EP4562164A1 - Neuartige genetische werkzeuge - Google Patents

Neuartige genetische werkzeuge

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Publication number
EP4562164A1
EP4562164A1 EP23741017.0A EP23741017A EP4562164A1 EP 4562164 A1 EP4562164 A1 EP 4562164A1 EP 23741017 A EP23741017 A EP 23741017A EP 4562164 A1 EP4562164 A1 EP 4562164A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
promoter
expression
plasmid
toxin
lactobacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23741017.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shrikrishnan SANKARAN
Sourik DEY
Marc BLANCH ASENSIO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INM Leibniz Institut fuer Neue Materialien Ggmbh
Original Assignee
INM Leibniz Institut fuer Neue Materialien Ggmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INM Leibniz Institut fuer Neue Materialien Ggmbh filed Critical INM Leibniz Institut fuer Neue Materialien Ggmbh
Publication of EP4562164A1 publication Critical patent/EP4562164A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • Novel genetic tools Description Field of the invention
  • the invention relates to novel genetic tools for Lactobacillus.
  • the vector can also additionally comprise at least one toxin/antitoxin system.
  • Lactobacilli (Lactobacillus) are gram-positive, rod-shaped lactic acid bacteria (LAB) that typically occur as commensals in humans and animals. Their stress-resistant phenotypic characteristics allow them to colonize a wide range of host microenvironments, such as the intestine, skin, vagina, nasal and pharyngeal cavities. They often provide health benefits such as anti-inflammatory, anti-pathogenic and immunomodulatory activity.
  • lactobacilli are also essential for numerous fermentation processes in the food industry, for example in the production of yogurt, cheese, sourdough bread, beer and wine. Because of this ubiquity in daily life, there is considerable interest in genetically improving and expanding the capabilities of these bacteria for both medical and industrial purposes. In the medical field, lactobacilli are being developed as live biotherapeutic products (LBPs) that produce and deliver drugs directly to the site of diseases such as ulcerative colitis.
  • LBPs live biotherapeutic products
  • lactobacilli are being considered as alternative hosts for recombinant expression of E. coli because they offer two key advantages: (i) they do not produce endotoxins, and many strains have “Generally Recognized” status - nized as Safe” (GRAS), which minimizes the risk of purified therapeutic proteins causing toxic effects in humans and (ii) the infrastructure for their culture is already well established and optimized in the food industry.
  • GRAS Generally Recognized” status - nized as Safe
  • a promoter or regulatory DNA sequence is said to be "associated with” a DNA sequence that encodes RNA or a protein if the two sequences are operably linked or arranged so that the regulatory DNA sequence influences the expression level of the coding or structural DNA sequence.
  • a "coding sequence” is a nucleic acid sequence that is transcribed into RNA such as mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense RNA or antisense RNA.
  • the RNA is then translated in an organism to produce a protein.
  • “Expression cassette” means a nucleic acid sequence capable of directing expression of a particular nucleotide sequence in a suitable host cell and comprising a promoter operably linked to the nucleotide sequence of interest, operably linked to termination signals connected is. In addition, it usually includes se- sequences that are required for proper translation of the nucleotide sequence.
  • the expression cassette containing the nucleotide sequence of interest may have at least one of its components that is heterologous compared to at least one of its other components.
  • the expression cassette can also be a naturally occurring cassette, but which has been obtained in a recombinant form suitable for heterologous expression.
  • the expression cassette is heterologous with respect to the host, that is, the specific nucleic acid sequence of the expression cassette does not occur naturally in the host cell and must have been introduced into the host cell or an ancestor of the host cell through a transformation event. Expression of the nucleotide sequence in the expression cassette can occur under the control of a constitutive promoter or an inducible promoter that triggers transcription only when the host cell is exposed to a specific external stimulus.
  • the expression cassette preferably comprises at least one ribosome binding site. This is preferably arranged in the 5'-3' direction between the promoter and the protein to be expressed, or the start codon (ATG) of the protein to be expressed.
  • An expression cassette containing a nucleotide sequence of interest may be chimeric, that is, at least one of its components is heterologous with respect to at least one of its other components.
  • An expression cassette may also contain a native promoter driving the native gene but obtained in a recombinant form that is suitable for heterologous expression. Such use of an expression cassette causes it to not occur naturally in the cell into which it is introduced.
  • An expression cassette may also optionally contain a transcriptional and/or translational termination region (ie, termination region) that is functional in Lactobacillus.
  • a variety of transcription terminators are available for use in expression cassettes, which are responsible for terminating transcription after the heterologous nucleotide sequence of interest and for correct mRNA polyadenylation.
  • the termination region may be native to the transcription initiation region, it may be native to the operably linked nucleotide sequence of interest, it may be native to Lactobacillus, or it may be from another source (ie, foreign or heterologous to the promoter, the Nucleotide sequence of interest, Lactobacillus or any combination thereof).
  • the native transcription terminator of a coding sequence can also be used. Any available terminator known to function in Lactobacillus can be used in the present invention.
  • RNA e.g. mRNA, rRNA, tRNA or snRNA
  • transcription i.e. by the enzymatic action of an RNA polymerase
  • translation i.e. by the enzymatic action of an RNA polymerase
  • Gene expression can be regulated at many stages of the process.
  • the expression can, for example, only relate to the transcription of the antisense RNA or the dsRNA.
  • the term “expression” refers to the transcription and stable accumulation of sense RNA (mRNA) or functional RNA.
  • the term “expression” can also refer to the production of proteins.
  • a “gene” is a defined region within a genome that includes a coding nucleic acid sequence and typically also contains other, especially regulatory, nucleic acids that are responsible for controlling the expression, ie transcription and translation, of the coding part are responsible.
  • a gene may also contain other 5' and 3' untranslated sequences and termination sequences. Other elements that may be present include: B. Introns.
  • a heterologous nucleic acid sequence or a “heterologous” nucleic acid molecule is a nucleic acid sequence or a nucleic acid molecule that or that is not naturally associated with the host cell into which it is introduced.
  • a heterologous nucleic acid sequence or nucleic acid molecule may be a chimeric sequence, such as B. a chimeric expression cassette, in which the promoter and the coding region come from several starting organisms.
  • the promoter sequence can be a constitutive promoter sequence, a chemically inducible promoter sequence, a temperature-inducible promoter sequence or a stress-inducible promoter sequence. Heterologous is also referred to as endogenous.
  • a "homologous" nucleic acid sequence is a nucleic acid sequence that is inherently associated with a host cell into which it is introduced. “Homologous recombination” is the mutual exchange of nucleic acid fragments between homologous nucleic acid molecules. “Identity” or “percent identity” refers to the degree of similarity between two nucleic acid or protein sequences. When comparing sequences, one sequence usually serves as a reference sequence with which the test sequences are compared.
  • test and reference sequences are entered into a computer, if necessary, partial sequence coordinates are specified and program parameters for the sequence algorithm are specified.
  • the sequence comparison algorithm then calculates the percent sequence identity for the test sequence(s) relative to the reference sequence based on the specified program parameters.
  • substantially identical in the context of two nucleic acids or two amino acid sequences, refers to two or more sequences or subsequences that have at least about 50% nucleotide or amino acid residue identity when compared and for maximum similarity aligned as measured using one of the following sequence comparison algorithms or by visual inspection.
  • substantially identical sequences have at least about 60%, or at least about 70%, or at least about 80%, or at least about 85%, or even at least about 90% or 95% nucleotide or amino acid residue identity. In certain embodiments, there is substantial identity over a region of the sequences that is at least about 50 residues long, or over a region of at least about 100 residues, or the sequences are substantially identical over at least about 150 residues. In further embodiments, the sequences are substantially identical if they are identical over the entire length of the coding regions. The above also applies to regulatory sequences, such as promoters, in relation to their nucleotide sequence. An optimal alignment of the sequences to be compared can e.g. B.
  • HSPs high-scoring sequence pairs
  • T is referred to as the neighborhood word value threshold (Altschul et al., 1990).
  • the cumulative results are calculated for nucleotide sequences with the parameters M (reward value for a pair of matching residues; always > 0) and N (penalty value for mismatched residues; always ⁇ 0).
  • M forward value for a pair of matching residues; always > 0
  • N penalty value for mismatched residues; always ⁇ 0.
  • a scoring matrix is used to calculate the cumulative score. The expansion of word hits in each direction is stopped if the cumulative alignment score deviates from its maximum achieved value by an amount The end of one of the two sequences is reached.
  • the parameters W, T and X of the BLAST algorithm determine the sensitivity and speed of the alignment.
  • W word length
  • E expectation
  • the BLASTP program defaults to a word length (W) of 3, an expectation (E) of 10, and the BLOSUM62 scoring matrix (see Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989 )).
  • the BLAST algorithm also performs a statistical analysis of the similarity between two sequences (see e.g. Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • test nucleic acid sequence is considered similar to a reference sequence if the smallest sum probability when comparing the test nucleic acid sequence with the reference nucleic acid sequence is less than about 0.1, preferably less than about 0.01 and particularly preferably less than about 0.001 .
  • Another indication that two nucleic acids are essentially identical is the fact that the two molecules hybridize to each other under strict conditions.
  • hybridize with refers to the binding, duplexing, or hybridization of a molecule only with a particular nucleotide sequence under strict conditions when that sequence is present in a complex mixture (e.g., whole cellular) DNA or RNA is.
  • Boding(s) essentially refers to the complementary hybridization between a probe nucleic acid and a target nucleic acid and includes minor mismatches that can be compensated for by reducing the stringency of the hybridization media to achieve the desired detection of the target nucleic acid sequence.
  • “Strict hybridization conditions” and “strict hybridization wash conditions” in the context of nucleic acid hybridization experiments such as Southern and Northern hybridizations are sequence dependent and differ in various environmental parameters.
  • the Tm value is the temperature (at a defined ionic strength and pH value) at which 50% of the target sequence hybridizes with a perfectly matched probe.
  • Very stringent conditions are chosen to correspond to the Tm value for a particular probe.
  • An example of stringent hybridization conditions for hybridization of complementary nucleic acids that have more than 100 complementary residues on a filter in a Southern or Northern blot is 50% formamide with 1 mg heparin at 42°C, with hybridization carried out overnight.
  • An example of very severe washing conditions is 0.15M NaCl at 72°C for about 15 minutes.
  • An example of severe washing conditions is a 0.2x SSC wash at 65°C for 15 minutes (see J.
  • a high-stringency wash is often preceded by a low-stringency wash to remove the signal from the background probe.
  • An example of a medium stringency wash for a duplex of e.g. B. more than 100 nucleotides is 1x SSC at 45°C for 15 minutes.
  • An example of a low stringency wash for a duplex of e.g. B. more than 100 nucleotides is 4-6x SSC at 40°C for 15 minutes.
  • stringent conditions typically include salt concentrations of less than about 1.0 M Na ions, typically about 0.01 to 1.0 M Na ions concentration (or other salts) at pH 7.0 to 8.3, and the temperature is typically at least about 30°C. Strict conditions can also be achieved by adding destabilizing agents such as formamide. In general, a signal-to-noise ratio of 2x (or higher) than an unrelated probe in the respective hybridization assay indicates evidence of specific hybridization. Nucleic acids that do not hybridize with each other under strict conditions are still essentially identical if the proteins they encode are essentially identical. This is e.g.
  • nucleic acid sequence is "isocoding" with a reference nucleic acid sequence if the nucleic acid sequence encodes a polypeptide that has the same amino acid sequence as the polypeptide that the reference nucleic acid sequence encodes.
  • isolated nucleic acid molecule or toxin is a nucleic acid molecule or toxin that exists outside of its natural environment by man and is therefore not a product of nature.
  • nucleic acid molecule or toxin may be in a purified form or may exist in a non-natural environment, e.g. B. in a recombinant microbial cell.
  • a "nucleic acid molecule” or “nucleic acid sequence” is a segment of single- or double-stranded DNA or RNA that can be isolated from any source. In the context of the present invention, the nucleic acid molecule is typically a DNA segment. In some embodiments, the nucleic acid molecules according to the invention are isolated nucleic acid molecules.
  • the terms “protein,” “peptide,” and “polypeptide” are used interchangeably herein.
  • codon optimized sequence refers to the nucleotide sequence of a recombinant, transgenic or synthetic polynucleotide in which the codons are chosen to reflect the particular codon bias that a host cell may have. This is done in such a way that the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the codon-optimized polynucleotide is preserved.
  • the nucleotide sequence of the recombinant DNA construct contains a sequence that has been codon optimized for the cell (e.g., an animal, plant, or fungal cell) in which the construct is to be expressed.
  • a “promoter” is an untranslated DNA sequence upstream of the coding region that contains the binding site for RNA polymerase and initiates transcription of the DNA.
  • the promoter region may also contain other elements that act as regulators of gene expression. Sequences that are involved in controlling the expression of a nucleotide sequence are referred to as “regulatory elements”. Regulatory elements include a promoter operably linked to the nucleotide sequence of interest and optionally termination signals. They usually also include sequences that are required for proper translation of the nucleotide sequence.
  • Transformation is a method of introducing heterologous nucleic acid into a host cell or organism.
  • transformation means the stable integration of a DNA molecule into the genome (nucleus or plastid) of an organism of interest.
  • Transformed/transgenic/recombinant refers to a host organism, such as a bacterium or plant, into which a heterologous nucleic acid molecule has been introduced.
  • the nucleic acid molecule can be stably integrated into the genome of the host organism or can also be present as an extrachromosomal molecule. Such an extrachromosomal molecule can be self-replicating.
  • Transformed cells, tissues or plants include not only the end products of a transformation process, but also their transgenic progeny.
  • a “non-transformed”, “non-transgenic” or “non-recombinant” host refers to a wild-type organism, e.g. b. a bacterium that the heterologous nucleic acid molecule does not contain. Nucleotides are indicated by their bases with the following standard abbreviations: adenine (A), cytosine (C), thymine (T), and guanine (G).
  • amino acids are also given with the following standard abbreviations: alanine (Ala; A), arginine (Arg; R), asparagine (Asn; N), aspartic acid (Asp; D), cysteine (Cys; C), glutamine (Eqn ; Q), glutamic acid (Glu; E), glycine (Gly; G), histidine (His; H), isoleucine (Ile; 1), leucine (Leu; L), lysine (Lys; K), methionine (Met; M), phenylalanine (Phe; F), proline (Pro; P), serine (Ser; S), threonine (Thr; T), tryptophan (Trp; W), tyrosine (Tyr; Y) and valine (Val; V ).
  • an expression cassette for expression in Lactobacillus comprising a promoter in operative linkage with a nucleic acid which encodes at least one protein, the promoter being essentially identical to the P tlpA promoter, preferably with a sequence which is in the Essentially identical to sequence ID No. 1, solved.
  • the promoter preferably has an identity of at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identity with the sequence of SEQ ID No. 1.
  • the promoter is a heterologous promoter, preferably from Salmonella typhimurium.
  • the expression cassette comprises at least one ribosome binding site operatively linked to the promoter, which is preferably arranged between the promoter and the encoded protein.
  • the distance between the ribosome interface and the start codon of the encoded protein is at least 8 base pairs, in particular at least 9 base pairs, preferably from 9 to 24 base pairs, in particular 9 to 15 base pairs.
  • the invention also relates to a vector, in particular a plasmid, comprising the expression cassette.
  • These can be any vectors that are suitable for Lactobacillus.
  • the vectors can include further regulatory elements.
  • Lactobacillus in the sense of the application is preferably understood to mean a bacterium of the order of lactic acid bacteria (Lactobacillales), preferably of the family Lactobacillaceae, particularly preferably of the genus Lactobacillus, Lacticaseibacillus, Lactiplantibacillus.
  • the preferred species are Lactobacillus reuteri, Lactobacillus paracasei (Lacticaseibacillus paracasei), Lactobacillus plantarum (Lactiplantibacillus plantarum), Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus casei (Lacticaseibacillus casei), Lactococcus lactis, preferably Lactobacillus plantarum (Lactiplantipacillus plantarum), particularly preferably Lactobacillus plantarum WCFS1 (Lactiplantibacillus plantarum WCFS1).
  • the protein encoded by the nucleic acid can be a Lactobacillus homologous or heterologous protein, preferably a heterologous protein.
  • the protein can be adjusted according to the use of the Lactobacillus.
  • the invention also relates to a Lactobacillus comprising the at least one expression cassette.
  • the invention also relates to a Lactobacillus comprising at least one expression cassette according to the invention.
  • the invention also relates to a Lactobacillus comprising at least one vector comprising the at least one expression cassette.
