EP4448736A1

EP4448736A1 - Besonders geeignete 3-desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-synthase zur fermentativen herstellung von ortho-aminobenzoesäure

Info

Publication number: EP4448736A1
Application number: EP22856985.1A
Authority: EP
Inventors: Simon KLAFFL; Georg Sprenger; Katrin GOTTLIEB; Jung-Won YOUN
Original assignee: Covestro Deutschland AG
Current assignee: Covestro Deutschland AG
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2024-10-23
Also published as: CA3236772A1; US20250043254A1; EP4198123A1; WO2023111055A1; CN118302521A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung spezieller Varianten der 3- Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase zur Herstellung von ortho-Aminobenzoesäure durch eine mikrobielle Fermentation und Mikroorganismen, die hierfür geeignet sind.

Description

Besonders geeignete 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase zur fermentativen Herstellung von ortho-Aminobenzoesäure Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung spezieller Varianten der 3- Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase zur Herstellung von ortho-Aminobenzoesäure durch eine mikrobielle Fermentation und Mikroorganismen, die hierfür geeignet sind. Die Herstellung von ortho-Aminobenzoesäure (oAB) mit Hilfe einer Reihe von genetisch veränderten Mikroorganismen ist aus dem Stand der Technik bekannt, z.B. aus Balderas-Hernandez et al. (2009) „Metabolic engineering for improving anthranilate synthesis from glucose in Escherichia coli”, WO 2015/124687 und WO 2017/102853. Aus EP 0077196 ist eine Variante der 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase bekannt, deren Aktivität in Anwesenheit aromatischer Aminosäuren weniger stark inhibiert wird als dies bei anderen Varianten dieses Enzyms der Fall ist. Eine Verwendung dieses Enzyms in Corynebacterium glutamicum wurde nicht gezeigt. Es wurde auch nicht gezeigt, dass die fermentative Herstellung von oAB durch Einsatz dieses Gens verbessert werden kann. EP 2147972 offenbart Varianten der DAHP-Synthase, die von der Aminosäuresequenz der DAHP- Synthase wie in SEQ ID NO.11 definiert abweichen. Dies gilt ebenso auch für WO 2018/203947. WO 2019/073033, WO 2020/270587 sowie Bongaerts et al., 2001, „Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids”, Metabolic Engineering, 3: 289-300. In der Studie, die der vorliegenden Patentanmeldung zugrunde liegt, wurde überraschend herausgefunden, dass Corynebacterium glutamicum in Anwesenheit der in EP 0 077 196 beschriebenen DAHP-Synthase-Variante mehr oAB produziert als dies bei Verwendung anderer Enzymvarianten der Fall ist. Diese Erfindung und vorteilhafte Ausführungsformen davon werden in den Patentansprüchen und nachfolgend in der Beschreibung näher definiert. Die vorliegende Erfindung betrifft in einer ersten Ausführungsform die Verwendung einer 3- Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase (DAHP-Synthase) mit einer Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID NO. 11 definiert oder einer Variante davon zur Herstellung von ortho- Aminobenzoesäure (oAB) durch eine mikrobielle Fermentation. Wenn in der vorliegende Anmeldung bezüglich der oAB oder einer anderen Verbindung des Shikimat-Weges von „Herstellung“ die Rede ist, so ist ein Prozess gemeint, in dessen Verlauf die betreffende Verbindung in technisch relevanten Mengen aus der Zelle in das umgebende Medium ausgeschüttet wird und sich darin anreichert. Bevorzugt werden im Zuge dieses Prozesses der Ausschüttung und Anreicherung extrazelluläre Konzentrationen der jeweiligen Verbindung von wenigstens 1 g/L, stärker bevorzugt wenigstens 2 g/L und am stärksten bevorzugt wenigstens 4 g/L erreicht. Die bloße Existenz einer Verbindung als intrazelluläres Zwischenprodukts eines Stoffwechselweges ist keine „Herstellung“ im Sinne der vorliegenden Patentanmeldung. Verwendung Die „Verwendung“ der 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase (DAHP-Synthase) mit einer Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID NO. 11 definiert besteht darin, dass dieses Enzym in wenigstens einer mikrobiellen Zelle rekombinant exprimiert wird und dass diese wenigstens eine mikrobielle Zelle, die besagtes Enzym rekombinant exprimiert, unter Bedingungen kultiviert wird, die eine metabolische Aktivität der Zelle ermöglichen. Die erfindungsgemäße Verwendung der DAHP-Synthase wie durch SEQ ID NO. 11 definiert schließt nicht aus, dass die mikrobielle Zelle zusätzlich weitere genetische Modifikationen enthält, insbesondere weitere Proteine rekombinant exprimiert. Diese Modifikationen sind vorzugsweise jene, die weiter unten in dieser Anmeldung offenbart werden. Da die verbesserte 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase den Fluss von Metaboliten durch den gesamten Shikimat-Weg bis zur oAB erhöht, wird die erfindungsgemäße verbesserte DAHP- Synthase in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Synthese wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7- phosphat, 3-Dehydrochinat, 3-Dehydroshikimat, Shikimat, Shikimat-3-Phosphat, Chorismat, Prephenat und ortho-Aminobenzoesäure durch eine mikrobielle Fermentation verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die verbesserte 3- Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase zur Herstellung wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylanthranilsäure, para-Aminobenzoesäure, Vanillin, Indol, Indoxyl, Indigo, Mandelsäure, Ferulasäure und Zimtsäure verwendet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Herstellung von oAB, Methylanthranilsäure oder para-Aminobenzoesäure. Alle unten in dieser Anmeldung gegebenen Definitionen gelten auch für diese Ausführungsform. Der Fachmann versteht, dass die metabolische und genetische Ausstattung der verwendeten mikrobiellen Zellen oder Zellen an das angestrebte angepasst werden muss, indem die Aktivität von Enzymen, welche die Umsetzung des angestrebten Produkts zu Folgeprodukten katalysieren, reduziert oder ganz unterbunden wird. 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase Der Begriff „3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase“ bezeichnet das Enzym, welches die erste Reaktion des Shikimisäurewegs katalysiert, nämlich die Umsetzung von Erythrose-4-Phosphat und Phosphoenolpyruvat zu 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat und einem anorganischen Phosphat. Die Enzymvariante, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.11 hat, wurde in EP 0 077196 offenbart. Eine „Variante“ der DAHP-Synthase wie in SEQ ID NO.11 definiert ein Enzym, das durch Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 5 %, bevorzugt bis zu 2 %, der im jeweiligen Enzym enthaltenen Aminosäuren erhalten wird, mit der Maßgabe, dass die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben. Es ist weiterhin bevorzugt, dass zusätzlich auch die Positionen 10, 13, 147, 148, 150, 151, 179, 209, 211 und 212 unverändert bleiben. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind in der Variante zusätzlich auch die Positionen 144, 175 und 215 unverändert. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind zusätzlich zu den vorgenannten Positionen auch die Positionen 92, 97, 165, 186 und 268 unverändert. Der Fachmann versteht, dass sich die vorgenannten Positionen entsprechend verschieben, wenn Aminosäuren deletiert oder eingefügt werden. Grundsätzlich können die vorgenannten Modifikationen an jeder beliebigen Stelle des Enzyms kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Bevorzugt erfolgen sie aber nur am N-Terminus und/oder am C-Terminus des Polypeptids. Bei Substitutionen von Aminosäuren handelt es sich vorzugsweise um konservative Substitutionen, d.h. um solche, bei denen die veränderte Aminosäure einen Rest mit ähnlichen chemischen Eigenschaften besitzt wie die im unveränderten Enzym vorliegende Aminosäure. Es werden also besonders bevorzugt Aminosäuren mit basischen Resten gegen solche mit basischen Resten, Aminosäuren mit sauren Resten gegen solche mit ebenfalls sauren Resten, Aminosäuren mit polaren Resten gegen solche mit polaren Resten und Aminosäuren mit unpolaren gegen solche mit unpolaren Resten ausgetauscht. Es ist besonders bevorzugt, dass auch die Variante der DAHP-Synthase eine entsprechende Enzymaktivität besitzt. Besonders bevorzugt liegt die spezifische Enzymaktivität der Variante bei wenigstens bei 80 % spezifischen Aktivität der unveränderten DAHP-Synthase gemäß SEQ ID NO.11. Ortho-Aminobenzoesäure Der Begriff oAB bezeichnet die ortho-Aminobenzoesäure, auch unter der Bezeichnung „Anthranilsäure“ bekannt. Da diese Verbindung sowohl über eine Carboxylgruppe mit sauren Eigenschaften als auch über eine Aminogruppe mit basischen Eigenschaften verfügt, ist die Ladung des Moleküls abhängig vom pH. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung bezeichnet der Begriff „ortho- Aminobenzoesäure“ das Molekül unabhängig davon, ob es eine positive, eine negative oder gar keine Nettoladung hat. Mikrobielle Fermentation Der Begriff „mikrobielle Fermentation“ bezeichnet die Inkubation einer oder mehrerer mikrobieller Zellen in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen, welche die Stoffwechselaktivität der Zellen ermöglichen. Dies bedeutet insbesondere die Einstellung und Aufrechterhaltung eines geeigneten pH-Wertes, einer geeigneten Sauerstoffsättigung, einer geeigneten Temperatur und einer geeigneten Osmolarität. Der Fachmann kann Kultivierungsbedingungen, die für den jeweiligen Mikroorganismus geeignet sind, anhand seiner Fachkenntnisse und der allgemein verfügbaren Literatur auswählen. Die Kultivierung von Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum erfolgt vorzugsweise bei einem pH zwischen 6 und 8, bei einer Temperatur zwischen 25 °C und 40 °C sowie bei einer Osmolalität zwischen 400 und 2600 mOsmol/kg. Die Sauerstoffsättigung wird vorzugsweise möglichst nahe an dem unter Normaldruck und Normalatmosphäre erreichbaren Maximum gehalten. Insbesondere wird den mikrobiellen Zellen bei einer mikrobiellen Fermentation auch wenigstens eine fermentierbare Kohlenstoffquelle zur Verfügung gestellt. Hierbei handelt es sich um eine organische Kohlenstoffverbindung, die von den Zellen zur Bildung von oAB genutzt werden kann. Es ist bevorzugt, dass sie zusätzlich auch als Energiequelle für den Stoffwechsel sowie als Kohlenstoffquelle für den Aufbau von mikrobieller Biomasse genutzt werden kann. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Stoffwechselwege der mikrobiellen Zelle für die Bildung von mikrobieller Biomasse und die Bildung von oAB soweit getrennt, dass wenigstens eine fermentierbare Kohlenstoffquelle für den Energie- und Baustoffwechsel verwendet wird und wenigstens eine andere für die Produktbildung. Bevorzugte fermentierbare Kohlenstoffquellen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C-5- Monosacchariden, C-6-Monosacchariden, Disacchariden und Trisacchariden. Bevorzugte C-5- Monosaccharide sind Xylose und Arabinose. Bevorzugte C-6-Monosaccharide sind Glucose, Fructose und Mannose. Ein bevorzugtes Disaccharid ist Saccharose. Ein bevorzugtes Trisaccharid ist Kestose. Die metabolische Aktivität besteht vorzugsweise in der Produktion von oAB und/oder dem Aufbau von Biomasse, besonders bevorzugt in der Produktion von oAB. Ein geeigneter Parameter, der die kontinuierliche Überwachung der metabolischen Aktivität zur Prozesssteuerung erlaubt, ist auch die Sauerstoffaufnahmerate. Diese kann, z.B. durch Sauerstoffelektroden, kontinuierlich erfolgen und liefert ohne zeitlichen Verzug Messergebnisse, die zur Anpassung der Kultivierungsbedingungen verwendet werden können. Nährmedium Nährmedien, die zur Kultivierung mikrobieller Zellen, insbesondere von Corynebacterium sp., geeignet sind, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Geeignete Nährmedien enthalten wenigstens einen Puffer zur Regulation des pH, für den verwendeten Mikroorganismus verwertbare Quellen anorganischer Nährstoffe, insbesondere Stickstoff, Schwefel und Phosphor sowie die vom eingesetzten Organismus benötigten Spurenelemente. Je nach Mikroorganismus kann der Zusatz von Vitaminen und/oder komplexen Medienbestandteilen wie z.B. Pepton oder Hefeextrakt sinnvoll sein. Besonders geeignete Nährmedien sind in den in dieser Anmeldung enthaltenen Ausführungsbeispielen beschrieben. Mikrobielle Zelle Bei der mikrobiellen Zelle handelt es sich bevorzugt um eine Bakterienzelle, stärker bevorzugt um einen Stamm des Genus Corynebacterium und noch stärker bevorzugt um Corynebacterium glutamicum. Wenn im Kontext dieser Anmeldung von „einer mikrobiellen Zelle“ die Rede ist, so ist eine Mehrzahl von Zellen immer eingeschlossen, da die Bildung einer nennenswerten Produktmenge in überschaubaren Zeiträumen die Anwesenheit einer Vielzahl von Zellen voraussetzt. Außerdem führt die Kultivierung einer Zelle im Regelfall auch zur Vermehrung der Zelle, so dass selbst bei der Anwesenheit einer einzigen Zelle im Nährmedium nach einiger Zeit eine Mehrzahl von Zellen entsteht. Bei der mikrobiellen Zelle handelt es sich um eine rekombinante mikrobielle Zelle. Dies bedeutet, dass diese Zelle wenigstens eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für ein Gen kodiert, das in der fraglichen Zelle endogen nicht vorhanden ist („Fremdgen“). Bei diesem Fremdgen kann es sich auch um die Variante eines endogen vorkommenden Enzyms handeln, die sich vom endogen vorkommenden Enzym nur durch eine höhere oder niedrigere Enzymaktivität unterscheidet oder die einem anderen Regulationsmechanismus unterliegt. Dieses Fremdgen muss in einer Form vorliegen, die seine Expression ermöglicht. Dies bedeutet insbesondere, dass es unter Kontrolle eines für die jeweilige mikrobielle Zelle geeigneten Promotors steht. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das Fremdgen mit der für den betreffenden Mikroorganismus geeigneten Promotorsequenz in einem Plasmid vor. In einer anderen Ausführungsform ist das Fremdgen mit der für den betreffenden Mikroorganismus geeigneten Promotorsequenz in das Genom der mikrobiellen Zellen integriert. Obligatorisch enthält die rekombinante mikrobielle Zelle ein Gen, das für eine DAHP-Synthase mit einer Sequenz wie durch SEQ ID NO: 11 definiert oder eine Variante davon kodiert, mit der Maßgabe, dass die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der mikrobiellen Zelle um eine Zelle, die sich zusätzlich zur Anwesenheit der oben definierten DAHP-Synthase gemäß SEQ ID NO.11 oder einer Variante davon vom Wildtyp des betreffenden Mikroorganismus wenigstens durch folgendes Merkmal unterscheidet: Eine gegenüber dem jeweiligen Wildtyp reduzierte Aktivität der Anthranilat- Phosphoribosyltransferase, wobei aber eine Restaktivät vorhanden sein muss. Die Restaktivität liegt vorzugsweise zwischen 10 % und 60 %, stärker bevorzugt zwischen 20 % und 50 % der in C. glutamicum ATCC13032 nativ vorhandenen Aktivität. Dies wird vorzugsweise durch eine gegenüber dem Wildtyp reduzierte Expression des Gens für die Anthranilat-Phosphoribosyltransferase (trpD) erreicht, wobei die Expression aber nicht vollständig unterbunden ist. Dies erfolgt bevorzugt durch Einsatz einer Promotorsequenz, die gegenüber der endogen vorhandenen Promotorsequenz eine geringere Transkriptionsaktivität aufweist oder durch eine Modifikation des Abstands der Ribosomenbindestelle zum Start-Codon des trpD-Gens oder durch eine Veränderung des Start-Codons selbst. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Reduzierung der Aktivität der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase durch Deletion oder Inaktivierung des Gens für die endogene Anthranilat-Phosphoribosyltransferase (trpD) und den Ersatz dieses Gens durch ein Gen für eine Anthranilat-Phosphoribosyltransferase mit einer veränderten ribosomalen Bindestelle und optional einem veränderten Start-Codon wie in SEQ ID NO. 1 oder 2, bevorzugt SEQ ID NO. 2 definiert. Die Aminosäuresequenz der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase entspricht vorzugsweise der endogenen Anthranilat-Phosphoribosyltransferase, besonders bevorzugt wird sie durch SEQ ID NO.3 oder eine Variante davon definiert. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist mikrobielle Zelle zusätzlich (ii) durch die Deletion oder Inaktivierung des Gens, das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase wie in SEQ ID NO.4 definiert kodiert, gekennzeichnet. Dies kann auf alle dem Fachmann geläufigen Weisen geschehen, vorzugsweise durch Deletion des Gens oder einer Teilsequenz davon, durch Einführung wenigstens eines Stop-Codons oder durch Deletion oder Inaktivierung der Promotorsequenz. Besonders bevorzugt ist die Deletion wenigstens eines Teils der proteinkodierenden Sequenz des Gens (SEQ ID NO.5). In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mikrobielle Zelle zusätzlich durch wenigstens eines der nachfolgend genannten Merkmale gekennzeichnet: (iii) Erhöhte Aktivität der Shikimat-Kinase. Dies erfolgt vorzugsweise durch erhöhte Expression eines entsprechenden Enzyms. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Steigerung der Aktivität durch erhöhte Expression des Gens für die endogen vorhandene Shikimat-Kinase wie in SEQ ID NO. 6 definiert oder einer Variante davon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt dies durch Expression einer exogenen Shikimat-Kinase, bevorzugt wie in SEQ ID NO.7 definiert oder einer Variante davon. Eine verstärkte Expression eines Genes kann durch alle dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, insbesondere durch die Einführung mehrerer Kopien des entsprechenden Gens in den Mikroorganismus oder durch die Verwendung stärkerer Promotoren zur Expression des endogen vorhandenen Enzyms. Ein besonders bevorzugter Promotor für die Expression von Fremdgenen oder die verstärkte Expression endogener Gene ist ptuf wie in SEQ ID NO.8 definiert. (iv) Erhöhte Aktivität der 3-Phosphoshikimat-1-carboxyvinyltransferase und Chorismat-Synthase. Bevorzugt haben diese Enzyme eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO 9 oder einer Variante davon und SEQ ID NO.10 oder einer Variante davon definiert. Dies erfolgt bevorzugt durch die Einführung zusätzlicher Kopien der für diese Enzyme kodierenden Gene in den Mikroorganismus. Bevorzugt wird der ptuf-Promotor zur Steuerung der Expression verwendet. Bezogen auf die Anthranilat-Phosphoribosyltransferase (SEQ ID NO.3), Shikimat-Kinase (SEQ ID NO.6 oder 7), 3-Phosphoshikimat-1-carboxyvinyltransferase (SEQ ID NO.9) und Chorismat-Synthase (SEQ ID NO. 10) bedeutet „Variante“ ein Enzym, das durch Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 10 %, bevorzugt bis zu 5 %, der im jeweiligen Enzym enthaltenen Aminosäuren erhalten wird. Grundsätzlich können die vorgenannten Modifikationen an jeder beliebigen Stelle des Enzyms kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Bevorzugt erfolgen sie aber nur am N-Terminus und/oder am C-Terminus des Polypeptids. Bei Substitutionen von Aminosäuren handelt es sich vorzugsweise um konservative Substitutionen, d.h. um solche, bei denen die veränderte Aminosäure einen Rest mit ähnlichen chemischen Eigenschaften besitzt wie die im unveränderten Enzym vorliegende Aminosäure. Es werden also besonders bevorzugt Aminosäuren mit basischen Resten gegen solche mit basischen Resten, Aminosäuren mit sauren Resten gegen solche mit ebenfalls sauren Resten, Aminosäuren mit polaren Resten gegen solche mit polaren Resten und Aminosäuren mit unpolaren gegen solche mit unpolaren Resten ausgetauscht. Bevorzugt Die spezifische Enzymaktivität einer Variante liegt vorzugsweise wenigstens bei 80 % spezifischen Aktivität des unveränderten Enzyms. Enzymtests zum Nachweis der Aktivität der vorgenannten Enzyme kann der Fachmann der Literatur entnehmen. Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Studie hat gezeigt, dass eine 3- Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO.11 definiert das Wachstum der Produktionsstämme, die Substrataufnahme, die Produktbildung, sowie die Produktausbeute verbessert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine rekombinante Zelle des Genus Corynebacterium, des Genus Bacillus oder des Genus Pseudomonas enthaltend ein Gen, das für eine DAHP-Synthase wie in SEQ ID NO. 11 definiert oder eine Variante davon kodiert. Bevorzugt handelt es sich um eine Zelle eines Stamms von Corynebacterium glutamicum, stärker bevorzugt um C. glutamicum ATCC13032. Im Genus Bacillus ist Bacillus subtilis bevorzugt. Im Genus Pseudomonas ist Pseudomonas putida bevorzugt. Diese Zelle enthält in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung folgende weitere genetische Modifikation: Eine gegenüber dem jeweiligen Wildtyp reduzierte Aktivität der Anthranilat- Phosphoribosyltransferase, wobei aber eine Restaktivät vorhanden sein muss. Die Restaktivität liegt vorzugsweise zwischen 10 % und 60 %, stärker bevorzugt zwischen 20 % und 50 % der in C. glutamicum ATCC13032 nativ vorhandenen Aktivität. Dies wird vorzugsweise durch eine gegenüber dem Wildtyp reduzierte Expression des Gens für die Anthranilat-Phosphoribosyltransferase (trpD) erreicht, wobei die Expression aber nicht vollständig unterbunden ist. Dies erfolgt bevorzugt durch Einsatz einer Promotorsequenz, die gegenüber der endogen vorhandenen Promotorsequenz eine geringere Transkriptionsaktivität aufweist oder durch eine Modifikation des Abstands der Ribosomenbindestelle zum Start-Codon des trpD-Gens oder durch eine Veränderung des Start-Codons selbst. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Reduzierung der Aktivität der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase durch Deletion oder Inaktivierung des Gens für die endogene Anthranilat-Phosphoribosyltransferase (trpD) und den Ersatz dieses Gens durch ein Gen für eine Anthranilat-Phosphoribosyltransferase mit einer veränderten ribosomalen Bindestelle und optional einem veränderten Start-Codon wie in SEQ ID NO. 1 oder 2, bevorzugt SEQ ID NO. 2 definiert. Die Aminosäuresequenz der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase entspricht vorzugsweise der endogenen Anthranilat-Phosphoribosyltransferase, besonders bevorzugt wird sie durch SEQ ID NO.3 oder eine Variante davon definiert. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mikrobielle Zelle (ii) zusätzlich durch die Deletion oder Inaktivierung des Gens, das für die Phosphoenolpyruvat- Carboxylase wie in SEQ ID NO.4 definiert kodiert, gekennzeichnet. Dies kann auf alle dem Fachmann geläufigen Weisen geschehen, vorzugsweise durch Deletion des Gens oder einer Teilsequenz davon, durch Einführung wenigstens eines Stop-Codons oder durch Deletion oder Inaktivierung der Promotorsequenz. Besonders bevorzugt ist die Deletion wenigstens eines Teils der proteinkodierenden Sequenz des Gens (SEQ ID NO.5). In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mikrobielle Zelle zusätzlich durch wenigstens eines der nachfolgend genannten Merkmale gekennzeichnet: (iii) Erhöhte Aktivität der Shikimat-Kinase. Dies erfolgt vorzugsweise durch erhöhte Expression eines entsprechenden Enzyms. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Steigerung der Aktivität durch erhöhte Expression des Gens für die endogen vorhandene Shikimat-Kinase wie in SEQ ID NO. 6 definiert oder einer Variante davon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt dies durch Expression einer exogenen Shikimat-Kinase, bevorzugt wie in SEQ ID NO.7 definiert oder einer Variante davon. Eine verstärkte Expression eines Genes kann durch alle dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, insbesondere durch die Einführung mehrerer Kopien des entsprechenden Gens in den Mikroorganismus oder durch die Verwendung stärkerer Promotoren zur Expression des endogen vorhandenen Enzyms. Ein besonders bevorzugter Promotor für die Expression von Fremdgenen oder die verstärkte Expression endogener Gene ist ptuf wie in SEQ ID NO.8 definiert. (iv) Erhöhte Aktivität der 3-Phosphoshikimat-1-carboxyvinyltransferase und Chorismat-Synthase. Bevorzugt haben diese Enzyme eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO 9 oder einer Variante davon und SEQ ID NO.10 oder einer Variante davon definiert. Dies erfolgt bevorzugt durch die Einführung zusätzlicher Kopien der für diese Enzyme kodierenden Gene in den Mikroorganismus. Bevorzugt wird der ptuf-Promotor zur Steuerung der Expression verwendet. Alle weiter oben gegebenen Definitionen, insbesondere zu „Varianten“ der Enzyme gelten auch für diese Ausführungsform. Verwendung einer rekombinanten mikrobiellen Zelle In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer rekombinanten Zelle enthaltend ein Gen, das für eine DAHP-Synthase wie in SEQ ID NO.11 definiert oder eine Variante davon mit der Maßgabe, dass die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben, kodiert, zur Herstellung von oAB durch eine mikrobielle Fermentation. Alle oben in dieser Anmeldung gegebenen Definitionen gelten auch für diese Ausführungsform. Die „Verwendung“ besteht vorzugsweise in der Kultivierung der Zelle in einem geeigneten Nährmedium in Gegenwart einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle, die von dieser Zelle in oAB umgesetzt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die rekombinante Zelle zur Synthese wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3- Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat, 3-Dehydrochinat, 3-Dehydroxyshikimat, Shikimat, Shikimat- 3-Phosphat, Chorismat, Prephenat und ortho-Aminobenzoesäure durch eine mikrobielle Fermentation verwendet. Der Fachmann versteht, dass die metabolische und genetische Ausstattung der verwendeten mikrobiellen Zellen oder Zellen an das angestrebte angepasst werden muss, indem die Aktivität von Enzymen, welche die Umsetzung des angestrebten Produkts zu Folgeprodukten katalysieren, reduziert oder ganz unterbunden wird. Verfahren In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren enthaltend die Schritte a) Bereitstellung einer wenigstens einer rekombinanten mikrobiellen Zelle enthaltend ein Gen, das für eine DAHP-Synthase wie in SEQ ID NO.11 definiert oder eine Variante davon kodiert, mit der Maßgabe, dass die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben; b) Kultivierung der wenigstens einen rekombinanten mikrobiellen Zelle in einem Nährmedium, das wenigstens eine fermentierbare Kohlenstoffquelle enthält, wobei wenigstens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oAB, 3- Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat, 3-Dehydrochinat, 3-Dehydroshikimat, Shikimat, Shikimat-3-Phosphat, Chorismat, Prephenat, Methylanthranilsäure, para- Aminobenzoesäure, Vanillin, Indol, Indoxyl, Indigo, Mandelsäure, Ferulasäure und Zimtsäure produziert wird. Alle oben gegebenen Definitionen gelten auch für diese Ausführungsform. Die „Kultivierung“ der rekombinanten mikrobiellen Zellen erfolgt unter den Bedingungen, die oben in dieser Anmeldung für die „mikrobielle Fermentation“ beschrieben sind. Da das Verfahren auf die effiziente Herstellung von oAB abzielt, versteht der Fachmann, dass der Begriff „wenigstens eine rekombinante mikrobielle Zelle“ in dieser Ausführungsform bevorzugt eine Vielzahl von Zellen, besonders bevorzugt wenigstens 10⁹ Zellen, bedeutet. Die „Bereitstellung“ der rekombinanten mikrobiellen Zelle bedeutet, dass am Ende des Verfahrensschritts eine lebensfähige rekombinante Zelle wie oben in dieser Anmeldung beschrieben vorliegt. Der Verfahrensschritt b) wird vorzugsweise für 15 bis 80 Stunden durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Verfahrensschritt b) solange durchgeführt, bis eine Konzentration von wenigstens 1 g/L, bevorzugt wenigstens 6 g/l, und am stärksten bevorzugt wenigstens 9 g/l oAB erreicht ist. Zusammensetzung In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung enthaltend a) wenigstens eine mikrobielle Zelle des Genus Corynebacterium enthaltend ein Gen, das für eine DAHP-Synthase wie in SEQ ID NO. 11 definiert oder eine Variante davon kodiert, mit der Maßgabe, dass die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben; b) wenigstens eine fermentierbare Kohlenstoffquelle; und c) wenigstens eine Stickstoffquelle, wenigstens eine Phosphorquelle, wenigstens eine Schwefelquelle und Spurenelemente. Alle oben gegebenen Definitionen gelten auch für diese Ausführungsform. Bevorzugt handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung um ein Nährmedium, das die rekombinante mikrobielle Zelle in lebensfähiger Form enthält. Die fermentierbare Kohlenstoffquelle ist eine solche, die von der mikrobiellen Zelle für die oAB-Produktion genutzt werden kann, besonders bevorzugt handelt es sich um Glucose, Xylose oder eine Mischung daraus. Der Fachmann versteht, dass der Begriff „wenigstens eine“ in dieser Ausführungsform bevorzugt eine Mehrzahl von Zellen, besonders bevorzugt wenigstens 10⁹ Zellen, bedeutet, um eine hinreichende Raum-Zeit-Ausbeute der mikrobiellen Fermentation sicherzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung zusätzlich oAB, stärker bevorzugt wenigstens 1 g/L, noch stärker bevorzugt wenigstens 6 g/l und am stärksten bevorzugt wenigstens 9 g/l oAB. Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen nur dazu, die Erfindung zu illustrieren. Sie sollen den Schutzbereich der Patentansprüche in keiner Weise beschränken.

