia K279a, Bacillus intermedius sowie Bacillus sphaericus natürlicherweise vorhanden sind.
Generell sind nur ausgewählte Proteasen für den Einsatz in flüssigen Tensid-haltigen Zubereitungen überhaupt geeignet. Viele Proteasen zeigen in derartigen Zubereitungen keine ausreichende katalytische Leistung. Für die Anwendung von Proteasen in Reinigungsmitteln ist daher eine hohe katalytische Aktivität unter Bedingungen wie sie sich während eines Waschgangs darstellen und eine hohe Lagerstabilität besonders wünschenswert.
Folglich haben Protease- und Tensid-haltige flüssige Formulierungen aus dem Stand der Technik den Nachteil, dass die enthaltenen Proteasen unter Standard-Waschbedingungen (z.B. in einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C) keine zufriedenstellende proteolytische Aktivität aufweisen oder nicht lagerstabil sind und die Formulierungen daher keine optimale Reinigungsleistung an Protease-sensitiven Anschmutzungen zeigen.
Überraschenderweise wurde jetzt festgestellt, dass eine wie hierin definiert Protease, insbesondere eine Protease aus Bacillus pumilus, oder eine hierzu hinreichend ähnliche Protease (bezogen auf die Sequenzidentität), in Kombination mit einem kovalent gebundenen, heterologen Adhäsionsvermittlerpeptid hinsichtlich der Reinigungsleistung gegenüber der Protease an sich verbessert ist und daher besonders für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln geeignet ist.
Überraschenderweise haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Leistung von Proteasen signifikant gesteigert werden kann, wenn diese mit speziellen adhäsionsvermittelnden Peptiden fusioniert werden. Dieser Effekt wurde hierin mit einer beispielhaften Protease demonstriert, ist aber ebenso auf andere Proteasen übertragbar. Die Leistung der Proteasen wird durch Fusion mit den hierin beschriebenen Peptiden, welche als Adhäsionsvermittler fungieren, derart gesteigert, dass die eingesetzte Konzentration ohne Leistungsverlust signifikant verringert werden kann.
Daher richtet sich die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Proteasekonjugat, bestehend aus A) einer Protease, vorzugsweise eine Protease vom Subtilisin Typ, besonders aus Bacillus pumilus, wobei die Protease proteolytische Aktivität aufweist;
B) mindestens einem heterologen Peptid, welches kovalent mit der Protease verbunden ist; und optional
C) mindestens einem Linker, vorzugsweise mindestens einem Peptidlinker, bevorzugt einem Peptidlinker; wobei es sich bei dem heterologen Peptid um ein Peptid umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt 10 bis 24 Aminosäuren handelt, wobei
(a) die Aminosäuresequenz in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Sequenz aufweist
(C)mXlX2X3(X4)nX5(C)o, wobei Xi eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder K, noch bevorzugter R, X2 und X3 ungeladene Aminosäuren sind, vorzugsweise ausgewählt aus A, L, S, I, M und Q, noch bevorzugter aus A, S, I und L, insbesondere A und L, jedes X4 unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G; X5 eine beliebige positiv geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder eine ungeladene Aminosäure, noch bevorzugter Q, A oder L, insbesondere A oder L, m und 0 0 oder 1 sind, wobei m+o = 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 46, bevorzugt von 6 bis 20 ist; oder
(b) die Aminosäuresequenz mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, mindestens 87%, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, mindestens 99,5% oder
100% Sequenzidentität mit einer der in SEQ ID NOs: 19-20 oder 21-25 genannten
Aminosäuresequenzen aufweist.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Nukleinsäure kodierend für ein Proteasekonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine nicht-menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein Proteasekonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteasekonjugats umfassend a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung; und b) Isolieren des Proteasekonjugats aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Proteasekonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung enthält. In noch einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren ein zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet wird.
Schließlich richtet sich die vorliegende Erfindung in einem letzten Aspekt auch auf die Verwendung eines Proteasekonjugats gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Wasch- oder Reinigungsmittel zur Entfernung von peptid- oder proteinhaltigen Anschmutzungen.
Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der beiliegenden Beschreibung.
Alle Prozentangaben sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozent (Gew.-%).
Numerische Bereiche, die in dem Format „von x bis y“ angegeben sind, schließen die genannten Werte ein. Wenn mehrere bevorzugte numerische Bereiche in diesem Format angegeben sind, ist es selbstverständlich, dass alle Bereiche, die durch die Kombination der verschiedenen Endpunkte entstehen, ebenfalls erfasst werden.
„Mindestens ein“, wie hierin verwendet, bedeutet 1 oder mehr, z.B. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder mehr. Bezogen auf einen Bestandteil oder eine Verbindung bezieht sich dieser Begriff, sofern nicht anders angegeben, nicht auf die absolute Anzahl der Moleküle, sondern vielmehr auf die Anzahl der verschiedenen Arten von Molekülen, die unter die jeweilige Definition des Bestandteils oder der Verbindung fallen. „Mindestens eine Protease“ bedeutet somit, dass mindestens eine Art von Protease enthalten ist, aber nicht, dass mindestens ein Proteasemolekül enthalten ist.
„Etwa“, „ca.“ oder „ungefähr“, wie hierin in Bezug auf einen Zahlenwert verwendet, beziehen sich auf den entsprechenden Zahlenwert ±10%, vorzugsweise ±5%.
„Im Wesentlichen frei von“ bedeutet, dass die Zusammensetzung bzw. das Mittel weniger als 2 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 1 Gew.-%, weiter bevorzugt weniger als 0,5 Gew.-% und besonders bevorzugt weniger als 0,1 Gew.-%, der entsprechenden Substanz, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung/des Mittels, enthält.
„Flüssig“, wie hierin verwendet, schließt Flüssigkeiten und Gele sowie auch pastöse Zusammensetzungen ein. Es ist bevorzugt, dass die flüssigen Zusammensetzungen bei Raumtemperatur fließfähig und gießbar sind, es ist aber auch möglich, dass sie eine Fließgrenze aufweisen. Ein Stoff, z.B. eine Zusammensetzung oder ein Mittel ist gemäß Definition der Erfindung festförmig, wenn sie bei 25°C und 1 .013 mbar im festen Aggregatzustand vorliegt. Ein Stoff, z.B. eine Zusammensetzung oder ein Mittel ist gemäß Definition der Erfindung flüssig, wenn sie bei 25°C und 1 .013 mbar im flüssigen Aggregatzustand vorliegt. Dabei umfasst flüssig auch gelförmig.
„Heterolog“, wie hierin in Bezug auf die Peptidsequenz verwendet, bezieht sich darauf, dass die Peptidsequenz, welche adhäsionsvermittelnd wirkt, natürlicherweise nicht in Kombination mit der Protease vorkommt. Die hierin beschriebenen Konjugate sind somit nicht natürliche Hybride aus einer Protease und einem mit der Protease nicht verwandten Peptid.
Unter „Adhäsion“ wird im Kontext dieser Erfindung eine Wechselwirkung zwischen dem Peptid und einer Oberfläche verstanden, wodurch das Peptid an der Oberfläche haften kann. Somit bezeichnet ein „adhäsionsvermittelnd“ die Fähigkeit, unter geeigneten Bedingungen, d.h. üblicherweise nicht denaturierenden Bedingungen, an verschiedene Oberflächen, z.B. textile Oberflächen, zu wechselwirken und/oder an einer bestimmten Oberfläche zu haften, wobei die Bindungsaffinität größer ist als die einer Referenzsequenz, die keine adhäsionsvermittelnden Eigenschaften aufweist.
Der Begriff „Variante“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Varianten eines Enzyms oder eines Proteins/Peptids, die weiterhin die Funktionalität des Ausgangsmoleküls aufweisen, sich aber von der Ausgangssequenz durch eine oder mehrere Sequenzabweichungen, z.B. 1 , 2 oder 3 oder mehr Sequenzabweichungen, z.B. eine Substitution, Deletion oder Insertion unterscheiden. Die Sequenzidentität solcher Varianten kann im Bereich von 80% bezogen auf die gesamte Länge des Ausgangspeptids liegen, und kann mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 99,5% betragen.
Wenn hierin auf verschiedene miteinander verbundene oder einzelne Aminosäuresequenzen Bezug genommen wird, sind diese, sofern nicht anders angegeben, immer in N- zu C-terminaler Orientierung dargestellt. Ferner sind die einzelnen Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen miteinander über Peptidbindungen verbunden, sofern nicht anders angegeben. Demnach bedeutet der Bindestrich in der Darstellung Protease-Linker-Peptid z.B., dass diese entsprechenden drei Sequenzen über Peptidbindungen miteinander fusioniert sind.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. z.B. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403- 410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden z.B. die Clustal-Serie (vgl. z.B. Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T-Coffee (vgl. z.B. Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen bzw. Algorithmen basieren. Ferner möglich sind Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTIR Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standard Parametern, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert, oder Clone Manager 10 (Verwendung der Scoring Matrix BLOSUM 62 für Sequenz- Alignment auf Aminosäureebene). Soweit nicht anders angegeben, wird die hierin angegebene Sequenzidentität mit dem BLAST-Algorithmus bestimmt.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, d.h. dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Peptids/Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch als Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Peptide, Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäureoder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Peptids/Proteins aber essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz.
Die Peptid- oder Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, z.B. dem BCA- Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2‘-Bichinolyl-4,4‘-dicarbonsäure) oder dem Biuret- Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751-766) bestimmt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet der Peptid- und Proteintechnologie kennt eine Vielzahl geeigneter Verfahren zur Bestimmung der Peptid- oder Proteinkonzentration, die im Rahmen dieser Erfindung angewendet werden können.
Die Peptide können Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure- Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Peptide sind z.B. durch gezielte genetische Veränderung, d.h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (z.B. hinsichtlich ihrer Stabilität, Bindung, usw.) optimiert. Beispielsweise können in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen eingeführt werden, um z.B. bestimmte Eigenschaften zu verändern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit einer Oberfläche verändert werden. So kann z.B. die Nettoladung der Peptide verändert werden, um darüber die Substratbindung zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen z.B. die Stabilität oder Adsorption des Peptids erhöht werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen.
Der Begriff „konservative Aminosäuresubstitution“ bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z.B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen z.B.: G=A=S, l=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T. Es kann aber bevorzugt sein, dass derartige Austausche als Zielaminosäure nicht Glycin oder Tyrosin haben oder z.B. auch keine Aminosäure, die ein niedriges alpha-Helix-bildendes Potential hat.
Ein erfindungsgemäßes Proteasekonjugat besteht aus
A) einer Protease, Protease, vorzugsweise eine Protease vom Subtilisin Typ, besonders aus Bacillus pumilus, wobei die Protease proteolytische Aktivität aufweist;
B) mindestens einem heterologen Peptid, welches kovalent mit der Protease verbunden ist; und optional
C) mindestens einem Linker, vorzugsweise mindestens einem Peptidlinker, bevorzugt einem Peptidlinker; wobei es sich bei dem heterologen Peptid um ein Peptid umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt 10 bis 24 Aminosäuren handelt, wobei
(a) die Aminosäuresequenz in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Sequenz aufweist
(C)mXlX2X3(X4)nX5(C)o, wobei Xi eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder K, noch bevorzugter R, X2 und X3 ungeladene Aminosäuren sind, vorzugsweise ausgewählt aus A, L, S, I, M und Q, noch bevorzugter aus A, S, I und L, insbesondere A und L, jedes X4 unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G; X5 eine beliebige positiv geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder eine ungeladene Aminosäure, noch bevorzugter Q, A oder L, insbesondere A oder L, m und 0 0 oder 1 sind, wobei m+o = 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 46, bevorzugt von 6 bis 20 ist; oder
(b) die Aminosäuresequenz mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, mindestens 87%, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, mindestens 99,5% oder
100 % Sequenzidentität mit einer der SEQ ID NOs: 19-20 oder 21-25 genannten Aminosäuresequenzen aufweist.
A) Protease Proteasen, welche als Bestandteil des erfindungsgemäßen Proteasekonjugats in Frage kommen, schließen sämtliche bekannten und noch unbekannte Proteasen ein, insbesondere jene, die im Stand der Technik bekannt sind.
Bei den im Kontext der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteasen handelt es sich um Proteasen, welche enzymatische Aktivität aufweisen, d.h. sie sind zur Hydrolyse von Peptiden und Proteinen befähigt, insbesondere in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. Eine geeignete Protease ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Amid/Peptidbindungen in Protein/Peptid- Substraten katalysiert und dadurch in der Lage ist, Proteine oder Peptide zu spalten. Ferner handelt es sich bei einer geeigneten Protease vorzugsweise um eine reife (mature) Protease, d.h. um das katalytisch aktive Molekül ohne Signal- und/oder Propeptid(e). Soweit nicht anders angegeben beziehen sich auch die angegebenen Sequenzen auf jeweils reife (prozessierte) Enzyme.
Beispiele für Proteasen sind die Subtilisine BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens und Carlsberg aus Bacillus licheniformis, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von dem Unternehmen Novozymes erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase® bzw. Savinase® von dem Unternehmen Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich Proteasevarianten ab. Weitere brauchbare Proteasen sind z.B. die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase®, Progress Uno 101 L® und Ovozyme® von dem Unternehmen Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase®, Properase®, Preferenz P100® und Preferenz P300® von dem Unternehmen Danisco/DuPont, das unter dem Handelsnamen Lavergy pro 104 LS® von dem Unternehmen BASF, das unter dem Handelsnamen Protosol® von dem Unternehmen Advanced Biochemicals Ltd., das unter dem Handelsnamen Wuxi® von dem Unternehmen Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von dem Unternehmen Amano Pharmaceuticals Ltd., und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von dem Unternehmen Kao Corp, erhältlichen Enzyme. Besonders bevorzugt eingesetzt werden auch die Proteasen aus Bacillus gibsonii und Bacillus pumilus, die offenbart sind in WO 2008/086916, WO 2007/131656, WO 2017/215925, WO 2021/175696 und WO 2021/175697. Weitere vorteilhaft einsetzbare Proteasen sind offenbart in z.B. WO 91/02792, WO 2008/007319, WO 93/18140, WO 01/44452, GB 1243784 A, WO 96/34946, WO 02/029024 und WO 03/057246. Weitere verwendbare Proteasen sind diejenigen, die in den Mikroorganismen Stenotrophomonas maltophilia, insbesondere Stenotrophomonas maltophilia K279a, Bacillus intermedius sowie Bacillus sphaericus natürlicherweise vorhanden sind.