  • the expression cassette is operatively linked to at least one toxin/antitoxin system. This means that in addition to the expression cassette, at least one toxin and at least one antitoxin can be expressed.
  • Such systems are known from antibiotic-free genetic stabilization.
  • a toxin and an associated antitoxin are also expressed.
  • the toxin usually inhibits the growth of the Lactobacillus.
  • the antitoxin neutralizes the toxin, with the toxin being broken down more slowly than the antitoxin. If a cell without the antitoxin gene is created during cell division, it is killed by the toxin.
  • These systems are therefore preferably used for gene maintenance, in particular plasmid maintenance, in cells over several generations. Since they do not require antibiotics, they are also suitable for use in living systems, such as: B. the gastrointestinal tract.
  • the at least one toxin/antitoxin system can be homologous or heterologous.
  • the at least one toxin/antitoxin system is arranged on the same vector as the expression cassette.
  • the expression cassette is operatively linked to at least two toxin/antitoxin systems, preferably at least two different toxin/antitoxin systems. In the case of a vector, these elements are arranged on the vector.
  • the toxin/antitoxin system is linked to a promoter, preferably a different promoter than the promoter of the expression cassette. It is only important that the promoter is at least active when the promoter of the expression cassette is activated. It is preferably a constitutive promoter which is not switched by an external stimulus.
  • operatively linked can also mean that the expression cassette and the TA systems are arranged on the same vector and the plasmid retention by the toxin/antitoxin system represents the operational linkage.
  • Many toxin/antitoxin systems are known. A distinction is made between different types of such systems (Singh G. et al. Current Research in Microbial Sciences 2, 2021, 100047, Bacterial toxin-antitoxin modules: classification, functions, and association with persistence).
  • the antitoxin is an antisense RNA that inhibits the translation of the toxin's mRNA.
  • hok-sok module (Gerdes, K., Bech, FW, J ⁇ rgensen, ST, L ⁇ bner-Olesen, A., Rasmussen, PB, Atlung, T., Boe, L., Karlstrom, O ., Molin, S., von Meyenburg, K., 1986.
  • EMBO J 5 (8), 2023– 2029. In type II TA systems, toxin and antitoxin are proteins that form a complex with each other.
  • the toxins are endoribonucleases or inhibitors of DNA gyrase.
  • the antitoxin is an RNA that interacts directly with the toxin protein.
  • antitoxin and toxin are proteins that do not interact directly with each other, but rather bind competitively to a protein.
  • the antitoxin is an endoribonuclease against the mRNA of the toxin.
  • the toxin inhibits replication while the antitoxin causes degradation of the toxin.
  • the antitoxin modifies the toxin.
  • the TA system may be a Type I, Type II, Type III, Type IV, Type V, or Type VI system.
  • type I TA systems are Hok and Sok, Fst and RNAII, TisB and IstR, LdrB and RdlD, FlmA and FlmB, lbs and Sib, TxpA/BmT and RatA, SymE and SymR, and XXCV2162 and ptaRNAl.
  • type II TA systems are CcdB and CcdA, ParE and ParD, MaxF and MazE, yafO and yafN, HicA and HicB, Kid and Kis, Zeta and Epsilon, DarT and DarG, Txe and Axe, YafQ and DinJ, HigB and HigA, HipA and HipB, PhD and Doc, RelB and RelE, VapB and VapC, RnlA and RnlB, MqsR and MqsA.
  • An example of a type III TA system is ToxN and Toxl.
  • An example of a Type IV TA system is An example of a Type V TA system is GoT and GoS.
  • the at least one toxin/antitoxin system is a type II TA system, preferably selected from the group comprising Txe (SEQ ID No. 8)/Axe (SEQ ID No. 9), YafQ ( SEQ ID No. 10) / DinJ (SEQ ID No. 11), HicA (SEQ ID No. 12) / HicB (SEQ ID No. 13), HigB (SEQ ID No. 14) / HigA (SEQ ID No. 15 ) and MazF (SEQ ID No. 16) / MazE (SEQ ID No. 17).
  • the sequences are preferably arranged adjacently, although they can also overlap.
  • Such a toxin/antitoxin system can increase the retention of a plasmid over several generations of Lactobacillus. Surprisingly, it has now been found that retention is significantly improved by the presence of at least two toxin/antitoxin systems, in particular two toxin/antitoxin systems, especially two different toxin/antitoxin systems. A retention of at least 15% after 100 generations, in particular at least 20%, is preferred. In the presence of at least two toxin/antitoxin systems, a retention of at least 40%, preferably over 50% after 100 generations, is preferred. In a preferred embodiment, the at least one toxin/antitoxin system achieves a G 50 value of at least 50, in particular at least 60.
  • the G 50 value is the number of generations until the proportion of cells with plasmid falls to below 50%. In the case of at least two toxin/antitoxin systems, a G 50 value of over 100 is preferred. These retentions are indeed lower than retention under the influence of antibiotics. However, these systems do not require the external addition of antibiotics. Furthermore, plasmid loss leads to the emergence of a natural organism without genetic modification. A Lactobacillus with such a vector can therefore also be referred to as a temporary genetically modified organism (GMO). Over the generations, this organism loses genetic modification. This is of particular interest if the Lactobacillus is to be used in a medical or human environment.
  • the vector can contain additional regulatory elements, such as antibiotic resistance, which simplify production.
  • the invention also relates to the use of the promoter according to the invention of the expression cassette in Lactobacillus.
  • the invention also relates to the use of the vector according to the invention in Lactobacillus, in particular in Lactobacillus plantarum. It is precisely the improved expression of the protein through the promoter according to the invention that enables many new applications.
  • the high expression also allows the detection of expressed fluorescent proteins in vivo, which was only possible with difficulty with the known promoters due to the low expression. This allows the promoter to be used better in analysis and diagnosis.
  • Materials and methods Further details and features result from the following description of preferred exemplary embodiments in conjunction with the subclaims. The respective features can be implemented alone or in combination with one another. The possibilities for solving the task are not limited to the exemplary embodiments.
  • the lines correspond to the mean of three biological replicates and the faint stripes to the standard deviation; Fig.
  • the lines correspond to the mean of three biological replicates, the faint stripes are the standard deviation;
  • the order of measurements from top to bottom is: Antibiotic, Combo, YafQ/DinJ; HicA/HicB, MazF/MazE, HigB/HigA, Txe/Axe, No TA);
  • the blue markers correspond to the bacteria from which promoters were adapted in this study, and the orange markers correspond to the bacteria from which TA systems were adapted.
  • L. plantarum WCFS1 is marked green because both promoters and TA systems were adapted from this bacterium.
  • Data correspond to three independently performed biological replicates; 6
  • A) Fluorescence microscopic images of P TlpA , P 23 , P 48 , P spp , P Tuf encoded mcherry constructs and empty vector constructs in L. plantarum WCFS1, cultured at 37 ° C for 18 h (scale bar 10 ⁇ m).
  • Data refer to three independently performed biological replicates;
  • Figure 7 A RFU plot of P 23 , P 48 and P Tuf encoded mcherry constructs showing enhanced fluorescence expression in contrast to P spp based protein expression within the temperature gradients from 31°C to 41°C.
  • the data refer to three independently performed biological replicates.
  • the total number of colonies can be determined from the bright field images (top row), and the colonies visible in the fluorescence images (bottom row) represent the plasmid-containing bacteria;
  • Fig. 9 Measurement of the growth rate (OD 600 ) of P tlpA -mcherry constructs in combination with the TA modules in comparison to the P tlpA -mcherry construct in the absence (without TA) and in the presence ( Antibiotic) of the selection pressure was grown for 18 hours at 37°C.
  • the data refer to three biological repeats and the weak bands are the respective standard deviations (No TA: no TA system; Combo: 2 TA systems; Antibiotic: presence of antibiotic);
  • Fig. 9 Measurement of the growth rate (OD 600 ) of P tlpA -mcherry constructs in combination with the TA modules in comparison to the P tlpA -mcherry construct in the absence (without TA) and in the presence ( Antibiotic) of the selection pressure was grown for 18 hours at 37°C.
  • FIG. 10 Obtaining different plasmids under antibiotic control (A) and under toxin/antitoxin control (B) (combo: 2 TA systems); Fig. 11 Schematic representation of the vector with the start of replication (ori); eryR: erythromycin resistance; toxin/anti-toxin; The arrows stand for promoters and the T for terminators; Strains, media and plasmids L. plantarum WCFS1 (ATCC number BAA-793) was used as a parental strain for the characterization of promoter strength and plasmid retention. The tribe was held in the media by De Man, Rogosa and Sharpe (MRS). The culture media, antibiotics, and supplementary reagents were purchased from Carl Roth GmbH, Germany.
  • A antibiotic control
  • B toxin/antitoxin control
  • FIG. 11 Schematic representation of the vector with the start of replication (ori); eryR: erythromycin resistance; toxin/anti-toxin; The arrows stand for promote
  • the nutrient medium was supplemented with 10 ⁇ g/ml erythromycin to produce the manipulated L. plantarum WCFS1 strains to cultivate.
  • the plasmids pSIP403 and pLp_3050sNuc used in this study were developed by Prof. Lars Axelsson (Addgene Plasmid # 122028) (S ⁇ rvig E, Mathiesen G, Naterstad K, Eijsink VG, Axelsson L. High-level, inducible gene expression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum using versatile expression vectors. Microbiology. 2005;151(7):2439-49) and Prof. Geir Mathiesen (Addgene plasmid no.
  • the plasmid pUC-GFP-AT was provided by Prof. Chris Barnes (Addgene plasmid no. 133306) (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho YK, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post -segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34).
  • the L. plantarum WCFS1 strain was provided by Prof. Gregor Fuhrmann (Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research, Saarland). The sequence-tested genetic constructs created in this study were conserved in an E. coli DH5 ⁇ strain.
  • the genetic constructs developed in this study are based on the pLp3050sNuc/ pSIP403 vector backbone.
  • the HiFi Assembly Master Mix, the Quick Blunting Kit and the T4 DNA Ligase enyzme were purchased from New England BioLabs (NEB, Germany).
  • the PCR was performed using the Q5 High Fidelity 2X Master Mix (NEB) and primers from Integrated DNA Technologies (IDT) (Louvain, USA).
  • the oligonucleotide gene fragments were purchased as eBlocks from IDT (Coralville, USA). These were optimized for maximum expression in the host strain using the Java Codon Optimization Tool (JCAT) or the IDT Codon Optimization Tool (Coralville, USA).
  • L. plantarum WCFS1 Competent cell production and DNA transformation A single colony of L. plantarum WCFS1 was inoculated into 5 mL MRS medium and cultured overnight at 37 °C with shaking (250 rpm).
  • the primary culture was diluted 1:50 (v/v) in a 25 mL secondary culture consisting of MRS media and 1% (w/v) glycine premixed at a 4:1 ratio.
  • the secondary culture was incubated at 37 °C and 250 rpm until the OD reached 6000.8.
  • the cells were then pelleted by centrifugation at 4000 rpm (3363 ⁇ g) for 10 minutes at 4°C.
  • dsDNA circular plasmid or DNA-ligated mixture
  • electroporation cuvettes with 2 mm spacing (Bio-Rad Laboratories GmbH, Germany). Electroporation transformation was performed with a single pulse at 1.8 kV, after which 1 ml of lukewarm MRS medium was immediately added. The mixture was incubated for a recovery phase of 3 hours at 37 °C and 250 rpm.
  • L. plantarum WCFS1 The plasmids were constructed using the DNA assembly method optimized in this study and directly transformed into the L. plantarum WCFS1 strain. Complementary overhangs for high-fidelity assembly were either generated using PCR primers or synthesized as custom eBlocks by IDT (Coralville, USA).
  • Purified overlapping DNA fragments were mixed with HiFi DNA Assembly Master Mix and assembled as recommended in the standard reaction protocol.
  • the assembled DNA product was then exponentially amplified by another round of PCR using a pair of primers which attaches specifically to the insert segment.
  • 5 ⁇ l of the HiFi assembly reaction was used as a template for the PCR amplification of the assembled product (100 ⁇ l final volume).
  • the purified PCR product was then phosphorylated using the Quick Blunting Kit. 2000 ng of purified PCR product was mixed with 2.5 ⁇ l 10X Quick Blunting buffer and 1 ⁇ l enzyme mix (Milli-Q water was made up to 25 ⁇ l).
  • the reaction was first incubated at 25 °C for 30 minutes and then at 70 °C for 10 minutes to inactivate the enzyme.
  • the phosphorylated products were then ligated using the enzyme T4 ligase.
  • 6 ⁇ l of the phosphorylated DNA was mixed with 2.5 ⁇ l 10X T4 Ligase Buffer and 1.5 ⁇ l T4 Ligase Enzyme (Milli-Q water was made up to 25 ⁇ l).
  • Two ligation reactions were carried out per cloning (25 ⁇ l each). The respective reactions were incubated at 25 °C for 2 hours and then at 70 °C for 30 minutes to inactivate the enzyme.
  • the ligated reactions were mixed together and purified.
  • cultures were diluted to 0.1 OD 600 in 3 mL of fresh MRS medium supplemented with antibiotics and propagated at 30°C and 250 rpm.
  • OD 600 0.4
  • the cultures were filled into FisherbrandTM 0.2mL PCR tube strips with flat caps (Thermo Electron LED GmbH, Germany) and placed in the Biometra thermocycler (Analytik Jena. GmbH, Germany).
  • the PCR strips were centrifuged in a benchtop minicentrifuge (Biozym GmbH, Germany) to pellet the cells and discard the supernatant.
  • the cells were then resuspended in 200 ⁇ l 1X PBS and added to the 96-well clear-bottom microtiter plate (Corning® 96 Well Opak Black Plate, USA).
  • the z position and gain settings for mCherry fluorescence intensity acquisition were set to 19442 ⁇ m and 136, respectively.
  • the images were adjusted to identical brightness and contrast settings and processed using the FiJi ImageJ2 software.
  • Flow cytometric analysis Quantification of fluorescent protein expression levels of the strains was performed using the Guava easyCyte BG flow cytometer (Luminex, USA). Bacterial cultures subjected to the above-mentioned treatment conditions were used for the flow cytometric analysis. 1 mL of the bacterial suspensions were harvested by centrifugation at 13,000 rpm (15,700 ⁇ g). The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 1 mL of sterile Dulbecco's 1X PBS.
  • the gain settings used for data recording were: forward scatter (FSC) - 11.8; Side scatter (SSC) - 4 and orange G fluorescence - 1.68.
  • the compensation control for fluorescence recording voltage was set to 0.01 with an acquisition rate of 5 decades.
  • Data analysis and presentation was carried out using Luminex GuavaSoft 4.0 software for EasyCyte. Construction of plasmids based on toxin/antitoxin modules Based on a literature search, the effect of the Txe/Axe module (toxin/antitoxin) from E. faecium (Grady R, Hayes F.
  • Axe–Txe a broad -spectrum proteic toxin–antitoxin system specified by a multidrug-resistant, clinical isolate of Enterococcus faecium. Molecular microbiology. 2003;47(5):1419- 32) in L. plantarum WCFS1 was tested to determine its role in an- to investigate antibiotic-free plasmid retention.
  • the TA Finder tool version 2.0 (Xie Y, Wei Y, Shen Y, Li (D1):D749-D53) was used to select additional type II TA systems (toxin/antitoxin) in Lactobacillus genomes. The genomes of L. acidophilus, L. crispatus, L. casei, L.
  • reuteri and L. plantarum WCFS1 were retrieved from NCBI Genome.
  • the TA systems contained in these genomes were searched using the standard parameters of the TA Finder. Only TA systems annotated by NCBI BlastP were selected as test candidates.
  • the TA systems YafQ/DinJ, HicA/HicB, HigB/HigA, MazF/MazE from L. ca-sei, L. acidophilus and L. plantarum WCFS1 were selected for further testing and analysis.
  • the Axe/Txe system was amplified by PCR from the plasmid pUC-GFP-AT (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho YK, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34).
  • the DinJ/YafQ and HicA/HicB systems were synthesized as custom eBlocks by IDT (Coralville, USA).
  • HigA/HigB and MazE/MazF were amplified from the genome of L. plantarum WCFS1.
  • the TA systems were inserted into the P tlpA -mCherry plasmid, resulting in the plasmids P tlpA -mCherry-Txe/Axe, P tlpA -mCherry- YafQ/DinJ, P tlpA -mCherry-HicA/HicB, P tlpA - mCherry-HigB/HigA, P tlpA - mCherry-MazF/MazE emerged. All of these plasmids were cloned directly into L. plantarum WCFS1 using the DNA assembly method optimized in this study.