Beispiele Material und Methoden Die verwendeten Produktionsstämme und Expressionsplasmide sind in Tabelle 1 dargestellt. C. glutamicum-Stämme wurden aerob bei 30°C in CGXII Minimal-Medium (s. Tabelle 2) mit 2 % (w/v) Glukose als Kohlenstoffquelle und einer optischen Dichte (OD) von 1 kultiviert. Die Vorkultivierungen wurden in SY und anschließend VKII Medium durchgeführt (s. Tabelle 2). Die Hauptkultivierungen fanden entweder in 500 mL Glas-Schüttelkolben mit 30 mL Medium auf einem Rotationsschüttler mit 200 rpm statt oder in 250 mL Glas-Bioreaktoren mit 100 mL Medium in einem Fed-Batch Fermentationsprozess. Die Begasung bzw. Rührergeschwindigkeit im Bioreaktor wurde auf einen gelösten Sauerstoffgehalt (dissolved oxygen, DO) von 30 % eingestellt. Zu Beginn der Fermentation wurden 20 g/L Glukose vorgelegt. Bei Überschreitung des DO im Medium von 37 % wurde die Zugabe von Glukose durch eine Bolus-Dosierung auf eine Konzentration von 20 g/L Glukose gelöst. Zur pH- Kontrolle wurde ein Gemisch aus 1,5 mol/L NaOH und 4,9 mol/L (NH4)2OH zudosiert. Für die Analyse des Wachstums wurden OD Messungen bei einer Wellenlänge von 600 nm durchgeführt. Zusätzlich wurde das Trockengewicht der Zellen bestimmt. Der Überstand der Proben diente zur Quantifizierung der Glukose am CedexBio Analyzer und zusätzlich zur Messung der Produkt- Konzentration im Medium mittels HPLC Analyse an einer Luna 3 µm C18(2) Trennsäule. Tabelle 1: Für dieses Patent verwendete Produktionsstämme und Expressionsplasmide

