EP4247875A1 - Funktionalisierte polyglycin-poly(alkylenimin)-copolymere, deren herstellung und verwendung zur herstellung von wirkstoff- und effektstoff-formulierungen - Google Patents

Funktionalisierte polyglycin-poly(alkylenimin)-copolymere, deren herstellung und verwendung zur herstellung von wirkstoff- und effektstoff-formulierungen

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Publication number
EP4247875A1
EP4247875A1 EP21815365.8A EP21815365A EP4247875A1 EP 4247875 A1 EP4247875 A1 EP 4247875A1 EP 21815365 A EP21815365 A EP 21815365A EP 4247875 A1 EP4247875 A1 EP 4247875A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
formula
chr
structural units
poly
mol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21815365.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christine Weber
Natalie GÖPPERT
Ulrich S. Schubert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ngp Polymers GmbH
Original Assignee
Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU filed Critical Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Publication of EP4247875A1 publication Critical patent/EP4247875A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/04—Preparatory processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0233—Polyamines derived from (poly)oxazolines, (poly)oxazines or having pendant acyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
    • C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to new copolymers which can be described as functionalized polyglycine-polyalkyleneimine copolymers and which are distinguished by very good degradability.
  • the invention relates to the preparation and processing of these copolymers by oxidation of polyalkyleneimines followed by functionalization of NH groups in the partially oxidized polymer backbone. These copolymers can be used in particular for the production of active substance and effect substance formulations.
  • Biocompatible polymers represent highly attractive materials for biomedical applications such as drug delivery.
  • Poly(ethylene glycol) (PEG) is currently the most commonly used polymer for such purposes. Due to its high hydrophilicity and so-called “cloaking behavior” it elicits little immune response in the body and thus increases the drug's blood circulation time.
  • PEG has several disadvantages, namely the formation of toxic by-products, sequestration in organs, and the stimulation of anti-PEG antibodies.
  • PAOx Poly(2-n-alkyl-2-oxazolines) with short side chains show similar hydrophilicity, biocompatibility and "cloaking behavior" and therefore appear to be promising candidates as a replacement for PEG, which is further demonstrated in a detailed comparison of their solution behavior was confirmed (cf. Grube, M.; Leiske, MN; Schubert, US; Nischang, I. POx as an alternative to PEG? A hydrodynamic and light scattering study. Macromolecules 2018, 51, 1905-1916). In contrast to PEG, PAOx also exhibit higher structural versatility due to their side-chain modifiability.
  • PAOx with longer side chains are hydrophobic and can be used to make amphiphilic copolymers, low surface energy materials or low adhesion coatings. Thermal and crystalline properties can also be tuned by variations in the PAOx side chains (compare Hoogenboom, R.; Fijten, M.W.M.; Thijs, H.M.L.; van Lankvelt, B.
  • a strategy to solve the problem could be to incorporate hydrolytically sensitive groups into the polymer backbone, such as ester or amide moieties. These can be hydrolyzed under, for example, acidic or enzymatic conditions, which could lead to degradation of the entire polymer.
  • hydrolytically sensitive groups such as ester or amide moieties. These can be hydrolyzed under, for example, acidic or enzymatic conditions, which could lead to degradation of the entire polymer.
  • ester groups into the PAOx backbone.
  • the object of the present invention is therefore to provide new functionalized copolymers with improved degradability.
  • Another object of the present invention is to provide a simple method for preparing these functionalized copolymers.
  • R 1 is a radical of the formula -CO-R 2 , of the formula -CO-NH-R 2 or of the formula -CH 2 -CH(OH)-R 12 ,
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are independently hydrogen, methyl, ethyl, propyl or butyl,
  • R 2 is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, aralkyl, -C m H 2 mX or -(C n H 2n -O)o-(CpH 2p -O)q R 6 , R 6 is hydrogen or is Ci -Ce-alkyl,
  • R 12 is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, alkenyl, cycloalkyl, aryl or aralkyl,
  • X is selected from the group consisting of hydroxyl, alkoxy, carboxyl, carboxylic acid ester, sulfuric acid ester, sulfonic acid ester or carbamic acid ester, m is an integer from 1 to 18, n and p are independently integers from 2 to 4, where n is not equal to p , and o and q are independently integers from 0 to 60, where at least one of o or q is not equal to 0, the percentages referring to the total amount of structural units of formula (I), (II) and (III) or of formula ( IV), (V) and (VI) are related.
  • copolymers can be prepared starting from readily available poly(alkyleneimines).
  • the invention therefore also relates, in a first variant, to a process for preparing these copolymers with the measures i) reacting a polyalkyleneimine which contains recurring structural units of the formula (Ia) or the formula (IVa), preferably in an amount of at least 90 mol %, with an oxidizing agent, whereby a copolymer containing the structural units of the formula (Ia) and the formula (II) or containing the structural units of the formula (IVa) and the formula (V) is obtained
  • the invention relates to a process for the production of these copolymers with the measures iii) partial hydrolysis of a polyoxazoline containing recurring structural units of the formula (I) or of a polyoxazine containing recurring structural units of the formula (IV)
  • degradable, functionalized polyglycine-polyalkyleneimine copolymers having amide bonds integrated into the polymer backbone can be prepared via a simple synthetic route.
  • polyalkyleneimines can be partially oxidized and the resulting product functionalized via reaction with an epoxide, an isocyanate, or an activated acyl derivative such as an activated ester or an acyl halide.
  • polyoxazolines or polyoxazines can be partially hydrolyzed, resulting in polyalkyleneimine units, which can be oxidized in whole or in part in a subsequent step.
  • Polyalkyleneimines used in the first variant of the process according to the invention usually contain at least 90 mol % of recurring structural units of the formula (Ia) or of the formula (IVa) and are commercially available or can be obtained by hydrolysis of poly(2-oxazolines) substituted in the 2-position ( POx), in particular from PEtOx, or from poly(2-oxazines) substituted in the 2-position.
  • the starting materials used for the hydrolysis are usually POx which contain at least 20 mol %, preferably at least 50 mol %, of repeating structural units derived from 2-oxazoline in the polymer. While commercially available polyalkyleneimines are branched, linear polyalkyleneimines are obtained by the hydrolysis of POx.
  • hydrolysis of polyoxazolines or polyoxazines can also take place partially and leads to copolymers which contain recurring structural units of the formulas (I) and (III) or which contain recurring structural units of the formulas (IV) and (VI). These copolymers can be oxidized, leading directly to the copolymers of this invention. In this variant of the process, there is usually no reacylation.
  • a preferred simple synthetic route for the post-polymerization proceeds via the consecutive hydrolysis of poly(2-ethyl-2-oxazoline) (PEtOx), a partial oxidation and reacylation.
  • PEtOx poly(2-ethyl-2-oxazoline)
  • CROP cationic ring-opening polymerization
  • PEI linear poly(ethyleneimine)
  • PEI is disadvantageous because of its cytotoxicity and, like PEtOx, its non-degradability.
  • Englert et al. reported the controlled oxidation of linear PEI with Hydrogen peroxide to increase degradability by incorporating amide groups into the PEI backbone (cf. Enhancing the biocompatibility and biodegradability of linear poly(ethylene imine) through controlled oxidation; Macromolecules 2015, 48, 7420-7427).
  • the resulting structure corresponds to the repeating unit of poly(glycine) and hence the polymer can be considered poly(ethyleneimine-co-glycine) (referred to herein as oxPEI). Due to its additional hydrolytically sensitive amide groups, the polymer not only showed increased degradability, but also improved biocompatibility compared to the otherwise cytotoxic PEI.
  • oxPEI was functionalized with a subsequent reacylation step or by reaction with isocyanates or with epoxides. Accordingly, the homologous polypropyleneimine (PPI) can also be used instead of PEI.
  • PPI polypropyleneimine
  • acylating reagents such as acyl halides
  • dPAOx poly(2-n-alkyl-2-oxazoline-staf-glycines)
  • the amount of acyl derivative of the formula (VII) or of isocyanate of the formula (VIII) or of epoxide of the formula (IX) should be chosen so that the proportion of structural units of the formula (III) or of the formula (VI ) in the resulting copolymer is between 0 and 20 mol%.
  • copolymers are to be understood as meaning the abovementioned organic compounds which are characterized by the repetition of certain units (monomer units or repeating units).
  • the copolymers according to the invention consist of at least two types of different repeating units. Polymers are produced through the chemical reaction of monomers with the formation of covalent bonds (polymerization) and form the so-called polymer backbone by linking the polymerized units. This can have side chains on which functional groups can be located. Copolymers according to the invention consist of at least two different monomer units, which can be arranged randomly, as a gradient, alternately or as a block. If some of the copolymers have hydrophobic properties, they can form nanoscale structures (e.g. nanoparticles, micelles, vesicles) in an aqueous environment.
  • nanoscale structures e.g. nanoparticles, micelles, vesicles
  • water-soluble compounds or “water-soluble copolymers” are to be understood as meaning compounds or copolymers which dissolve in at least 1 g/L of water at 25°C.
  • active substances are to be understood as meaning compounds or mixtures of compounds which act on a living organism exert a desired effect.
  • This can be, for example, active pharmaceutical ingredients or agrochemical active ingredients.
  • Active ingredients can be low or high molecular weight organic compounds.
  • the active ingredients are preferably low-molecular pharmaceutically active substances or higher-molecular pharmaceutically active substances, for example from potentially usable proteins, such as antibodies, interferons, cytokines.
  • pharmaceutically active substance means any inorganic or organic molecule, substance or compound which has a pharmacological effect.
  • active pharmaceutical ingredient is used herein synonymously with the term “drug”.
  • effect substances are to be understood as meaning compounds or mixtures of compounds which are added to a formulation in order to impart certain additional properties to it and/or to facilitate its processing.
  • effect substances and “auxiliaries and additives” are used synonymously in this description.
  • auxiliaries and additives are substances that are added to a formulation in order to impart certain additional properties to it and/or to facilitate its processing.
  • auxiliaries and additives are tracers, contrast media, carriers, fillers, pigments, dyes, perfumes, lubricants, UV stabilizers, antioxidants or surfactants.
  • excipients and additives means any pharmacologically tolerable and therapeutically useful substance that is not a pharmaceutical active substance but can be formulated together with a pharmaceutical active substance in a pharmaceutical composition in order to influence the qualitative properties of the pharmaceutical composition, in particular to to enhance.
  • the auxiliaries and/or additives preferably develop none or with regard to the intended Treatment no appreciable or at least no undesired pharmacological effect.
  • polymer particles are to be understood as meaning copolymers according to the invention which are present in particle form and which may also contain other ingredients.
  • the particles may be in liquid form dispersed in a hydrophilic liquid, or the particles may be in solid form, either dispersed in a hydrophilic liquid or in the form of a powder.
  • the size of the particles can be determined by visual methods, for example by microscopy; for particle sizes in the nano range, light scattering or electron microscopy can be used.
  • the shape of the polymer particles can be arbitrary, for example spherical, ellipsoidal or irregular.
  • the polymer particles can also form aggregates of several primary particles.
  • the particles of copolymers according to the invention are preferably in the form of nanoparticles.
  • the particles can also contain other components, for example active ingredients or auxiliaries or additives.
  • Nanoparticles are to be understood as meaning particles whose diameter is less than 1 ⁇ m and which can be composed of one or more molecules. They are generally characterized by a very high surface-to-volume ratio and thus offer very high chemical reactivity. Nanoparticles can consist of copolymers according to the invention or contain other components in addition to these copolymers, such as active ingredients or auxiliaries or additives.
  • the copolymers according to the invention can be in the form of linear polymers or they can also be branched copolymers.
  • Linear copolymers are formed, for example, by consecutive hydrolysis of PEtOx, followed by partial oxidation to oxPEI and reacylation to dPAOx.
  • Branched Copolymers arise for example by partial oxidation of commercially available PEI, which is known to be branched, to oxPEI followed by re-functionalization, eg by reacylation to dPAOx.
  • solubility of the copolymers according to the invention can be influenced by copolymerization with suitable monomers and/or by functionalization. Such techniques are known to those skilled in the art
  • the copolymers according to the invention can cover a wide molar mass range.
  • Typical molar masses (M n ) range from 1000 to 500 000 g/mol, in particular from 1000 to 50 000 g/mol. These molar masses can be determined by 1 H NMR spectroscopy of the dissolved polymer.
  • an analytical ultracentrifuge or chromatographic methods such as size exclusion chromatography, can be used to determine the molar masses.
  • Preferred copolymers according to the invention have an average molar mass (number average) in the range from 1000 to 50 000 g/mol, in particular from 3000 to 10 000 g/mol, determined by 1 H-NMR spectroscopy or by using an analytical ultracentrifuge. These are preferably linear copolymers. Branched copolymers according to the invention preferably have a higher average molar mass, for example an M n in the range from 50,000 to 500,000 g/mol, in particular from 80,000 to 200,000 g/mol.
  • the molar proportion of structural units of the formula (I) in the copolymers according to the invention is 10 to 95 mol%, preferably 20 to 90 mol% and in particular 30 to 70 mol%, based on the total amount of structural units of the formulas (I), (II) and (III).
  • the molar proportion of structural units of the formula (II) in the copolymers according to the invention is 5 to 90 mol %, preferably 10 to 80 mol % in particular 30 to 70 mol %, based on the total amount of structural units of the formulas (I), (II) and (III).
  • the molar proportion of structural units of the formula (III) in the copolymers according to the invention is 0 to 20 mol %, preferably 0 to 10 mol %, based on the total amount of structural units of the formulas (I), (II) and (III).
  • the molar proportion of structural units of the formula (IV) in the copolymers according to the invention is 10 to 95 mol%, preferably 20 to 90 mol% and in particular 30 to 70 mol%, based on the total amount of structural units of the formulas (IV), (V) and (VI).
  • the molar proportion of structural units of the formula (V) in the copolymers according to the invention is 5 to 90 mol%, preferably 10 to 80 mol% and in particular 30 to 70 mol%, based on the total amount of structural units of the formulas (IV), (V) and (VI).
  • the molar proportion of structural units of the formula (VI) in the copolymers according to the invention is 0 to 20 mol %, preferably 0 to 10 mol %, based on the total amount of structural units of the formulas (IV), (V) and (VI).
  • R 1 is a radical of the formula -CO-R 2 or of the formula -CO-NH-R 2 or of the formula -CH 2 -CH(OH)-R 12 , preferably a radical of the formula -CO-R 2 .
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 independently of one another are hydrogen, methyl, ethyl, propyl or butyl, preferably hydrogen, methyl or ethyl and in particular hydrogen.
  • R 2 is hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, aralkyl, -C m H2m-X or - (C n H 2n -O) 0 - (C p H 2 pO) qR 6 , preferably hydrogen, CiC-is-alkyl, Cyclohexyl or phenyl, in particular Ci-C 18 -alkyl, and very particularly Ci-Cu-alkyl.
  • R 6 is hydrogen or Ci -Ce-alkyl, preferably hydrogen or methyl
  • R 12 is hydrogen, alkyl, alkenyl, cycloalkyl, aryl or aralkyl, preferably hydrogen, CrCis-alkyl, C2- Ci8 -alkenyl, cyclohexyl or phenyl, in particular hydrogen, Ci- Cß -alkyl or C2-C3-alkenyl.
  • m is an integer from 1 to 18, preferably from 2 to 12.
  • X is hydroxyl, alkoxy, carboxyl, carboxylic acid ester, sulfuric acid ester, sulfonic acid ester or carbamic acid ester, preferably hydroxyl or alkoxy
  • n and p are independently integers from 2 to 4, where n is not equal to p.
  • n is 2 and p is 3.
  • o and q are independently integers from 0 to 60, at least one of o or q being non-zero.
  • o and q are independently 1 to 40, especially 2 to 10.
  • the radicals R 2 and R 12 can be alkyl. These are usually alkyl groups with one to twenty carbon atoms, which can be straight-chain or branched. Examples are methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl or eicosyl. Methyl, ethyl and propyl are particularly preferred.
  • R 12 can be alkenyl. These are usually alkenyl groups with two to twenty carbon atoms, which can be straight-chain or branched. The double bond can be in any position in the chain, but is preferably in the alpha position.
  • alkenyl radicals are vinyl, allyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, heptenyl, octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tridecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, nonadecenyl or eicosenyl. Vinyl and allyl are particularly preferred.
  • the radicals R 2 and R 12 can mean cycloalkyl. These are usually cycloalkyl groups with five to six ring carbon atoms. Cyclohexyl is particularly preferred.
  • the radicals R 2 and R 12 can mean aryl. These are usually aromatic hydrocarbon radicals with five to ten ring carbon atoms. Phenyl is preferred.
  • the radicals R 2 and R 12 can mean aralkyl. These are usually aryl groups linked to the rest of the molecule via an alkylene group. Benzyl is preferred.
  • Radical X can mean alkoxy. These are usually Ci-Cß-alkoxy groups. Preference is given to ethoxy and in particular methoxy.
  • Radical X can be a carboxylic ester (-COOR), sulfonic ester (-SO 3 R), sulfuric ester (-SO4R) or carbamic ester (-NR'COOR or -OCONRR) (R and R' are each monovalent organic radicals).
  • R and R' are usually esters of carboxylic, sulfonic, sulfuric or carbamic acids with aliphatic alcohols, in particular with aliphatic Ci-C 6 alcohols. Ethyl and especially methyl esters are preferred.
  • Copolymers which contain 20 to 90 mol % of structural units of the formula (I), 10 to 80 mol % of structural units of the formula (II) and 0 to 20 mol % of structural units of the formula (III).
  • copolymers wherein R 1 is a radical of the formula -CO-R 2 .
  • copolymers in which R.sup.2 is C.sub.3 -C.sub.18 -alkyl , in particular C7-C.sub.12 -alkyl.
  • R 2 is Ci-Ci 8 -alkyl and R 3 , R 4 , R 5 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are hydrogen.
  • copolymers are preferred in which R 6 is hydrogen or methyl.
  • R 2 is Ci-Ci 8 -alkyl, cycloalkyl or phenyl.
  • Particularly preferred copolymers are water soluble.
  • the copolymers according to the invention can consist of the structural units of the formulas (I), (II) and, if appropriate, (III) or of the structural units of the formulas (IV), (V) and, if appropriate, (VI), or can also contain other structural units which are derived of monomers which can be copolymerized with monomers used in the preparation of polyalkyleneimines or polyoxazolines.
  • the proportion of such further structural units, based on the total mass of the copolymer, is generally up to 25 mol %.
  • These further structural units can be randomly distributed or arranged in the form of blocks in the copolymer.
  • Preferred copolymers according to the invention are characterized in that they contain at least 90 mol %, in particular at least 95 mol %, based on their total mass, of structural units of the formula (I), the formula (II) and optionally of the formula (III) or of the formula (IV), of the formula (V) and optionally of the formula (VI).
  • copolymers according to the invention have end groups which typically arise in the preparation of poly(oxazolines) or of poly(alkyleneimines). These end groups can be modified by functionalization. The techniques required for this are known to those skilled in the art.
  • Copolymers according to the invention can be covalently linked to other active ingredients or effect substances via the end groups.
  • the copolymers according to the invention can be prepared by partial oxidation of polyalkyleneimines and by re-functionalization of the oxidized product by reaction with an epoxide, isocyanate or an activated acyl derivative, in particular with an activated ester or acyl halide.
  • the oxidation is preferably carried out in solution, in particular in an aqueous or alcoholic-aqueous solution.
  • Oxidizing agents known per se can be used as the oxidizing agent. Examples are per-compounds, hypochlorites, chlorine or oxygen, especially hydrogen peroxide.