  • the combinatorial TA module (P tlpA -mCherry Combo), the best endogenous and non-endogenous TA systems recorded after 100 generations (MazF/MazE and YafQ/DinJ) were subcloned and incorporated into the same plasmid integrated in reverse orientation.
  • the bacterial cultures were incubated for 12 consecutive days with a daily growth period of 24 hours to ensure an average number of 8 generations per day until the final threshold of 100 generations was exceeded.
  • Sample preparation for flow cytometric analysis was carried out according to the above-mentioned protocol.
  • the mCherry-positive cell population directly correlated with the Bacterial population that contained the manipulated plasmid.
  • the entire experiment was repeated in biological triplicates.
  • the bacterial cultures grown for 100 generations were centrifuged without the addition of antibiotics and resuspended in 1 ml of sterile Dulbecco's 1X PBS.
  • the kinetic assay was set to record the absorbance of the bacterial cultures at a wavelength of 600 nm at a 10 minute interval over a period of 18 hours. The experiment was carried out in triplicate on three independent days. Experimental results Direct cloning in L. plantarum WCFS1 In order to obtain sufficient plasmid quantities ( ⁇ 1 ⁇ g) for transformation into Lactobacillus, shuttle vectors that can be amplified in E. coli are often used. It is known that certain plasmid constructs that were passaged in E. coli and contain signal peptides and repeating sequences in the gene of interest have caused mutations.
  • PCR-based amplification and circularization of the recombinant plasmids was performed to obtain 1000 ng of circular plasmid, which was sufficient for transformation into L. plantarum WCFS1.
  • the transformation efficiency was relatively low at 50 cfu/ ⁇ g plasmid, but the genetic fidelity was >95% because L. plantarum harbors three endogenous plasmids. Since L. plantarum has three endogenous plasmids, sequencing was carried out on PCR-amplified sections of the transformed plasmid from cell lysates. This direct cloning strategy was subsequently used for the transformation of all plasmids into L. plantarum WCFS1.
  • the Salmonella tlpA promoter drives high-level constitutive expression.
  • mCherry expression was investigated downstream of the Salmonella-derived P tlpA promoter along with the thermoreactive TlpA repressor (Piraner DI, Abedi MH, Moser BA, Lee-Gosselin A, Shapiro MG. Tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbial therapeutics. Nature chemical biology. 2017;13(1):75-80; Hurme R, Berndt KD, Normark SJ, Rhen M. A proteinaceous gene regulatory thermometer encoded in Salmonella. Cell. 1997;90(1):55-64).
  • Promoter P L (pL mcherry; SEQ ID NO: 18), promoter P R (pR mcherry; SEQ ID NO: 19), promoter P TlpA (pTlpA mcherry; SEQ ID NO: 20), promoter P TlpA + TlpA -Repressor (pTlpA A39 mcherry; SEQ ID No. 21), promoter P 23 (P23 mcherry; SEQ ID No. 22), promoter P 48 (P48 mcherry; SEQ ID No. 23), promoter P spp (SPP mcherry; SEQ ID NO. 24), promoter P tuf (tuf mcherry; SEQ ID NO.
  • TA systems ensure the persistence of plasmids in a bacterial population through a post-segregation killing mechanism. They constitutively express long-lived toxins and short-lived antitoxins. As long as the plasmid is present, sufficient antitoxin is produced to neutralize the corresponding toxin. If a daughter cell does not receive any plasmid copies during bacterial division, the antitoxin is quickly broken down and the active toxin kills the cell.
  • TA systems Several natural TA systems have been studied (Yamaguchi Y, Inouye M.
  • Txe is an endoribonuclease and Ax is the corresponding inhibitory protein.
  • This module was added to the plasmid encoding P tlpA -driven mCherry expression ( Figure 2A), and the resulting strain was subcultured repeatedly for up to 100 generations. Plasmid retention was quantified by determining the proportion of the bacterial population expressing mCherry using flow cytometry and agar plate colony image analysis (FIG. 8B).
  • the Txe/Axe system initially supported better retention a plasmid loss of about 0.5%/generation for 40 generations, after which this loss accelerated to about 1.2%/generation, ending with ⁇ 18% of the population retaining the plasmid after 100 generations.
  • the bioinformatics tool TA-Finder was used and 4 additional type II TA systems were selected - YafQ/DinJ from L. casei (Levante A, Folli C, Montanini B, Ferrari A, Neviani E, Lazzi C. Expression of DinJ-YafQ System of Lactobacillus casei group strains in response to food processing stresses. Microorganisms.
  • HigB/HigA and MazF/MazE from L. plantarum WCFS1 and HicA/HicB from L. acidophilus. All of these TA candidates are endoribonuclease toxins that target the RNA pool of the metabolically active and rapidly dividing microbial host. Similar to the Txe/Axe module, these TA modules were added to the P tlpA _mCherry plasmid ( Figure 2C). Analysis of plasmid retention revealed that the HigB/HigA and MazF/MazE systems functioned largely similarly to Txe/Axe, but had slightly better retention after 100 generations (20% and 30%, respectively).
  • FIG. 10A shows the plasmid maintenance of various plasmids over 100 generations under antibiotic control. As expected, the plasmids remain almost completely intact.
  • Figure 10B shows the retention under the control of the toxin/antitoxin systems. It shows significantly improved retention compared to the wild type.
  • PtlpA is a promoter of the ⁇ 70 sigma factors, which are involved in regulating the expression of housekeeping genes in most prokaryotes.
  • Todt et al. (Todt TJ, Wels M, Bongers RS, Siezen RS, Van Hijum SA, Kleerebezem M. Genome-wide prediction and validation of sigma70 promoters in Lactobacillus plantarum WCFS1. 2012). used a genome-wide analysis approach to identify ⁇ 70-based promoter consensus sequences in L. plantarum WCFS1 and predicted 568 promoter regions in close proximity to transcription start sites ( ⁇ 40 nt).
  • G 50 can range from 50 genes for the “No TA” condition up to 110 gens (extrapolated) can be set for the combo system. Further exploration of additional TA systems in future studies will contribute to finer tuning of retention lifetimes and may even lead to near-perfect retention as achieved in E. coli by the Txe/Axe system (Fedorec AJ , Ozdemir T, Doshi A, Ho YK, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregation killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34) .
  • G 50 values are expected to depend on cultural parameters and environmental factors, therefore they could also become a useful benchmark for assessing the natural and industrial conditions under which lactobacilli grow and function.
  • the following vectors were used: P TlpA + Txe/Axe (pTlpA mcherry Txe/Axe; SEQ ID No. 26), P Tlpa + YafQ/DinJ (pTlpA mcherry YafQ/DinJ; SEQ ID No. 27), P TlpA + HigB/HigA (pTlpA mcherry HigB/HigA; SEQ ID No.
  • Figure 11 showed the schematic representation of the vector with the start of replication (ori); eryR: erythromycin resistance; Toxin/antitoxin.
  • the arrows stand for promoters and the T for terminators. Antibiotic resistance is optional.
  • the toxin/antitoxin system has its own promoter. The order of toxin/antitoxin can also be reversed.
  • the vector can also have several toxin/antitoxin systems.
  • Cited literature Rud I Jensen PR, Naterstad K, Axelsson L. A synthetic promoter library for constitutive gene expression in Lactobacillus plantarum. Microbiology. 2006;152(4):1011-9. Heiss S, Hörmann A, Tauer C, Sonnleitner M, Egger E, Grabherr R, et al. Evaluation of novel inducible promoter/repressor systems for recombinant protein expression in Lactobacillus plantarum. Microbial cell factories. 2016;15(1):1-17. S ⁇ rvig E, Mathiesen G, Naterstad K, Eijsink VG, Axelsson L.
  • TADB 2.0 an updated database of bacterial type II toxin–antitoxin loci.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen neuen Promotor für Lactobacillus, sowie die Verwendung von Toxin/Antitoxin-Systemen in Lactobacillus.

Description

Neuartige genetische Werkzeuge Beschreibung Gebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft neuartige genetische Werkzeuge für Lac- tobacillus. Dies betrifft insbesondere einen Promotor zur Ex- pression von Proteinen, insbesondere einen Vektor mit einem solchen Promotor. Der Vektor kann auch noch zusätzlich mindes- tens ein Toxin/Antitoxin-System umfassen. Stand der Technik Laktobazillen (Lactobacillus) sind gram-positive, stäbchenför- mige Milchsäurebakterien (LAB), die typischerweise bei Menschen und Tieren als Kommensalen vorkommen. Ihre stressresistenten phänotypischen Eigenschaften ermöglichen ihnen die Besiedlung eines breiten Spektrums von Mikroumgebungen des Wirts, wie Darm, Haut, Vagina, Nasen- und Rachenhöhle. Sie bieten häufig gesundheitliche Vorteile wie entzündungshemmende, antipathogene und immunmodulatorische Aktivität. Aus diesem Grund sind sie eine der größten Klassen von Probiotika und mehrere Arten wer- den klinisch zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten wie Colitis ulcerosa, Mastitis, atopische Dermatitis, bakterielle Vaginose und Parodontitis verwendet. Abgesehen von ihrem ge- sundheitlichen Nutzen sind Laktobazillen auch für zahlreiche Fermentationsprozesse in der Lebensmittelindustrie unerläss- lich, zum Beispiel bei der Herstellung von Joghurt, Käse, Sau- erteigbrot, Bier und Wein. Aufgrund dieser Allgegenwärtigkeit im täglichen Leben besteht ein erhebliches Interesse daran, die Fähigkeiten dieser Bakterien sowohl für medizinische als auch für industrielle Zwecke genetisch zu verbessern und zu erwei- tern. Im medizinischen Bereich werden Laktobazillen als lebende biotherapeutische Produkte (LBPs) entwickelt, die Medikamente direkt am Ort von Krankheiten wie Colitis ulcerosa produzieren und abgeben. Um die Pharmakokinetik und die Besiedlung dieser therapeutischen Bakterien im Körper zu untersuchen, wurden diese Bakterien so manipuliert, dass sie Reporterproteine ex- primieren, die in situ abgebildet werden können. In der Indust- rie werden Laktobazillen als alternative Wirte für die rekombi- nante Expression von E. coli in Betracht gezogen, da sie zwei entscheidende Vorteile bieten: (i) Sie produzieren keine En- dotoxine, und viele Stämme haben den Status "Generally Recog- nized as Safe" (GRAS), was die Gefahr minimiert, dass gerei- nigte therapeutische Proteine toxische Wirkungen beim Menschen hervorrufen und (ii) die Infrastruktur für ihre Kultur ist in der Lebensmittelindustrie bereits gut etabliert und optimiert. Trotz dieses Potenzials sind die wichtigsten Einschränkungen für das Engineering von Lactobacillus der Mangel an gut charak- terisierten genetischen Werkzeugen und das unzureichende Ver- ständnis der biochemischen Wege. Mehr als zwei Jahrzehnte sorg- fältiger Untersuchungen und Screenings bei phylogenetisch nahe- stehenden Bakterien haben eine Handvoll zuverlässiger Werkzeuge für die Verwendung in Lactobacillus hervorgebracht, wie konsti- tutive und induzierbare Promotoren, Operatoren, Replikons, Re- tentionsmodule, Signalpeptide usw. Die meisten dieser Werkzeuge wurden in einigen wenigen Arten entwickelt, die sich für eine gentechnische Veränderung als geeignet erwiesen haben, wobei Lactiplantibacillus plantarum (oder Lactobacillus plantarum) eine der am häufigsten verwendeten Arten ist. Die genomische Integration von Genen wurde bei diesen Bakterien zwar nachge- wiesen, die größte Funktionsvielfalt wurde jedoch mit Hilfe von Plasmiden erreicht. Allerdings sind die verfügbaren, gut cha- rakterisierten genetischen Werkzeuge im Vergleich zum Werkzeug- kasten von E. coli immer noch winzig und müssen erweitert wer- den, um die Art von Kreisläufen zu konstruieren, die für Anwen- dungen in der Medizin- oder Lebensmittelindustrie erforderlich sind. Aufgabe Aufgabe der Erfindung ist es, eine Möglichkeit bereitzustellen, in Lactobacillus Proteine in hoher Ausbeute zu exprimieren. Lösung Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Die Erfindungen umfassen auch alle sinnvollen und insbesondere alle erwähnten Kombinati- onen von unabhängigen und/oder abhängigen Ansprüchen. Der Klarheit halber werden bestimmte Begriffe, die in der Be- schreibung verwendet werden, wie folgt definiert und beschrie- ben: "Assoziiert mit / operativ verbunden" bezieht sich auf zwei Nukleinsäuren, die physisch oder funktionell miteinander ver- bunden sind. So wird beispielsweise ein Promotor oder eine re- gulatorische DNA-Sequenz als "assoziiert mit" einer DNA-Sequenz bezeichnet, die für RNA oder ein Protein kodiert, wenn die bei- den Sequenzen operativ miteinander verknüpft sind oder so ange- ordnet sind, dass die regulatorische DNA-Sequenz das Expressi- onsniveau der kodierenden oder strukturellen DNA-Sequenz beein- flusst. Eine "kodierende Sequenz" ist eine Nukleinsäuresequenz, die in RNA wie mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense RNA oder antisense RNA transkribiert wird. Vorzugsweise wird die RNA dann in einem Or- ganismus übersetzt, um ein Protein herzustellen. "Expressionskassette" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, die Expression einer bestimmten Nukleotidse- quenz in einer geeigneten Wirtszelle zu steuern, und die einen Promotor umfasst, der funktionell mit der interessierenden Nuk- leotidsequenz verbunden ist, die funktionell mit Terminierungs- signalen verbunden ist. Außerdem umfasst sie in der Regel Se- quenzen, die für eine ordnungsgemäße Translation der Nukleo- tidsequenz erforderlich sind. Die Expressionskassette, die die interessierende Nukleotidsequenz enthält, kann mindestens einen ihrer Bestandteile aufweisen, der im Vergleich zu mindestens einem ihrer anderen Bestandteile heterolog ist. Bei der Expres- sionskassette kann es sich auch um eine natürlich vorkommende Kassette handeln, die jedoch in einer für die heterologe Ex- pression geeigneten rekombinanten Form erhalten wurde. In der Regel ist die Expressionskassette jedoch heterolog in Bezug auf den Wirt, d. h., die bestimmte Nukleinsäuresequenz der Expres- sionskassette kommt in der Wirtszelle nicht natürlich vor und muss durch ein Transformationsereignis in die Wirtszelle oder einen Vorfahren der Wirtszelle eingeführt worden sein. Die Ex- pression der Nukleotidsequenz in der Expressionskassette kann unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors erfolgen, der die Transkription nur dann auslöst, wenn die Wirtszelle einem bestimmten externen Stimulus ausgesetzt ist. Außerdem umfasst die Expressionskassette bevorzugt mindestens eine Ribosomenbindungsstelle. Diese ist bevorzugt in 5‘-3‘- Richtung zwischen Promotor und zu exprimierendem Protein ange- ordnet, bzw. Startkodon (ATG) des zu exprimierenden Proteins. Eine Expressionskassette, die eine Nukleotidsequenz von Inte- resse enthält, kann chimär sein, d. h., dass mindestens einer ihrer Bestandteile heterolog in Bezug auf mindestens einen ih- rer anderen Bestandteile ist. Eine Expressionskassette kann auch einen nativen Promotor enthalten, der das native Gen an- treibt, aber in einer rekombinanten Form erhalten wurde, die für