Tabelle 2: Zusammensetzung von Vor- und Hauptkultivierungsmedien sowie Stammlösungen Ergebnisse Es wurden Schüttelkolbenkultivierungen mit dem Produktionsstamm C. glutamicum Δppc ΔrpD::trpD5 durchgeführt, der mit unterschiedlichen Expressionsplasmiden transformiert wurde. In Tabelle 3 sind Produkttiter gezeigt, die jeweils über den Verlauf einer Kultivierungszeit von 48 h gemessen wurden. Es ist zu erkennen, dass sowohl die Leerplasmid- Kontrolle, als auch aroF^wt bzw. aroF^E154N tragende Expressionsplasmide keinen Effekt auf die Produktbildung im Stammhintergrund zeigten. Ausschließlich der Produktionsstamm mit aroG^new Expressionsplasmid zeigte eine signifikante Steigerung des finalen Titers um 54 - 72 % (s. Tabelle 3). Tabelle 3: Produktkonzentrationen (g/L) aus Schüttelkolbenkultivierungen mit unterschiedlichen Expressionsplasmiden. Die gemessenen Werte sind Mittelwerte aus zwei biologischen Replikaten. Messpunkte mit einer Standardabweichung über 5 % wurden mit einem * markiert. Um den positiven Effekt der Genvariante aroG^new genauer zu charakterisieren, wurden Fermentationen durchgeführt, in denen der Produktionsstamm C. glutamicum Δppc ΔtrpD::trpD5 ΔaroF jeweils mit den in Tabelle 3 gezeigten Expressionsplasmiden transformiert wurde. Wie in Tabelle 4 gezeigt, wirkt sich die Transformation mit dem aroG^new tragenden Expressionsplasmid positiv auf das Wachstum der Zellen, die Substrataufnahme, Produkttiter sowie Produktausbeuten aus (s. Tabelle 4). Bezogen auf die finale Produktausbeute erzielte die Ausprägung von AroG^new eine Verbesserung um 44 – 48 %. Tabelle 4: Fermentative Charakterisierung eines Produktionsstammes mit unterschiedlichen Expressionsplasmiden im Bioreaktor. Da die oben gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass die Ausprägung von aroF keinen Effekt auf die gemessenen Parameter hat, wurde im Folgenden für die Untersuchung weiterer AroG Varianten der Stamm C. glutamicum Δppc ΔtrpD::trpD5 eingesetzt. Hierbei wurde für die Expression der Genvarianten aroG^D146N bzw. aroG^S180F aus E. coli der Stamm C. glutamicum Δppc ΔtrpD::trpD5 mit pEKEx2_aroG^D146N bzw. pEKEx2_ aroG^S180F transformiert. In Tabelle 5 wird deutlich, dass Wachstum, Substratverbrauch und Produkttiter erkennbar unter den gemessenen Werten des Stammes mit aroG^new Expressionsplasmid liegen (s. Tabelle 4 und 5). Hervorzuheben ist, dass bis zu einer Fermentationszeit von 28,9 h auch die Ausbeute mit Plasmid-basierter aroG^new Expression erkennbar über der Ausbeute aller weiterer getesteten DAHPS Genvarianten liegt (s. Tabelle 4 und 5). Zu diesem Zeitpunkt liegt die Produktausbeute mit aroG^new Expression 635 % bzw.343 % über der Expression von aroG^D146N bzw. aroG^S180F. Tabelle 5: Fermentative Charakterisierung eines Produktionsstammes mit unterschiedlichen Expressionsplasmiden im Bioreaktor. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte aus zwei biologischen Replikaten. Diskussion Die beschriebenen Versuche zeigen, dass die Einbringung der aroG^new Genvariante einen überraschenden Vorteil für die Produktionsstämme aufweist bezüglich Wachstum, Substrataufnahme, Produktbildung sowie Produktausbeute. Diese Beobachtungen waren allein auf die Modifikationen der E. coli-basierten aroG Genvariante aroG^new im C. glutamicum Stammhintergrund zurückzuführen und konnten nicht mit weiteren untersuchten Varianten von DAHP-Synthetasen repliziert werden.

Sequence Listing Information : DTD Version : Vl_3 File Name : 2021P30312_Sequence_Listing_PCT . xml Software Name : WIPO Sequence Software Version : 2 .2 . 0 Production Date : 2022-11-29 General Information : Current application / Applicant file reference : 2021P30312EP Earliest priority application / IP Office : EP Earliest priority application / Application number : 21215753 . 1 Earliest priority application / Filing date : 2021-12-17 Applicant name : Covestro Deutschland AG Applicant name / Language : de Invention title : Besonders geeignete 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase zur fermentativen Herstellung von ortho-Aminobenzoesaeure ( de ) Sequence Total Quantity : 20 Sequences : Sequence Number (ID) : 1 Length : 1070 Molecule Type : DNA Features Location/Qualif iers : - misc_feature, 1 . . 1070

> note, Expressionskonstrukt

- source, 1 . . 1070

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct Residues : gccctgcagg taaaaaaagg attgtgactt ctccagcaac actgaaagtt ctcaacgcct 60 acttggataa ccccactcca accctggagg aggcaattga ggtgttcacc ccgctgaccg 120 tgggtgaata cgatgacgtg cacatcgcag cgctgcttgc caccatccgt actcgcggtg 180 agcagttcgc tgatattgcc ggcgctgcca aggcgttcct cgcggcggct cgtccgttcc 240 cgattactgg cgcaggtttg ctagattccg ctggtactgg tggcgacggt gccaacacca 300 tcaacatcac caccggcgca tccctgatcg cagcatccgg tggagtgaag ctggttaagc 360 acggcaaccg ttcggtgagc tccaagtccg gctccgccga tgtgctggaa gcgctgaata 420 ttcctttggg ccttgatgtg gatcgtgctg tgaagtggtt cgaagcgtcc aacttcacct 480 tcctgttcgc acctgcgtac aaccctgcga ttgcgcatgt gcagccggtt cgccaggcgc 540 tgaaattccc caccatcttc aacacgcttg gaccattgct gtccccggcg cgcccggagc 600 gtcagatcat gggcgtggcc aatgccaatc atggacagct catcgccgag gtcttccgcg 660 agttgggccg tacacgcgcg cttgttgtgc atggcgcagg caccgatgag atcgcagtcc 720 acggcaccac cttggtgtgg gagcttaaag aagacggcac catcgagcat tacaccatcg 780 agcctgagga ccttggcctt ggccgctaca cccttgagga tctcgtaggt ggcctcggca 840 ctgagaacgc cgaagctatg cgcgctactt tcgcgggcac cggccctgat gcacaccgtg 900 atgcgttggc tgcgtccgca ggtgcgatgt tctacctcaa cggcgatgtc gactccttga 960 aagatggtgc acaaaaggcg ctttccttgc ttgccgacgg caccacccag gcatggttgg 1020 ccaagcacga agagatcgat tactcagaaa aggagtcttc caatgactag Sequence Number (ID) : 2

Length : 1070

Molecule Type : DNA

Features Location/Qualif iers :

- misc_feature, 1 . . 1070

> note, Expressionskonstrukt

- source, 1 . . 1070

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues : gccctgcagg taaaaaaagg attttgactt ctccagcaac actgaaagtt ctcaacgcct 60 acttggataa ccccactcca accctggagg aggcaattga ggtgttcacc ccgctgaccg 120 tgggtgaata cgatgacgtg cacatcgcag cgctgcttgc caccatccgt actcgcggtg 180 agcagttcgc tgatattgcc ggcgctgcca aggcgttcct cgcggcggct cgtccgttcc 240 cgattactgg cgcaggtttg ctagattccg ctggtactgg tggcgacggt gccaacacca 300 tcaacatcac caccggcgca tccctgatcg cagcatccgg tggagtgaag ctggttaagc 360 acggcaaccg ttcggtgagc tccaagtccg gctccgccga tgtgctggaa gcgctgaata 420 ttcctttggg ccttgatgtg gatcgtgctg tgaagtggtt cgaagcgtcc aacttcacct 480 tcctgttcgc acctgcgtac aaccctgcga ttgcgcatgt gcagccggtt cgccaggcgc 540 tgaaattccc caccatcttc aacacgcttg gaccattgct gtccccggcg cgcccggagc 600 gtcagatcat gggcgtggcc aatgccaatc atggacagct catcgccgag gtcttccgcg 660 agttgggccg tacacgcgcg cttgttgtgc atggcgcagg caccgatgag atcgcagtcc 720 acggcaccac cttggtgtgg gagcttaaag aagacggcac catcgagcat tacaccatcg 780 agcctgagga ccttggcctt ggccgctaca cccttgagga tctcgtaggt ggcctcggca 840 ctgagaacgc cgaagctatg cgcgctactt tcgcgggcac cggccctgat gcacaccgtg 900 atgcgttggc tgcgtccgca ggtgcgatgt tctacctcaa cggcgatgtc gactccttga 960 aagatggtgc acaaaaggcg ctttccttgc ttgccgacgg caccacccag gcatggttgg 1020 ccaagcacga agagatcgat tactcagaaa aggagtcttc caatgactag