  • Per compounds are preferably used. Examples of this are hydrogen peroxide, peracids, organic peroxides or organic hydroperoxides, in particular hydrogen peroxide.
  • step i) Preference is given to processes in which the oxidizing agent used in step i) is hydrogen peroxide.
  • the amount of oxidizing agent is chosen so that the desired proportion of oxidized structural units is formed in the polymer backbone.
  • the reaction temperature is generally between 10 and 80°C, in particular in the range from 20 to 40°C.
  • the oxidation reaction time is generally between 5 minutes and 5 days.
  • the oxidized product is refunctionalized by reaction with an acyl derivative of formula (VII) described above, or with an isocyanate of formula (VIII) described above, or with an epoxide of formula (IX) described above.
  • acyl derivatives are acyl halides, carboxylic acid anhydrides or carboxylic acids activated by means of known coupling agents, for example N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester), dicyclohexylcarbodiimide ester (DCC ester) or 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide ester (EDC ester).
  • NHS ester N-hydroxysuccinimide ester
  • DCC ester dicyclohexylcarbodiimide ester
  • EDC ester 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide ester
  • isocyanates are monoalkyl isocyanates such as methane isocyanate or ethane isocyanate, cyclohexyl isocyanate or phenyl isocyanate.
  • Suitable epoxides are ethylene oxide, propylene oxide, 1,2-epoxybut-3-ene or 1,2-epoxypent-4-ene.
  • the reaction temperature is generally between 10 and 80°C, in particular in the range from 20 to 40°C.
  • the reaction time for the refunctionalization is generally between 5 minutes and 5 days, in particular between 12 and 48 hours.
  • the poly(alkylenimines) used are preferably copolymers which have been obtained by alkaline or, in particular, by acidic hydrolysis of poly(2-oxazolines), in particular of poly(2-alkyl-2-oxazolines). These copolymers are linear and are used as well-defined starting materials derived from polymers that can be obtained by CROP of commercially available monomers.
  • Poly(oxazolines) are known compounds. These are usually prepared by cationic ring-opening polymerization of 2-oxazolines in solution and in the presence of an initiator.
  • initiators are electrophiles such as esters of aromatic sulfonic acids, salts or esters of aliphatic sulfonic acids or carboxylic acids, or aromatic halogen compounds. Multifunctional electrophiles can also be used as initiators.
  • branched or star-shaped molecules can also form.
  • preferred initiators are esters of arylsulfonic acids, such as methyl tosylate, esters of alkanesulfonic acids, such as methyl triflate, or mono- or dibromomethylbenzene.
  • the polymerisation is usually carried out in a polar aprotic solvent, for example in acetonitrile.
  • 2-oxazines can also be used to prepare homologous poly(oxazines).
  • the hydrolysis of poly(oxazolines) is preferably carried out in solution, in particular in an aqueous or alcoholic-aqueous solution.
  • Inorganic or organic acids can be used as acids.
  • Mineral acids are preferably used.
  • hydrochloric acid, sulfuric acid or nitric acid preferably hydrochloric acid.
  • suitable bases are alkali metal hydroxides, such as sodium hydroxide or potassium hydroxide.
  • the reaction temperature is generally between 20 and 180°C, in particular in the range from 70 to 130°C.
  • the hydrolysis reaction time is generally between 5 minutes and 24 hours.
  • the polyalkyleneimine used in step i) is obtained by hydrolysis, in particular by acidic hydrolysis, of a poly(oxazoline).
  • the copolymers according to the invention can be used to produce formulations which contain pharmaceutical or agrochemical active substances.
  • the copolymers according to the invention can be water-soluble or non-water-soluble.
  • Copolymers functionalized with formyl, acetyl, propionyl or butionyl groups are generally water soluble.
  • Copoylmers functionalized with longer AIkanoyl chains are not water-soluble.
  • Water-insoluble copolymers according to the invention can be present in dispersed form in hydrophilic liquids, for example as emulsions or as suspensions.
  • copolymers according to the invention are preferably in the form of particles, in particular in the form of nanoparticles.
  • the invention therefore also relates to particles, in particular nanoparticles, containing the copolymers described above.
  • Particles which contain one or more pharmaceutical or agrochemical active ingredients are very particularly preferred.
  • particularly preferred particles contain at least one active pharmaceutical ingredient and suitable auxiliaries and additives.
  • the particles can be present as a powder in solid form or they can be present in dispersed form in hydrophilic solvents, the particles being present in the dispersing medium in liquid form or, in particular, in solid form.
  • the particles preferably form a disperse phase in a liquid containing water and/or water-miscible compounds.
  • the proportion of particles in a dispersion can cover a wide range.
  • the proportion of particles in the dispersion medium is 0.5 to 20% by weight, preferably 1 to 5% by weight.
  • the particles according to the invention can be produced by precipitation, preferably by nanoprecipitation.
  • the copolymers according to the invention which are little or not hydrophilic due to the presence of hydrophobic groups, are dissolved in a water-miscible solvent, such as acetone. This solution is dropped into a hydrophilic dispersing medium. This is preferably done with vigorous stirring. This can promote the production of smaller particles.
  • the copolymer is deposited in the dispersing medium in finely divided form.
  • the particles according to the invention can also be produced by emulsification, preferably by nanoemulsion.
  • the copolymers according to the invention which are little or not hydrophilic due to the presence of hydrophobic groups, are dissolved in a water-immiscible solvent, such as dichloromethane or ethyl acetate. This solution is combined with a hydrophilic dispersing medium, as a result of which two liquid phases are preferably formed. This mixture is then emulsified by energy input, preferably by exposure to ultrasound.
  • one or more active ingredients and/or one or more auxiliaries and additives can be present when it is dispersed in the dispersing medium.
  • these active substances and/or auxiliary and additives are added after dispersing the copolymer in the hydrophilic liquid.
  • the polymer particles can be separated from the hydrophilic liquid in different ways. Examples are centrifugation, ultrafiltration or dialysis.
  • the polymer dispersion produced according to the invention can be further purified after production. Common methods include cleaning by dialysis, by ultrafiltration, by filtration or by centrifugation.
  • Aqueous hydrogen peroxide solution (30% w/w) was obtained from Carl Roth.
  • Acetyl chloride (ca. 90%) was purchased from Merck Schuchardt.
  • Propionyl chloride (>98.0%), n-Butyryl chloride (>98.0%), Valeroyl chloride (>98.0%), n-Hexanoyl chloride (>98.0%), n-Heptanoyl chloride (>98.0%) , n-octanoyl chloride (>99.0%) and n-nonanoyl chloride (>95.0%) were purchased from Tokyo Chemical Industry (TCI). Amberlite IRA-67 was obtained from Merck and was washed several times with deionized water before use.
  • N,N-dimethylformamide (DMF) and acetonitrile were dried in a solvent purification system (MB-SPS-800 from M Braun).
  • Phosphate buffered saline (PBS) was obtained from Biowest. taking measurements
  • Proton ( 1 H) nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were measured on a Bruker AC 300 MHz and a Bruker AC 400 MHz spectrometer, respectively.
  • Correlation Spectroscopic (COSY) NMR, Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopic (HSQC) NMR, Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) NMR spectra and DOSY NMR spectra were recorded on a Bruker AC 400 MHz spectrometer. Measurements were performed at room temperature using either D 2 O, d4-methanol or deuterated chloroform as solvent. Chemical shifts ( ⁇ ) are reported in parts per million (ppm) relative to the residual non-deuterated solvent resonance signal.
  • Infrared (IR) spectroscopy was performed on a Shimadzu I RAffinity-1 CE system equipped with a Quest ATR single-reflective diamond crystal ATR cuvette for extended range measurement.
  • Size exclusion chromatography was performed with two different setups. Measurements in N,N-dimethylacetamide (DMAc) were performed using an Agilent 1200 series system equipped with a PSS degasser, G1310A pump, G1329A autosampler, Techlab oven, G1362A refractive index detector ( RID) and a PSS GRAM-guard/30/1000 ⁇ column (10 pm particle size). DMAc with 0.21% by weight LiCl was used as the eluent. The flow rate was 1 ml min'1 and the oven temperature was 40°C. Polystyrene (PS) standards from 400 to 1,000,000 g mol' 1 were used for the calculation of molar masses.
  • PS Polystyrene
  • Measurements in chloroform were performed using a Shimadzu system (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) equipped with an SCL-10A VP system controller, a SIL-10AD VP autosampler, an LC-10AD VP pump, an RID -10A RI detector, a CTO-10A VP oven and a PSS SDV guard/lin S column (5mm particle size).
  • a mixture of chloroform/isopropanol/triethylamine (94/2/4 vol%) was used as eluent.
  • the flow rate was 1 ml min' 1 and the Oven temperature was 40°C.
  • PS standards from 400 to 100,000 g mol" 1 were used to calibrate the system.
  • thermogravimetric analysis was carried out using a Netzsch TG 209 F1 Iris from 20 to 580° C. at a heating rate of 20 K min' 1 under an N 2 atmosphere.
  • Decomposition temperatures were determined at 95% of the original mass.
  • DSC Differential scanning calorimetry
  • PEtOx was synthesized by cationic ring-opening polymerization (CROP) of EtOx.
  • CROP cationic ring-opening polymerization
  • MeOTs 124 g, 0.665 mol
  • EtOx 3965 g, 40.00 mol, 60.2 equiv
  • MeCN dry MeCN
  • PEtOx (80.0 g, 12.5 mmol) was dissolved in aqueous hydrochloric acid (6 M, 600 mL) and heated at 90 °C for 24 h. Volatiles were removed under reduced pressure and the residue was dissolved in deionized water (1600 mL). Aqueous NaOH (3 M, 300 mL) was added in portions to reach pH 10, resulting in precipitation of the polymer. The polymer was then filtered off and purified by recrystallization from water (800ml). PEI was obtained as a white solid (yield: 47.5 g)
  • oxPEI The synthesis of oxPEI was carried out using a method adapted from Englert et al. carried out (Englert, C.; Hart Kunststoff, M.; Bellstedt, P.; Kempe, K.; Yang, C.; Chu, SK; Ke, X.; Garcia, JM; Ono, RJ; Fevre, M.; Wojtecki, RJ; Schubert, US; Yang, YY; Hedrick, JL Enhancing the biocompatibility and biodegradability of linear poly(ethylene imine) through controlled oxidation. Macromolecules 2015, 48, 7420-7427).
  • PEI (45.0 g, 17.0 mmol) was dissolved in methanol (1100 mL) with stirring and aqueous hydrogen peroxide solution (72 mL, 30% w/w, 0.7 equiv per amine unit) was added dropwise. After stirring at room temperature for 3 days, the solvent was removed under reduced pressure and the product dried in vacuo at room temperature for 7 days and at 70°C for 1 day. oxPEI was recovered as a brown solid (yield: 29.1 g).
  • the degree of hydrolysis DH was calculated according to equation (1) from the integrals of the 1 H NMR spectra of PEI.
  • D is the integral of the methylene groups of the ethyleneimine units and A is the integral of the methyl groups of the remaining EtOx units.
  • the degree of oxidation DO was calculated from the integrals of the polymer backbone signals of the 1 H NMR spectra of oxPEI according to Equation (2).
  • F is the integral of the methylene group of the glycine units
  • A is the integral of the methyl groups of the remaining EtOx units
  • D is the integral of the methylene groups of the ethyleneimine units.
  • Titrations to determine the residual amino groups were performed using an automated Metrohm OMNIS titrator equipped with a Metrohm Ecotrode plus pH electrode. All measurements were performed in a dynamic titration mode that adjusted the titration speed to the change in pH during the titration. A typical measurement was performed as follows: The polymer was dissolved in deionized water to give a 10 mL polymer solution with a concentration of 1 mg mL' 1 . The polymer solution was acidified to reach a pH of 2 by adding a concentrated aqueous HCl solution dropwise. The solution was then titrated to pH 12 against 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution while stirring. The equivalence points were determined from the first derivative of the titration curve.
  • dPMeOx (20 mg) and proteinase K (10 mg) were dissolved in PBS buffer solution and incubated at 37° C. for 30 days. Then the water was removed under reduced pressure. Both products were analyzed by NMR spectroscopy.
  • Preparation example H1 Synthesis of poly(2-methyl-2-oxazoline-stat-glycine), dPMeOx dPMeOx was prepared according to the general procedure by adding 3.2 g (1.0 mmol) oxPEI, 16 ml (11.6 g, 115 mmol, 4.1 equiv per amine moiety) triethylamine and 6 mL (6.6 g, 84 mmol, 3.0 equiv per amine moiety) acetyl chloride were used. The reaction mixture was precipitated by pouring it directly into ice-cold diethyl ether (ca. -80°C, 700 ml).
  • Triethylammonium chloride formed during the reaction was filtered off and the solution precipitated in ice-cold diethyl ether (1000 mL, -80°C).
  • the residue was dissolved in DMF (50 mL) and reprecipitated into ice-cold diethyl ether (500 mL).
  • the crude product was dissolved in deionized water, Amberlite IRA-67 ion exchange resin was added and the mixture was stirred for 1.5 h. Then the Amberlite IRA-67 was filtered off and water was removed under reduced pressure.
  • the residue was twice dissolved in methanol (30 ml) and precipitated in ice-cold diethyl ether (ca. -80°C).
  • Preparation Example H5 Synthesis of poly(2-n-pentyl-2-oxazoline-staf-glycine), dPPentOx dPPentOx was prepared according to the general procedure by adding 2.7 g (0.88 mmol) oxPEI, 13 ml (9.4 g, 93 mmol, 3.6 equiv per amine) triethylamine and 10 ml (9.6 g, 72 mmol, 2.8 equiv per amine) hexanoyl chloride. Triethylammonium chloride was filtered off and volatiles were removed under reduced pressure.
  • the crude product was dissolved in chloroform (100 mL) and washed with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (3 x 40 mL) and aqueous sodium chloride solution (4 x 40 mL). To remove the remaining triethylammonium chloride and DMF impurities, the organic phase was diluted with chloroform (100 mL) and washed again with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (3 x 500 mL) and aqueous sodium chloride solution (3 x 500 ml). The organic phase was dried over sodium sulfate, filtered and the solvent removed under reduced pressure. After drying under vacuum overnight the product was obtained as a brown, highly viscous liquid (yield: 6.5 g).
  • Preparation example H6 Synthesis of poly(2-n-hexyl-2-oxazoline-stat-glycine), dPHexOx dPHexOx was prepared according to the general procedure by adding 2.1 g (0.88 mmol) oxPEI, 10.5 ml (7 .6 g, 75 mmol, 3.8 equiv per amine unit) triethylamine and 8.5 mL (8.2 g, 55 mmol, 2.8 equiv per amine unit) heptanoyl chloride were used. The precipitated triethylammonium salt was filtered off and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • Preparation Example H7 Synthesis of poly(2-n-heptyl-2-oxazoline-sfat-glycine), dPHeptOx dPHeptOx was prepared according to the general procedure by adding 2.0 g (0.65 mmol) oxPEI, 10 ml (7.3 g, 72 mmol, 3.8 equiv per amine unit) triethylamine and 9 mL (8.6 g, 53 mmol, 2.8 equiv per amine unit) octanoyl chloride. Triethyl ammonium chloride was filtered off and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • Preparation example H8 Synthesis of poly(2-n-octyl-2-oxazoline-sfaf-glycine), dPOctOx dPOctOx was prepared according to the general procedure by adding 1.9 g (0.61 mmol) oxPEI, 9.5 ml (6 .9 g, 68 mmol, 3.8 equiv per amine unit) triethylamine and 9.5 mL (8.9 g, 51 mmol, 2.8 equiv per amine unit) nonanoyl chloride were used. Triethyl ammonium chloride formed during the reaction was filtered off and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • Preparation example H9 Synthesis of poly(2-n-nonyl-2-oxazoline-sfaf-glycine), dPNonOx dPNonOx was prepared according to the general procedure by using 1.8 g (0.58 mmol) oxPEI, 9 ml (6.5 g, 65 mmol, 3.8 equiv per amine unit) triethylamine and 10 mL (9.2 g, 48 mmol, 2.8 equiv per amine unit) decanoyl chloride. Precipitated triethylammonium chloride was removed by filtration and volatiles were removed under reduced pressure.
  • Example C1 Characterization of the polymers by 1 H-NMR spectroscopy
  • the first step towards a dPAOx library was to synthesize a substantial amount of PEtOx as a well-defined starting material via CROP (see general synthetic methods, Synthesis of PEtOx).
  • a synthesis protocol was developed in a 10 L Normag reactor, yielding almost 4 kg of PEtOx with a degree of polymerization (DP) of 60 and a narrow dispersity (D) of 1.14 determined by SEC in DMAc.
  • DP degree of polymerization
  • D narrow dispersity
  • the resulting PEtOx contained two isomeric end groups arising from nucleophilic attack at the 2- or 5-positions of the oxazoline ring, but in both cases resulting in hydroxyl end groups upon hydrolysis to linear poly(ethyleneimine) (PEI) led.
  • the hydrolysis was carried out under acidic conditions (cf. general synthesis methods, synthesis of PEI). To obtain complete hydrolysis, the reaction was carried out overnight with excess 6M HCl. The successful synthesis was confirmed by the 1 H NMR spectrum (compare Figure 1 ), which clearly showed the disappearance of the signals assigned to the ethyl substituents of PEtOx.
  • Figure 1 shows 1 H NMR spectra (300 MHz, 300 K, D 2 O or MeOD) of PEtOx, PEI, oxPEI and dPEtOx and the assignment of the signals to the schematic representations of the structures.
  • PEI was prepared by oxidizing PEtOx with hydrogen peroxide as the oxidizing agent.
  • the oxidation occurred in the polymer backbone and thus formed randomly distributed backbone amide groups.
  • the structure of the resulting oxPEI corresponds to the repeating unit of poly(glycine) alongside unaffected ethyleneimine units. Therefore, the polymer can also be referred to as a poly(ethyleneimine stat glycine) copolymer.
  • Aiming to generate 50% of the amino groups by oxidation in the PEI became 0.7 equivalents Hydrogen peroxide used per amino group.
  • the degree of oxidation (DO) which was determined by the integral ratio in the 1 H-NMR spectrum to be 54% (cf.
  • the resulting oxPEI provided the platform for the synthesis of various degradable polymers.
  • subsequent reacylation with a homologous series of aliphatic acyl chlorides from acetyl chloride to n-decanoyl chloride was applied to reintroduce amide moieties equivalent to the N-acylethyleneimine structures in PAOx.
  • the resulting polymer structures resemble PAOx with additional, randomly distributed poly(glycine) units integrated into the polymer backbone.
  • poly(2-n-alkyl-2-oxazoline-stat-glycine) copolymers or as degradable poly(2-n-alkyl-2-oxazoline) analogs due to the degradability of the glycine moiety.
  • the described synthetic approach thus enabled the construction of a dPAOx library with the same chain length and DO using only EtOx as a commercially available monomer.
  • Example C2 Characterization of the polymers by IR spectroscopy
  • Figure 2 shows ATR-IR spectra of PEtOx, PEI, oxPEI and dPEtOx in the range of wavenumbers from 1000 to 3500 cm' 1 including the assignment of the most important bands.
  • the IR spectroscopy of PEtOx, PEI, poly(glycine), as well as oxPEI has been previously reported in the literature, which allowed easy assignment of vibrational bands.
  • the band decreased upon oxidation to oxPEI and almost disappeared after the subsequent re-acylation step to dPEtOx, indicating almost complete functionalization of the amino groups.