die heterologe Expression geeignet ist. Eine solche Verwen- dung einer Expressionskassette bewirkt, dass sie in der Zelle, in die sie eingeführt wurde, nicht natürlich vorkommt. Eine Expressionskassette kann auch optional eine transkriptio- nelle und/oder translationale Terminationsregion (d.h. Termina- tionsregion) enthalten, die in Lactobacillus funktionell ist. Für die Verwendung in Expressionskassetten steht eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren zur Verfügung, die für die Been- digung der Transkription nach der heterologen Nukleotidsequenz von Interesse und die korrekte mRNA-Polyadenylierung verant- wortlich sind. Die Terminationsregion kann für die Transkripti- onsinitiationsregion nativ sein, sie kann für die operativ ver- knüpfte Nukleotidsequenz von Interesse nativ sein, sie kann für Lactobacillus nativ sein, oder sie kann aus einer anderen Quelle stammen (d. h. fremd oder heterolog für den Promotor, die Nukleotidsequenz von Interesse, Lactobacillus oder eine be- liebige Kombination davon). Darüber hinaus kann auch der native Transkriptionsterminator einer kodierenden Sequenz verwendet werden. Jeder verfügbare Terminator, von dem bekannt ist, dass er in Lactobacillus funktioniert, kann im Rahmen der vorliegen- den Erfindung verwendet werden. Der Begriff "Expression", wenn er in Bezug auf ein Polynukleo- tid, wie ein Gen, einen ORF oder einen Teil davon, oder ein Transgen in Lactobacillus verwendet wird, bezieht sich auf den Prozess der Umwandlung der in einem Gen kodierten genetischen Information in RNA (z. B. mRNA, rRNA, tRNA oder snRNA) durch "Transkription" des Gens (d. h. durch die enzymatische Wirkung einer RNA-Polymerase) und gegebenenfalls durch "Translation" der mRNA in Protein (z. B. wenn ein Gen für ein Protein ko- diert). Die Genexpression kann in vielen Phasen des Prozesses reguliert werden. Im Falle von Antisense- bzw. dsRNA-Konstruk- ten kann sich die Expression beispielsweise nur auf die Tran- skription der Antisense-RNA oder der dsRNA beziehen. In einigen Ausführungsformen bezieht sich der Begriff "Expression" auf die Transkription und stabile Akkumulation von Sense-RNA (mRNA) o- der funktioneller RNA. Der Begriff "Expression" kann sich auch auf die Produktion von Proteinen beziehen. Ein "Gen" ist eine definierte Region innerhalb eines Genoms, die eine kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst und typischer- weise auch andere, vor allem regulatorische Nukleinsäuren ent- hält, die für die Kontrolle der Expression, d. h. der Tran- skription und Translation, des kodierenden Teils verantwortlich sind. Ein Gen kann auch andere 5'- und 3'-untranslatierte Se- quenzen und Terminationssequenzen enthalten. Weitere Elemente, die vorhanden sein können, sind z. B. Introns. Die regulatori- sche Nukleinsäuresequenz des Gens ist normalerweise nicht mit der in der Natur vorkommenden zugehörigen Nukleinsäuresequenz operativ verbunden und wäre somit ein chimäres Gen. Eine "heterologe" Nukleinsäuresequenz oder ein "heterologes" Nukleinsäuremolekül ist eine Nukleinsäuresequenz oder ein Nuk- leinsäuremolekül, die bzw. das nicht auf natürliche Weise mit der Wirtszelle, in die sie bzw. es eingebracht wird, assoziiert ist. Eine heterologe Nukleinsäuresequenz oder ein heterologes Nukleinsäuremolekül kann eine chimäre Sequenz, wie z. B. eine chimäre Expressionskassette, umfassen, bei der der Promotor und die kodierende Region aus mehreren Ausgangsorganismen stammen. Bei der Promotorsequenz kann es sich um eine konstitutive Pro- motorsequenz, eine chemisch induzierbare Promotorsequenz, eine temperaturinduzierbare Promotorsequenz oder eine stressindu- zierbare Promotorsequenz handeln. Heterolog wird auch als endo- gen bezeichnet. Eine "homologe" Nukleinsäuresequenz ist eine Nukleinsäurese- quenz, die von Natur aus mit einer Wirtszelle assoziiert ist, in die sie eingeführt wird. "Homologe Rekombination" ist der wechselseitige Austausch von Nukleinsäurefragmenten zwischen homologen Nukleinsäuremolekü- len. "Identität" oder "prozentuale Identität" bezieht sich auf den Grad der Ähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäure- oder Pro- teinsequenzen. Beim Sequenzvergleich dient in der Regel eine Sequenz als Referenzsequenz, mit der die Testsequenzen vergli- chen werden. Bei der Verwendung eines Sequenzvergleichsalgo- rithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, gegebenenfalls werden Teilsequenzkoordinaten ange- geben und Programmparameter für den Sequenzalgorithmus festge- legt. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann die pro- zentuale Sequenzidentität für die Testsequenz(en) relativ zur Referenzsequenz auf der Grundlage der angegebenen Programmpara- meter. Der Ausdruck "im Wesentlichen identisch" bezieht sich im Zusammenhang mit zwei Nukleinsäuren oder zwei Aminosäuresequen- zen auf zwei oder mehr Sequenzen oder Teilsequenzen, die min- destens etwa 50 % Nukleotid- oder Aminosäurerestidentität auf- weisen, wenn sie verglichen und auf maximale Übereinstimmung ausgerichtet werden, wie mit einem der folgenden Sequenzver- gleichsalgorithmen oder durch visuelle Inspektion gemessen. In bestimmten Ausführungsformen weisen im Wesentlichen identische Sequenzen mindestens etwa 60 % oder mindestens etwa 70 % oder mindestens etwa 80 % oder mindestens etwa 85 % oder sogar min- destens etwa 90 % oder 95 % Nukleotid- oder Aminosäurerestiden- tität auf. In bestimmten Ausführungsformen besteht wesentliche Identität über einen Bereich der Sequenzen, der mindestens etwa 50 Reste lang ist, oder über einen Bereich von mindestens etwa 100 Resten, oder die Sequenzen sind über mindestens etwa 150 Reste im Wesentlichen identisch. In weiteren Ausführungsformen sind die Sequenzen im Wesentlichen identisch, wenn sie über die gesamte Länge der kodierenden Regionen identisch sind. Das Vor- stehende gilt auch für regulatorische Sequenzen, wie Promoto- ren, dann bezogen auf ihre Nukleotidsequenz. Eine optimale Ausrichtung der zu vergleichenden Sequenzen kann z. B. mit dem lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Wa- terman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den Homologie-A- lignment-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch die Methode der Ähnlichkeitssuche von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), durch computergestützte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Pack- age, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o- der durch visuelle Inspektion erfolgen. Ein Beispiel für einen Algorithmus, der sich zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit eignet, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) erwähnt wird. Die Software zur Durch- führung von BLAST-Analysen ist über das National Center for Bi- otechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffent- lich zugänglich. Bei diesem Algorithmus werden zunächst hoch bewertete Sequenzpaare (HSPs) ermittelt, indem kurze Wörter der Länge W in der Abfragesequenz identifiziert werden, die entwe- der mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz übereinstimmen oder einen positiv bewerteten Schwellenwert T erfüllen, wenn sie mit diesem Wort ausgerichtet werden. T wird als Schwellenwert für den Nachbarschaftswortwert bezeichnet (Altschul et al., 1990). Diese anfänglichen Worttreffer in der Nachbarschaft dienen als Startpunkt für die Suche nach längeren HSPs, die diese Wörter enthalten. Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen entlang jeder Sequenz so weit ausgedehnt, wie der kumulative Alignment Score erhöht werden kann. Die ku- mulativen Ergebnisse werden für Nukleotidsequenzen mit den Pa- rametern M (Belohnungswert für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Strafwert für nicht übereinstimmende Reste; immer < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Bewertungsmatrix verwendet, um die kumulative Bewertung zu be- rechnen. Die Ausdehnung der Worttreffer in jede Richtung wird gestoppt, wenn der kumulative Alignment-Score um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abweicht, der kumulative Score aufgrund der Ansammlung eines oder mehrerer negativ be- werteter Rest-Alignments auf Null oder darunter geht oder das Ende einer der beiden Sequenzen erreicht wird. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Alignments. Das Programm BLASTN (für Nukle- otidsequenzen) verwendet als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, einen Cutoff von 100, M=5, N=-4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequen- zen verwendet das BLASTP-Programm standardmäßig eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62- Bewertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)). Neben der Berechnung der prozentualen Sequenzidentität führt der BLAST-Algorithmus auch eine statistische Analyse der Ähn- lichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Ein Maß für die Ähnlichkeit, das der BLAST-Algorithmus liefert, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit gibt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auf- treten würde. Eine Testnukleinsäuresequenz gilt beispielsweise als ähnlich zu einer Referenzsequenz, wenn die kleinste Summen- wahrscheinlichkeit bei einem Vergleich der Testnukleinsäurese- quenz mit der Referenznukleinsäuresequenz weniger als etwa 0,1, vorzugsweise weniger als etwa 0,01 und besonders bevorzugt we- niger als etwa 0,001 beträgt. Ein weiteres Indiz dafür, dass zwei Nukleinsäuren im Wesentli- chen identisch sind, ist die Tatsache, dass die beiden Moleküle unter strengen Bedingungen aneinander hybridisieren. Der Aus- druck "spezifisch hybridisieren mit" bezieht sich auf die Bin- dung, Duplexbildung oder Hybridisierung eines Moleküls nur mit einer bestimmten Nukleotidsequenz unter strengen Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch (z. B. gesamter zellulärer) DNA oder RNA vorhanden ist. "Bindung(en) im Wesent- lichen" bezieht sich auf die komplementäre Hybridisierung zwi- schen einer Sondennukleinsäure und einer Zielnukleinsäure und umfasst geringfügige Fehlpaarungen, die durch Verringerung der Stringenz der Hybridisierungsmedien ausgeglichen werden können, um den gewünschten Nachweis der Zielnukleinsäuresequenz zu er- reichen. "Strenge Hybridisierungsbedingungen" und "strenge Hybridisie- rungswaschbedingungen" im Zusammenhang mit Nukleinsäure-Hybri- disierungsexperimenten wie Southern- und Northern-Hybridisie- rungen sind sequenzabhängig und unterscheiden sich in verschie- denen Umgebungsparametern. Längere Sequenzen hybridisieren spe- zifisch bei höheren Temperaturen. Eine umfassende Anleitung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Over- view of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York. Im Allgemeinen werden sehr strenge Hybridisierungs- und Waschbedingungen gewählt, die etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezi- fische Sequenz bei einer bestimmten Ionenstärke und einem be- stimmten pH-Wert liegen. Typischerweise hybridisiert eine Sonde unter "strengen Bedingungen" mit ihrer Zielsubsequenz, aber nicht mit anderen Sequenzen. Der Tm-Wert ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50 % der Zielsequenz mit einer perfekt angepassten Sonde hybridisieren. Sehr strenge Bedingun- gen werden so gewählt, dass sie dem Tm-Wert für eine bestimmte Sonde entsprechen. Ein Beispiel für strenge Hybridisierungsbe- dingungen für die Hybridisierung von komplementären Nukleinsäu- ren, die mehr als 100 komplementäre Reste auf einem Filter in einem Southern oder Northern Blot aufweisen, ist 50% Formamid mit 1 mg Heparin bei 42°C, wobei die Hybridisierung über Nacht durchgeführt wird. Ein Beispiel für sehr strenge Waschbedingun- gen ist 0,15M NaCl bei 72°C für etwa 15 Minuten. Ein Beispiel für strenge Waschbedingungen ist ein 0,2-facher SSC-Waschlauf bei 65°C für 15 Minuten (siehe J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), für eine Beschrei- bung des SSC-Puffers). Häufig geht einem hochstringenten Wasch- vorgang ein niedrigstringenter Waschvorgang voraus, um das Sig- nal der Hintergrundsonde zu entfernen. Ein Beispiel für einen Waschvorgang mit mittlerer Stringenz für einen Duplex von z. B. mehr als 100 Nukleotiden ist 1x SSC bei 45°C für 15 Minuten. Ein Beispiel für einen Waschvorgang mit geringer Stringenz für einen Duplex von z. B. mehr als 100 Nukleotiden ist 4-6x SSC bei 40°C für 15 Minuten. Für kurze Sonden (z. B. etwa 10 bis 50 Nukleotide) umfassen strenge Bedingungen typischerweise Salz- konzentrationen von weniger als etwa 1,0 M Na-Ionen, typischer- weise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3, und die Temperatur beträgt typi- scherweise mindestens etwa 30°C. Strenge Bedingungen können auch durch die Zugabe von Destabilisierungsmitteln wie Formamid erreicht werden. Im Allgemeinen deutet ein Signal-Rausch-Ver- hältnis von 2x (oder höher) als bei einer nicht verwandten Sonde in dem jeweiligen Hybridisierungsassay auf den Nachweis einer spezifischen Hybridisierung hin. Nukleinsäuren, die unter strengen Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind den- noch im Wesentlichen identisch, wenn die Proteine, für die sie kodieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies ist z. B. der Fall, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Codon-Degenerierung, die der genetische Code zulässt, erstellt wird. Nachstehend sind Beispiele für Hybridisierungs-/Waschbedingun- gen aufgeführt, die zur Klonierung homologer Nukleotidsequenzen verwendet werden können, die im Wesentlichen mit den Referenz- nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung identisch sind: Eine Referenznukleotidsequenz hybridisiert vorzugsweise mit der Referenznukleotidsequenz in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 2X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, insbesondere in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,5X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, vor- zugsweise in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, noch bevorzugter in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Ein weiteres Indiz dafür, dass zwei Nukleinsäuren oder Proteine im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das von der ersten Nukleinsäure kodierte Protein mit dem von der zweiten Nuklein- säure kodierten Protein immunologisch kreuzreaktiv ist oder spezifisch daran bindet. So ist ein Protein typischerweise im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Protein, wenn sich die beiden Proteine nur durch konservative Substitutionen unter- scheiden. Eine Nukleinsäuresequenz ist "isokodierend" mit einer Referenz- Nukleinsäuresequenz, wenn die Nukleinsäuresequenz für ein Po- lypeptid kodiert, das die gleiche Aminosäuresequenz hat wie das Polypeptid, für das die Referenz-Nukleinsäuresequenz kodiert. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül oder ein isoliertes Toxin ist ein Nukleinsäuremolekül oder Toxin, das durch Menschenhand außerhalb seiner natürlichen Umgebung existiert und daher kein Produkt der Natur ist. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül oder Toxin kann in gereinigter Form vorliegen oder in einer nicht natürlichen Umgebung existieren, z. B. in einer rekombinanten mikrobiellen Zelle. Ein "Nukleinsäuremolekül" oder eine "Nukleinsäuresequenz" ist ein Segment einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, das aus einer beliebigen Quelle isoliert werden kann. Im Zusam- menhang mit der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremo- lekül typischerweise ein DNA-Segment. In einigen Ausführungs- formen sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle iso- lierte Nukleinsäuremoleküle. Die Begriffe "Protein", "Peptid" und "Polypeptid" werden hier austauschbar verwendet. Der Begriff "kodonoptimierte" Sequenz bezeichnet die Nukleo- tidsequenz eines rekombinanten, transgenen oder synthetischen Polynukleotids, bei dem die Kodons so gewählt werden, dass sie den besonderen Kodon-Bias widerspiegeln, den eine Wirtszelle haben kann. Dies geschieht so, dass die Aminosäuresequenz des durch das kodonoptimierte Polynukleotid kodierten Polypeptids erhalten bleibt. In bestimmten Ausführungsformen enthält die Nukleotidsequenz des rekombinanten DNA-Konstrukts eine Sequenz, die für die Zelle (z. B. eine Tier-, Pflanzen- oder Pilzzelle), in der das Konstrukt exprimiert werden soll, kodonoptimiert wurde. Ein "Promotor" ist eine nicht-translatierte DNA-Sequenz strom- aufwärts der kodierenden Region, die die Bindungsstelle für die RNA-Polymerase enthält und die Transkription der DNA einleitet. Die Promotorregion kann auch andere Elemente enthalten, die als Regulatoren der Genexpression wirken. Als "regulatorische Elemente" werden Sequenzen bezeichnet, die an der Kontrolle der Expression einer Nukleotidsequenz betei- ligt sind. Regulatorische Elemente umfassen einen Promotor, der funktionsfähig mit der interessierenden Nukleotidsequenz ver- bunden ist, sowie optional Terminierungssignale. Sie umfassen in der Regel auch Sequenzen, die für eine ordnungsgemäße Trans- lation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. "Transformation" ist ein Verfahren zur Einführung heterologer Nukleinsäure in eine Wirtszelle oder einen Organismus. Insbe- sondere bedeutet "Transformation" die stabile Integration eines DNA-Moleküls in das Genom (Kern oder Plastid) eines Organismus von Interesse. "Transformiert / transgen / rekombinant" bezieht sich auf einen Wirtsorganismus wie ein Bakterium oder eine Pflanze, in den ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeführt wurde. Das Nuklein- säuremolekül kann stabil in das Genom des Wirtsorganismus inte- griert sein oder auch als extrachromosomales Molekül vorliegen. Ein solches extrachromosomales Molekül kann selbstreplizierend sein. Unter transformierten Zellen, Geweben oder Pflanzen sind nicht nur die Endprodukte eines Transformationsprozesses zu verstehen, sondern auch deren transgene Nachkommenschaft. Ein "nicht transformierter", "nicht transgener" oder "nicht rekom- binanter" Wirt bezieht sich auf einen Wildtyp-Organismus, z. B. ein Bakterium, den das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält. Nukleotide werden durch ihre Basen mit den folgenden Stan- dardabkürzungen angegeben: Adenin (A), Cytosin (C), Thymin (T) und Guanin (G). Die Aminosäuren werden ebenfalls mit den fol- genden Standardabkürzungen angegeben: Alanin (Ala; A), Arginin (Arg; R), Asparagin (Asn; N), Asparaginsäure (Asp; D), Cystein (Cys; C), Glutamin (Gln; Q), Glutaminsäure (Glu; E), Glycin (Gly; G), Histidin (His; H), Isoleucin (Ile; 1), Leucin (Leu; L), Lysin (Lys; K), Methionin (Met; M), Phenylalanin (Phe; F), Prolin (Pro; P), Serin (Ser; S), Threonin (Thr; T), Tryptophan (Trp; W), Tyrosin (Tyr; Y) und Valin (Val; V). Die Aufgabe wird unter anderem durch Expressionskassette zur Expression in Lactobacillus umfassend einen Promotor in opera- tiver Verknüpfung mit einer Nukleinsäure, welche mindestens ein Protein kodiert, wobei der Promotor im Wesentlichen identisch mit dem PtlpA-Promotor ist, bevorzugt mit einer Sequenz, welche im Wesentlichen identisch mit der Sequenz ID Nr. 1 ist, gelöst. Bevorzugt weist der Promotor eine Identität von mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindes- tens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, oder 100 % Identität mit der Sequenz der SEQ-ID Nr. 1 auf. Der Promotor ist dabei ein heterologer Promotor, bevorzugt aus Salmonella typhimurium. Überraschenderweise wurde gefunden, dass dieser Promotor in Lactobacillus eine sehr hohe Expression des operativ verknüpf- ten Proteins ermöglicht. Die Expression ist dabei insbesondere in dem Bereich bei Temperaturen zwischen 31 °C und 45 °C ver- stärkt, insbesondere in einem Temperaturbereich von 37 bis 43 °C. Überraschenderweise wurde gefunden, dass der PtlpA-Promotor auch in Abwesenheit seines zugehörigen Repressors eine sehr starke Expressions ermöglicht, insbesondere im bevorzugten Temperatur- bereich. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Expressions- kassette mindestens eine mit dem Promotor operativ verknüpfte Ribosomenbindungsstelle, welche bevorzugt zwischen Promotor und kodiertem Protein angeordnet ist. In einer bevorzugten Ausfüh- rungsform beträgt der Abstand zwischen Ribosomenschnittstelle und Startkodon des kodierten Proteins mindestens 8 Basenpaare, insbesondere mindestens 9 Basenpaare, bevorzugt von 9 bis 24 Basenpaare, insbesondere 9 bis 15 Basenpaare. Die Erfindung betrifft außerdem einen Vektor, insbesondere ein Plasmid, umfassend die Expressionskassette. Es kann sich dabei um beliebige Vektoren handeln, welche für Lactobacillus geeignet sind. Die Vektoren können noch weitere regulatorische Elemente umfas- sen. Unter Lactobacillus im Sinne der Anmeldung wird bevorzugt ein Bakterium der Ordnung der Milchsäurebakterien (Lactobacilla- les), bevorzugt der Familie Lactobacillaceae verstanden, beson- ders bevorzugt der Gattung Lactobacillus, Lacticaseibacillus, Lactiplantibacillus. Bevorzugt sind dabei die Arten Lactobacillus reuteri, Lactoba- cillus paracasei (Lacticaseibacillus paracasei), Lactobacillus plantarum (Lactiplantibacillus plantarum), Lactobacillus john- sonii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lac- tobacillus salivarius, Lactobacillus casei (Lacticaseibacillus casei), Lactococcus lactis, bevorzugt Lactobacillus plantarum (Lactiplantipacillus plantarum), besonders bevorzugt Lactoba- cillus plantarum WCFS1 (Lactiplantibacillus plantarum WCFS1). Das von der Nukleinsäure kodierte Protein kann ein zu Lactoba- cillus homologes oder heterologes Protein sein, bevorzugt ein heterologes Protein. Das Protein kann entsprechend der Verwendung des Lactobacillus angepasst werden. Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend die mindestens eine Expressionskassette. Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend mindestens eine erfindungsgemäße Expressionskassette. Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend mindestens einen Vektor umfassend die mindestens eine Expressi- onskassette. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Expressionskas- sette mit mindestens einem Toxin/Antitoxin-System operativ ver- knüpft. Dies bedeutet, dass zusätzlich zur Expressionskassette mindestens ein Toxin und mindestens ein Antitoxin exprimiert werden kann. Solche Systeme sind aus der Antibiotikum-freien genetischen Stabilisierung bekannt. Dabei wird bei der Expres- sion eines Proteins auch ein Toxin und ein zugehöriges Antito- xin exprimiert. Das Toxin bewirkt dabei in der Regel eine Wachstumshemmung des Lactobacillus. Das Antitoxin neutralisiert dabei das Toxin, wobei das Toxin langsamer abgebaut wird, als das Antitoxin. Wenn bei einer Zellteilung eine Zelle ohne das Antitoxin-Gen entsteht, wird sie durch das Toxin abgetötet. Diese Systeme werden daher bevorzugt zur Generhaltung, insbe- sondere Plasmiderhaltung, in Zellen über mehrere Generationen eingesetzt. Da sie keine Antibiotika dafür benötigen, sind sie geeignet auch in lebenden Systemen, wie z. B. dem Magen-Darm- Trakt, eingesetzt zu werden. Das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System kann homolog oder heterolog sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System auf dem gleichen Vektor wie die Expres- sionskassette angeordnet. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Expressionskas- sette mit mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, bevorzugt mindestens zwei unterschiedlichen Toxin/Antitoxin-Systemen, operativ verknüpft. Im Falle eines Vektors sind diese Elemente auf dem Vektor angeordnet. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Toxin/Antitoxin- System mit einem Promotor verknüpft, bevorzugt einem anderen Promotor, als der Promotor der Expressionskassette. Wichtig ist nur, dass der Promotor mindestens auch aktiv ist, wenn der Pro- motor der Expressionskassette aktiviert wird. Bevorzugt handelt es sich um einen konstitutiven Promotor, welcher nicht von ei- nem externen Stimulus geschaltet wird. Dadurch ist diese Plas- midretention immer aktiv, wenn das Plasmid in der Zelle ist. In diesem Fall kann „operativ verknüpft“ auch bedeuten, dass die Expressionskassette und die TA-Systeme auf dem gleichen Vektor angeordnet sind und die Plasmidretention durch das Toxin/Anti- toxin-System die operative Verknüpfung darstellt. Es sind viele Toxin/Antitoxin-Systeme bekannt. Es werden verschiedene Typen von solchen Systemen unterschieden (Singh G. et al. Current Research in Microbial Sciences 2, 2021, 100047, Bacterial toxin-antitoxin modules: classifica- tion, functions, and association with persistence). Bei Typ-I-TA-Systemen ist das Antitoxin eine antisense RNA, welche die Translation der mRNA der Toxins inhibiert. Ein Bei- spiel dafür ist das hok-sok-Modul (Gerdes, K., Bech, F.W., Jørgensen, S.T., Løbner-Olesen, A., Rasmussen, P.B., Atlung, T., Boe, L., Karlstrom, O., Molin, S., von Meyenburg, K., 1986. Mechanism of postsegregational killing by the hok gene product of the parB system of plasmid R1 and its homology with the relF gene product of the E.coli relB operon. EMBO J 5 (8), 2023– 2029.). Bei Typ-II-TA-Systemen sind Toxin und Antitoxin Prote- ine, welche miteinander einen Komplex bilden. Viele der Toxine sind dabei Endoribonucleasen oder Inhibitoren der DNA Gyrase. Bei einem Typ-III-TA-System ist das Antitoxin eine RNA, welche direkt mit dem Toxin-Protein interagiert. Bei einem Typ-IV-TA-System sind Antitoxin und Toxin proteine, welche nicht direkt miteinander interagieren, sondern kompeti- tiv an ein Protein binden. Bei einem Typ-V-TA-System ist das Antitoxin eine Endoribonukle- ase gegen die mRNA des Toxins. Bei einem Typ-VI-TA-System hemmt das Toxin die Replikation, während das Antitoxin die Zersetzung des Toxins verursacht. Bei einem Typ-VII-TA-System modifiziert das Antitoxin das To- xin. Das TA-System kann ein System vom Typ I, Typ II, Typ III, Typ IV, Typ V oder Typ VI sein. Beispiele für Typ-I-TA-Systeme sind Hok und Sok, Fst und RNAII, TisB und IstR, LdrB und RdlD, FlmA und FlmB, lbs und Sib, TxpA/BmT und RatA, SymE und SymR, and XXCV2162 und ptaRNAl. Beispiele für Typ-II-TA-Systeme sind CcdB und CcdA, ParE und ParD, MaxF und MazE, yafO und yafN, HicA und HicB, Kid und Kis, Zeta und Epsilon, DarT und DarG, Txe und Axe, YafQ und DinJ, HigB und HigA, HipA und HipB, PhD und Doc, RelB und RelE, VapB und VapC, RnlA und RnlB, MqsR und MqsA. Ein Beispiel für ein Typ-III-TA-System ist ToxN und Toxl. Ein Beispiel für ein Typ-IV-TA-System ist Ein Beispiel für ein Typ-V-TA-System ist GoT and GoS. Ein Beispiel für ein Typ-VI-TA-System ist SocA and SocB. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System ein Typ-II-TA-System, bevorzugt ausge- wählt aus der Gruppe umfassend Txe (SEQ ID Nr. 8) / Axe (SEQ ID Nr. 9), YafQ (SEQ ID Nr. 10) / DinJ (SEQ ID Nr. 11), HicA (SEQ ID Nr. 12) / HicB (SEQ ID Nr. 13) , HigB (SEQ ID Nr. 14) / HigA (SEQ ID Nr. 15) und MazF (SEQ ID Nr. 16) / MazE (SEQ ID Nr. 17). Die Sequenzen sind bevorzugt benachbart angeordnet, wobei sie sich auch überlappen können. Ein solches Toxin/Antitoxin-System kann dabei die Retention ei- nes Plasmids über mehrere Generationen von Lactobacillus erhö- hen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch die An- wesenheit von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, insbe- sondere zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, ganz besonders zwei ver- schiedene Toxin/Antitoxin-Systemen, die Retention deutlich ver- bessert wird. Bevorzugt ist eine Retention mindestens 15 % nach 100 Generati- onen, insbesondere mindestens 20 %. Bei Anwesenheit von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen ist eine Retention von mindestens 40 %, bevorzugt über 50 % nach 100 Generationen, bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform erreicht das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System einen G50-Wert von mindestens 50, insbesondere mindestens 60. Dabei ist der G50-Wert die Zahl der Generationen bis der Anteil an Zellen mit Plasmid auf unter 50 % fällt. Im Falle von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen ist ein G50-Wert von über 100 bevorzugt. Diese Retentionen sind zwar geringer, als bei der Retention un- ter dem Einfluss von Antibiotika. Allerdings kommen diese Sys- teme ohne externe Zugabe von Antibiotika aus. Außerdem führt der Plasmidverlust zum Entstehen eines natürlichen Organismus ohne genetische Modifikation. Ein Lactobacillus mit einem sol- chen Vektor kann daher auch als temporärer genmodifizierter Or- ganismus (GMO) bezeichnet werden. Im Laufe der Generationen verliert dieser Organismus die genetische Modifikation. Dies ist insbesondere von Interesse, wenn die Lactobacillus im medi- zinischen oder humanen Umfeld eingesetzt werden sollen. Der Vektor kann noch weitere regulatorische Elemente enthalten, beispielsweise Resistenzen von Antibiotika, welche die Herstel- lung vereinfachen. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des erfindungs- gemäßen Promotors der Expressionskassette in Lactobacillus. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des erfindungs- gemäßen Vektors in Lactobacillus, insbesondere in Lactobacillus plantarum. Gerade die verbesserte Expression des Proteins durch den erfin- dungsgemäßen Promotor ermöglicht viele neue Anwendungen. So er- laubt die hohe Expression auch die Detektion von exprimierten fluoreszierenden Proteinen in vivo, was bei den bekannten Pro- motoren aufgrund der geringen Expression nur schlecht möglich war. Dadurch kann der Promotor besser bei der Analyse und Diag- nose eingesetzt werden. Materialien und Methoden Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfol- genden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweili- gen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt. Die Ausführungsbeispiele sind in den Figuren schematisch darge- stellt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeich- nen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt: Fig. 1 A) Fluoreszenzmikroskopie der PtlpA getriebenen mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1, kultiviert bei 31°C und 39°C für 18 h. Skalenbalken = 10 µm. B) Durchflusszytometrische Analyse der PtlpA , P23 ,P48 , Pspp und PTuf Promotor-gesteuerten mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1 nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C. C) Fluoreszenzspektroskopische Analyse der durch den PtlpA , P23 , P48 , Pspp und PTuf Promotor gesteuerten mCherry-Expression nach 18 Stunden Inkubation bei Tem- peraturen von 31°C bis 41°C. D) Messung der Wachstums- rate (OD600) der Kontrolle (leerer Vektor) und der PtlpA getriebenen mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1 für 18 Stunden bei 37°C. In C und D entsprechen die Linien dem Mittelwert von drei biologischen Replikaten und die schwachen Streifen der Standardabweichung; Fig. 2 A) Schematische Darstellung der direkten Klonierung der verschiedenen Toxin/Antitoxin-Genmodule in das Plasmid mit PtlpA gesteuerter mCherry-Expression. B) Durchflusszytometrisches Histogramm des Stammes mit einem Plasmid, das kein TA-Modul enthält, nach 50 Ge- nerationen serieller Passage in Abwesenheit von Anti- biotika. Das rechte Kästchen entspricht der Bakterien- population, die das Plasmid enthält, und das linke Kästchen der Bakterienpopulation ohne das Plasmid in Abwesenheit von Selektionsdruck. C) Grafische Darstel- lung des Ausmaßes der Plasmid-Retention durch die TA- Module in L. plantarum WCFS1 für 100 Generationen im Vergleich zu ohne TA-System (No TA) oder antibioti- scher Kontrolle (Antibiotic). Die Linien entsprechen dem Mittelwert von drei biologischen Replikaten, die schwachen Streifen sind die Standardabweichung; Die Reihenfolge der Messungen von oben nach unten ist: An- tibiotic, Combo, YafQ/DinJ; HicA/HicB, MazF/MazE, HigB/HigA, Txe/Axe, No TA); Fig. 3 A) Phylogenetischer Baum, der die Abstände zwischen den Arten aufzeigt, von denen verschiedene genetische Teile in L. plantarum getestet wurden. Die blauen Mar- kierungen entsprechen den Bakterien, von denen in die- ser Studie Promotoren adaptiert wurden, und die oran- gefarbenen Markierungen entsprechen den Bakterien, von denen TA-Systeme adaptiert wurden. L. plantarum WCFS1 ist grün markiert, da sowohl Promotoren als auch TA- Systeme von diesem Bakterium adaptiert wurden. B) Ho- mologieanalyse von σ70 RpoD-Genen aus L. plantarum, E. coli und S. typhimurium. Höhe und Helligkeit der gel- ben Balken zeigen an, inwieweit einzelne Reste über alle 3 Bakterien hinweg konserviert sind; Fig. 4 G50 Werte der verschiedenen TA-Systeme (No TA: kein TA-System, Combo: 2 TA-Systeme); und Fig. 5 A) Durchflusszytometrische Analyse der PR , PL und PTlpA promotorkodierten mcherry-Konstrukte in L. plantarum WCFS1 nach 18 h Inkubation bei 37°C. B) Fluoreszenz- spektroskopische Analyse der PR , PL und PTlpA promotor- kodierten mcherry-Konstrukte nach 18-stündiger Inkuba- tion bei Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C. Die Daten beziehen sich auf drei biologische Wiederholun- gen. C) Fold Change (n-fache Zunahme) der auf dem PTlpA Promotor basierenden mcherry-Expression im Vergleich zu den PR und PL Promotoren bei 37°C. D) RFU-Plot der auf PTlpA und PTlpA39 basierenden mcherry-Expression nach 18-stündiger Inkubation bei Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C. Die Daten entsprechen drei unabhängig voneinander durchgeführten biologischen Replikaten; Fig. 6 A) Fluoreszenzmikroskopische Bilder von PTlpA , P23 , P48 , Pspp, PTuf kodierten mcherry-Konstrukten und lee- ren Vektorkonstrukten in L. plantarum WCFS1, kulti- viert bei 37°C für 18 h (Maßstab = 10µm). B) Fold Change der PTlpA , P23 , P48 und Pspp kodierten mcherry- Konstrukte in Bezug auf die PTuf Promotor-basierte mcherry-Expression bei 31°C bzw. 39°C. Die Daten be- ziehen sich auf drei unabhängig voneinander durchge- führte biologische Wiederholungen; Fig. 7 A) RFU-Plot von P23 , P48 und PTuf kodierten mcherry- Konstrukten, die eine verstärkte Fluoreszenzexpression im Gegensatz zu der auf Pspp basierenden Proteinexpres- sion innerhalb der Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C zeigen. Die Daten beziehen sich auf drei unabhän- gig voneinander durchgeführte biologische Wiederholun- gen. B) Fold Change der PTlpA Promotor-basierten mcherry-Expression mit 9 bp Spacer (zwischen RBS und Startcodon) im Vergleich zum PTlpA -6 bp Spacer-Kon- strukt; Fig. 8 A) Durchflusszytometrie-Plots, die zeigen, dass Stämme mit P48 -getriebener mCherry-Expression relativ ge- ringe Intensitäten erzeugen, wobei sich ein Teil der Population mit dem Signal überschneidet, das von Bak- terien stammt, die keine fluoreszierenden Proteine ex- primieren (Kontrolle). Im Vergleich dazu ist das Sig- nal von PtlpA deutlich von dem der Kontrolle abge- grenzt. B) Agarplattenbasierte Analyse der Plasmid-Re- tention, die von den verschiedenen TA-Systemen bereit- gestellt wird. Die Gesamtzahl der Kolonien kann aus den Hellfeldbildern (obere Reihe) bestimmt werden, und die in den Fluoreszenzbildern sichtbaren Kolonien (un- tere Reihe) stellen die Plasmid-enthaltenden Bakterien dar; Fig. 9 Messung der Wachstumsrate (OD600) von PtlpA -mcherry- Konstrukten in Kombination mit den TA-Modulen im Ver- gleich zu dem PtlpA -mcherry-Konstrukt, das in Abwesen- heit (ohne TA) und in Anwesenheit (Antibiotikum) des Selektionsdrucks 18 Stunden lang bei 37°C gewachsen ist. Die Daten beziehen sich auf drei biologische Wie- derholungen und die schwachen Banden sind die jeweili- gen Standardabweichungen (No TA: kein TA-System; Combo: 2 TA-Systeme; Antibiotic: Anwesenheit Antibio- tikum); Fig. 10 Erhalt unterschiedlicher Plasmide unter antibiotischer Kontrolle (A) und unter Toxin/Antitoxin-Kontrolle (B) (Combo: 2 TA-Systeme); Fig. 11 Schematische Darstellung des Vektors mit Replikations- beginn (ori); eryR: Erythromycinresistenz; Toxin/Anti- toxin; Die Pfeile stehen für Promotoren und die T für Terminatoren; Stämme, Medien und Plasmide L. plantarum WCFS1 (ATCC Nummer BAA-793) wurde als Elternstamm für die Charakterisierung der Promotorstärke und der Plasmidre- tention verwendet. Der Stamm wurde in den Medien von De Man, Rogosa und Sharpe (MRS) gehalten. Die Kulturmedien, Antibiotika und ergänzenden Reagenzien wurden von der Carl Roth GmbH, Deutschland, bezogen. Das Nährmedium wurde mit 10 μg/ml Eryth- romycin ergänzt, um die manipulierten L. plantarum WCFS1-Stämme zu kultivieren. Die in dieser Studie verwendeten Plasmide pSIP403 und pLp_3050sNuc wurden von Prof. Lars Axelsson (Addgene Plasmid # 122028) (Sørvig E, Mathiesen G, Naterstad K, Eijsink VG, Axelsson L. High-level, inducible gene expression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum using versa- tile expression vectors. Microbiology. 2005;151(7):2439-49) und Prof. Geir Mathiesen (Addgene-Plasmid Nr. 122030) (Mathiesen G, Sveen A, Brurberg MB, Fredriksen L, Axelsson L, Eijsink VG. Ge- nome-wide analysis of signal peptide functionality in Lactoba- cillus plantarum WCFS1. BMC genomics. 2009;10(1):1-13) bezie- hungsweise das Plasmid pTlpA39-Wasabi wurde von Prof. Mikhail Shapiro zur Verfügung gestellt (Addgene Plasmid # 86116) (Pira- ner DI, Abedi MH, Moser BA, Lee-Gosselin A, Shapiro MG. Tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbial therapeu- tics. Nature chemical biology. 2017;13(1):75-80). Das Plasmid pUC-GFP-AT wurde von Prof. Chris Barnes zur Verfügung gestellt (Addgene-Plasmid Nr. 133306) (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segrega- tional killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Der L. plantarum WCFS1-Stamm wurde von Prof. Gregor Fuhrmann (Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung, Saarland) zur Verfügung gestellt. Die in dieser Studie erstellten se- quenzgeprüften genetischen Konstrukte wurden in einem E. coli DH5α-Stamm konserviert. Molekularbiologie Die in dieser Studie entwickelten genetischen Konstrukte basie- ren auf dem pLp3050sNuc/ pSIP403 Vektor-Backbone. Der HiFi As- sembly Master Mix, das Quick Blunting Kit und das T4 DNA Ligase enyzme wurden von New England BioLabs (NEB, Deutschland) bezo- gen. Die PCR wurde mit dem Q5 High Fidelity 2X Master Mix (NEB) und Primern von Integrated DNA Technologies (IDT) (Louvain, USA) durchgeführt. Die Oligonukleotid-Genfragmente wurden als eBlocks von IDT (Coralville, USA) erworben. Diese wurden für eine maximale Expression im Wirtsstamm mit dem Java Codon Opti- mization Tool (JCAT) oder dem IDT Codon Optimization Tool (Coralville, USA) optimiert. Für die Plasmidextraktion und die DNA-Aufreinigung wurden Kits der Qiagen GmbH (Hilden, Deutsch- land) bzw. der Promega GmbH (Walldorf, Deutschland) verwendet. Die Sanger-Sequenzierung der Kolonie-PCR-amplifizierten geneti- schen Segmente wurde durch die Eurofins Genomics GmbH (Ebers- berg, Deutschland) durchgeführt, indem der kommerziell angebo- tene zusätzliche DNA-Reinigungsschritt gewählt wurde. Die in dieser Studie verwendeten Promotorsequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. L. plantarum WCFS1 Herstellung kompetenter Zellen und DNA- Transformation Eine einzelne Kolonie von L. plantarum WCFS1 wurde in 5 mL MRS- Medium beimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (250 U/min) kultiviert. Die Primärkultur wurde im Verhältnis 1:50 (v/v) in einer 25-mL-Sekundärkultur verdünnt, die aus MRS- Medien und 1 % (w/v) Glycin bestand, das im Verhältnis 4:1 vor- gemischt wurde. Die Sekundärkultur wurde bei 37 °C und 250 U/min bebrütet, bis die OD6000,8 erreichte. Anschließend wur- den die Zellen durch Zentrifugieren bei 4000 U/min (3363 × g) für 10 Minuten bei 4 °C pelletiert. Das Pellet wurde zweimal mit 5 mL eiskalter 10 mM MgCl2 und anschließend zweimal mit 5 mL bzw. 1 mL eiskalter Sac/Gly-Lösung [10% (v/v) Glycerin (Gly) und 1 M Saccharose (Sac) im Verhältnis 1:1 (v/v)] gewaschen. Schließlich wurde der restliche Überstand verworfen und das Pellet in 500 μl Sac/Gly-Lösung resuspendiert. Die kompetenten Zellen wurden dann in 60 μl Aliquots für die DNA-Transformation verteilt. Für alle Transformationen wurden den kompetenten Zel- len 1 μg dsDNA (zirkuläres Plasmid oder DNA-ligierte Mischung) zugesetzt und dann in gekühlte Elektroporationsküvetten mit 2 mm Abstand (Bio-Rad Laboratories GmbH, Deutschland) überführt. Die Elektroporationstransformation wurde mit einem einzigen Puls bei 1,8 kV durchgeführt, woraufhin sofort 1 ml lauwarmes MRS-Medium zugegeben wurde. Die Mischung wurde für eine Erho- lungsphase von 3 Stunden bei 37 °C und 250 U/min bebrütet. Nach der Erholungsphase wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 4000 U/min (3363 × g) zentrifugiert, 800 μl des Überstands verworfen und 200 μl des resuspendierten Pellets auf MRS-Agar mit 10 μg/ml Erythromycin ausplattiert. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C bebrütet, um das Wachstum einzelner Kolonien zu ermöglichen. Konstruktion von genetischen Modulen in L. plantarum WCFS1 Die Plasmide wurden unter Verwendung der in dieser Studie opti- mierten DNA-Assembly-Methode konstruiert und direkt in den L. plantarum WCFS1-Stamm transformiert. Komplementäre Überhänge für die HiFi-Assemblierung wurden entweder mit PCR-Primern er- zeugt oder als kundenspezifische eBlocks von IDT (Coralville, USA) synthetisiert. Gereinigte überlappende DNA-Fragmente wur- den mit dem HiFi DNA Assembly Master Mix gemischt und wie im Standardreaktionsprotokoll empfohlen assembliert. Das assemb- lierte DNA-Produkt wurde dann durch eine weitere PCR-Runde ex- ponentiell vervielfältigt, wobei ein Primerpaar verwendet wurde, das sich spezifisch an das Insert-Segment anlagert. 5 µl der HiFi-Assembly-Reaktion wurden als Template für die PCR- Amplifikation des assemblierten Produkts verwendet (100 µl End- volumen). Das gereinigte PCR-Produkt wurde anschließend mit dem Quick Blunting Kit phosphoryliert. 2000 ng des gereinigten PCR- Produkts wurden mit 2,5 µl 10X Quick Blunting-Puffer und 1 µl Enzymmix gemischt (Milli-Q-Wasser wurde auf 25 µl aufgefüllt). Die Reaktion wurde zunächst 30 Minuten lang bei 25 °C und an- schließend 10 Minuten lang bei 70 °C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Anschließend wurden die phosphorylierten Produkte mit Hilfe des Enzyms T4-Ligase ligiert. 6 µl der phosphorylier- ten DNA wurden mit 2,5 µl 10X T4 Ligase Buffer und 1,5 µl T4 Ligase Enzym gemischt (Milli-Q Wasser wurde auf 25 µl aufge- füllt). Pro Klonierung wurden zwei Ligationsreaktionen durchge- führt (jeweils 25 µl). Die jeweiligen Reaktionen wurden 2 Stun- den lang bei 25 °C und anschließend 30 Minuten lang bei 70 °C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Die ligierten Reaktio- nen wurden zusammengemischt und gereinigt. Um das gereinigte Endprodukt zu konzentrieren, wurden drei Elutionsrunden statt einer durchgeführt. Jede Elution basierte auf 10 µl Milli-Q- Wasser. Die Konzentration des gereinigten Ligationsprodukts wurde mit dem NanoDrop Microvolume UV-Vis-Spektrophotometer (ThermoFisher Scientific GmbH, Deutschland) gemessen. Schließ- lich wurden 1000 ng des ligierten Produkts in L. plantarum WCFS1 elektrokompetente Zellen transformiert. Mikroplatten-Reader-Setup für die thermische Gradientenanalyse Die Bakterienkulturen wurden in 5 mL MRS-Medium (ergänzt mit 10 µg/mL Erythromycin, außer für den unveränderten Elternstamm) bei 30°C und kontinuierlichem Schütteln (250 U/min) kultiviert. Am folgenden Tag wurden die Kulturen in 3 mL mit Antibiotika angereichertem frischem MRS-Medium auf 0,1 OD600 verdünnt und bei 30°C und 250 U/min vermehrt. Bei OD600 = 0,4 wurden die Kul- turen in Fisherbrand™ 0,2mL PCR Tube Strips mit flachen Kappen (Thermo Electron LED GmbH, Deutschland) abgefüllt und in den Biometra Thermocycler (Analytik Jena. GmbH, Deutschland) gege- ben. Für das Pspp-mCherry-Konstrukt wurden 25 ng/ml des 19 Ami- nosäuren umfassenden Sakacin P-Induktionspeptids (SppIp) mit der Sequenz NH2-MAGNSSNFIHKIKQIFTHR-COOH (GeneCust, Frankreich) zu der Kultur gegeben und vor der Herstellung der Aliquots gründlich vortexen. Der thermische Test wurde mit einem Tempe- raturgradienten von 31°C auf 41°C mit regelmäßigen Steigerungen von 2°C durchgeführt. Die Deckeltemperatur wurde auf 50°C ein- gestellt, um die Verdunstung der Flüssigkeit zu verhindern und eine homogene Temperatur in den räumlich verteilten PCR-Gefäßen aufrechtzuerhalten. Nach einem Zeitintervall von 18 h wurden die PCR-Streifen in einer Tisch-Minizentrifuge (Biozym GmbH, Deutschland) zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren und den Überstand zu verwerfen. Die Zellen wurden dann in 200 µl 1X PBS resuspendiert und in die 96-Well-Mikrotiterplatte mit kla- rem Boden (Corning® 96 Well Opak Black Plate, USA) gegeben. Die Proben wurden dann im Microplate Reader Infinite 200 Pro (Tecan Deutschland GmbH, Deutschland) analysiert und sowohl die Ab- sorption (600 nm Wellenlänge) als auch die mCherry-Fluores- zenzintensität (Exλ / Emλ = 587 nm/625 nm) wurden gemessen. Die z-Position und die Verstärkungseinstellungen für die Aufnahme der mCherry-Fluoreszenzintensität wurden auf 19442 µm bzw. 136 eingestellt. Die Fluoreszenzwerte wurden mit der optischen Dichte der Bakterienzellen normalisiert, um die relativen Fluo- reszenzeinheiten (RFU) nach der Formel RFU = Fluoreszenz/OD600 zu berechnen. Analyse der Fluoreszenzmikroskopie Die Bakterienkulturen wurden über Nacht in 5 mL MRS-Medium (er- gänzt mit 10 µg/mL Erythromycin, außer bei der Negativkon- trolle) bei 37◦C unter ständigem Schütteln (250 U/min) gezüch- tet. Am folgenden Tag wurde die OD600 des Pspp-mCherry-Konstrukts gemessen und bei OD600 = 0,01 subkultiviert. Als die Pspp- mCherry-Bakterienkultur eine OD600 = 0,3 erreichte, wurde sie mit 25 ng/mL SppIp induziert, und die übrigen Konstrukte wurden in frischem Medium bei 0,01 OD600 subkultiviert. Alle Kulturen wurden dann 18 Stunden lang unter denselben Wachstumsbedingun- gen (37◦C, 250 U/min) wachsen gelassen, um jegliche Heterogeni- tät in der Promotorstärkeexpression aufgrund unterschiedlicher Wachstumsparameter zu verhindern. Anschließend wurden 1 mL der Kulturen durch Zentrifugation (15700 × g, 5 min, 4 °C) geern- tet, zweimal mit Dulbeccos 1X PBS (Phosphatpuffersalzlösung) gewaschen und schließlich in 1 mL 1X PBS resuspendiert. 