Bevorzugte Proteasen umfassen a) eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% oder 98,8% identisch ist und, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:2, (i) an der Position, die der Position 101 entspricht, die Aminosäuresubstitution R101 E, und (ii) an den mindestens einer der Positionen, die den Positionen 3, 4, 45, 55, 58, 59, 61 , 87, 97, 98, 106, 117, 120, 124, 129, 136, 137, 143, 156, 161 , 163, 171 , 172, 185, 199, 205, 209, 222, 238, 244, 261 und 262 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus S3T, V4I, R45E, R45D, R45Q, P55N, T58W, T58Y, T58L, Q59D, Q59M, Q59N, Q59T, G61 D, G61 R, S87E, G97S, A98D, A98E, A98R, S106A, S106W, N117E, H120V, H120D, H120K, H120N, S124M, P129D, E136Q, Q137H, S143W, S156D, S161T, S163A, S163G, Y171 L, A172S, N185Q, V199M, V205I, Y209W, M222Q, N238H, V244T, N261T und L262N, L262Q, L262D, L262E bestehenden Gruppe ausgewählt ist, aufweist; wobei die Aminosäuresubstitutionskombination der Gruppe (ii) vorzugsweise aus der aus N238E-L262E, S156D-L262E, S3T-V4I-V205I, S3T-V4I-A228V, G195E- V199M, H120D-S163G-N261 D, N76D-A228V-N261 D, S3T-N76D-S156D-Y209W, Q137H-S141 H- R145H-N238E-L262E, Q137H-S141 H-R145H-S156D-L262E, N76D-Q137H-S141 H-R145H- A228V-N261 D, N76D-Q137H-S141 H-R145H-S163G-N238E, H120D-Q137H-S141 H-R145H-
S163G-N261 D, S3T-N76D-Q137H-S141 H-R145H-S156D-Y209W bestehenden Gruppe ausgewählt ist; b) eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:3 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist und, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:2, (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 130, 133, 144, 217, 252 und 271 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus P9T, N130D, N130V, T133A, N144K, Y217M, N252T und Q271 E bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und (ii) an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 63, 89, 99, 101 , 131 , 156, 166, 170, 187, 188, 189, 211 und 224 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus Y6F, Y6W, F61 G, Q62N, S63Q, S89A, S89G, N99H, D101S, D101 E, D101A, G131 H, G131Y, G131 F, S156R, G166A, G166M, G166L, G166I, K170R, K170G, N187D, N188G, S189T, S189L, S189I, S189R, S211 N, S211 Q, S224A, S224G bestehenden Gruppe ausgewählt ist, aufweist, wobei die Protease vorzugsweise eine Aminosäuresubstitutionskombination aufweist, die aus der aus P9T-N130D-T133A-N144K-G166M- S189T-Y217M-N252T-Q271 E, P9T-N130D-T133A-N 144K-G166M-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E, P9T-N130D-T133A-N144K-G166M-S211 N-Y217M-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-
G131 H-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A- N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N187D-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T- S89A-N130D-T133A-N144K-S189R-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A- N144K-N187D-S189R-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 S-N130D-T133A-N144K- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 E-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M- S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E, P9T-S89A-N99H-N130D-T133A-N144K-K170R-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S156R-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S63Q-S89A- N130D-T133A-N144K-G166A-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-F61 G-Q62-N-S89A- N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-N130D-T133A- N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T- Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-F61 G-Q62N-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T- Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M- S224A-N252T-Q271 E bestehenden Gruppe ausgewählt ist; c) eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% oder 98,8% identisch ist und, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 (i) an den Positionen, die den Positionen 3, 4, 99 und 199 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen S3T, V4I, R99E und V199I, und (ii) an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 74, 136, 143, 154, 160, 161 , 163, 171 , 181 , 183, 185, 200, 203, 209, 212 oder 256 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus N74D, N74E, N74Q, A136Q, R143L, R143W, R143Y, S154D, S154Q, S160G, Y161T, A163G, V171 L, A181 D, F183R, Q185R, Q200A, Q200L, Q200S, Q200T, Y203K, Y203V, Y203W, A209K, A209W, N212S, N212T und L256D, L256E und L256Q bestehenden Gruppe ausgewählt ist, aufweist, wobei die Protease vorzugsweise eine Aminosäuresubstitutionskombination aufweist, die aus der aus S3T-V4I-R99E-V199I-Q200L- Y203W, S3T-V4I-R99E-V199I-N212S, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D, S3T-V4I-R99E-V199I-S154D- L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-Q200L-Y203W-S154D-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-Q200L- Y203W, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-S154D-Q200L-Y203W-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D- N212S, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-S154D-Y203W-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-Y203W, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-S154D-Q200L-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-Q200L, S3T-V4I- R99E-V199I-S154D-Q200L-Y203W, S3T-V4I-R99E-V199I-Q200L-Y203W-L256E, S3T-V4I-R99E- V199I-A136Q-R143W-Y161 T-Q200L, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-R143Y-A209W-N212S-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-S154D-Y203W-L256E; S3T-V4I-R99E-V199I-Q200L-Y203W-A209K- S154D-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-S154D-S160G-Q185R-Q200L-Y203W-L256E, S3T-V4I- R99E-V199I-S154D-A181 D-F183R-Q200L-Y203W-L256E und S3T-V4I-R99E-V199I-A136Q- S154D-V171 L-Q200L bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind Proteasen vom Subtilisin Typ, insbesondere solche aus Bacillus pumilus, wie z.B. offenbart in DE 102020105721 A1 , DE 102020205400 A1 , DE 102016204814 A1 , DE 102016208463 A1 , DE 102017215628 A1 sowie DE 102017215629 A1.
Besonders bevorzugt ist die Protease ausgewählt aus Proteasen der Gruppe b).
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Protease um eine Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:3 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist und, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO: 2 (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 130, 133, 144, 217, 252 und 271 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus P9T, N130D, N130V, T133A, N144K, Y217M, N252T und Q271 E bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und (ii) an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 63, 89, 99, 101 , 131 , 156, 166, 170, 187, 188, 189, 211 und 224 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus Y6F, Y6W, F61G, Q62N, S63Q, S89A, S89G, N99H, D101S, D101 E, D101A, G131 H, G131Y, G131 F, S156R, G166A, G166M, G166L, G166I, K170R, K170G, N187D, N188G, S189T, S189L, S189I, S189R, S211 N, S211 Q, S224A, S224G bestehenden Gruppe ausgewählt ist, aufweist, wobei die Protease vorzugsweise die folgende Aminosäuresubstitutionskombination aufweist: P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E.
B) Peptid
Bei dem erfindungsgemäß mit der Protease, wie voranstehend beschrieben und definiert, verbundenen heterologen Peptid, welches als Adhäsionsvermittler für die Protease fungiert, handelt es sich um ein Peptid umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 8, 9, 10, 11 , oder 12 Aminosäuren Länge. Bevorzugte Längen sind bis 40, bis 35, bis 30, oder bis 25 oder bis 24 Aminosäuren. Beispielsweise kann das Peptid eine Länge von 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 oder 24 Aminosäuren, insbesondere 12 bis 18 Aminosäuren haben.
Die Peptide weisen
(a) in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Aminosäuresequenz auf (C)mXlX2X3(X4)nX5(C)o, wobei Xi eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder K, noch bevorzugter R, X2 und X3 ungeladene Aminosäuren sind, vorzugsweise ausgewählt aus A, L, M, S, I und Q, bevorzugter aus A, S, I und L, insbesondere aus A und L, jedes X4 unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G; X5 eine beliebige positiv geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder eine ungeladenen Aminosäure, noch bevorzugter Q, A oder L, insbesondere A oder L, m und 0 0 oder 1 sind, wobei m+o = 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 46, bevorzugt von 6 bis 20 ist, z.B. 9, 10, 11 , 12 oder 13.
Alternativ oder zusätzlich umfassen oder bestehen die Peptide aus einer Aminosäuresequenz die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 81 %, mindestens 82%, mindestens 83%, mindestens 84% oder mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, mindestens 87 %, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91 %, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% Sequenzidentität mit einer der in SEQ ID NOs: 16-17 und/oder 18-22 genannten Aminosäuresequenzen aufweist.
Unter einem „Peptid“ im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein aus Aminosäuren, bevorzugt den 20 proteinogenen L-Aminosäuren, zusammengesetztes, vorzugsweise linear aufgebautes Polymer zu verstehen, das bis zu 100 Aminosäuren aufweist, welche über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Die Peptide der Erfindung weisen eine Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren auf. Die Aminosäuren werden im Kontext dieser Erfindung im Ein-Buchstaben-Code angegeben, wobei z.B. C für Cystein, R für Arginin, A für Alanin und L für Leucin steht. Insbesondere steht „C“ in obiger Sequenz (C)mXiX2X3(X4)nX5(C)ofür einen Cysteinrest. Es ist ferner klar, dass sofern nicht anders angegeben, die Aminosäuren in einer hierin offenbarten Aminosäuresequenz über Peptidbindungen verknüpft sind und die Sequenz, sofern nicht anders angegeben, in N- zu C-terminaler Orientierung aufgeführt ist.
Die Peptide können in verschiedenen Ausführungsformen chemisch synthetisiert und/oder rekombinant mittels Proteindesign hergestellt worden sein. Kurze Peptide sind heutzutage einfach synthetisch, z.B. über Festphasensynthese, darstellbar. Längere Peptide und Polypeptide werden dagegen häufig auch rekombinant in Wirtsorganismus hergestellt.
Der Begriff „N-Terminus“ oder „N-terminal“ beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung typischerweise das Ende der Aminosäurekette des Peptids, welches eine freie Aminogruppe aufweist.
Der Begriff „C-Terminus“ oder „C-terminal“ beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung typischerweise das Ende der Aminosäurekette des Peptids, welches eine freie Carboxylgruppe aufweist.
Der Ausdruck „in N- zu C-terminaler Orientierung“ bezieht sich im Kontext dieser Erfindung auf eine Aminosäuresequenz, in der die Reihenfolge der Aminosäuren ausgehend vom N-Terminus hin zum C-Terminus beschrieben werden.
Typische saure oder negativ geladene Aminosäuren (abhängig vom pH-Wert) sind D und E.
Zu den positiv geladenen oder basischen Aminosäuren (abhängig vom pH-Wert) zählen typischerweise R, K und H. Aminosäuren wie G, A, C, I, L, M, F, V, P, S, T, W, Y, N und Q sind typischerweise ungeladene, d.h. neutrale Aminosäuren.
Wenn hierin auf eine „beliebige“ Aminosäure Bezug genommen wird, ist hiermit üblicherweise eine der 20 natürlich vorkommenden proteinogenen Aminosäuren gemeint, d.h. eine von Glycin (G), Alanin (A), Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I), Phenylalanin (F), Serin (S), Threonin (T), Prolin (P), Methionin (M), Cystein (C), Histidin (H), Lysin (K), Arginin (R), Glutamin (Q), Asparagin (N), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Tyrosin (Y) und Tryptophan (W). Die Aminosäuren sind, sofern nicht anders angegeben, typischerweise L-Aminosäuren. In alternativen Ausführungsformen kann das Peptid auch aus D-Aminosäuren bestehen, wobei es allerdings bevorzugt sein kann, dass innerhalb der hierin beschriebenen Peptide nicht gleichzeitig D- und L-Aminosäuren vorkommen. In verschiedenen Ausführungsformen erfasst eine derartige beliebige Aminosäure alle der vorgenannten Aminosäuren mit der Ausnahme von Prolin, bzw. in manchen Ausführungsformen auch mit Ausnahme von Prolin und Glycin. Diese beiden Aminosäuren sind in bestimmten Ausführungsformen nicht bevorzugt, da diese Helix-brechende Eigenschaften aufweisen und daher die Sekundärstruktur der Peptide nachteilig beeinflussen können.
In bevorzugten Ausführungsformen weist das Peptid eine Gesamtladung von -2 bis +12, vorzugsweise von 0 bis +8, noch bevorzugter von 0 bis +4, insbesondere von 0 bis +2 auf. Die Gesamtladung des Peptids basiert auf der Anzahl von positiv und negativ geladenen Aminosäuren im Peptid, insbesondere Arginin (R), Lysin (K), Histidin (H), Asparaginsäure (D) und Glutaminsäure (E) und ergibt sich aus der Summe der negativen und positiven Ladungen, wobei sich jeweils eine positive und eine negative Ladung aufheben. Ein Peptid mit 2 Arginin-Resten und 1 Glutaminsäure-Rest hätte somit eine Gesamtladung von +1 . Die Gesamtladung des Peptids beträgt bevorzugt -2 bis +12, stärker bevorzugt 0 bis +8, noch stärker bevorzugt 0 bis +4, insbesondere 0 bis +2.
In bevorzugten Ausführungsformen weist das Peptid
(i) eine Gesamtladung von -2 bis +12, vorzugsweise von 0 bis +8, noch bevorzugter von 0 bis +4, insbesondere von 0 bis +2 auf; und/oder
(ii) am N-Terminus, der die ersten 3-4 Aminosäuren umfasst, eine positive Nettoladung auf; und/oder
(iii) am C-Terminus, der die letzten 3-6 Aminosäuren umfasst, eine negative oder neutrale Nettoladung auf, vorzugsweise mindestens eine negative geladene Aminosäure, insbesondere E; und/oder
(iv) kein P und noch bevorzugter auch kein G und insbesondere auch kein Y auf.
Alle vorgenannten Merkmale, insbesondere (i)-(iv), können individuell oder in jeder beliebigen Kombination verwirklicht sein.
Das Merkmal, dass das Peptid am „N-Terminus, der die ersten 3-4 Aminosäuren umfasst, eine positive Nettoladung“ aufweist, bedeutet, dass die N-terminalen 3-4 Aminosäuren mehr positive geladene als negative geladene Aminosäure umfassen. In verschiedenen Ausführungsformen ist dieses Merkmal z.B. dann erfüllt, wenn die N-terminalen 3-4 Aminosäuren 1 oder 2 positive geladene Aminosäuren, d.h. H, K oder R, vorzugsweise K oder R, noch bevorzugter R, und keine negativ geladenen Aminosäure wie E oder D aufweisen. Sofern der N-Terminus eine negativ geladene Aminosäure enthält, muss die Zahl an positiv geladenen Aminosäuren mindestens 2 betragen, damit die Nettoladung positiv bleibt.
Für das Merkmal, dass das Peptid am „C-Terminus, der die letzten 3-6 Aminosäuren umfasst, eine negative oder neutrale Nettoladung“ aufweist bedeutet, dass die Zahl der geladenen Aminosäuren 0 sein muss oder die Zahl der negativ geladenen Aminosäuren, d.h. D und E, größer als die Zahl der positiv geladenen sein muss. Ein Beispiel für eine solche C-terminale Sequenz wäre z.B. EAL oder die doppelte Abfolge dieses Motivs.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist die Sequenz X1X2X3 RAL, RSI oder RLA, vorzugsweise RAL oder RLA, insbesondere RAL. Die N-terminale Sequenz RAL oder RLA weist nicht nur in vorteilhafter Weise eine positive Nettoladung auf, sie umfasst auch Aminosäuren mit einem besonders hohen alpha-Helix bildenden Potential, wie weiter unten erläutert wird. In manchen Ausführungsformen kann der Arginin-Rest auch durch Lysin ersetzt sein, besonders bevorzugt ist allerdings der N-terminale Arginin-Rest.
Ferner ist es bevorzugt, dass
(i) die Sequenz (X4)nX5 mindestens eine Sequenz XeXyXs umfasst, wobei Xe eine geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R, K, E, L, A oder Q, noch bevorzugter R, K, E oder Q, und X7 und Xe unabhängig voneinander negativ-geladene oder ungeladene Aminosäure mit Ausnahme von P und G sind, vorzugsweise A, L, E, R, Q oder M, z.B. A, L, E, Q oder M, noch bevorzugter A, E, Q oder L, noch bevorzugter A, E oder L, insbesondere A oder L; und/oder
(ii) (X4)n mindestens eine aromatische Aminosäure, vorzugsweise W oder F umfasst.
Wenn die Sequenz XeXyXs ein Xe umfasst, welches R oder K ist, ist die Sequenz XeXyXs vorzugsweise nicht am C-Terminus und vorzugsweise nicht innerhalb der 6 C-terminalen Aminosäuren. In solchen Fällen kann die Sequenz (X4)nXe eine oder mehrere weitere Sequenzen XeXyXs umfassen, die C-terminal zu der Sequenz liegen, die als Xe eine positiv geladene Aminosäure umfasst, wobei diese weiteren Sequenzen dann vorzugsweise keine positiv geladene Aminosäure als Xe aufweisen.
Es ist bevorzugt, dass eine der Sequenzen XeXyXs, die nahe, d.h. innerhalb der 6 C- terminalen Aminosäuren, oder am C-Terminus liegen, als Xe eine negativ geladene Aminosäure aufweisen, z.B. E.