  • the vibrational band at 1628 cm' 1 in the PEtOx spectrum can be assigned to the amide I band, which is mainly due to the carbonyl stretching vibration.
  • the band almost completely disappeared during hydrolysis to PEI due to cleavage of the carbonyl-bearing side chain.
  • Amide groups were reintroduced during oxidation to oxPEI and subsequent reacylation to dPEtOx, leading to an increase in the carbonyl vibrational band.
  • the amide II band at 1543 cm' 1 mainly caused by the bending vibration of the NH bond, was not observed in PEtOx, which had only tertiary amide groups without NH bonds, and showed the structural difference between PEtOx and dPEtOx.
  • Signals from carboxylic acid derivatives, which are due to possible degradation products, are expected at around 1710 cm'- 1 . However, such signals could not be observed in the spectra of oxPEI or dPEtOx.
  • Example C3 Characterization of the polymers by SEC SEC analyzes were only possible to a limited extent due to solubility changes in the synthesis route and possible interactions of some polymers with the column material. However, all polymers dissolved in both CHCh and DMAc, except for PEI, which was not soluble in these SEC solvents and dPMeOx, which was only soluble in DMAc (see Table 1).
  • PETOx, PEI, oxPEI and dPAOx a Obtained by calculation with theoretical monomer units.
  • b Determined by SEC in CHC (2 vol% isopropanol, 4 vol% triethylamine, PS calibration, RI detection).
  • c Determined by SEC in DMAc (0.21 wt% LiCl, PS calibration, RI detection).
  • d decomposition temperature determined by TGA at 95% of the original mass.
  • f melting temperature determined by DSC using the third heating curve at 10 K min' 1 .
  • PEtOx and poly(2-n-propyl-2-oxazoline) have a lower Critical solution temperature (LCST) in water, while this was not observed for dPEtOx or dPPropOx, possibly due to the formation of additional hydrogen bonds that can be formed by the amide hydrogen of the glycine moiety.
  • Example C4 Characterization of the polymers by titration
  • Aqueous solution titrations were performed to determine the number of amino groups in the polymer backbone of PEI, oxPEI and the water-soluble dPAOx, namely dPMeOx, dPEtOx and dPPropOx. Although the titration of amino groups allowed a qualitative assessment, an accurate quantitative analysis was not performed due to residual water in PEI and oxPEI, which would affect the results.
  • a superimposition of the titration curves of PEI, oxPEI and dPMeOx is shown in Figure 3 as an example.
  • Figure 3 shows titration curves of PEI, oxPEI and dPMeOx (1 mg mL' 1 ) against 0.1 M NaOH and their first derivatives.
  • the polymer solutions were acidified with concentrated HCl before titration. The individual curves are superimposed vertically for clarity and the corresponding pH values of the equivalence points are indicated.
  • Figure 3 shows the development within the synthetic sequence. Acidification of the aqueous polymer solutions with concentrated HCl prior to titrations resulted in the appearance of two equivalence points (EP) for amine-containing polymers when titrated with dilute sodium hydroxide solution.
  • the first EP corresponds to the neutralization of the excess HCl, while the second EP relates to the neutralization of the amino groups.
  • the oxidation of PEI to oxPEI converted 54% of the amino moieties to amide moieties of the poly(glycine) moieties.
  • the reduced number of amino groups was reflected in the reduced distance between the two EPs during titration.
  • Example C5 Characterization of the polymers by TGA and DSC
  • thermogravimetric analysis TGA
  • DSC differential scanning calorimetry
  • the dPAOx showed good thermal stability up to temperatures above 100 °C. However, they are not as stable as their non-degradable PAOx analogues, which have degradation temperatures (T d ) exceeding 300 °C.
  • T d degradation temperatures
  • the lower thermal stability of dPAOx can be attributed to the presence of additional degradable amide groups in the backbone.
  • Figure 4 shows the DSC thermograms of PEtOx, PEI, oxPEI and dPEtOx (N 2 , third heating curve, 10 K min' 1 ). The individual thermograms are superimposed vertically for clarity.
  • Figure 5 shows the DSC thermograms of different dPAOx (N 2 , third heating run, 10 K min' 1 ). Here, too, the individual thermograms are superimposed vertically for reasons of better representation.
  • the figure shows the DSC thermograms of the Ci-Cg-alkyl substituted derivatives of dPAOx (dPMeOx - dPNonOx).
  • Figure 6 shows glass transition temperatures and melting temperatures of dPAOx compared to glass transition temperatures and melting temperatures of non-degradable PAOx from the literature. Glass transitions were made from the turning points determined. The data from the literature was taken from the following publications:
  • FIG. 4 An overlay of the DSC thermograms of PEtOx, PEI, oxPEI and dPEtOx in Figure 4 shows the differences in the thermal behavior of the polymers within the synthesis sequence.
  • the polymers showed an amorphous behavior.
  • the PEI backbone has no side chains, allowing the main chains to pack regularly, resulting in the formation of crystallites with a melting temperature (T m ) of 62 °C.
  • T m melting temperature
  • the introduction of random amide groups by oxidation disrupted the packing, leading to amorphous behavior of oxPEI.
  • dPEtOx Similar to PEtOx, dPEtOx also showed amorphous behavior, both with glass transition temperature (T g ) values above the T g of oxPEI due to the existence of side chains. dPEtOx showed the highest T g within the sequence, as it exhibits both the irregularity of the polymer backbone due to the randomly distributed amide groups and A/-acyl side chains. From the DSC thermograms of the dPAOx polymers in Figure 5, as well as from the relationships between the T g and T m values and the number of carbon atoms in the dPAOx side chain and comparison with the T g and T m values of The following information can be obtained from the non-degradable PAOx in Figure 6.
  • T g values decreased linearly with increasing side chain length with a similar slope for both series, especially for dPAOx with longer side chains. Macromolecules with only short side chains can pack more tightly, leading to stronger interactions between the amide dipoles, which slows down the relaxation of the backbone and thus leads to higher T g values.
  • poly(2-n-heptyl-2-oxazoline)-(dPHeptOx) poly(2-n-octyl-2-oxazoline)-(dPOctOx) and poly(2-n-nonyl-2-oxazoline)- Analogues (dPNonOx) semicrystalline behavior was observed.
  • the semicrystalline properties, unique to dPAOx with side chains of at least seven carbon atoms, can be attributed to side chain crystallization analogously to PAOx.
  • PAOx exhibits semicrystallinity even with shorter alkyl substituents. The difference can be attributed to the irregularity in the dPAOx backbone due to the additional, randomly distributed glycine units.
  • the T m values of dPHeptOx, dPOctOx and dPNonOx were more than 100 °C below the T m values of the corresponding PAOx of around 150 °C.
  • the melting points increased with increasing side chain length from T m from 9 °C for dPHeptOx to a T m of 28 °C for dPNonOx, while the T m values of PAOx were independent of side chain length.
  • asymmetric triple melting peaks were observed for dPAOx with longer side chains, while the corresponding PAOx showed only one symmetric melting peak. The asymmetry became less pronounced with increasing side chain length.
  • Example C6 Characterization of the polymers by degradation studies using acidic hydrolysis
  • dPAOx compared to PAOx is its ability to be potentially degradable due to the additional backbone amide groups.
  • Figure 7 shows the successful degradation of the dPAOx polymers under these conditions.
  • dPEtOx Before treatment with HCl, dPEtOx showed broad signals corresponding to Polymers are typical, while the signals from the degraded dPEtOx were sharp, as is commonly observed for small molecules.
  • DOSY NMR spectroscopy was used to confirm the degradation of dPAOx.
  • Figure 8 shows the overlay of the DOSY NMR spectra of PEtOx (left) and dPEtOx (right) before (upper spectrum) and after (lower spectrum) treatment with HCl (400 MHz, 297 K, D 2 O, solvent-signate suppressed). For reasons of clarity, the individual spectra are superimposed vertically.
  • DOSY NMR spectroscopy allows the 1 H NMR signals to be fractionated according to their diffusion coefficients. Before treatment with HCl, all PEtOx signals corresponded to the same diffusion coefficient and confirmed the covalent bonds between the individual groups.
  • the cleaved propionic acid could be clearly distinguished from the non-degraded PEI backbone, since it had a higher diffusion coefficient due to its lower molar mass.
  • all dPEtOx signals showed the same diffusion coefficient.
  • the spectrum of the degraded dPEtOx showed signals with three different diffusion coefficients.
  • the propionic acid signals formed were easy to identify as they showed the same diffusion coefficient as in the post-treatment PEtOx spectra. Therefore, the other two signals were attributed to degradation products of the former polymer backbone, such as glycine, which showed different diffusion behavior.
  • Example C7 Characterization of the polymers by degradation studies using enzymatic hydrolysis
  • dPMeOx was treated with proteinase K at 37°C in a PBS buffer solution for 30 days.
  • Figure 9 shows the overlay of the 1 H NMR spectra of dPMeOx after treatment with proteinase K in PBS buffer (upper spectrum) and of glycine with proteinase K in PBS buffer (lower spectrum) (400 MHz, 297 K, D 2 O). For reasons of clarity, the individual spectra are superimposed vertically.
  • the 1 H NMR spectrum of dPMeOx after treatment with proteinase K in Figure 9 confirmed the partial degradation of the polymer.
  • the sharp signal at 1.93 ppm showed cleavage of the side chains, resulting in acetic acid in the case of dPMeOx.
  • the sharp signal at 8.46 ppm and the signal at 3.58 ppm were already observed for the dPAOx degraded under acidic conditions, thus confirming the degradation of the polymer backbone.
  • Overlay with a 1 H NMR spectrum of glycine in a proteinase K PBS buffer solution of the same concentration confirms the assignment of the latter signal to glycine.
  • the broad polymer signals from the methyl side chain, the dPMeOx backbone, and the backbone amide group can still be observed in the spectrum, indicating the slow degradation kinetics under the experimental conditions.
  • glycine moieties facilitated the degradability of the dPAOx backbone under acidic and enzymatic conditions and highlighted their potential to be used in biomedical or other applications as degradable PAOx analogues.

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Abstract

Beschrieben werden Copolymere enthaltend Struktureinheiten der Formel (I), der Formel (II) und gegebenenfalls der Formel (III) -NR1-CHR3-CHR4- (I), -NH-CO-CHR7- (II), -NH-CHR9-CHR10- (III), oder Struktureinheiten der Formel (IV), der Formel (V) und gegebenenfalls der Formel (VI) -NR1-CHR3-CHR4-CHR5- (IV), -NH-CO-CHR7-CHR8- (V), -NH-CHR9-CHR10-CHR11- (VI), worin R1 einen Rest der Formel -CO-R2, der Formel -CO-NH-R2 oder der Formel -CH2-CH(OH)-R12 bedeutet, R3, R4, R5, R7, R8, R9, R10 und R11 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl bedeuten, und R2 und R12 Wasserstoff oder ausgewählte organische Reste sind. Diese Copolymeren zeichnen sich durch eine gute Abbaubarkeit aus und können beispielsweise zur Herstellung von Wirkstoff-Formulierungen eingesetzt werden.

Description

Beschreibung
Funktionalisierte Polyglycin-Poly(alkylenimin)-Copolymere, deren Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Wirkstoff- und Effektstoff-Formulierungen
Die Erfindung betrifft neue Copolymere, die als funktionalisierte Polyglycin- Polyalkylenimin-Copolymere beschrieben werden können und die sich durch eine sehr gute Abbaubarkeit auszeichnen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung und Verarbeitung diese Copolymeren durch Oxidation von Polyalkyleniminen gefolgt von einer Funktionaliserung von NH-Gruppen im teilweise oxidierten Polymerrückgrat. Diese Copolymeren lassen sich insbesondere zur Herstellung von Wirk- und Effektstoff-Formulierungen einsetzen.
Biokompatible Polymere stellen hochattraktive Materialien für biomedizinische Anwendungen wie für die Arzneimittelabgabe dar. Poly(ethylenglykol) (PEG) ist derzeit das am häufigsten verwendete Polymer für solche Zwecke. Aufgrund seiner hohen Hydrophilie und des so genannten "verbergenden Verhaltens" löst es wenig Immunantwort im Körper aus und erhöht somit die Blut-Zirkuationszeit des Arzneimittels. Allerdings weist PEG verschiedene Nachteile auf, nämlich der Bildung toxischer Nebenprodukte, die Sequestrierung in Organen, und die Stimulation von Anti-PEG-Antikörpern.
Poly(2-n-alkyl-2-oxazoline) (PAOx) mit kurzen Seitenketten zeigen eine ähnliche Hydrophilie, Biokompatibilität und "verbergendes Verhalten" und scheinen daher vielversprechende Kandidaten für einen Ersatz von PEG zu sein, was darüber hinaus in einem detaillierten Vergleich ihres Lösungsverhaltens bestätigt wurde (vergl. Grube, M.; Leiske, M. N.; Schubert, U. S.; Nischang, I. POx as an alternative to PEG? A hydrodynamic and light scattering study. Macromolecules 2018, 51, 1905-1916). Im Gegensatz zu PEG weisen PAOx aufgrund ihrer Seitenketten- Modifizierbarkeit auch eine höhere strukturelle Vielseitigkeit auf.
PAOx mit längeren Seitenketten sind hydrophob und können zur Herstellung von amphiphilen Copolymeren, Materialien mit geringer Oberflächenenergie oder Beschichtungen mit geringer Haftung verwendet werden. Thermische und kristalline Eigenschaften können auch durch Variationen in den PAOx-Seitenketten angepasst werden (vergl. Hoogenboom, R.; Fijten, M. W. M.; Thijs, H. M. L.; van Lankvelt, B.
M.; Schubert, U. S. Microwave-assisted synthesis and properties of a series of poly(2-alkyl-2-oxazoline)s. Des. Monomers Polym. 2005, 8, 659-671 ; Pettier, E. F. J.; Kranenburg, J. M.; Lambermont-Thijs, H. M. L.; Hoogenboom, R.; Schubert, U. S. Thermal, mechanical, and surface properties of poly(2-/\/-alkyl-2-oxazoline)s Macromol. Chem. Phys. 2010, 211, 2443-2448; Kempe, K.; Lobert, M.; Hoogenboom, R.; Schubert, U. S. Synthesis and characterization of a series of diverse poly(2-oxazoline)s. J. Polym. Sei., Part A: Polym. Chem. 2009, 47, 3829- 3838; Beck, M.; Birnbrich, P.; Eicken, U.; Fischer, H.; Fristad, W. E.; Hase, B.; Krause, H.-J. Polyoxazoline auf fettchemischer Basis. Angew. Makromol. Chem. 1994, 223, 217-233; Rodriguez-Parada, J. M.; Kaku, M.; Sogah, D. Y. Monolayers and Langmuir-Blodgett films of poly(AT-acylethylenimines) with hydrocarbon and fluorocarbon side chains. Macromolecules 1994, 27, 1571-1577; Oleszko-Torbus,
N.; Utrata-Wesolek, A.; Bochenek, M.; Lipowska-Kur, D.; Dworak, A.; Watach, W. Thermal and crystalline properties of poly(2-oxazoline)s. Polym. Chem. 2020, 11, 15- 33; Demirel, A. L.; Tatar, G. P.; Verbraeken, B.; Schlaad, H.; Schubert, U. S.; Hoogenboom, R. Revisiting the crystallization of poly(2-alkyl-2-oxazoline)s. J. Polym. Sei., Part B: Polym. Phys. 2016, 54, 721-729). Schubert und Kollegen berichteten zuvor von einer Abnahme der Glasübergangstemperatur (Tg) mit zunehmender Seitenkettenlänge für eine Reihe von Poly(2-n-alkyl-2-oxazolinen) bis Poly(2-pentyl- 2-oxazolinen). Bei PAOx mit längeren Seitenketten wurden kristalline Eigenschaften mit einer von der Seitenkettenlänge unabhängigen Schmelztemperatur Tm beobachtet. PAOx sowie PEG gelten jedoch als nicht biologisch abbaubar. Für eine Vielzahl von Anwendungen in der Biomedizin und auf anderen Gebieten wäre die biologische Abbaubarkeit eine wichtige Eigenschaft, um beispielsweise eine Anreicherung von Polymeren mit Molmassen jenseits von 20.000 g mol'1 im Körper zu verhindern und das Polymer vollständig aus dem Organismus zu entfernen. Eine Strategie zur Lösung des Problems könnte darin bestehen, hydrolytisch empfindliche Gruppen in das Polymer-Rückgrat zu integrieren, z.B. Ester- oder Amid-Einheiten. Diese können unter z.B. sauren oder enzymatischen Bedingungen hydrolysiert werden, was zu einem Abbau des gesamten Polymers führen könnte. Es wurden bereits mehrere Routen untersucht, um Estergruppen in das PAOx-Rückgrat einzubauen. Vor kurzem wurde über die Synthese einer Reihe von Poly(esteramiden) mit lateralen Amidbindungen, hergestellt durch organokatalytische Ringöffnungspolymerisation von /V-Acetylierten-1 ,4-oxazepan-7-on-monomeren, berichtet (vergl. Wang, X.; Hadjichristidis, N. Organocatalytic ring-opening polymerization of A/-acylated-1 ,4- oxazepan-7-ones toward well-defined poly(ester amide)s: Biodegradable alternatives to poly(2-oxazoline)s. ACS Macro Lett. 2020, 9, 464-470). Die resultierenden Polymere können als alternierende Poly(ester-co-oxazoline) angesehen werden und daher als biologisch abbaubare PAOx-Alternativen. In der Reihe unterschiedlich abbaubarer Poly-(2-alkyl-2-oxazolin)- und Poly(2-aryl-2-oxazolin)-Analoga zeigten alle Polymere ein amorphes Verhalten und zeigten eine niedrigere Tg im Vergleich zu ihren nicht abbaubaren PAOx-Gegenstücken.
Kürzlich wurde von Polymeren berichtet, die aus den gleichen sich wiederholenden Einheiten bestanden, welche durch spontane zwitterionische Copolymerisation von 2-Oxazolin und Acrylsäure synthetisiert worden waren, um zu A/-acyatierten Poly(aminoester)-Makromonomeren zu gelangen. Eine nachgelagerte redoxinitiierte reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungs-Polymerisation (RRAFT) dieser Makromonomere führte zu biologisch abbaubaren Kammpolymeren (vergl. Kempe, K.; de Jongh, P. A.; Anastasaki, A.; Wilson, P.; Haddleton, D. M. Novel comb polymers from alternating A/-acylated poly(aminoester)s obtained by spontaneous zwitterionic copolymerisation. Chem. Commun. 2015, 51, 16213- 16216; de Jongh, P. A. J. M.; Mortiboy, A.; Sulley, G. S.; Bennett, M. R.; Anastasaki, A.; Wilson, P.; Haddleton, D. M.; Kempe, K. Dual stimuli-responsive comb polymers from modular N-acylated poly(aminoester)-based macromonomers. ACS Macro Lett. 2016, 5, 321-325).
Andere Ansätze nutzten eine Amidierung von Diethanolamin, was zu unterschiedlichen Hydroxyethylsuccinamid-Monomeren führte, und anschließend eine Polykondensation dieser Monomeren mit Bernsteinsäure, was auf ähnliche Polymerstrukturen abzielte (vergl. Swanson, J. P.; Monteleone, L. R.; Haso, F.; Costanzo, P. J.; Liu, T.; Joy, A. A library of thermoresponsive, coacervate-forming biodegradable polyesters. Macromolecules 2015, 48, 3834-3842; Gokhale, S.; Xu, Y.; Joy, A. A library of multifunctional polyesters with "peptide-like" pendant functional groups. Biomacromolecules 2013, 14, 2489-2493).