1070

Sequence Number (ID) : 3 Length : 348 Molecule Type : AA Features Location/Qualif iers : - source, 1 . . 348

> mol_type, protein

> organism, Corynebacterium glutamicum Residues :

MTSPATLKVL NAYLDNPTPT LEEAIEVFTP LTVGEYDDVH IAALLATIRT

RGEQFADIAG 60

AAKAFLAAAR PFPITGAGLL DSAGTGGDGA NTINITTGAS LIAASGGVKL

VKHGNRSVSS 120 KSGSADVLEA LNIPLGLDVD RAVKWFEASN FTFLFAPAYN PAIAHVQPVR

QALKFPTIFN 180 TLGPLLSPAR PERQIMGVAN ANHGQLIAEV FRELGRTRAL WHGAGTDEI AVHGTTLVWE 240 LKEDGTIEHY TIEPEDLGLG RYTLEDLVGG LGTENAEAMR ATFAGTGPDA HRD ALAAS AG 300 AMFYLNGDVD SLKDGAQKAL SLLADGTTQA WLAKHEEIDY SEKESSND 348

Sequence Number ( ID) : 4

Length : 919

Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- source , 1 . . 919

> mol_type , protein

> organism, Corynebacterium glutamicum Residues :

MTDFLRDDIR FLGQILGEVI AEQEGQEVYE LVEQARLTSF DIAKGNAEMD

SLVQVFDGIT 60 PAKATPIARA FSHFALLANL AEDLYDEELR EQALDAGDTP PDSTLDATWL

KLNEGNVGAE 120

AVADVLRNAE VAPVLTAHPT ETRRRTVFDA QKWITTHMRE RHALQSAEPT

ARTQSKLDEI 180

EKNIRRRITI LWQTALIRVA RPRIEDEIEV GLRYYKLSLL EEIPRINRDV

AVELRERFGE 240

GVPLKPWKP GSWIGGDHDG NPYVTAETVE YSTHRAAETV LKYYARQLHS

LEHELSLSDR 300

MNKVTPQLLA LADAGHNDVP SRVDEPYRRA VHGVRGRILA TTAELIGEDA

VEGVWFKVFT 360

PYASPEEFLN DALTIDHSLR ESKDVLIADD RLSVLISAIE SFGFNLYALD

LRQNSESYED 420 VLTELFERAQ VTANYRELSE AEKLEVLLKE LRSPRPLIPH GSDEYSEVTD

RELGIFRTAS 480

EAVKKFGPRM VPHCIISMAS SVTDVLEPMV LLKEFGLIAA NGDNPRGTVD

VIPLFETIED 540

LQAGAGILDE LWKIDLYRNY LLQRDNVQEV MLGYSDSNKD GGYFSANWAL

YDAELQLVEL 600

CRSAGVKLRL FHGRGGTVGR GGGPSYDAIL AQPRGAVQGS VRITEQGEII

SAKYGNPETA 660

RRNLEALVSA TLEASLLDVS ELTDHQRAYD IMSEISELSL KKYASLVHED

QGFIDYFTQS 720

TPLQEIGSLN IGSRPSSRKQ TSSVEDLRAI PWVLSWSQSR VMLPGWFGVG

TALEQWIGEG 780

EQATQRIAEL QTLNESWPFF TSVLDNMAQV MSKAELRLAK LYADLIPDTE

VAERVYSVIR 840

EEYFLTKKMF CVITGSDDLL DDNPLLARSV QRRYPYLLPL NVIQVEMMRR

YRKGDQSEQV 900 SRNIQLTMNG LSTALRNSG

919

Sequence Number ( ID) : 5 Length : 2760 Molecule Type : DNA Features Location/Qualif iers : - source , 1 . . 2760

> mol_type , genomic DNA

> organism, Corynebacterium glutamicum Residues : atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60 gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120 gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180 ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct

21 ggctaacctg 240 gcggaagacc tctacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300 ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360 gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420 gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480 cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540 gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600 cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660 gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720 ggtgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780 aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840 ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900 atgaataagg tcaccccgca gctgcttgcg ctggcagatg cagggcacaa cgacgtgcca 960 agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020 acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080 ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140 gaatccaagg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200 agctttggat tcaaccttta cgcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260 gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320 gcagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380 ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440 gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500 tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggtg ttgctcaagg aattcggact catcgcagcc 1560 aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620 ctccaggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatctcta ccgcaactac 1680 ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740 ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800 tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860 ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca ggggggctgt ccaaggttcc 1920 gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980 cgccgaaacc tcgaagccct ggtctcagcc acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040 gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100 aagaagtacg cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160 acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220 acctcctcgg tggaagattt gcgagccatc ccatgggtgc tcagctggtc acagtctcgt 2280 gtcatgctgc caggctggtt tggtgtcgga accgcattag agcagtggat tggcgaaggg 2340 gagcaggcca cccaacgcat tgccgagctg caaacactca atgagtcctg gccatttttc 2400 acctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460 ctctacgcag acctgatccc agatacggaa gtagccgagc gagtctattc cgtcatccgc 2520 gaggagtact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggctctga tgatctgctt 2580 gatgacaacc cacttctcgc acgctctgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640 aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagtg 2700 tcccgcaaca ttcagctgac catgaacggt ctttccactg cgctgcgcaa ctccggctag 2760

Sequence Number (ID) : 6 Length : 185 Molecule Type : AA Features Location/Qualif iers : - source, 1 . . 185

> mol_type, protein

> organism, Corynebacterium glutamicum Residues :

MNDQIHLDHQ SDDTSECSCP IWLVGLPGA GKSTIGRRLA RALNTELVDS DELIERATGK 60 ACGAVFSELG EPAFRELEAI HVAEALKSSG WSLGGGSVL TESTRELLKG QDWWIDVPV 120 EEGIRRTANE RSRPVLQAAD PAEHYRNLVK VRTPLYEEVA TYRLRTNNRS PQQWAAVLH 180 RLE ID 185

Sequence Number (ID) : 7

Length : 174

Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- source, 1 . . 174

> mol_type, protein

> organism, Escherichia coli Residues :

MTQPLFLIGP RGCGKTTVGM ALADSLNRRF VDTDQWLQSQ LNMTVAEIVE

REEWAGFRAR 60

ETAALEAVTA PSTVIATGGG IILTEFNRHF MQNNGIWYL CAPVSVLVNR

LQAAPEEDLR 120 PTLTGKPLSE EVQEVLEERD ALYREVAHII IDATNEPSQV ISEIRSALAQ TINC 174

Sequence Number (ID) : 8

Length : 179

Molecule Type : DNA

Features Location/Qualif iers :

- misc_feature, 1 . . 179

> note, Pomotorsequenz

- source, 1 . . 179

> mol_type, other DNA

23 > organism, synthetic construct

Residues : cacagggtag ctggtagttt gaaaatcaac gccgttgccc ttaggattca gtaactggca 60 cattttgtaa tgcgctagat ctgtgtgctc agtcttccag gctgcttatc acagtgaaag 120 caaaaccaat tcgtggctgc gaaagtcgta gccaccacga agtccaggag gacatacat 179

Sequence Number (ID) : 9 Length : 430 Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- source, 1 . . 430

> mol_type, protein

> organism, Escherichia coli

Residues : MVFVSDSSIS LPIWDAPRAR GPIVSDLAIP GSKSITNRAL ILAALASTPS TIIDVLRSRD 60 TDLMTDGLRS LGITITEEAV DRYRVEPGQL SAGSVECGLA GTVMRFLPPV AAFADGP VHF 120 DGDPQARVRP MTSILDALRS LGVEVDNNNL PFTVNAGEVP EGGWEIDAS GSSQFVSGLL 180 LSAPRFKNGV TVKHVGGRLP SMPHIEMTVD MLRSAGIEIE ESENQWWHP GEILGRTWRI 240 EPDLSNATPF LAAAAVTGGT IKINHWPIKT TQPGDAIRSI LERMGCEVEL VAQGEGYDLS 300 VTGPVALKGI EIDMSDIGEL TPTVAALAAL ASTESRLTGI AHLRGHETDR LAALTAEINK 360 LGGKCTELKD GLLIEPASLH GGVWHSYADH RMATAGAIIG LAVDGVQVED IKTTSKTFPG 420

FENVWEEMVG

430

Sequence Number (ID) : 10

Length : 410

Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- source, 1 . . 410

> mol_type, protein

> organism, Corynebacterium glutamicum Residues :

MLGMLRWTTA GESHGQALIA TVEHMPAGVP VTKDEVSYQL ARRRLGYGRG

ARMKFEQDAL 60 TFLTGIRHGL TLGSPISIMI GNTEWDKWTT IMSSDALDME DPDNVAAMSS

GRGAKLTRPR 120 PGHADYAGML KYGFDDARNV LERSSARETA ARVAAATVAR SFLRETLGVE

VLSHVISIGA 180 SEPYTGAEPT FADIQAIDDS PVRAFGKDAE ESMIAEIEAA KKAGDTLGGI

VEVIVEGLPI 240 GLGSHISGED RLDAQIAAAL MGIQAIKGVE IGDGFEEARR RGSEAHDEVF

LDDNGVYRNT 300 NRAGGLEGGM TNGETLRVRA GMKPISTVPR ALKTIDMENG KAATGIHQRS

D VCAVP AAGV 360 VAEAMVTLVL ARAVLQKFGG DSLSETKSNI DTYLKNIEER MKFEGLEDGA 410

Sequence Number (ID) : 11

Length : 350

Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- REGION, 1 . . 350

> note, modifiziertes Enzym - source , 1 . . 350

> mol_type , protein

> organism, synthetic construct Residues :