Wenn das Peptid in manchen Ausführungsformen eine aromatische Aminosäure ausgewählt aus W und F enthält, befindet sich neben, insbesondere C-terminal, eine positiv oder negativ geladene Aminosäure, insbesondere befindet sich neben der aromatischen Aminosäure keine weitere aromatische Aminosäure. Die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin (F) und Tryptophan (W) werden in der erfindungsgemäßen Peptidsequenz bevorzugt als Helixbildner und/oder für das Pi-Stacking eingesetzt. Die aromatische Aminosäure Tyrosin (Y) wird in verschiedenen Ausführungsformen nicht in der Peptidsequenz verwendet, da diese Helix-brechende Eigenschaften hat. In verschiedenen Ausführungsformen ist das Peptid daher frei von Y-Resten.
„Pi-Stacking“ bezieht sich im Kontext der vorliegenden Erfindung auf die nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen aromatischen Ringsystemen.
Bevorzugt umfasst
(i) (X4)n mindestens eine Sequenz XeXyXs, wobei XeXyXs RAL oder RLA, vorzugsweise RAL, ist, und wobei diese Sequenz vorzugsweise in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 4-7 bzw. mindestens 6-7 Aminosäuren vom C-Terminus entfernt lokalisiert ist; und/oder
(ii) (X4)nX5 mindestens eine Sequenz XeXyXs umfasst, wobei XeXyXs EAL, LEA oder ELA, vorzugsweise EAL, ist, und wobei diese Sequenz vorzugsweise nicht in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 1-6 lokalisiert ist; und/oder
(iii) (X4)nX5 mindestens eine Sequenz XeXyXs umfasst, wobei XeXyXs EQA, QAL, LQA oder QLA, vorzugsweise EQA, QAL oder QLA, insbesondere QAL, ist.
In anderen möglichen Ausführungsformen umfasst (X4)nX5 mindestens eine Sequenz XeX Xa, wobei XeXyXs QLA oder EQA ist, wobei diese Sequenz vorzugsweise nicht in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 1 -6 oder 1-11 lokalisiert ist.
Es ist ferner möglich, dass (X4)nX5 mindestens eine Sequenz XeXyXsXg umfasst, wobei XeXyXsXg AQLA oder SEQA ist, wobei diese Sequenz vorzugsweise nicht in den N-terminalen Aminosäuren der Positionen 1 -6 oder 1-11 lokalisiert ist.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Peptid die Sequenz X1X2X3, wobei X1X2X3 RAL ist, und (X4)nX5 mindestens eine von QAL und EAL umfasst, vorzugsweise beide. In derartigen Ausführungsformen hat das Peptid die Sequenz
(C)mRAL(Xio)qQAL(Xii)rEAL(Xi2)s(C)0, oder
(C)mRAL(Xio)qEAL(Xii)rQAL(Xi2)s(C)0, wobei X10 und Xu unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure sind, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G; X12 eine beliebige ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise Q, A oder L, insbesondere A oder L;q und r 0 oder ganze Zahlen von 1-10 sind, vorzugsweise 0, 1 , 2 oder 3; und s 0 oder 1 ist, wobei q+r+s = 0-21 sind, vorzugsweise 0-15 oder 0-9 oder 1-15 oder 1 -9 oder 1 -6 oder 0-6 oder 0-3 oder 1 -3.
Ferner ist es bevorzugt, dass das Peptid zusätzlich mindestens eine weitere (zweite) Sequenz RAL umfasst. Diese kann, in verschiedenen Ausführungsformen, direkt C-terminal auf die erste RAL-Sequenz folgen oder von dieser durch 1-3 Aminosäuren getrennt sein, z.B. 7 durch 1 oder 3 drei Aminosäuren. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Peptid zwei Sequenzen RAL und jeweils mindestens eine Sequenz EAL und QAL. Bevorzugte Abfolgen sind:
RALRAL(Xio)qQAL(Xii)rEAL(Xi2)s,
RALRAL(Xio)qEAL(Xii)rQAL(Xi2)s
RAL(Xio)qRALQAL(Xii)rEAL(Xi2)s,
RAL(Xio)qRALEAL(Xii)rQAL(Xi2)s
RAL(Xio)qQALRAL (Xn)rEAL(Xi2)s,
RAL(Xio)qEALRAL (Xn)rQAL(Xi2)s, wobei X10 und Xu unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure sind, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G, z.B. W oder F oder weitere Motive QAL oder EAL umfasst; X12 eine beliebige ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise Q, A oder L, insbesondere A oder L; q und r 0 oder ganze Zahlen von 1-6 sind, vorzugsweise 0, 1 , 2, oder 3; und s 0 oder 1 , vorzugsweise 0 ist, wobei q+r = 0-9 sind, vorzugsweise 0-6 oder 0-3 oder 1- 9 oder 1-6 oder 1-3.
Ferner ist es in verschiedenen Ausführungsformen bevorzugt, dass das Peptid mindestens ein W oder F, vorzugsweise genau ein W oder F enthält.
Bevorzugt umfasst das Peptid Aminosäuren mit einem hohem alpha-Helix-bildenden Potential, wobei diese Aminosäuren ausgewählt werden aus E, A, L, M, Q, K, R, F, I, H, W und D, stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R, F, I und H; noch stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R und F.
In bevorzugten Ausführungsformen besteht das Peptid zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 65%, stärker bevorzugt zu mindestens 70%, insbesondere zu mindestens 75% oder zu mindestens 80% oder zu mindestens 85% oder zu mindestens 90% oder zu mindestens 95% aus Aminosäuren mit einem hohem alpha-Helix-bildenden Potential, wobei diese Aminosäuren bevorzugt ausgewählt werden aus E, A, L, M, Q, K, R, F, I, H, W und D, stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R, F, I und H; noch stärker bevorzugt E, A, L, M, Q, K, R und F.
Besonders bevorzugt bildet das Peptid eine helikale Sekundärstruktur aus, insbesondere eine a-Helix-Struktur, vorzugsweise mit einem a-Helix-Gehalt von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, insbesondere höher als 95%. Die Verwendung des Motivs AL oder LA in der Aminosäuresequenz des Peptids kann zur Stabilität der Helixstruktur beitragen, weil diese Aminosäuren ein hohes a- Helix-Potential aufweisen.
In bevorzugten Ausführungsformen weist das Peptid eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NOs: 1-15 und/oder 16-17 auf, insbesondere 1-15, oder Varianten davon, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 81%, mindestens 82%, mindestens 83%, mindestens 84% oder mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, mindestens 87%, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91 %, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, mindestens 99,5% Sequenzidentität zu der angegebenen Sequenz haben, wobei vorzugsweise das Motiv RAL, und stärker bevorzugt auch das Motiv EAL und/oder QAL, sofern vorhanden, invariabel sind. Wenn die Motive RAL, EAL und QAL in dem Peptid vorhanden sind, sind diese vorzugsweise in allen vorgenannten Varianten invariabel.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Peptid einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren aufweisen ausgewählt aus A, L, F, W, V, M, I und P, insbesondere A, L, F, W, V, M und I.
Bevorzugt weist das Peptid eine Aminosäuresequenz auf, die eine Länge von 10 bis 24 Aminosäuren, z.B. 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 oder 24 Aminosäuren, insbesondere 12 bis 19 Aminosäuren, z.B. 12-18 Aminosäuren hat.
In manchen Ausführungsformen weist das Peptid am C-Terminus die Aminosäure Cystein (C) auf. In anderen Ausführungsformen weist das Peptid die Aminosäure Cystein am N-Terminus auf. Diese Aminosäure kann über die freie Sulfhydryl-Gruppe die Kopplung an andere Moleküle, Strukturen oder Substrate ermöglichen. Diese Aminosäure dient daher als Verknüpfungsstelle ist aber typischerweise nicht an der gewünschten adhäsiven Wirkung beteiligt.
Bevorzugt umfasst oder besteht das Peptid (aus) eine(r) Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, noch stärker bevorzugt mindestens 87%, noch stärker bevorzugt mindestens 88%, noch stärker bevorzugt mindestens 89%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 91%, noch stärker bevorzugt mindestens 92%, noch stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5%, insbesondere 100% Sequenzidentität mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist: RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO:4), RALRALRALEALEAL (SEQ ID NO:5), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO:6, RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO:7), RALRALQALEALEAL (SEQ ID NO:8), RALFEALQALFRALEAL (SEQ ID NO:9), RALRALEALQALEA (SEQ ID NQ:10), RALFEALFRALEALR (SEQ ID NO:11), RALFEALFRALEAL (SEQ ID NO:12), RALEALFRALEAL (SEQ ID NO:13), RALRALFEALEAL (SEQ ID NO:14), RALEALFRALQALEAL (SEQ ID NO:15), RALEALWRALQALEAL (SEQ ID NO:16), RALEALWRALEAL (SEQ ID NO:17), RALARALARALAQALA (SEQ ID NO:18), RSIVTFSLRQNAQLA (SEQ ID NO:19) oder RSIVTFSLRQNSEQA (SEQ ID NQ:20), bevorzugt 4-18.
In verschiedenen anderen Ausführungsformen umfasst oder besteht das Peptid (aus) eine(r) Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, noch stärker bevorzugt mindestens 87%, noch stärker bevorzugt mindestens 88%, noch stärker bevorzugt mindestens 89%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 91%, noch stärker bevorzugt mindestens 92%, noch stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5%, insbesondere 100% Sequenzidentität mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist: RSIVTFSLRQNAQLA (SEQ ID NO:19), RSIVTFSLRQNSEQA (SEQ ID NO:20), GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO: 21), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO:22), QQSIRIMTIKHP (SEQ ID NO:23), WRHPRLRCGNLL (SEQ ID NO:24) oder QKSRNRMTRTHP (SEQ ID NO:25), bevorzugt 19 oder 20.
In verschiedenen anderen Ausführungsformen umfasst oder besteht das Peptid (aus) eine(r) Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, noch stärker bevorzugt mindestens 87%, noch stärker bevorzugt mindestens 88%, noch stärker bevorzugt mindestens 89%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 91%, noch stärker bevorzugt mindestens 92%, noch stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5%, insbesondere 100% Sequenzidentität mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist: GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO:21), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO:22), QQSIRIMTIKHP (SEQ ID NO:23), WRHPRLRCGNLL (SEQ ID NO:24) oder QKSRNRMTRTHP (SEQ ID NO:25).
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Peptid ferner eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfassen oder daraus bestehen, oder eine Variante davon sein: SRARLFVVTYHK (SEQ ID NO:26), HMISTMNAASRR (SEQ ID NO:27), RSIVTFSLRQNR (SEQ ID NO:28), RNTIRIRTIKHP (SEQ ID NO:29) oder RHSSTLRYRPLP (SEQ ID NQ:30), wobei eine Variante eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, noch stärker bevorzugt mindestens 87%, noch stärker bevorzugt mindestens 88%, noch stärker bevorzugt mindestens 89%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 91%, noch stärker bevorzugt mindestens 92%, noch stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5% Sequenzidentität mit einer der Aminosäuresequenzen aufweist.
Varianten der Peptide, deren Aminosäuresequenz mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, noch stärker bevorzugt mindestens 87%, noch stärker bevorzugt mindestens 88%, noch stärker bevorzugt mindestens 89%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 91%, noch stärker bevorzugt mindestens 92%, noch stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5% Sequenzidentität mit einer der Aminosäuresequenzen aufweist, die den Sequenzen in SEQ ID NOs: 4-30, bevorzugt 4-25, stärker bevorzugt 4-18, 19-20, oder 21-25, stärker bevorzugt 4-18 oder 19-20, insbesondere 4-18 entsprechen, unterscheiden sich bevorzugt in maximal 3 Positionen, stärker bevorzugt in maximal 2 Positionen, insbesondere in maximal 1 Position von einer der Aminosäuresequenzen, die den Sequenzen in SEQ ID NOs: 4-30, bevorzugt 4-25, stärker bevorzugt 4-18, 19-20, oder 21 -25, stärker bevorzugt 4-18 oder 19-20, insbesondere 4-18 entsprechen. Beispielsweise kann, wenn 1 Position unterschiedlich ist entweder eine der Aminosäuren der jeweiligen Sequenz ausgetauscht sein oder aber die Sequenzen stimmen überein, aber es wurde eine Aminosäure innerhalb der Aminosäurekette oder N- oder C-terminal ergänzt oder weggelassen. Beispielsweise könnte C- oder N-terminal ein Cystein (C) angehängt worden sein.
Somit sind ebenfalls solche Peptide geeignet, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie aus einem Peptid wie vorstehend beschrieben als Ausgangsmolekül erhältlich sind, z,B. aus einem Molekül mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOs: 4-30, bevorzugt 4-25, stärker bevorzugt 4-18, 19-20 und/oder 21-25, noch stärker bevorzugt 4-18 oder 19-21 , insbesondere 4- 18, an welchem z.B. ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, unter anderem auch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution, durchgeführt wurden, wobei das resultierende Peptid mindestens 80% Sequenzidentität mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOs: 4-30, bevorzugt 4-25, stärker bevorzugt 4-18, 19-20 oder 21-25, noch stärker bevorzugt 4-18 oder 19-20, insbesondere 4-18 aufweist.
In bevorzugten Ausführungsformen kann das Peptid auch modifiziert sein. Bevorzugte Modifikationen können z.B. das Koppeln des Peptids mit bestimmten anderen Molekülen oder chemischen Gruppen sein, z.B. organischen (Makro-)Molekülen, einschließlich peptidischen Molekülen. Ist das Peptid mit mindestens einem weiteren (Makro-)Molekül gekoppelt, kann es auch als Peptid-Derivat bezeichnet werden. Das Peptid ist dann derivatisiert.
In manchen Ausführungsformen sind die genannten Peptide, welche z.B. für Kopplungszwecke N- oder C-terminal die Aminosäure Cystein aufweisen können, mit Biotin gekoppelt (funktional modifiziert), bevorzugt an einer geeigneten Aminosäure der Kette und/oder N- und/oder C-terminal. Eine derartige Modifizierung ist N- bzw. C-terminal im Kontext der vorliegenden Erfindung allerdings nur an jenem Terminus möglich, welcher nicht mit der Protease, optional mittels eines Linkers C), kovalent verbunden ist.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Peptid
(i) eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfassen oder daraus bestehen: RALQALRALQALEAL-C (SEQ ID NO:31), RALRALRALEALEAL-C (SEQ ID NO:32), RALRALRALQALQAL-C (SEQ ID NO:33), RALRALRALQALEAL-C (SEQ ID NO:34), RALRALQALEALEAL-C (SEQ ID NO:35), RALFEALQALFRALEAL-C (SEQ ID NO:36), RALRALEALQALEA-C (SEQ ID NO:37), RALFEALFRALEALR-C (SEQ ID NO:38), RALFEALFRALEAL-C (SEQ ID NO:39), RALEALFRALEAL-C (SEQ ID NQ:40), RALRALFEALEAL-C (SEQ ID NO:41), RALEALFRALQALEAL-C (SEQ ID NO:42), RALEALWRALQALEAL-C (SEQ ID NO:43), RALEALWRALEAL-C (SEQ ID NO:44), RALARALARALAQALA-C (SEQ ID NO:45), RSIVTFSLRQNAQLA-C (SEQ ID NO:46), RSIVTFSLRQNSEQA-C (SEQ ID NO:47), insbesondere eine von SEQ ID NOs: 31-39, 42-47, insbesondere 31-35, 37, 45-47; oder
(ii) eine Aminosäuresequenz umfassen oder daraus bestehen, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84% oder 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, noch stärker bevorzugt mindestens 87%, noch stärker bevorzugt mindestens 88%, noch stärker bevorzugt mindestens 89%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 91%, noch stärker bevorzugt mindestens 92%, noch stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5% Sequenzidentität mit einer der Sequenzen, die in SEQ ID NOs: 31 -47 (31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46 oder 47) genannt werden, aufweist, vorzugsweise mit einer von SEQ ID NOs: 31-39, 42-47, insbesondere 31-35, 37, 45-47.