Jedoch wurden nach unserem Kenntnisstand bisher keine Versuche unternommen, um Amidbindungen in ein Polyoxazolin-Rückgrat oder in ein Rückgrat anderer funktionalisierter Polyalkylenimine einzuführen zwecks Verbesserung der Abbaubarkeit.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung neuer funktionalisierter Copolymerer mit verbesserter Abbaubarkeit.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer einfachen Methode zur Herstellung dieser funktionalisierten Copolymere.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung von Copolymeren enthaltend 10 bis 95 mol % an Struktureinheiten der Formel (I), 5 bis 90 mol % an Struktureinheiten der Formel (II) und 0 bis 20 mol % an Struktureinheiten der Formel (III)
-NR1-CHR3-CHR4- (I), -NH-CO-CHR7- (II), -NH-CHR9-CHR10- (III), oder von Copolymeren enthaltend
10 bis 95 mol % an Struktureinheiten der Formel (IV),
5 bis 90 mol % an Struktureinheiten der Formel (V) und
0 bis 20 mol % an Struktureinheiten der Formel (VI)
-NR1-CHR3-CHR4-CHR5- (IV), -NH-CO-CHR7-CHR8- (V),
-NH-CHR9-CHR10-CHR11- (VI), worin
R1 einen Rest der Formel -CO-R2, der Formel -CO-NH-R2 oder der Formel -CH2-CH(OH)-R12 bedeutet,
R3, R4, R5, R7, R8, R9, R10 und R11 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl bedeuten,
R2 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, -CmH2m-X oder -(CnH2n-O)o-(CpH2p-O)q-R6, R6 Wasserstoff oder C-i -Ce-Alkyl ist,
R12 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl,
X ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Alkoxy, Carboxyl, Carbonsäureester, Schwefelsäureester, Sulfonsäureester oder Carbamidsäureester, m eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist, n und p unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 4 sind, wobei n ungleich p ist, und o und q unabhängig ganze Zahlen von 0 bis 60 sind, wobei mindestens eines der o oder q ungleich 0 ist, wobei die Prozentangaben auf die Gesamtmenge der Struktureinheiten der Formel (I), (II) und (III) oder der Formel (IV), (V) und(VI) bezogen sind.
Diese Copolymeren können ausgehend von gut zugänglichen Poly(alkyleniminen) hergestellt werden. Die Erfindung betrifft daher auch in einer ersten Variante ein Verfahren zur Herstellung dieser Copolymeren mit den Maßnahmen i) Umsetzung eines Polyalkylenimins, das wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (la) oder der Formel (IVa), vorzugsweise in einer Menge von mindestens 90 mol % enthält, mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Copolymer enthaltend die Struktureinheiten der Formel (la) und der Formel (II) oder enthaltend die Struktureinheiten der Formel (IVa) und der Formel (V) erhalten wird
-NH-CR3H-CR4H- (la), -NH-CO-CR7H- (II),
-NH-CR3H-CR4H-CR5H- (IVa), -NH-CO-CR7H-CR8H- (V), worin R3, R4, R5, R7 und R8 die weiter oben definierte Bedeutung besitzen, und ii) Umsetzung des Copolymers aus Schritt i) mit einem Acylderivat der Formel (VII) oder mit einem Isocyanat der Formel (VIII) oder mit einem Epoxid der Fomel (IX) zu einem Copolymer enthaltend die vorstehend definierten Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und gegebenenfalls (III) oder der Formeln (IV), (V) und gegebenenfalls (VI) worin R2 und R12 die weiter oben definierten Bedeutungen besitzen und R13 eine Abgangsgruppe, insbesondere Fluor, Chor, Brom, lod oder eine andere Abgangsgruppe eines aktivierten Carbonsäurederivats bedeutet.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung in einer zweiten Variante ein Verfahren zur Herstellung dieser Copolymeren mit den Maßnahmen iii) partielle Hydrolyse eines Polyoxazolins enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (I) oder eines Polyoxazins enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (IV)
-NR1-CHR3-CHR4- (I), -NR1-CHR3-CHR4-CHR5- (IV), zu einem Copolymer enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (I) und der Formel (III) oder der Formel (IV) und der Formel (VI)
-NH-CHR9-CHR10- (III), -NH-CHR9-CHR10-CHR11- (VI), worin R1, R3, R4, R5, R9, R10 und R11 die weiter oben definierte Bedeutung besitzen, und iv) Umsetzung des Copolymeren aus Schritt iii) mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Copolymer enthaltend die Struktureinheiten der Formel (I), der Formel (II) und gegebenenfalls der Formel (III) oder enthaltend die Struktureinheiten der Formel (IV), der Formel (V) und gegebenenfalls der Formel (VI) erhalten wird
-NH-CO-CHR7- (II), -NH-CO-CHR7-CHR8- (V), worin R7 und R8 die weiter oben definierte Bedeutung besitzen.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass abbaubare funktionalisierte Polyglycin- Polyalkylenimin-Copolymere mit in das Polymerrückgrat integrierten Amidbindungen über einen einfachen Syntheseweg hergestellt werden können. Zu diesem Zweck können Polyalkylenimine partiell oxidiert werden und das resultierende Produkt kann über eine Umsetzung mit einem Epoxid, einem Isocyanat oder einem aktivierten Acylderivat, wie einem aktivierten Ester oder einem Acylhalogenid funktionalisiert werden. In einem alternativen Syntheseweg können Polyoxazoline oder Polyoxazine partiell hydrolisiert werden, wodurch Polyalkylenimineinheiten entstehen, welche in einem nachfolgenden Schritt ganz oder teilweise oxidiert werden können. In der ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Polyalkylenimine enthalten üblicherweise mindestens 90 mol % an wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (la) oder der Formel (IVa) und sind kommerziell erhältlich oder können durch Hydrolyse von in 2-Position substitutierten Poly(2- oxazolinen) (POx), insbesondere von PEtOx, bzw. von in 2-Position substituierten Poly(2-oxazinen) erhalten werden.
Als Ausgangsmaterialien für die Hydrolyse werden üblicherweise POx eingesetzt, die mindestens 20 mol %, vorzugsweise mindestens 50 mol % an wiederkehrenden von 2-Oxazolin abgeleiteten Struktureinheiten im Polymer enthalten. Während kommerziell erhältliche Polyalkylenimine verzweigt sind, werden durch die Hydrolyse von POx lineare Polyalkylenimine erhalten.
In einer zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Hydrolyse von Polyoxazolinen oder Polyoxazinen auch teilweise erfolgen und führt zu Copolymeren, die wiederkehrende Struktureinheiten der Formeln (I) und (III) oder die wiederkehrende Struktureinheiten der Formeln (IV) und (VI) enthalten. Diese Copolymeren können oxidiert werden, was direkt zu den erfindungsgemäßen Copolymeren führt. In dieser Verfahrensvariante entfällt üblicherweise eine Reacylierung.
Ein bevorzugter einfacher Syntheseweg der Nachpolymerisation verläuft über die konsekutive Hydrolyse von Poly(2-ethyl-2-oxazolin) (PEtOx), eine partielle Oxidation und Reacylierung. Die Verwendung von PEtOx oder entsprechenden Poly(2-alkyl-2- oxazolinen) als klar definierte Ausgangsmaterialien ist vorteilhaft, da diese Polymeren durch kationische Ringöffnungspolymerisation (CROP) von handelsüblichen Monomeren gewonnen werden können. Die folgende Hydrolyse von PEtOx oder entsprechenden Poly(2-alkyl-2-oxazolinen) unter sauren Bedingungen, die zu linearem Poly-(ethylenimin) (PEI) führt, ist gut untersucht, dem Fachmann bekannt und kann auch teilweise erfolgen. Jedoch ist PEI nachteilig wegen seiner Zytotoxizität und, ebenso wie PEtOx, seiner Nichtabbaubarkeit. Englert et al. berichteten über die kontrollierte Oxidation von linearem PEI mit Wasserstoffperoxid, um die Abbaubarkeit durch Einbeziehung von Amidgruppen in das PEI-Rückgrat zu erhöhen (vergl. Enhancing the biocompatibility and biodegradability of linear poly(ethylene imine) through controlled oxidation; Macromolecules 2015, 48, 7420-7427). Die resultierende Struktur entspricht der Wiederholeinheit von Poly(glycin) und daher kann das Polymer als Poly(ethylenimin- co-glycin) (hier als oxPEI bezeichnet) betrachtet werden. Durch seine zusätzlichen hydrolytisch empfindlichen Amidgruppen zeigte das Polymer nicht nur eine erhöhte Abbaubarkeit, sondern auch eine verbesserte Biokompatibilität im Vergleich zum ansonsten zytotoxischen PEI.
Erfindungsgemäß wurde oxPEI mit einem nachfolgenden Reacylierungsschritt oder durch Umsetzung mit Isocyanaten oder mit Epoxiden funktionalisiert. Entsprechend kann anstelle von PEI auch das homologe Polypropylenimin (PPI) verwendet werden. Bei der Reacylierung von oxPEI mit Acylierungsreagenzien, wie Acylhalogeniden, konnten Poly(2-n-alkyl-2-oxazolin-staf-glycine) (hier als dPAOx bezeichnet) hergestellt werden. Aufgrund der Anwesenheit von zusätzlichen Amidgruppen im Polymerrückgrat wurde vermutet und auch experimentell nachgewiesen, dass die resultierenden dPAOx eine erhöhte Abbaubarkeit im Vergleich zu ihren Poly(2-n-alkyl-2-oxazolin)-Äquivalenten aufwiesen. Ähnliche Acylierungsreaktionen von PEI mit aktivierten Carbonsäure-derivaten, wie Acylchloriden, Anhydriden oder A/-Hydroxysuccinimidestern wurden bereits auf verschiedene Weise berichtet (vergl. Mees, M. A.; Hoogenboom, R. Functional poly(2-oxazoline)s by direct amidation of methyl ester side chains. Macromolecules 2015, 48, 3531-3538; Sedlacek, O.; Monnery, B. D.; Hoogenboom, R. Synthesis of defined high molar mass poly(2-methyl-2-oxazoline). Polym. Chem. 2019, 10, 1286- 1290; Englert, C.; Tauhardt, L.; Hartlieb, M.; Kempe, K.; Gottschaidt, M.; Schubert, U. S. Linear poly(ethylene imine)-based hydrogels for effective binding and release of DNA. Biomacromolecules 2014, 15, 1124-1131 ; Englert, C.; Trutzschier, A. K.; Raasch, M.; Bus, T.; Borchers, P.; Mosig, A. S.; Traeger, A.; Schubert, U. S. Crossing the blood-brain barrier: Glutathione-conjugated poly(ethylene imine) for gene delivery. J. Controlled Release 2016, 241, 1-14; und Englert, C.; Prohl, M.; Czaplewska, J. A.; Fritzsche, C.; Preussger, E.; Schubert, U. S.; Traeger, A.; Gottschaidt, M. D-Fructose-decorated poly( ethylene imine) for human breast cancer cell targeting. Macromol. Biosci. 2017, 17, 1600502).
Eine Re-Funktionalisierung von oxPEI oder oxidiertem Poly(propylenimin) (oxPPI) wurde bislang noch nicht beschrieben.
Bei der Re-Funktionalisierung ist die Menge an Acylderivat der Formel (VII) oder an Isocyanat der Formel (VIII) oder an Epoxid der Fomel (IX) so zu wählen, dass der Anteil an Struktureinheiten der Formel (III) oder der Formel (VI) im resultierenden Copolymer zwischen 0 und 20 mol % liegt.
Unter „Copolymeren“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung die oben genannten organischen Verbindungen zu verstehen, die durch Wiederholung von bestimmten Einheiten (Monomereinheiten oder Wiederholungseinheiten) gekennzeichnet sind. Die erfindungsgemäßen Copolymere bestehen aus mindestens zwei Arten verschiedener Wiederholungseinheiten. Polymere werden durch die chemische Reaktion von Monomeren unter Ausbildung von kovalenten Bindungen hergestellt (Polymerisation) und bilden durch Verknüpfen der polymerisierten Einheiten das sogenannte Polymerrückgrat. Dieses kann Seitenketten aufweisen, an denen sich funktionelle Gruppen befinden können. Erfindungsgemäße Copolymere bestehen aus mindestens zwei unterschiedlichen Monomereinheiten, welche statistisch, als Gradient, alternierend oder als Block angeordnet sein können. Besitzen die Copolymere zum Teil hydrophobe Eigenschaften, können sie in wässriger Umgebung nanoskalige Strukturen (z.B. Nanopartikel, Mizellen, Vesikel) ausbilden.
Unter „wasserlöslichen Verbindungen“ oder „wasserlöslichen Copolymeren“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Verbindungen bzw. Copolymere zu verstehen, die sich zu mindestens 1 g/L Wasser bei 25 °C lösen.
Unter „Wirkstoffen“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Verbindungen oder Gemische von Verbindungen zu verstehen, die auf einen lebenden Organismus eine gewünschte Wirkung ausüben. Dabei kann es sich z.B. um pharmazeutische Wirkstoffe oder um agrochemische Wirkstoffe handeln. Wirkstoffe können niederöder hochmolekulare organische Verbindungen sein. Bevorzugt handelt es sich bei den Wirkstoffen um niedermolekulare pharmazeutisch wirksame Substanzen oder um höhermolekulare pharmazeutisch wirksame Substanzen, beispielsweise aus potentiell nutzbaren Proteinen, wie z.B. Antikörpern, Interferonen, Zytokinen.
Unter dem Begriff „pharmazeutischer Wirkstoff“ wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung jede(s) beliebige anorganische oder organische Molekül, Substanz oder Verbindung verstanden, das (die) eine pharmakologische Wirkung aufweist. Der Begriff „pharmazeutischer Wirkstoff' wird hierin mit dem Begriff „Arzneimittel“ synonym verwendet.
Unter „Effektstoffen“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Verbindungen oder Gemische von Verbindungen zu verstehen, die einer Formulierung zugesetzt werden, um dieser bestimmte zusätzliche Eigenschaften zu verleihen und/oder um deren Verarbeitung zu erleichtern. Die Begriffe „Effektstoffe“ und „Hilfs- und Zusatzstoffe“ werden im Rahmen dieser Beschreibung synonym verwendet.
Unter „Hilfs- und Zusatzstoffen“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Substanzen zu verstehen, die einer Formulierung zugesetzt werden, um dieser bestimmte zusätzliche Eigenschaften zu verleihen und/oder um deren Verarbeitung zu erleichtern. Beispiele für Hilfs- und Zusatzsstoffe sind Tracer, Kontrastmittel, Trägerstoffe, Füllstoffe, Pigmente, Farbstoffe, Parfums, Gleitmittel, UV- Stabilisatoren, Antioxidantien oder Tenside. Insbesondere ist unter „Hilfs-und Zusatzstoffen“ jede pharmakologisch verträgliche und therapeutisch sinnvolle Substanz zu verstehen, die kein pharmazeutischer Wirkstoff ist, jedoch zusammen mit einem pharmazeutischen Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden kann, um qualitative Eigenschaften der pharmazeutischen Zusammensetzung zu beeinflussen, insbesondere zu verbessern. Bevorzugt entfalten die Hilfs- und/oder Zusatzstoffe keine oder im Hinblick auf die beabsichtigte Behandlung keine nennenswerte oder zumindest keine unerwünschte pharmakologische Wirkung.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung sind unter „Polymerpartikel“ in Teilchenform vorliegende erfindungsgemäße Copolymere zu verstehen, welche gegebenenfalls noch weitere Inhaltsstoffe enthalten. Die Teilchen können in flüssiger Form in einer hydrophilen Flüssigkeit dispergiert vorliegen oder die Teilchen liegen in fester Form vor, entweder in einer hydrophilen Flüssigkeit dispergiert oder in Form eines Pulvers. Die Größe der Partikel kann mittels visueller Methoden, beispielsweise durch Mikroskopie, ermittelt werden; bei Teilchengrößen im Nanobereich können Lichtstreuung oder Elektronenmikroskopie herangezogen werden. Die Gestalt der Polymerteilchen kann beliebig sein, beispielsweise sphärisch, ellipsoid oder irrgulär. Die Polymerteilchen können auch Aggregate aus mehreren Primärteilchen bilden. Vorzugsweise liegen die Partikel aus erfindungsgemäßen Copolymeren in der Form von Nanopartikeln vor. Die Teilchen können neben den Copolymeren noch weitere Bestandteile enthalten, beispielsweise Wirkstoffe oder Hilfs- oder Zusatzstoffe.
Die Begriffe „Teilchen“ oder „Partikel“ werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung synonym verwendet.
Unter „Nanopartikeln“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Teilchen zu verstehen, deren Durchmesser kleiner als 1 pm ist und die aus einem oder mehreren Molekülen aufgebaut sein können. Sie zeichnen sich allgemein durch ein sehr hohes Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis aus und bieten damit eine sehr hohe chemische Reaktivität. Nanopartikel können aus erfindungsgemäßen Copolymeren bestehen oder enthalten neben diesen Copolymeren noch andere Bestandteile, wie z.B. Wirkstoffe oder Hilfs- oder Zusatzstoffe.
Die erfindungsgemäßen Copolymere können als lineare Polymere vorliegen oder es kann sich auch um verzweigte Copolymere handeln. Lineare Copolymere entstehen beispielsweise durch konsekutive Hydrolyse von PEtOx, gefolgt von partieller Oxidation zu oxPEI und von Reacylierung zu dPAOx. Verzweigte Copolymere entstehen beispielsweise durch partielle Oxidation von kommerziell erhältlichem PEI, das bekanntermaßen verzweigt ist, zu oxPEI gefolgt von Re-Funktionalisierung, z.B. von Reacylierung zu dPAOx.
Die Löslichkeit der erfindungsgemäßen Copolymere kann durch Co-Polymerisation mit geeigneten Monomeren und/oder durch Funktionalisierung beeinflusst werden. Dem Fachmann sind solche Techniken bekannt
Die erfindungsgemäßen Copolymere können einen weiten Molmassenbereich umfassen. Typische Momassen (Mn) bewegen sich im Bereich von 1.000 bis 500.000 g/mol, insbesondere von 1.000 bis 50.000 g/mol. Diese Molmassen können durch 1H-NMR-Spektroskopie des gelösten Polymers bestimmt werden.
Insbesondere lassen sich zur Bestimmung der Molmassen eine analytische Ultrazentrifuge oder chromatographische Methoden, wie die Größenausschlusschromatographie, einsetzen.
Bevorzugte erfindungsgemäße Copolymere weisen eine mittlere Molmasse (Zahlenmittel) im Bereich von 1.000 bis 50.000 g/mol, insbesondere von 3.000 bis 10.000 g/mol auf, ermittelt durch 1H-NMR-Spektroskopie oder durch Verwendung einer analytischen Ultrazentrifuge. Dabei handelt es sich vorzugsweise um lineare Copolymere. Verzweigte erfindungsgemäße Copolymere haben vorzugsweise eine höhere mittlere Molmasse, beispielsweise ein Mn im Bereich von 50.000 bis 500.000 g/mol, insbesondere von 80.000 bis 200.000 g/mol.
Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (I) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 10 bis 95 mol %, vorzugsweise 20 bis 90 mol % und insbesondere 30 bis 70 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III).
Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (II) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 5 bis 90 mol %, vorzugsweise 10 bis 80 mol % und insbesondere 30 bis 70 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III).
Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (III) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 0 bis 20 mol %, vorzugsweise 0 bis 10 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und (III).
Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (IV) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 10 bis 95 mol %, vorzugsweise 20 bis 90 mol % und insbesondere 30 bis 70 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (IV), (V) und (VI).
Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (V) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 5 bis 90 mol %, vorzugsweise 10 bis 80 mol % und insbesondere 30 bis 70 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (IV), (V) und (VI).
Der molare Anteil an Struktureinheiten der Formel (VI) in den erfindungsgemäßen Copolymeren beträgt 0 bis 20 mol %, vorzugsweise 0 bis 10 mol %, bezogen auf die Gesamtmenge an Struktureinheiten der Formeln (IV), (V) und (VI).
R1 bedeutet einen Rest der Formel -CO-R2 oder der Formel -CO-NH-R2 oder der Formel -CH2-CH(OH)-R12, vorzugsweise einen Rest der Formel -CO-R2.
R3, R4, R5, R7, R8, R9, R10 und R11 bedeuten unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, vorzugsweise Wasserstoff, Methyl oder Ethyl und insbesondere Wasserstoff.
R2 bedeutet Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, -CmH2m-X oder -(CnH2n-O)0- (CpH2p-O)q-R6, vorzugsweise Wasserstoff, C-i-C-is-Alkyl, Cyclohexyl oder Phenyl, insbesondere Ci-C18-Alkyl, und ganz besonders C-i-Cu-Alkyl. R6 ist Wasserstoff oder C-i -Ce-Alkyl, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl
R12 bedeutet Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl, vorzugsweise Wasserstoff, CrCis-Alkyl, C2-Ci8-Alkenyl, Cyclohexyl oder Phenyl, insbesondere Wasserstoff, Ci-Cß-Alkyl oder C2-C3-Alkenyl. m bedeutet eine ganze Zahl von 1 bis 18, vorzugsweise von 2 bis 12.
X bedeutet Hydroxyl, Alkoxy, Carboxyl, Carbonsäureester, Schwefelsäurerester, Sulfonsäureester oder Carbamidsäureester, vorzugsweise Hydroxyl oder Alkoxy n und p sind unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 4, wobei n ungleich p ist. Vorzugsweise ist n 2 und p ist 3. o und q sind unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 60, wobei mindestens eines der o oder q ungleich 0 ist. Vorzugsweise sind o und q unabhängig voneinander 1 bis 40, insbesondere 2 bis 10.
Die Reste R2 und R12 können Alkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Alkylgruppen mit ein bis zwanzig Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein können. Beispiele dafür sind Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Heptadecyl, Octadecyl, Nonadecyl oder Eicosyl. Besonders bevorzugt sind Methyl, Ethyl und Propyl.
Rest R12 kann Alkenyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Alkenylgruppen mit zwei bis zwanzig Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein können. Die Doppelbindung kann sich an beliebigen Positionen in der Kette befinden, bevorzugt jedoch in alpha-Position. Beispiele für Alkenylreste sind Vinyl, Allyl, Butenyl, Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl, Nonenyl, Decenyl, Undecenyl, Dodecenyl, Tridecenyl, Tetradecenyl, Pentadecenyl, Hexadecenyl, Heptadecenyl, Octadecenyl, Nonadecenyl oder Eicosenyl. Besonders bevorzugt sind Vinyl und Allyl.
Die Reste R2 und R12 können Cycloalkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Cycloalkylgruppen mit fünf bis sechs Ringkohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt ist Cyclohexyl.
Die Reste R2 und R12 können Aryl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um aromatische Kohlenwasserstoffreste mit fünf bis zehn Ringkohlenstoffatomen. Bevorzugt ist Phenyl.
Die Reste R2 und R12 können Aralkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Arylgruppen, die über eine Alkylengruppe mit dem Rest des Moleküls verbunden sind. Bevorzugt ist Benzyl.
Rest X kann Alkoxy bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Ci-Cß-Alkoxy- gruppen. Bevorzugt ist Ethoxy und insbesondere Methoxy.
Rest X kann einen Carbonsäureester (-COOR), Sulfonsäureester (-SO3R), Schwefelsäurester (-SO4R) oder Carbamidsäurester (-NR'COOR oder -OCONRR ) bedeuten (R und R'jeweils einwertige organische Reste). Dabei handelt es sich in der Regel um Ester von Carbon-, Sulfon-, Schwefel- oder Carbamidsäuren mit aliphatischen Alkoholen, insbesondere mit aliphatischen Ci-C6-Alkoholen. Bevorzugt sind Ethyl- und insbesondere Methylester.
Bevorzugt sind Copolymere, die 20 bis 90 mol % an Struktureinheiten der Formel (I), 10 bis 80 mol % an Struktureinheiten der Formel (II) und 0 bis 20 mol % an Struktureinheiten der Formel (III) enthalten.
Ebenfalls bevorzugt sind Copolymere, worin R1 ein Rest der Formel -CO-R2 ist. Weiterhin bevorzugt sind Copolymere, worin R2 Ci-Ci8-Alkyl, insbesondere Ci-C6- Alkyl, und ganz besonders bevorzugt Ci-C2-Alkyl ist.
Weiterhin bevorzugt sind Copolymere, worin R2 C3-Ci8-Alkyl, insbesondere C7-C12- Alkyl ist.
Eine weitere Gruppe bevorzugter Copolymerer ist dadurch gekennzeichnet, dass R2 Ci-Ci8-Alkyl ist und R3, R4, R5, R7, R8, R9, R10 und R11 Wasserstoff bedeuten.
Ferner sind Copolymere bevorzugt, worin R6 Wasserstoff oder Methyl ist.
Weitere bevorzugte Copolymere sind dadurch gekennzeichnet, dass R2 Ci-Ci8-Alkyl, Cycloalkyl oder Phenyl ist.
Weitere bevorzugte Copolymere sind dadurch gekennzeichnet, dass n = 2 und p = 3 ist.
Besonders bevorzugte Copolymere sind wasserlöslich.
Die erfindungsgemäßen Copolymeren können aus den Struktureinheiten der Formeln (I), (II) und gegebenenfalls (III) oder aus den Struktureinheiten der Formeln (IV), (V) und gegebenenfalls (VI) bestehen oder daneben noch weitere Struktureinheiten enthalten, die sich ableiten von Monomeren, welche sich mit bei der Herstellung von Polyalkyleniminen oder Polyoxazolinen eingesetzten Monomeren copolymerisieren lassen. Der Anteil solcher weiteren Struktureinheiten, bezogen auf die Gesamtmasse des Copolymeren, beträgt in der Regel bis zu 25 mol.-%. Diese weiteren Struktureinheiten können statistisch verteilt oder in Form von Blöcken im Copolymer angeordnet sein.
Bevorzugte erfindungsgemäße Copolymere sind dadurch gekennzeichnet, dass diese mindestens 90 mol.-%, insbesondere mindestens 95 mol.-%, bezogen auf deren Gesamtmasse, an Struktureinheiten der Formel (I), der Formel (II) und gegebenenfalls der Formel (III) oder der Formel (IV), der Formel (V) und gegebenenfalls der Formel (VI) aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Copolymere weisen Endgruppen auf, die typischerweise bei der Herstellung von Poly(oxazolinen) bzw. von Poly(alkyleniminen) entstehen. Diese Endgruppen können durch Funktionalisierung modifiziert werden. Die dafür nötigen Techniken sind dem Fachmann bekannt.
Beispiele für omega-Endgruppen der Polyoxazolin- oder Polyoxazin- Ausgangsmaterialien der erfindungsgemäßen Copolymere sind Halogenatome, wie Fluor, Chlor, Brom oder lod; oder Azidgruppen -N3; oder Fluor(alkyl)-sulfon- säureestergruppen, wie die Nonaflatgruppe -OSO2C4F9, die Trifluormethan- sulfonatgruppe -OSO2CF3 oder die Fluorsulfonatgruppe -OSO2F; oder Aryl- bzwl Alkylsulfonsäuregruppen, wie die Tosylgruppe CH3-C6H4-SO2- oder die Mesylgruppe CH3-SO2-; die unsubstituierte, einfach- oder zweifach-su bstitutierte Aminogruppe -NH2, -NHR oder -NR2 (mit R = einwertiger organischer Rest), die Hydroxylgruppe -OH, die Thiolgruppe -SH, oder die Estergruppe -OCOR, die Thioestergruppe -SCOR; die Phthalimidgruppe oder die Cyanogruppe -CN sowie weitere funktionelle Gruppen, die durch Modifikation dieser Endgruppen erhalten werden können. Die erfindungsgemäßen Copolymere enthalten diese Reste als Endgruppen oder können die Hydrolyse- und / oder Oxidationsprodukte dieser Reste als Endgruppen enthalten.
Erfindungsgemäße Copolymere können über die Endgruppen kovalent mit anderen Wirk- oder Effektstoffen verknüpft sein.
Die erfindungsgemäßen Copolymeren können - wie oben dargelegt - durch partielle Oxidation von Polyalkyleniminen und durch Re-Funktionalisierung des oxidierten Produktes durch Umsetzung mit einem Epoxid, Isocyanat oder einem aktivierten Acylderivat, insbesondere mit einem aktivierten Ester oder Acylhalogenid hergestellt werden. Die Oxidation wird vorzugsweise in Lösung durchgeführt, insbesondere in wässriger oder alkoholisch-wässriger Lösung. Als Oxidationsmittel können an sich bekannte Oxidantien verwendet werden. Beispiele dafür sind Perverbindungen, Hypochlorite, Chlor oder Sauerstoff, insbesondere Wasserstoffperoxid .
Bevorzugt werden Perverbindungen eingesetzt. Beispiele dafür sind Wasserstoffperoxid, Persäuren, organische Peroxide oder organische Hydroperoxide, insbesondere Wasserstoffperoxid.
Bevorzugt werden Verfahren, bei denen das in Schritt i) verwendete Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid ist.
Die Menge an Oxidiationsmittel wird so gewählt, dass der gewünschte Anteil an oxidierten Struktureinheiten im Polymerrückgrat entsteht.
Die Reaktionstemperatur liegt im Allgemeinen zwischen 10 und 80°C, insbesondere im Bereich von 20 bis 40 °C.
Die Reaktionsdauer bei der Oxidation beträgt im Allgemeinen zwischen 5 Minuten und 5 Tagen.
Die Re-Funktionalisierung des oxidierten Produktes erfolgt durch Umsetzung mit einem Acylderivat der oben beschriebenen Formel (VII) oder mit einem Isocyanat der oben beschriebenen Formel (VIII) oder mit einem Epoxid der oben beschriebenen Formel (IX).
Beispiele für geeignete Acylderivate sind Acylhalogenide, Carbonsäureanhydride oder mittels bekannter Kopplungsreagenzien aktivierte Carbonsäuren, beispielsweise N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester), Dicyclohexylcarbodiimidester (DCC- Ester) oder 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidester (EDC-Ester). Beispiele für geeignete Isocyanate sind Monoalkylisocyanate, wie Methanisocyanat oder Ethanisocyanat, Cyclohexylisocyanat oder Phenylisocyanat.
Beispiele für geeignete Epoxide sind Ethylenoxid, Propylenoxid, 1 ,2-Epoxybut-3-en oder 1,2-Epoxypent-4-en.
Die Reaktionstemperatur liegt im Allgemeinen zwischen 10 und 80°C, insbesondere im Bereich von 20 bis 40 °C.
Die Reaktionsdauer bei der Re-Funktionalisierung beträgt im Allgemeinen zwischen 5 Minuten und 5 Tagen, insbesondere zwischen 12 und 48 Stunden.
Vorzugsweise werden als Poly(alkylenimine) Copolymere eingesetzt, die durch alkalische oder insbesondere durch saure Hydrolyse von Poly-(2-oxazolinen), insbesondere von Poly(2-alkyl-2-oxazolin)en erhalten wurden. Diese Copolymere sind linear und werden als klar definierte Ausgangsmaterialien eingesetzt, die sich von Polymeren ableiten, welche durch CROP von handelsüblichen Monomeren gewonnen werden können.
Poly(oxazoline) sind bekannte Verbindungen. Diese werden üblicherweise durch kationische Ringöffnungspolymerisation von 2-Oxazolinen in Lösung und in Gegenwart eines Initiators hergestellt. Beispiele für Initiatoren sind Elektrophile, wie Ester von aromatischen Sulfonsäuren Salze oder Ester von aliphatischen Sulfonsäuren oder Carbonsäuren oder aromatische Halogenverbindungen. Es können auch mehrfach-funktionelle Elektrophile als Initiatoren eingesetzt werden. Dabei können neben linearen Poly(oxazolin)en auch verzweigte oder sternförmige Moleküle entstehen. Beispiele für bevorzugte Initiatoren sind Ester der Arylsulfonsäuren, wie Methyltosylat, Ester der Alkansulfonsäuren, wie Methyltriflat, oder Mono- oder Dibrommethylbenzol. Die Polymerisation wird üblicherweise in einem polaren aprotischen Lösungsmittel durchgeführt, beispielsweise in Acetonitril. Als Oxazoline zur Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Poly(oxazoline) werden 2-Oxazoline (4,5-Dihydrooxazole) mit einer C=N-Doppelbindung zwischen dem Kohlenstoffatom 2 und dem Stickstoffatom eingesetzt. Diese können am 2-, 4- und/oder 5-Kohlenstoffatom substituiert sein, vorzugsweise am 2-Kohlenstoffatom.
Bevorzugt werden 2-Oxazoline eingesetzt, welche an 2-Position einen Substituenten enthalten. Beispiele für solche Substituenten sind Methyl oder Ethyl.
Neben den 2-Oxazolinen können bei der Herstellung der erfindungsgemäß als Ausgangsmaterialien eingesetzten Poly(oxazoline) noch weitere mit 2-Oxazolinen copolymerisierbare Monomere eingesetzt werden.
Anstelle von Oxazolinen können auch 2-Oxazine zur Herstellung homologer Poly- (oxazine) verwendet werden.
Die Hydrolyse von Poly(oxazolinen) wird vorzugsweise in Lösung durchgeführt, insbesondere in wässriger oder alkoholisch-wässriger Lösung. Als Säuren können anorganische oder organische Säuren verwendet werden. Vorzugsweise werden Mineralsäuren eingesetzt. Beispiele dafür sind Salzsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure, vorzugsweise Salzsäure. Als Basen eignen sich beispielsweise Alkalihydroxide, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid.
Die Reaktionstemperatur liegt im Allgemeinen zwischen 20 und 180°C, insbesondere im Bereich von 70 bis 130 °C.
Die Reaktionsdauer bei der Hydrolyse beträgt im Allgemeinen zwischen 5 Minuten und 24 Stunden.
Bevorzugt werden also Verfahren, bei denen das in Schritt i) eingesetzte Polyalkylenimin durch Hydrolyse, insbesondere durch saure Hydrolyse eines Poly(oxazolins) erhalten wird. Die erfindungsgemäßen Copolymere können zur Herstellung von Formulierungen eingesetzt werden, welche pharmazeutische oder agrochemische Wirkstoffe enthalten.
Infolge ihrer guten biologischen Abbaubarkeit eignen sie sich hervorragend für Anwendungen im Bereich der Wirkstoffabgabe. Diese Verwendungen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Copolymeren können in Abhängigkeit von deren Funktionalisierung wasserlöslich oder nicht-wasserlöslich sein. Mit Formyl-, Acetyl- Propionylgruppen oder Butionyl funktionalisierte Copolymere sind im Allgemeinen wasserlöslich. Mit längeren AI kanoyl ketten funktionalisierte Copoylmere hingegen sind nicht wasserlöslich.
Nicht wasserlösliche erfindungsgemäße Copolymere können in hydrophilen Flüssigkeiten dispergiert vorliegen, beispielsweise als Emulsionen oder als Suspensionen.
Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Copolymeren in der Form von Partikeln vor, insbesondere in der Form von Nanopartikeln.
Die Erfindung betrifft daher auch Partikel, insbesondere Nanopartikel enthaltend die oben beschriebenen Copolymere.
Bevorzugt sind Nanopartikel deren mittlerer Durchmesser D50 weniger als 1 pm, vorzugsweise 20 bis 500 nm beträgt.
Ganz besonders bevorzugt sind Partikel die einen oder mehrere pharmazeutische oder agrochemische Wirkstoffe enthalten.
Besonders bevorzugte Partikel enthalten neben dem erfindungsgemäßen Copolymer mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff sowie geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe. Die Partikel können als Pulver in fester Form vorliegen oder sie können in hydrophilen Lösungsmitteln dispergiert vorliegen, wobei die Teilchen im Dispergiermedium in flüssiger Form oder insbesondere in fester Form vorliegen.
Bevorzugt bilden die Partikel eine disperse Phase in einer Flüssigkeit enthaltend Wasser und/oder mit Wasser mischbare Verbindungen.
Der Anteil der Partikel in einer Dispersion kann einen weiten Bereich umfassen. Typischerweise beträgt der Anteil der Partikel in dem Dispersionsmedium 0,5 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-%.
Die erfindungsgemäßen Partikel können durch Fällung, vorzugsweise durch Nanofällung hergestellt werden. Dazu werden die erfindungsgemäßen Copolymere, welche durch die Anwesenheit hydrophober Gruppen wenig oder nicht hydrophil sind in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Aceton gelöst. Diese Lösung wird in ein hydrophiles Dispergiermedium eingetropft. Dieses erfolgt vorzugsweise unter starkem Rühren. Dadurch kann die Herstellung kleinerer Partikel gefördert werden. Das Copolymer wird im Dispergiermedium in feinverteilter Form abgeschieden.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Partikel auch durch Emulgieren erzeugt werden, vorzugsweise durch Nanoemulsion. Dazu werden die erfindungsgemäßen Copolymere, welche durch die Anwesenheit hydrophober Gruppen wenig oder nicht hydrophil sind, in einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder Ethylacetat, gelöst. Diese Lösung wird mit einem hydrophilen Dispergiermedium kombiniert, wodurch sich vorzugsweise zwei flüssige Phasen ausbilden. Anschließend wird dieses Gemisch durch Energieintrag emulgiert, vorzugsweise durch Beschallen mit Ultraschall.
Zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen Copolymer können bei dessen Dispergierung im Dispergiermedium ein oder mehrere Wirkstoffe und/oder ein oder mehrere Hilfs- und Zusatzstoffe zugegen sein. Alternativ können diese Wirkstoffe und/oder Hilfs- und Zusatzstoffe nach dem Dispergieren des Copolymers in der hydrophilen Flüssigkeit hinzugefügt werden.
Die Abtrennung der Polymerpartikel aus der hydrophilen Flüssigkeit kann auf unterschiedliche Weisen erfolgen. Beispiele dafür sind Zentrifugation, Ultrafiltration oder Dialyse.
Die erfindungsgemäß hergestellte Polymerdispersion kann nach der Herstellung weiter aufgereinigt werden. Gängige Verfahren beinhalten das Reinigen mittels Dialyse, mittels Ultrafiltration, mittels Filtration oder mittels Zentrifugieren.
Die folgendenBeispiele erläutern die Erfindung ohne diese zu begrenzen.