MNYQNDDLRI KEIKELLPPV ALLEKFPATE NAANTVAHAR KAIHKILKGN

DDRLLWIGP 60 CSIHDPVAAK EYATRVLALR EELKDELEIV MRVYFEKPRT TVGWKGLIND

PHMDNSFQIN 120 DGLRIARKLL LDINDSGLPA AGEFLDMITP QYLADLMSWG AIGARTTESQ VHRELASGLS 180 CPVGFKNGTD GTIKVAIDAI NAAGAPHCFL FVTKWGHSAI VNTSGNGDCH IILRGGKEPN 240 YSAKHVAEVK EGLNKAGLPA QVMIDFSHAN SSKQFKKQMD VCADVCQQIA

GGEKAIIGVM 300 VESHLVEGNQ SLESGEPLAY GKSITDACIG WEDTDALLRQ LANAVKARRG 350

Sequence Number ( ID) : 12

Length : 446

Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- source , 1 . . 446

> mol_type , protein

> organism, Xanthomonas campestris Residues :

MSNTVFIGAK EYFPGIGKIG FEGRDSDNPL AFKVYDANKQ VAGKTMAEHL

RFAVAYWHSF 60 CGNGADPFGP GTRAYPWDVG NTALARAEAK SDAAFEFFTK LGVPYYCFHD

IDLAPDADDI 120 GEYENNLKHM VGIAKQRQAD TGVKLLWGTA NLFSHPRYMN GASTNPDFNV

VARAAVQ VKA 180 AIDATVELGG ENYVFWGGRE GYACLHNTQM KREQDNMARF LTLARDYGRA

IGFTGNFLIE 240 PKPMEPMKHQ YDFDSATVIG FLRQHGLDQD FKLNIEANHA TLSGHSFEHD

LQVASDAGLL 300 GSIDANRGNP QNGWDTDQFP TDLYD TVGAM LWLRQGGLA PGGLNFDAKV

RRESSDPQDL 360 FLAHIGGMDA FARGLEVANA LLTSSPLETW RAQRYASFDS GAGADFANGT

STLADLAKYA 420 AGKGEPTQVS GRQEAYENLI NQYLTR

446

Sequence Number ( ID) : 13

Length : 463

Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- REGION, 1 . . 463

> note , modifiziertes Enzym

- source , 1 . . 463

> mol_type , protein

> organism, synthetic construct Residues :

MSNTVFIGAK EYFPGIGKIG FEGRDSDNPL AFKVYDANKQ VAGKTMAEHL

RFAVAYWHSF 60 CGNGADPFGP GTRAYPWDVG NTALARAEAK SDAAFEFFTK LGVPYYCFHD

IDLAPDADDI 120

GEYENNLKHM VGIAKQRQAD TGVKLLWGTA NLFSHPRYMN GASTNPDFNV

VARAAVQ VKA 180

AIDATVELGG ENYVFWGGRE GYACLHNTQM KREQDNMARF LTLARDYGRA

IGFTGNFLIE 240

PKPMEPMKHQ YDFDSATVIG FLRQHGLDQD FKLNIEANHA TLSGHSFEHD

LQVASDAGLL 300

GSIDANRGNP QNGWDTDQFP TDLYD TVGAM LWLRQGGLA PGGLNFDAKV RRESSDPQDL 360 FLAHIGGMDA FARGLEVANA LLTSSPLETW RAQRYASFDS GAGADFANGT

STLADLAKYA 420 AGKGEPTQVS GRQEAYENLI NQYLTRHRVA GSLKINAVAL RIQ

463

Sequence Number (ID) : 14

Length : 460

Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- source, 1 . . 460

> mol_type, protein

> organism, Corynebacterium glutamicum Residues :

MALVLGIDSS TQSCKALLVD AATGQVIDEG RASHPSGSEV DPRAWIAALD

QATEGLLERA 60 DAVSIAGQQH GMVALDENDE IVRPALLWND TRSAQAALDL NEEIGGDQAA

VDATGSVYVA 120 SLTATKMRWM RDHEPENAAR TASVMLPHDF LTWHLMGRGR KVTDHGDASG TGYYSTRDRA 180

WRTDLAALAL GHEVELPELL APNAIAGTTP GGVKVAAGTG DNAAAALGLD

LQPGDVSVSI 240 GTSGVAGMTV QHSVHDPSGL VTGFADATGA YFPLACTLNG APVLEFGRRI

LGVEWEEFDA 300

LALAAQPGSG GVTLQPYLEG ERTPNRPAAR GVLAGLNCAT TREDFARATV

EGLLLALDDA 360 VTALVEATGV PVQRIQLIGG GARSQAVREI APEIFGHEIV VPEPAEYVAL

GAARQ AAWAL 420 SGEATPPQWP TPGSDPHRAP KNTELSTRYA KLRAATQGWY 460

Sequence Number (ID) : 15

Length : 3302

Molecule Type : DNA Features Location/Qualif iers :

- misc_feature, 1 . . 3302

> note, Expressionskonstrukt

- source, 1 . . 3302

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct Residues : gatcccacag ggtagctggt agtttgaaaa tcaacgccgt tgcccttagg attcagtaac 60 tggcacattt tgtaatgcgc tagatctgtg tgctcagtct tccaggctgc ttatcacagt 120 gaaagcaaaa ccaattcgtg gctgcgaaag tcgtagccac cacgaagtcc aggaggacat 180 acagtatgac acaacctctt tttctgatcg ggcctcgggg ctgtggtaaa acaacggtcg 240 gaatggccct tgccgattcg cttaaccgtc ggtttgtcga taccgatcag tggttgcaat 300 cacagctcaa tatgacggtc gcggagatcg tcgaaaggga agagtgggcg ggatttcgcg 360 ccagagaaac ggcggcgctg gaagcggtaa ctgcgccatc caccgttatc gctacaggcg 420 gcggcattat tctgacggaa tttaatcgtc acttcatgca aaataacggg atcgtggttt 480 atttgtgtgc gccagtatca gtcctggtta accgactgca agctgcaccg gaagaagatt 540 tacggccaac cttaacggga aaaccgctga gcgaagaagt tcaggaagtg ctggaagaac 600 gcgatgcgct atatcgcgaa gttgcgcata ttatcatcga cgcaacaaac gaacccagcc 660 aggtgatttc tgaaattcgc agcgccctgg cacagacgat caattgttga caatctttag 720 aggagacaca acatggtctt tgtgtctgat tcgtctatct ctttgcccat ttgggatgct 780 ccgcgcgctc gcggccccat agtctcggac ctggctatcc ctggttccaa gtcgatcacc 840 aaccgcgccc tcatcttggc tgcgctcgca tcaactccat ccaccatcat tgatgtcctt 900 cgtagtcgtg ataccgatct catgactgat ggtctacgca gcctcggaat caccattact 960 gaagaggcag tcgatcgcta ccgcgttgag cccggacagt tgtctgctgg ctccgttgag 1020 tgtggtcttg ctggtacggt catgcgcttt ttgcctcctg ttgctgcttt cgctgatggt 1080 cctgttcatt ttgatggcga tcctcaagct cgtgttcgtc cgatgaccag cattttggat 1140 gcgctgcgtt cgcttggtgt ggaggtagac aacaacaatc tgcctttcac tgttaatgct 1200 ggtgaggtcc ctgagggtgg cgtggttgag attgatgctt ccggctcatc tcagtttgtt 1260 tctggtcttt tgctttcagc gcctcgtttt aaaaatggcg tcaccgttaa gcacgtcggt 1320 ggtcgtctgc cgagcatgcc gcatattgag atgaccgtcg atatgcttcg ttccgcaggc 1380 attgagatcg aagagtcaga aaatcagtgg gttgttcatc ctggtgagat cttgggtcgg 1440 acctggcgca ttgagccgga tctttctaat gcgactccgt tcctagctgc cgctgcggtc 1500 actggtggaa ccatcaagat taaccactgg ccaatcaaaa ctactcagcc tggcgatgct 1560 attcgttcga ttcttgagcg catgggctgc gaagttgagc tggttgctca gggtgaaggt 1620 tacgatctgt cggtgactgg tccggttgct ctcaagggca ttgagatcga tatgtccgat 1680 atcggtgagt tgacccctac cgtggcggcg ttggctgcgt tggcgtcgac agagtctcgt 1740 ttgaccggta ttgctcatct tcgtggccat gagacggatc gtttggctgc gttgactgcg 1800 gagatcaaca aacttggtgg aaagtgcact gagcttaagg atggtctgtt gattgagcct 1860 gcgtcgctgc acggtggtgt gtggcattca tatgctgatc accgtatggc tactgctggt 1920 gcgatcattg gcctcgcggt tgatggcgtt caggttgaag acattaagac cacttccaaa 1980 actttccctg gttttgaaaa tgtttgggag gagatggttg gctaggcgaa agtcgtagcc 2040 accacgaagt ccgaaaggag gcccttcaga tgctaggcat gcttcgatgg actacagcag 2100 gtgaatccca cggccaggcg cttatcgcca cggttgaaca catgccagca ggcgtgcccg 2160 tgactaaaga tgaggtctcg tatcaattgg cgcgccgacg ccttggatat ggtcgcggcg 2220 ctcgcatgaa gtttgagcaa gacgcgttga ccttcctcac cggcatccgc cacggcctca 2280 ctttgggtag ccccatctca atcatgatcg gcaacactga gtgggataag tggaccacca 2340 tcatgtcctc tgacgctttg gacatggaag acccagataa cgttgcggcg atgtcttcgg 2400 gtcggggcgc aaaactgact cgtccgcgtc caggccacgc tgattacgca ggcatgctca 2460 agtacggatt cgatgatgcc cgcaacgtgc tggagcgttc ttcagcccgt gagacggcag 2520 cacgcgtggc agcagcaacc gttgcgcgtt ccttcctgcg tgaaaccttg ggcgtggaag 2580 tgctttccca cgtaatttcc attggtgcgt ccgagcctta cactggcgcg gagccaacct 2640 ttgcagatat tcaagcaatc gatgattccc cagttcgtgc atteggtaaa gacgctgaag 2700 aatccatgat cgcggaaatc gaggccgcaa agaaagccgg cgataccctc ggtggcatcg 2760 tggaagtgat tgttgaaggc ctgcccatcg gtttgggctc acacatttct ggcgaagatc 2820 gcctcgatgc gcagatcgca gctgcactca tgggcattca ggccatcaag ggcgtggaaa 2880 tcggtgacgg tttcgaagaa gctcgtcgac gtggctccga agcccacgat gaagtgttcc 2940 tggatgacaa cggcgtatac cgcaacacca accgtgcagg tggcctcgaa ggcggcatga 3000 ccaacggtga aaccctgcgc gttcgtgctg geatgaagee aatttctact gtgcctcgcg 3060 ccctgaaaac cattgatatg gaaaacggca aggcagcaac cggaatccac cagcgttccg 3120 acgtgtgcgc tgttccagcc geeggt gteg ttgeagaage aatggtcacc ctggttctcg 3180 cccgcgcagt cctgcagaaa ttcggcggtg actccctgag cgaaaccaag agcaacattg 3240 acacctacct caaaaacatt gaggaaegaa tgaaattcga aggtttagag gatggagcgt 3300 aa 3302