Ferner ist es möglich, dass das Peptid
(i) eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfasst oder daraus besteht: GLHTSATNLYLH-C (SEQ ID NO:48), QHSIRLLTIKKP-C (SEQ ID NO:49), QQSIRIMTIKHP-C (SEQ ID NO:50), WRHPRLRCGNLL-C (SEQ ID NO:51), oder QKSRNRMTRTHP-C (SEQ ID NO:52); oder
(ii) eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84% oder 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, noch stärker bevorzugt mindestens 87%, noch stärker bevorzugt mindestens 88%, noch stärker bevorzugt mindestens 89%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 91%, noch stärker bevorzugt mindestens 92%, noch stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5% Sequenzidentität mit einer der Sequenzen, die in SEQ ID NOs: 48-52 (48, 49, 50, 51 oder 52) genannt werden, aufweist.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Peptid ferner eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs: 53-57 (SRARLFWTYHK-C (SEQ ID NO:53), HMISTMNAASRR-C (SEQ ID NO:54), RSIVTFSLRQNR-C (SEQ ID NO:55), RNTIRIRTIKHP-C (SEQ ID NO:56), RHSSTLRYRPLP-C (SEQ ID NO:57)) oder eine Variante davon, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84% oder 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, noch stärker bevorzugt mindestens 87%, noch stärker bevorzugt mindestens 88%, noch stärker bevorzugt mindestens 89%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 91%, noch stärker bevorzugt mindestens 92%, noch stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 94%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97%, noch stärker bevorzugt mindestens 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, noch stärker bevorzugt mindestens 99,5% Sequenzidentität damit aufweist, umfassen oder daraus bestehen.
In den vorgenannten Ausführungsformen, in denen die genannten Peptide N- oder C-terminal die Aminosäure Cystein aufweisen, ist die Protease erfindungsgemäß entsprechend am jeweils anderen Terminus des Peptids mit diesem kovalent verbunden. Mit anderen Worten gilt, dass im Falle eines N-terminal an das Peptid gebundenen Cysteins die Protease entsprechend am C- Terminus des Peptids gebunden ist, bzw. dass im Falle eines C-terminal an das Peptid gebundenen Cysteins die Protease entsprechend am N-Terminus des Peptids gebunden ist.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist die heterologe Peptidsequenz, welche als Adhäsionsvermittler für die Protease fungiert, direkt kovalent mit der Protease verknüpft, d.h. die erste und/oder letzte Aminosäure der Protease ist über eine Peptidbindung mit einer terminalen Aminosäure der Peptidsequenz verknüpft. Alternativ kann die Bindung aber auch über einen Linker, insbesondere einen Peptidlinker, erfolgen. Eine derartige Bindung über einen Peptidlinker ist bevorzugt. Geeignete Linker sind im Stand der Technik bekannt und können statisch/steif oder flexibel sein. Diese Eigenschaft wird von der Sekundärstruktur des Linkers bestimmt, so können steife Linker z.B. als Sekundärstruktur eine alpha-Helix aufweisen. In verschiedenen Ausführungsformen ist die Peptidlinkersequenz flexibel und weist keine Sekundärstruktur oder nur kurze Sekundärstrukturelemente auf. Im Kontext der vorliegenden Erfindung geeignete Linker werden nachfolgend beschrieben.
C) Linker
Im Kontext der vorliegenden Erfindung geeignete Linker, bei denen es sich bevorzugt um Peptidlinker handelt, lassen sich in flexible Linker und steife/rigide Linker unterteilen. Derartige Linker sind im Stand der Technik grundsätzlich bekannt. Umfasst das erfindungsgemäß Proteasekonjugat mindestens einen Linker, vorzugsweise einen Linker (liebe Erfinder, bitte überprüfen), dann stellt der Linker die kovalente Bindung des heterologen Peptids an die Protease das und weist das entsprechende Proteasekonjugat in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Struktur auf:
(i) Peptid-Linker-Protease; oder
(ii) Protease-Linker-Peptid.
Handelt es sich bei dem Linker, wie bevorzugt, um einen Peptidlinker, dann ist die erste oder letzte Aminosäure der Protease über eine Peptidbindung mit einer terminalen Aminosäure der Linkersequenz verknüpft und ist die erste oder letzte Aminosäure des heterologen Peptids mit der anderen terminalen Aminosäure der Linkersequenz verknüpft.
Typischerweise weisen solche Peptidlinker eine Länge von 1 bis 200 Aminosäure, z.B. 1 bis
100 Aminosäuren, bevorzugt 2 bis 30 Aminosäuren, noch bevorzugter 5 bis 25 Aminosäuren auf. In verschiedenen Ausführungsformen ist der Linker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (I) (GGGGS)n mit n = 1 , 2, 3, oder 4; (II) (G)6; (G)8; (III) (EAAAK)n mit n = 1 , 2, oder 3; (IV) A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A; (V) PAPAP; (VI) AEAAAKEAAAKA; und (VII) (AP)n mit n = 10-34.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind auch funktionelle Homologe der vorgenannten Linkersequenzen geeignet.
„Funktionelle Homologe“, wie in diesem Zusammenhang verwendet, bezieht sich auf Sequenzen, die mindestens 70%, vorzugsweise 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8%, 99,0%, 99,2%, 99,4% oder 99,6% identisch mit der angegebenen Referenzsequenz sind und deren Funktionalität aufweisen, d.h. als Bindung zwischen Protease und heterologem Peptid fungieren können, ohne die vorteilhaften Eigenschaften entsprechender Proteasekonjugate, wie hierin beschrieben und offenbart, zu beeinträchtigen.
Bevorzugte Kombination aus Protease, Linker und heterologem Peptid sind, in N- zu C- terminaler Orientierung:
(a) Peptid-Linker (I)-Protease;
(b) Peptid-Linker (Il)-Protease;
(c) Peptid-Linker (Ill)-Protease;
(d) Peptid-Linker (IV)-Protease;
(e) Peptid-Linker (V)-Protease;
(f) Peptid-Linker (Vl)-Protease;
(g) Peptid-Linker (VI I)-Protease;
(h) Protease-Linker (I)-Peptid;
(i) Protease-Linker (Il)-Peptid;
(j) Protease-Linker (Ill)-Peptid;
(k) Protease-Linker (IV)-Peptid;
(l) Protease-Linker (V)-Peptid;
(m) Protease-Linker (Vl)-Peptid;
(n) Protease-Linker (Vll)-Peptid, wobei die Protease vorzugsweise eine der folgenden Aminosäuresubstitutionsvarianten, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , aufweist:
P9T, N130D, T133A, N144K, G166M, S189T, Y217M, N252T, Q271 E;
P9T, N130D, T133A, N144K, G166M, S189T, Y217M, S224A, N252T, Q271 E;
P9T, S89A, N130D, G131 H, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T, Q271 E;
Y6W, P9T, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T, Q271 E;
P9T, N130D, T133A, N144K, G166M, S211 N, Y217M, N252T, Q271 E;
P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T, Q271 E;
P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, N187D, Y217M, S224A, N252T, Q271 E;
P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189R, Y217M, S224A, N252T, Q271 E; P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, N187D, S189R, Y217M, S224A, N252T, Q271 E; vorzugsweise: P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T, Q271 E, wobei das Peptid vorzugsweise eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfasst oder daraus besteht, oder eine Variante davon ist: RALQALRALQALEAL (SEQ ID NO:4), RALRALRALEALEAL (SEQ ID NO:5), RALRALRALQALQAL (SEQ ID NO:6), RALRALRALQALEAL (SEQ ID NO:7), RALRALQALEALEAL (SEQ ID NO:8), RALFEALQALFRALEAL (SEQ ID NO:9), RALRALEALQALEA (SEQ ID NQ:10), RALFEALFRALEALR (SEQ ID NO:11), RALFEALFRALEAL (SEQ ID NO:12), RALEALFRALEAL (SEQ ID NO:13), RALRALFEALEAL (SEQ ID NO:14), RALEALFRALQALEAL (SEQ ID NO:15), RALEALWRALQALEAL (SEQ ID NO:16), RALEALWRALEAL (SEQ ID NO:17), RALARALARALAQALA (SEQ ID NO:18), RSIVTFSLRQNAQLA (SEQ ID NO:19) oder RSIVTFSLRQNSEQA (SEQ ID NQ:20), GLHTSATNLYLH (SEQ ID NO:21), QHSIRLLTIKKP (SEQ ID NO:22), QQSIRIMTIKHP (SEQ ID NO:23), WRHPRLRCGNLL (SEQ ID NO:24) oder QKSRNRMTRTHP (SEQ ID NO:25), SRARLFWTYHK (SEQ ID NO:26), HMISTMNAASRR (SEQ ID NO:27), RSIVTFSLRQNR (SEQ ID NO:28), RNTIRIRTIKHP (SEQ ID NO:29) oder RHSSTLRYRPLP (SEQ ID NQ:30), wobei das Peptid vorzugsweise aus einer der Aminosäuresequenzen SEQ ID NOs: 4-30 besteht.
In verschiedenen Ausführungsformen sind die obengenannten Kombinationen (a)-(n) bevorzugt, wobei die Protease jeweils die Aminosäuresubstitutionsvariante P9T, S89A, N130D, T133A, N144K, S189T, Y217M, S224A, N252T, Q271 E aufweist, bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 , und wobei das Peptid jeweils aus einer der Aminosäuresequenzen SEQ ID NOs: 4-30 besteht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Proteasekonjugat kodiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
Hierbei kann es sich um DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesem Erfindungsgegenstand eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, z.B. eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Verwendung. Unter Codon-Verwendung wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie z.B. die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind z.B. aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laboratory Press, bekannt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zelllinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen z.B. solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachromosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom oder chromosomale DNA integrieren.
Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, z.B. durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene Nukleinsäure in Klonierungsvektoren nicht exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die ein erfindungsgemäßes Proteasekonjugat beinhaltet, insbesondere eine, die das Proteasekonjugat in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d.h. Nukleinsäure-Teile oder -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, d.h. prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was z.B. die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, z.B. einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft z.B. leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Ferner können die Proteasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, z.B. durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können das Proteasekonjugat funktionell beeinflussen.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die z.B. auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryotische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren oder Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.
Bei gramnegativen Bakterien wie z.B. Escherichia co// wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie z.B. Bacilli oder Actin omyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Verwendung verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist.
Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren.
Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu prokaryotischen Zellen sind eukaryotische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann z.B. dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryotische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören z.B. die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können z.B. zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie z.B. Cellulasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich z.B. thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in üblicher weise kultiviert und fermentiert, z.B. in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann.
Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Proteasekonjugate herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Proteasekonjugats umfassend a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, und b) Isolieren des Proteasekonjugats aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, z.B. der erfindungsgemäßen Proteasekonjugate. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteasekonjugats beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse bzw. Trockenmasse und/oder insbesondere in der Aktivität des interessierenden Enzyms erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.
Das hergestellte Proteasekonjugat kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation des Proteasekonjugats aus der Wirtszelle, d.h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern oder -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen das Proteasekonjugat in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation des Proteasekonjugats aus der Wirtszelle, d.h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen, z.B. durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder durch chromatographische Reinigung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es mindestens ein Proteasekonjugat, wie voranstehend beschrieben und definiert, enthält. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel.
Alle Prozentangaben, die im Zusammenhang mit den hierin beschriebenen Zusammensetzungen/Mitteln gemacht werden, beziehen sich, sofern nicht explizit anders angegeben auf Gew.-%, jeweils bezogen auf die jeweilige Mischung/das jeweilige Mittel.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stehen Fettsäuren bzw. Fettalkohole bzw. deren Derivate - soweit nicht anders angegeben - stellvertretend für verzweigte oder unverzweigte Carbonsäuren bzw. Alkohole bzw. deren Derivate mit vorzugsweise 6 bis 22 Kohlenstoffatomen. Insbesondere sind auch die z.B. nach der RoELENschen Oxo-Synthese erhältlichen Oxo-Alkohole bzw. deren Derivate entsprechend einsetzbar.
Wann immer im Folgenden Erdalkalimetalle als Gegenionen für einwertige Anionen genannt sind, so bedeutet das, dass das Erdalkalimetall natürlich nur in der halben - zum Ladungsausgleich ausreichenden - Stoffmenge wie das Anion vorliegt.
Unter einem Wasch- oder Reinigungsmittel sind erfindungsgemäß alle denkbaren Waschoder Reinigungsmittelarten zu verstehen, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche bzw. -reinigung. Dazu gehören z.B. Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören z.B. auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen (maschinelle Geschirrspülmittel) oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln z.B. auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmitteln im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, z.B. zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als pulverförmige oder granuläre Feststoffe, in verdichteter oder nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können neben einer erfindungsgemäßen Protease alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Tenside, Builder (Gerüststoffe), Polymere, Glaskorrosionsinhibitoren, Korrosionsinhibitoren, Bleichmittel wie Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren oder Bleichkatalysatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Enzymstabilisatoren, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.
Vorteilhafte Inhaltsstoffe erfindungsgemäßer Mittel sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO 2009/121725, dort beginnend auf Seite 5, vorletzter Absatz, und endend auf Seite 13 nach dem zweiten Absatz. Auf diese Offenbarung wird ausdrücklich Bezug genommen und der dortige Offenbarungsgehalt in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält mindestens ein erfindungsgemäßes Proteasekonjugat vorteilhafterweise in einer Menge von 2 pg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 pg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 pg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 pg bis 10 mg pro g des Mittels. In verschiedenen Ausführungsformen beträgt die Konzentration des hierin beschriebenen Proteasekonjugats (aktives Enzym) in dem Mittel >0 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0,0001 oder 0,001 , noch bevorzugter 0,001 bis 0,1 Gew. -%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält das Proteasekonjugat zunehmend bevorzugt in einer Menge von 1 x 10-8 bis 5 Gew.-%, von 0,0001 bis 1 Gew.-%, von 0,0005 bis 0,5 Gew.-%, von 0,001 bis 0,1 Gew.-%, jeweils bezogen auf aktives Protein und bezogen auf das Gesamtgewicht des Waschmittels.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen erfindungsgemäßer Mittel, die ggf. auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, z.B. in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Flüssige Mittel sind generell bevorzugt. Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt.
Wenn die erfindungsgemäßen Waschmittel in flüssiger Form vorliegen, enthalten sie vorzugsweise bezogen auf ihr Gesamtgewicht mehr als 40 Gew.-%, vorzugsweise 50 bis 90 Gew.- % und besonders bevorzugt 60 bis 80 Gew.-% Wasser.
Die erfindungsgemäßen Mittel können ein oder mehrere Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische in Frage kommen, aber auch kationische, zwitterionische und/oder amphotere Tenside können enthalten sein. Die Mittel enthalten vorzugsweise 5 bis 70 Gew.-% Tensid, bevorzugt 5 bis 60 Gew.-% und weiter bevorzugt 5 bis 50 Gew.-% Tensid.
Geeignete anionische Tenside sind insbesondere Seifen und solche, die Sulfat- oder Sulfonat- Gruppen mit bevorzugt Alkaliionen als Kationen enthalten. Verwendbare Seifen sind bevorzugt die Alkalisalze der gesättigten oder ungesättigten C s-Fettsäuren. Derartige Fettsäuren können auch in nicht vollständig neutralisierter Form eingesetzt werden. Zu den brauchbaren Tensiden des Sulfat-Typs gehören die Salze der Schwefelsäurehalbester von C s-Fettalkoholen und die Sulfatierungsprodukte der genannten nichtionischen Tenside mit niedrigem Ethoxylierungsgrad. Zu den verwendbaren Tensiden vom Sulfonat-Typ gehören z.B. Cg-14-Alkylbenzolsulfonate, Alkansulfonate, die aus C s-Alkanen z.B. durch Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse bzw. Neutralisation gewonnen werden, Ci2-18-Olefinsulfonate, die bei der Umsetzung entsprechender Monoolefine mit Schwefeltrioxid entstehen, Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten, Disulfonaten, wie man sie z.B. aus C s-Monoolefinen mit end- oder innenständigen Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, sowie a- Sulfofettsäureester (Estersulfonate), die bei der Sulfonierung von Fettsäuremethyloder -ethylestern entstehen, z.B. a-sulfonierte Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren.