Materialien
Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden von kommerziellen Lieferanten gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet, sofern nicht anders angegeben. 2-Ethyl-2- oxazolin (EtOx, 99+%), Triethylamin (NEts, 99,7%) und EtOx wurden von Acros Organics bezogen. 2-Ethyl-2-oxazolin wurde über Calciumhydrid getrocknet und unter Argonatmosphäre destilliert. Methyltosylat (MeOTs, 98%), n-Decanoylchlorid (98%) und Proteinase K wurden von Sigma Aldrich erhalten. Methyltosylat wurde über Bariumoxid getrocknet und unter Argonatmosphäre destilliert. Salzsäure (37%) wurde von Fisher Chemicals bezogen. Wässrige Wasserstoffperoxidlösung (30% w/w) wurde von Carl Roth erhalten. Acetylchlorid (ca. 90 %) wurde von Merck Schuchardt bezogen. Propionylchlorid (>98,0%), n-Butyrylchlorid (>98,0%), Valeroylchlorid (>98,0%), n-Hexanoylchlorid (>98,0%), n-Heptanoylchlorid (>98,0%), n-Octanoylchlorid (>99,0%) und n-Nonanoylchlorid (>95.0%) wurden von Tokyo Chemical Industry (TCI) gekauft. Amberlite IRA-67 wurde von Merck erhalten und wurde vor Gebrauch mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen. N, N- Dimethylformamid (DMF) und Acetonitril wurden in einem Lösungsmittelreinigungssystem getrocknet (MB-SPS-800 von M Braun). Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) wurde von Biowest erhalten. Durchführung von Messungen
Proton (1H) Kernspinresonanzspektren (NMR) wurden auf einem Bruker AC 300 MHz bzw. einem Bruker AC 400 MHz Spektrometer gemessen. Korrelationsspektroskopische (COSY) NMR, heteronukleare Einzelquanten-Korrelations- spektroskopische (HSQC) NMR, heteronukleare Multiple-Bond-Korrelations (HMBC) NMR-Spektren und DOSY NMR-Spektren wurden auf einem Bruker AC 400 MHz Spektrometer aufgenommen. Die Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei entweder D2O, d4-Methanol oder deuteriertes Chloroform als Lösungsmittel verwendet wurden. Chemische Verschiebungen (ö) werden in Teilen pro Million (ppm) relativ zum verbliebenen nicht deuterierten Lösemittelresonanzsignal angegeben. Die Infrarotspektroskopie (IR) wurde auf einem Shimadzu I RAffinity-1 CE-System durchgeführt, das für die Messung in einem erweiterten Bereich mit einer einfach reflektierenden ATR-Küvette mit Diamantkristall des Typs Quest ATR ausgestattet war.
Die Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde mit zwei verschiedenen Aufbauten durchgeführt. Messungen in N,N-Dimethylacetamid (DMAc) wurden mit Hilfe eines Agilent Systems der 1200-er Serie durchgeführt, das mit einem PSS-Entgaser, einer G1310A-Pumpe, einem G1329A-Autosampler, einem Techlab-Ofen, einem G1362A-Brechungsindexdetektor (RID) und einer PSS GRAM-guard/30/1000 Ä- Säule (10 pm Partikelgröße) ausgestattet war. Als Eluent wurde DMAc mit 0,21 Gew.-% LiCI eingesetzt. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 ml min’1 und die Ofentemperatur betrug 40 °C. Für die Berechnung von Molmassen wurden Polystyrol (PS) Standards von 400 bis 1.000.000 g mol'1 verwendet. Die Messungen in Chloroform wurden mit Hilfe eines Shimadzu-Systems (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) durchgeführt, das mit einem SCL-10A VP-Systemregler, einem SIL-10AD VP-Autosampler, einer LC-10AD VP-Pumpe, einem RID-10A Rl-Detektor, einem CTO-10A VP-Ofen und einer PSS SDV guard/lin S-Säule (5 mm Partikelgröße) ausgestattet war. Ein Gemisch aus Chloroform/lsopropanolZ-Triethylamin (94/2/4 Vol%) wurde als Eluent verwendet. Die Durchflussrate betrug 1 ml min’1 und die Ofentemperatur betrug 40 °C. PS-Standards von 400 bis 100.000 g mol"1 wurden zur Kalibrierung des Systems verwendet.
Die thermogravimetrische Analyse (TGA) wurde mit Hilfe einer Netzsch TG 209 F1 Iris von 20 bis 580 °C mit einer Heizgeschwindigkeit von 20 K min’1 unter N2- Atmosphäre durchgeführt. Zersetzungstemperaturen (Td) wurden bei 95% der ursprünglichen Masse bestimmt.
Messungen der dynamischen Differenzkalorimetrie (DSC) wurden mit Hilfe eines Netzsch DSC 204 F1 Phoenix unter N2-Atmosphäre von -100 bis 160 °C, -100 bis 150 °C, -190 bis 100 °C bzw. -190 bis 140 °C durchgeführt. Für jede Messung wurden drei Heizläufe aufgezeichnet. Der erste und der zweite Lauf wurden mit einer Heizgeschwindigkeit von 20 K min’1 und der dritte Lauf wurde mit einer Heizge- schwindkeit von 10 K min’1 durchgeführt. Die Abkühlgeschwindigkeit zwischen dem ersten und dem zweiten Lauf wurde auf 20 K min'1 und zwischen dem zweiten und dem dritten Lauf auf 10 K min'1 eingestellt. Glasübergangstemperaturen (Tg, Wendepunkte) und Schmelztemperaturen (Tm) wurden aus dem dritten Heizlauf ermittelt. Thermogramme wurden mit der Software Netzsch Proteus Thermal Analysis 4.6.1 analysiert, die bei Bedarf die Glättungsoption zur Analyse des Tg-Wertes anwendet.
Allgemeine Synthesemethoden
Synthese von Poly(2-ethyl-2-oxazolin), PEtOx.
PEtOx wurde durch kationische Ringöffnungspolymerisation (CROP) von EtOx synthetisiert. In einer Scale-Up-Chargenmethode wurden MeOTs (124 g, 0,665 mol) und EtOx (3965 g, 40,00 mol, 60,2 Äquiv.) unter Argonatmosphäre in trockenem MeCN (5860 ml) in einem 10 L Normag-Reaktor aufgelöst, um ein Monomer-zu- Initiatorverhältnis [M]:[l] von 60:1 zu erreichen. Nach einer Reaktionszeit von 6,5 h unter Rückflussbedingungen wurde die Polymerisation mit 270 ml entionisiertem Wasser beendet. Nach der Entnahme von aliquoten Teilen zur Bestimmung des Monomerumsatzes (99,7%) mittels 1H NMR-Spektroskopie wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, der Rückstand in Dichlormethan (20 L) gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (10 L) und wässriger Natriumchloridlösung (2 x 10 1) gewaschen. Die organische Phase wurde über eine Mischung aus Natriumsulfat (15 kg) und Magnesiumsulfat (4 kg) getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das Produkt wurde schließlich im Vakuum 14 Tage lang getrocknet (Ausbeute: 3848 g) und mittels 1H- NMR-Spektroskopie (300 MHz, D2O) und SEC analysiert.
Mn.theor. — 6000 g mol , Mn, NMR — 6300 g mol'1; DP = 60.
Synthese von linearem Poly(ethylenimin), PEI.
Die Synthese von PEI wurde nach einem angepassten Verfahren auf der Grundlage von zuvor veröffentlichten Methoden durchgeführt (Van Kuringen, H. P.; Lenoir, J.; Adriaens, E.; Bender, J.; De Geest, B. G.; Hoogenboom, R. Partial hydrolysis of poly(2-ethyl-2-oxazoline) and potential implications for biomedical applications? Macromol. Biosci. 2012, 12, 1114-1123; Tauhardt, L.; Kempe, K.; Knop, K.; Altunta§, E.; Jäger, M.; Schubert, S.; Fischer, D.; Schubert, U. S. Linear polyethyleneimine: Optimized synthesis and characterization - On the way to “pharmagrade” batches. Macromol. Chem. Phys. 2011, 212, 1918-1924). PEtOx (80,0 g, 12,5 mmol) wurde in wässriger Salzsäure (6 M, 600 ml) gelöst und 24 h auf 90 °C erhitzt. Flüchtige Stoffe wurden unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in entionisiertem Wasser (1600 ml) gelöst. Wässrige NaOH (3 M, 300 mL) wurde in Portionen zugegeben, um einen pH-Wert von 10 zu erreichen, was zur Ausfällung des Polymers führte. Anschließend wurde das Polymer abfiltriert und durch Umkristallisieren in Wasser (800 ml) gereinigt. PEI wurde als weißer Feststoff erhalten (Ausbeute: 47,5 g)
1H NMR (300 MHz, CD3OD): Hydrolysegrad (DH) = 99%.
Synthese von Poly(ethylenimin-stat-glycin), oxPEI.
Die Synthese von oxPEI wurde nach einer angepassten Methode nach Englert et al. durchgeführt (Englert, C.; Hartlieb, M.; Bellstedt, P.; Kempe, K.; Yang, C.; Chu, S. K.; Ke, X.; Garcia, J. M.; Ono, R. J.; Fevre, M.; Wojtecki, R. J.; Schubert, U. S.; Yang, Y. Y.; Hedrick, J. L. Enhancing the biocompatibility and biodegradability of linear poly(ethylene imine) through controlled oxidation. Macromolecules 2015, 48, 7420- 7427). PEI (45,0 g, 17,0 mmol) wurde in Methanol (1100 ml) unter Rühren gelöst und wässrige Wasserstoffperoxid lösung (72 ml, 30% w/w, 0,7 Äquiv. pro Amineinheit) wurden tropfenweise zugegeben. Nach 3-tägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und das Produkt im Vakuum 7 Tage lang bei Raumtemperatur und 1 Tag lang bei 70 °C getrocknet. oxPEI wurde als brauner Feststoff gewonnen (Ausbeute: 29,1 g).
1H NMR (300 MHz, D2O): Oxidationsgrad (DO) = 54%.
Allgemeine Synthesevorschrift für Poly(2-n-alkyl-2-oxazolin-staf-glycin)e, dPAOx. oxPEI wurde unter Vakuum 2 h lang bei 70 °C vorgetrocknet und anschließend in trockenem DMF (6 ml pro g Polymer) unter Argonatmosphäre gelöst. Triethylamin (4 Äquiv. pro Amineinheit) wurde hinzugefügt, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von Acylchlorid-Lösungen (3 Äquiv. pro Amineinheit) in trockenem DMF (6 mL pro g Polymer). Dabei wurde das Gemisch im Eisbad gekühlt. Zusätzliches trockenes DMF (6 ml pro g Polymer) wurde verwendet, um Rückstände von den Kolbenwänden abzuspülen. Nach Erreichen der Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch weitere 24 Stunden lang gerührt. Die Reinigung wurde in Abhängigkeit von der Löslichkeit der Produkte angepasst. Einzelheiten zur Herstellung einzelner dPAOx sind im nachstehenden experimentellen Teil zu finden.
Bestimmung des Hydrolysegrads
Der Hydrolysegrad DH wurde nach Gleichung (1 ) aus den Integralen der 1H NMR- Spektren von PEI berechnet. Dabei bedeutet D das Integral der Methylengruppen der Ethylenimineinheiten und A bedeutet das Integral der Methylgruppen der verbleibenden EtOx-Einheiten. D
DH = - -— - 100% (1 )
D + ij4
Bestimmung des Oxidationsgrads
Der Oxidationsgrad DO wurde aus den Integralen der Polymerrückgratsignale der 1H NMR-Spektren von oxPEI nach Gleichung (2) berechnet. Dabei bedeutet F das Integral der Methylengruppe der Glycineinheiten, A bedeutet das Integral der Methylgruppen der verbleibenden EtOx-Einheiten und D bedeutet das Integral der Methylengruppen der Ethylenimineinheiten.
Durchfühung der Titration
Titrationen zur Bestimmung der restlichen Aminogruppen wurden mit einem automatisierten Metrohm OMNIS Titrator durchgeführt, der mit einer Metrohm Ecotrode plus pH-Elektrode ausgestattet war. Alle Messungen wurden in einem dynamischen Titrationsmodus durchgeführt, der die Titrationsgeschwindigkeit an die Änderung des pH-Wertes während der Titration anpasste. Eine typische Messung wurde wie folgt durchgeführt: Das Polymer wurde in entionisiertem Wasser gelöst, um eine Polymerlösung von 10 mL mit einer Konzentration von 1 mg ml'1 zu ergeben. Die Polymerlösung wurde durch Zugabe einer konzentrierten wässrigen HCI-Lösung tropfenweise angesäuert, um einen pH-Wert von 2 zu erreichen. Anschließend wurde die Lösung unter Rühren gegen wässrige 0,1 M Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 12 titriert. Die Äquivalenzpunkte wurden aus der ersten Ableitung der Titrationskurve bestimmt.
Durchführung von Abbaustudien. Für den Abbau unter sauren Bedingungen wurde das Polymer (20 mg) in 6 mol L'1 HCl (2 ml) gelöst und 48 h lang bei 90 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit wässriger Natriumhydroxidlösung neutralisiert und das Wasser wurde unter reduziertem Druck entfernt.
Für den Abbau unter enzymatischen Bedingungen wurden dPMeOx (20 mg) und Proteinase K (10 mg) in PBS-Pufferlösung gelöst und für 30 Tage bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde das Wasser unter reduziertem Druck entfernt. Beide Produkte wurden mittels NMR-Spektroskopie untersucht.
Herstellungsbeispiel H1: Synthese von Poly(2-methyl-2-oxazolin-stat-glycin), dPMeOx dPMeOx wurde gemäß der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 3,2 g (1 ,0 mmol) oxPEI, 16 ml (11 ,6 g, 115 mmol, 4,1 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 6 ml (6,6 g, 84 mmol, 3,0 Äquiv. pro Amineinheit) Acetylchlorid verwendet wurden. Das Reaktionsgemisch wurde durch direktes Einbringen in eiskalten Diethylether (ca.-80 °C, 700 ml) ausgefällt. Der Rückstand wurde in DMF (70 ml) gelöst und die Fällung wurde zweimal wiederholt. Das Rohprodukt wurde in entionisiertem Wasser gelöst, Amberlite IRA-67 lonenaustauschharz wurde zugegeben und die Mischung wurde 1 ,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Amberlite IRA-67 wurde abfiltriert und Wasser unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde in Methanol gelöst und zweimal in eiskaltem Diethylether (ca. -80 °C) ausgefällt. Das Produkt wurde in Methanol gelöst und unter reduziertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde in entionisiertem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Um alle verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen, wurde das Produkt in entionisiertem Wasser gelöst und mit Amberlite IRA-67 lonenaustauscherharz für weitere 4 h gerührt. Amberlite IRA- 67 wurde abfiltriert und das Produkt unter reduziertem Druck getrocknet. Auflösen in entionisiertem Wasser und Gefriertrocknung ergaben dPMeOx als braunen Feststoff (Ausbeute: 1 ,9 g). Herstellungsbeispiel H2: Synthese von Poly(2-ethyl-2-oxazolin-sfaf-glycin), dPEtOx dPEtOx wurde gemäß der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 3,2 g (1 ,0 mmol) oxPEI, 16 ml (11 ,6 g, 115 mmol, 3,8 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 7,5 ml (8,0 g, 86 mmol, 2,9 Äquiv. pro Amineinheit) Propionylchlorid verwendet wurden. Triethylammoniumchlorid, das während der Reaktion gebildet wurde, wurde abfiltriert und die Lösung in eiskaltem Diethylether (1000 ml, -80 °C) ausgefällt. Der Rückstand wurde in DMF (50 ml) gelöst und wieder in eiskaltem Diethylether (500 ml) ausgefällt. Das Rohprodukt wurde in entionisiertem Wasser gelöst, Amberlite IRA-67 lonenaustauscherharz wurde zugegeben und die Mischung wurde für 1 ,5 h gerührt. Anschließend wurde das Amberlite IRA-67 abfiltriert und Wasser wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal in Methanol (30 ml) gelöst und in eiskaltem Diethylether (ca. -80 °C) ausgefällt. Das Produkt wurde in Methanol gelöst und unter reduziertem Druck getrocknet, in entionisiertem Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Das Produkt wurde in entionisiertem Wasser wieder aufgelöst und mit Amberlite IRA-67 lonenaustauscherharz für 4 h gerührt. Amberlite IRA-67 wurde abfiltriert und Wasser unter reduziertem Druck entfernt. Das Produkt wurde in entionisiertem Wasser wieder aufgelöst und gefriergetrocknet. dPEtOx wurde als brauner Feststoff erhalten (Ausbeute: 1 ,0 g).
Herstellungsbeispiel H3: Synthese von Poly(2-n-propyl-2-oxazolin-staf-glycin), dPPropOx dPPropOx wurde nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 3,2 g (1 ,0 mmol) oxPEI, 16 ml (11 ,6 g, 115 mmol, 3,8 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 8,5 ml (8,8 g, 82 mmol, 2,7 Äquiv. pro Amineinheit) Butyrylchlorid verwendet wurden. Das ausgefällte Triethylammoniumsalz wurde nach der Reaktion abfiltriert und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform (200 ml) gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (3 x 500 ml) und wässriger Natriumchloridlösung (3 x 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und flüchtige Stoffe wurden unter reduziertem Druck entfernt. Trocknung im Vakuum über Nacht ergab das Polymer als braune, hochviskose Flüssigkeit (Ausbeute: 6,7 g).
Herstellungsbeispiel H4: Synthese von Poly(2-n-butyl-2-oxazolin-staf-glycin), dPButOx dPButOx wurde nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 3,0 g (0,96 mmol) oxPEI, 15 ml (10,9 g, 108 mmol, 3,9 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 9,5 ml (9,7 g, 80 mmol, 2,9 Äquiv. pro Amineinheit) Valeroylchlorid verwendet wurden. Triethylammoniumchlorid wurde durch Filtration entfernt. Flüchtige Substanzen wurden unter reduziertem Druck entfernt, der Rückstand wurde in Chloroform (50 ml) gelöst, und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (3 x 20 ml) und wässriger Natriumchloridlösung (3 x 20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filritert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt, bis alle Verunreinigungen an Triethylammoniumsalz entfernt waren. Nach Entfernung des Lösungsmittels und Trocknung im Vakuum über Nacht wurde das Produkt als braune, hochviskose Flüssigkeit gewonnen (Ausbeute: 5,7 g).
Herstellungsbeispiel H5: Synthese von Poly(2-n-pentyl-2-oxazolin-staf-glycin), dPPentOx dPPentOx wurde nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 2,7 g (0,88 mmol) oxPEI, 13 ml (9,4 g, 93 mmol, 3,6 Äquiv. pro Amin) Triethylamin und 10 ml (9,6 g, 72 mmol, 2,8 Äquiv. pro Amin) Hexanoylchlorid verwendet wurden. Triethylammoniumchlorid wurde abfiltriert und flüchtige Stoffe wurden unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde in Chloroform (100 ml) gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (3 x 40 ml) und wässriger Natriumchloridlösung (4 x 40 ml) gewaschen. Um die verbliebenen Triethylammoniumchlorid- und DMF-Verun-reinigungen zu entfernen, wurde die organische Phase mit Chloroform (100 ml) verdünnt und erneut mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (3 x 500 ml) und wässriger Natriumchloridlösung (3 x 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Nach dem Trocknen unter Vakuum über Nacht wurde das Produkt als braune, hochviskose Flüssigkeit erhalten (Ausbeute: 6,5 g).
Herstellungsbeispiel H6: Synthese von Poly(2-n-hexyl-2-oxazolin-stat-glycin), dPHexOx dPHexOx wurde nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 2,1 g (0,88 mmol) oxPEI, 10,5 ml (7,6 g, 75 mmol, 3,8 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 8,5 ml (8,2 g, 55 mmol, 2,8 Äquiv. pro Amineinheit) Heptanoylchlorid verwendet wurden. Das ausgefällte Triethylammoniumsalz wurde abfiltriert und das wurde Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform (200 ml) gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (3 x 500 ml) und wässriger Natriumchloridlösung (3 x 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Nach dem Trocknen über Nacht wurde dPHexOx als braune, hochviskose Flüssigkeit erhalten (Ausbeute: 7,6 g).