Sequence Number (ID) : 16

Length : 3539

Molecule Type : DNA Features Location/Qualif iers :

- misc_feature, 1 . . 3539

> note, Expressionskonstrukt

- source, 1 . . 3539

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct Residues : cacagggtag ctggtagttt gaaaatcaac gccgttgccc ttaggattca gtaactggca 60 cattttgtaa tgegetagat ctgtgtgctc agtcttccag getgettate acagtgaaag 120 caaaaccaat tegtggetge gaaagtcgta gccaccacga agtccaggag gacatacatg 180 aaaggaggee cttcagatgt ccaacaccgt gtt cat egge gcaaaggaat acttcccagg 240 catcggcaag at egget t eg aaggeegega ttccgataac ccactggcat tcaaggtgta 300 cgatgcaaac aagcaggtgg caggcaagac catggcagaa cacctgcgct tegeagtgge 360 ataetggeae tccttctgcg gcaacggcgc agatccattc ggcccaggca cccgcgcata 420 cccatgggat gtgggcaaca ccgcactggc aegegeagaa geaaagteeg atgcagcatt 480 egaattette accaagctgg gcgtgccata ctactgcttc cacgatatcg atctggcacc 540 agatgeagat gatateggeg aatacgaaaa caacctgaag cacatggtgg geategeaaa 600 gcagcgccag geagataeeg gegtgaaget gctgtggggc accgcaaacc tgttctccca 660 cccacgctac atgaacggcg catccaccaa cccagatttc aacgtggtgg cacgcgcagc 720 agtgeaggtg aaggcagcaa tcgatgcaac cgtggaactg ggcggcgaaa actacgtgtt 780 ctggggcggc cgcgaaggct acgcatgcct gcacaacacc cagatgaagc gcgaacagga 840 taacatggca cgcttcctga ccctggcacg cgattacggc cgcgcaatcg gcttcaccgg 900 caacttcctg atcgaaccaa agccaatgga accaatgaag caccagtacg atttcgattc 960 cgcaaccgtg atcggcttcc tgcgccagca cggcctggat caggatttca agctgaacat 1020 cgaagcaaac cacgcaaccc tgtccggcca ctccttcgaa cacgatctgc aggtggcatc 1080 cgatgcaggc ctgctgggct ccatcgatgc aaaccgcggc aacccacaga acggctggga 1140 taccgatcag ttcccaaccg atctgtacga taccgtgggc gcaatgctgg tggtgctgcg 1200 ccagggcggc ctggcaccag gcggcctgaa cttcgatgca aaggtgcgcc gcgaatcctc 1260 cgatccacag gatctgttcc tggcacacat cggcggcatg gatgcattcg cacgcggcct 1320 ggaagtggca aacgcactgc tgacctcctc cccactggaa acctggcgcg cacagcgcta 1380 cgcatccttc gattccggcg caggcgcaga tttcgcaaac ggcacctcca ccctggcaga 1440 tctggcaaag tacgcagcag gcaagggcga accaacccag gtgtccggcc gccaggaagc 1500 atacgaaaac ctgatcaacc agtacctgac ccgccacagg gtagctggta gtttgaaaat 1560 caacgccgtt gcccttagga ttcagtaact ggcacatttt gtaatgcgct agatctgtgt 1620 gctcagtctt ccaggctgct tatcacagtg aaagcaaaac caattcgtgg ctgcgaaagt 1680 cgtagccacc acgaagtcca ggaggacata catgaaagga ggcccttcag atggctttgg 1740 ttcttggaat cgatagttcc acccaatcct gcaaggcttt gcttgtcgat gccgccaccg 1800 gccaggttat cgacgaaggc cgcgcgagtc acccgagcgg gtcggaggta gatccacgtg 1860 cgtggatcgc tgcgctggat caagctaccg aggggttgtt agaacgcgcg gacgctgtat 1920 ctattgcagg ccagcagcac ggcatggtgg cgttggatga aaacgatgaa atcgttcgcc 1980 cggcgttgtt atggaatgac actcgttctg cccaggctgc gttggatctc aat gaggaga 2040 tcggcggcga tcaggctgcg gtagatgcca cgggaagtgt gtatgttgct tctttaactg 2100 ccaccaaaat gcggtggatg cgtgatcatg aaccagaaaa tgcagcgcgc acggcgtcgg 2160 tgatgttgcc tcatgatttc ctcacctggc atttgatggg acgcggacgc aaagtcaccg 2220 accatggtga tgcttctgga acgggctact acagcacgcg tgatcgtgcg tggcgcaccg 2280 atctagctgc cttggcgctg ggccatgagg tggaacttcc tgaactcctg gccccaaatg 2340 cgattgcggg aacaactcca ggtggagtga aagttgctgc aggcacggga gataatgctg 2400 cggctgcgct tggccttgat ttgcagcctg gtgatgtcag cgtgtcgatc ggcacctctg 2460 gcgttgccgg catgaccgtt caacatagcg tccacgatcc atctggtttg gtcactggtt 2520 tcgccgatgc cacgggtgcg tatttcccgc tggcctgcac gcttaatggc gcaccggtgt 2580 tggaattcgg ccgccgcatt ctgggcgtgg aatgggaaga gttcgatgcg cttgcactgg 2640

29 ctgctcaacc cggttcaggt ggcgtgacgc tccagcctta tttggagggc gagcgtacgc 2700 cgaatcgtcc cgcagcacgt ggcgttttgg ctggactaaa ctgtgcaacg acccgcgagg 2760 actttgcccg agcaactgtt gaaggcttgt tgttggcatt ggatgatgct gtaacggcgc 2820 tggttgaggc cacgggagtg cccgttcagc gcatccagct catcggtggc ggcgcgcgtt 2880 cacaggcggt tcgtgagatt gcccctgaga ttttcggcca tgagattgtg gttccagaac 2940 ccgctgaata tgtggcgttg ggtgcagctc gtcaggcggc atgggcgctg tcgggtgagg 3000 ccacgccacc gcagtggcca actcccggtt ccgatccgca ccgcgcacct aaaaacactg 3060 agctgagcac gcgttatgcg aagctgcgtg ctgcaacgca gggttggtac tagggctgtt 3120 ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc 3180 tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 3240 actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 3300 ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 3360 atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg 3420 aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg 3480 catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactct 3539

Sequence Number (ID) : 17

Length : 1101

Molecule Type : DNA

Features Location/Qualif iers :

- source, 1 . . 1101

> mol_type, other DNA

> organism, Corynebacterium glutamicum Residues : atgagttctc cagtctcact cgaaaacgcg gcgtcaacca gcaacaagcg cgtcgtggct 60 ttccacgagc tgcctagccc tacagatctc atcgccgcaa acccactgac accaaagcag 120 gcttccaagg tggagcagga tcgccaggac ategetgata tettegetgg cgacgatgac 180 cgcctcgttg tcgttgtggg accttgctca gttcacgatc ctgaagcagc catcgattac 240 gcaaaccgcc tggctccgct ggcaaagcgc cttgatcagg acctcaagat tgtcatgcgc 300 gtgtacttcg agaagcctcg caccatcgtc ggatggaagg gattgatcaa tgatcctcac 360 ctcaacgaaa cctacgacat cccagagggc ttgcgcattg egegeaaagt gcttatcgac 420 gttgtgaacc ttgatctccc agt egget gc gaattcctcg aaccaaacag ccctcagtac 480 tacgccgaca ctgtcgcatg gggagcaatc ggcgctcgta ccaccgaatc tcaggtgcac 540 cgccagctgg cttctgggat gtctatgcca attggtttca agaacggaac tgacggaaac 600 atccaggttg cagtcgacgc ggtacaggct gcccagaacc cacacttctt cttcggaacc 660 tccgacgacg gcgcgctgag egtegtggag accgcaggca acagcaactc ccacatcatt 720 ttgcgcggcg gtacctccgg cccgaatcat gatgcagctt cggtggaggc cgtcgtcgag 780 aagcttggtg aaaacgctcg tctcatgatc gatgcttccc atgctaactc cggcaaggat 840 catatccgac aggttgaggt tgttcgtgaa atcgcagagc agatttctgg cggttctgaa 900 gctgtggctg gaatcatgat tgagtccttc ctcgttggtg gcgcacagaa ccttgatcct 960 gcgaaattgc gcatcaatgg cggtgaaggc ctggtgtacg gacagtctgt gaccgataag 1020 tgcatcgata ttgacaccac catcgatttg ctcgctgagc tggccgcagc agtaagggaa 1080 cgccgagcag cagccaagta a 1101