Vorzugsweise weist das Mittel 2 bis 55 Gew.-%, vorzugsweise 3 bis 35 Gew.-%, Aniontensid auf. Ganz besonders bevorzugt weist das Mittel 3 bis 25 Gew.-% Alkylbenzolsulfonat auf. Darüber hinaus kann das Mittel vorzugsweise noch weitere anionische Tenside, insbesondere Alkylethersulfate, sowie nichtionische Tenside, insbesondere Fettalkoholalkoxylate, enthalten. Diese können dann den Rest der Tenside ausmachen.
Geeignete Alkylbenzolsulfonate sind vorzugsweise ausgewählt aus linearen oder verzweigten Alkylbenzolsulfonaten der Formel in der R' und R" unabhängig H oder Alkyl sind und zusammen 6 bis 19, vorzugsweise 7 bis 15 und insbesondere 9 bis 13 C-Atome enthalten. Ein ganz besonders bevorzugter Vertreter ist Natriumdodecylbenzylsulfonat.
Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der Schwefelsäurehalbester der Ci2-18-Fettalkohole, z.B. aus Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der Cio-20-Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen, auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die Ci2-16-Alkylsulfate und Ci2-15-Alkylsulfate sowie C- s-Alkylsulfate bevorzugt.
Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C7-2i-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte Cg-n-Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder Ci2-18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet.
Geeignete Alkylethersulfate sind z.B. Verbindungen der Formel
R1-O-(AO)n-SO3- X+.
In dieser Formel steht R1 für einen linearen oder verzweigten, substituierten oder unsubstituierten Alkylrest, vorzugsweise für einen linearen, unsubstituierten Alkylrest, besonders bevorzugt für einen Fettalkoholrest. Bevorzugte Reste R1 sind ausgewählt aus Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl-, Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-, Octadecyl-, Nonadecyl-, Eicosylresten und deren Mischungen, wobei die Vertreter mit gerader Anzahl an C-Atomen bevorzugt sind. Besonders bevorzugte Reste R1 sind abgeleitet von C s-Fettalkoholen, z.B. von Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder von C10-20- Oxoalkoholen. AO steht für eine Ethylenoxid-(EO) oder Propylenoxid-(PO)-Gruppierung, vorzugsweise für eine Ethylenoxidgruppierung. Der Index n steht für eine ganze Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise von 1 bis 20 und insbesondere von 2 bis 10. Ganz besonders bevorzugt steht n für die Zahlen 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8. X+ steht für ein einwertiges Kation oder den n-ten Teil eines n- wertigen Kations, bevorzugt sind dabei die Alkalimetallionen und darunter Na+ oder K+, wobei Na+ äußerst bevorzugt ist. Weitere Kationen X+ können ausgewählt sein aus NHT, % Zn2+, % Mg2+, % Ca2+, % Mn2+ und deren Mischungen.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Alkylethersulfat ausgewählt sein aus Fettalkoholethersulfaten der Formel mit k = 1 1 bis 19, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8. Ganz besonders bevorzugte Vertreter sind Na-Ci2- 14-Fettalkoholethersulfate mit 2 EO (k = 11 -13, n = 2). Der angegebenen Ethoxylierungsgrad stellt einen statistischen Mittelwert dar, der für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein kann. Die angegebenen Alkoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoxylate/Ethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow range ethoxylates, NRE).
Es hat sich für die Kaltwaschleistung als vorteilhaft erwiesen, wenn die Waschmittel zusätzlich Seife(n) enthalten. Bevorzugte Waschmittel sind daher dadurch gekennzeichnet, dass sie Seife(n) enthalten. Geeignet sind gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, z.B. Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.
Geeignete nichtionische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 8 bis etwa 18 C-Atomen im Alkylteil und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylethergruppen. Weiterhin sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von N-Alkylaminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden, die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten entsprechen, sowie von Alkylphenolen mit 5 bis 12 C-Atomen im Alkylrest brauchbar.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann bzw. lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, z.B. aus Kokos-, Palm-, Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören z.B. Ci2-14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, Cg-n-Alkohol mit 7 EO, C s-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C s-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus Ci2-14-Alkohol mit 3 EO und Ci2-18-Alkohol mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow range ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Talgfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO.
Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.
Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhaft eingesetzt werden kann, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkylpolyglycoside genügen der allgemeinen Formel
RO(G)z, in der R für einen linearen oder verzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Glycosidierungsgrad z liegt dabei zwischen 1 und 4, vorzugsweise zwischen 1 und 2 und insbesondere zwischen 1 ,1 und 1 ,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare Alkylpolyglycoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.
Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, z.B. N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Die Menge dieser nichtionischen Tenside beträgt vorzugsweise nicht mehr als die der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere nicht mehr als die Hälfte davon.
Geeignete Amphotenside sind z.B. Betaine der Formel
(Riii)(Riv)(Rv)N+CH2COO-, in der R'" einen ggf. durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen unterbrochenen Alkylrest mit 8 bis 25, vorzugsweise 10 bis 21 Kohlenstoffatomen und Riv sowie Rv gleichartige oder verschiedene Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeuten, insbesondere C10-18- Alkyldimethylcarboxymethylbetain und Cn-17-Alkylamidopropyldimethylcarboxymethylbetain.
Geeignete kationische Tenside sind u.a. die quartären Ammoniumverbindungen der Formel (Rvi)(Rvii)(Rviii)(Rix)N+X-, in der Rvi bis Rix für vier gleich- oder verschiedenartige, insbesondere zwei lang- und zwei kurzkettige, Alkylreste und X- für ein Anion, insbesondere ein Halogenidion, stehen, z.B. Didecyldimethylammoniumchlorid, Alkylbenzyldidecylammoniumchlorid und deren Mischungen. Weitere geeignete kationische Tenside sind die quaternären oberflächenaktiven Verbindungen, insbesondere mit einer Sulfonium-, Phosphonium-, Jodonium- oder Arsoniumgruppe, die auch als antimikrobielle Wirkstoffe bekannt sind. Durch den Einsatz von quaternären oberflächenaktiven Verbindungen mit antimikrobieller Wirkung kann das Mittel mit einer antimikrobiellen Wirkung ausgestaltet werden bzw. dessen ggf. aufgrund anderer Inhaltsstoffe bereits vorhandene antimikrobielle Wirkung verbessert werden.
Ein weiterer bevorzugter Bestandteil erfindungsgemäßer Waschmittel sind Komplexbildner. Besonders bevorzugte Komplexbildner sind die Phosphonate, sofern ihr Einsatz regulatorisch zulässig ist. Die komplexbildenden Phosphonate umfassen neben der 1-Hydroxyethan-1 ,1- diphosphonsäure eine Reihe unterschiedlicher Verbindungen, wie z.B. Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) (DTPMP). In dieser Anmeldung bevorzugt sind insbesondere Hydroxyalkan- bzw. Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriaminpentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, z.B. als Hexanatri umsalz der EDTMP bzw. als Hepta- und Octa- Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden. Ein im Rahmen dieser Anmeldung bevorzugtes Waschmittel enthält ein oder mehrere Phosphonat(e) aus der Gruppe Aminotrimethylenphosphonsäure (ATMP) und/oder deren Salze;
Ethylendiamintetra(methylenphosphonsäure) (EDTMP) und/oder deren Salze;
Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) (DTPMP) und/oder deren Salze; 1-Hydroxyethan- 1 ,1-diphosphonsäure (HEDP) und/oder deren Salze; 2-Phosphonobutan-1 ,2,4-tricarbonsäure (PBTC) und/oder deren Salze; Hexamethylendiamintetra(methylenphosphonsäure) (HDTMP) und/oder deren Salze; Nitrilotri(methylenphosphonsäure) (NTMP) und/oder deren Salze. Besonders bevorzugt sind Waschmittel, welche als Phosphonate 1-Hydroxyethan-1 ,1- diphosphonsäure (HEDP) oder Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) (DTPMP) enthalten. Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Waschmittel zwei oder mehr unterschiedliche Phosphonate enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Waschmittel sind dadurch gekennzeichnet, dass das Waschmittel mindestens einen Komplexbildner aus der Gruppe der Phosphonate, vorzugsweise 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonat, enthält, wobei der Gewichtsanteil des Phosphonat am Gesamtgewicht des Waschmittels vorzugsweise 0,1 und 8,0 Gew.-%, bevorzugt 0,2 und 5,0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0,3 und 3,0 Gew.-% und besonders bevorzugt 0, 5-2,0 Gew.-% beträgt.
Die erfindungsgemäßen Waschmittel enthalten weiterhin vorzugsweise Gerüststoff (Builder), vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den Gerüststoffe zählen dabei insbesondere die Silikate, Carbonate und organische Cobuilder.
Als organische Cobuilder sind insbesondere Polycarboxylate/Polycarbonsäuren, polymere Polycarboxylate, Asparaginsäure, Polyacetale, Dextrine, weitere organische Cobuilder sowie Phosphonate zu nennen. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben. Organische Cobuildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 bis 8 Gew.-% enthalten sein. Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind z.B. die in Form der freien Säure und/oder ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren und Carboxymethylinuline, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Glycindiessigsäure, Methylglycindiessigsäure, Glutamindiessigsäure, Nitrilotriessigsäure (NTA), Iminodisuccinat wie Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure und Hydroxyiminodisuccinate, Ethylendiamintetraessigsäure sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetrakis(methylenphosphonsäure), Lysintetra(methylenphosphosäure) und 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonsäure, polymere Hydroxyverbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly)carbonsäuren, insbesondere durch Oxidation von Polysacchariden bzw. Dextrinen zugängliche Polycarboxylate, und/oder polymere Acrylsäuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 50 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-%, vorzugsweise von 10 bis 20 Gew.-% und besonders bevorzugt von 1 bis 5 Gew.-% enthalten sein. Die freien Säuren besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Waschmitteln.
Insbesondere sind hierbei Citronensäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Mit besonderem Vorzug wird als Gerüstsubstanz die Citronensäure oder Salze der Citronensäure eingesetzt. Weitere besonders bevorzugte Gerüstsubstanzen sind ausgewählt unter Methylglycindiessidsäure (MGDA), Glutaminsäurediacetat (GLDA), Asparaginsäurediacetat (ASDA), Hydroxyethyliminodiacetat (HEIDA), Iminodisuccinat (IDS) und Ethylendiamindisuccinat (EDDS), Carboxymethylinulin und Polyaspartat. In bevorzugten Ausführungsformen wird als wasserlöslicher, organischer Builder Citronensäure und/oder Citrat eingesetzt. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von 0,5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 0,75 bis 12,5 Gew.-%, weiter bevorzugt 1 bis 4 Gew.-% Citronensäure und/oder 0,5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 0,75 bis 12,5 Gew.-%, weiter bevorzugt 1 bis 4 Gew.-% Citrat, vorzugsweise Alkalicitrat, noch bevorzugter Natriumcitrat. Citronensäure/Citrat können jeweils in Form ihrer Hydrate eingesetzt werden, so kann z.B. Citronensäure in Form des Monohydrats, Citrat in Form des Trinatriumcitratdihydrats eingesetzt werden.
Als Gerüststoffe sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind z.B. die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, z.B. solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70.000 g/mol. Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Anmeldung um gewichtsmittlere Molmassen Mw der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Anmeldung angegebenen Molmassen. Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2.000 bis 20.000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2.000 bis 10.000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3.000 bis 5000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein. Geeignet sind weiterhin Copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im Allgemeinen 2.000 bis 70.000 g/mol, vorzugsweise 20.000 bis 50.000 g/mol und insbesondere 30.000 bis 40.000 g/mol.
Ein erfindungsgemäßes festes Mittel enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den wasserlöslichen organischen Buildersubstanzen gehören die oben genannten organischen Gerüstsubstanzen.
Zusätzlich zu den vorstehend genannten wasserlöslichen organischen Buildern, können die Mittel der Erfindung weiterhin auch anorganische wasserlösliche Builder enthalten. Als wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere Alkalisilikate, Alkalicarbonate, Alkalihydrogenbarbonate, Alkaliphosphate und/oder Sesquicarbonate, die in Form ihrer alkalischen, neutralen oder sauren Natrium- oder Kaliumsalze vorliegen können, in Betracht. Ggf. können auch geringe Mengen an Calciumcarbonate in festen Textilwaschmitteln enthalten sein. Geeignet sind z.B. wasserlöslichen kristalline und/oder amorphe Alkalisilikate. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu SiO2 unter 0,95, insbesondere von 1 :1 ,1 bis 1 :12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis Na2O:SiO2 von 1 :2 bis 1 :2,8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na2SixO2x+i • y H2O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul, eine Zahl von 1 ,9 bis 22, insbesondere 1 ,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 33 ist und bevorzugte Werte fürx 2, 3 oder 4 sind. Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl ß- als auch ö-Natriumdisilikate (Na2Si2Ü5 • y H2O) bevorzugt. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der oben genannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1 ,9 bis 2,1 bedeutet, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. In einer weiteren Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es aus Sand und Soda hergestellt werden kann. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1 ,9 bis 3,5 werden in einer weiteren Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. In Mitteln, die sowohl amorphe als auch kristalline Alkalisilikate enthalten, beträgt das Gewichtsverhältnis von amorphem Alkalisilikat zu kristallinem Alkalisilikat vorzugsweise 1 :2 bis 2:1 und insbesondere 1 :1 bis 2:1. Kristalline schichtförmige Silikate der oben angegebenen Formel (I) werden von der Fa. Clariant GmbH unter dem Handelsnamen Na-SKS vertrieben, z.B. Na-SKS-1 (Na2Si22Ü45 • x H2O, Kenyait), Na-SKS-2 (Na2Sii4C>29 • x H2O, Magadiit), Na-SKS-3 (Na2SisOi7 • x H2O) oder Na-SKS-4 (Na2Si4Og • x H2O, Makatit). Von diesen eignen sich vor allem Na-SKS-5 (a-Na2Si2O5), Na-SKS-7 (ß-Na2Si2C>5, Natrosilit), Na-SKS-9 (NaHSi2O5 • 3 H2O), Na-SKS-10 (NaHSi2O5 • 3 H2O, Kanemit), Na-SKS-11 (t- Na2Si2Ü5) und Na-SKS-13 (NaHSi2C>5), insbesondere aber Na-SKS-6 (ö-Na2Si2C>5). In einer Ausgestaltung erfindungsgemäßer Mittel setzt man ein granuläres Compound aus kristallinem Schichtsilikat und Citrat, aus kristallinem Schichtsilikat und oben genannter (co-)polymerer Polycarbonsäure, oder aus Alkalisilikat und Alkalicarbonat ein, wie es z.B. unter dem Namen Nabion® 15 im Handel erhältlich ist. Derartige wasserlösliche anorganischen Buildermaterialien sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen von 1 bis 20 Gew.-%, insbesondere 5 bis 15 Gew.-%, enthalten. Des Weiteren sind als wasserlösliche anorganische Buildersubstanzen noch die Carbonate (und hyodrogencarbonate), insbesondere Natriumcarbonat, und die Phosphonsäuren/Phosphonate von Bedeutung.
Die erfindungsgemäßen Mittel sind vorzugsweise frei von Phosphat-Builder, d.h. enthalten weniger als 1 Gew.-%, bevorzugt keinen bewusst zugegebenen Phosphat-Builder.