10 µL der Suspensionen wurden auf 1,5 mm dicke Glasobjektträger (Paul Marienfeld GmbH, Deutschland) gegeben und 1,5H-Glasdeckgläser (Carl Roth GmbH, Deutschland) daraufgelegt. Die Proben wurden dann unter dem Plan Apochromat 100X Ölimmersionsobjektiv (BZ- PA100, NA 1,45, WD 0,13 mm) des Fluoreszenzmikroskops BZ-X800 (Keyence Corporation, Illinois, USA) beobachtet. Das mCherry- Signal wurde mit dem BZ-X TRITC-Filter (Modell OP-87764) bei einer Anregungswellenlänge von 545/25 nm und einer Emissions- wellenlänge von 605/70 nm mit einem dichroitischen Spiegel bei einer Wellenlänge von 565 nm aufgezeichnet. Die Bilder wurden auf identische Helligkeits- und Kontrasteinstellungen einge- stellt und mit der Software FiJi ImageJ2 bearbeitet. Durchflusszytometrische Analyse Die Quantifizierung der Fluoreszenzprotein-Expressionsniveaus der Stämme wurde mit dem Guava easyCyte BG-Durchflusszytometer (Luminex, USA) durchgeführt. Für die durchflusszytometrische Analyse wurden Bakterienkulturen verwendet, die den oben ge- nannten Behandlungsbedingungen unterworfen waren. 1 mL der Bak- teriensuspensionen wurden durch Zentrifugation bei 13000 U/min (15700 × g) geerntet. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 1 mL steriler Dulbecco's 1X PBS resuspendiert. Die Proben wurden dann mit einem Verdünnungsfaktor (DF) von 104 seriell verdünnt und 5.000 Bakterienereignisse wurden für die Analyse aufgezeichnet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung an drei verschiedenen Tagen durchgeführt. Bei jeder Analyse diente der nicht fluoreszierende Wildtyp-Stamm als Ne- gativkontrolle. Zur Entfernung von Debris und Doubletten wäh- rend der Ereignissammlung und -analyse wurde ein vorgefertigter Schwellenwert auf der Grundlage von Vorwärts-Seitenstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) verwendet. Die Fluoreszenzinten- sität von mCherry wurde durch Anregung mit einem grünen Laser bei 532 nm (100 mW) und Signalanalyse mit dem Orange-G-Detekti- onskanal bei 620/52 nm gemessen. Die für die Datenaufzeichnung verwendeten Verstärkungseinstellungen waren: Vorwärtsstreuung (FSC) - 11,8; Seitenstreuung (SSC) - 4 und Orange-G-Fluoreszenz - 1,68. Die Kompensationssteuerung für die Fluoreszenzaufzeich- nung wurde auf 0,01 mit einer Erfassungsrate von 5 Dekaden ein- gestellt. Die Datenanalyse und -darstellung erfolgte mit der Luminex GuavaSoft 4.0 Software für EasyCyte. Konstruktion von Plasmiden auf der Grundlage von Toxin/Antito- xin-Modulen Auf der Grundlage einer Literaturrecherche wurde die Wirkung des Txe/Axe-Moduls (Toxin/Antitoxin) aus E. faecium (Grady R, Hayes F. Axe–Txe, a broad-spectrum proteic toxin–antitoxin sys- tem specified by a multidrug-resistant, clinical isolate of Enterococcus faecium. Molecular microbiology. 2003;47(5):1419- 32) in L. plantarum WCFS1 getestet, um seine Rolle bei der an- tibiotikafreien Plasmidretention zu untersuchen. Das Werkzeug TA Finder Version 2.0 (Xie Y, Wei Y, Shen Y, Li X, Zhou H, Tai C, et al. TADB 2.0: an updated database of bacterial type II toxin–antitoxin loci. Nucleic acids research. 2018;46(D1):D749- D53) wurde verwendet, um weitere Typ-II-TA-Systeme (Toxin/Anti- toxin) in Lactobacillus-Genomen auszuwählen. Die Genome von L. acidophilus, L. crispatus, L. casei, L. reuteri und L. planta- rum WCFS1 wurden vom NCBI Genome abgerufen. Die in diesen Geno- men enthaltenen TA-Systeme wurden mit den Standardparametern des TA-Finders durchsucht. Nur TA-Systeme, die von NCBI BlastP annotiert wurden, wurden als Testkandidaten ausgewählt. Die TA- Systeme YafQ/DinJ, HicA/HicB, HigB/HigA, MazF/MazE aus L. ca- sei, L. acidophilus und L. plantarum WCFS1 wurden für weitere Tests und Analysen ausgewählt. Das Axe/Txe-System wurde durch PCR aus dem Plasmid pUC-GFP-AT amplifiziert (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Die Systeme DinJ/YafQ und HicA/HicB wurden als kundenspezifische eBlocks von IDT (Coralville, USA) synthetisiert. HigA/HigB und MazE/MazF wurden aus dem Genom von L. plantarum WCFS1 amplifi- ziert. Die TA-Systeme wurden in das PtlpA-mCherry-Plasmid einge- fügt, wodurch die Plasmide PtlpA-mCherry-Txe/Axe, PtlpA-mCherry- YafQ/DinJ, PtlpA-mCherry-HicA/HicB, PtlpA-mCherry-HigB/HigA, PtlpA- mCherry-MazF/MazE entstanden. Alle diese Plasmide wurden mit der in dieser Studie optimierten DNA-Montagemethode direkt in L. plantarum WCFS1 kloniert. Für die Konstruktion des kombina- torischen TA-Moduls (PtlpA-mCherry Combo) wurden die besten endo- genen und nicht endogenen TA-Systeme, die nach 100 Generationen erfasst wurden (MazF/MazE und YafQ/DinJ), subkloniert und in das gleiche Plasmid in umgekehrter Orientierung integriert. TA-vermittelte Plasmid-Retentionsanalyse Die TA-Module, die die Konstrukte enthielten, wurden in 5-mL- Kulturen mit 10 µg/mL Erythromycin-angereichertem MRS-Medium beimpft und über Nacht bei 37 °C unter ständigem Schütteln (250 U/min) bebrütet. Am folgenden Tag wurden die Konstrukte bei ei- ner anfänglichen OD600 = 0,01 in frischem MRS-Medium (sowohl mit als auch ohne Antibiotikazusatz) subkultiviert. Die Bakterien- kulturen wurden an 12 aufeinanderfolgenden Tagen mit einer täg- lichen Wachstumszeit von 24 Stunden bebrütet, um eine durch- schnittliche Anzahl von 8 Generationen pro Tag zu gewährleis- ten, bis die endgültige Schwelle von 100 Generationen über- schritten war. Die Probenvorbereitung für die durchflusszyto- metrische Analyse erfolgte nach dem oben genannten Protokoll. Die mCherry-positive Zellpopulation korrelierte direkt mit der Bakterienpopulation, die das manipulierte Plasmid enthielt. Das gesamte Experiment wurde in biologischen Triplikaten wieder- holt. Für die qualitative Analyse wurden die 100 Generationen lang gezüchteten Bakterienkulturen ohne Antibiotikazusatz zentrifu- giert und in 1 ml sterilem Dulbeccos 1X PBS resuspendiert. Die resuspendierte Bakterienlösung wurde verdünnt (DF=106) und auf MRS-Agarplatten mit und ohne Antibiotikazusatz aufgebracht und 48 Stunden lang in einem statischen Inkubator bebrütet. Die Platten wurden dann mit dem GelDocumentation System Fluorchem Q (Alpha Innotech Biozym GmbH, Deutschland) sowohl im Ethidium- bromid-Kanal (Exλ /Emλ = 300 nm/600 nm) als auch im Cy3-Kanal (Exλ /Emλ = 554 nm/568 nm) abgebildet, um die mCherry-Fluores- zenz produzierende Zellpopulation sichtbar zu machen. Messungen der Wachstumsrate Um den Einfluss der heterologen Proteinproduktion und der To- xin-Antitoxin-Module auf die bakterielle Wachstumsrate zu un- tersuchen, wurden die Bakterienkulturen über Nacht in mit Anti- biotika angereicherten MRS-Medien bei 37°C unter ständigem Schütteln (250 rpm) kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Bak- terienkulturen in Sekundärkulturen bei einer anfänglichen OD600 = 0,01 subkultiviert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C er- reichte die OD600 der Kulturen 0,1 und 200 µL der Kulturen wur- den in UV STAR Flat Bottom 96 Well Mikrotiterplatten (Greiner BioOne GmbH, Deutschland) verteilt. Die 96-Well-Assay-Platte wurde unter ständigem Schütteln bei einer Inkubationstemperatur von 37°C in den Microplate Reader gestellt. Der kinetische As- say wurde so eingestellt, dass die Absorption der Bakterienkul- turen bei einer Wellenlänge von 600 nm in einem Intervall von 10 Minuten über einen Zeitraum von 18 Stunden aufgezeichnet wurde. Der Versuch wurde in dreifacher Ausführung an drei unab- hängigen Tagen durchgeführt. Experimentelle Ergebnisse Direkte Klonierung in L. plantarum WCFS1 Um ausreichende Plasmidmengen (~1 µg) für die Transformation in Lactobacillus zu erhalten, werden häufig Shuttle-Vektoren ver- wendet, die in E. coli amplifiziert werden können. Dabei ist bekannt, dass bestimmte Plasmidkonstrukte, die in E. coli passagiert wurden und Signalpeptide und sich wiederholende Se- quenzen im interessierenden Gen enthalten, Mutationen hervorge- rufen haben. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine PCR-basierte Amplifikation und Zirkularisierung der rekombinan- ten Plasmide durchgeführt, um 1000 ng zirkuläres Plasmid zu er- halten, was für die Transformation in L. plantarum WCFS1 aus- reichend war. Die Transformationseffizienz war mit 50 cfu/µg Plasmid relativ gering, aber die genetische Treue betrug >95%, da L. plantarum drei endogene Plasmide beherbergt. Da L. plant- arum drei endogene Plasmide besitzt, wurde die Sequenzierung an PCR-amplifizierten Abschnitten des transformierten Plasmids aus Zelllysaten durchgeführt. Diese direkte Klonierungsstrategie wurde im Folgenden für die Transformation aller Plasmide in L. plantarum WCFS1 verwendet. 1 - Der tlpA-Promotor von Salmonella treibt die konstitutive Expression auf hohem Niveau an Auf der Suche nach einem hitze-induzierbaren Promotor für the- rapeutische Anwendungen wurde die mCherry-Expression stromab- wärts des von Salmonella stammenden PtlpA-Promotors zusammen mit dem thermoreaktiven TlpA-Repressor (Piraner DI, Abedi MH, Moser BA, Lee-Gosselin A, Shapiro MG. Tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbial therapeutics. Nature chemical bi- ology. 2017;13(1):75-80; Hurme R, Berndt KD, Normark SJ, Rhen M. A proteinaceous gene regulatory thermometer in Salmonella. Cell. 1997;90(1):55-64) kodiert. Während der Repressor die Gen- expression nicht unterdrückte (Figur 5D), schien der Promotor überraschenderweise konstitutiv eine hohe Proteinexpression mit einem geringen Grad an thermischer Regulation (<5-facher An- stieg von 31°C auf 39°C) zu bewirken (Figur 1A). Im Vergleich dazu erwiesen sich pR und pL, zwei andere häufig verwendete Promotoren mit einem thermoreaktiven Repressor, cI, aus E. coli lambda-Phagen, als sehr schwach und trieben nur geringe Mengen an mCherry-Expression an (Figur 5A, 5B). Die Fluoreszenzspekt- roskopie zeigte, dass die Stärke des PtlpA Promotors bei 37 ºC 26- bzw. 39-mal höher war als die des PR- bzw. PL-Promotors (Fi- gur 5C). Besonders bemerkenswert ist, dass die Fluoreszenzmik- roskopie und die Durchflusszytometrie-Analyse auch zeigten, dass die mCherry-Expression, die durch den PtlpA -Promotor ausge- löst wird, deutlich über derjenigen liegt, die durch die stärksten Promotoren ausgelöst wird, über die zuvor in L. plantarum berichtet wurde - P23(Meng Q, Yuan Y, Li Y, Wu S, Shi K, Liu S. Optimization of electrotransformation parameters and engineered promoters for Lactobacillus plantarum from wine. ACS Synthetic Biology. 2021;10(7):1728-38), P48(Rud I, Jensen PR, Naterstad K, Axelsson L. A synthetic promoter library for con- stitutive gene expression in Lactobacillus plantarum. Microbi- ology. 2006;152(4):1011-9), Pspp (Sørvig E, Mathiesen G, Nater- stad K, Eijsink VG, Axelsson L. High-level, inducible gene ex- pression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum us- ing versatile expression vectors. Microbiology. 2005;151(7):2439-49) und PTuf (Spangler JR, Caruana JC, Phillips DA, Walper SA. Broad range shuttle vector construction and pro- moter evaluation for the use of Lactobacillus plantarum WCFS1 as a microbial engineering platform. Synthetic Biology. 2019;4(1):ysz012) (Figur 1B, Figur 6A). Bei 31°C war die mCherry-Expression mindestens 2-fach höher als bei den anderen Promotoren, während sie bei 39°C auf das 5-fache anstieg (Figur 1C, Figur 6B). Die konstitutiven Promotoren (P23 ,P48 , PTuf) wa- ren leicht thermoreaktiv, während der induzierbare Promotor (Pspp) dies nicht war (Figur 7A). Bemerkenswert ist, dass in al- len Fällen die Spacerlänge zwischen der Ribosomenbindungsstelle (RBS, 5'-AGGAGA-3') und dem Startcodon das Expressionsniveau stark beeinflusste. In Übereinstimmung mit früheren Berichten wurde eine hohe mCherry-Expression bei einer Spacer-Länge von 9 bp beobachtet, die deutlich abnahm, wenn sie auf 6 bp reduziert wurde (25-fach niedriger für PtlpA) (Figur 7B). Trotz der hohen Proteinexpression, die durch PtlpA mit einem 9 bp Spacer ausge- löst wurde, war die Wachstumsrate dieses Stammes bei 37°C ähn- lich wie die des leeren Kontrollstammes, was darauf hindeutet, dass diese Proteinüberexpression die Zelle überraschenderweise nicht metabolisch überlastet (Figur 1D). Es wurden folgende Vektoren hergestellt und verwendet: Promotor PL (pL mcherry; SEQ-ID Nr. 18), Promotor PR (pR mcherry; SEQ-ID Nr. 19), Promotor PTlpA (pTlpA mcherry; SEQ-ID Nr. 20), Promotor PTlpA + TlpA-Repressor (pTlpA A39 mcherry; SEQ- ID Nr. 21), Promotor P23 (P23 mcherry; SEQ-ID Nr. 22), Promotor P48 (P48 mcherry; SEQ-ID Nr. 23), Promotor Pspp (SPP mcherry; SEQ-ID Nr. 24), Promotor Ptuf (tuf mcherry; SEQ-ID Nr. 25), lee- rer Vektor (SEQ-ID Nr. 32) 2 - Toxin/Antitoxin (TA)-basierte Plasmid-Retention und tran- siente GVOs TA-Systeme gewährleisten den Verbleib von Plasmiden in einer Bakterienpopulation durch einen Mechanismus zur Abtötung nach der Segregation. Sie exprimieren konstitutiv langlebige Toxine und kurzlebige Antitoxine. Solange das Plasmid vorhanden ist, wird ausreichend Antitoxin produziert, um das entsprechende To- xin zu neutralisieren. Erhält eine Tochterzelle bei der Bakte- rienteilung keine Plasmidkopien, wird das Antitoxin rasch abge- baut, und das aktive Toxin tötet die Zelle. Es wurden mehrere natürliche TA-Systeme untersucht (Yamaguchi Y, Inouye M. Regu- lation of growth and death in Escherichia coli by toxin–antito- xin systems. Nature Reviews Microbiology. 2011;9(11):779-90) und einige davon mit vielversprechenden Ergebnissen auf Plas- midrückhaltung in E. coli untersucht (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post- segregational killing mechanisms for the implementation of syn- thetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34; Wright O, Delmans M, Stan G-B, Ellis T. Ge- neGuard: a modular plasmid system designed for biosafety. ACS synthetic biology. 2015;4(3):307-16; Abedi MH, Yao MS, Mittel- stein DR, Bar-Zion A, Swift MB, Lee-Gosselin A, et al. Ultra- sound-controllable engineered bacteria for cancer immunother- apy. Nature communications. 