Sequence Number (ID) : 18

Length : 366

Molecule Type : AA

Features Location/Qualif iers :

- REGION, 1 . . 366

> note, Modifiziertes Enzym

- source, 1 . . 366

> mol_type, protein

> organism, synthetic construct Residues :

MSSPVSLENA ASTSNKRWA FHELPSPTDL IAANPLTPKQ ASKVEQDRQD

IADIFAGDDD 60

RLWWGPCS VHDPEAAIDY ANRLAPLAKR LDQDLKIVMR VYFEKPRTIV

GWKGLINDPH 120

LNETYDIPEG LRIARKVLID WNLDLPVGC EFLNPNSPQY YADTVAWGAI

GARTTESQVH 180

RQLASGMSMP IGFKNGTDGN IQVAVDAVQA AQNPHFFFGT SDDGALSWE

TAGNSNSHII 240

LRGGTSGPNH DAASVEAWE KLGENARLMI DASHANSGKD HIRQVEWRE

IAEQISGGSE 300

AVAGIMIESF LVGGAQNLDP AKLRINGGEG LVYGQSVTDK CIDIDTTIDL

LAELAAAVRE 360 RRAAAK

366

Sequence Number (ID) : 19

Length : 1053

Molecule Type : DNA Features Location/Qualif iers : - source, 1 . . 1053

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct Residues : atgaattatc agaacgacga cctgcgcatc aaagaaatta aagaactgct gcctccggtt 60 gcactgctgg aaaaatttcc ggcaaccgaa aatgcagcaa ataccgttgc acatgcacgt 120 aaagccattc acaaaattct gaaaggtaat gatgatcgcc tgctggttgt tattggtccg 180 tgtagcattc atgatccggt tgccgcaaaa gaatatgcaa cccgtctgct ggcactgcgt 240 gaagaactga aagatgaact ggaaattgtg atgcgcgtgt attttgaaaa accgcgtacc 300 accgttggtt ggaaaggtct gattaatgat ccgcacatgg ataacagctt tcagattaac 360 gatggtctgc gtattgcccg taaactgctg ctggatatta atgatagcgg tctgcctgca 420 gccggtgaat ttctgaatat gattacaccg cagtatctgg ccgatctgat

31 gagctggggt 480 gcaattggtg cacgcaccac cgaaagccag gttcatcgtg aactggcaag cggtctgagc 540 tgtccggttg gctttaaaaa cggcaccgat ggcaccatta aagttgcaat tgatgcaatt 600 aatgcagcgg gtgcaccgca ttgttttctg agcgttacca aatggggtca tagcgcaatt 660 gttaatacca gcggtaatgg tgattgccat attattctgc gtggtggtaa agaaccgaat 720 tattcagcaa aacatgtggc cgaagttaaa gaaggtctga ataaagcagg tctgccagca 780 caggttatga ttgattttag ccatgcaaat agcagcaaac agttcaaaaa acaaatggat 840 gtttgtgccg atgtgtgtca gcagattgcc ggtggtgaaa aagcaattat tggtgttatg 900 gttgaaagcc atctggtgga aggtaatcag agcctggaaa gcggtgaacc gctggcctat 960 ggtaaaagca ttaccgatgc atgtattggt tgggaagata ccgatgccct gctgcgtcag 1020 ctggcaaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

Sequence Number (ID) : 20

Length : 1053

Molecule Type : DNA Features Location/Qualif iers : - source, 1 . . 1053

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct Residues : atgaactacc agaacgatga tctgcgcatc aaagagatca aagaactgct gccaccagtg 60 gcactgctgg aaaagttccc agcaaccgaa aacgcagcaa acaccgtggc acacgcacgc 120 aaggcaatcc acaagatcct gaagggcaac gatgaccgcc tgctcgtggt gatcggtcca 180 tgctccatcc acgatccagt ggcagcaaaa gaatacgcaa cccgcttgct ggcactgcgc 240 gaagaactga aggatgaact ggaaatcgtg atgcgcgtgt acttcgaaaa gccacgcacc 300 accgtcggct ggaagggcct gatcaacgat ccacacatgg ataattcctt ccagatcaac 360 gacggcctgc gcattgcacg caagctgctg ctggacatca acgattccgg tctgccagcc 420 gcaggcgagt tcctggatat gatcacccca cagtacctgg ccgatctgat gtcctggggt 480 gcaatcggtg ctcgcaccac tgaatcccag gtgcaccgcg aactggcatc cggtctgttc 540 tgcccagtgg gcttcaagaa cggcaccgac ggcaccatca aggtggcaat cgatgcaatc 600 aacgcagcag gcgcaccaca ctgctttctg tccgtgacca agtggggtca ctccgcaatc 660 gtgaacacct ccggcaacgg cgactgccac atcatccttc gcggtggcaa agaaccaaac 720 tactccgcaa agcacgtggc agaagtgaaa gaaggcctga acaaggctgg cctgccagca 780 caggtgatga tcgatttctc ccacgcaaac tcctccaagc agttcaaaaa gcagatggat 840 gtgtgcgcag atgtgtgcca gcagatcgca ggcggtgaaa aggcaatcat cggcgtgatg 900 gtggaatccc acctggtgga aggcaaccag tccttggaat ccggtgaacc actggcatac 960 ggcaagtcca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgcact

32 gctgcgccag 1020 ctcgcaaacg cagtgaaggc acgccgtggc taa 1053 END

33

Claims

Patentansprüche

1. Rekombinante Zelle des Genus Corynebacterium enthaltend ein Gen, das für eine DAHP- Synthase wie in SEQ ID NO. 11 definiert oder eine Variante davon kodiert, mit der Maßgabe, dass in der Variante der DAHP-Synthase die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben.

2. Die rekombinante Zelle gemäß Anspruch 1, wobei in der Variante der durch SEQ ID NO. 11 definierten DAHP-Synthase zusätzlich die Positionen 10, 13, 147, 148, 150, 151, 179, 209, 211 und 212 unverändert bleiben.

3 Die rekombinante Zelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich um C. glutamicum handelt.

4. Die rekombinante Zelle gemäß eines der Ansprüche 1 bis 3, zusätzlich gekennzeichnet durch

(i) Eine gegenüber dem jeweiligen Wildtyp reduzierte Aktivität der Anthranilat- Phosphoribosyltransferase, wobei aber eine Restaktivität vorhanden sein muss; und

(ii) optional die Deletion oder Inaktivierung des Gens, das für die Phosphoenolpyruvat- Carboxylase wie in SEQ ID NO. 4 definiert kodiert.

5. Verwendung einer rekombinanten Zelle enthaltend ein Gen, das für eine DAHP-Synthase wie in SEQ ID NO. 11 definiert oder eine Variante davon kodiert mit der Maßgabe, dass in der Variante der DAHP-Synthase die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben, zur Herstellung wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oAB, 3- Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat, 3-Dehydrochinat, 3-Dehydroshikimat, Shikimat, Shikimat-3-Phosphat, Chorismat, Prephenat, Methylanthranilsäure, para-Aminobenzoesäure, Vanillin, Indol, Indoxyl, Indigo, Mandelsäure, Ferulasäure und Zimtsäure durch eine mikrobielle Fermentation.

6. Die Verwendung nach Anspruch 5, wobei die mikrobielle Zelle ein Corynebacterium sp. ist.

7. Die Verwendung der rekombinanten Zelle nach Anspruch 5 oder 6, wobei die rekombinante Zelle sich vom Wildtyp des betreffenden Mikroorganismus zusätzlich durch folgende Merkmale unterscheidet:

(i) Eine gegenüber dem jeweiligen Wildtyp reduzierte Aktivität der Anthranilat- Phosphoribosyltransferase, wobei aber eine Restaktivät vorhanden sein muss; und (ii) Deletion oder Inaktivierung des Gens, das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase wie in SEQ ID NO. 4 definiert kodiert. Verwendung einer 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase (DAHP-Synthase) mit einer Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID NO. 11 definiert oder einer Variante davon zur Herstellung von ortho-Aminobenzoesäure (oAB) durch eine mikrobielle Fermentation, mit der Maßgabe, dass in der Variante der DAHP-Synthase die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben. Verfahren enthaltend die Schritte a) Bereitstellung einer wenigstens einer rekombinanten mikrobiellen Zelle enthaltend ein Gen, das für eine DAHP-Synthase wie in SEQ ID NO. 11 definiert oder eine Variante davon kodiert mit der Maßgabe, dass in der Variante der DAHP-Synthase die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben; b) Kultivierung der wenigstens einen rekombinanten mikrobiellen Zelle in einem Nährmedium, das wenigstens eine fermentierbare Kohlenstoffquelle enthält, wobei oAB produziert wird. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei in Verfahrensschritt b) im Nährmedium eine Konzentration der besagten Verbindung von wenigstens 1 g/L erreicht wird. Zusammensetzung enthaltend a) wenigstens eine rekombinante mikrobielle Zelle enthaltend ein Gen, das für eine DAHP-Synthase wie in SEQ ID NO. 11 oder eine Variante davon definiert kodiert mit der Maßgabe, dass in der Variante der DAHP-Synthase die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben; b) wenigstens eine fermentierbare Kohlenstoffquelle; und c) wenigstens eine Stickstoffquelle, wenigstens eine Phosphorquelle, wenigstens eine Schwefelquelle und Spurenelemente. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, zusätzlich enthaltend wenigstens eine Verbidung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oAB, 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat, 3- Dehydrochinat, 3-Dehydroshikimat, Shikimat, Shikimat-3-Phosphat, Chorismat, Prephenat, Methylanthranilsäure, para-Aminobenzoesäure, Vanillin, Indol, Indoxyl, Indigo, Mandelsäure, Ferulasäure und Zimtsäure.

13. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei die Konzentration der besagten Verbindung wenigstens 1 g/L beträgt.