Die Mittel können ferner auch wasserunlösliche Buildersubstanzen enthalten. Als wasserunlösliche anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kristalline oder amorphe wasserdispergierbare Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht über 40 Gew.-%, insbesondere von 3 bis 20 Gew.-% und besonders bevorzugt von 1 bis 15 Gew.- %, eingesetzt. Unter diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität, insbesondere Zeolith A, Zeolith P, Zeolith MAP und ggf. Zeolith X, allein oder in Mischungen, z.B. in Form eines Co-Kristallisats aus den Zeolithen A und X (Vegobond® AX, ein Handelsprodukt der Condea Augusta S.p.A.), bevorzugt. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen mit einer Korngröße über 30 pm auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen mit einer Größe unter 10 pm. Ihr Calciumbindevermögen, das gemäß DE 2412837 A1 bestimmt werden kann, liegt in der Regel im Bereich von 100 bis 200 mg CaO pro Gramm.
In Ergänzung zu den zuvor beschriebenen Gerüststoffen können in dem Waschmittel reinigungsaktive Polymere enthalten sein. Der Gewichtsanteil der reinigungsaktiven Polymere am Gesamtgewicht erfindungsgemäßer Waschmittel beträgt vorzugsweise 0,1 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,0 bis 15 Gew.-% und weiter bevorzugt 2,0 bis 12 Gew.-%.
Als für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere organische Persäuren bzw. persaure Salze organischer Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perbenzoesäure oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoffperoxid und unter den Waschbedingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische Salze, zu denen Perborat, Percarbonat, Persilikat und/oder Persulfat wie Caroat gehören, sowie Wasserstoffperoxid-Einschlussverbindungen, wie H202-Harnstoffaddukte, in Betracht. Wasserstoffperoxid kann dabei auch mit Hilfe eines enzymatischen Systems, d.h. einer Oxidase und ihres Substrates, erzeugt werden. Sofern feste Persauerstoffverbindungen eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter Weise umhüllt sein können. Die Persauerstoffverbindungen können als solche oder in Form diese enthaltender Mittel, die prinzipiell alle üblichen Wasch-, Reinigungsoder Desinfektionsmittelbestandteile enthalten können, zu der Waschlauge zugegeben werden. Besonders bevorzugt wird Alkalipercarbonat oder Alkaliperborat-Monohydrat eingesetzt. Falls ein erfindungsgemäßes Mittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in Mengen von vorzugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 bis 30 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,1 bis 20 Gew.-% vorhanden.
Als Bleichaktivatoren können in den Mitteln Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder ggf. substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder ggf. substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1 ,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1 ,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate oder -carboxylate bzw. die Sulfon- oder Carbonsäuren von diesen, insbesondere Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat oder Laroyloxybenzolsulfonat (NOBS bzw. iso-NOBS bzw. LOBS), 4-(2-Decanoyloxyethoxycarbonyloxy)-benzolsulfonat (DECOBS) oder Decanoyloxybenzoat (DOBA), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglykoldiacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol bzw. deren beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglukose (PAG), Pentaacetylfruktose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose, acetyliertes, ggf. N-alkyliertes Glucamin und Gluconolacton, N-acylierte Lactame, z.B. N-Benzoylcaprolactam, Nitrile, aus denen sich Perimidsäuren bilden, insbesondere Aminoacetonitrilderivate mit quaterniertem Stickstoffatom, und/oder sauerstoffübertragende Sulfonimine und/oder Acylhydrazone. Die hydrophil substituierten Acylacetale und die Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Derartige Bleichaktivatoren können, insbesondere bei Anwesenheit obengenannter Wasserstoffperoxid-Iiefernder Bleichmittel, im üblichen Mengenbereich, vorzugsweise in Mengen von 0,5 bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 bis 8 Gew.-%, bezogen auf gesamtes Mittel, enthalten sein, fehlen bei Einsatz von Percarbonsäure als alleinigem Bleichmittel jedoch vorzugsweise ganz.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können in festen Mitteln auch Sulfonimine und/oder bleichverstärkende Übergangsmetallsalze bzw. Übergangsmetallkomplexe als sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein.
Geeignete Vergrauungsinhibitoren bzw. soil-release-Wirkstoffe (soil release polymer) sind Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulosen und Cellulosemischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose und Methylcarboxymethylcellulose. Vorzugsweise werden Natriumcarboxymethylcellulose, Hydroxyporpylmethylcellulose und deren Gemische und ggf. deren Gemische mit Methylcellulose eingesetzt. Zu den üblicherweise eingesetzten Soil-release-Wirkstoffen gehören Copolyester, die Dicarbonsäureeinheiten, Alkylenglykoleinheiten und Polyalkylenglykoleinheiten enthalten. Der Anteil an Vergrauungsinhibitoren und/oder soil-release-Wirkstoffen in erfindungsgemäßen Mitteln liegt im Allgemeinen nicht über 2 Gew.-% und beträgt vorzugsweise 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 Gew.-%.
Als optische Aufheller für insbesondere Textilien aus Cellulosefasern (z.B. Baumwolle) können z.B. Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure bzw. deren Alkalimetallsalze enthalten sein. Geeignet sind z.B. Salze der 4,4’-Bis(2-anilino-4-morpholino-1 ,3,5-triazin-6-yl-amino)-stilben-2,2’- disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholinogruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ des substituierten 4,4’-Distyryl-diphenyl anwesend sein, z.B. 4,4’-Bis-(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyl. Auch Gemische von Aufhellern können verwendet werden. Für Polyamidfasern eignen sich besonders gut Aufheller vom Typ der 1 ,3-Diaryl-2-pyrazoline, z.B. 1-(p-Sulfoamoylphenyl)-3-(p-chlorphenyl)-2-pyrazolin sowie gleichartig aufgebaute Verbindungen. Der Gehalt des Mittels an optischen Aufhellern bzw. Aufhellergemischen liegt im Allgemeinen nicht über 1 Gew.-%, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 Gew.-%. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Mittel frei von derartigen Wirkstoffen.
Zu den in den erfindungsgemäßen Mitteln einsetzbaren üblichen Schaumregulatoren gehören z.B. Polysiloxan-Kieselsäure-Gemische, wobei die darin enthaltene feinteilige Kieselsäure vorzugsweise silaniert oder anderweitig hydrophobiert ist. Die Polysiloxane können sowohl aus linearen Verbindungen wie auch aus vernetzten Polysiloxan-Harzen sowie aus deren Gemischen bestehen. Weitere Entschäumer sind Paraffinkohlenwasserstoffe, insbesondere Mikro paraffine und Paraffinwachse, deren Schmelzpunkt oberhalb 40°C liegt, gesättigte Fettsäuren bzw. Seifen mit insbesondere 20 bis 22 C-Atomen, z.B. Natriumbehenat, und Alkalisalze von Phosphorsäuremono- und/oder -dialkylestern, in denen die Alkylketten jeweils 12 bis 22 C-Atome aufweisen. Unter diesen wird bevorzugt Natriummonoalkylphosphat und/oder -dialkylphosphat mit C16-18- Alkylgruppen eingesetzt. Der Anteil der Schaumregulatoren kann vorzugsweise 0,2 bis 2 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 1 Gew.-% betragen.
Zur Einstellung des gewünschten pH-Werts können die erfindungsgemäßen Mittel system- und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure oder Alkalihydrogensulfate, oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide, vorzugsweise Natriumhydroxid, enthalten. Derartige pH-Regulatoren sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise nicht über 10 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 6 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,3 bis 2 Gew.-% enthalten.
Als einen weiteren Bestandteil können die erfindungsgemäßen Waschmittel ein organisches Lösungsmittel enthalten. Der Zusatz organischer Lösungsmittel wirkt sich vorteilhaft auf die Enzymstabilität und die Reinigungsleistung dieser Mittel aus. Bevorzugte organische Lösungsmittel stammen aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glykolether. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanol, Glykol, Propandiol, Butandiol, Glycerin, Diglykol, Propyldiglykol, Butyldiglykol, Hexylenglycol, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Etheylenglykolmono- n-butylether, Diethylenglykolmethylether, Di-ethylenglykolethylether, Propylenglykolmethylether, Propylenglykolethylether, Propylenglykolpropylether, Dipropylenglykolmethylether, Dipropylenglykolethylether, Methoxytriglykol, Ethoxytriglykol, Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2- propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylenglykol-t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel. Der Gewichtsanteil dieser organischen Lösungsmittel am Gesamtgewicht erfindungsgemäßer Waschmittel beträgt vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,2 bis 8,0 Gew.-% und weiter bevorzugt 0,5 bis 5,0 Gew.-%. Ein besonders bevorzugtes und in Bezug auf die Stabilisierung der Waschmittel besonders wirksames organisches Lösungsmittel ist das Glycerin sowie das 1 ,2 Propylenglykol. Flüssige Waschmittel umfassen vorzugsweise mindestens ein Polyol, vorzugsweise aus der Gruppe Glycerin und 1 ,2-Propylenglycol, bezogen auf das Gesamtgewicht des Waschmittels, vorzugsweise zu 0,1 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,2 bis 8,0 Gew.-% und weiter bevorzugt 0,5 bis 5,0 Gew.-%. Weitere bevorzugte organische Lösungsmittel sind die organischen Amine und Alkanolamine. Die erfindungsgemäßen Waschmittel enthalten diese Amine vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.-%, bevorzugt von 0,2 bis 8,0 Gew.-% und weiter bevorzugt von 0,5 bis 5,0 Gew.-%, jeweils bezogen auf ihr Gesamtgewicht. Ein besonders bevorzugtes Alkanolamin ist das Ethanolamin.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich eine Protease in Form eines erfindungsgemäßen Proteasekonjugats enthalten. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Lipase, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, ß-Glucosidase, Pektinase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase sowie weiterhin andere Protease, d.h. Proteasen, die nicht in Form eines erfindungsgemäßen Konjugats vorliegen, sowie deren Gemische. Weitere Enzyme sind in dem Mittel vorteilhafterweise jeweils in einer Menge von 1 x 10-8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein enthalten. Zunehmend bevorzugt ist jedes weitere Enzym in einer Menge von 1 x 10-7 bis 3 Gew.-%, von 0,00001 bis 1 Gew.-%, von 0,00005 bis 0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, bezogen auf aktives Protein. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Reinigungsleistungen gegenüber bestimmten Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Ganz besonders bevorzugt liegt ein solcher Synergismus vor zwischen dem erfindungsgemäß enthaltenen Proteasekonjugat und einem weiteren Enzym eines erfindungsgemäßen Mittels, darunter insbesondere zwischen dem erfindungsgemäßen Proteasekonjugat und einer Amylase und/oder einer Lipase und/oder einer Mannanase und/oder einer Cellulase und/oder einer Pektinase. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
Erfindungsgemäß bevorzugte Textilwaschmittel weisen mindestens ein Proteasekonjugat und mindestens eine Amylase auf. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen Textilwaschmittel mindestens ein Proteasekonjugat und mindestens eine Cellulase auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Textilwaschmittel mindestens ein Proteasekonjugat und mindestens eine Lipase auf. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Textilwaschmittel mindestens ein Proteasekonjugat, mindestens eine Amylase und mindestens eine Lipase auf. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Textilwaschmittel mindestens ein Proteasekonjugat, mindestens eine Amylase und mindestens eine Cellulase auf. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Textilwaschmittel mindestens ein Proteasekonjugat, mindestens eine Amylase, mindestens eine Cellulase und mindestens eine Lipase auf. Besonders bevorzugt sind Textilwaschmittel, welche 3 bis 10 verschiedene Enzyme aufweisen, wobei Textilwaschmittel, welche 3 bis 10 unterschiedliche Enzymarten aufweisen, im Hinblick auf die Reinigungsleistung gegenüber einem sehr großen Fleckenspektrum von besonderer Bevorzugung sein können.
Beispiele für Proteasen, welche zusätzlich zu dem mindestens einen Proteasekonjugat, wie hierin definiert und beschrieben, in erfindungsgemäßen Mitteln zum Einsatz kommen können, sind die Subtilisine BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens und Carlsberg aus Bacillus licheniformis, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von dem Unternehmen Novozymes erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase® bzw. Savinase® von dem Unternehmen Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich Proteasevarianten ab. Weitere brauchbare Proteasen sind z.B. die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase®, Progress Uno 101 L® und Ovozyme® von dem Unternehmen Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase®, Properase®, Preferenz P100® und Preferenz P300® von dem Unternehmen Danisco/DuPont, das unter dem Handelsnamen Lavergy pro 104 LS® von dem Unternehmen BASF, das unter dem Handelsnamen Protosol® von dem Unternehmen Advanced Biochemicals Ltd., das unter dem Handelsnamen Wuxi® von dem Unternehmen Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von dem Unternehmen Amano Pharmaceuticals Ltd., und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von dem Unternehmen Kao Corp, erhältlichen Enzyme. Besonders bevorzugt eingesetzt werden auch die Proteasen aus Bacillus gibsonii und Bacillus pumilus, die offenbart sind in WO 2008/086916, WO 2007/131656, WO 2017/215925, WO 2021/175696 und WO 2021/175697. Weitere vorteilhaft einsetzbare Proteasen sind offenbart in z.B. WO 91/02792, WO 2008/007319, WO 93/18140, WO 01/44452, GB 1243784 A, WO 96/34946, WO 02/029024 und WO 03/057246. Weitere verwendbare Proteasen sind diejenigen, die in den Mikroorganismen Stenotrophomonas maltophilia, insbesondere Stenotrophomonas maltophilia K279a, Bacillus intermedius sowie Bacillus sphaericus natürlicherweise vorhanden sind.
Beispiele für Amylasen sind die a-Amylasen aus Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus stearothermophilus sowie insbesondere auch deren für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus Bacillus licheniformis ist von dem Unternehmen Novozymes unter dem Namen Termamyl® und von dem Unternehmen Danisco/DuPont unter dem Namen Purastar® ST erhältlich.
Weiterentwicklungsprodukte dieser a-Amylase sind unter den Handelsnamen Duramyl® und Termamyl® ultra (beide von Novozymes), Purastar® OxAm (Danisco/DuPont) und Keistase® (Daiwa Seiko Inc.) erhältlich. Die a-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens wird von dem Unternehmen Novozymes unter dem Namen BAN® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der a-Amylase aus Bacillus stearothermophilus unter den Namen BSG® und Novamyl®, ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes. Des Weiteren sind für diesen Zweck die a-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus Bacillus agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben. Ferner sind die amylolytischen Enzyme einsetzbar, die in WO 95/26397, WO 96/23873, WO 99/23211 , WO 00/60060, WO 2003/002711 , WO 2003/054177, WO 2006/002643, WO 2007/079938, WO 2011/100410 und WO 2013/003659 offenbart sind. Ebenso sind Fusionsprodukte aller genannten Moleküle einsetzbar. Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl® von dem Unternehmen Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der a-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Weitere vorteilhaft einsetzbare Handelsprodukte sind z.B. die Amylase-LT® und Stainzyme® oder Stainzyme® ultra bzw. Stainzyme® plus sowie Amplify™ 12L oder Amplify Prime™ 100L, letztere ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes, sowie die PREFERENZ S® Serie von dem Unternehmen Danisco/DuPont, umfassend z.B. PREFERENZ S100®, PREFERENZ S1000® oder PREFERENZ S210®. Auch durch Punktmutationen erhältliche Varianten dieser Enzyme können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Der Begriff "Cellulase", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Enzym, das die Hydrolyse von 1 ,4-ß-D-Glucosidbindungen in Cellulose (Cellobiose), und/oder Lichenin und/oder ß-D-Glucanen katalysiert. Sie sind oft auch in der Lage, die 1 ,4-Bindungen in ß-D-Glucanen zu hydrolysieren, die neben den 1 ,4-Bindungen auch 1 ,3-Bindungen besitzen. Cellulasen sind in der Lage, Cellulose zu ß-Glucose zu spalten. Folglich wirken Cellulasen insbesondere auf cellulosehaltige oder cellulosederivathaltige Reste und katalysieren deren Hydrolyse. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Cellulase eine Endoglucanase (EC 3.2.1 .4). Für Cellulasen können synonyme Bezeichnungen verwendet werden, insbesondere Endoglucanase, Endo-1 ,4-ß- Glucanase, Carboxymethylcellulase, Endo-1 ,4-ß-D-Glucanase, ß-1 ,4-Glucanase, ß-1 ,4- Endoglucanhydrolase, Celludextrinase oder Avicelase. Der entscheidende Faktor, ob ein Enzym eine Cellulase im Rahmen der Erfindung ist, ist seine Fähigkeit, 1 ,4-ß-D-Glucosidbindungen in Cellulose zu hydrolysieren.