Herstellungsbeispiel H7: Synthese von Poly(2-n-heptyl-2-oxazolin-sfat-glycin), dPHeptOx dPHeptOx wurde nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 2,0 g (0,65 mmol) oxPEI, 10 ml (7,3 g, 72 mmol, 3,8 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 9 ml (8,6 g, 53 mmol, 2,8 Äquiv. pro Amineinheit) Octanoylchlorid verwendet wurden. Triethyl-ammoniumchlorid wurde abfiltriert und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform (200 ml) gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (3 x 500 ml) und wässriger Natriumchloridlösung (3 x 500 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Entfernung des Lösungsmittels und Trocknen über Nacht ergab das Produkt als braune, hochviskose Flüssigkeit (Ausbeute: 7,4 g). Herstellungsbeispiel H8: Synthese von Poly(2-n-octyl-2-oxazolin-sfaf-glycin), dPOctOx dPOctOx wurde nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 1 ,9 g (0,61 mmol) oxPEI, 9,5 ml (6,9 g, 68 mmol, 3,8 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 9,5 ml (8,9 g, 51 mmol, 2,8 Äquiv. pro Amineinheit) Nonanoylchlorid verwendet wurden. Triethyl-ammoniumchlorid, das während der Reaktion gebildet wurde, wurde abfiltriert und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform (200 ml) gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (3 x 500 ml) und wässriger Natriumchloridlösung (3 x 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungs-mittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Nach dem Trocknen über Nacht wurde das Produkt als braune, hochviskose Flüssigkeit erhalten (Ausbeute: 7,5 g).
Herstellungsbeispiel H9: Synthese von Poly(2-n-nonyl-2-oxazolin-sfaf-glycin), dPNonOx dPNonOx wurde nach der allgemeinen Vorschrift hergestellt, indem 1 ,8 g (0,58 mmol) oxPEI, 9 ml (6,5 g, 65 mmol, 3,8 Äquiv. pro Amineinheit) Triethylamin und 10 ml (9,2 g, 48 mmol, 2,8 Äquiv. pro Amineinheit) Decanoylchlorid verwendet wurden. Ausgefälltes Triethylammoniumchlorid wurde durch Filtration entfernt und flüchtige Stoffe wurden unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde in Chloroform (200 ml) gelöst und mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung (3 x 500 ml) und wässriger Natriumchloridlösung (3 x 500 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck und Trocknung unter Vakuum über Nacht wurde das Produkt als braune, hochviskose Flüssigkeit erhalten (Ausbeute: 6,7 g).
Beispiel C1: Charakterisierung der Polymere durch 1H-NMR Spektroskopie Der erste Schritt zu einer dPAOx-Bibliothek bestand in der Synthese einer erheblichen Menge von PEtOx als klar definiertes Ausgangsmaterial über CROP (vergl. allgemeine Synthesemethoden, Synthese von PEtOx). Zu diesem Zweck wurde ein Syntheseprotokoll in einem 10 L Normag-Reaktor entwickelt, das fast 4 kg PEtOx mit einem Polymerisationsgrad (DP) von 60 und einer engen Dispersität (D) von 1 ,14 ergab, bestimmt durch SEC in DMAc. Da die CROP durch Zugabe von Wasser beendet wurde, enthielt das resultierende PEtOx zwei isomere Endgruppen, die von einem nucleophilen Angriff auf die 2- oder 5-Stellungen des Oxazolinringes herrührten, was jedoch in beiden Fällen zu Hydroxylendgruppen bei Hydrolyse zu linearem Poly(ethylenimin) (PEI) führte. Die Hydrolyse wurde unter sauren Bedingungen durchgeführt (vergl. allgemeine Synthesemethoden, Synthese von PEI). Um eine vollständige Hydrolyse zu erhalten, wurde die Reaktion über Nacht mit einem Überschuss von 6 M HCl durchgeführt. Die erfolgreiche Synthese wurde durch das 1H-NMR-Spektrum bestätigt (verg. Abbildung 1 ), welches das Verschwinden der den Ethylsubstituenten von PEtOx zugeordneten Signale deutlich zeigte. Darüber hinaus bestätigte eine klare Hochfeldverschiebung des Rückgratsignals (vergl. C vs. D in Abbildung 1 ) die Bildung von PEI. Der Hydrolysegrad (DH) wurde mit 99% bestimmt, berechnet durch das Verhältnis der Integrale im 1H NMR- Spektrum (vergl. allgemeine Synthesemethoden, Synthese und Charakterisierung von dPAOx, Gleichung (1 )).
Abbildung 1 zeigt 1H NMR Spektren (300 MHz, 300 K, D2O oder MeOD) von PEtOx, PEI, oxPEI und dPEtOx sowie die Zuordnung der Signale zu den schematischen Darstellungen der Strukturen.
Als nächstes wurde PEI durch Oxidation von PEtOx mit Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel hergestellt. Die Oxidation erfolgte im Polymerrückgrat und es bildeten sich so statistisch verteilte Rückgrat-Amidgruppen. Die Struktur des resultierenden oxPEI entspricht der sich wiederholenden Einheit von Poly-(glycin) neben nicht betroffenen Ethylenimineinheiten. Daher kann das Polymer auch als Poly(ethylenimin-stat-glycin)-Copolymer bezeichnet werden. Mit dem Ziel, 50% der Aminogruppen durch Oxidation im PEI zu erzeugen wurden 0,7 Äquivalente Wasserstoffperoxid pro Aminogruppe verwendet. Der Oxidationsgrad (DO), der durch das Integralverhältnis im 1H-NMR-Spektrum als 54% bestimmt wurde (vergl. allgemeine Synthesemethoden, Synthese und Charakterisierung von dPAOx, Gl. (2)), bestätigte die erfolgreiche Synthese. Die Methylengruppensignale, die den Ethylenimin- (D) und den Glycin-Wiederholeinheiten (F) zugeordnet sind, traten in unmittelbarer Nähe im 1H-NMR-Spektrum auf und überlappten einander teilweise. Die Kopplung dieser Signale im HMBC NMR-Spektrum bestätigte die zufällige Verteilung der beiden verschiedenen sich wiederholenden Einheiten innerhalb des Polymers. Das NH-Protonensignal E zeigte die Bildung einer Amidgruppe an, was das Vorhandensein von Glycineinheiten ebenso bestätigte.
Da die verbleibenden Aminogruppen weiter funktionalisiert werden können, stellte das resultierende oxPEI die Plattform für die Synthese verschiedener abbaubarer Polymere dar. Hier wurde eine nachfolgende Reacylierung mit einer homologen Serie von aliphatischen Acylchloriden von Acetylchlorid bis n-Decanoylchlorid angewendet, um Amideinheiten wieder einzuführen, die äquivalent zu den N- Acylethylenimin-Strukturen in PAOx waren. Die resultierenden Polymerstrukturen ähneln PAOx mit zusätzlichen, statistisch verteilten Poly-(glycin)-Einheiten, die in das Polymerrückgrat integriert sind. Daher können sie auch als Poly(2-n-alkyl-2- oxazolin-stat-glycin)-Copolymere oder aufgrund der Abbaubarkeit der Glycineinheit als abbaubare Poly(2-n-alkyl-2-oxazolin)-analoga angesehen werden. Der beschriebene synthetische Ansatz ermöglichte somit die Erstellung einer dPAOx- Bibliothek mit gleicher Kettenlänge und gleichem DO, wobei nur EtOx als kommerziell erhältliches Monomer eingesetzt wurde.
Die Charakterisierung des gereinigten dPAOx mittels 1H NMR-Spektroskopie deutete auf eine Abnahme der den PEI-Wiederholeinheiten zugeordneten Signale hin, während Signale, die den Alkylseitenketten zugeschrieben werden, ihre Umwandlung in die entsprechenden /V-Acylethyleniminstrukturen bestätigten. Wie in Abbildung 1 für dPEtOx veranschaulicht, traten die entsprechenden Signale (A und B) bei den gleichen chemischen Verschiebungen wie im nicht abbaubaren PEtOx- Ausgangsmaterial auf. Die Zuordnungen wurden durch COSY NMR-, HSQC NMR- und HMBC NMR-Messungen überprüft.
Beispiel C2: Charakterisierung der Polymere durch IR-Spektroskopie
Ein weiterer struktureller Nachweis wurde durch IR-Spektroskopie gewonnen. Abbildung 2 zeigt ATR-IR Spektren von PEtOx, PEI, oxPEI und dPEtOx im Bereich der Wellenzahlen von 1000 bis 3500 cm’1 einschließlich der Zuordnung der wichtigsten Banden. Die IR-Spektroskopie von PEtOx, PEI, Poly(glycin) sowie oxPEI wurde zuvor in der Literatur beschrieben, was eine einfache Zuordnung von Schwingungsbanden ermöglichte. Die Bande bei 3213 cm’1 im PEI-Spektrum, die der NH-Schwingung der Aminogruppe zugeordnet ist, wurde für PEtOx nicht beobachtet, trat aber nach der Hydrolyse auf. Die Bande verringerte sich bei der Oxidation zu oxPEI und verschwand fast nach dem folgenden Re-Acylierungsschritt zu dPEtOx, was auf eine fast vollständige Funktionalisierung der Aminogruppen hindeutet. Die Schwingungsbande bei 1628 cm’1 im PEtOx-Spektrum kann der Amid I Bande zugeschrieben werden, die hauptsächlich auf die Carbonylvalenz- schwingung zurückzuführen ist. Die Bande verschwand während der Hydrolyse zu PEI aufgrund der Spaltung der Carbonylgruppen tragenden Seitenkette fast vollständig. Während der Oxidation zu oxPEI und der folgenden Reacylierung zu dPEtOx wurden Amidgruppen wieder eingeführt, was zu einer Erhöhung der Carbonyl-Vibrationsbande führte. Die Amid II Bande bei 1543 cm’1, hauptsächlich durch die Deformationsschwingung der NH-Bindung verursacht, wurde bei PEtOx nicht beobachtet, das nur tertiäre Amidgruppen ohne NH-Bindungen aufwies, und zeigte den strukturellen Unterschied zwischen PEtOx und dPEtOx. Signale von Carbon-säurederivaten, die auf mögliche Abbauprodukte zurückzuführen sind, werden bei etwa 1710 cm’1 erwartet. Jedoch konnten solche Signale in den Spektren von oxPEI oder dPEtOx, nicht beobachtet werden.
Beispiel C3: Charakterisierung der Polymere durch SEC SEC-Analysen waren aufgrund von Löslichkeitsänderungen im Syntheseweg sowie aufgrund möglicher Wechselwirkungen einiger Polymere mit dem Säulenmaterial nur eingeschränkt möglich. Jedoch lösten sich alle Polymere sowohl in CHCh als auch in DMAc, mit Ausnahme von PEI, das in diesen SEC-Lösungsmitteln nicht löslich war und dPMeOx, welches nur in DMAc löslich war (vergl. Tabelle 1 ).
In Übereinstimmung mit den theoretisch erwarteten Molmassen erschien das Signal von PEtOx bei dem niedrigsten Elutionsvolumen im polaren Eluent DMAc, während das hydrodynamische Volumen von oxPEI signifikant abnahm. Die Reacylierung zu dPEtOx verschob dessen Signal auf ein dazwischen liegendes Elutionsvolumen und entsprechender Molmasse. Ein Vergleich der SEC-Elugramme aller dPAOx ergab jedoch eindeutig, dass signifikante Veränderungen der Hydrophilie infolge der zunehmenden Seitenkettenlänge zu berücksichtigen sind, da diese die hydrodynamischen Volumina der Polymere beeinflussten. Dies zeigte sich besonders deutlich an der scheinbar höheren Molmasse von dPMeOx im Vergleich zu dPEtOx, die auf die relative Methode zur Molmassebestimmung der SEC zurückzuführen ist.
Die erhöhte Hydrophobie des dPAOx mit längeren Seitenketten wurde durch einen Vergleich ihrer SEC-Elugramme im hydrophoben Eluent CHCI3 angezeigt Ihre Signale verlagerten sich in Richtung niedrigerer Elutionsvolumina mit zunehmender Seitenkettenlänge. Dies entspricht dem Trend, der für die theoretischen Molmassen aufgrund einer erhöhten Lipophilie und damit zunehmenden hydrodynamischen Volumens innerhalb der homologen Reihe erwartet wird. Dennoch nahm die Diskrepanz zwischen den von der SEC ermittelten Mn-Werten und den theoretischen Molmassen mit der Seitenkettenlänge zu, was auf eine zunehmende Differenz zwischen den hydrodynamischen Volumina der dPAOx- und der SEC-Standards hinweist, die bereits für PAOx berichtet wurden.
Tabelle 1: Molmassen Mn, Dispersitätswerte D und thermische Eigenschaften von
PEtOx, PEI, oxPEI und dPAOx. aErhalten durch Berechnung mit theoretischen Monomereinheiten. bBestimmt durch SEC in CHC (2 vol% Isopropanol, 4 vol% Triethylamin, PS-Kalibrierung, Rl- Detektion). cBestimmt durch SEC in DMAc (0,21 Gew.-% LiCI, PS-Kalibrierung, Rl- Detektion). dZersetzungstemperatur; bestimmt durch TGA bei 95% der ursprünglichen Masse. eGlasübergangstemperatur; ermittelt durch DSC anhand der dritten Aufheizkurve bei 10 K min'1; Wendepunkte werden als Tg-Werte bestimmt. fSchmelztemperatur; bestimmt durch DSC anhand der dritten Aufheizkurve bei 10 K min'1.
Unter den synthetisierten dPAOx waren nur die Polymere mit den kürzesten Seitenketten, nämlich dPMeOx und dPEtOx, ausreichend hydrophil, um in Wasser bei Raumtemperatur zu löslich zu sein. Im Gegensatz dazu waren abbaubare Poly(2-n-butyl-2-oxazolin)-analoga (dPButOx) und längere Seitenkettenanaloga hydrophob und konnten nur in organischen Lösungsmitteln gelöst werden. Das abbaubare Poly(2-n-propyl-2-oxazolin)-analoge (dPPropOx) zeigte ein intermediäres Löslichkeitsverhalten. Nur geringe Mengen konnten in Wasser gelöst werden, was die Titration von Aminogruppen in wässriger Lösung (siehe unten) ermöglichte. Nicht abbaubare PAOx weisen ähnliche Lösungseigenschaften auf. Allerdings weisen PEtOx und Poly(2-n-propyl-2-oxazolin) (PPropOx) eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST) in Wasser auf, während dies bei dPEtOx oder dPPropOx nicht beobachtet wurde, was möglicherweise auf die Ausbildung zusätzlicher Wasserstoffbrückenbindungen zurückzuführen ist, die durch den Am id Wasserstoff der Glycineinheit ausgebildet werden können.
Beispiel C4: Charakterisierung der Polymere durch Titration
Titrationen in wässriger Lösung wurden durchgeführt, um die Anzahl der Aminogruppen im Polymerrückgrat von PEI, oxPEI und dem wasserlöslichen dPAOx, nämlich dPMeOx, dPEtOx und dPPropOx, zu bestimmen. Obwohl die Titration von Aminogruppen eine qualitative Bewertung ermöglichte, wurde aufgrund von Wasserrückständen in PEI und oxPEI, welche die Ergebnisse beeinflussen würden keine genaue quantitative Analyse durchgeführt. Eine Überlagerung der Titrationskurven von PEI, oxPEI und dPMeOx ist exemplarisch in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 3 zeigt Titrationskurven von PEI, oxPEI und dPMeOx (1 mg mL’1) gegen 0,1 M NaOH and deren erste Ableitungen. Die Polymerlösungen wurden vor der Titration mit konzentriertem HCl angesäuert. Die individuellen Kurven sind zur Übersichtlichkeitvertikal übereinander gelegt und die entsprechenden pH- Werte der Äquivalenzpunkte angezeigt.
Abbildung 3 zeigt die Entwicklung innerhalb der Synthesesequenz. Die Ansäuerung der wässrigen Polymerlösungen mit konzentriertem HCl vor den Titrationen führte zum Auftreten von zwei Äquivalenzpunkten (EP) für Aminogruppen enthaltende Polymere bei der Titration mit verdünnter Natriumhydroxidlösung. Der erste EP entspricht der Neutralisierung des HCI-Überschusses, während der zweite EP sich auf die Neutralisation der Aminogruppen bezieht. Die Oxidation von PEI zu oxPEI wandelte 54% der Aminoeinheiten in Amideinheiten der Poly(glycin)-Einheiten um. Die verringerte Anzahl von Aminogruppen zeigte sich in dem verringerten Abstand zwischen den beiden EP während der Titration.
In den Titrationskurven von dPMeOx und dPPropOx wurde nur ein EP beobachtet. Das ist auf die alleinige Neutralisation des HCl zurückzuführen und bestätigte die vollständige Funktionalisierung der Aminogruppen. In der Titrationskurve von dPEtOx traten noch zwei EP auf, was eine unvollständige Reacylierung offenbarte. Jedoch deutete ihre Nähe darauf hin, dass nur eine kleine Anzahl von Aminogruppen verblieben war, was mit den Beobachtungen aus der IR-Spektroskopie übereinstimmt.
Beispiel C5: Charakterisierung der Polymere durch TGA und DSC
Die thermischen Eigenschaften der Polymeren wurden unter Verwendung der thermogravimetrischen Analyse (TGA) und der differentiellen Differenzkalorimetrie (DSC) untersucht.
Die dPAOx zeigten eine gute thermische Stabilität bis zu Temperaturen über 100 °C. Sie sind jedoch nicht so stabil wie ihre nicht abbaubaren PAOx-Analoga, die Abbautemperaturen (Td) bis über 300 °C aufweisen. Die geringere thermische Stabilität von dPAOx kann der Anwesenheit von zusätzlichen abbaubaren Amidgruppen im Rückgrat zugeschrieben werden.
In Abbildung 4 sind die DSC-Thermogramme von PEtOx, PEI, oxPEI und dPEtOx (N2, dritte Aufheizkurve, 10 K min'1) gezeigt. Die individuellen Thermogramme sind zur Übersichtlichkeit vertikal übereinander gelegt.
Abbildung 5 zeigt die DSC-Thermogramme verschiedener dPAOx (N2, dritter Heizlauf, 10 K min'1). Auch hier sind die individuellen Thermogramme aus Gründen der besseren Darstellung vertikal übereinander gelegt. In der Abbildung sind die DSC-Thermogramme der C-i-Cg-alkylsubstituierten Derivate von dPAOx (dPMeOx - dPNonOx) gezeigt.
Abbildung 6 zeigt Glasübergangstemperaturen und Schmelztemperaturen von dPAOx verglichen mit Glasübergangstemperaturen und Schmelztemperaturen von nicht abbaubaren PAOx aus der Literatur. Glasübergänge wurden aus den Wendepunkten bestimmt. Die Daten aus der Literatur wurden aus den folgenden Veröffentlichungen entnommen:
Hoogenboom, R.; Fijten, M. W. M.; Thijs, H. M. L.; van Lankvelt, B. M.; Schubert, U. S. Microwave-assisted synthesis and properties of a series of poly(2-alkyl-2- oxazoline)s. Des. Monomers Polym. 2005, 8, 659-671.
Rettler, E. F. J.; Kranenburg, J. M.; Lambermont-Thijs, H. M. L.; Hoogenboom, R.; Schubert, U. S. Thermal, mechanical, and surface properties of poly(2-N-alkyl-2- oxazoline)s. Macromol. Chem. Phys. 2010, 211, 2443-2448.