2022;13(1):1-11), wurde ihre Ver- wendung in Lactobacillus bisher nicht erforscht. Dazu wurde zu- nächst das TA-System vom Typ II, Txe/Axe untersucht, das aus Enterococcus faecium stammt und nachweislich eine langfristige Plasmidretention in E. coli gewährleistet (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). In diesem System ist Txe eine Endoribonuklease und Axe das entsprechende inhibitorische Protein. Dieses Modul wurde zu dem Plasmid hinzugefügt, das für die PtlpA-gesteuerte mCherry-Expression kodiert (Figur 2A), und der daraus resultie- rende Stamm wurde bis zu 100 Generationen lang wiederholt sub- kultiviert. Die Plasmid-Retention wurde quantifiziert, indem der Anteil der mCherry exprimierenden Bakterienpopulation mit Hilfe von Durchflusszytometrie und Agarplatten-Koloniebildana- lyse bestimmt wurde (Figur 8B). Die Sensitivität dieser Analyse wurde durch die hohe Expressionsrate, die durch den PtlpA-Promo- tor angetrieben wurde, erheblich verbessert, was eine klare Ab- grenzung von Zellen mit Plasmid-Retention und solchen ohne Plasmid ermöglichte (Figur 2B). Eine solch klare Abgrenzung war mit anderen Promotoren wie P23 nicht möglich, da sich das Fluo- reszenzsignal teilweise mit dem Hintergrundsignal von nicht fluoreszierenden Zellen überschnitt (Figur 8A). In Abwesenheit eines TA-Systems (PtlpA mCherry-Plasmid) nahm der Anteil der Plasmid-tragenden Bakterien stetig um etwa 1 % pro Generation ab und endete mit ~15 % der Population, die das Plasmid nach 100 Generationen behielten (Figur 2C). Im Vergleich dazu unter- stützte das Txe/Axe-System anfangs eine bessere Retention mit einem Plasmidverlust von etwa 0,5 %/Generation für 40 Generati- onen, danach beschleunigte sich dieser Verlust auf etwa 1,2 %/Generation und endete bei ~18 % der Population, die das Plas- mid nach 100 Generationen behielten. In einem Versuch, potenzi- ell leistungsfähigere TA-Systeme zu identifizieren, wurde das Bioinformatik-Tool TA-Finder verwendet, und es wurden 4 weitere TA-Systeme vom Typ II ausgewählt - YafQ/DinJ aus L. casei (Le- vante A, Folli C, Montanini B, Ferrari A, Neviani E, Lazzi C. Expression of DinJ-YafQ System of Lactobacillus casei group strains in response to food processing stresses. Microorga- nisms. 2019;7(10):438), HigB/HigA und MazF/MazE aus L. planta- rum WCFS1 und HicA/HicB aus L. acidophilus. Bei all diesen TA- Kandidaten handelt es sich um ein Endoribonuklease-Toxin, das auf den RNA-Pool des metabolisch aktiven und sich schnell tei- lenden mikrobiellen Wirts abzielt. Ähnlich wie das Txe/Axe-Mo- dul wurden diese TA-Module dem PtlpA_mCherry-Plasmid hinzugefügt (Figur 2C). Die Analyse der Plasmid-Retention ergab, dass die Systeme HigB/HigA und MazF/MazE größtenteils ähnlich wie Txe/Axe funktionierten, aber nach 100 Generationen eine etwas bessere Retention aufwiesen (20 % bzw. 30 %). HicA/HicB ver- langsamte den Plasmidverlust auf 0,5 %/Generation für 50 Gene- rationen und 0,8 %/Generation danach, was zu einem Retentions- niveau von ~35 % nach 100 Generationen führte. Schließlich wurde festgestellt, dass YafQ/DinJ die besten Rückhaltefähig- keiten mit einem Plasmidverlust von 0,5 %/Generation für 70 Ge- nerationen und 1 %/Generation danach bietet, was zu einem Rück- haltegrad von ~40 % nach 100 Generationen führt (Fig. 10A, 10B). Figur 10A zeigt den Plasmiderhalt verschiedener Plasmide über 100 Generationen unter antibiotischer Kontrolle. Wie erwartet, bleiben die Plasmide nahezu vollständig erhalten. Figur 10B zeigt die Retention unter Kontrolle der Toxin/Antitoxin-Sys- teme. Es zeigt eine deutlich verbesserte Retention im Vergleich zum Wildtyp. Die Kombination von zwei Toxin/Antitoxin-Systemen führt noch einmal zu einer deutlichen Verbesserung. Grundlegende Studien haben gezeigt, dass verschiedene TA- Systeme kumulativ bessere Plasmidrückhaltefähigkeiten bieten können (Bardaji L, Añorga M, Echeverría M, Ramos C, Murillo J. The toxic guardians—multiple toxin-antitoxin systems provide stability, avoid deletions and maintain virulence genes of Pseudomonas syringae virulence plasmids. Mobile DNA. 2019;10(1):1-17). Auf dieser Grundlage wurde das leistungs- stärkste endogene TA-System von L. plantarum WCFS1 (MazF/MazE) mit dem leistungsstärksten nicht endogenen System (YafQ/DinJ) kombiniert. Interessanterweise wurde bei dieser Kombination bessere Plasmid-Retentionsfähigkeiten mit einem Plasmidverlust von 0,2 %/Generation für 50 Generationen und einem allmählichen Anstieg auf 0,8 %/Generation danach beobachtet, was zu einer deutlich höheren Retention von 60 % über 100 Generationen führte. Im Vergleich dazu wurden Plasmide, die unter antibioti- schem Selektionsdruck gehalten wurden, erwartungsgemäß über 100 Generationen hinweg zu >90 % erhalten. Bei allen TA-Systemen unterschieden sich die bakteriellen Wachstumsraten über 10 Ge- nerationen nicht wesentlich von den Bedingungen ohne TA oder mit Antibiotika-Retention, was darauf hindeutet, dass die To- xine die reguläre Funktion der Zellen nicht drastisch beein- trächtigten (Figur 9). Bei den TA-Systemen führt der Verlust des Plasmids lediglich dazu, dass das Bakterium in seinen na- türlichen, genetisch unveränderten probiotischen Status zurück- versetzt wird, was die Konstruktion von transienten GVO ermög- licht. Aufgrund der vorteilhaften Präsenz von Laktobazillen im mensch- lichen Körper, in der Nahrung und in der Umwelt besteht ein er- hebliches Interesse an der gentechnischen Herstellung von hoch- gradig heterologer Proteinproduktion für medizinische und in- dustrielle Anwendungen. Unter den verschiedenen Stämmen ist L. plantarum einer der am intensivsten untersuchten, und bei der Suche nach starken Promotoren wurde in der Regel das Genom des Wirtsstamms durchleuchtet und Anpassung der Promotoren, die eine hochgradige Proteinexpression in phylogenetisch nahen Milchsäurebakterien (Figur 3A). Nur sehr wenige Studien haben Promotoren von phylogenetisch entfernten Arten wie P. megate- rium (PxylA) oder E. coli (PT7 von lambda phage) getestet (Heiss S, Hörmann A, Tauer C, Sonnleitner M, Egger E, Grabherr R, et al. Evaluation of novel inducible promoter/repressor systems for recombinant protein expression in Lactobacillus plantarum. Microbial cell factories. 2016;15(1):1-17), obwohl die Expres- sionsraten gering waren. Überraschenderweise ermöglicht der Promotor (PtlpA) aus dem phylogenetisch weit entfernten gramnega- tiven Salmonella typhimurium, die Proteinexpression stärker an- zutreiben als die zuvor berichteten starken Promotoren in L. plantarum WCFS1. In Salmonella ist PtlpA ein Promotor der σ70- Sigma-Faktoren, die in den meisten Prokaryonten an der Regulie- rung der Expression von Housekeeping-Genen beteiligt sind. Todt et al., (Todt TJ, Wels M, Bongers RS, Siezen RS, Van Hijum SA, Kleerebezem M. Genome-wide prediction and validation of sigma70 promoters in Lactobacillus plantarum WCFS1. 2012) verwendeten einen genomweiten Analyseansatz zur Identifizierung von σ70-ba- sierten Promotor-Konsensussequenzen in L. plantarum WCFS1 und sagten 568 Promotorregionen in unmittelbarer Nähe der Tran- skriptionsstartstellen (<40 nt) voraus. Ihre Ergebnisse in Kom- bination mit ähnlichen Analysen aus anderen Organismen (Davis MC, Kesthely CA, Franklin EA, MacLellan SR. The essential ac- tivities of the bacterial sigma factor. Canadian journal of mi- crobiology. 2017;63(2):89-99; Paget MS, Helmann JD. The σ 70 family of sigma factors. Genome biology. 2003;4(1):1-6) deuten darauf hin, dass die σ70-Promotor-Bindungsmotive in verschiede- nen Gattungen konserviert sind und dass divergente Promotoren, die σ70 zur Steuerung der Transkription in diesen Bakterienar- ten rekrutieren, möglich sind. Multiple Sequence Alignment (MSA) zwischen den wichtigsten RNA-Polymerase-σ70-Proteinen (RpoD) von E. coli, S. typhimurium und L. plantarum-Stämmen (Figur 3B) ergab eine signifikante Ähnlichkeit zwischen den Do- mäne-2- und Domäne-4-Regionen, die für die Bindung an die -10- und -35-Regionen des Promotors während der Transkriptionsein- leitung verantwortlich sind. Abgesehen von der hohen Expressionsrate erfordern die medizini- sche und industrielle Anwendbarkeit von Laktobazillen Strate- gien, um heterologe Gene in den manipulierten Bakterien auf kostengünstige und kompatible Weise zu erhalten. Während die genomische Integration eine stabile Retention heterologer Gene gewährleistet, bieten Plasmide eine weitaus größere Vielseitig- keit und einfachere Technik. Meistens wird die Retention durch die Bereitstellung eines Antibiotikaresistenzgens im Plasmid und die Kultivierung der Bakterien in Gegenwart des Antibioti- kums sichergestellt. Die wichtigste antibiotikafreie Retenti- onsstrategie für Laktobazillen besteht darin, auxotrophe Stämme zu erzeugen, indem ein wesentliches Stoffwechselgen ausgeschal- tet und in das Plasmid eingebaut wird. Die Notwendigkeit, auxotrophe Stämme durch Gen-Knockout zu entwickeln, schränkt jedoch die breite Anwendbarkeit dieser Strategie ein. Hier wur- den zum ersten Mal Toxin-Antitoxin-Systeme für die Plasmid-Re- tention in Laktobazillen erforscht, die keine Genom-Manipulati- onen erfordern und leicht auf verschiedene Stämme angewendet werden können, ohne dass externe Selektionsdruckbedingungen er- forderlich sind. Solche TA-Systeme wurden bisher nur bei eini- gen wenigen Bakterienarten erprobt und haben in E. coli be- trächtliche Rückhaltefähigkeiten gezeigt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl homologe als auch heterologe TA-Systeme dazu beitragen, den Plasmidverlust über mehrere Generationen zu verlangsamen, obwohl die Retention über 100 Generationen nur zwischen 10 und 30 % lag. Interessanterweise führte die Kombi- nation von zwei TA-Systemen in einem einzigen Plasmid zu einer erheblichen Verbesserung der Retention, nämlich bis zu 60 % über 100 Generationen (Figur 10 B). Diese verbesserte kumula- tive Wirkung von TA-Systemen ist zwar in der Natur beobachtet worden (Bardaji L, Añorga M, Echeverría M, Ramos C, Murillo J. The toxic guardians—multiple toxin-antitoxin systems provide stability, avoid deletions and maintain virulence genes of Pseudomonas syringae virulence plasmids. Mobile DNA. 2019;10(1):1-17), wurde aber bisher noch nicht bei einem gen- technisch veränderten Plasmid gezeigt, insbesondere bei einer Kombination von heterologen und homologen TA-Systemen. Es ist wichtig zu beachten, dass eine einzige Generation einer bakteriellen Verdopplung entspricht, so dass 10 Generationen = 210 oder ~103 Bakterien und 100 Generationen = 2100 oder ~1030 Bakterien aus einer einzigen Zelle sind. Potenzielle Anwendun- gen von Lactobacillus für lebende Therapeutika oder künstlich hergestellte lebende Materialien werden voraussichtlich keine so hohen Generationszahlen erreichen, entweder aufgrund kurzer Anwendungszeiträume (Watterlot L, Rochat T, Sokol H, Cherbuy C, Bouloufa I, Lefèvre F, et al. Intragastric administration of a superoxide dismutase-producing recombinant Lactobacillus casei BL23 strain attenuates DSS colitis in mice. International jour- nal of food microbiology. 2010;144(1):35-41; Janahi EMA, Haque S, Akhter N, Wahid M, Jawed A, Mandal RK, et al. Bioengineered intravaginal isolate of Lactobacillus plantarum expresses algal lectin scytovirin demonstrating anti-HIV-1 activity. Microbial pathogenesis. 2018;122:1-6; Wang M, Fu T, Hao J, Li L, Tian M, Jin N, et al. A recombinant Lactobacillus plantarum strain ex- pressing the spike protein of SARS-CoV-2. International journal of biological macromolecules. 2020;160:736-40) oder externer Wachstumsbeschränkungen (Bhusari S, Sankaran S, del Campo A. Regulating bacterial behavior within hydrogels of tunable vis- coelasticity. bioRxiv. 2022). Daher sollten die >90% Retenti- onsraten, die das Combo-TA-System für bis zu 40 Generationen bietet, für diese Anwendungen mehr als ausreichend sein. Da der Verlust des Plasmids die Bakterien nur in ihren probiotischen Nicht-GVO-Status zurückversetzt, könnten solche transienten GVO für solche Anwendungen sogar wünschenswert sein. Dementspre- chend könnte durch Variation des verwendeten TA-Systems die GVO-Lebensdauer dieser Organismen eingestellt werden. Auf der Grundlage dieses Konzepts wurde eine neue Metrik, G50 , zur Cha- rakterisierung solcher transienten GVO eingeführt. Der Wert G50 entspricht der Generation, in der die Hälfte der Population ei- nes Stammes ihr Plasmid verloren hat. Wie in Figur 4 darge- stellt, kann G50 von 50 gens für die Bedingung "Keine TA" bis zu 110 gens (extrapoliert) für das Combo-System eingestellt wer- den. Die weitere Erforschung zusätzlicher TA-Systeme in zukünf- tigen Studien wird zu einer feineren Abstimmung der Retentions- lebensdauern beitragen und möglicherweise sogar zu einer nahezu perfekten Retention führen, wie sie in E. coli durch das Txe/Axe-System erreicht wurde (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segrega- tional killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Es wird erwartet, dass diese G50 -Werte von Kulturparametern und Umweltfaktoren abhängen, weshalb sie auch zu einem nützlichen Maßstab für die Bewertung der natürlichen und industriellen Be- dingungen werden könnten, unter denen Laktobazillen wachsen und funktionieren. Es wurden folgende Vektoren verwendet: PTlpA + Txe/Axe (pTlpA mcherry Txe/Axe; SEQ-ID Nr. 26), PTlpa + YafQ/DinJ (pTlpA mcherry YafQ/DinJ; SEQ-ID Nr. 27), PTlpA + HigB/HigA (pTlpA mcherry HigB/HigA; SEQ-ID Nr. 28), PTlpA + MazF/MazE (pTlpA mcherry MazF/MazE; SEQ-ID Nr. 29), PTlpA + HicA/HicB (pTlpA mcherry HicA/HicB; SEQ-ID Nr. 30), PTlpA + MazF/MazE + YafQ/DinJ (pTlpA mcherry Combo; SEQ-ID Nr. 31). In den Figuren und in der Beschreibung werden die Vektoren auch ohne die Angabe „pTlpA mcherry“ bezeichnet, z. B. HigB/HigA o- der Combo). TlpA wird auch als tlpA angegeben. Alle Sequenzen und ihre Bezeichnungen sind auch in Tabelle 2 angegeben. Figur 11 zeigte die schematische Darstellung des Vektors mit Replikationsbeginn (ori); eryR: Erythromycinresistenz; To- xin/Antitoxin. Die Pfeile stehen für Promotoren und die T für Terminatoren. Die Antibiotikumresistenz ist optional. Das To- xin/Antitoxin-System weist einen eigenen Promotor auf. Die Rei- henfolge von Toxin/Antitoxin kann auch umgekehrt sein. Der Vek- tor kann auch mehrere Toxin/Antitoxin-Systeme aufweisen.
Tabelle 1
Tabelle 2
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Claims
Patentansprüche 1. Expressionskassette zur Expression in Lactobacillus um- fassend einen Promotor in operativer Verknüpfung mit einer Nuk- leinsäure, welche ein zu exprimierendes Protein kodiert, wobei der Promotor im Wesentlichen identisch mit dem PtlpA-Promotor ist 2. Expressionskassette, wobei der Promotor eine Sequenz auf- weist, welche im Wesentlichen identisch mit der Sequenz ID Nr. 1 ist.
3. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wo- bei die Expressionskassette mit mindestens einem Toxin/Antito- xin-System operativ verknüpft ist.
4. Expressionskassette nach Anspruch 3, wobei die Expressi- onskassette mit mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen opera- tiv verknüpft ist.
5. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Txe (SEQ ID Nr. 8) / Axe (SEQ ID Nr. 9), YafQ (SEQ ID Nr. 10) / DinJ (SEQ ID Nr. 11), HicA (SEQ ID Nr. 12) / HicB (SEQ ID Nr. 13) , HigB (SEQ ID Nr. 14) / HigA (SEQ ID Nr. 15) und MazF (SEQ ID Nr. 16) / MazE (SEQ ID Nr. 17)
6. Vektor umfassen die Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Lactobacillus umfassend mindestens eine Expressionskas- sette nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
8. Lactobacillus umfassend mindestens einen Vektor nach An- spruch 6.
9. Verwendung des Promotors der Expressionskassette nach ei- nem der Ansprüche 1 bis 5 in Lactobacillus.
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