Der Begriff "Cellulase-Aktivität" ist hier definiert als ein Enzym, das die Hydrolyse von 1 ,4-ß-D- Glucosidbindungen in ß-1 ,4-Glucan (Cellulose) katalysiert. Die Celluloseaktivität wird mit einer Standardmethode gemessen, z.B. wie folgt: Cellulasen setzen Glucose aus CMC (Carboxymethylcellulose) frei. Die Proben werden unter definierten Reaktionsbedingungen (100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5, 40°C, 15 min) mit einem Substrat (1 ,25% CMC) inkubiert. Bei der Reaktion mit p-Hydroxybenzoesäurehydrazid (PAHBAH) in Gegenwart von Wismut entsteht ein gelber Farbstoff, der photometrisch bei 410 nm bestimmt werden kann. Voraussetzung ist ein alkalischer pH-Wert während der Farbreaktion. Die der Färbung entsprechende Menge an freigesetztem Zucker ist ein Maß für die Enzymaktivität (Lever, Anal. Biochem., 1972, 47 & 1977, 81).
Geeignete Cellulasen umfassen solche bakterieller oder pilzlicher Herkunft. Chemisch modifizierte oder proteintechnisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen sind Cellulasen aus den Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, z.B. die Pilzcellulasen aus Humicola insolens, Myceliophthora thermophila und Fusarium oxysporum, die in US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 und WO 89/09259 offenbart sind. Besonders geeignete Cellulasen sind die alkalischen oder neutralen Cellulasen mit farbpflegenden Eigenschaften. Beispiele für solche Cellulasen sind Cellulasen, die in EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397 und WO 98/08940 beschrieben sind. Andere Beispiele sind Cellulase-Varianten, wie sie in WO 94/07998, EP 0531315, EP 3212777, EP 3502243, EP 3653705, EP 3653706, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471 , WO 98/12307 und WO 99/01544 und WO 2019/122520 beschrieben sind.
Beispiele für Cellulasen mit Endo-1 ,4-Glucanase-Aktivität (EC 3.2.1 .4) sind in WO 2002/099091 beschrieben, z.B. solche mit einer Sequenz von mindestens 97% Identität zu der Aminosäuresequenz der Positionen 1 bis 773 von SEQ ID NO:2 der WO 2002/099091 . Ein weiteres Beispiel kann eine GH44-Xyloglucanase umfassen, z.B. ein Xyloglucanase-Enzym mit einer Sequenz von mindestens 60% Identität zu den Positionen 40 bis 559 der SEQ ID NO:2 der WO 2001/062903.
Andere Beispiele für Cellulasen umfassen die in WO 96/29397 beschriebenen GH45- Cellulasen und insbesondere Varianten davon mit Substitution, Insertion und/oder Deletion an einer oder mehreren der Positionen, die den folgenden Positionen in SEQ ID NO:8 der WO 2002/099091 entsprechen: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21 , 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91 , 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101 , 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121 , 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141 , 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151 , 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161 , 162, 164, 165, 168, 170, 171 , 172, 173, 175, 176, 178, 181 , 183, 184, 185, 186, 188, 191 , 192, 195, 196, 200, und/oder 20, vorzugsweise ausgewählt aus P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H oder Q146R.
Zu den kommerziell verfügbaren Cellulasen gehören Celluzyme™, Carezyme™, Carezyme Premium™, Celluclean™ (z.B. Celluclean™ 5000L ans Celluclean™ 4000T), Celluclean Classic™, Cellusoft™, Endolase®, Renozyme® und Whitezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ und Puradax HA™ (Genencor International Inc.), KAC-500(B)™ (Kao Corporation), Revitalenz™ 1000, Revitalenz™ 2000 und Revitalenz™ 3000 (DuPont), sowie Ecostone® und Biotouch® (AB Enzymes).
Als weitere Enzyme einsetzbar sind z.B. Lipasen oder Cutinasen, insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen.
Geeignete Lipasen und Cutinasen sind solche bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs. Chemisch modifizierte oder durch Proteinengineering erzeugte mutierte Enzyme sind eingeschlossen. Beispiele sind Lipase aus Thermomyces, z.B. aus T. lanuginosus (früher Humicola lanuginosa genannt), wie in EP 0258068 und EP 0305216 beschrieben, Cutinase aus Humicola, z.B. H. insolens (WO 96/13580), Lipase aus Stämmen von Pseudomonas (einige davon jetzt umbenannt in Burkholderia), z.B. P. alcaligenes oder P. pseudoalcaligenes (EP 0218272), P. cepacia (EP 0331376), P. sp. Stamm SD705 (WO 95/06720 & WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), Streptomyces-Lipasen vom GDSL-Typ (WO 2010/065455), Cutinase aus Magnaporthe grisea (WO 2010/107560), Cutinase aus Pseudomonas mendocina (US 5389536), Lipase aus Thermobifida fusca (WO 2011/084412), Lipase aus Geobacillus stearothermophilus (WO 2011/084417), Lipase aus Bacillus subtilis (WO 2011/084599), und Lipase aus Streptomyces griseus (WO 2011/150157) und S. pristinaespiralis (WO 2012/137147).
Zu bevorzugten Lipasen gehören z.B. die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen bzw. daraus weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit einem oder mehreren der folgenden Aminosäureaustausche ausgehend von der genannten Lipase in den Positionen D96L, T213R und/oder N233R, besonders bevorzugt T213R und N233R. Lipasen werden z.B. von dem Unternehmen Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase®, Lipolase® Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® und Lipex® vertrieben. Eine weitere vorteilhaft einsetzbare Lipase ist unter dem Handelsnamen Lipoclean® von dem Unternehmen Novozymes erhältlich.
Des Weiteren sind z.B. die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusarium solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von dem Unternehmen Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B® bzw. Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillus sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-AP® und Lipase AML® erhältlich. Von dem Unternehmen Danisco/DuPont sind z.B. die Lipasen bzw. Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige Handelsprodukte sind die von dem Unternehmen Danisco/DuPont vertriebenen Präparationen M1 Lipase® und Lipomax® und die von dem Unternehmen Meito Sangyo KK unter den Namen Lipase MY-30®, Lipase OF® und Lipase PL® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast® von dem Unternehmen Danisco/DuPont.
Weitere Beispiele sind Lipasen, die auch als Acyltransferasen oder Perhydrolasen bezeichnet werden, z.B., Acyltransferasen mit Homologie zu Candida antarctica Lipase A (WO 2010/111143), Acyltransferase aus Mycobacterium smegmatis (WO 2005/056782), Perhydrolasen aus der CE 7- Familie (WO 2009/067279) und Varianten der M. smegmatis Perhydrolase, insbesondere die S54V-Variante, die in dem kommerziellen Produkt Gentle Power Bleach von Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 2010/100028) verwendet wird. Weitere Beispiele sind Lipase- Varianten, wie sie in EP 0407225, WO 92/05249, WO 94/01541 , WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381 , WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 2000/034450, WO 2000/060063, WO 2001/092502, WO 2007/087508 und WO 2009/109500 beschrieben sind.
Zu den bevorzugten kommerziellen Lipaseprodukten gehören Lipolase™, Lipex™, Lipolex™ und Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (Genencor / DuPont) und Lipomax (Gist-Brocades).
Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können erfindungsgemäß Oxidoreduktasen, z.B. Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucoseoder Manganperoxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) eingesetzt werden. Vorteilhafterweise werden zusätzlich vorzugsweise organische, besonders bevorzugt aromatische, mit den Enzymen wechselwirkende Verbindungen zugegeben, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elektronenfluss zu gewährleisten (Mediatoren).
In den hierin beschriebenen Reinigungsmitteln können die einzusetzenden Enzyme ferner zusammen mit Begleitstoffen, etwa aus der Fermentation, konfektioniert sein. In flüssigen Formulierungen werden die Enzyme bevorzugt als Enzymflüssigformulierung(en) eingesetzt.
Die Enzyme werden in der Regel nicht in Form des reinen Proteins, sondern vielmehr in Form stabilisierter, lager- und transportfähiger Zubereitungen bereitgestellt. Zu diesen vorkonfektionierten Zubereitungen zählen z.B. die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren oder weiteren Hilfsmitteln versetzt.
Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, z.B. durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, z.B. solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, z.B. Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, z.B. durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, z.B. durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.
Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so dass ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.
Die Enzyme können auch in wasserlösliche Filme, wie sie z.B. bei der Konfektionierung von Wasch- und Reinigungsmitteln in Einheitsdosisform verwendet werden, eingebracht werden. Ein derartiger Film ermöglicht die Freisetzung der Enzyme nach Kontakt mit Wasser. Wie hierin verwendet, bezieht sich „wasserlöslich“ auf eine Filmstruktur, die vorzugsweise vollständig wasserlöslich ist. Bevorzugt besteht ein solcher Film aus (vollständig oder teilweise hydrolysiertem) Polyvinylalkohol (PVA).
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet wird. In verschiedenen Ausführungsformen zeichnet sich das oben beschriebene Verfahren dadurch aus, dass das Proteasekonjugat bei einer Temperatur von 0°C bis 100°C, bevorzugt 20°C bis 60°C, weiter bevorzugt 20°C bis 40°C und am meisten bevorzugt bei 30°C eingesetzt wird.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was z.B. die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind. Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung oder Verdünnung dieses Mittels behandelt wird.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Proteasekonjugate und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung -M- an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.
Beispiele
Erfindunqsqemäße Konjugate bestehend aus Protease, Linker und Peptid:
Mit dem Peptid RALRALQ ALE ALE AL (SEQ ID NO:8) a. C-terminales Peptid: N-Protease-steifer Linker-Peptid-C (der Linker ist zur visuellen Abgrenzung fett und kursiv gedruckt)
AQTVPYGITQIKAPAVHAQGYKGANVKVAVLDTGIHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQ SHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSAALYAVKVLDRNGDGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGG PDGSAALKNAVDTANKRGWVVAAAGNSGSTGSTSTVGYPAKYDSTIAVANVNSSNVRNSTSSA GPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSMTGTSMAAPHVAGAAALILSKNPNLSNSQVRQRLETTATPLG NSFYYGKGLINAEAASNEAAAKEAAAKEAAAKRALRALQALEALEAL b. C-terminales Peptid: N-Protease-flexibel Linker-Peptid-C (der Linker ist zur visuellen Abgrenzung fett und kursiv gedruckt)
AQTVPYGITQIKAPAVHAQGYKGANVKVAVLDTGIHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQ SHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSAALYAVKVLDRNGDGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGG PDGSAALKNAVDTANKRGWVVAAAGNSGSTGSTSTVGYPAKYDSTIAVANVNSSNVRNSTSSA GPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSMTGTSMAAPHVAGAAALILSKNPNLSNSQVRQRLETTATPLG NSFYYGKGLINAEAASNGGGGSGGGGSGGGGSRALRALQALEALEAL c. N-terminales Peptid: N-Peptid-steifer Linker-Protease-C (der Linker ist zur visuellen Abgrenzung fett und kursiv gedruckt)
RALRALQALEALEALEAAAKEAAAKEAAAKAQTVPYGITQIKAPAVHAQGYKGANVKVAVLD TGIHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQSHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSAALYAVKVLDR NGDGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGGPDGSAALKNAVDTANKRGVVWAAAGNSGSTGST STVGYPAKYDSTIAVANVNSSNVRNSTSSAGPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSMTGTSMAAPHVA GAAALILSKNPNLSNSQVRQRLETTATPLGNSFYYGKGLINAEAASN d. N-terminales Peptid: N-Peptid-flexibel Linker-Protease-C (der Linker ist zur visuellen Abgrenzung fett und kursiv gedruckt)
RALRALQALEALEALGGGGSGGGGSGGGGSAQTVPYGITQIKAPAVHAQGYKGANVKVAVL DTGIHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQSHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSAALYAVKVLD RNGDGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGGPDGSAALKNAVDTANKRGVVVVAAAGNSGSTGS TSTVGYPAKYDSTIAVANVNSSNVRNSTSSAGPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSMTGTSMAAPHV AGAAALILSKNPNLSNSQVRQRLETTATPLGNSFYYGKGLINAEAASN
Mit dem Peptid WRHPRLRCGNLL (SEQ ID NO:24) a. C-terminales Peptid: N-Protease-steifer Linker-Peptid-C (der Linker ist zur visuellen Abgrenzung fett und kursiv gedruckt)
AQTVPYGITQIKAPAVHAQGYKGANVKVAVLDTGIHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQ SHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSAALYAVKVLDRNGDGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGG PDGSAALKNAVDTANKRGWVVAAAGNSGSTGSTSTVGYPAKYDSTIAVANVNSSNVRNSTSSA GPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSMTGTSMAAPHVAGAAALILSKNPNLSNSQVRQRLETTATPLG NSFYYGKGLINAEAASNEAAAKEAAAKEAAAK WRHPRLRCGNLL b. C-terminales Peptid: N-Protease-flexibel Linker-Peptid-C (der Linker ist zur visuellen Abgrenzung fett und kursiv gedruckt)
AQTVPYGITQIKAPAVHAQGYKGANVKVAVLDTGIHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQ SHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSAALYAVKVLDRNGDGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGG PDGSAALKNAVDTANKRGWVVAAAGNSGSTGSTSTVGYPAKYDSTIAVANVNSSNVRNSTSSA GPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSMTGTSMAAPHVAGAAALILSKNPNLSNSQVRQRLETTATPLG NSFYYGKGLINAEAASNGGGGSGGGGSGGGGS WRHPRLRCGNLL c. N-terminales Peptid: N-Peptid-steifer Linker-Protease-C (der Linker ist zur visuellen Abgrenzung fett und kursiv gedruckt)
WRHPRLRCGNLLEAAAKEAAAKEAAAKAQTVPYGITQIKAPAVHAQGYKGANVKVAVLDTG IHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQSHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSAALYAVKVLDRNG DGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGGPDGSAALKNAVDTANKRGWVVAAAGNSGSTGSTST VGYPAKYDSTIAVANVNSSNVRNSTSSAGPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSMTGTSMAAPHVAG AAALILSKNPNLSNSQVRQRLETTATPLGNSFYYGKGLINAEAASN d. N-terminales Peptid: N-Peptid-flexibel Linker-Protease-C (der Linker ist zur visuellen Abgrenzung fett und kursiv gedruckt)
WRH PRLRCGN LL GGGGSGGGGSGGGGSAQTVPYG ITQ I KAPAVH AQG YKG AN VKVAVLDT GIHAAHPDLNVAGGASFVPSEPNATQDFQSHGTHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSAALYAVKVLDRN GDGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGGPDGSAALKNAVDTANKRGVWVAAAGNSGSTGSTS TVGYPAKYDSTIAVANVNSSNVRNSTSSAGPELDVSAPGTSILSTVPSSGYTSMTGTSMAAPHVA GAAALILSKNPNLSNSQVRQRLETTATPLGNSFYYGKGLINAEAASN
Im Vergleich zur Wildtyp-Protease (SEQ ID NO:3) weist die Variante 1 folgende Mutationen auf:
Verwendete Waschmittelmatrix Folgende Tabelle zeigt die Waschmittelmatrix (enthält zwar Enzyme, allerdings keine Protease), die für den Waschtest verwendet wurde:
Protease-Aktivitätsassays
Die Proteaseaktivität wird in einem diskontinuierlichen Assay bestimmt, in dem Casein als Substrat verwendet wird. Die Endkonzentration der Substrat-Lösung beträgt 12 mg/ml Casein (hergestellt nach Hammarsten; Merck, Darmstadt, #2242) und 30 mM Tris in synthetischem Leitungswasser. Synthetisches Leitungswasser ist eine Lösung von 0,029% (w/v) CaCL ■ 2H2O, 0,014% (w/v) MgCL ■ 6H2O und 0,021 % (w/v) NaHCCh mit 15° dH (deutscher Härte). Die Substrat- Lösung wird auf 70°C erhitzt und ihr pH wird auf 8,5 bei 50°C durch Verwendung von 0,1 N NaOH eingestellt. Die Protease-Lösung wird hergestellt durch Zugabe von 2% (w/v) wasserfreiem Pentanatriumtripolyphosphat in synthetisches Leistungswasser und Einstellung auf pH 8,5 mit Salzsäure. Zu 600 pl der Casein-Lösung wird 200 pl der Enzym-Lösung gegeben. Das Gemisch wird bei 50°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 600 pl von 0,44 M Trichloressigsäure (TCA), 0,22 M Natriumacetat in 3% (w/v) beendet. Nach einem Kühlungsschritt von 15 Minuten auf Eis wird das TCA unlösliche Protein durch Zentrifugation entfernt. 900 pl der verbleibenden Lösung werden mit 300 pl von 2 N NaOH gemischt und die Absorption dieses Gemisches, das TCA lösliche Proteine enthält, wird bei 290 nm gemessen. Kontrollwerte werden erzeugt durch die Zugabe von 600 pl TCA-Lösung zu 600 pl Casein-Lösung gefolgt von einer Zugabe von 200 pl Enzymlösung. Eine Protease-Lösung, die unter diesen Bedingungen eine Absorptionsänderung von 0,500 OD bei 290 nm bewirkt, hat nach vorliegender Bezeichnung eine Aktivität von 10 HPE pro ml.