Kempe, K.; Lobert, M.; Hoogenboom, R.; Schubert, U. S. Synthesis and characterization of a series of diverse poly(2-oxazoline)s. J. Polym. Sei., Part A: Polym. Chem. 2009, 47, 3829-3838.
Beck, M.; Birnbrich, P.; Eicken, U.; Fischer, H.; Fristad, W. E.; Hase, B.; Krause, H.- J. Polyoxazoline auf fettchemischer Basis. Angew. Makromol. Chem. 1994, 223, 217-233.
Rodriguez-Parada, J. M.; Kaku, M.; Sogah, D. Y. Monolayers and Langmuir-Blodgett films of poly(AT-acylethylenimines) with hydrocarbon and fluorocarbon side chains. Macromolecules 1994, 27, 1571-1577.
Eine Überlagerung der DSC-Thermogramme von PEtOx, PEI, oxPEI und dPEtOx in Abbildung 4 zeigt die Unterschiede im thermischen Verhalten der Polymere innerhalb der Synthesesequenz. Mit Ausnahme von PEI zeigten die Polymere ein amorphes Verhalten. Das PEI-Rückgrat besitzt keine Seitenketten, so dass die Hauptketten regelmäßig gepackt werden können, was zur Bildung von Kristalliten mit einer Schmelztemperatur (Tm) bei 62 °C führt. Die Einführung statistisch verteilter Amidgruppen durch Oxidation störte die Packung, was zu einem amorphen Verhalten von oxPEI führte. Ähnlich wie PEtOx zeigte auch dPEtOx ein amorphes Verhalten, beide mit Glasübergangstemperaturwerten (Tg) über dem Tg von oxPEI aufgrund der Existenz von Seitenketten. dPEtOx zeigte die höchste Tg innerhalb der Sequenz, da es sowohl die Unregelmäßigkeit des Polymerrückgrats aufgrund der statistisch verteilten Amidgruppen als auch A/-Acyl-Seiten ketten aufweist. Aus den DSC-Thermogrammen der dPAOx-Polymere in Abbildung 5 sowie aus den Beziehungen zwischen den Tg- und Tm-Werten und der Anzahl der Kohlenstoffatome in der dPAOx-Seitenkette und dem Vergleich mit den Tg- und Tm-Werten von nicht abbaubarem PAOx in Abbildung 6 lassen sich folgende Informationen entnehmen.
Je nach Struktur der Polymerseitenkette wurden signifikante Unterschiede im thermischen Verhalten beobachtet. Analog zu ihren PAOx-Pendants zeigten die dPAOx mit kurzen n-Alkyl-Seitenketten bis zum abbaubaren Poly-(2-n-hexyl-2- oxazolin)-Analogon (dHexOx) amorphe Eigenschaften. Die Tg-Werte verringerten sich linear mit zunehmender Seitenkettenlänge mit ähnlicher Steigung für beide Serien, insbesondere für dPAOx mit längeren Seitenketten. Makromoleküle mit nur kurzen Seitenketten können enger gepackt werden, was zu einer stärkeren Wechselwirkung zwischen den Amiddipolen führt, welche die Relaxation des Rückgrats verlangsamt und somit zu höheren Tg-Werten führt. Es wurde jedoch zwischen der Tg von dPEtOx bei 75 °C und der Tg von dPPropOx bei 24 °C eine Lücke beobachtet. Folglich waren die Tg-Werte von dPMeOx und dPEtOx höher als die Tg-Werte von PMeOx und PEtOx, während alle anderen dPAOx Glasübergangstemperaturen bei niedrigeren Temperaturen lagen als bei ihren nicht abbaubaren PAOx-Analoga. Entsprechend ihren Tg-Werten über Raumtemperatur erschienen dPMeOx und dPEtOx makroskopisch als Feststoffe, während dPPropOx und die dPAOx mit längeren Seitenketten hochviskose Flüssigkeiten bildeten, die durch ihre Glasübergänge unter der Raumtemperatur bewirkt wurden
Bei den abbaubaren Poly(2-n-heptyl-2-oxazolin)- (dPHeptOx), Poly(2-n-octyl-2- oxazolin)- (dPOctOx) und Poly(2-n-nonyl-2-oxazolin)-Analoga (dPNonOx) wurde semikristallines Verhalten beobachtet. Die semikristallinen Eigenschaften, die nur für dPAOx mit Seitenketten von mindestens sieben Kohlenstoffatomen vorkamen, können analog zu PAOx der Seitenkettenkristallisation zugeschrieben werden. PAOx weist jedoch bereits bei kürzeren Alkylsubstituenten eine Semikristallinität auf. Der Unterschied kann auf die Unregelmäßigkeit im dPAOx-Rückgrat aufgrund der zusätzlichen, statistisch verteilten Glycineinheiten zurückgeführt werden. Die Tm-Werte von dPHeptOx, dPOctOx und dPNonOx lagen mehr als 100 °C unter den Tm-Werten des entsprechenden PAOx von rund 150 °C. Die Schmelzpunkte erhöhten sich mit zunehmender Seitenkettenlänge von Tm von 9 °C für dPHeptOx auf ein Tm von 28 °C für dPNonOx, während die Tm-Werte von PAOx unabhängig von der Seitenkettenlänge waren. Darüber hinaus wurden asymmetrische Dreifachschmelzpeak für dPAOx mit längeren Seitenketten beobachtet, während das entsprechende PAOx nur einen symmetrische Schmelzpeak zeigte. Die Asymmetrie wurde mit zunehmender Seitenkettenlänge weniger ausgeprägt. Ähnliche asymmetrische Doppelschmelzpeaks wurden zuvor für Poly(2-n-butyl-2-oxazolin) sowie für andere semikristalline Polymere wie Poly-(ethylenterephthalat), Poly- (ether-keton), Poly-(L-milchsäure) oder chirale Poly-(2-oxazoline) beobachtet und können durch Rekristallisation der Schmelze erklärt werden.
Beispiel C6: Charakterisierung der Polymere durch Abbaustudien mittels sauerer Hydrolyse
Ein wichtiger Vorteil von dPAOx im Vergleich zu PAOx ist deren Fähigkeit, durch die zusätzlichen Rückgrat-Amidgruppen potenziell abbaubar zu sein. Um das zu bestätigen wurden PEtOx, PEI, oxPEI und die wasserlöslichen dPAOx, nämlich dPMeOx, dPEtOx und dPPropOx, mit 6 M HCl bei 90 °C für 2 Tage behandelt. Diese Bedingungen ähneln denen, die für die Hydrolyse von PEtOx zu PEI angewendet wurden, bei der kein Abbau des PEtOx- oder des PEI-Polymer-Rückgrats auftritt.
In Abbildung 7 ist die Überlagerung der 1H NMR Spektren von PEtOx (links) und von dPEtOx (rechts) vor (unteres Spektrum) und nach (oberes Spektrum) der Behandlung mit HCl (400 MHz, 297 K, D2O, Lösungsmittelsignale unterdrückt) dargestellt. Die individuellen Spektren sind aus Gründen der besseren Übersichtlichkeit vertikal übereinander gelegt.
Abbildung 7 zeigt den erfolgreichen Abbau der dPAOx-Polymere unter diesen Bedingungen. Vor der Behandlung mit HCl zeigte dPEtOx breite Signale, die für Polymere typisch sind, während die Signale des degradierten dPEtOx scharf waren, wie es bei kleinen Molekülen üblicherweise beobachtet wird.
Die Aufspaltung der EtOx-Seitenkettensignale bei 1 ,04 ppm bzw. 2,16 ppm in ein Triplet bzw. ein Quartett deutete auf die Abspaltung der Seitenkette vom Polymerrückgrat hin, wodurch Propionsäure erhalten wird. Dies bestätigte nicht unbedingt den Abbau der Polymerkette selbst und wurde auch für PEtOx bei der Behandlung mit HCl gefunden. Während jedoch die Spektren von PEtOx nach der Behandlung nur das Rückgratsignal des verbliebenen PEI aufwiesen, traten verschiedene scharfe Signale bei chemischen Verschiebungen des ehemaligen dPEtOx-Rückgrats auf. Das Singulett bei 3,21 ppm kann der Methyleneinheit des Glycins zugeordnet werden, ddas bei Abbau gebildet wird, während die beiden Tripletts bei 3,91 ppm und 3,10 ppm den verbleibenden Ethylenimineinheiten zugeschrieben werden können. Darüber hinaus erschien ein scharfes Signal bei 8,45 ppm, das bereits für oxPEI nach dem Abbau berichtet worden war und das auf weiteren Abbauprodukten zurückzuführen sein könnte. Gleichzeitig verschwand das breite Amidsignal bei etwa 8,0 ppm, was auf die Hydrolyse der zugehörigen Rückgrat-Amidgruppen hindeutet.
Des Weiteren wurde die DOSY NMR-Spektroskopie verwendet, um den Abbau von dPAOx zu bestätigen. Abbildung 8 zeigt die Überlagerung der DOSY NMR Spektren von PEtOx (links) und dPEtOx (rechts) vor (oberes Spektrum) und nach (unteres Spektrum) Behandlung mit HCl (400 MHz, 297 K, D2O, Lösungsmittel-signate unterdrückt). Die individuellen Spektren sind aus Gründen der besseren Übersichtlichkeit vertikal übereinander gelegt. DOSY NMR-Spektroskopie ermöglicht die Fraktionierung der 1H-NMR-Signale gemäß ihren Diffusionskoeffizienten. Vor der Behandlung mit HCl entsprachen alle PEtOx-Signale demselben Diffusionskoeffizienten und bestätigten die kovalenten Bindungen zwischen deneinzelnen Gruppen. Nach der der Hydrolyse konnte die abgespaltene Propionsäure deutlich vom nicht abgebauten PEI-Rückgrat unterschieden werden, da sie aufgrund ihrer niedrigeren Molmasse einen höheren Diffusionskoeffizienten aufwies. Vor der Behandlung mit HCl zeigten alle dPEtOx-Signale den gleichen Diffusionskoeffizienten. Im Gegensatz dazu zeigte das Spektrum des abgebauten dPEtOx Signale mit drei verschiedenen Diffusionskoeffizienten. Die gebildeten Propionsäuresignale waren leicht zu identifizieren, da sie den gleichen Diffusionskoeffizienten wie in den Spektren von PEtOx nach der Behandlung zeigten. Daher wurden die beiden anderen Signale Abbau Produkten des ehemaligen Polymerrückgrats, beispielsweise Glycin zugeschrieben, welche unterschiedliches Diffusionsverhalten zeigten.
Beispiel C7: Charakterisierung der Polymere durch Abbaustudien mittels enzymatischer Hydrolyse
Es wurden Abbaustudien unter enzymatischen Bedingungen durchgeführt, um die Abbaubarkeit der Polymere unter milderen und biologischen Bedingungen zu bestätigen. Daher wurde dPMeOx 30 Tage lang mit Proteinase K bei 37 °C in einer PBS-Pufferlösung behandelt.
Abbildung 9 zeigt die Überlagerung der 1H NMR Spektren von dPMeOx nach der Behandlung mit Proteinase K in PBS Puffer (oberes Spektrum) und von Glycin mit Proteinase K in PBS Puffer (unteres Spektrum) (400 MHz, 297 K, D2O). Die individuellen Spektren sind aus Gründen der besseren Übersichtlichkeit vertikal übereinander gelegt.
Das 1H NMR-Spektrum von dPMeOx nach der Behandlung mit Proteinase K in Abbildung 9 bestätigte den partiellen Abbau des Polymers. Das scharfe Signal bei 1 ,93 ppm zeigte die Spaltung der Seitenketten, was bei dPMeOx zu Essigsäure führte. Das scharfe Signal bei 8,46 ppm und das Signal bei 3,58 ppm wurden bereits für das unter sauren Bedingungen abgebaute dPAOx beobachtet und bestätigen somit den Abbau des Polymerrückgrats. Die Überlagerung mit einem 1H NMR Spektrum von Glycin in einer Proteinase K PBS Pufferlösung der gleichen Konzentration bestätigt die Zuordnung des letzteren Signals zu Glycin. Die breiten Polymersignale der Methylseitenkette, des dPMeOx-Rückgrats und der Rückgrat-Amidgruppe können jedoch weiterhin im Spektrum beobachtet werden, was auf die langsame Abbaukinetik unter den Bedingungen des Versuchs hindeutet.
Diese Versuchsergebnisse bestätigen, dass ein einfacher Weg der Synthese durch polymeranaloge Funktionalisierungen zum Aufbau einer Bibliothek sauer und enzymatisch abbaubarer Poly-(2-n-alkyl-2-oxazolin)-Analoga gefunden wurde. Dabei wurden Copolymere entwickelt, welche über konsekutive Hydrolyse von PEtOx, partielle Oxidation des Polymerrückgrats und Re-Acylierung der verbliebenen Aminogruppen zur Wiedereinführung von N-Acylethylenimin-Einheiten hergestellt wurden. Unter den resultierenden dPAOx-Polymeren waren nur dPMeOx und dPEtOx wasserlöslich, während dPButOx und längere Seitenkettenanaloga hydrophobe Eigenschaften zeigten.
In Analogie zu ihren nicht abbaubaren PAOx-Gegenstücken wurde eine starke Abhängigkeit der thermischen Eigenschaften von den Seitenketten beobachtet. dPAOx mit n-Alkyl-Seitenketten von bis zu sechs Kohlenstoffatomen waren amorph. Ähnlich wie bei den kürzeren nicht abbaubaren PAOx verringerten sich die Tg-Werte der Polymere mit zunehmender Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Seitenkette.
Höhere dPAOx-Homologe waren semikristallin und zeigten Tm-Werte, die mit der Länge der n-Alkylseitenketten zunahmen, aber unter 30 °C blieben, was die neuartigen Materialien für eine Reihe pharmazeutischer Anwendungen interessant macht, z. B. als PEG-Ersatz.
Der Einbau von Glycin-Einheiten erleichterte die Abbaubarkeit des dPAOx- Rückgrats unter sauren und enzymatischen Bedingungen und verdeutlichte deren Potenzial, in biomedizinischen oder anderen Anwendungen als abbaubare PAOx- Analoga eingesetzt zu werden.

Claims

48 Patentansprüche 220fs02.wo
1 . Copolymere enthaltend 10 bis 95 mol % an Struktureinheiten der Formel (I), 5 bis 90 mol % an Struktureinheiten der Formel (II) und 0 bis 20 mol % an Struktureinheiten der Formel (III)
-NR1-CHR3-CHR4- (I), -NH-CO-CHR7- (II), -NH-CHR9-CHR10- (III), oder
Copolymer enthaltend 10 bis 95 mol % an Struktureinheiten der Formel (IV), 5 bis 90 mol % an Struktureinheiten der Formel (V) und 0 bis 20 mol % an Struktureinheiten der Formel (VI)
-NR1-CHR3-CHR4-CHR5- (IV), -NH-CO-CHR7-CHR8- (V),
-NH-CHR9-CHR10-CHR11- (VI), worin
R1 einen Rest der Formel -CO-R2, der Formel -CO-NH-R2 oder der Formel -CH2-CH(OH)-R12 bedeutet,
R3, R4, R5, R7, R8, R9, R10 und R11 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl bedeuten,
R2 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, -CmH2m-X oder -(CnH2n-O)o-(CpH2p-O)q-R6, R6 Wasserstoff oder C-i-C6-Alkyl ist,
R12 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Aryl oder Aralkyl,
X ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Alkoxy, Carboxyl, Carbonsäureester, Schwefelsäureester, Sulfonsäureester oder Carbamidsäureester, m eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist, n und p unabhängig voneinander ganze Zahlen von 2 bis 4 sind, wobei n ungleich p ist, und 49 o und q unabhängig ganze Zahlen von 0 bis 60 sind, wobei mindestens eines der o oder q ungleich 0 ist, wobei die Prozentangaben auf die Gesamtmenge der Struktureinheiten der Formel (I), (II) und (III) oder der Formel (IV), (V) und(VI) bezogen sind. Copolymere nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass diese 20 bis 90 mol % an Struktureinheiten der Formel (I), 10 bis 80 mol % an Struktureinheiten der Formel (II) und 0 bis 20 mol % an Struktureinheiten der Formel (III) enthalten. Copolymere nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R1 ein Rest der Formel -CO-R2 ist. Copolymere nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R2 Ci-Cis-Alkyl, insbesondere Ci-C6-Alkyl, und ganz besonders bevorzugt Ci-C2-Alkyl ist. Copolymere nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass n = 2 und p = 3 ist. Verfahren zur Herstellung von Copolymeren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 mit den Maßnahmen i) Umsetzung eines Polyalkylenimins, das wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (la) oder der Formel (IVa) enthält, mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Copolymer enthaltend die Struktureinheiten der Formel (la) und der Formel (II) oder enthaltend die Struktureinheiten der Formel (IVa) und der Formel (V) erhalten wird
-NH-CR3H-CR4H- (la), -NH-CO-CR7H- (II),
-NH-CR3H-CR4H-CR5H- (IVa), -NH-CO-CR7H-CR8H- (V), 50 worin R3, R4, R5, R7 und R8, die in Anspruch 1 definierte Bedeutung besitzen, und ii) Umsetzung des Copolymers aus Schritt i) mit einem Acylderivat der Formel (VII) oder mit einem Isocyanat der Formel (VIII) oder mit einem Epoxid der Fomel (IX) zu einem Copolymer nach Anspruch 1 worin R2 und R12 die in Anspruch 1 definierten Bedeutungen besitzen und R13 eine Abgangsgruppe, insbesondere Fluor, Chor, Brom, lod oder eine aktivierte Carbonsäure bedeutet. Verfahren zur Herstellung von Copolymeren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 mit den Maßnahmen iii) partielle Hydrolyse eines Polyoxazolins enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (I) oder eines Polyoxazins enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (IV)
-NR1-CHR3-CHR4- (I), -NR1-CHR3-CHR4-CHR5- (IV), zu einem Copolymer enthaltend wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (I) und der Formel (III) oder der Formel (IV) und der Formel (VI)
-NH-CHR9-CHR10- (III), -NH-CHR9-CHR10-CHR11- (VI), worin R1, R3, R4, R5, R9, R10 und R11 die in Anspruch 1 definierte Bedeutung besitzen, und iv) Umsetzung des Copolymeren aus Schritt iii) mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Copolymer enthaltend die Struktureinheiten der Formel (I), der Formel (II) und gegebenenfalls der Formel (III) oder enthaltend die Struktureinheiten der Formel (IV), der Formel (V) und gegebenenfalls der Formel (VI) erhalten wird 51
-NH-CO-CHR7- (II), -NH-CO-CHR7-CHR8- (V), worin R7 und R8 die in Anspruch 1 definierte Bedeutung besitzen. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Oxidationsmittel ein Peroxid, Hydroperoxid oder eine Percarbonsäure ist, insbesondere Wasserstoffperoxid. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 6 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt i) eingesetzte Polyalkylenimin durch saure Hydrolyse eines Poly(oxazolins) oder eines Poly(oxazins) erhalten wird. Verwendung der Copolymere nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung von Formulierungen, welche pharmazeutische oder agrochemische Wirkstoffe enthalten. Verwendung der Copolymere nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 für Anwendungen im Bereich der Wirkstoffabgabe. . Partikel enthaltend Copolymere nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5. Partikel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass diese als Nanopartikel vorliegen, deren mittlerer Durchmesser D50 weniger als 1 pm, vorzugsweise 20 bis 500, nm beträgt. Partikel nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese pharmazeutische oder agrochemische Wirkstoffe enthalten.
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