Miniwaschtest und Ergebnisse
Mini-Waschtest wurde mit Bacillus subtilis Kulturüberständen durchgeführt, welche die Proteasekonjugate enthalten. Die Überstände werden aktivitätsgleich zum Benchmark (hier Variante 1) gewaschen: 6 HPE/ml (= 1 ,15 pg/ml Aktivprotein in der Waschflotte).
Bedingungen:
40°C, 16°dH Wasser, 1 h
Anschmutzungen:
CS38: Eigelb-Pigment
10N: Ganzei, Ruß
C05: Blut, Milch, Tusche
CS32: Sebum
PC10: Milch, Öl
H-MR-B: Milch, Ruß
Ausgestanzte Gewebe (Durchmesser = 10 mm) in Mikrotiterplatte vorlegen, Waschlauge auf 40°C vortemperieren, Endkonzentration 3,17 g/L, Lauge und Enzym (1 ,15 pg/mL) auf die Anschmutzung geben, für 1 h bei 40°C und 600 rpm inkubieren, anschließend die Anschmutzung mehrmals mit klarem Wasser spülen, trocken lassen und mit einem Farbmessgerät die Helligkeit bestimmen. Je heller das Gewebe wird, desto besser ist die Reinigungsleistung. Gemessen wird hier der Y-Wert = Helligkeit, je höher desto heller. Alle gemessenen Y-Werte wurden durch die Leistung der Waschlauge alleine (ohne Protease) korrigiert (Y-Variante - Y-Blank = AY-Variante. Für jede Anschmutzung wurde eine AY-Variante ermittelt und alle AY Werte der 6 Anschmutzungen pro Variante einmal summiert, um auf ^AY-Variante zu bestimmen.
Ergebnisse Waschleistung bei 40°C:
*: Variante 1 ; **: (EAAAK)3; *** (GGGGS)3 Im Allgemeinen zeigen die Fusionskonstrukte unabhängig vom Peptid oder Linker eine signifikant erhöhte Waschleistung im Vergleich zur Ausgangsprotease. Dabei ist die Proteaseaktivität insbesondere in Kombination mit den Peptiden SEQ ID NO. 24 und SEQ ID NO. 28 verbessert, wenn diese sich am N-Terminus von der Protease befinden, unabhängig von den Linkern.

Claims

Patentansprüche
1 . Proteasekonjugat, bestehend aus
A) einer Protease, vorzugsweise eine Protease vom Subtilisin Typ, besonders aus Bacillus pumilus, wobei die Protease proteolytische Aktivität aufweist;
B) mindestens einem heterologen Peptid, welches kovalent mit der Protease verbunden ist; und optional
C) mindestens einem Linker, vorzugsweise mindestens einem Peptidlinker, bevorzugt einem Peptidlinker; wobei es sich bei dem heterologen Peptid um ein Peptid umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz von 4 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt 10 bis 24 Aminosäuren handelt, wobei
(a) die Aminosäuresequenz in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Sequenz aufweist
(C)mXlX2X3(X4)nX5(C)o, wobei Xi eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder K, noch bevorzugter R, X2 und X3 ungeladene Aminosäuren sind, vorzugsweise ausgewählt aus A, L, S, I, M und Q, noch bevorzugter aus A, S, I und L, insbesondere A und L, jedes X4 unabhängig voneinander jede beliebige Aminosäure ist, vorzugsweise mit Ausnahme von P, noch bevorzugter mit Ausnahme von P und G; X5 eine beliebige positiv geladene oder ungeladene Aminosäure ist, vorzugsweise R oder eine ungeladene Aminosäure, noch bevorzugter Q, A oder L, insbesondere A oder L, m und 0 0 oder 1 sind, wobei m+o = 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 46, bevorzugt von 6 bis 20 ist; oder
(b) die Aminosäuresequenz mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 86%, mindestens 87%, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99%, mindestens 99,5% oder
100 % Sequenzidentität mit einer der in SEQ ID NOs: 19-20 oder 21-25 genannten
Aminosäuresequenzen aufweist.
2. Proteasekonjugat gemäß Anspruch 1 , wobei
(i) das Peptid eine Gesamtladung von 0 bis +4 aufweist, vorzugsweise 0 bis +2; und/oder
(ii) der N-Terminus umfassend die ersten 3-4 Aminosäuren eine positive Nettoladung aufweist; und/oder
(iii) der C-Terminus umfassend die letzten 3-6 Aminosäuren eine negative oder neutrale Nettoladung aufweist und vorzugsweise mindestens eine negative geladene Aminosäure, insbesondere E, umfasst; und/oder (iv) das Peptid kein P und vorzugsweise auch kein G und noch bevorzugter auch kein Y enthält.
3. Proteasekonjugat gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NOs: 4-30 aufweist, sowie Varianten davon, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, Sequenzidentität zu der angegebenen Sequenz haben, wobei bevorzugt das Motiv RAL, und vorzugsweise auch das Motiv EAL und/oder QAL, sofern vorhanden, invariabel sind.
4. Proteasekonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:24 oder gemäß SEQ ID NO:28 aufweist, sowie Varianten davon, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, Sequenzidentität zu der angegebenen Sequenz haben, wobei bevorzugt das Motiv RAL, und vorzugsweise auch das Motiv EAL und/oder QAL, sofern vorhanden, invariabel sind.
5. Proteasekonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Protease ausgewählt ist aus: a) einer Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% oder 98,8% identisch ist und, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:2, (i) an der Position, die der Position 101 entspricht, die Aminosäuresubstitution R101 E, und (ii) an den mindestens einer der Positionen, die den Positionen 3, 4, 45, 55, 58, 59, 61 , 87, 97, 98, 106, 117, 120, 124, 129, 136, 137, 143, 156, 161 , 163, 171 , 172, 185, 199, 205, 209, 222, 238, 244, 261 und 262 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus S3T, V4I, R45E, R45D, R45Q, P55N, T58W, T58Y, T58L, Q59D, Q59M, Q59N, Q59T, G61 D, G61 R, S87E, G97S, A98D, A98E, A98R, S106A, S106W, N117E, H120V, H120D, H120K, H120N, S124M, P129D, E136Q, Q137H, S143W, S156D, S161T, S163A, S163G, Y171 L, A172S, N185Q, V199M, V205I, Y209W, M222Q, N238H, V244T, N261T und L262N, L262Q, L262D, L262E bestehenden Gruppe ausgewählt ist, aufweist; wobei die Aminosäuresubstitutionskombination der Gruppe (ii) vorzugsweise aus der aus N238E-L262E, S156D-L262E, S3T-V4I-V205I, S3T-V4I-A228V, G195E- V199M, H120D-S163G-N261 D, N76D-A228V-N261 D, S3T-N76D-S156D-Y209W, Q137H-S141 H- R145H-N238E-L262E, Q137H-S141 H-R145H-S156D-L262E, N76D-Q137H-S141 H-R145H- A228V-N261 D, N76D-Q137H-S141 H-R145H-S163G-N238E, H120D-Q137H-S141 H-R145H-
S163G-N261 D, S3T-N76D-Q137H-S141 H-R145H-S156D-Y209W bestehenden Gruppe ausgewählt ist; oder b) einer Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:3 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist und, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:2, (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 130, 133, 144, 217, 252 und 271 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus P9T, N130D, N130V, T133A, N144K, Y217M, N252T und Q271 E bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und (ii) an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 63, 89, 99, 101 , 131 , 156, 166, 170, 187, 188, 189, 211 und 224 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus Y6F, Y6W, F61 G, Q62N, S63Q, S89A, S89G, N99H, D101S, D101 E, D101A, G131 H, G131Y, G131 F, S156R, G166A, G166M, G166L, G166I, K170R, K170G, N187D, N188G, S189T, S189L, S189I, S189R, S211 N, S211 Q, S224A, S224G bestehenden Gruppe ausgewählt ist, aufweist, wobei die Protease vorzugsweise eine Aminosäuresubstitutionskombination aufweist, die aus der aus P9T-N130D-T133A-N144K-G166M- S189T-Y217M-N252T-Q271 E, P9T-N130D-T133A-N 144K-G166M-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E, P9T-N130D-T133A-N144K-G166M-S211 N-Y217M-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D- G131 H-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A- N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N187D-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T- S89A-N130D-T133A-N144K-S189R-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A- N144K-N187D-S189R-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 S-N130D-T133A-N144K- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 E-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M- S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E, P9T-S89A-N99H-N130D-T133A-N144K-K170R-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S156R-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S63Q-S89A- N130D-T133A-N144K-G166A-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-F61 G-Q62-N-S89A- N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-N130D-T133A- N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T- Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-F61 G-Q62N-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T- Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M- S224A-N252T-Q271 E bestehenden Gruppe ausgewählt ist; oder c) einer Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% oder 98,8% identisch ist und, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:1 (i) an den Positionen, die den Positionen 3, 4, 99 und 199 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen S3T, V4I, R99E und V199I, und (ii) an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 74, 136, 143, 154, 160, 161 , 163, 171 , 181 , 183, 185, 200, 203, 209, 212 oder 256 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus N74D, N74E, N74Q, A136Q, R143L, R143W, R143Y, S154D, S154Q, S160G, Y161T, A163G, V171 L, A181 D, F183R, Q185R, Q200A, Q200L, Q200S, Q200T, Y203K, Y203V, Y203W, A209K, A209W, N212S, N212T und L256D, L256E und L256Q bestehenden Gruppe ausgewählt ist, aufweist, wobei die Protease vorzugsweise eine Aminosäuresubstitutionskombination aufweist, die aus der aus S3T-V4I-R99E-V199I-Q200L- Y203W, S3T-V4I-R99E-V199I-N212S, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D, S3T-V4I-R99E-V199I-S154D- L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-Q200L-Y203W-S154D-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-Q200L- Y203W, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-S154D-Q200L-Y203W-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D- N212S, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-S154D-Y203W-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-Y203W, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-S154D-Q200L-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-Q200L, S3T-V4I- R99E-V199I-S154D-Q200L-Y203W, S3T-V4I-R99E-V199I-Q200L-Y203W-L256E, S3T-V4I-R99E- V199I-A136Q-R143W-Y161 T-Q200L, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-R143Y-A209W-N212S-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-N74D-S154D-Y203W-L256E; S3T-V4I-R99E-V199I-Q200L-Y203W-A209K- S154D-L256E, S3T-V4I-R99E-V199I-S154D-S160G-Q185R-Q200L-Y203W-L256E, S3T-V4I- R99E-V199I-S154D-A181 D-F183R-Q200L-Y203W-L256E und S3T-V4I-R99E-V199I-A136Q- S154D-V171 L-Q200L bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
6. Proteasekonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Protease ausgewählt ist aus einer Protease, die proteolytische Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 70% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% und 98% identisch ist und, jeweils bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:2, (i) an den Positionen, die den Positionen 9, 130, 133, 144, 217, 252 und 271 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus P9T, N130D, N130V, T133A, N144K, Y217M, N252T und Q271 E bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und (ii) an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 6, 61 , 62, 63, 89, 99, 101 , 131 , 156, 166, 170, 187, 188, 189, 211 und 224 entsprechen, mindestens eine Aminosäuresubstitution, die aus der aus Y6F, Y6W, F61 G, Q62N, S63Q, S89A, S89G, N99H, D101S, D101 E, D101A, G131 H, G131Y, G131 F, S156R, G166A, G166M, G166L, G166I, K170R, K170G, N187D, N188G, S189T, S189L, S189I, S189R, S211 N, S211 Q, S224A, S224G bestehenden Gruppe ausgewählt ist, aufweist, wobei die Protease vorzugsweise eine Aminosäuresubstitutionskombination aufweist, die aus der aus P9T-N130D-T133A-N144K-G166M- S189T-Y217M-N252T-Q271 E, P9T-N130D-T133A-N 144K-G166M-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E, P9T-N130D-T133A-N144K-G166M-S211 N-Y217M-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D- G131 H-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A- N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N187D-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T- S89A-N130D-T133A-N144K-S189R-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A- N144K-N187D-S189R-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 S-N130D-T133A-N144K- S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 E-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M- S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-D101 A-N130D-T133A-N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T- Q271 E, P9T-S89A-N99H-N130D-T133A-N144K-K170R-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S156R-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-S63Q-S89A- N130D-T133A-N144K-G166A-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, P9T-F61 G-Q62-N-S89A- N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-N130D-T133A- N144K-S189T-Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T- Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-F61 G-Q62N-S89A-N130D-T133A-N144K-S189T- Y217M-S224A-N252T-Q271 E, Y6W-P9T-S89A-N130D-T133A-N144K-N188G-S189T-Y217M- S224A-N252T-Q271 E bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
7. Proteasekonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die heterologe Peptidsequenz über einen Linker mit der Protease verbunden ist, vorzugsweise über einen Peptidlinker, insbesondere ausgewählt aus flexiblen Linkern und steifen Linkern, wobei das Proteasekonjugat in N- zu C-terminaler Orientierung die folgende Struktur aufweist:
(i) Peptid-Linker-Protease; oder
(ii) Protease-Linker-Peptid.
8. Proteasekonjugat gemäß Anspruch 7, wobei der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (GGGGS)n mit n = 1 , 2, 3, oder 4; (G)e; (G)a; (EAAAK)n mit n = 1 , 2, oder 3; A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A; PAPAP; AEAAAKEAAAKA; und (AP)n mit n = 10-34.
9. Nukleinsäure kodierend für ein Proteasekonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. Nicht-menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 oder eine Proteasekonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 beinhaltet.
11 . Verfahren zur Herstellung eines Proteasekonjugats umfassend a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 10; und b) Isolieren des Proteasekonjugats aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
12. Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Proteasekonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.
13. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel gemäß Anspruch 12 angewendet wird.
14. Verwendung eines Proteasekonjugats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Wasch- oder Reinigungsmittel zur Entfernung von peptid- oder proteinhaltigen Anschmutzungen.
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